CN102329809A - 犬瘟热病毒cdv/r-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)CDV/R-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用，该系统包含：转录质粒，所述转录质粒能够表达所述犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的基因组全长cDNA序列；和一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和大聚合酶蛋白(L)。通过上述反向遗传操作系统，成功救获了重组犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株。本研究的犬瘟热病毒反向遗传操作技术平台的建立为进一步开展犬瘟热病毒活载体疫苗研制及犬瘟热病毒相关基础研究提供了极佳的技术平台。

Description

犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株的反向遗传操作系统及其应用

技术领域

本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种犬瘟热病毒反向遗传操作系统及其应用。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的犬科(尤其是幼犬)、鼬科及部分浣熊动物的急性、高度接触性和致死性传染病，能引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30％～80％^[1](参考文献编号，以下同)，雪貂的病死率高达100％^[2]，可引起惨重的经济损失。近年来陆续有不同种动物发生CD的报道^[1]，甚至虎、豹、拼猴和大熊猫也能发生感染，引起越来越多的学者对CDV研究的广泛关注和重视。

CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，为负链单股不分节段的RNA病毒。CDV基因组全长15,690核苷酸，具有6个独立转录单元，分别为核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)。CDV与其它负链RNA病毒一样，其最小的感染单位是核蛋白复合体，无蛋白包裹的RNA并无感染性。CDV的基因组RNA与NP、P、L蛋白共同组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒。重组CDV作为活病毒疫苗载体具有极为突出的优点，犬瘟热弱毒疫苗长期以来一直用于犬及其他皮毛动物防疫，其安全有效性已被充分证明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种犬瘟热病毒的反向遗传操作系统或试剂盒，该系统或试剂盒包含：

(1)转录质粒，所述转录质粒能够表达所述犬瘟热病毒的基因组全长cDNA序列；

(2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和/或大聚合酶蛋白(L)；

(3)任选地，犬瘟热病毒的病毒复制许可的宿主细胞，优选BHK细胞或Vero细胞。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒包括三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和大聚合酶蛋白(L)，优选所述犬瘟热病毒是弱毒疫苗株，更优选是犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述转录质粒还包含编码外源蛋白的基因，如标记基因，优选编码EGFP蛋白的基因。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述编码外源蛋白的基因(如标记基因，优选编码EGFP蛋白的基因)位于所述犬瘟热病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述转录质粒是pCI-CDV或pCI-CDV-EGFP。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述辅助质粒分别是pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL。

本发明的另一个目的是提供一种制备重组犬瘟热病毒的方法，其包括以下步骤：

1)使用上述反向遗传操作系统或试剂盒中所述的转录质粒和辅助质粒共转染犬瘟热病毒的病毒复制许可的宿主细胞；

2)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。

本发明的另一个目的是提供根据以上的方法制备的的重组犬瘟热病毒，优选为rCDV和rCDV-EGFP。

本发明还有的另一个目的是提供根据本发明的重组犬瘟热病毒在制备预防犬瘟热的疫苗中的应用。

本发明还有的另一个目的是提供根据本发明的重组犬瘟热病毒作为多价活病毒载体疫苗的应用。

具体而言，本发明采用生产实践中广泛应用、免疫效果良好的犬瘟热病毒(Caninedistemper virus，CDV)CDV/R-20/8疫苗株，构建了犬瘟热病毒基因组全长cDNA克隆及表达CDV NP、P和L蛋白的辅助质粒；在此基础上进一步构建了表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组CDV基因组全长cDNA克隆，采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术，成功救获野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。病毒一步生长试验显示，反向遗传救获的rCDV和rCDV-EGFP的生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异。重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞上连续传5代，仍保持GFP的稳定表达。本研究为进一步开展CDV活载体疫苗研制及CDV病毒相关基础研究提供了可行的技术平台。

附图说明

图1.犬瘟热弱毒疫苗株野生型及重组型基因组cDNA的构建(A.克隆于pCI上的CDV基因组cDNA克隆pCI-CDV；B.含有EGFP基因的重组CDV基因组cDNA克隆pCI-CDV-EGFP：其中“斜体大写字母序列”为Pme I酶切位点，基因转录信号终止(gene-end，GE)序列用“加下划线的小写字母”标识，“大写加粗的序列CTT”为基因间隔区核苷酸，基因转录信号起始(gene-start，GS)序列用“加下划线的大写字母”标识，“斜体粗体大写字母”序列为kozak序列，Mlu I酶切位点用“粗体小写字母”标识)；

