CN1293195C - 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统及其应用，该系统包含：转录质粒，该转录质粒包括所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的宿主细胞。通过上述反向遗传操作系统，成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

Description

新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用

技术领域

本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为不分节段单股负链RNA病毒，作为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒疫苗载体具有非凡的优点：包括LaSota株在内的NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及细胞基因组整合的可能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉^{(1，7，8，11，12，13)}。NDV为高度传染性和高度致死性的家禽疫病原，我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。NDV作为活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒^{(1，2，3，4，5，6)}。

NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个独立转录编码单元(图1A)。本研究将GFP蛋白克隆到P和M之间，来研究外源蛋白在NDV中的表达适当位置。NDV和其它负链RNA病毒一样，其最小感染单位是核糖核蛋白复合物，无蛋白包裹的RNA本身并无感染性。NDV的基因组RNA通过与NP、P、L蛋白一起组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒^(7，10)。根据这一原理，1999年欧洲学者率先建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统(reversegenetic system，RGS系统)⁽²⁾。目前在欧、美至少有4个实验室利用NDV的RGS技术在基础与应用研究方面开展激烈的竞争性研究。2001-2002年，Palese.P.等相继构建表达H1亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDV B1株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVB1株，免疫试验表明这两种NDV活载体疫苗可分别在小鼠和禽类诱导保护性免疫反应。但是由于B1本身高度致弱，在免疫接种鸡体内的复制能力较差，因而诱导免疫鸡形成有效免疫保护的能力也相对较弱，试验表明，表达H7亚型HA基因的NDV B1株对NDV及H7亚型高致病力禽流感致死性攻击的存活保护分别仅为60％和40％，且不能阻止病毒在体内的复制和排放⁽¹²⁾。

研究表明，NDV基因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高度的遗传和表达稳定性^{(11，12，13)}。我们选择我国自行培育、生产实践广泛应用、免疫效果良好的的NDV LaSota弱毒疫苗株，建立了相应的反向遗传操作系统，成功救获了表达GFP重组病毒株。救获病毒具有良好的鸡胚生长特性，免疫新生SPF雏鸡可诱导高水平的HI抗体反应。本研究为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，该系统包含：

(1)转录质粒，该转录质粒包括所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的病毒复制许可的宿主细胞，BHK-21。

在一个优选实施方案中，优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗株为购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)的新城疫LaSota疫苗株AV1615。

在上述反向遗传操作系统的一个实施方案中，包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序列位于T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因组cDNA转录模板。在一个优选实施方案中，所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。

在上述反向遗传操作系统的另一个实施方案中，包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列都位于T7启动子之后。

在一个优选实施方案中，所述转录质粒是包含外源标签基因GFP的质粒pBRN-FL-GFP3。

在一个优选实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP，pBSP和pBSL。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是BHK-21。

本发明另一个目的是提供上述反向遗传操作系统在制备负链RNA病毒中的应用。在一个优选实施方案中，所述转录质粒中的新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列被突变、缺失或被外源基因插入，以制备相应的突变、缺失或重组的负链RNA病毒。

本发明还有一个目的是提供利用上述反向遗传操作系统制备负链RNA病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将所述转录质粒和所述转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(2)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获病毒。

附图说明

图1.从高保真RT-PCR产生的亚基因组重叠cDNA片段装配全长NDV cDNA。将cDNA片段在共有的限制位点连接，并且在转录质粒pBR322中装配，在转录质粒pBR322中将RBZ和T7终止子序列预先克隆在EcoRI和salI位点之间(详见说明书)。(A)显示亲代NDV的整个全长基因组的第一个和最后一个核苷酸。(B)在顶部显示含有GFP基因的NDV的cDNA克隆，在遗传图谱之下的水平线显示单个cDNA的位置。

图2.通过RT-PCR产生引入修饰酶位点的核苷酸变化，并通过使用PRISM试剂盒(Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自动测序仪测序。加框的是通过PCR诱变在pBRN1-10中引入的一个核苷酸替代(由A突变为G)。

图3.rNDV蛋白表达的免疫荧光分析。用rLaSota-GFP感染汇合BHK-21细胞。(A)MOI为1时感染的细胞，(B)阴性对照。将感染的细胞固定，透化，和用鸡抗-NDV抗血清探测，接着与FITC-偶联的兔抗-鸡IgG抗体温育。在Leica DMIRES2荧光显微镜下观察细胞。显示感染后28小时的数据。

