CN103981202A - 一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 - Google Patents
一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103981202A CN103981202A CN201410257546.5A CN201410257546A CN103981202A CN 103981202 A CN103981202 A CN 103981202A CN 201410257546 A CN201410257546 A CN 201410257546A CN 103981202 A CN103981202 A CN 103981202A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- plasmid
- primer
- primers
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明的目的是提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，本发明中引物设计充分考虑到在构建质粒FA、FB和FC时要保证各段基因开放阅读框的完整性，尤其是质粒FB含有完整H基因和F基因，H和F基因是CDV主演的研究内容，对毒力和免疫原性有重要影响，质粒FB的构建为本发明在以后使用中对CDV主要研究内容的基因操作提供了便利，此外个各引物和酶切位点的选择也是基于这方面的考虑，可以将各主要基因片段完整酶切替换等基因克隆操作。总之，本方法中通过间质粒FA、FB和FC的构建相比有方法大量减少了基因克隆的次数，位后期不同目的用途提供了便利条件。
Description
技术领域
本发明属于病源微生物基因组学研究技术领域，具体涉及一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法。
背景技术
犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染引起的，具有高度接触性、致死性的急性败血症。CDV在副粘病毒家族中与麻疹病毒、牛瘟病毒同属麻疹病毒属，是副粘病毒科中一个血清学上密切相关的属，宿主特异性却各自不相同。犬瘟热病毒感染犬可导致隐性感染，有肠道症状，或有呼吸道症状，有时伴有中枢神经系统症状。神经症状也可能是犬瘟热感染的晚期表现。
犬瘟热病毒基因组是不分节段RNA病毒全长15690bp，在自然界分离的病毒基因长度上存在高度一致性，并遵循六碱基原则。其3’-端和5’-端分别是先导序列和尾随序列，它们在调节基因复制和转录中起作用，5’-端的非编码区可能含有核衣壳化起始位点和编码反基因3’-端复制启动子。犬瘟热病毒自3’-端至5’-端非重叠方式表达6个结构蛋白分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)、磷蛋白(Phosphoprotein,PP)、基质蛋白(Matrixprotein,MP)、融合蛋白(Fusion protein,FP)、血凝素蛋白(Haemagglutininprotein,HP)和大蛋白(RNA-dependent RNA-polymerase protein,LP)
反向遗传学技术已广泛应用于病毒学研究的各个领域，极大地推动了病毒学基础与应用研究的快速发展。病毒反向遗传操作系统借助真核质粒使载体上的病毒cNDA在细胞内产生有活性的DNA/RNA片段，通常DNA和一部分RNA具有感染性可以产生病毒，另外一些RNA病毒需要病毒蛋白结合产生病毒。
在早期的CDV拯救系统使用能够产生RNA聚合酶的拯救细胞或表达RNA聚合酶痘病毒感染，载体含有T7RNA聚合酶启动子来产生病毒RNA。随着技术发展和研究深入，犬瘟热病毒广泛采用的拯救系统主要使用真核表达载体，两端分别加丁型肝炎核酶(Hdv Rz)和锤头核酶(Ham Rz)的全基因，再构建表达N、P和L蛋白的辅助质粒，共转染细胞以后产生核糖核蛋白复合物(RNP)进入细胞复制周期，产生CDV。这一方法首先在狂犬病毒上应用，这是首个应用此方法的负链RNA病毒，随后广泛用于其它负链RNA病毒，如正粘病毒、副粘病毒等。但副粘病毒科基因长度较长，通常在15k左右，所以随后的CDV拯救都是分6-10段扩增病毒基因片段逐段连接。例如GASSEN(Establishment of a Rescue System for Canine DistemperVirus)在2000文章中方法为例，作者选择12个酶切位点分11个片段扩增CDV基因包含两段核酶序列连接如T载体，然后逐段酶切连接入pEMC或pBS SK II载体，该方法构建感染性克隆需要进行11次亚克隆以获得完整基因。，极易在构建的过程中发生错误，且耗时长导致效率低下。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，本发明的方法可以快速的构建CDV感染性克隆，方便后期操作，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，包括如下的步骤：
1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：
| 引物名称 | 引物序列 | 序列表顺序 |
| F1f | 5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAT-3’ | SEQ ID NO:1 |
| F1r | 5’-AGTAAGCATCCTCATCTTGG-3’ | SEQ ID NO:2 |
| F2f | 5’-ATGAGGATGCTTACTAAGATGC-3’ | SEQ ID NO:3 |
| F2r | 5’-TGGATCTATTACTCTGACTTGG-3’ | SEQ ID NO:4 |
| F3f | 5’-AGAGTAATAGATCCAGGACTCG-3’ | SEQ ID NO:5 |
| F3r | 5’-AGGCACCACAGGACTAAC-3’ | SEQ ID NO:6 |
