CN102816741A - 犬瘟热弱毒疫苗株f和h基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备疫苗/试剂盒中的应用。

Description

犬瘟热弱毒疫苗株F和H基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H或HA)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备疫苗/试剂盒中的应用。

背景技术

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染引起的急性、高度接触性传染病。该病不但可以感染犬科动物，还能感染鼬科、浣熊科和猫科等多种动物，发病率高，几乎可以达到100％，且临床症状多样，容易发生细菌、病毒的混合感染和继发二次感染，死亡率更是可高达80％，素有“毁灭性传染病”之称^[1]。近年来，Mee等从患Pagets疾病的病人组织中检测出犬瘟热病毒核酸^[2]，使得犬瘟热成为继狂犬病之后人畜共患的第二种疫病，引起了动物病毒学界及医学界的普遍关注。

犬瘟热病毒(canine distemp virus，CDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，为单股不分节段的负链RNA病毒，其基因组长15690bp，编码N、P、M、F、H、L和C蛋白。融合蛋白(fusion protein，F)，是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白，介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞间的融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力。研究发现虽然针对F蛋白的单抗不能完全中和CDV，但其诱导的免疫反应能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情况下抑制症状的发生^[3]。附着或血凝素蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein，H或HA)，是CDV囊膜表面上典型的II型糖蛋白，诱导机体产生中和抗体，是抗犬瘟热病毒免疫的主要抗原。抗犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体具有病毒中和活性，对试验鼠的保护力强于抗F蛋白的单克隆抗体^[4]。病毒通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，因此，H蛋白决定了犬瘟热病毒宿主的特异性，并协助F蛋白使犬瘟热病毒以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞^[5]。F、H是产生中和抗体的重要抗原之一，在病毒免疫中占有重要地位。

CD是可以预防的，主要通过给幼犬接种犬瘟热弱毒苗进行免疫，但由于母源抗体的存在会直接干扰免疫效果，常常导致免疫失败。因此研制不受犬只已有抗体干扰的疫苗产品迫在眉睫。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功拯救了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人为研制更安全有效、生产成本低廉的犬瘟热活载体疫苗，在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建出表达犬瘟热弱毒疫苗株Rockborn-20/8F或H蛋白的重组病毒rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H，通过Western-blot和免疫荧光试验验证犬瘟热融合蛋白和血凝素蛋白的正确表达，进行两株重组病毒的毒力检测，并通过对小鼠和犬的免疫试验对其免疫原性进行研究和评价。

因此，本发明的一个目的是提供一种表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中优选所述犬瘟热病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，优选所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

在一个实施方案中，所述编码所述犬瘟热病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示，和/或编码所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No.4所示。

在一个实施方案中，通过反向遗传操作技术在新城疫LaSota弱毒疫苗中表达所述犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)，优选用于表达所述犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。

在一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防犬瘟热和/或新城疫的疫苗中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种生产本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列，优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株，

其中优选所述犬瘟热病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，优选所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；更优选其中编码所述犬瘟热病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示，和/或编码所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No.4所示。

在一个实施方案中，所述转录质粒是pBRN-FL-F或pBRN-FL-H，和/或所述转录辅助质粒分别是质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备疫苗中的应用，所述疫苗用于受试者针对犬瘟热的加强免疫，优选所述受试者已经用犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫，更优选所述受试者选自由犬科动物、鼬科动物、浣熊科动物和猫科动物组成的组，最优选犬科动物，特别是犬。

本发明还有一个目的是提供一种用于预防犬瘟热和/或新城疫的试剂盒，其在相同或不同包装或容器中包括：(a)犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗；(b)根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H或它们的混合物；和任选地(c)使用说明书，优选(a)和(b)是在试剂盒中的不同包装或容器中，其中所述使用说明书指示(a)用于首次免疫，(b)用于加强免疫。

非复制性活载体疫苗-新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)只在禽源组织中复制，具有宿主限制性，被其表达的外源蛋白与其它哺乳动物病毒表达载体相比，具有较高的表达效率，而且生产成本低廉。NDV活载体疫苗不需佐剂即可诱导机体产生比较广泛的免疫，包括体液免疫和较强的细胞免疫，甚至粘膜免疫，是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。