图4.用rLasota-GFP感染的BHK-21细胞的绿色荧光。左边是感染10⁹pFU/ml rLasota-GFP的BHK-21细胞。右边是正常BHK-21细胞。

图5.GFP在不同代次的重组病毒内的稳定表达。用rLasota-GFP感染鸡胚原代细胞(CEF)(获自哈尔滨兽医研究所)，24h后荧光显微镜观察：(A)第一代，(B)第三代，(C)第五代，(D)第七代，(E)第九代。

图6.在含胚的鸡蛋中rLasota-GFP病毒的生长曲线。用1×10⁴ EID₅₀rLasota-GFP接种胚鸡蛋，在不同时刻(接种后24，48，和72小时)收集尿囊液。通过EID₅₀测定胚鸡蛋的病毒滴度。数值获自两个独立的实验，每个实验一式三份进行。Log滴度来源于平均病毒滴度。

图7.pBTRT的质粒图谱。

图8.pBTRT质粒的DNA序列。第一个斜体部分：T7启动子；带下划线部分：核酶序列；第二个带下划线的斜体部分：T7终止子。

图9.pBRN-FL-GFP3的质粒图谱。

图10.pBRN-FL-GFP3质粒的DNA序列。第一个斜体部分：T7启动子；带下划线部分：核酶序列；第二个带下划线的斜体部分：T7终止子。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统的构建

细胞和病毒

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC CCL-10)，培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)及1μg/ml G418的DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基)；NDV Lasota疫苗株AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。接种9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔扩增后-70℃冻存备用；鸡抗NDV高免性血清由本研究室制备(Chu，H.P，G.Snell，D.J.Alexander，和G.C.Schild.1982.Avian Pathol 11：227-234)；SPF鸡胚及SPF鸡雏均由哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供。

转录载体的构建

基因组RNA转录载体pBTRT以低拷贝克隆载体pBR322(Invitrogen)为骨架并在EcoRI/salI位点插入T7启动子(T7 promotor)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7转录终止信号(T7 terminal)，由本实验室自行构建。克隆在T7启动子和核酶之间的DNA片段可以在T7RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于Rib的自身催化功能，可以保证转录产物的3′末端与克隆的DNA片断精确一致。

NDV LaSota株基因组全长cDNA的构建

为建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的十个cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在低拷贝质粒转录载体质粒pBTRT连接组装获得了15186nt的完整cDNA克隆，序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400，并将GFP基因(GenBank AAZ16159.1)克隆到P，M之间。在全长cDNA片段5’末端前缀T7RNA聚合酶启动子，在cDNA片断后连有具有自我催化功能的肝炎δ核酶(GenBank X04451)和T7转录终止信号。构建完成的质粒命名为pBRN-FL-GFP3。为避免Xba位点的甲基化，通过PCR基因组将基因组cDNA中F蛋白编码区第6178位碱基由T同义突变为C，并作为拯救病毒的分子标记。与其他研究者一样，我们同时在T7聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，这可能有助于副粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。具体如下：

NDV Lasota疫苗株病毒鸡胚接种尿囊液经常规方法(动物病毒学，第二版)提取基因组RNA；整个基因组分为末端部分重叠的10个片段(F1-F10)进行RT-PCR扩增，cDNA片段克隆至pBluescript(Clontech)SmaI位点并经序列分析确证与病毒基因组RNA序列完全一致；序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY845400。为引入特异的分子遗传标签，选择Lasota疫苗株基因组cDNA 6172bp处存在一甲基化的XbaI位点，序列为TCTAGATCA，利用PCR手段将其突变为TCTAGACCA，使其不再受甲基化酶识别，因而能够被限制性内切酶XbaI所识别；利用相邻片段重叠部分存在的限制酶切位点连接成组装完整的NDV基因组cDNA(图1A)，并将GFP基因克隆到P，M之间的PmeI位点，并在前装上基因终止和基因起始序列(GE/GS)(TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在转录载体pBTRT上，构建成含有GFP基因病毒基因组转录质粒pBRN-FL-GFP3(图1B)；表达核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBluescriptII(+/-)质粒T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL。

从全长cDNA克隆救获感染性NDV(病毒拯救)

