CN111218474A - 一种副粘病毒的拯救系统和副粘病毒拯救方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种副粘病毒拯救方法，包括以下步骤：(1)将副粘病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pT7‑T7RNAP质粒、pCDIBP‑T7RNAP质粒和动物细胞混合；(2)使用物理或化学方法介导多质粒共转染；(3)培养细胞；(4)收集病毒。所述pT7‑T7RNAP质粒是带有T7启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒；所述pCDIBP‑T7RNAP质粒是带有CMV启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒。本发明可以高效拯救出副粘病毒，并且能够适用于人用副粘病毒减毒活疫苗的生产。

Description

一种副粘病毒的拯救系统和副粘病毒拯救方法

技术领域

本发明涉及病毒反向遗传学领域，特别涉及一种副粘病毒的拯救系统和方法。

背景技术

副粘病毒是与粘液蛋白有特殊亲和性的一类病毒，其中麻疹、呼吸道合胞、新城疫病毒等可感染人或动物，人们通常用减毒活疫苗对副粘病毒感染进行预防。减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后，发生变异，毒性减弱，但仍保留其免疫原性的毒株。

副粘病毒是一种负链RNA病毒。RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。采用反向遗传学系统不需要经过传统毒株的变异筛选即可拯救获得活疫苗中的活性成分病毒减毒株。

与正链RNA病毒相比，负链RNA病毒裸露的基因组或由cDNA转录所得的RNA无感染性，需与核衣壳蛋白，RNA依赖型RNA聚合酶等形成核糖核蛋白复合物，才能开始正常的复制和组装。因此，利用反向遗传学系统拯救副粘病毒，需共转染含病毒全长cDNA的质粒和表达病毒N、P、L蛋白的辅助质粒，其中N蛋白也称NP蛋白。T7RNA聚合酶，是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。由于T7RNA聚合酶启动转录效率相对较强且具有严格的启动子识别特异性，所以基于T7RNA聚合酶的病毒拯救系统应用非常广泛，特别是对于一些基因组比较大的病毒，该系统更是具有不可替代的优势。

副粘病毒反向遗传学系统的建立过程中，通常将病毒株全长cDNA与编码蛋白N、P、L的基因克隆在T7启动子控制的质粒上，将全长质粒及辅助质粒共转染宿主细胞，质粒需在T7RNA聚合酶的作用下进行转录完成病毒的拯救。T7RNA聚合酶通常通过转染可表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒或能稳定表达T7RNA聚合酶的工程化细胞提供。

将重组痘病毒转入T7RNA聚合酶获得的工程化细胞用于疫苗生产，后期纯化时无法彻底去除重组痘病毒，无法满足GMP对病毒候选疫苗临床应用的要求，因此采用该方法拯救所得病毒不能用于疫苗的开发和生产。此外，相对于拯救病毒，重组痘病毒具有相对快速的细胞病变效应，使感染细胞快速产生CPE，缩短了目的病毒拯救及扩增的时间，影响拯救效率。

可持续表达T7RNA聚合酶的工程化细胞拯救重组病毒无需引入重组痘病毒，但在使用过程中也受到一定的限制。一方面，构建并维持能稳定表达T7RNA聚合酶工程细胞存在一定的难度；另一方面，构建所得的工程化细胞基因组序列在原有细胞基础上有插入，为保证疫苗临床应用的安全性，将工程化细胞应用到疫苗的开发、生产过程中需要经过验证，验证工程化细胞并将其用于疫苗的生产难度较大。因此，对于需要在人类身上进行临床试验进行评估的候选疫苗的开发，在其病毒株的生产过程中使用能表达T7RNA聚合酶的病毒或工程化细胞，都会使得整个疫苗从开发到临床应用过程复杂化，加大批准难度。

疫苗生产一个非常重要的因素是疫苗终产品的安全性和免疫原性，所有用于疫苗生产的基质必须完全避免隐藏未知病原体的污染而原代细胞基质很难避免这种污染。传统而经典的细胞基质例如鸡胚成纤维细胞作为病毒疫苗的生产能力有限，其他细胞基质例如CHO，MRC-5，WI-38，HEK 293，Vero，EB66细胞可作为疫苗安全生产的细胞系。Vero细胞作为可用于疫苗生产的细胞系，已被批准用于多种病毒疫苗的生产，如口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、轮状病毒减毒活疫苗、将黄病毒YFV17D的膜蛋白替换为日本脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白的嵌合减毒活疫苗Imojev疫苗等。

转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。目前转染主要为化学法和物理法两类，化学法包括DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法等。物理法包括：显微注射、电穿孔、基因枪等，显微注射常用来制备转基因动物，但却不适用于需要大量转染细胞的研究。基因枪法是一种基因导入仪技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器，是目前国际上最先进的基因导入技术电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。电穿孔法常用来转染如植物原生质体这样的常规方法不容易转染的细胞。适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组(>65kb)但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。