本研究选用单股负链RNA病毒反向遗传操作系统-新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株为载体，构建了表达犬瘟热弱毒疫苗株Rockborn-20/8(CDV/R-20/8)F或H基因的重组NDV疫苗株，为研制和应用安全、有效、生产成本低廉的新型犬瘟热活载体疫苗及犬瘟热的防制奠定基础。

更具体地，本发明在现有技术已知的新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统(参见ZL200510097997.8)的基础上，构建了表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H。两重组株均与亲本株一致，具有高鸡胚生长滴度的特性和低致病性。重组株rLa-CDVR-F免疫犬在初免和加强免疫后其体内CDV中和抗体均≤2；接种rLa-CDVR-H或接种rLa-CDVR-F/H混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗体效价平均值为2，而二次免疫后，中和抗体效价在一周后平均值分别达到37.64和26.24；CDV弱毒疫苗Rockborn-20/8(CDV/R-20/8)接种组初次免疫一周中和抗体效价为19.69，经rLa-CDVR-F/H混合病毒液加强免疫后中和抗体平均值高达204.06。这一结果表明，重组疫苗株rLa-CDVR-H表达的H蛋白的免疫原性远远高于重组株rLa-CDVR-F表达的F蛋白，但F蛋白在抗体滴度的维持方面呈现一定作用。rLa-CDVR-F/H可不受CDV抗体干扰，免疫增强效果显著。这也为探寻新型犬瘟热重组活载体疫苗奠定了基础。

附图说明

图1.表达CDVR F或H的重组型NDV基因组全长cDNA的构建；

图2.激光共聚焦观察CDVR-F或CDVR-H蛋白在重组病毒感染细胞内的表达；

图3.Western-blot检测CDV F或H抗原在重组新城疫病毒感染细胞的表达；

图4.重组疫苗滴鼻及肌肉注射免疫小鼠诱导产生的抗体滴度；

图5.重组疫苗肌肉免疫犬诱导产生的病毒中和抗体滴度；

图6.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图7.质粒pBS-NP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图8.质粒pBS-P的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图9.质粒pBS-L的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列；

图10.质粒pBRN-FL-F的全序列；

图11.质粒pBRN-FL-H的全序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1 表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的构建和生物学活性

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞、病毒、重组质粒、鸡胚和实验动物：HEp-2细胞(ATCCCCL-23)和BHK-21细胞(ATCC CCL-10)，培养基为含10％胎牛血清DMEM；Vero-E6细胞由本实验室保存；稳定表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购于ATCC；NDV感染性克隆质粒pBRN-FL-PmeI以及辅助核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)和大聚合酶蛋白(pBS-L)重组质粒均由本实验室构建并保存^[6，7]，它们也可以根据ZL200510097997.8的说明书实施例1进行构建；重组新城疫弱毒疫苗株rLaSota^[6，7](其也可以根据ZL200510097997.8的说明书实施例1进行构建)和表达绿色荧光蛋白的重组犬瘟热病毒rCDVR-EGFP^[6，7]均由本实验室克隆，拯救并保存；犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8购自军事兽医研究所；鸡抗NDV、鼠抗CDV和犬抗CDV高免血清均由本研究室制备；新城疫血凝抑制试验(HI)诊断抗原由哈尔滨维科生物技术开发公司生产并提供；9～11日龄SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供；3周龄BALB/c小鼠(均为雌性)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；12周龄比格犬购自广州医药工业研究院。

1.1.2主要试剂和仪器：rTaq酶，Primer Star HS DNA Polymerase均购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自NEB公司；TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理的胰酶、FITC(异硫氰酸荧光素)标记的兔抗鸡IgG和山羊抗鼠IgG荧光抗体、TIRTC(罗丹明衍生物)标记山羊抗鼠IgG荧光抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体和兔抗鸡IgG抗体均购自Sigma公司；优化的无血清培养基opti-MEM、RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(M-MLV)试剂盒以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)均购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；胶回收试剂盒(Gel ExtractionMini Kit)及质粒小量提取试剂盒(Plasmid Mini Kit)均购自OMEGA公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；荧光显微镜为Leica DMIRB，购自Leica公司。