| F4f | 5’-CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT-3’ | SEQ ID NO:7 |
| F4r | 5’-ATCATATCACCTCCAGAGTATC-3’ | SEQ ID NO:8 |
| F5f | 5’-AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’ | SEQ ID NO:9 |
| F5r | 5’-GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT-3’ | SEQ ID NO:10 |
| F6f | 5’-ATGCTGACCGCTACCTCAGAC-3’ | SEQ ID NO:11 |
| F6r | 5’-GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’ | SEQ ID NO:12 |
| F7f | 5’-TAACATCGCCAACTCTACAACCA-3’ | SEQ ID NO:13 |
| F7R | 5’-CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA-3’ | SEQ ID NO:14 |
| F8f | 5’-TGATACTGCTATGGCAATTG-3’ | SEQ ID NO:15 |
| F8r | 5’-TCATCCGTAATTCCTCAAGT-3’ | SEQ ID NO:16 |
| F9f | 5’-GAGGAATTACGGATGATTACCC-3’ | SEQ ID NO:17 |
| F9r | 5’-ACCAGACAAAGCTGGGTATGA-3’ | SEQ ID NO:18 |
以提取的病毒核酸反转录产物为模板，使用引物F1f和F1r扩增得到片段F1；引物F2f和F2r扩增得到片段F2；引物F3f和F3r扩增得到片段F3；引物F4f和F4r扩增得到片段F4；引物F5f和F5r扩增得到片段F5；引物F6f和F6r扩增得到片段F6；引物F7f和F7r扩增得到片段F7；引物F8f和F8r扩增得到片段F8；引物F9f和F9r扩增得到片段F9；所有产物连接T载体得到F1～F9质粒；
2)使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物，以F1质粒为模板，扩增得到Ham Rz+F1片段，将Ham Rz+F1片段连接到T载体得到质粒HamRz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物，以F9质粒为模板，通过前后两轮PCR得到F9+HDV Rz片段，连接到T载体得到质粒F9+HDV Rz；
3)用引物Infusion_P1和F1r，以质粒Ham Rz+F1为模板；用引物F2f和F2r，质粒F2为模板；用引物F3f和Infusion_P2，质粒F3为模板进行扩增；三个产物依次连接入T载体为FA质粒；
引物Infusion_P3和F4r以质粒F4为模板的PCR产物；引物F5f和Infusion_P4以质粒F5为模板的PCR产物，二个产物接入T载体为FB(-)质粒，然后将质粒FB(-)和质粒F4经过Sac I和Hpa I双酶切后连接为质粒FB(+)；质粒FB(+)和质粒F7经过Nco I和Hind III双酶切连接成为片段质粒FB；
引物Infusion_P5和F8r以质粒F8为模板的PCR产物；引物F9f和Infusion_P6以质粒F9+HDV Rz为模板的PCR产物连接入T载体为FC质粒。
| 引物名称 | 引物序列 | 序列表顺序 |
| Infusion_P1 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG-3’ | SEQ ID NO:22 |
| Infusion_P2 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC-3’ | SEQ ID NO:23 |
| Infusion_P3 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’ | SEQ ID NO:24 |
| Infusion_P4 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’ | SEQ ID NO:25 |
| Infusion_P5 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG-3’ | SEQ ID NO:26 |
| Infusion_P6 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT-3’ | SEQ ID NO:27 |
4)将序列为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的Oligo DNA溶解后退火形成双链，然后将pVAX1载体用NheI和ApaI双酶切后胶回收，与双链连接形成载体pVAX2；
5)然后将片段FA、FB和FC酶切，再依次连入载体pVAX2得到CDV全基因组感染性克隆pVAX-rCDV。
本发明还提供一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，包括如下的步骤
1)用引物N-f、N-r扩增片段N、用引物P-f、P-r扩增片段P和用引物L-f、L-r扩增片段L，双酶切连入pVAX2构成辅助质粒pVAX-N、pVAX-P和pVAX-L；其中引物的序列信息如下：
2)辅助质粒验证：用Leader-f、Leader-r、EGFP-f、EGFP-r、Tailer-f和Tailer-r引物分别扩增CDV基因5′端Leader+N基因GS序列、L基因GE序列和3′端Tailer序列，从pIRES2-EGFP扩增增强型绿色荧光蛋白基因开放阅读框，经过两轮连接PCR连接成LET片段，再反向连入pVAX1载体，为pVAX-LET，与复制质粒共转染BHK细胞，24-48h后观察荧光情况；筛选出目的重组细胞；所使用的引物序列如下