Vero细胞，于1962年从正常的成年非洲绿猴肾细胞获得的转化细胞。该细胞是贴壁依赖性的成纤维细胞。它能支持多种病毒的增殖，包括乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病等病毒，已被准许用于生产人用病毒疫苗。Vero细胞用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，是在限定代次内不致癌的异倍体细胞，WHO_TRS_878指导意见指出用于疫苗生产的Vero细胞控制在134-150代次内。

副粘病毒拯救体系在Vero细胞中拯救，需同时转染6种质粒，且DNA用量大，Vero细胞转染效率低，其中外源质粒表达T7 RNA聚合酶来启动含病毒全部遗传信息的全长质粒的转录及N、P、L基因的表达。因此，T7 RNA聚合酶的足量表达是病毒成功拯救的关键。

综上，使用常规的病毒拯救体系无法满足副粘病毒疫苗开发的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种副粘病毒的拯救系统和方法。

首先，本发明提供了一种副粘病毒的拯救系统，其特征在于，它包括：病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pT7-T7RNAP质粒和pCDIBP-T7RNAP质粒；

所述病毒基因组质粒是带有T7启动子、且带有副粘病毒的基因组或反基因组序列的质粒；

所述N质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应N蛋白或NP蛋白的DNA序列的质粒；

所述P质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应P蛋白的DNA序列的质粒；

所述L质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应L蛋白的DNA序列的质粒；

所述pCDIBP-T7RNAP质粒是带有CMV启动子和T7 RNA聚合酶DNA序列的质粒；

所述pT7-T7RNAP质粒是带有T7启动子和T7 RNA聚合酶DNA序列的质粒。

前述的拯救系统中，pCDIBP-T7RNAP质粒具有如SEQ ID NO.1所述的序列。

进一步地，所述pT7-T7RNAP质粒具有如SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明还提供了一种副粘病毒拯救方法，包括如下步骤：

(1)将前述病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP质粒和动物细胞混合；

(2)使用物理或化学方法介导多质粒共转染；

(3)培养细胞；

(4)收集病毒；

进一步地，步骤(1)中所述N质粒、P质粒和L质粒所带的启动子是T7启动子；病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP按所述顺序的质量比例是12:(8～10):(4～10):(1～8):4:4。

进一步地，步骤(1)中所述N质粒、P质粒和L质粒所带的启动子是CMV启动子；病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP按所述顺序的比例是12:(8～10):(4～10):8:4:(2～4)。

进一步地，步骤(2)细胞数不低于5×10⁵个，所述病毒基因组质粒用量不低于12微克。

进一步地，步骤(1)所述动物细胞为CHO、MRC-5、WI-38、HEK 293、EB66和Vero细胞中的至少一种。

更进一步地，步骤(1)所述动物细胞为Vero细胞。

进一步地，步骤(2)所述的物理或化学方法为电穿孔法。

在本发明的技术方案中，T7启动子由外源的T7RNA聚合酶识别，而CMV启动子由真核细胞的RNA聚合酶II识别；聚合酶识别启动子后就能开始转录和表达。

本发明借助真核细胞自带的RNA聚合酶II识别pCDIBP-T7RNAP(结构见图2)的CMV启动子，表达其T7RNA聚合酶；再用此T7RNA聚合酶识别pT7-T7RNAP(结构见图1)中的T7启动子，进一步启动pT7-T7RNAP中的T7RNA聚合酶表达。而pT7-T7RNAP表达的T7RNA聚合酶会促进质粒本身表达，形成一个正反馈调节通路，大大强化了T7RNA聚合酶在宿主细胞中的表达。T7RNA聚合酶表达会促进T7启动子启动的病毒基因组质粒和其它辅助质粒。

本发明的一种优选的实施方式中，将传统辅助质粒N质粒、P质粒和L质粒中的启动子——T7启动子换成RNA聚合酶II识别的CMV启动子，亦能有效地拯救病毒。

本发明还优化了各种质粒的用量及电转参数，保证了病毒成功转染细胞，以及病毒基因组的成功拯救。

本发明在能成功拯救副粘病毒的前提下，避免了现有技术中重组痘病毒带来的潜在危害，也免于花费大量时间和精力构建需要长时间审批的工程化稳定表达T7RNA聚合酶的细胞。

本发明在疫苗生产用细胞中拯救副粘病毒，避免了隐藏未知病原体的污染，获得的副粘病毒可用于疫苗生产。

本发明在副粘病毒制备，尤其是副粘病毒疫苗的制备中具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是pT7-T7RNAP质粒示意图。