为了从克隆的cDNA中拯救感染性NDV，首先以pBRN-FL-GFP3及表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。NDV的融合蛋白F0必须裂解成F1和F2才具有感染性，对于Lasota弱毒株而言，BHK-21细胞不能分泌裂解F0蛋白所需的蛋白酶，因此在培养基中加入相应蛋白酶，所以此时应换成无血清培养基并加入TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮.Sigma)(1μg/ml)，继续培养2-3天，收获转染细胞上清接种于9-11日龄的SPF鸡胚。4天后收获鸡胚尿囊液，血凝(HA)试验结果阳性，不同鸡胚的HA价介于2^8-11；NDV免疫血清血凝抑制(HI)试验分析同样呈现阳性结果。收获病毒阳性尿囊液作为救获病毒rLasota-GFP的F1代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F1代救获病毒基因组cDNA的6178位点碱基为C，而非原LaSota亲本株的C，和预期完全相符(图2)。结果表明，通过反遗传操作技术，利用NDV LaSota疫苗株基因组cDNA克隆成功地救获具有感染性的子代病毒rLaSota-GFP。更具体地，实验步骤如下：

BHK-21细胞接种于35mm六孔板内生长达50-80％单层时，转录质粒及辅助质粒pBRN-FL-GFP3、pBSNP、pBSP和pBSL分别以5μg、2.5μg、1.25μg 1.25μg，共转染BHK-21细胞，采用CaPO4转染试剂盒(Invitrogene)，操作按试剂盒说明书进行。转染后8-12小时，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5分钟，加入完全DMEM过夜孵育，第二天换成无血清培养基，并加入TPCK(1μg/ml)继续孵育2-3天后，收获培养物上清，0.22um孔径滤器过滤后接种9-11天的SPF胚尿囊腔；接种后的SPF胚继续培养，3-5天，取鸡胚尿囊液50μl进行按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验(Thayer SG，Nersessian BN，RivetzB，Fletcher OJ.Comparison of serological tests for antibodies againstNewcastle disease virus and infectious bronchitis virus using ImmunoCombsolid-phase immunoassay，a commercial enzyme-linked immunosorbent assay，and the hemagglutination-inhibition assay.Avian Dis.1987 Jul-Sep；31(3)：459-63.)。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚及鸡胚成纤维细胞滴定每毫升EID₅₀及PFU病毒含量⁽¹⁴⁾。命名为rLaSota-GFP。

           实施例2间接免疫荧光试验(IFA)试验

NDV LaSota疫苗株能一过性感染体外培养的薄弱动物细胞。为证明rLaSota-GFP病毒在BHK-21细胞内的复制及病毒抗原表达，rLaSota-GFP尿囊毒以MOI为1的病毒量感染约70-80％的单层BHK-21细胞，感染后24小时细胞出现早期CPE(细胞病变)现象，立即以NDV高免SPF鸡阳性血清为检测抗体进行间接免疫荧光染色，结果病毒感染细胞荧光显微镜下观察到强阳性反应(图3A)，而SPF鸡对照血清荧光染色则为阴性(图3B)。更具体地，实验步骤如下：

鸡胚接种尿囊病毒液rLaSota-GFP以DMEM适当倍数稀释，按MOI约为5、50μl体积感染生长于24孔板的BHK-21，37℃，孵育1h后用DMEM洗涤三遍，然后加入完全DMEM继续培养，24h后用95％乙醇固定细胞5min，PBST(含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗细胞后用SPF鸡血清进行封闭1小时后，以鸡抗NDV高免血清和SPF血清作为一抗，以1∶100稀释鸡抗NDV高免性血清为一抗和相同稀释倍数的SPF鸡阴性血清为对照，作用30分钟后PBST洗涤后，加入1∶160稀释荧光素(FITC)标记的二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。

              实施例3 GFP蛋白的表达

尿囊毒rLaSota-GFP以MOI为1的病毒量感染约80％的单层BHK-21细胞，感染后24小时细胞出现早期CPE现象，出现病变后在荧光显微镜下(Leica DMIRES2)观察结果。阳性样品中有绿色荧光出现，野生型NDV作为阴性对照，结果为阴性(图4)。