本发明特点是在构建感染性克隆时使用分级连接方法，相对现行方法有明显优势。一、用时间短；二、减少亚克隆次数；三、酶切位点限制小；四、方便后期基因操作。
新方法用分级链接方法，先将相邻几个PCR扩增片段链接到一个克隆载体上构建三个CDV基因质粒的亚克隆，依次链接入载体，相比传统方法，本发明可同时进行多个中间克隆质粒的酶切和连接，对于多片段的连入同一个质粒可一次完成，极高的提高链接效率，节省时间。
本方法在构建感染性克隆前的亚克隆，FA、FB和FC三个质粒的存在为以后的研究和操作提供了较小容易操作的高拷贝质粒，质粒较小，相比pVAX-rCDV可使用的限制性内切酶种类多，在感受态中拷贝数高，复制快。
另外，构建一个可用于检测辅助质粒表达蛋白RNA聚合酶活性的犬瘟热病毒微型基因组。该微型基因组载体中含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因,同辅助质粒一同转让BHK细胞通过EGFP是否表达判断辅助质粒功能。
附图说明
图1：犬瘟热CDV3全基因扩增结果电泳图；
其中泳道M:DL5000DNA marker(TaKaRa,Dalian,China)5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1:1607bp、2:1959bp、3:1769bp、4:2029bp、5:2457bp、6:2034bp、7:1577bp、8:3107bp、9:2848bp；
图2：FA质粒构建示意图；
图3：F3质粒构建示意图；
图4：FC质粒构建示意图；
图5：pVAX-CDV质粒构建示意图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
一、CDV3全基因的扩增
1、引物设计
根据Gene Bank中CDV3(GenBank:EU726268.1)序列使用Primer5.0设计9对引物(表1)，其中部分相邻片段PCR扩增引物按照PCRCloning System说明书要求设计。
表1：CDV基因扩增引物序列信息
| 引物名称 | 引物序列 | 序列表顺序 |
| F1f | 5’-ACCAGACAAAGTTGGCTAT-3’ | SEQ ID NO:1 |
| F1r | 5’-AGTAAGCATCCTCATCTTGG-3’ | SEQ ID NO:2 |
| F2f | 5’-ATGAGGATGCTTACTAAGATGC-3’ | SEQ ID NO:3 |
| F2r | 5’-TGGATCTATTACTCTGACTTGG-3’ | SEQ ID NO:4 |
| F3f | 5’-AGAGTAATAGATCCAGGACTCG-3’ | SEQ ID NO:5 |
| F3r | 5’-AGGCACCACAGGACTAAC-3’ | SEQ ID NO:6 |
| F4f | 5’-CGAGCTCCGCTTCTAGGAATCTCACTT-3’ | SEQ ID NO:7 |
| F4r | 5’-ATCATATCACCTCCAGAGTATC-3’ | SEQ ID NO:8 |
| F5f | 5’-AGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’ | SEQ ID NO:9 |
| F5r | 5’-GGTAGCGGTCAGCATATTGATTATCT-3’ | SEQ ID NO:10 |
| F6f | 5’-ATGCTGACCGCTACCTCAGAC-3’ | SEQ ID NO:11 |
| F6r | 5’-GCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’ | SEQ ID NO:12 |
| F7f | 5’-TAACATCGCCAACTCTACAACCA-3’ | SEQ ID NO:13 |
| F7R | 5’-CCAAGCTTCACTGTCTAGGCTAAGAGGCATAA-3’ | SEQ ID NO:14 |
| F8f | 5’-TGATACTGCTATGGCAATTG-3’ | SEQ ID NO:15 |
| F8r | 5’-TCATCCGTAATTCCTCAAGT-3’ | SEQ ID NO:16 |
| F9f | 5’-GAGGAATTACGGATGATTACCC-3’ | SEQ ID NO:17 |
| F9r | 5’-ACCAGACAAAGCTGGGTATGA-3’ | SEQ ID NO:18 |
注：斜体字为酶切位点，f代表正向引物，r代表反向引物
2、CDV3全基因扩增
提取CDV3核酸，使用表1中引物F1f、F4f和F8f，PrimeScriptTMReverseTranscriptase进行反转录获得cDNA，反转录体系为：
反应条件为42℃30min，-20℃保存备用。
使用上一步中反转录产物为模板PCR扩增，引物见表1，使用HS DNA Polymerase，反应体系为：
PCR反应条件为：
PCR产物经1％琼脂糖电泳25min后胶回收，链接T载体制成质粒F1～F9。
二、犬瘟热基因质粒FA、FB和FC构建
1引物设计
合成含有锤头核酶Ham Rz和丁型肝炎核酶HDV Rz的引物，并分别在核酶序列最外侧引入NotI和ApaI限制性内切酶位点(表2)；按照PCR Cloning System说明书要求设计中间质粒连接质粒引物(表3)；人工合成两条DNA寡聚核普酸单链(表4)。
表2：核酶引物信息
表3：In-Fusion连接引物信息
| 引物名称 | 引物序列 | 序列表顺序 |
| Infusion_P1 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCGCGGCCGCTTGTCTGGTCTG-3’ | SEQ ID NO:22 |
| Infusion_P2 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCAGGCACCACAGGACTAAC-3’ | SEQ ID NO:23 |
| Infusion_P3 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCAGTCCTGTGGTGCCTCGGAAT-3’ | SEQ ID NO:24 |