1.2CDV/R-20/8融合蛋白(F)和血凝蛋白(H或HA)基因的获取和序列分析

从GenBank获得CDV弱毒疫苗株Rockborn基因组F和H基因的开放阅读框(ORF)序列(F基因GenBank Accession No.AF026244.1；H基因GenBank Accession No.GU266280.1)，设计两对引物(见表1)，在上述两种上游引物起始密码子ATG前分别加入了基因起始、基因间隔、基因终止和利于真核表达的Kozak序列，并在上下游引物中引入Pme I限制酶识别序列，同时要保证重组病毒基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数。

将犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8按MOI约为1.0的病毒量接种于Vero-E6细胞中，72h后收获病毒液。Trizol法提取病毒液中的基因组RNA，利用上述两对成对的引物经RT-PCR方法分别获得F和H基因的PCR产物，经凝胶电泳回收后平端克隆到pBlueScrip II KS(+)载体的EcoR V位点，克隆产物分别命名为pBS-CDVR-F和pBS-CDVR-H，通过测序确保克隆的基因片段与病毒基因组DNA序列完全一致。

表1.表达F或HA基因的全长基因组克隆质粒构建所用引物

注：带下划线序列是F或H-特异性序列，限制性位点用粗体表示，Kozak序列用斜体表示，转录终止序列GE和转录起始序列Gs用加框表示。

1.3表达F或HA基因的重组病毒基因组全长cDNA的构建

质粒pBS-CDVR-F和pBS-CDVR-H分别经Pme I酶切处理后，回收CDVR-F或CDVR-H片段，并与同样经Pme I酶切去磷酸化的NDV感染性克隆质粒pBRN-FL-PmeI^[7]连接，分别构建成表达CDV/R-20/8F或H基因的重组基因组全长cDNA克隆，分别命名为pBRN-FL-F和pBRN-FL-H。

1.4重组病毒的拯救

BHK-21细胞接种于35mM六孔板内，当细胞生长达80％～90％单层时，按MOI约为0.01的病毒量接种表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3。vTF7-3预感染细胞1h后，利用磷酸钙转染试剂盒(Calcium PhosphateTransfection System)，将转录质粒pBRN-FL-F或pBRN-FL-H及辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L分别以每孔5μg、2.5μg、1.25μg、1.25μg共转染BHK-21细胞，具体拯救方法见参考文献^[7]。收获HA及HI实验^[7]结果均为阳性的尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别接种于9～11日龄鸡胚滴定每毫升病毒液EID₅₀含量。拯救出的重组病毒分别命名为rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H(在本文中有时也称为rLa-CDVR-HA)。

1.5重组病毒的RT-PCR鉴定

各取250μL重组病毒鸡胚接种尿囊液，用Trizol经常规方法提取病毒基因组RNA。分别以CDVR-F-PF和pBRN-8306-PR(5′-GACTGCATTCACTGATGAG-3′)或CDVR-H-PF和pBRN-8306-PR为引物，参照文献^[8]中所述进行RT-PCR扩增，对扩增的PCR产物进行测序和序列分析。

1.6激光共聚焦检测F或HA蛋白的表达

将rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H和rCDV/R-20/8病毒液按MOI约为1.0感染BHK-21细胞，24h后3％多聚甲醛固定20min。1xPBST洗3x5min后，依次以1∶50稀释的鼠抗CDV高免血清和鸡抗NDV高免血清为一抗孵育1h，再依次以1∶200稀释TIRTC标记山羊抗鼠IgG和FITC标记的兔抗鸡IgG荧光抗体为二抗孵育1h。PBST洗涤完毕后，加入DAPI(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，购自sigma)对细胞进行染核处理。使用激光共聚焦显微镜对处理完毕的样品进行观察并拍照。