为证明rLaSota-GFP病毒在BHK-21细胞内的复制及插入外源报告基因GFP在传代过程中仍然能够保持稳定表达，rLaSota-GFP鸡胚尿囊腔接种连续传代9次，各代次鸡胚尿囊病毒液分别10倍连续梯度稀释100ul体积接种24孔板培养鸡胚原代细胞(CEF)，24h后荧光显微镜(LeicaDMIRES2)直接观察结果(见图5)，根据镜下表达强阳性绿色荧光蛋白的细胞数量，确定各代次rLaSota-GFP每毫升蚀斑形成单位(PFU)介于10⁹-10¹⁰之间(表1)。结果证明，rLaSota-GFP病毒在BHK-21细胞内的复制及插入外源报告基因GFP在传代过程中仍然能够保持稳定表达。

    表1传代中rLaSota-GFP的GFP的稳定表达

传代	HA滴度	PFU/ml	GFP表达
				F1F2F3F4F5F6F7F8F9	292821021121021028210212	8×1092×1094×10102×10108×1093×10104×1091×10102×109	+++++++++

        实施例4 rNDV在鸡胚的生长特性及致病特性

为确定反向遗传操作救获rLaSota-GFP的鸡胚生长特性及其对鸡胚的致病性，rLaSota-GFP病毒F1代尿囊病毒液按1×10⁴EID₅₀接种SPF鸡胚尿囊腔。1×10⁴EID₅₀接种后96小时内完全不致死SPF鸡胚。接种后24小时、48小时、72小时及96小时收获尿囊液，HA滴度平均值分别为2^7.5、2^10.3、2^11.3和2^11.6，而每毫升尿囊液EID₅₀则分别为10^-8.54、10^-8.635、10^-10.085和10^-9.43(图6)。按照OIE标准测定NDV LaSota疫苗亲本株和rLaSota-GFP脑内致病指数(ICPI)分别为为0.37和0.35。结果表明反向遗传操作救获病毒rLaSota-GFP仍然保持NDV LaSota疫苗亲本株在鸡胚的高滴度生长及低致死的生物学特性。

           实施例5诱导动物保护性抗体的免疫效果

为测定反向遗传操作救获rLaSota-GFP对SPF鸡雏的免疫原性，鸡胚扩增尿囊毒2×10⁶EID₅₀剂量经经滴鼻加点眼途径人工免疫12羽七日龄白色来亨SPF鸡雏(哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供)，另设非免疫组对照组8羽；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。3周以后翅静脉采血分离血清按常规检测NDV特异HI抗体。另外，在免疫后21天用强毒F48E9(获自哈尔滨兽医研究所)以10³EID₅₀剂量经滴鼻加点眼途径进行攻击，观察两周，统计发病与死亡情况。

实验结果：rLaSota-GFP尿囊病毒液F1代以2×10⁶EID₅₀剂量经滴鼻加点眼途径人工免疫七日龄白色来亨SPF鸡雏，免疫后观察3周，期间免疫组所有雏鸡无任何异常，饲料消耗及生长发育与非免疫对照组无明显差异。免疫后3周检测血清NDV特异HI抗体水平，全部介于2⁷-2⁹，平均为2^8.2(表2)。免疫组攻毒后未出现任何发病或死亡，完全保护(10/10)，同日龄非免疫对照组则全部发病死亡(0/4)(表3)。结果显示，rLaSota-GFP一次免疫雏鸡即可诱导高水平的保护性抗体反应，具有良好的免疫原性，并且保留低致病性LaSota疫苗株良好的安全性。

本研究采用稳定表达T7聚合酶的重组痘病毒^(9，10)，感染BHK-21细胞在转染细胞中转录全长基因组负链RNA，同时表达启动病毒复制所需的NP、P和L蛋白，取得了很高病毒拯救的效率。另外，转染细胞的培养基中加入蛋白酶也是救获病毒的必要条件。在鸡胚尿囊液中存在特殊的蛋白酶，可以特异将弱毒株的F0裂解成F1和F2，释放F1N端高度疏水的融合功能区域，是装配病毒粒子获得进一步的感染能力，而用于转染的BHK-21细胞中不存在相应蛋白酶，因此我们加入乙酰化胰蛋白酶(TPCK)来替代鸡胚尿囊液，以促进病毒粒子获得感染性。相反，在不加胰酶进行转染的情况下，我们未能成功救获病毒。

                   表2.重组NDV的免疫原性

^a剂量，2×10⁶EID_50. ^b接种后.核酸序列号.NDV LaSota疫苗株基因组全长cDNA序列(15186nt)GeneBank登录号：AY845400。