图2是pCDIBP-T7RNAP质粒示意图。

图3是AT组红色荧光蛋白表达情况图。

图4是BT组红色荧光蛋白表达情况图。

图5是Vero电转全质粒拯救出MV_S191-GFP的荧光显微镜观察图：E-L，E组白光；E-F，E组荧光；F-L，F组白光；F-F，F组荧光。

图6是拯救所得MVsw感染Vero细胞形成细胞显微观察图。

图7是拯救所得麻疹JL1感染Vero细胞形成细胞显微观察图。

图8是pT7-IRESGFP质粒转染BSRT7细胞培养72h荧光观察图。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1实验细胞及电转质粒准备

将电转所需的Vero细胞按1:4的比例传代到T75瓶，37℃，5％CO₂培养24-48h至细胞70％以上汇合度或薄单层。Vero细胞用胰酶消化后，取适量培养基(6-8ml)洗脱，用移液器吸取10μl用于血球计数板计数。细胞计数后，计算所需细胞用量，按计算的量将细胞加入高压灭菌后的1.5ml EP管中。将所需质粒按事先计算的量加入高压灭菌后的1.5ml EP管中，并做好标记。

将EP管中的细胞放入离心机，常温下经2000g×5min离心后去除培养基。每个实验样品用110μl电转缓冲液充分轻柔悬浮细胞，将细胞悬液移入含质粒的EP管中，轻柔混匀。

实施例2电转条件摸索

缓冲液：本系统选取了两种电转缓冲液进行实验，AT电转缓冲液和BT电转缓冲液。

AT电转缓冲液为北京英格恩Entranster-H电转缓冲液，货号：98668。

BT电转缓冲液为lonzanucleofector电转缓冲液，货号：V4LP-3520。

质粒：带CMV启动子的pCDNA3.1-RFP(可在真核细胞中表达红色荧光蛋白，便于后期通过观察荧光蛋白表达量来评估电转效率)；

细胞：Vero(每个实验组细胞用量均为5×10⁵个)。

电转杯：C厂家：海门市爱苯德实验器材有限公司QIVON电极杯货号：CUV502

D厂家：伯乐公司电转杯货号：165-2086。

细胞及质粒混匀后移入2mm直径的电转杯中。设置多功能电转仪电转条件(条件如表1和表2所示)后进行电击。电击后电转杯上部有白色泡沫，多为细胞碎片或死细胞。

电转后细胞转入培养瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养约4h后，通过显微镜观察细胞的存活状况，贴壁良好，轮廓清晰，正常伸展，透光性好的为活细胞，圆缩，透光性差，浮于培养液中的细胞为死细胞，以一个视野下的细胞粗略统计细胞在各条件下的存活率，结果如表1、表2的最后一行所示。

表1 AT缓冲液中电转条件

试验组	A	B	C	D	E	F	G	H
									质粒用量(μg)	4	29	4	29	4	4	4	4
电压(V)	150	150	120	120	110	110	100	90
									电容(μF)	950	950	950	950	950	950	950	950
电转杯	C厂家	C厂家	C厂家	C厂家	C厂家	D厂家	D厂家	D厂家
									电击次数	1	1	1	1	1	1	1	1
细胞存活率	＜5％	＜5％	＜10％	＜10％	15％	20％	30％	40％

电转细胞培养24h后换液5ml MEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)继续培养，细胞培养到薄单层后观察红色荧光蛋白表达情况(见图3和图4)。

表2 BT缓冲液中电转条件

试验组	1	2	3	4	5	6
							质粒用量(μg)	4	4	4	4	4	4
电压(V)	100	120	130	140	150	160
							电容(μF)	950	950	950	950	950	950
电转杯	D厂家	D厂家	D厂家	D厂家	D厂家	D厂家
							电击次数	1	1	1	1	1	1
细胞存活率	50％	50％	40％	40％	30％	20％

结论：细胞电转后存活率与电转电压密切相关，电压越低，细胞存活率越高；相同电转条件下，质粒用量对细胞存活率影响不大，使用D厂家电转杯电转后细胞存活率高于使用C厂家电转杯的组。质粒pCDNA3.1-RFP电转染Vero细胞，使用AT电转缓冲液，D厂家电转杯，电压为110V时电转效率最高。使用BT电转缓冲液，电压为140V或150V时电转效率最高，但140V时细胞存活率较150V时高，所以电转最佳电压为140V。单质粒电转染Vero细胞，使用AT电转缓冲液或BT电转缓冲液，在各自的最佳电转条件下，电转效率相当。

实施例3 Vero细胞电转全质粒拯救重组麻疹病毒MV-GFP

所用质粒：pT7-MV_S191N、pT7-MV_S191P、pT7-MV_S191L、pCDIBP-T7RNAP(序列见附录中SEQ ID NO.1)、pT7-T7RNAP(序列见附录中SEQ ID NO.2)；pT7-MV_S191-GFP的构建见专利CN201710001203-一种用于拯救麻疹病毒、重组麻疹病毒的系统以及方法。