| Infusion_P4 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCGCCATAGCAGTATCAGTCATTAGCC-3’ | SEQ ID NO:25 |
| Infusion_P5 | 5’-GGATCCTCTAGAGATATCTGATACTGCTATGGCAATTG-3’ | SEQ ID NO:26 |
| Infusion_P6 | 5’-CTGCAGGTCGACGATATCGGGCCCCGCCCTCCCT-3’ | SEQ ID NO:27 |
注：下划线位19-T载体末端重复序列
表4：pVAX1载体多克隆微点改造序列信息
2.病毒基因3’端和5’端加入核酶序列
使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物(表2，表1)以F1质粒为模板PCR，在片段上游加入Ham Rz序列，为Ham Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物(表1，表2)，以F9质粒为模板PCR，通过两轮PCR在片段下游引入HDV Rz序列，为F9+HDV Rz。
HS DNA Polymerase反应体系为：
PCR反应条件为：
PCR产物经1％琼脂糖电泳25min后胶回收，链接T载体为质粒Ham Rz+F1和质粒F9+HDV Rz。
3.中间质粒的构建
表5：用于扩增构建中间质粒片段的引物和模板
按照表5中的引物和模板PCR使用HS DNA Polymerase扩增片段，反应体系和反应条件同上。PCR产物胶回收，参照PCR Cloning System说明书要求在Clontech网站http://bioinfo.clontech.com/infusion/中用Molar Ratio Calculator工具计算连入pMD19-T时外源基因用量，基因片段在连接体系中含量见表6。
表6：PCR Cloning System连接体系中各基因片段与载体用量
连接体系为：
连接反应条件为：50℃保温15min，获得质粒FA、FB(-)和FC。
将FB(-)和F4质粒分别双酶切，酶切反应体系如下：
酶切反应条件为37℃2h。酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收FB(-)和F4，连接胶回收产物，连接体系为：
获得质粒FB(+)，质粒FB(+)和F7分别双酶切，酶切反应体系如下：
酶切反应条件为37℃2h。酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收FB(+)和F7，连接胶回收产物。阳性菌液提取质粒，操作方法同上,获得质粒FB。
4.pVAX1酶切位点改造
表4两条单链寡核苷酸去离子水溶解，体积1：1混合后沸水浴5min，室温冷却后为含有酶切微点NheI、NotI、HindIII、swaI和ApaI的Linker。pVAX1用NheI和ApaI双酶切，酶切体系如下：
反应条件37℃2h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收pVAX1片段。pVAX1与Linker连接，体系如下：
4℃连接过夜，转化感受态细胞，pVAX1更新酶切位点为pVAX-m。
5.CDV全基因连接
FA和pVAX-m质粒分别双酶切，体系如下：
反应条件37℃2h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收FA与pVAX-m片段。FA与pVAX-m片段连接，体系如下：
4℃连接过夜，转化感受态细胞，获得质粒pVAX+A。pVAX+A与FB分别双酶切体系如下：
反应条件30℃1h后37℃1h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收pVAX+A与FB片段。pVAX+A与FB片段连接，体系如下：
4℃连接过夜，转化感受态细胞，获得阳性质粒为pVAX+A+B。pVAX+A+B与FC分别先后经过SwaI和ApaI两次单酶切体系如下：
第一次酶切：
第二次酶切：
反应条件均为37℃2h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收pVAX+A+B与FC片段。pVAX+A+B与FC片段连接，体系如下：
4℃连接过夜，转化感受态细胞，获得阳性质粒为pVAX-rCDV。
pVAX-rCDV、pVAX-N、pVAX-P和pVAX-L按比例转染BHK细胞，24-48小时后细胞刮刮下细胞与VERO细胞共培养48-96小时后收毒。
三、辅助质粒与微基因组构建
1.引物设计与合成
表7：辅助质粒基因扩增引物序列信息
表8：微型基因组构建引物信息
2.N、P和L基因ORF扩增及辅助质粒构建
使用pVAX-rCDV为模板PCR扩增，引物见表7，使用HSDNA Polymerase，反应体系为：
PCR反应条件为：
收产物各回收产物，酶切体系如下：
分别用ApaI和HindIII，ApaI和KpnI双酶切pVAX1载体，酶切体系如下：
反应条件37℃2h，酶切产物经1％琼脂糖电泳25min后放入GoldView染胶液染色10min，切胶回收。
反应条件37℃2h，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收各酶切片段与pVAX1酶切载体连接。辅助质粒连接体系如下：
4℃8～12h后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。获得辅助质粒pVAXN、质粒pVAXP和质粒pVAXL
3.犬瘟热病毒微型基因组构建
使用表8中引物Leader-f和Leader-r从pVAX-rCDV扩增犬瘟热病毒Leader序列和N基因GS(Gene Start)序列；表8中引物Tailer-f和Tailer-r从pVAX-rCDV扩增犬瘟热病毒Tailer序列和L基因GE(Gene End)序列；表8中引物EGFP-f和EGFP-r从pIRES2-EGFP扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列。PCR体系如下：
PCR反应条件为：