图2.间接免疫荧光检测rCDV和rCDV-EGFP感染的Vero细胞(以1∶50倍稀释的鼠抗灭活犬瘟热弱毒疫苗株全病毒高免血清为一抗检测rCDV感染的Vero细胞(A)、rCDV-EGFP感染的Vero细胞(B)和未感染的Vero细胞(C))；

图3.rCDV和rCDV-EGFP在Vero细胞上的生长动力学曲线；

图4.GFP在重组病毒rCDV-EGFP感染的Vero细胞内的表达(将第1代(A)、第2代(B)、第3代(C)、第4代(D)和第5代(E)连续5代次重组病毒rCDV-EGFP按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，5％CO₂、37℃培养3天(d)后，荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察结果)；

图5.转录质粒pCI-CDV的序列(从5′端到3′端)(1058-1115为HamRz序列；1116-16805为CDV基因组序列；16806-16893为HdvRz序列)；

图6.转录质粒pCI-CDV-EGFP的序列(从5′端到3′端)(1058-1115为HamRz序列；1116-17579为CDV-EGFP基因组序列；4532-5251为EGFP基因序列；17580-17667为HdvRz序列)；

图7.辅助质粒pCI-CDV-N的序列(从5′端到3′端)(SEQ ID NO：1)(1075-2646为CDVN基因组序列)；

图8.辅助质粒pCI-CDV-P的序列(从5′端到3′端)(SEQ ID NO：2)(1086-2609为CDV P基因组序列)；和

图9.辅助质粒pCI-CDV-L的序列(从5′端到3′端)(SEQ ID NO：3)(1075-7629为CDV L基因组序列)。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1犬瘟热病毒反向遗传操作系统的构建

1材料与方法

1.1材料

犬瘟热弱毒疫苗CDV/R-20/8株购自解放军军事医学科学院军事兽医研究所；BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC No.CCL-10)和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCCNo.CCL-81)，培养液均为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI购自Promega，pBluescript购自Clontech；PrimeSTAR(R)HS DNA聚合酶，T4DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(MLV)、胎牛血清以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate Transfection Kit)购自Invitrogen；鼠抗犬瘟热病毒全病毒高免血清经由CDV CDV/R-20/8株Vero细胞培养裂解上清反复免疫BALB/c小鼠制备，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室提供；红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗购自Sigma公司；荧光显微镜为LeicaDM IRB，购自Leica公司。

1.2CDV基因组全长cDNA克隆及辅助质粒的构建

犬瘟热弱毒疫苗株病毒接种Vero细胞收获的病毒液按常规方法(Trizol法)提取病毒基因组RNA；整个基因组分为9个末端部分重叠的片段(F1～F9)进行RT-PCR扩增，在F1片段5’端通过PCR引入锤头状核酶结构(HamRz)，在F9片段3’端通过PCR引入丁肝病毒核酶结构(HdvRz)，同时在HamRz序列的上游和HdvRz序列的下游分别引入SpeI和NotI位点，cDNA片段克隆至pBluescript EcoRV位点并经序列测定确证与病毒基因组RNA序列完全一致；利用相邻近片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装成完整的CDV基因组cDNA，并克隆在转录载体pCI中CMV-IE启动子的下游NheI和NotI位点之间，构成CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV(质粒序列见附图5)。pCI-CDV中CMV-IE启动子和SV40晚期多腺苷酸化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录，并且由于HamRz和HdvRz的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的CDV基因组cDNA片段精确一致。

按照上述方法，分别将CDV的NP、P和L基因的ORF cDNA，分别克隆在pCI质粒CMV-IE启动子的下游，分别构成表达CDV NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL(质粒序列分别见附图7-9)。

1.3表达GFP的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

在上述CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV的基础上，通过PCR方法在cDNA3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点(GTTTAAACTAACGCGT)，构成重组CDV基因组转录载体pCI-CDV-P/M；再以pIRES-EGFP(Cloneech)为模板，通过PCR在GFP的ORF 5’端引入Pme I限制酶识别序列和CDV自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列GE(ATTATAAAAAA)及转录起始序列GS(AGGACACAAGAGCCTAA)，PCR产物克隆至pBluescript EcoR V位点并经序列测定正确后，经限制酶Pme I消化插入pCI-CDV-P/M的Pme I位点，构成表达EGFP重组CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-EGFP(质粒序列见附图6)。