1.7Western-Blot检测F或H抗原表达

将rLaSota、rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H和rCDV/R-20/8病毒液按MOI为5.0感染单层BHK-21细胞，24h后将5％DMEM换成优化培养基opti-MEM，同时每孔加入8μL的TPCK(0.25μg/μL)。待80％～90％细胞脱落后离心收集细胞，用细胞裂解液裂解后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电转印，5％脱脂乳封闭过夜。一抗为1∶100稀释的犬抗CDV高免血清检测F蛋白和H蛋白。二抗为1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗犬IgG。DAB(二氨基联苯胺)显色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色3～5min后去离子水终止反应，观察结果。同时设空白BHK-21细胞为阴性对照。

2结果

2.1表达F或H基因的重组病毒基因组全长cDNA的构建和重组病毒的拯救

在新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统基础上，利用PCR手段在CDV/R-20/8株F或H基因两端引入转录调控GE、GS序列和Pme I酶切位点后，插入同样经Pme I酶切处理的NDV感染性克隆pBRN-FL-PmeI，分别构建成表达犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8F或H基因的重组NDVcDNA克隆pBRN-FL-F，pBRN-FL-H(如图1所示)。以CDVR-F-PF或CDVR-H-PF分别和pBRN-8306-PR(5′-GACTGCATTCACTGATGAG-3′)为引物，利用PCR方法扩增出2495bp和2333bp的产物与预期结果相符，经测序鉴定已证实插入NDV全长cNDA克隆的片段大小和方向均正确。

为了从克隆的cDNA中拯救出感染性重组病毒，分别以pBRN-FL-F或pBRN-FL-H与表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。休克、换液72h后，收获细胞培养上清转接于9～11日龄的SPF鸡胚，继续培养5天后收获血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验结果阳性的尿囊液作为拯救病毒的F1代。病毒样品经SPF鸡胚连续传代3次后，提取病毒液RNA，进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F3代重组病毒基因组的预期位点正确插入了CDV/R-20/8株F或H基因及其引入的转录调控序列。以上结果表明，通过反向遗传操作技术，利用NDV LaSota疫苗株基因组cDNA克隆成功救获了具有感染性的重组子代病毒rLa-CDVR-F株和rLa-CDVR-H株。

2.2共聚焦检测检测F或H蛋白表达

为能更直观地观察重组病毒在细胞内F或H蛋白表达量和锚定的位置，将亲本株rLaSota(即通过反向遗传操作技术由AV1615获得的疫苗株)和重组株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H，rCDV/R-20/8分别感染BHK-21细胞24h后固定，以鸡抗NDV高免血清和鼠抗CDV高免血清为一抗，FITC标记的兔抗鸡IgG和TIRTC标记山羊抗鼠IgG荧光抗体为二抗，DAPI染核处理制备共聚焦样品。通过激光共聚焦观察到亲本株rLaSota感染的细胞内只有NDV蛋白表达(图2，B，C)；在重组株rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H感染的BHK-21细胞中有NDV和CDV两类蛋白，且犬瘟热病毒的两种糖蛋白F和H均位于宿主细胞膜上(图2，G，K)，而重组病毒rCDV/R-20/8感染的细胞内只有CDV蛋白表达(图2，N，O)。结果显示重组病毒表达了F或H蛋白。

2.3Western-Blot检测F或H蛋白表达

将重组病毒株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H和亲本株rLaSota分别感染的BHK-21细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳，转印至尼龙膜后，以重组疫苗株rCDV/R-20/8免疫制备的犬高免血清为一抗、HRP-标记的兔抗犬IgG为二抗，进行Western-blot检测。图3d中显示分子量为60kDa的多肽与重组毒rLa-CDVR-F感染细胞所表达的F0前体蛋白大小相一致。重组病毒rLa-CDVR-H感染的BHK-21细胞中检测到一种85kDa的多肽(图3e)，这与完全糖基化的犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的大小相一致。在亲本株rLaSota感染组(图3b)和空白(图3c)BHK-21细胞中均未检测到CDVR-F和H的特异性产物。这些结果显示犬瘟热病毒F和H抗原分别在重组新城疫病毒感染细胞中获得了正确表达。

实施例2 重组病毒的致病性试验、对小鼠的免疫保护试验和对犬的免疫试验

1.材料与方法

1.1重组病毒的致病性试验

按O.I.E标准方法^[9]对重组病毒rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H F3代进行平均鸡胚致死时间(MDT)、脑内致死指数(ICPI)及静脉内致病指数(IVPI)等致病性指标测定。

1.2重组病毒对小鼠的免疫试验

将4周龄雌性BALB/c小鼠分为四组，每组15只，重组株rLa-CDVR-F，重组株rLa-CDVR-H，rLa-CDVR-F/H混合病毒液(1∶1)以约10^8.5EID₅₀/100μL剂量(半数鸡胚感染量(EID₅₀))经滴鼻和肌注两种途径分别免疫，每只130μL，第四组为正常对照组，采用相同方式免疫亲本株rLaSota。免疫28天后重组病毒均以相同剂量和相同途径加强免疫小鼠。初次和加强免疫14天后小鼠眼眶后静脉丛取血。由于分离的血清量较少不足以进行中和抗体检测，因此采用间接ELISA试验进行抗体滴定。

通过间接ELISA方阵试验确定纯化的rCDV/R-20/8最适抗原包被浓度为5μg/mL后，以此浓度包被96孔ELISA板，4℃过夜放置。次日取出用1％BSA室温封闭1h后，加入待检血清和阴、阳性血清进行倍比稀释，于25℃放置1h，随后以1∶4000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗进行间接ELISA检测。

1.3重组病毒对犬的免疫试验

分别将重组疫苗株rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H及rLa-CDVR-F/H混合病毒液以2x10^9.5EID₅₀的剂量经肌肉注射接种于12周龄比格犬各5只，同时取犬瘟热弱毒疫苗株Rockborn-20/8(CDV/R-20/8)免疫同龄比格犬5只作为对照。免疫后第四周以rLa-CDVR-F/H混合病毒液对所有免疫组进行加强免疫。采集免疫后一周的犬前臂静脉血，分离血清进行荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测。

血清样品首先经56℃水浴灭活补体，随后将连续4倍至128倍倍比稀释好的血清与含100个TCID₅₀(半数组织感染量)的rCDVR-EGFP病毒等体积混合，37℃孵育1h后每孔加入100μL Vero-E6细胞悬液。每个样品作4个重复，同时设阳性、阴性血清对照。感染72h后用荧光显微镜观察结果。被检血清的病毒中和抗体(virus neutralize antibody，VNA)滴度为能保护50％细胞孔不出现病变的血清最高倍数。

2结果

2.1重组病毒的致病性分析

重组病毒株rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H F3代的半数鸡胚感染量(EID₅₀)分别为10^8.5/0.1mL和10^8.67/0.1mL；鸡胚平均致死时间分别为130.8h和135.2h，远远大于90h，属于温和或缓发型毒株。该结果表明重组株保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性。

2.2重组病毒对小鼠的免疫保护试验

分别将亲本毒rLaSota，重组病毒rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H(即rLa-CDVR-HA)和混合病毒液rLa-CDVR-F/H(即rLa-CDVR-F+HA)经滴鼻和肌注两种途径免疫4周龄的BALB/c小鼠，免疫四周后以相同方式进行加强。对采集的血清样品利用间接ELISA试验方法检测抗体滴度。结果显示，初免和加强免疫后重组株rLa-CDVR-F与亲本株rLaSota所免疫血清OD值均为阴性值，未检测到抗体；而重组株rLa-CDVR-H和混合免疫组rLa-CDVR-F/H初免两周后抗体浓度分别为2.05μg/mL和1.91μg/mL；加强免疫两周后抗体滴度显著增加，分别达到58.87μg/mL和44.76μg/mL(如图4所示)。