三段PCR产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收后通过两次连接PCR进行连接，连接Leader和EGFP连接体系和引物如下：
连接PCR反应条件为：
连接PCR产物琼脂糖凝胶电泳，胶回收后再次与Tailer连接，连接体系和引物如下：
连接PCR反应条件为：
PCR产物即为犬瘟热病毒微型基因组(Mini-genome，mg)，将PCR连接产物胶回收与pMDTM19-T Vector连接，连接体系为：
胶回收产物 4.5μl
T-Vector 0.5μl
SulotionI 5μl
4℃8～12h(16℃15min)后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。调取菌落鉴定阳性克隆提取质粒测序。
连接有mg的测序正确质粒和pCI-noe分别双酶切，酶切体系如下：
反应条件37℃2h，酶切产物经1％琼脂糖电泳25min后放入GoldView染胶液染色10min，切胶回收。胶回收各酶切片段mg与pCI-noe酶切载体连接。辅助质粒连接体系如下：
4℃8～12h后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得CDV微基因组质粒pCI-CDVmg。
以GASSEN(Establishment of a Rescue System for Canine DistemperVirus)在2000文章中方法为例，该文选择12个酶切位点分11个片段扩增CDV基因包含两段核酶序列连接如T载体，然后逐段酶切连接入pEMC或pBS SK II载体，构建感染性克隆需要进行11次亚克隆以获得完整基因。
而本发明的方法相比传统方法(以Gassen方法为例)只进行四轮亚克隆(FA、FB和FC连接可同时进行)，远少于Gassen的11次亚克隆方法；时间减少近一倍；也避免了选择多个酶切位点进行酶切反应；FA、FB和FC质粒基因较长也便于以后对CDV进行基因改造操作。
本发明中引物设计充分考虑到在构建质粒FA、FB和FC时要保证各段基因开放阅读框的完整性，尤其是质粒FB含有完整H基因和F基因，H和F基因是CDV主演的研究内容，对毒力和免疫原性有重要影响，质粒FB的构建为本发明在以后使用中对CDV主要研究内容的基因操作提供了便利，此外个各引物和酶切位点的选择也是基于这方面的考虑，可以将各主要基因片段完整酶切替换等基因克隆操作。总之，本方法中通过间质粒FA、FB和FC的构建相比有方法大量减少了基因克隆的次数，位后期不同目的用途提供了便利条件。
Claims (3)
1.一种构建CDV反向遗传全基因载体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)首先设计用于扩增CDV基因组不同片段的9对引物，引物的序列信息如下：
以提取的病毒核酸反转录产物为模板，使用引物F1f和F1r扩增得到片段F1；引物F2f和F2r扩增得到片段F2；引物F3f和F3r扩增得到片段F3；引物F4f和F4r扩增得到片段F4；引物F5f和F5r扩增得到片段F5；引物F6f和F6r扩增得到片段F6；引物F7f和F7r扩增得到片段F7；引物F8f和F8r扩增得到片段F8；引物F9f和F9r扩增得到片段F9；所有产物连接T载体得到F1～F9质粒；
2)使用Ham Rz p1为上游引物和F1r为下游引物，以F1质粒为模板，扩增得到Ham Rz+F1片段，将Ham Rz+F1片段连接到T载体得到质粒Ham Rz+F1；使用上游引物F9f，HDV Rz p1和HDV Rz p2为下游引物，以F9质粒为模板，通过前后两轮PCR得到F9+HDV Rz片段，连接到T载体得到质粒F9+HDV Rz；
3)用引物Infusion_P1和F1r，以质粒Ham Rz+F1为模板；用引物F2f和F2r，质粒F2为模板；用引物F3f和Infusion_P2，质粒F3为模板进行扩增；三个产物依次连接入T载体为FA质粒；
引物Infusion_P3和F4r以质粒F4为模板的PCR产物；引物F5f和Infusion_P4以质粒F5为模板的PCR产物，二个产物接入T载体为FB(-)质粒，然后将质粒FB(-)和质粒F4经过Sac I和Hpa I双酶切后连接为质粒FB(+)；质粒FB(+)和质粒F7经过Nco I和Hind III双酶切连接成为片段质粒FB；
引物Infusion_P5和F8r以质粒F8为模板的PCR产物；引物F9f和Infusion_P6以质粒F9+HDV Rz为模板的PCR产物连接入T载体为FC质粒；
4)将序列为SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的Oligo DNA溶解后退火形成双链，然后将pVAX1载体用NheI和ApaI双酶切后胶回收，与双链连接形成载体pVAX2；
5)然后将片段FA、FB和FC酶切，再依次连入载体pVAX2得到CDV全基因组感染性克隆pVAX-rCDV。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的Ham Rz p1、Hdv Rz p1、Hdv Rz p2的引物序列信息如下：
3.一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤
1)用引物N-f、N-r扩增片段N、用引物P-f、P-r扩增片段P和用引物L-f、L-r扩增片段L，双酶切连入pVAX2构成辅助质粒pVAX-N、pVAX-P和pVAX-L；其中引物的序列信息如下：
2)辅助质粒验证：用Leader-f、Leader-r、EGFP-f、EGFP-r、Tailer-f和Tailer-r引物分别扩增CDV基因5′端Leader+N基因GS序列、L基因GE序列和3′端Tailer序列，从pIRES2-EGFP扩增增强型绿色荧光蛋白基因开放阅读框，经过两轮连接PCR连接成LET片段，再反向连入pVAX1载体，为pVAX-LET，与复制质粒共转染BHK细胞，24-48h后观察荧光情况；筛选出目的重组细胞；所使用的引物序列如下