电转缓冲液：AT电转缓冲液；BT电转缓冲液。

电转杯：D厂家。

根据实施例1摸索的最佳电转条件进行实验操作，电转具体条件及质粒使用量见表3。若试验成功，所得的重组麻疹病毒MV-GFP可表达绿色荧光蛋白(图5)，便于后期在显微镜下观察。

将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

表3重组麻疹病毒MV-GFP电转条件优化

实验组	A	B	C	D	E	F	G
								pT7-MV<sub>S191</sub>N(μg)	4	4	8	8	8	8	8
pT7-MV<sub>S191</sub>P(μg)	2	2	4	4	4	4	4
								pT7-MV<sub>S191</sub>L(μg)	0.5	0.5	1	1	1	1	1
pT7-T7RNAP(μg)	2	2	2	4	4	0	4
								pCDIBP-T7RNAP(μg)	2	2	4	4	4	8	4
pT7-MV<sub>S191</sub>-GFP(μg)	6	6	12	12	12	12	12
								缓冲液	BT	AT	BT	AT	BT	AT	AT
电压(V)	140	110	140	110	140	110	110
								电击次数	1	1	1	1	1	1	1
拯救结果	未成功	未成功	未成功	未成功	成功	未成功	未成功

多质粒共转染Vero细胞后，pCDIBP-T7RNAP带有CMV启动子，可在Vero细胞中启动T7 RNA聚合酶的表达，表达的T7 RNA聚合酶又可以启动其他质粒的T7启动子，继而表达N、P、L等蛋白，共转染含病毒全长cDNA的质粒在T7启动子下转录所得的RNA与这些蛋白形成核糖核蛋白复合物，开始正常的复制和组装，从而拯救得到重组麻疹病毒MV_S191-GFP。因此，T7RNA聚合酶的成功表达是拯救成功的关键因素，足量的T7 RNA聚合酶可启动T7启动子下所带基因的表达，共转染的pT7-T7 RNAP质粒可进一步增加T7 RNA聚合酶的表达量。多质粒转染拯救重组麻疹病毒，需要共转染的所有质粒进入同一个细胞中进行表达，得到拯救病毒，其拯救效率远低于单质粒转染pCDNA3.1-RFP时红色荧光蛋白的表达。从重组麻疹病毒MV_S191-GFP的拯救结果来看，电转缓冲液BT效果优于AT。

实施例4 Vero细胞电转全质粒拯救麻疹病毒MVsw

所用质粒：pT7-MVswN、pT7-MVswP、pT7-MVswL、pT7-T7RNAP、pT7-MVsw、pCDIBP-T7RNAP。

电转缓冲液：BT。

电转杯：D厂家。

根据前面拯救MV_S191-GFP摸索的最佳电转条件，作出适当的调整后进行实验操作，具体条件见表4。

将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5ml MEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

表4麻疹病毒MVsw电转条件优化

实验组	A	B	C	D	E	F
							pT7-MV<sub>sw</sub>N(μg)	8	8	8	8	8	10
pT7-MV<sub>sw</sub>P(μg)	4	4	4	4	4	10
							pT7-MV<sub>sw</sub>L(μg)	1	1	1	8	8	8
pT7-T7RNAP(μg)	0	4	2	2	4	4
							pCDIBP-T7RNAP(μg)	8	4	4	4	4	4
pT7-MV<sub>sw</sub>(μg)	12	12	12	12	12	12
							细胞量(个)	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>6</sup>
电压(V)	140	140	110	140	140	140
							电击次数	1	1	1	1	1	2
拯救结果	未成功	未成功	未成功	未成功	未成功	成功

使用电转效率更高的进口电转缓冲液BT，根据前面MV_S191-GFP的拯救条件，未能成功拯救得到麻疹病毒MVsw。在原来的基础上对各个质粒的用量做出适当的调整，并增加电击次数到两次，由于电击次数增加，细胞存活率会更低，因此，成倍增加电转细胞用量，可成功拯救得到麻疹病毒MVsw(图6)。

实施例5 Vero细胞电转全质粒拯救腮腺炎病毒JL1

所用质粒：pCDIBP-NP、pCDIBP-P、pCDIBP-L、pT7-T7RNAP、pT7-Muv-JL1、pCDIBP-T7RNAP。

电转缓冲液：BT。

电转杯：D厂家。

细胞：Vero细胞(每个样含有1×10⁵个细胞)。

根据前面拯救MV_S191-GFP及MVsw摸索的最佳电转条件，作出适当的调整后进行实验操作(具体条件见表5)。

将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变(见图7),图7为D实验组拯救获得的JL1病毒感染Vero细胞，导致细胞间膜融合形成由数个大小不同的“空泡”组成的大噬斑样病变。

表5 Vero细胞电转全质粒拯救腮腺炎病毒JL1条件优化

实验组	A	B	C	D	E
						pCDIBP-NP(μg)	8	8	8	8	8
pCDIBP-P(μg)	4	4	4	4	4
						pCDIBP-L(μg)	1	1	8	8	8
pT7-T7 RNAP(μg)	4	0	4	4	2
						pCDIBP-T7RNAP(μg)	4	8	4	4	4
pT7-Muv-JL1(HdvRz)(μg)	12	12	12	12	12
						缓冲液	D厂家	D厂家	D厂家	D厂家	D厂家
电压(V)	140	140	140	140	140
						电击次数	1	1	2	1	1
拯救结果	未成功	未成功	成功	成功	成功

本实验将N、P、L蛋白的表达基因也放到质粒pCDIBP的CMV启动子下。在未调整pCDIBP-L用量时，拯救仍不成功，后续实验调整pCDIBP-L用量到8μg，大大增加拯救效率。

实施例6副粘病毒的拯救系统1

本系统用于拯救麻疹病毒。

1.拯救系统组成

拯救系统各组分如表6所示。其中N质粒、P质粒及L质粒带有T7启动子。

表6副粘病毒拯救的系统1

2.拯救系统的用法

1)将表6所述各质粒与悬于电转缓冲液中的5×10⁵个Vero细胞混匀，移入伯乐公司2mm直径电转杯中，设置140V电压电击1次。

2)将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

3)按照实际需要收毒，即可。

实施例7副粘病毒拯救系统2

本系统用于拯救麻疹病毒。

1.拯救系统的组成

拯救系统的各组分如表7所示，其中N质粒、P质粒及L质粒带有T7启动子。

表7副粘病毒的拯救系统2

名称	用量(μg)
		麻疹病毒全长质粒	12
麻疹病毒N质粒	10
		麻疹病毒P质粒	10
麻疹病毒L质粒	8
		pT7-T7RNAP质粒	4
pCDIBP-T7RNAP	4

2.拯救系统的用法

1)将上述拯救系统与悬于电转缓冲液中的5×10⁶个vero细胞混匀，移入伯乐公司2mm直径电转杯中，设置140V电压电击2次。

2)将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

3)按照实际需要收毒，即可。

实施例8一种副粘病毒的拯救系统3

本系统用于拯救腮腺炎病毒。

1.拯救系统的组成

拯救系统各组分如表8所示，其中N质粒、P质粒及L质粒带有CMV启动子。

表8副粘病毒的拯救系统3

名称	用量(μg)
		腮腺炎病毒全长质粒	12
腮腺炎病毒N质粒	8
		腮腺炎病毒P质粒	4
腮腺炎病毒L质粒	8
		pT7-T7RNAP质粒	2
pCDIBP-T7RNAP	4

2.拯救系统的用法

1)将上述拯救系统与悬于电转缓冲液中的1×10⁵个Vero细胞混匀，移入伯乐公司2mm直径电转杯中，设置140V电压电击1次。

2)将电转后细胞移入T25瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养24h后换液5mlMEM或DMEM低糖培养基(含10％NBS)，第3天后开始观察细胞病变。

3)按照实际需要收毒，即可。

为了验证pT7-T7RNAP质粒放大T7 RNA聚合酶表达对下游质粒表达的促进作用，本发明还提供了以下实验例。

实验例中均使用可稳定表达T7 RNA聚合酶的工程化细胞—BSRT7细胞。

实验例1 pT7-T7RNAP对pT7-IRESGFP质粒GFP表达的影响

转染方法：脂质体转染。

转染试剂：Lipofectamine^TM3000。

将BSRT7细胞于6孔板中37℃培养过夜，待其细胞汇合度约为80％～90％时进行转染。A孔4μg pT7-IRESGFP质粒或B孔4μg pT7-IRESGFP质粒，4μgpT7-T7RNAP质粒，分别与100μl DMEM培养液混匀，再与已预混10μl Lipofectamine^TM3000的100μl DMEM培养液混匀，室温放置30min后滴加至6孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱培养5h，更换新配制的含2％FBS的DMEM培养液，培养72h后，观察荧光表达情况。

结果显示：B孔中可见更多的绿色荧光信号。说明pT7-T7RNAP在BSRT7细胞中提供了更多的T7RNA聚合酶，增强了绿色荧光蛋白GFP在BSRT7细胞中的表达(图8)。

实验例2 pT7-T7RNAP对重组麻疹病毒及副粘病毒在BSRT7细胞中拯救效率的影响。

所用辅助质粒：pT7-MV_S191N、pT7-MV_S191P、pT7-MV_S191L、pT7-T7RNAP；其中前三个为各组实验病毒对应的N、P和L蛋白质粒。

转染方法：脂质体转染。

转染试剂：Lipofectamine^TM3000。

质粒用量如表9所示。

表9 BSRT7细胞中拯救实验的质粒用量

在BSRT7细胞中添加pT7-T7RNAP，可表达更多的T7 RNA聚合酶，有利于各质粒后续的表达，提高不同病毒拯救效率。

以上实施例和实验例表明，本发明的病毒拯救方法，能成功拯救副粘病毒，且避免了现有技术中重组痘病毒带来的潜在危害，也免于花费大量时间和精力构建工程化稳定表达T7RNA聚合酶的细胞，具有很好的应用前景。

附录 部分序列

pCDIBP-T7RNAP的序列(SEQ ID NO.1)：

pT7-T7RNAP的序列(SEQ ID NO.2)：

SEQUENCE LISTING

<110> 成都生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种副粘病毒的拯救系统和副粘病毒拯救方法

<130> GY014-18P1709

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7381

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pCDIBP-T7RNAP

<400> 1

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780

agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840

tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900

tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 960

cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020

ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080

gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgc caccatgaac accatcaata 1740

ttgccaagaa cgacttttct gatatcgagc tggccgctat tccattcaat acactggctg 1800

accactacgg agagcggctg gcccgcgaac agctggctct ggagcatgaa agctatgaga 1860

tgggagaagc ccgattcagg aagatgtttg agaggcagct gaaagctggg gaagtggcag 1920

acaacgcagc cgctaagcca ctgattacca cactgctgcc caaaatgatc gccagaatta 1980

atgattggtt cgaggaagtg aaggcaaaac gaggaaagag gcctaccgcc ttccagtttc 2040

tgcaggagat caagccagaa gctgtggcat acatcaccat caagactacc ctggcatgcc 2100

tgacaagcgc cgacaacaca actgtgcagg cagtcgcttc cgcaatcgga cgagctattg 2160

aggacgaagc acgctttggg agaatccggg atctggaggc caagcacttc aagaaaaacg 2220

tggaggaaca gctgaacaag agggtggggc atgtctataa gaaggccttc atgcaggtgg 2280

tcgaggccga catgctgtca aagggactgc tgggaggaga ggcctggagc tcctggcaca 2340

aagaagatag catccatgtg ggagtccgct gcatcgagat gctgattgaa tctactggga 2400

tggtgagtct gcaccgacag aacgccggcg tggtcggaca ggactctgag acaatcgaac 2460

tggctcccga gtatgccgaa gctattgcaa ctagagccgg agctctggca gggatcagtc 2520

caatgttcca gccctgcgtg gtccccccta agccttggac tggcatcacc gggggcggat 2580

actgggctaa tggaaggaga ccactggcac tggtgcgaac acactctaag aaagccctga 2640

tgagatacga ggatgtctat atgcccgaag tgtataaggc catcaacatt gctcagaata 2700

cagcatggaa aattaacaag aaagtgctgg ccgtcgctaa tgtgatcact aagtggaaac 2760

attgtcccgt ggaggacatc cctgccattg aacgggagga actgcctatg aagccagagg 2820

acatcgatat gaaccctgaa gctctgaccg catggaagcg cgcagccgct gcagtgtaca 2880

gaaaggataa agcccggaag tcccggcgca tttctctgga gttcatgctg gaacaggcca 2940

acaagtttgc taatcacaaa gcaatctggt tcccctacaa catggactgg cgcggacgag 3000

tctatgccgt gagcatgttc aaccctcagg ggaatgatat gacaaagggc ctgctgactc 3060

tggctaaggg gaaaccaatt gggaaggagg gctactattg gctgaaaatc cacggggcca 3120

attgcgctgg cgtcgacaag gtgccattcc ccgagaggat caagttcatc gaggaaaacc 3180

atgaaaatat tatggcatgt gccaagtctc ccctggagaa cacatggtgg gccgaacagg 3240

atagtccttt ctgctttctg gccttctgtt ttgagtacgc tggagtgcag caccatgggc 3300

tgagttataa ttgctccctg ccactggcct ttgacggctc ttgtagtgga atccagcact 3360

tctccgcaat gctgagggat gaggtcggag gaagagcagt gaacctgctg ccatctgaga 3420

cagtgcagga catctacggc attgtcgcca agaaagtgaa tgagatcctg caggctgacg 3480

caattaacgg gactgataat gaggtggtca ccgtcacaga tgaaaacact ggcgagatca 3540

gcgaaaaggt gaaactggga accaaggccc tggctggaca gtggctggca tacggagtca 3600

cccgctcagt gacaaagcga agcgtgatga ccctggctta tggcagcaaa gagttcggct 3660

tcaggcagca ggtgctggaa gacaccatcc agccagccat tgattccgga aaggggctga 3720

tgtttacaca gcccaaccag gccgctggct acatggccaa gctgatctgg gagtcagtga 3780

gcgtcacagt ggtcgcagcc gtggaagcta tgaattggct gaagtccgct gcaaaactgc 3840

tggccgctga ggtgaaggac aagaaaactg gcgaaattct gaggaaaaga tgcgccgtcc 3900

actgggtgac ccctgatgga ttcccagtgt ggcaggagta taagaaaccc atccagacca 3960

gactgaacct gatgttcctg ggccagtttc ggctgcagcc tacaatcaac actaataagg 4020

acagtgagat tgatgctcat aaacaggaat cagggattgc acctaatttt gtgcacagcc 4080

aggacggctc ccatctgcgg aagactgtgg tctgggctca cgagaaatac ggcatcgaat 4140

ccttcgcact gattcatgac tcttttggaa ccatcccagc cgatgcagcc aacctgttca 4200

aggctgtccg cgagactatg gtggacacct acgaaagttg tgatgtgctg gccgacttct 4260

atgatcagtt tgctgaccag ctgcacgagt cacagctgga taagatgccc gcactgcctg 4320

ccaaaggcaa cctgaatctg agagacatcc tggagtccga tttcgcattt gcctgactcg 4380

aggatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4440

cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4500

tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg 4560

tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt tggctataaa 4620

gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc cttattccat agaaaagcct 4680

tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt atttttttct ttaacatccc 4740

taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct cctctcctga ctactcccag 4800

tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat ccctcgacct gcagcccaag cttggcgtaa 4860

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 4920

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 4980

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gcggatccgc 5040

atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 5100

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 5160

ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 5220

taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 5280

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 5340

caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg gatccgctgc attaatgaat cggccaacgc 5400

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 5460

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 5520

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 5580

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 5640

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 5700

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 5760

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 5820

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 5880

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 5940

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 6000

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 6060

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 6120

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 6180

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 6240

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 6300

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 6360

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 6420

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 6480

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 6540

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 6600

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 6660

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 6720

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 6780

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 6840

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 6900

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 6960

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 7020

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 7080

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 7140

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 7200

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 7260

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 7320

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgggtcgac attgattatt 7380

g 7381

<210> 2

<211> 6028

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> pT7-T7RNAP

<400> 2

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

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actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

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gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

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cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt taatacgact cactataggc aaccatgata acgttactgg 2280

ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt 2340

gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc 2400

taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc 2460

agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg 2520

gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc 2580

tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa 2640

atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg 2700

tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa 2760

aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 2820

tatggccaca accatggatg aacacgatta acatcgctaa gaacgacttc tctgacatcg 2880

aactggctgc tatcccgttc aacactctgg ctgaccatta cggtgagcgt ttagctcgcg 2940

aacagttggc ccttgagcat gagtcttacg agatgggtga agcacgcttc cgcaagatgt 3000

ttgagcgtca acttaaagct ggtgaggttg cggataacgc tgccgccaag cctctcatca 3060

ctaccctact ccctaagatg attgcacgca tcaacgactg gtttgaggaa gtgaaagcta 3120

agcgcggcaa gcgcccgaca gccttccagt tcctgcaaga aatcaagccg gaagccgtag 3180

cgtacatcac cattaagacc actctggctt gcctaaccag tgctgacaat acaaccgttc 3240

aggctgtagc aagcgcaatc ggtcgggcca ttgaggacga ggctcgcttc ggtcgtatcc 3300

gtgaccttga agctaagcac ttcaagaaaa acgttgagga acaactcaac aagcgcgtag 3360

ggcacgtcta caagaaagca tttatgcaag ttgtcgaggc tgacatgctc tctaagggtc 3420

tactcggtgg cgaggcgtgg tcttcgtggc ataaggaaga ctctattcat gtaggagtac 3480

gctgcatcga gatgctcatt gagtcaaccg gaatggttag cttacaccgc caaaatgctg 3540

gcgtagtagg tcaagactct gagactatcg aactcgcacc tgaatacgct gaggctatcg 3600

caacccgtgc aggtgcgctg gctggcatct ctccgatgtt ccaaccttgc gtagttcctc 3660

ctaagccgtg gactggcatt actggtggtg gctattgggc taacggtcgt cgtcctctgg 3720

cgctggtgcg tactcacagt aagaaagcac tgatgcgcta cgaagacgtt tacatgcctg 3780

aggtgtacaa agcgattaac attgcgcaaa acaccgcatg gaaaatcaac aagaaagtcc 3840

tagcggtcgc caacgtaatc accaagtgga agcattgtcc ggtcgaggac atccctgcga 3900

ttgagcgtga agaactcccg atgaaaccgg aagacatcga catgaatcct gaggctctca 3960

ccgcgtggaa acgtgctgcc gctgctgtgt accgcaagga caaggctcgc aagtctcgcc 4020

gtatcagcct tgagttcatg cttgagcaag ccaataagtt tgctaaccat aaggccatct 4080

ggttccctta caacatggac tggcgcggtc gtgtttacgc tgtgtcaatg ttcaacccgc 4140

aaggtaacga tatgaccaaa ggactgctta cgctggcgaa aggtaaacca atcggtaagg 4200

aaggttacta ctggctgaaa atccacggtg caaactgtgc gggtgtcgat aaggttccgt 4260

tccctgagcg catcaagttc attgaggaaa accacgagaa catcatggct tgcgctaagt 4320

ctccactgga gaacacttgg tgggctgagc aagattctcc gttctgcttc cttgcgttct 4380

gctttgagta cgctggggta cagcaccacg gcctgagcta taactgctcc cttccgctgg 4440

cgtttgacgg gtcttgctct ggcatccagc acttctccgc gatgctccga gatgaggtag 4500

gtggtcgcgc ggttaacttg cttcctagtg aaaccgttca ggacatctac gggattgttg 4560

ctaagaaagt caacgagatt ctacaagcag acgcaatcaa tgggaccgat aacgaagtag 4620

ttaccgtgac cgatgagaac actggtgaaa tctctgagaa agtcaagctg ggcactaagg 4680

cactggctgg tcaatggctg gcttacggtg ttactcgcag tgtgactaag cgttcagtca 4740

tgacgctggc ttacgggtcc aaagagttcg gcttccgtca acaagtgctg gaagatacca 4800

ttcagccagc tattgattcc ggcaagggtc tgatgttcac tcagccgaat caggctgctg 4860

gatacatggc taagctgatt tgggaatctg tgagcgtgac ggtggtagct gcggttgaag 4920

caatgaactg gcttaagtct gctgctaagc tgctggctgc tgaggtcaaa gataagaaga 4980

ctggagagat tcttcgcaag cgttgcgctg tgcattgggt aactcctgat ggtttccctg 5040

tgtggcagga atacaagaag cctattcaga cgcgcttgaa cctgatgttc ctcggtcagt 5100

tccgcttaca gcctaccatt aacaccaaca aagatagcga gattgatgca cacaaacagg 5160

agtctggtat cgctcctaac tttgtacaca gccaagacgg tagccacctt cgtaagactg 5220

tagtgtgggc acacgagaag tacggaatcg aatcttttgc actgattcac gactccttcg 5280

gtaccattcc ggctgacgct gcgaacctgt tcaaagcagt gcgcgaaact atggttgaca 5340

catatgagtc ttgtgatgta ctggctgatt tctacgacca gttcgctgac cagttgcacg 5400

agtctcaatt ggacaaaatg ccagcacttc cggctaaagg taacttgaac ctccgtgaca 5460

tcttagagtc ggacttcgcg ttcgcgtaat ctagaatcga agggcgccac catcaccatc 5520

accattaggt aatctctgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tagcataacc 5580

ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttggat catccgcggc cgctaattca 5640

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 5700

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 5760

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 5820

acgcatctgt gcggtatttc acaccggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 5880

tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 5940

ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 6000

ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 6028

Claims (10)

1.一种副粘病毒的拯救系统，其特征在于，它包括：病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒和pT7-T7RNAP质粒；

所述病毒基因组质粒是带有T7启动子、且带有副粘病毒的基因组或反基因组序列的质粒；

所述N质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应N蛋白或NP蛋白的DNA序列的质粒；

所述P质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应P蛋白的DNA序列的质粒；

所述L质粒是带有启动子序列和前述副粘病毒对应L蛋白的DNA序列的质粒；

所述pCDIBP-T7RNAP质粒是带有CMV启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒；

所述pT7-T7RNAP质粒是带有T7启动子和T7RNA聚合酶DNA序列的质粒。

2.如权利要求1所述的拯救系统，其特征在于，所述pCDIBP-T7RNAP质粒具有如SEQ IDNO.1所述的序列。

3.如权利要求1或2所述的拯救系统，其特征在于，所述pT7-T7RNAP质粒具有如SEQ IDNO.2所示的序列。

4.一种副粘病毒拯救方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1～3所述病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP质粒和动物细胞混合；

(2)使用物理或化学方法介导多质粒共转染；

(3)培养细胞；

(4)收集病毒。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述N质粒、P质粒和L质粒所带的启动子是T7启动子；病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP按所述顺序的质量比例是12:(8～10):(4～10):(1～8):4:4。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述N质粒、P质粒和L质粒所带的启动子是CMV启动子；病毒基因组质粒、N质粒、P质粒、L质粒、pCDIBP-T7RNAP质粒、pT7-T7RNAP按所述顺序的比例是12:(8～10):(4～10):8:4:(2～4)。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤(2)细胞数不低于5×10⁵个，所述病毒基因组质粒用量不低于12微克。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述动物细胞为CHO、MRC-5、WI-38、HEK 293、EB66和Vero细胞中的至少一种。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述动物细胞为Vero细胞。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的物理或化学方法为电穿孔法或脂质体转染法。

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