2.3重组病毒对犬的免疫试验

将重组弱毒疫苗株rLa-CDVR-F，rLa-CDVR-H、rLa-CDVR-F/H混合病毒液以及Rockborn-20/8(CDV/R-20/8)分别接种12周龄比格犬。并于初次免疫后4周用rLa-CDVR-F/H混合病毒液进行加强免疫。通过中和试验对所采集血样的中和抗体滴度(virus neutralize antibody，VNA)进行检测。结果显示，重组株rLa-CDVR-F免疫犬在初免和加强免疫后其体内CDV中和抗体均≤2；接种rLa-CDVR-H或接种rLa-CDVR-F/H混合病毒液的免疫犬在初免后一周的CDV中和抗体效价平均值为2，而进行二次免疫后，抗体滴度显著升高，产生的中和抗体效价在一周后平均值分别达到37.64和26.24；Rockborn-20/8(CDV/R-20/8)接种组初次免疫一周中和抗体效价为19.69，经rLa-CDVR-F/H混合病毒液加强免疫后中和抗体平均值高达204.06(图5)。

3.讨论

犬瘟热呈世界性分布，敏感宿主范围广，而且可在大量不相关的动物种类中进行种间传播，因此免疫接种预防犬瘟热病毒感染具有重要的公共卫生意义。目前，国内外常用疫苗主要分为灭活苗和弱毒疫苗两种，CDV灭活苗因免疫原性差，生产成本高而逐渐被弱毒疫苗、尤其联苗取代。国内常用的犬瘟热弱毒疫苗为鸡胚成纤维细胞源弱毒株(Ondersteppot)和犬细胞培养适应毒株(Rockborn)，犬瘟热弱毒疫苗虽然非常有效，但其本身易受母源抗体干扰，而且CDV弱毒疫苗对温度敏感、热稳定性差，对于疫苗的运输和保存条件要求很高。此外CDV弱毒疫苗对部分免疫缺陷犬和野生食肉动物不安全，易出现变态反应等问题。因此，寻求更安全有效、生产成本低廉的新型疫苗已经成为当前国内外学者的研究热点。Norrby等用单抗亲和层析方法纯化CDV的H、F蛋白抗原接种犬^[10]，这种基因工程亚单位疫苗虽然呈现较好的免疫原性，但其生产成本高。Cherpillod P etal(2000)^[11]将CDV强毒株A75/17的F、H、N基因克隆进真核表达载体pCI，构建了pCI-N、pCI-F、pCI-H三种质粒，混合肌注免疫犬，三次免疫后四周攻强毒发现，该DNA疫苗对免疫犬提供了保护力。但由于其存在安全隐患而未得到推广。

以活病毒作为载体表达外源基因能够最大程度接近编码蛋白的天然状态，保持蛋白的抗原性，并可激发细胞免疫、体液免疫和局部粘膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式。本研究中，我们以负链RNA病毒反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS)成功建立的新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株作为活病毒表达载体。由于新城疫病毒活载体疫苗在哺乳动物中不能进行有效复制，便不会造成病毒在免疫个体中或未免疫群体及整个环境的交叉传播，这一特性表明其具有很高的安全性。而且其作为活载体疫苗的有效性和安全性也已在灵长实验动物获得证实，被国际学术界认为是防治重大烈性紧急传染病极有希望的安全、有效活病毒疫苗载体。Ge JY^[12]等已采用此NDV载体表达了狂犬病病毒ERA株的糖蛋白基因，免疫鼠和犬后，不仅表现出安全性，而且能够有效持久地保护动物抵抗狂犬病毒的攻击。我们采用同样的策略，分别构建了表达犬瘟热弱毒疫苗株Rockborn(CDVR)-20/8的融合蛋白(F)或血凝素蛋白(H)的重组新城疫病毒rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H，经Western-blot和免疫荧光试验验证插入的外源蛋白能正确表达并发挥其相应的生物学功能。

很多研究证实，麻疹病毒属的融合蛋白具有很低的免疫原性。虽然Malvoisin和Wild(1990)^[13]已经证明了具有中和活性的抗F单抗能被分离到，但是一直以来都认为在体外试验中融合抗体只具有很低的中和活性。1992年，Taylor等^[14，15]采用CPV和VV载体分别重组了MV的H、F基因，通过动物实验也证实了不论是接种CP-MVF重组疫苗还是接种VV-MVF重组疫苗的犬体内均未诱导产生MV中和抗体。这与本研究中免疫了重组株rLa-CDVR-F的小鼠和犬体内均未产生中和抗体的试验结果相一致。免疫试验中通过对犬体内中和抗体的持续检测发现，共同免疫了rLa-CDVR-F/H比单独免疫rLa-CDVR-H的犬体内中和抗体下降缓慢。这也表明犬瘟热的融合蛋白在维持抗体滴度方面呈现一定的作用。

犬瘟热的血凝素蛋白具有较高的免疫原性，我们研究发现，免疫了重组株rLa-CDVR-H或共同免疫了rLa-CDVR-F/H的小鼠一次免疫就能诱导产生与对照组有显著差异的IgG抗体；而免疫犬在初免后虽然中和抗体滴度很低，但进行二次免疫后，抗体滴度大幅提高。这也与Taylor等学者的研究结果相一致。但是免疫犬只在再次接种后一周抗体滴度显著升高，但二周后迅速下降，抗体持续周期较短(数据未显示)，这一特点与CDV弱毒疫苗免疫极其相似；因此，二次或多次加强免疫，对诱导高水平的免疫反应并维持长时间的有效保护反应具有极为重要意义。但考虑到CDV抗体对CDV弱毒疫苗的干扰作用，CDV弱毒疫苗多次加强免疫可能导致免疫失败，因此，在CDV弱毒疫苗首次免疫的基础上，本实验采用rLa-CDVR-F/H对Rockborn(CDVR)-20/8免疫组进行加强免疫，加强后一周的中和抗体滴度高达204，加强效果非常显著。

重组活载体疫苗rLa-CDVR-F和rLa-CDVR-H平均每毫升鸡胚接种尿囊液病毒滴度可达10^9.5EID₅₀/mL，对温度不敏感，冻干疫苗产品可常温运输不会导致疫苗滴度下降；鸡胚接种的生产成本低远远低于CDV弱毒疫苗，操作简单便于大规模生产；NDV活载体疫苗经实验验证对哺乳动物呈一过性感染，不会在哺乳动物体内进行扩散，相比较于CDV弱毒疫苗具有更高的安全性，尤其对于水貂等经济动物安全性尤为重要。此项研究为进一步探索犬瘟热重组活病毒疫苗的应用奠定了基础，重组活载体疫苗有望部分取代传统CDV弱毒疫苗成为防制犬瘟热更廉价、安全的新型重组基因工程活载体疫苗。

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Claims (10)

1.一种表达犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中优选所述犬瘟热病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，优选所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中编码所述犬瘟热病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示，和/或编码所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1或2的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中通过反向遗传操作技术在新城疫LaSota弱毒疫苗中表达所述犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)，优选用于表达所述犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615。

4.根据权利要求1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rLa-CDVR-F或rLa-CDVR-H。

5.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防犬瘟热和/或新城疫的疫苗中的应用。

6.一种生产权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码犬瘟热病毒融合蛋白(F)或犬瘟热病毒血凝素蛋白(H)的基因的新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列，优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；和

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救重组病毒株，

其中优选所述犬瘟热病毒融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，优选所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；更优选其中编码所述犬瘟热病毒融合蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示，和/或编码所述犬瘟热病毒血凝素蛋白的基因的序列如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求6的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-F或pBRN-FL-H，和/或所述转录辅助质粒分别是质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L。

8.根据权利要求6-7中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

9.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备疫苗中的应用，所述疫苗用于受试者针对犬瘟热的加强免疫，优选所述受试者已经用犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗首次免疫，更优选所述受试者选自由犬科动物、鼬科动物、浣熊科动物和猫科动物组成的组，最优选犬科动物，特别是犬；还优选所述疫苗是通过滴鼻或肌肉注射对所述受试者进行免疫。

10.用于预防犬瘟热和/或新城疫的试剂盒，其在相同或不同包装或容器中包括：(a)犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗；(b)根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rLa-CDVR-F、rLa-CDVR-H或它们的混合物；和任选地(c)使用说明书，优选(a)和(b)是在试剂盒中的不同包装或容器中，其中所述使用说明书指示(a)用于首次免疫，(b)用于加强免疫。

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