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410257546.5A CN103981202B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410257546.5A CN103981202B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103981202A true CN103981202A (zh) | 2014-08-13 |
| CN103981202B CN103981202B (zh) | 2016-03-09 |
Family
ID=51273374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410257546.5A Active CN103981202B (zh) | 2014-06-11 | 2014-06-11 | 一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103981202B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105274089A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-01-27 | 扬州大学 | 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 |
| CN110129286A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-16 | 广西大学 | 重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法 |
| CN110951778A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-04-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586120A (zh) * | 2009-07-15 | 2009-11-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体 |
| CN102329809A (zh) * | 2010-07-12 | 2012-01-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用 |
| CN102816741A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-12-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 犬瘟热弱毒疫苗株f和h基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用 |
-
2014
- 2014-06-11 CN CN201410257546.5A patent/CN103981202B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586120A (zh) * | 2009-07-15 | 2009-11-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遗传操作系统及LEP绿色荧光蛋白重组病毒载体 |
| CN102329809A (zh) * | 2010-07-12 | 2012-01-25 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用 |
| CN102816741A (zh) * | 2012-03-06 | 2012-12-12 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 犬瘟热弱毒疫苗株f和h基因重组新城疫病毒活载体疫苗的构建及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GASSEN U ET AL.: "Establishment of a rescue system for canine distemper virus", 《J VIROL.》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105274089A (zh) * | 2015-11-19 | 2016-01-27 | 扬州大学 | 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 |
| CN105274089B (zh) * | 2015-11-19 | 2018-04-20 | 扬州大学 | 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法 |
| CN110129286A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-16 | 广西大学 | 重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法 |
| CN110951778A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-04-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用 |
| CN110951778B (zh) * | 2019-10-16 | 2021-08-03 | 中国农业科学院特产研究所 | 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103981202B (zh) | 2016-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Flick et al. | Reverse genetics system for Uukuniemi virus (Bunyaviridae): RNA polymerase I-catalyzed expression of chimeric viral RNAs | |