接种a	小鸡数量	接种龄	对NDV的血清HI效价：第19天b
				rLaSota-GFP	12345678910	7777777777	28282828272729292929
平均值	-	-	28.2

               表3.重组LaSota NDV免疫攻毒保护试验

组别	接种物*	剂量	血凝抑制价**	存活率***
					试验组对照组	rLaSota-GFPPBS	2×106EID50-	27.30	10/100/4

^*7日龄SPF雏鸡，经滴鼻点眼接种rLaSota-GFP(1×10⁶EID₅₀/只)。

^**翅下静脉采血，测定HI滴度，计算平均值。

^***免疫后三周，用NDV强毒经滴鼻和肌肉注射进行攻毒(1×10³EID₅₀/只)

本研究通过反向遗传操作系统拯救的表达GFP弱毒疫苗可在接种鸡胚内达到与亲本LaSota疫苗株相似的生长滴度，并且救获病毒以10³EID₅₀剂量尿囊腔内接种9-10日龄SPF鸡胚，96小时不致死鸡胚；接种后24、48、72及96小时尿囊液HA价分别为2^7.5、2^10.3、2^11.3和2^11.6，每毫升尿囊液EID₅₀则分别为10^-8.54、10^-8.635、10^-10.085和10^-9.43；免疫7日龄SPF雏鸡可诱导高水平的保护性抗体反应，免疫后19天抗体血清HI抗体滴度介于2^8-9，充分显示该本发明的反向遗传操作系统拯救的疫苗株作为活病毒载体疫苗应该具备的高度安全、良好鸡胚生长适应性及含有外源基因时良好的免疫原性。重组NDV活病毒载体疫苗生产成本低廉、使用极为方便，可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼给苗；由于呼吸道、消化道是NDV及其他多种重要疫病原的自然感染侵入途径，重组NDV活毒疫苗可诱导高水平的粘膜免疫反应，提供更为确实的有效免疫保护；NDV弱毒疫苗免疫在我国养禽业几乎是所有新生雏鸡必不可少的免疫程序，理所当然成为最具吸引力的重组活病毒疫苗载体。

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9.Angela Romer-Oberdorfer，Egbert Mundt，Teshome Mebatsion，Ursula J.Buchholz.1999.Generation of recombinant lentogenic Newcastledisease virus from cDNA.Journal of General Virology.80：2987-2995

10.B.P.H.Peeters，Y.K.Gruijthuijsen，O.S.de Leeuw，和A.L.J.Gielkens.2000.Genome replication of Newcastle disease virus：involvement ofthe rule-of-six.Archives of Virology.145：1829-1845

11.Z.Huang，S.Elankumaran，A.S.Yunus，和S.K.Samal.2004.ARecombinant Newcastle Disease Virus(NDV)Expressing VP2 Protein ofInfectious Bursal Disease Virus(IBDV)Protects against NDV and IBDV.Journal of General Virology.78：10054-10063

12.D.E.Swayne，D.L.Suarez，S.Schultz-Cherry，T.M.Tumpey，P.Palese，和A.Garcia-Sastre.2002.Recombinant Paramyxovirus Type 1-AvianInfluenza-H7 Virus as a Vaccine for Protection of Chickens Against Influenzaand Newcastle Disease.AVIAN DISEASES.47：1047-1050

13.Ines Engl-Herbert a，Ortrud Werner b，Jens P.Teifke c，TeshomeMebatsion d，Thomas C.Mettenleiter a，Angela Rmer-Oberdrfera.2002.Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressingthe green fluorescent protein.Journal of Virological Methods.108：19-28

14.殷震，刘景华.1997.动物病毒学(第二版)科学出版社.

Claims (4)

1.一种制备负链RNA病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(2)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获病毒，

其中所述转录质粒是包含外源标签基因GFP的质粒pBRN-FL-GFP3，其核苷酸序列如图10所示，

其中所述辅助质粒包括如下三个质粒：包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的质粒、包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列的质粒、和包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的质粒；

其中所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系。

2.根据权利要求1的方法，其中所述转录辅助质粒分别是质粒pBSNP，pBSP和pBSL，这三个质粒是将编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列分别克隆在pBluescript II(+/-)质粒T7启动子下游来构建的。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

4.根据权利要求1或2的方法制备的NDV LaSota疫苗株子代病毒rLaSota-GFP。

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