表1引物设计

1.4病毒的拯救及扩增

BHK细胞接种于35mm六孔板中，待生长至70％～80％单层时，采用CaPO₄转染试剂将转录质粒pCI-CDV(或pCI-CDV-EGFP)，以及辅助质粒pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL分别以5μg、1μg、0.8μg和0.5μg的量共转染BHK细胞，5％CO₂、37℃培养，具体操作按试剂盒说明书进行^[3]。转染后8～12h，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液，5％CO₂、37℃培养；4d后将细胞刮下来，将细胞悬液混匀，取300μL细胞悬液接种于生长过夜、密度约60％～70％的单层Vero细胞，感作1h后加入含5％胎牛血清的DMEM，5％CO₂、37℃培养4-6d，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。救获具有感染性的野生型CDV疫苗株和表达EGFP的重组病毒分别命名为rCDV和rCDV-EGFP。

1.5间接免疫荧光检测救获的病毒

Vero细胞接种于24孔板中，待生长至70％～80％单层时，分别将rCDV和rCDV-EGFP种毒液按感染复数MOI为0.01感染Vero细胞；3天后，弃培养上清，PBS洗涤细胞2次，3％多聚甲醛室温固定30min。分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清为一抗，作用30min。PBST洗涤后加入1∶64倍稀释红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察结果。

2结果

2.1CDV基因组全长cDNA克隆的构建

为了构建CDV基因组全长cDNA克隆，通过RT-PCR获得了覆盖整个基因组的9个cDNA克片段，并利用相邻近片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装获得了15690nt的完整cDNA克隆，在全长cDNA片段5’端前缀HamRz，在全长cDNA片段3’端连有HdvRz，构建成表达野生型CDV cDNA克隆pCI-CDV(图1A)。

2.2表达EGFP的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建

在CDV基因组全长cDNA克隆的基础上，在cDNA 3363-3388nt进行碱基定点突变，引入Pme I和Mlu I限制酶切位点，在Pme I限制酶切位点插入5’端引入CDV L聚合酶特异的转录调控序列GE和GS的EGFP基因，构建成表达EGFP的重组CDVcDNA克隆pCI-CDV-EGFP(图1B)。

2.3从cDNA克隆救获感染性rCDV和重组病毒rCDV-EGFP

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rCDV和rCDV-EGFP，以pCI-CDV(或pCI-CDV-GFP)及表达CDVNP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK细胞。转染4天后，刮下细胞，并将细胞悬液混匀，后取300μL细胞悬液接种于Vero细胞，培养4-6天，显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，分别作为救获病毒rCDV和rCDV-EGFP的F1代。按上述方法将救获病毒rCDV和rCDV-EGFP再传2代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，F3代救获病毒基因组cDNA分别与用于转染的pCI-CDV和pCI-CDV-GFP序列一致，与预期相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达EGFP的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。

2.4间接免疫荧光检测救获的病毒

为了进一步鉴定上述救获的病毒，分别以rCDV和rCDV-EGFP感染Vero细胞，3天后再分别以1∶50倍稀释的鼠抗灭活CDV全病毒高免血清为一抗进行间接免疫荧光染色。结果以1∶50倍稀释鼠抗灭活CDV全病毒高免血清检测rCDV和rCDV-EGFP感染的Vero细胞均显示阳性荧光信号(图2A和2B)，而以1∶50倍稀释鼠抗灭活CDV全病毒高免血清检测未感染病毒的Vero细胞则显示的荧光信号为阴性(图2C)。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV疫苗株基因组cDNA克隆成功救获具有感染性的野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达EGFP的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。

实施例2重组病毒与野生型病毒在Vero细胞上的生长动力学比较

将实施例1中制备的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-EGFP分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，于感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h分别收获上述感染病毒的细胞；将上述不同时间段收获的重组病毒rCDV-EGFP和亲本株病毒液冻融1次后，做10倍连续稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种铺于96孔板、生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，PBS洗2次，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，每个稀释度做8个重复；感染后第5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rCDV-EGFP和亲本株病毒液的病毒滴度(TCID₅₀)，以评价两种病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。

结果显示，通过反向遗传技术救获的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-EGFP生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异，见图3。

实施例3外源蛋白EGFP表达检测

为了评价重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞内表达GFP的稳定性，将F1～F5连续5代次重组病毒rCDV-EGFP按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含5％胎牛血清的DMEM完全培养液，5％CO₂、37℃培养，3天后荧光显微镜(Leica DMIRES2)下观察结果。结果显示，各代次的重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞内均能高效地表达GFP，见图4。

本研究选择我国生产实践中广泛应用多年、免疫效果良好的犬瘟热弱毒疫苗株，应用反向遗传操作技术救获野生型犬瘟热弱毒疫苗株rCDV和表达EGFP的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-EGFP。

本研究是在我国首次建立CDV的反向遗传操作系统，对我国CDV的致病机制及疫苗研究提供强大的技术支持。另外，通常普通传代细胞系不能用CDV初次分离，因为这些细胞表面没有CDV的受体蛋白，这是造成CDV分离困难的主要原因；而本研究所用犬瘟热病毒CDV/R-20/8株为Vero细胞适应株，且在Vero细胞上生长滴度比较高(见生长曲线)，使得该犬瘟热弱毒疫苗生产更为方便，并显著降低了的生产成本。

另外，动物实验表明(数据未显示)，本发明通过反向遗传技术救获的野生型病毒rCDV和重组病毒rCDV-EGFP可以为试验犬提供100％的抗CDV保护作用。

外源基因在基因组内的插入可对重组CDV的复制、生长能力产生显著影响。外源基因的插入位置还可能对其表达水平产生显著影响，一般认为，外源基因插入位置越接近基因组3’末端，其表达水平越高，但对有些外源免疫原蛋白，特别是一些病毒囊膜糖蛋白，表达后可装配于病毒粒子的表面，过高的表达有可能影响到重组病毒在体内的感染、复制、甚至遗传稳定性^[4]。综合考虑诸方面因素，本研究选择在P-M之间插入EGFP基因，构建表达EGFP的重组CDV基因组cDNA克隆质粒pCI-CDV-EGFP，经传染BHK-21细胞，拯救出野生型CDV弱毒疫苗株rCDV和表达绿色荧光蛋白的重组病毒rCDV-EGFP。rCDV和rCDV-EGFP均具有良好的Vero细胞生长适应性及遗传稳定性；EGFP蛋白在rCDV-EGFP感染的Vero细胞中能得到稳定、高效的表达，表明CDV具有作为活病毒疫苗载体的潜力和良好的应用前景。鉴于CD是犬科、鼬科及浣熊科动物的一种重要疫病，对皮毛经济动物养殖业造成严重危险，CDV可作为一种构建新疫苗的优良载体，可以开发为多价活病毒载体疫苗，可真正实现一种疫苗预防两种甚至两种以上疫病，并将会产生巨大的经济和社会效益。同时，本研究为进一步开展CDV相关基础研究提供了技术平台。

参考文献

1.何洪彬，夏咸柱.犬瘟热的诊断及其预防免疫的研究进展.动物医学进展.2001，22(1)：12-15.

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3.Parks CL，Lerch RA，Walpita P，et al.Enhanced measles virus cDNA rescue and geneexpression after heat shock..J Virol.，1999，73(5)：3560-6.

4.葛金英，温志远，王永等.表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建.微生物学报，2006，46(4)：547-551.

Claims (10)

1.一种犬瘟热病毒的反向遗传操作系统或试剂盒，该系统或试剂盒包含：

(1)转录质粒，所述转录质粒能够表达所述犬瘟热病毒的基因组全长cDNA序列；

(2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和/或大聚合酶蛋白(L)；

(3)任选地，犬瘟热病毒的病毒复制许可的宿主细胞，优选BHK细胞或Vero细胞。

2.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统或试剂盒，其包括三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述犬瘟热病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、和大聚合酶蛋白(L)，优选所述犬瘟热病毒是弱毒疫苗株，更优选是犬瘟热病毒CDV/R-20/8疫苗株。

3.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统或试剂盒，其中所述转录质粒还包含编码外源蛋白的基因，如标记基因，优选编码EGFP蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的反向遗传操作系统或试剂盒，其中所述编码外源蛋白的基因(如标记基因，优选编码EGFP蛋白的基因)位于所述犬瘟热病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。

5.根据权利要求1-4任一项所述的反向遗传操作系统或试剂盒，其中所述转录质粒是pCI-CDV或pCI-CDV-EGFP。

6.根据权利要求1-5任一项所述的反向遗传操作系统或试剂盒，其中所述辅助质粒分别是pCI-CDVN、pCI-CDVP和pCI-CDVL。

7.一种制备重组犬瘟热病毒的方法，其包括以下步骤：

1)使用在权利要求1-6任一项的反向遗传操作系统或试剂盒中所述的转录质粒和辅助质粒共转染犬瘟热病毒的病毒复制许可的宿主细胞；和

2)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组犬瘟热病毒。

8.根据权利要求7的方法制备的重组犬瘟热病毒，优选为rCDV和rCDV-EGFP。

9.根据权利要求7或8的重组犬瘟热病毒在制备预防犬瘟热的疫苗中的应用。

10.根据权利要求7或8的重组犬瘟热病毒作为多价活病毒载体疫苗的应用。

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