| Ikegami et al. | Rift valley fever virus nonstructural protein NSs promotes viral RNA replication and transcription in a minigenome system | |
| Martin et al. | RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication | |
| Flick et al. | Functional analysis of the noncoding regions of the Uukuniemi virus (Bunyaviridae) RNA segments | |
| Morin et al. | The telomeres of the linear mitochondrial DNA of Tetrahymena thermophila consist of 53 bp tandem repeats | |
| US20230272374A1 (en) | Compositions and methods for identifying polynucleotides of interest | |
| Ikegami et al. | Characterization of Rift Valley fever virus transcriptional terminations | |
| CN103981202B (zh) | 一种构建犬瘟热病毒反向遗传系统的方法 | |
| Zhang et al. | Development of a Newcastle disease virus vector expressing a foreign gene through an internal ribosomal entry site provides direct proof for a sequential transcription mechanism | |
| WO2015144045A1 (zh) | 包含两个随机标记的质粒库及其在高通量测序中的应用 | |
| Whelan et al. | Identification of a minimal size requirement for termination of vesicular stomatitis virus mRNA: implications for the mechanism of transcription | |
| CN104830908A (zh) | 假病毒包装系统及其用途 | |
| Liu et al. | Two-plasmid system to increase the rescue efficiency of paramyxoviruses by reverse genetics: the example of rescuing Newcastle disease virus | |
| CN105543223A (zh) | 一种基于miRNA/shRNA转录加工机制转录sgRNA的方法 | |
| CN104195154A (zh) | 新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遗传操作系统及其应用 | |
| US20220017895A1 (en) | Gramc: genome-scale reporter assay method for cis-regulatory modules | |
| Huang et al. | Development of a reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China | |
| Harmon et al. | RNA sequences involved in transcriptional termination of respiratory syncytial virus | |
| CN103451198A (zh) | 溶瘤型新城疫病毒D90株的全长感染性 cDNA及其构建方法和应用 | |
| Schneider et al. | Evidence for translation of the Borna disease virus G protein by leaky ribosomal scanning and ribosomal reinitiation | |
| CN102250950A (zh) | 一种基于dna水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统及其构建方法和应用 | |
| Parks et al. | Expression of a foreign gene by recombinant canine distemper virus recovered from cloned DNAs | |
| Morimoto et al. | A unique transcription mode of rabies virus high egg passage‐Flury strain detected in infected baby hamster kidney‐21 cells | |
| Zhao et al. | Application of the ligation-independent cloning (LIC) method for rapid construction of a minigenome rescue system for Newcastle disease virus VG/GA strain | |
| Jiang et al. | Plasmids driven minigenome rescue system for Newcastle disease virus V4 strain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |