KR101027755B1 - 바이러스 생산용 불멸화된 조류 세포주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 예방접종용 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산에 적합한 불멸화된 조류 세포주에 관한 것이다. 특히, 상기 세포주는 이 중의 하나가 세포 주기 진행을 야기하는 반면, 다른 하나는 조절곤란한 복제에 의해 유도된 세포의 타고난 방어 기작을 방해하는, 2개 이상의 바이러스 또는 세포 유전자로 형질전환된 1차 세포로부터 유래된다. 본 발명은 더욱이 상기 불멸화된 세포주의 생산 및 예방접종용 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 예방접종용 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산에 적합한 불멸화된 조류 세포주에 관한 것이다. 특히, 상기 세포주는 이 중의 하나가 세포 주기 진행을 야기하는 반면, 다른 하나는 조절곤란한 복제에 의해 유도된 세포의 타고난 방어 기작을 방해하는, 2개 이상의 바이러스 또는 세포 유전자로 형질전환된 1차 세포(primary cell)로부터 유래된다. 본 발명은 더욱이 상기 불멸화된 세포주의 생산 및 예방접종용 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
병아리 발육란은 여전히 인간 백신의 생산에 대한 주요 기질 중의 하나이다. 이는 다양한 범위의 인간 및 동물 바이러스의 복제를 지지할 수 있다. 상기 스펙트럼은 약독화된 바이러스, 즉, 인간 또는 포유동물 세포에서 복제하는 능력을 손상시켰으므로, 백신으로서 이용될 수 있는 결손 바이러스를 포함한다. 약독화는 발육란에서 연속적인 계대에 의해 생성되거나 또는 유지될 수 있다. 인간 백신 생산에 이용된 병아리 계란은 지정된 세트의 바이러스 및 박테리아 오염이 없다는 것이 인증되어야 한다(특정 병원균 부재 또는 SPF). SPF 계란은 상업적인 공급자로 부터 유용하다. 폭넓은 적용가능성 및 장기간의 국제적인 트랙 기록은 명확한 단점에도 불구하고 상기 전략을 살아남게 했다:
병아리 및 발육란의 SPF 무리는 비싸며, 백신 비용의 40%까지를 차지할 수 있다. 더욱이, SPF 무리에서 질병의 주기적인 출현에 의해 입증된 완전히 병원균이 없는 SPF 무리를 연속적으로 유지하는 것은 어렵다. 백신 로트(lot)는 SPF 공급자가 백신 로트를 제조하기 위해 이용된 발육란에 대한 부모 병아리가 임의의 질병이 완전히 없다는 것을 확인할 때까지 방출될 수 없다. 상기 불확실성은 상기 백신의 제조에 현저한 비용을 추가한다. 특정 백신(예를 들면, 인플루엔자)의 갑작스러운 요구에 대한 일반적인 상황에서, SPF 계란의 공급은 심각하게 제한될 수 있다. 또한, 계란을 감염시기코, 바이러스 성장을 유지하는 대규모 방법은 시간이 많이 걸리고, 종종 상이한 백신 배취에 걸쳐 일관성이 없다.
세포 배양 기술의 개발로, 백신 제조자는 발육란을 분리된 병아리 배아 섬유모세포로 대체하였다. 1차 세포 배양물의 이용이 제조 방법의 안전성 프로필, 효율 및 신뢰성을 개선하지만, 또한 비용을 증가시킨다: 병아리 섬유모세포는 생존 세포를 확립하고, 증폭하기 위해 배아를 잘게 썰어서 SPF 계란으로부터 제조된다. 1차 동물 세포에 전형적인 섬유모세포는 노화를 겪는다: 배가 시간은 계대에 따라 증가하며, 결국 모든 세포는 사멸한다. 상기 과정은 백신 제조에 현재 이용되는 설치류 또는 특정 인간 세포 기질(예를 들면, MRC-5 또는 WI-38)에 대한 것보다 훨씬 초기에, 약 20 계대 후에 일어난다. 섬유모세포 배양은 제조 과정에 부가적인 위험 인자를 추가하면서, 5-10% 소태아혈청의 존재하에 유지될 필요가 있다. 이는 또한 증식을 위해 고체 표면을 요구하며, 생물반응기 적용에 대한 바람직한 상태인 현탁액에서는 성장하지 않는다. 다중층 세포 공장의 이용에서조차도, 이는 스케일업 절차를 실질적으로 제한한다. 제한된 수명으로 인해, 완전한 세트의 안전성 시험이 병아리 섬유모세포의 각 로트에 적용될 필요가 있다.
섬유모세포는 잘 증식하는 병아리 배아 유래의 다양한 상이한 조직 중에서 유일한 세포 유형이다. 기타 세포 유형과 비교하여 섬유모세포의 우세는 특정 경우에 이론적인 바이러스 수율을 감소시켰는데, 이는 계란에서 전형적으로 상피 세포층인 융모요막이 바이러스 증폭에 대한 주요 자리이기 때문이다.
상기 논의된 문제는 지난 2년(2003 및 2004)에 심각한 인플루엔자 백신 부족에 기여하였다. 상기 한계를 극복하기 위해, 합성 배지, 바람직하게는 현탁액 또는 적어도 담체 상에서 자라는 영구 세포주가 매우 바람직할 수 있다.
병아리 섬유모세포에서 전형적으로 자라는 바이러스의 일부는 특정 세포주에 적응되었다. BHK-21 (베이비 햄스터 신장) 세포는 다양한 우두, 인플루엔자, 및 광견병 백신 균주의 성장을 지지하며(Drexler, I. et al., J. Gen. Virol. 79 (Pt2): 347-52 (1998); Gumusderelioglu M. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 33: 167-72(2001); Merten, O.W. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 397: 141-51(1996)), 무혈청 조건하에 담체 상에서 큰 발효기에서 용이하게 성장한다 (Pay, T. W. et al., Dev. Biol. Stand 60: 171-4 (1985); Gallegos, R. M. et al., Arch. Med. Res. 26: 59-63(1995)). 우두에 대해, 상기는 병아리 세포 상에서 개발된 매우 약독화된 균주 Ankara (MVA)에조차도 적용된다. BHK-21 세포주는 가축 동물에 대한 특정 백신의 생산에 대해 허용된다 (Lubiniecki, A. S., Bioprocess Technol. 10: 495-513(1990)). 그러나, 상기 BHK-21 세포주는 인간 생백신에 대한 안전성 요건을 만족시키지 못한다. BHK 세포는 자발적으로 형성되며, 매우 종양생성적이며, 이의 병력은 불충분하게 보고된다.
세포 기질에 관한 FDA, CBER 논의(2000.5.12)에 따라, 인간 및 기타 포유동물 유래 또는 미지의 기작에 의해 형질전환된 인간 세포 및 포유동물 세포 유래의 천연적으로 발생하는 종양으로부터 유래된 종양 세포에서 "최소로 정제된 생-약독화된 바이러스 백신 및 바이러스 벡터 백신"의 개발은 단념된다.
상기 규칙에 대한 예외로서, VERO 세포주(아프리카녹색원숭이에서 기원함)는 지정된 수의 계대 동안 입증된 안전성 프로필 및 형질전환된 표현형의 결핍에 기초하여 백신 제조용 세포 기질로서 허용된다. 상기 세포주는 임상 용도용 회색질척수염 및 마마 백신의 제조에 널리 이용되어 왔다. 그러나, VERO 세포는 부착을 요하며, 담체 기재 방법에 단지 순응한다.
부가적으로, 기재된 약력을 갖는 MDCK 세포 (개 신장 상피 유래의 자발적인 세포주)는 인플루엔자 바이러스의 제조에 적용되어 왔다 (Tree, J. A. et al., Vaccine 19: 3444-50(2001)).
더욱 최근에, 벡터 기재 백신의 개발 및 유전자요법 접근에 의해 유발되어, 인간 기원의 신규 소위 변조(designer) 세포주가 집중적으로 논의되며, 백신 생산을 위한 잠재적인 세포 기질의 스펙트럼에 포함된다 (Vaccines and Related Biological Products advisory committee, session from May 16,2001). 신규 영구 세포주가 생산 시스템 외부로 복제 결핍인 재조합 바이러스에 대한 상보(complementing) 유전자를 제공하기 위해 생성되었다. 그러나, 상보 유전자의 안정한 도입은 연장된 배양 시간을 요하며, 이는 1차 세포에 유용한 계대수의 천연 한계 또는 완전한 형질전환이 일어나기 전에 VERO 세포에 대한 계대수의 허용된 제한을 초과한다.
변조 세포주는 형질전환용 규명된 유전자를 이용하여 광대한 문서 조사로 시험관 내에서 생성된다. 예를 들면, 아데노바이러스의 E1 영역 유래의 상보 유전자는 단독으로 형질전환 특성을 나타내며, 인간 세포주, 예를 들면 PER.C6의 확립을 허용하였다 (Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1909-17(1998)). 상기 세포주의 적용은 이들이 디자인된 바이러스 벡터에 제한되지 않고, 기타 바이러스에 확장될 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스는 PER.C6에서 증식될 수 있다 (Pau, M.G. et al., Vaccine 19: 2716-21(2001)). 그러나, 상기 발견은 백신 개발과 관련된 모든 바이러스, 특히 조류 바이러스, 예를 들면, 마레크 병, 감염성 점액낭병, 뉴캐슬병, 칠면조 헤르페스, 또는 병아리 빈혈 바이러스에 적용되지 않는다. 상기 바이러스의 일부는 포유동물 세포주에서 잘 복제하지만, 바이러스 성장은 종종 불량하다. 기타 바이러스에 대해, 복제는 불량하며, 특정의 특히 적응된 균주에 제한된다.
또한, 영장류 유래된 세포 기질에 대한 적응과 함께, 바이러스 상의 수용체 결합 자리는 변형된 항원 패턴을 초래하면서 변할 것 같으므로, 면역원성에 일반적으로 영향을 줄 것 같다. 상기 유전적 적응은 조류 세포에서 계대를 통해 개발된 균주, 예를 들면, MVA 또는 병아리-적응된 홍역 바이러스에 대한 약독화를 반전시킬 수 있거나 (Escoffier, C., Gerlier, D., J. Virol. 73: 5220-4(1999)), 또는 이의 야생형 분리물과 비교하여 인간 세포에서 더욱 효율적으로 복제하는 신규 균주를 생성할 수 있다. 상기 바이러스는 또한 더욱 높은 병원성 잠재력을 수득할 수 있다.
상기 이유로, 백신 제조자는 포유동물 세포주로 전환하기를 꺼리며, 불멸의 조류 세포주에 대한 요구가 발생되었다.
조류 알파레트로바이러스에 의해 조류에서 종양 유도의 조사는 먼저 일반적으로 세포 형질전환에 대한 분자적 통찰력을 제공하였다. 레트로바이러스 종양유전자는 필수적인 조절자 도메인이 돌연변이되거나 또는 결실된 세포 유전자로부터 유래된다. 상기 연구 과정에서 확인된 인자의 일부, 예를 들면, v-myc 또는 v-ras는 망막모세포종 (RB) 및 p53 경로 양자에 직접 영향을 준다. 기타 단백질, 예를 들면, v-src 또는 v-erbB는 침해하는(impinging) 세포외 분열촉진물질을 모방하는 구성적으로 활성화되는(그리하여, 조절곤란한) 신호 변환기이다. 상기 인자에 대한 문제점은 이들이 효율적인 형질전환에 필요한 몇 가지 경로 중의 단지 하나를 표적화한다는 것이다. v-src 또는 v-myc의 존재는 세포를 형질전환하기 쉽게 하고, 완전한 형질전환을 위해 세포 내에 부가적이고, 자발적이며 예상할 수 없는 변경을 요한다. 레트로바이러스 종양유전자 중의 하나로 형질전환된 세포에 의해 부과된 환자의 위험은 그러므로 평가하기 어렵다.
기타 경우에, 단일 강한 종양 항원(예를 들면, v-jun)이 직접 종양 형성을 야기할 수 있다 (Hartl, M. et al., Curr. Cancer Drug Targets 3: 41-55(2003)). 많은 조류 바이러스 종양유전자는 포유동물 세포에서 이의 종양유전자 잠재력을 유지한다.
상기 바이러스에 의해 생성된 세포주는 백신 제조에 적합하지 않다. 종양유전자를 운반하는 레트로바이러스는 백신과 함께 활성화되고, 전달될 수 있다. 바이러스 LTR에 의해 둘러싸이지 않은 종양 항원조차도 보체 항원의 도움 없이 포유동물 세포를 형질전환할 수 있을 때 고위험을 제기할 수 있다. 상기 위험은 전형적으로 형질전환 잠재력, 백신의 수 및 백신 바이러스와 함께 전달되는 세포 핵산의 양의 고려에 의해 평가된다. 상기 양은 정제 방법의 효율에 의해 제한되며, 현재 10 pg/투여량으로 감소될 수 없다. 상기 기준은 특히 종종 건강한 집단이 매우 어린 나이에 접종되는 백신 생산에 엄격하다.
동일한 주장이 형질전환 DNA 바이러스, 예를 들면, 파필로마바이러스 및 폴리오마바이러스에 적용된다. 상기 바이러스는 공격적인 종양유전자로 장착된다: SV40 거대 T 항원은 세포 주기의 G1에서 체크포인트 조절 및 p53 활성 양자에 영향을 주는 다기능 단백질이다. 그러므로, 거대 T는 용이하게 설치류 및 인간 기원의 복수의 포유동물 조직을 불멸화하고, 형질전환한다. (거대 T 작용을 증진시키고, 부가적으로 AKT3 경로를 조절하는) 작은 T 항원의 첨가로, 조류 세포를 불멸화시키는 것이 가능하였다 (미국특허출원 2001-0016348의 일부). 그러나, 정교한 최근의 정제 방법에서조차, SV40 거대 T 항원은 인간 의학에 적용하기 위해 생성된 세포주에 이용하기에 너무 공격적인 것으로 고려된다. 상기와 대조적으로, 본 발명에서 제안된 유전자는 별개의 인자를 통해 세포 주기 및 p53 불활성화의 체크포인트 조절에 영향을 준다: 형질전환에 대한 2가지 특유의 인자의 요구된 동시의 전달 경우는 백신에 대한 임의의 이론적인 위험을 급격하게 감소시킨다.
미국특허출원 2001-0016348은 본 발명과 완전히 관련 없는 항-아폽토시스 경로의 이용을 기재한다. 이는 제1 유전자에 의해 야기된 강제적인 세포 주기 진행으로 인한 아폽토시스에 대한 내부 신호에 반대하는 제2 유전자를 제공하지는 않는다. 아폽토시스는 또한 다양한 외부 자극, 예를 들면, 성장인자의 결핍 또는 고정의 손실에 의해 유도될 수 있다. 상기 유형의 프로-아폽토시스 신호의 전달은 미국특허출원 2001-0016348의 핵심인 bcl-2 패밀리 유전자에 의해 저해될 수 있다.
90%의 자궁경부 암종이 파필로마바이러스 서열을 가지고 있지만, C-유형 아데노바이러스 (유형 2 및 5 포함)는 생체 내에서 종양을 유도하지 않는 것으로 생각되며, 아데노바이러스 서열은 인간 종양 조직에서는 검출되지 않았다.
대안적으로, 병아리 배아 섬유모세포의 연속적인 계대에 의해 세포주를 개발하려고 시도하였다. 설치류 세포가 자발적인 불멸화를 꽤 용이하게 경험하는 것처럼 보이지만 (Curatolo et al., In vitro 20: 597-601(1984)), 조류 및 영장류 세포는 상기 접근에 매우 저항성이다 (Harvey, et al., Genes and Development 5: 2375-2385 (1991); Pereira-Smith, J. Cell Physio. 144: 546-9 (1990); Smith et al., Science 273: 63-67(1996)). 조류 또는 영장류 기원의 체세포는 텔로머라아제가 결핍되며, 노화는 염색체 말단(텔로미어)의 짧아짐에 의해 야기된다. 그럼에도 불구하고, 병아리 섬유모세포주 UMNSAH-DF1이 상기 접근법을 이용하여 개발되었 다 (미국특허 제5,672,485호 및 제6,207,415호). 상기 접근에 의한 불멸화는 복수의 종양유전자 또는 종양 억제자 유전자에서 자발적인 돌연변이에 의해 야기된다. 이는 기타 조직 기원의 세포에서 특히 재현될 것 같지 않은 희귀한 경우이다. 가장 중요하게, 상기 접근은 종양유전자 전달의 위험을 평가하는 불멸화 유전자에 관한 상세한 지식을 제안하는 인간 생백신에 대한 일반적인 규칙으로서 지정된 위험(Defined Risk)에 반박한다. 다시, FDA (CBER Discussion from May 12,2000, 세포 기질에 관함)에 따라, 천연적으로 발생하는 종양으로부터 유래된 종양 세포 또는 미지의 기작에 의해 형질전환된 세포의 이용은 최소로 정제된 생-약독화된 바이러스 백신 및 바이러스 벡터 백신의 개발을 단념시켰다.
자발적으로 개발된 UMNSAH-DF1 병아리 섬유모세포주는 E2F 및 p53 활성에서 변경을 나타낸다 (Kim et al., Oncogene 20: 2671-82 (2001)). 이는 증진된 세포 주기 활성이 활성 E2F를 요구하고, 높은 E2F 활성은 활성 p53의 존재하에 아폽토시스를 유도한다는 포유동물 세포 연구로부터 알려져 있기 때문에 놀랍지 않다. 상기 연구는 원인이 되는 사건을 해명하지 않고 불멸 단계를 규명한다: 수많은 유전자에서 돌연변이는 불멸화를 야기할 수 있었다.
자발적인 형질전환 과정은 화학적 돌연변이원의 이용에 의해 증진될 수 있다 (미국특허 제5,989,805호). 상기 접근을 이용하여 생성된 특정 세포주는 노화를 극복하였으나, 섬유모세포 유사 외관을 유지하였으며, 비-종양생성이다. 이는 현저한 안전성 특징을 나타내지만, 상기 세포는 대규모 발효 기술에 대해 가치가 낮다. 더욱이, 상기 기회에 기초한 접근은 또한 지정된 위험 지침에 반박한다.
천연적으로 발생하는 종양에서 기원하는 조류 세포주, 예를 들면, 메추라기 섬유육종(WO 97/08307)이 또한 생물 제조에 대해 제안되었다. 다시, 인간 백신 생산에 이용하기 위한 지정된 위험 지침은 기회 사건(chance event)에 기초한 방법에 의해 위반된다.
전술한 연구에서 취한 접근은 본 발명에 따른 불멸화 유전자의 특정 그룹의 능동적인 도입과 첨예하게 대조적이며, 이는 불멸화에 대한 원인 물질을 지정하며, 위험을 평가하는 것을 허용하며, 다양한 조직의 선발에 대해 높은 융통성을 제공하며, 생성된 세포주의 특정 특징을 조절하게 한다.
병아리 계란 및 섬유모세포가 상당한 트랙 기록을 가진다는 사실에도 불구하고, 이는 또한 최근에 단지 집중을 받는 매우 특이적인 위험 인자와 관련된다: 병아리 세포는 적어도 2가지 유형의 레트로바이러스 입자인 내재하는 조류 레트로바이러스 (EAV) 및 내재하는 조류 백혈병 바이러스 (ALV-E)를 방출한다. 이슈는 재조합 단백질 (예를 들면, NSO)의 제조에 이용된 마우스 세포에서 내재하는 레트로바이러스 입자의 존재와 유사하다. 그러나, 마우스 세포와 대조적으로, 병아리 세포는 역전사효소를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 효율적인 검출 기술로 인해, RT 활성은 또한 병아리 세포 유래된 홍역, 볼거리 및 황열병 백신에서 검출되었다 (Hussain, A. I. et al., J. Virol. 77: 1105-11(2003); Shahabuddin, M. et al., J. Clin. Microbiol. 39: 675-84(2001)). 역전사효소 활성의 존재가 전파성 레트로바이러스를 초래하는가는 논쟁의 여지가 있다: 더욱 상세한 분석은 CEF (White Leghorn 유래)가 통합된 EAV를 갖는 5개의 좌위를 포함하는데, 이 중에서 2개는 감 염성 ALV-E를 발현할 수 있는 반면, 기타 3개는 결함이라는 것을 보여주었다 (Johnson, J. A., Heneine, W., J. Virol. 75: 3605-12(2001)). Tsang, S.X. 등(J. Virol. 73: 5843-51(1999))은 또한 RT 활성 및 바이러스 입자의 방출을 발견하였으나, 볼거리 백신을 수용한 어린이의 혈액 단핵세포에서 EAV 서열에 대한 조심스러운 탐색 후에 임의의 전파를 관찰하지 않았다. WHO (73) 28 (1998)의 주간 역학 기록에 따라, 독립적인 실험실은 광대한 동시 배양에 의해 다양한 인간 및 기타 포유동물 세포에 대해 상기 입자의 감염성을 조사하였으며, RT 활성 또는 생산적인 감염의 전파를 검출할 수 없었다. 상기 발견은 병아리세포 유래 백신의 이용 및 어린이의 것을 포함하는 암의 발생 사이의 어떠한 관련도 밝히지 못하였다.
더욱이, 언급한 주간 역학 기록에서, WHO는 특정 백신 균주의 약독화를 유지하기 위해 병아리 숙주 세포의 중요성을 강조한다. 대안적인 생산 방법이 현재 유용하지 않으며, 대안의 부족은 바이러스 오염물질의 공지되고, 연속적인 공급원의 수용에 대한 중요한 이유이다.
그러나, 역학 연구는 집단을 겹치게 하고, 기회 사건 또는 케이스 연구를 조사하지 않는다. 역학 연구는 예를 들면 이론적인 위험을 반박할 수 없다: 허용된 내재하는 RT 활성은 허용불가능한 외래의 오염으로부터 RT 활성을 마스킹할 수 있으며, 내재하는 바이러스는 패키징 구축물이 세포 내로 도입된다면 고정화되고 활성화될 수 있다 (Ronfort, C. et al., Virology 207: 271-5 (1995)).
그러나, 오리 및 거위 유래의 세포는 EAV 및 ALV 관련 서열을 포함하지 않으며, 일본 메추라기는 역전사효소가 없다는 것이 밝혀졌다 (Smith, L.M. et al., J. Gen. Virol. 80(pt1): 261-8(1999); Brudno, I.A. et al., Vopr. Virusol. 97-100(1980)).
아데노바이러스(AdV)는 잘 규명되어 있으며, 노출된(둘러싸이지 않은) 편재하는 바이러스이다. 가장 통상적인 혈청형 Ad2 및 Ad5에 대해, 인간 집단에서 혈청학적 발현율은 90%에 접근한다. 상기 바이러스의 복제 부적합 버전은 인간 환자에 대한 시도에서 유전자 요법 및 백신 벡터로서 이용된다. 인간 아데노바이러스 5의 E1 영역 유래의 유전자는 시험관 내에서 일부 특정 인간 세포를 형질전환하기 위해 이용되었다 (293 및 PER.C6 세포주; Fallaux, F. J. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1909-17(1998); Graham, F. L. et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977)). 일반적인 방법은 더 강한 다기능 종양유전자, 예를 들면, SV40 거대 T 항원과 비교하여 비효율적이다. 293이 뉴런 특이적 마커를 보여주며, PER.C6이 신경외배엽 기원이라는 관찰에 기초하여, Ad5 El에 기초한 형질전환이 신경 세포에 제한된다고 제안되었다 (Shaw et al. Faseb J 16(8): 869-71(2002)). 인간 및 조류 세포 사이의 현저한 종 장벽을 고려할 때, 트랜스펙션에 의한 복수의 조류 조직의 효율적인 불멸화는 더욱 예기치 않다.
포유동물 E1 형질전환된 세포주가 임상 시험에서 생(live) 정제된 아데노바이러스 벡터의 생산에 이용되었다. 백신 제제에서 오염 세포 DNA의 양 및 이의 크기의 조심스런 모니터링과 함께, Ad5의 형질전환 유전자는 안전한 장애물로 고려되지 않는다 (Vaccines and Related Biological Products advisory committee, session from May 16, 2001).
아데노바이러스는 감염된 세포의 핵에서 복제한다. 비활동적인 숙주 세포는 완전한 바이러스 생활 주기에 대해 허용되지 않기 때문에, 아데노바이러스는 세포를 S-상으로 강제하는 기작을 발전시켰다. 자손 바이러스의 방출수(burst size)를 최대화하기 위해, 또한 캡시드 통과 및 바이러스 복제에 대한 숙주 세포의 반응으로서 아폽토시스를 피하는 기작을 발전시켰다. 세포 주기 진행 및 아폽토시스의 저해 양자를 매개하는 게놈 영역은 El 영역이다.
상기 El 영역은 실제로 일렬로 배열되고, 각각이 이의 자신의 프로모터 및 폴리아데닐화 자리로 장착된 2개의 고유의 발현 카세트, E1A 및 E1B로 이루어진다. 적어도 3개의 단백질이 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 E1A 1차 전사체로부터 번역된다. 이들 중에서, EIA 단백질이 RB/E2F 복합체를 파괴하고, p300 및 CBP 전사 보조 활성화제를 방해하는 것이 밝혀졌다. RB 억제자로부터 E2F의 벗어남은 G1에서 S 상으로 세포 주기의 진행을 유도하는 반면, ElA/p300 복합체는 아폽토시스에 대한 주요 센서인 p53의 음성 조절자인 MdM2의 전사 억제를 포함하는 몇 가지 경로를 통해 아폽토시스를 유도한다 (Putzer, B. M. et al., Cell Death Differ. 7: 177-88(2000)).
ElA가 세포를 TNF 유도된 아폽토시스에 민감하게 할 때, 항종양제를 고려하며, 종양 치료에 대한 실험적인 접근에서 이용된다 (Lee, W. P. et al., Cancer Res. 63: 6229-36 (2003)).
더욱이, 전사 조절자로서 작용하면서, 잠재적인 세포 기질에 대해 유리한 특징인 탈분화로 세포를 유도한다.
Guilhot 등 (Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24(1993))은 Ad5 유래의 E1A의 12S 단백질의 레트로바이러스 형질도입은 메추라기 세포의 불멸화를 초래할 수 있다는 것을 보여주었다. 이는 조류 RB 및 E1A 사이의 상호작용의 결과인 것 같다. 그러나, 유전자가 레트로바이러스 감염 대신에 노출된 DNA의 트랜스펙션에 의해 도입될 때 상기 방법은 실패한다 (개인적인 관찰). 우리는 레트로바이러스 감염을 통한 극도로 효율적이고, 안정한 형질도입이 RB 불활성화시 정상적으로 유도되는 아폽토시스를 봉쇄하는 자발적인 게놈 변화와 함께 개개의 세포를 수용하기에 충분하게 큰 세포 풀을 생성한다고 제안한다. 이러한 요구되나 미지의 변화는 백신에 대한 위험을 증가시키고, 생성된 세포주는 변조 세포주로 고려될 수 없다 (특정 경로에서 지정된 봉쇄의 결과). 더욱이, 레트로바이러스를 통해 도입된 형질전환 유전자는 역방위 말단 반복에 의해 플랭킹되므로, 움직일 수 있다. 상기 사건은 내재하는 레트로바이러스로부터 역전사효소를 발현하는 세포주에서 더욱 현저할 수 있다.
발명의 요약
상기의 면에서, 불멸화/형질전환 유전자의 지정된 조합을 이용하여, 대규모 제조를 위한 편리한 성장 특성을 갖는 조류 세포주를 개발하는 것이 여전히 바람직하다. 상기 유전자의 어느 것도 기타 유전자에 독립적으로 포유동물 세포를 형질전환할 수 없는 것이 바람직하다. 더욱이, 단일 유전자의 작용은 불멸화/형질전환 효과를 가져서는 안 되거나 또는 각각의 유전자를 발현하는 세포의 아폽토시스를 초래해야 한다. 백신 수용자에 연결된 전달의 위험은 또한 각각의 유전자를 별개의 발현 단위에 위치함으로써 최소화되어야 한다. 최종적으로, 인간 집단이 각각의 유전자에 노출될 때, 상기 유전자가 인간 집단에서 종양 형성과 관련되지 않는 것이 바람직할 수 있다. 생성되는 세포주는 내재하는 레트로바이러스 유래의 감염성 바이러스 입자를 방출해서는 안 되거나 또는 역전사효소 활성을 나타내서는 안 된다.
이 중의 하나는 망막모세포종 단백질에, 나머지는 p53 단백질에 영향을 주는 2개의 특정 바이러스 및/또는 세포 유전자로 조류 세포의 형질전환은 예방접종용 바이러스의 생산에 적합한 세포주를 제공한다는 것을 발견하였다.
그리하여 본 발명은 하기를 제공한다:
(1) 하나 이상의 제1 유전자는 망막모세포종 단백질의 기능에 영향을 주며, 하나 이상의 제2 유전자는 p53 단백질 또는 이의 패밀리 멤버에 영향을 주는 바이러스 및/또는 세포 유전자 (이후에 간단하게 "유전자(들)"로서 언급함)의 조합을 이용하여 불멸화된 조류 세포주로서, 바람직하게는 상기 제1 유전자는 Gl 체크포인트 조절을 극복하고, 제2 유전자는 제1 유전자에 의해 유도된 아폽토시스를 막는다;
(2) 출발 세포를 제1 및 제2 유전자로 형질전환/트랜스펙션시키는 것을 포함하는, 상기 (1)에 정의된 세포주의 제조 방법;
(3) 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산, 바람직하게는 백신의 제조 또는 유전자 치료를 위한 상기 (1)에 정의된 세포주의 용도; 및
(4) 상기 (1)에 정의된 세포주를 이용한 바이러스 또는 생물학적 물질의 제조 방법.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 "불멸화된", "불멸화된 세포" 및 "불멸화된 세포주"는 각각의 출발 세포에 적어도 200 계대, 바람직하게는 제한되지 않는 수의 계대, 즉 불멸에 대한 능력을 부여하는 특정 기능적 DNA 서열에 의해 트랜스펙션된/형질전환된 세포 또는 세포주에 관한 것이다.
본 발명의 "유전자 카세트"는 망막모세포종 단백질의 기능에 영향을 주는, 즉, 직접 또는 간접으로 (예를 들면, 발현 후에) 망막모세포종 단백질 및 E2F 전사인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 유전자, 및 또한 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스의 유도를 막는 바이러스 유전자, 예를 들면, 모든 그룹의 아데노바이러스 E1B 55K 단백질, 파필로마바이러스의 E6 단백질, 바람직하게는 저위험 인간 파필로마바이러스 (HPV)의 E6 단백질 (예를 들면, HPV1, HPV6 및 HPV11, 그러나, HPV16, HPV18은 아님), 또는 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스를 막는 세포 유전자, 예를 들면, mdm2를 포함하는 DNA 서열로 이해되어야 한다.
더욱 상세하게, 상기 유전자 카세트는 (1)의 바람직한 양태에서, 직접 또는 간접으로(예를 들면, 세포 유도자를 통해) 망막모세포종 단백질 및 E2F 전사인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 "제1 유전자"를 포함한다. 상기 제1 유전자는 바이러스 유전자, 예를 들면, 마스트아데노바이러스 E1A, gaml 및 CELO의 orf22 또는 파필로마바이러스의 E7, 바람직하게는 저위험 인간 파필로마바이러스의 E7 (예를 들면 HPV1, HPV6 및 HPV11, 그러나, HPV16, HPV18은 아님), 또는 세포 유전자, 예를 들면, 구성적으로 활성인 CDK4 또는 과발현된 D 유형 사이클린일 수 있다. 상기 제1 유전자의 활성은 증가된 계대와 함께 아폽토시스 또는 성장 정지의 유도를 희생하여 세포 주기 진행을 매개한다.
"제2 유전자"는 상기 제1 유전자의 효과에 대항하기 위해 상기 유전자 카세트에 존재한다. 이는 아폽토시스 또는 성장 정지를 막으며, 바람직하게는 p53의 분해를 확대하거나 또는 p53을 전사 활성화제에서 전사 억제자로 전환하는 것을 통해 p53에 의한 전사 활성화를 저해함으로써 작용한다. 바람직하게는 상기 "제2 유전자"는 p53의 기능 억제를 포함하고, p53의 안정성의 감소를 야기함으로써, p53에 의한 전사 활성화를 막을 수 있다. 상기 "제2 유전자"는 바이러스 유전자, 예를 들면, 모든 그룹의 아데노바이러스 E1B 55K 단백질, CELO의 orf22, 파필로마바이러스의 E6 단백질, 바람직하게는 저위험 인간 파필로마바이러스의 E6 단백질 (예를 들면 HPV1, HPV6 및 HPV11, 그러나, HPV16, HPV18은 아님), 또는 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스를 막는 세포 유전자, 예를 들면, mdm2일 수 있다. 바람직하게는 상기 "제2 유전자"는 CELO의 orf22 또는 아데노바이러스 E1B 55k이다.
이는 미지의 기작에 의해 병아리 섬유모세포주의 생성과 관련된 외래의 활성 야생형 p53의 도입과 정확하게 반대이다 (US 5,879,924).
본 발명의 명세서에서 "생물학적 물질"은 항체, 효소, 호르몬, 수용체 또는 이의 리간드 및 이의 융합을 포함하는, 치료 및 재조합 단백질을 포함한다. 바람직한 생물학적 물질은 재조합 단백질이다.
구현예 (1)의 하나의 바람직한 양태는 배아 또는 부화된 병아리, 오리, 거위, 메추라기 등, 바람직하게는 병아리 또는 오리로부터 유래된 세포주의 용도이다. (1)의 특히 바람직한 양태에서, 부가적으로 상기 세포주는 병아리 배아, 부화된 병아리, 오리 배아 또는 부화된 오리에서 기원하는 1차 세포의 불멸화로부터 유래된 역전사효소 활성이 없으며, 배외막으로부터 유래되고/되거나 합성 배지에서 배양된다. 상기 배지는 바람직하게는 동물 혈청이 없다.
구현예 (1)의 또 다른 바람직한 양태는 불멸화시킨 세포는 섬유모세포, 신경, 뇌, 망막, 신장, 간, 심장, 근육 및 배아를 보호하는 배외 조직 및 막을 포함하는 단리된 신체 단편(체절) 또는 분리된 개개의 기관 유래의 세포를 포함하는 1차 세포라는 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 세포는 배외막 또는 망막 유래이다.
구현예 (1)의 세포를 초래하는 불멸화는 바람직하게는 리포좀, 덴드리머 또는 히드록시아파타이트 ("인산칼슘") 침전 및 전기천공에 의해 매개된 트랜스펙션을 포함하나, 이에 제한되지 않는 비바이러스성 트랜스펙션에 의해 수행된다.
바람직하게는, 구현예 (1)에서 상기 제1 유전자는 망막모세포종 단백질 및 E2F 전사인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 바이러스 유전자이다. 이는 마스트아데노바이러스 유래의 아데노바이러스 E1A 유전자 (바람직하게는 그룹 C의 마스트아데노바이러스 유래), 파필로마바이러스의 E7 단백질, 바람직하게는 저위험 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 유래 (예를 들면, HPV1, HPV6 및 HPV11, 그러나, HPV16, HPV18은 아님), 조류 아데노바이러스의 orf22 유전자 및/또는 양의 아트아데노바이러스 유래의 E43 개방형 해독틀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 구현예 (1)의 상기 제1 유전자는 망막모세포종 단백질 및 E2F 전사인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 세포 유전자이다. 이는 사이클린 D1, 사이클린 D2, 사이클린 D3 및/또는 pl6INK4a에 의한 불활성화에 감수성이 아닌 돌연변이된 CDK4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
구현예 (1)의 상기 제2 유전자는 바람직하게는 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스의 유도를 막는 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자이다. 이는 모든 그룹의 아데노바이러스 E1B55K 단백질, CELO의 GAM-1, 파필로마바이러스의 E6 단백질, 바람직하게는 저위험 HPV의 E6 단백질 (예를 들면, HPV1, HPV6 및 HPV11, 그러나 HPV16, HPV18은 아님)을 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게는 아데노바이러스 E1B55K 단백질 및 CELO의 GAM-1를 코딩하는 유전자이다. 대안적으로, 상기 제2 유전자는 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스를 막는 세포 단백질, 예를 들면, mdm2를 코딩한다.
구현예 (1)의 상기 제1 유전자 및 제2 유전자는 바람직하게는 이종 서열에 의해 공간적으로 분리되거나 또는 상이한 핵산 절편 또는 플라스미드에 위치한다.
구현예 (1)의 특히 바람직한 양태에서, 상기 제1 유전자는 E1A이며, 상기 제2 유전자는 마스트아데노바이러스 속, 바람직하게는 아데노바이러스 5 유래의 아데노바이러스의 E1B 영역이다. 가장 바람직하게는 상기 E1A 영역은 서열번호 7의 1193-2309 bp, 바람직하게는 1239-2309 bp의 서열 또는 서열번호 9의 4230-3113 bp에 상보적인 서열을 가진다. 더욱이, 가장 바람직하게는 상기 E1B 영역은 서열번호 8의 1145-3007 bp, 바람직하게는 1197-2810 bp의 서열 또는 서열번호 9의 2345-550 bp에 상보적인 서열을 가진다.
구현예 (1)의 추가의 특히 바람직한 양태에서, 상기 제1 유전자는 orf22 이며, 상기 제2 유전자는 아데노바이러스, 바람직하게는 아비아데노바이러스 CELO 속 유래의 GAM-1, 바람직하게는 서열번호 10의 1252-635 bp에 상보적인 서열 및 서열번호 10의 3138-2290 bp에 상보적인 서열로 표시되는 서열을 가진다.
구현예 (1) 및 (2)의 추가의 특히 바람직한 양태에서, 상기 플라스미드 36E (서열번호 19), 37E (도 1), 49E (서열번호 9), 25F (서열번호 10) 또는 60E (서열번호 18)이 세포의 불멸화에 이용된다.
더욱이, E1A 및/또는 E1B를 코딩하는 핵산과 상기 정의된 GAM-1 및/또는 Orf22의 조합은 구현예 (1)의 바람직한 양태이다.
구현예 (1)에 따른 세포주는 부가적으로 트랜스진, 예를 들면, 결손 바이러스를 보충하는 유전자 (예를 들면, EBNA1 등), 프로모터 (예를 들면, PGK-, EFl.알파-, CMV-프로모터, Ad5의 El-프로모터, tk-프로모터 등), 인핸서 (예를 들면, RSV-LTR), 선택 마커, 예를 들면, 네오마이신 내성, 퓨로마이신 내성 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 비천연 기능적 서열을 가질 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 상기 제1 및 제2 유전자는 PGK-, CMV-, El- 및 tk-프로모터로부터 독립적으로 선택된 별개의 프로모터의 조절하에 있다.
구현예 (1)에 따른 세포주는 하나의 바람직한 양태에서 백신 균주 (마레크 병, 감염성 점액낭병, 뉴캐슬병, 칠면조 헤르페스, 병아리 빈혈, 인플루엔자, 우두(MVA), 풍진, 광견병 바이러스, 등) 및 재조합 바이러스 벡터 (예를 들면, 재조합 MVA 또는 알파바이러스)를 포함하는 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산에 더욱이 적합하다. 예방접종용 가장 바람직한 바이러스는 MVA 및 인플루엔자 바이러스이다. 가장 바람직한 재조합 바이러스 벡터는 MVA이다.
구현예 (1)의 하나의 양태에서, 상기 세포주는 플라스미드 49E를 이용한 오리 배외막 세포의 불멸화로부터 유래된 세포주 12A07-A10 (DSM ACC2695)이다(실시예 2).
더욱이 바람직한 것은 약학 적용에 적합하게 하는 cGMP 조건하에 구현예 (1)에 따른 세포주의 생성이다.
구현예 (2)의 방법은 바람직하게는 상기 열거된 것과 같은 출발 세포의 비바이러스성 트랜스펙션을 포함한다. 가장 바람직하게는 리포좀 트랜스펙션, 특히 Effectene 시약에 의한 트랜스펙션이다.
구현예 (3)에 따른 바람직한 용도는 백신의 제조 또는 유전자 치료용 용도이다. 바이러스 백신 균주 또는 유전자 치료 벡터를 구현예 (1)에 따른 세포주의 세포와 접촉시켜, 감염을 발생시키고, 상기 바이러스를 상기 세포에 의해 증폭한다. 바이러스의 계속된 계대 (상기 세포 상에서 바이러스의 감염 및 수확의 반복된 주기)는 상기 특정 숙주 세포주에 대한 바이러스의 약독화 또는 적응을 초래할 것이다. 그리하여, 의도한 백신에 대한 더 적은 발병력을 갖는 바이러스 벡터 또는 백신 균주 (오리, 바람직하게는 조류가 아님)가 생성된다. 약독화된 바이러스는 백신의 면역계가 완전히 불활성화된 입자로 예방접종한 것보다 더 방어적이며, 야생형 (천연) 병원균을 이용한 감염보다 덜 심각한 반응을 시작하게 한다. 상기 구현예에 대한 바람직한 바이러스는 홍역 및 광견병 바이러스이다.
구현예 (4)에 따른 바이러스를 제조하는 방법은 바람직하게는 상기 바이러스를 구현예 (1)에 따른 세포주와 접촉시키는 것 및/또는 상기 세포주 상에 상기 바이러스의 배양을 포함한다. 특히, 상기 방법은 오리 세포주, 바람직하게는 오리 체절 또는 오리 신경 조직, 더 더욱 바람직하게는 오리 망막에서 기원한 세포주에서 폭스 바이러스, 바람직하게는 균주 MVA를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 특히 cGMP 조건하에 Ad5-El 영역의 트랜스펙션에 의해 수득된 오리 망막 및 체절 유래 세포는 1차 병아리 배아섬유모세포와 필적할만하거나 또는 보다 양호한 효율로 MVA의 증폭을 안정하게 지지한다 (실시예 5).
구현예 (4)에 따른 생물학적 물질, 특히 재조합 단백질의 제조 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 구현예 (1)에 따른 세포주 내로 도입, 상기 변형된 세포주의 배양 및 상기 재조합 단백질을 수확하는 것을 포함한다.
구현예 (4)의 방법은 바람직하게는 예방접종 또는 유전자 치료에 유용한 바이러스 및 생물학적 물질의 생산에 이용된다.
역사적으로, 병아리 계란 및 각각의 세포 (병아리 섬유모세포)는 백신의 제조용 우세한 기질이다. 약학 목적으로, 병아리는 광대한 모니터링 시스템을 갖는 병원균 제어된 환경으로부터 유용하다. 많은 문헌은 병아리 계란을 세포주 개발에 대한 일차 표적으로서 제안한다. 그러므로, 병아리 세포는 본 발명의 출발 세포에 대한 하나의 바람직한 공급원이다. 그러나, 병아리 유래 세포 및 세포주는 가장 RT 양성일 것 같다. 문헌 데이타는 감염성 바이러스의 방출에 대한 저위험을 제안한다. 그러나, 전파성 바이러스의 부재는 제조에 이용되는 임의의 세포주에 대해 모니터링될 필요가 있을 것이다. 정말로, 지금까지 확립된 대부분의 조류 세포주는 병아리에서 기원한다 (US 5,830,723, US 5,879,924). 조류 백혈병 바이러스가 없는 병아리 계통(라인 0)을 기르는 것이 가능하지만, 내재하는 조류 레트로바이러스 (EAV-HP)(Boyce-Jacino et al., J. Virol 66(8): 4919-29 (1992))가 라인 0를 포함하는 병아리 세포에 존재한다. EAV는 활성 역전사효소를 제공하나, 발현 수준은 실질적으로 다양하다. 그러므로, 덜 민감한 분석에서 RT 음성으로 시험된 DF1과 같은 1차 병아리 세포 및 세포주조차 (Crittenden et al., Virology 57(1): 128-38 (1974)) 아마도 최근 실시간 PCR 접근에서 양성으로 시험될 것이며, 특정 성장 조건하에 활성화된 레트로바이러스를 가질 것이다.
대안적으로, 세포주 개발을 위한 본 발명의 바람직한 조류 종은 내재하는 레트로바이러스를 포함하지 않거나 또는 역전사효소(RT)를 발현하지 않는 것이다. 이는 2가지 부가적인 이유로 적합한 오리를 포함한다: 오리 알은 또한 병원균 없는 모니터링된 스톡으로부터 유용하며, 오리는 거위와 대조적으로, 자발적인 종양을 덜 발생할 것 같다. 많은 관련된 백신 균주가 병아리 (배아) 세포 (예를 들면, 마레크 병 바이러스 (Witter, R.L., Avian Dis. 46: 925-37(2002)) 또는 풍진 (Rocchi, G., Salvadori, A., Nuovi Ann. Ig Microbiol. 21: 336-40(1970))에서 복제하는 것처럼, 오리 (배아) 세포에서 잘 복제하는 것으로 알려져 있지만, 이는 주요 관심의 바이러스 균주에 대해 밝혀져야 한다. 기타 백신에 대해, 상기 데이타는 유용하지 않다.
확실히, 매우 약독화된 폭스 바이러스 균주 MVA (변형된 우두 Ankara)가 통상적으로 이용되는 1차 병아리 배아섬유모세포와 유사하거나 또는 보다 높은 효율로 오리 세포주에서 복제하는 것은 본 발명의 신규하고, 예기치 않은 발견이다. 본 발명가의 하나의 의도는 조류 숙주, 또는 비포유동물 숙주가 바람직한 백신 균주를 요하는 바이러스의 증폭을 위한 1차 세포에 대한 안전하고 탄탄한 대안을 제공하는 것이었다. 편리한 숙주 세포가 유용하지 않은 중요한 바이러스는 MVA (변형된 우두 바이러스 Ankara)이다 MVA는 매우 약독화된 폭스 바이러스이며, 치료 및 방어 백신 적용을 위한 극도로 유망한 도구이다. MVA는 오리 세포의 규명을 위한 모델 바이러스로서 이용될 것이나, 배타적인 예로서 취급해서는 안 된다: 기재된 실험은 또한 병원균 또는 치료 벡터, 예를 들면 홍역, 풍진, 광견병, 또는 인플루엔자 바이러스이든지 간에 다양한 기타 바이러스를 이용하여 수행될 수 있다.
섬유모세포는 역사적인 및 실질적인 이유로 주로 바람직한 세포 유형으로서 선택되었다. 섬유모세포는 포유동물뿐만 아니라 조류 종 유래의 가장 빨리 자라는 1차 세포이다. 전체 병아리 배아 유래의 세포 현탁액을 배양할 때, 이는 유일하지 않고, 우세한 세포 유형이다. 그러나, 섬유모세포는 강하게 부착하여 자라며, 완전한 (종양생성) 형질전환 후에 단지 이 특징이 느슨해진다. 상기 과정은 신호 형질도입 경로를 방해하는 v-ras와 같은 강한 형질전환 유전자의 존재를 요한다. 섬유모세포 배양물의 초기 노화는 부분적으로 조류 및 인간에서 텔로머라아제 활성의 전체적인 부재에 기인한다 (Forsyth, N. R. et al., Differentiation 69 (4-5): 188-97 (2002)).
인간 1차 섬유모세포는 직접 상기 경로를 방해하지 않는 아데노바이러스 유형 5의 E1 유전자를 이용한 형질전환에 저항성이다 (개인적인 관찰). 현탁 배양물에서 효율적인 불멸화 및 성장은 상피 및 신경 세포에 대해 성공할 확률이 더 높다. 더욱이, 섬유모세포 대신에 상피는 조류 계란 내의 바이러스 복제에 대한 주요한 자리인 것 같다. 흥미롭게도, 인간 상황과 대조적으로, 조류 신장은 조류 신장 세포를 불멸화에 대한 양호한 표적으로 만드는 생존기간을 통해 텔로머라아제를 발현한다. 종합하면, 신장 상피 및 신경 세포를 포함하는 조류 상피 세포는 요구된 특징의 세포주를 개발하기 위한 가장 유망한 표적으로 고려된다.
그러므로, 조류 세포주 개발이 거의 배타적으로 상기 세포에 집중한 섬유모세포가 수득된다는 것은 용이하다 (Cowen, B. S., Braune, M. O., Avian Dis 32 (2): 282-97 (1988); US 5,830,723). 특정 경우에, 전체 배아가 이용되었다 (US 2001-0016348).
바이러스는 수용체 분포 및 복제를 지지하는 세포 인자에 기초하여 종뿐만 아니라 기관 및 조직 특이성을 나타낸다. 그러므로, 전형적인 접근과 대조적으로, 본 발명을 수행하는 바람직한 방식은 가장 바람직한 숙주 세포를 수득하기 위해 배양 전에 기관의 분리이다.
이의 백신-적당한 생산이 본 발명의 세포주의 주요 적용인 인플루엔자 바이러스에 대해, 전형적인 복제 자리는 배아 자체가 아니라 배외막이다. 그러므로, 구체적인 목적은 배아의 보호막을 포함하는 배외 물질로부터 세포주를 개발하는 것이었다. 배외막의 것을 포함하는 일부 조직 특이적인 1차 배양은 섬유모세포와 비교하여 매우 짧은 생존 시간을 가진다. 이는 또한 최적화된 숙주 세포를 수득하기 위해 디자인된 불멸화에 대한 필요를 강조한다. 제한된 시간 창문에서 복수의 조직의 성공적인 불멸화는 본 발명 내에 이용된 유전자의 특정 조합을 요한다.
조류 조직의 어느 것이 MVA 또는 Canarypox와 같은 폭스 바이러스에 대한 가장 높은 복제능을 가지는 가는 알려져 있지 않았다. MVA에 대한 전형적인 제조 방법은 붕괴 전에 제거되는 헤드를 제외하는 배아 유래의 세포 혼합물을 포함한다. 그러므로, 망막으로부터 발생된 신경 기원의 세포주가 MVA 복제에 대한 높은 능력을 가지는 반면, 기타 조직은 그렇지 않다는 것은 완전히 예상할 수 없다.
동일한 조직 특이성이 단백질 생산에 적용된다. 전사 능력은 유용한 세트의 전사인자에 의존하며, 더 강한 편재하는 바이러스 및 세포 프로모터가 상이한 조직에서 다양한 강도를 나타낸다. 더욱이, 분비된 단백질의 수율은 단백질을 올바르게 폴딩하고 가공하는 (예를 들면, 글리코실화) 특정 세포 유형의 능력에 강하게 의존한다.
1차 세포의 불멸화 및 형질전환을 초래하는 기작은 잘 기재되어 있다 (Hahn, W. C. et al., Nature 400: 464-8 (1999)). 필요한 성분은 (1) 세포 주기 진행의 조절, (2) 탈조절된 세포 주기에 의해 유도된 프로그램된 세포 사멸, (3) 인간 및 조류 세포에 대한 성장인자 신호 형질도입 및 (4) 염색체의 선형 말단인 텔로미어의 단축을 방해한다. 1차 세포를 불멸화되고, 형질전환된 표현형으로 이끌 수 있으나, 불멸화가 숙주에서 종양 형성을 최소화하는데 책임 있는 세포 체크포인트를 저해하는 것을 희생하게 되는 수많은 인자가 알려져 있다. 그러므로, 세포주의 실험적인 생성을 수행할 수 있으나, 변조 세포로부터 유래된 생물학적 물질의 수용자에서 종양 유도의 최소의 위험을 부과하는 형질전환 인자를 선발하는 것이 바람직하다. 상기 요건은 형질전환 인자의 강도와 함께 균형잡힐 필요가 있다: 이는 부가적인 자발적인 돌연변이의 축적에 대한 요구 없이 형질전환을 야기하기에 충분히 강해야 하는데; 즉, 생성된 세포주를 초래하는 분자 경로가 완전히 알려져 있어야 한다 (2002년 5월 Advisory Committee에서 백신 제시의 FDA CBER Office에 따른 카테고리 I 및 II). 백신 또는 환자에서 우연한 형질전환의 위험을 최소화하는 유전 물질의 동시 전달이 요구되도록 하기 위해, 1차 세포를 개별적으로 형질전환할 수 없는 인자의 상승적인 조합을 선발하는 것이 더욱이 바람직하다. 최종적으로, 면역 종양 감시가 제품 적용으로 인한 종양 형성의 예기치 않은 경우에 활성화되도록, 형질전환 인자가 생물학적 물질의 수용자에서 면역반응을 유도하는 것이 바람직하다. 최종 기준은 비세포성이나, 외래의 예를 들면, 바이러스성 형질전환 단백질이 이용된다면 현실화될 수 있다.
생성된 변조 세포가 상기 모든 기준을 따르도록 인간 아데노바이러스 5(Ad5) 유래의 E1 영역이 조류 세포를 형질전환하는데 이상적으로 적합하다는 것을 지금 발견하였다.
E1B 영역은 2개 시스트론 mRNA 상의 2개의 개방형 해독틀인 21K 및 55K 단백질을 코딩한다. 55K 단백질은 p53에 결합하므로, 프로-아폽토시스 전사 활성화제를 억제자로 전환한다. 21K 단백질은 Bax에 결합함으로써 항-아폽토시스 활성을 보충하므로, 미토콘드리아 막의 완전성을 유지하고, 시토크롬 C의 방출을 막는다. 상기 단백질은 부착성 세포를 기질 독립적인 성장으로 이끄는데 필수적이므로, 현탁액에서 발효 과정에 필수적이다.
인간 아데노바이러스 E1B 55K가 p53의 조류 동족체에 영향을 줄 수 있는지를 이전에는 밝혀지지 않았다. 더욱이, 조류 아데노바이러스는 E1B를 닮는 유전자로 장착되지 않으므로, 방해는 또한 가능하지 않았다. 모든 기대와 대조적으로, 본 발명가는 E1B가 E1A에 의한 불멸화를 허용하는 본질적인 기능을 제공할 수 있다는 것을 발견하였다.
본원에 기재된 달성에 대한 신규하고 결정적인 인자는 강한 재조합 프로모터의 조절하에 이의 약한 자연적인 상황 및 배치로부터 E1B의 제거이었다. 상기 신규한 변형 및 조합은 레트로바이러스 형질도입 대신에 트랜스펙션에 의해 오리 및 병아리 유래의 복수의 조직의 효율적인 불멸화를 허용하였다.
E1에 의한 형질전환에 대한 기초적인 기작이 복잡하지만, 하나의 특징은 가장 바람직한 특징이다: E1A는 세포 증식 및 아폽토시스의 강한 유도자인 반면, E1B 단백질은 아폽토시스를 효율적으로 방해하나 세포 주기 조절에 대한 제한을 방출할 수 없다.
그리하여, 단일 인자가 아닌 E1A 및 E1B 단백질의 연속적인 존재가 실험적으로 유도된 형질전환된 표현형을 유지하는데 요구된다.
1970년대에 v-src의 기재 이후로 (Brugge, J. S., Erikson, R.L., Nature 269: 346-8(1977)), 형질전환 인자의 장식이 개발되고 규명되었다. 정말로, 최초로 분자적 통찰력을 제공한 알파레트로바이러스에 의한 조류에서 종양의 유도 연구이었다 (Martin, G. S., Nature 227: 1021-3(1970)). 레트로바이러스 종양유전자는 필수적인 조절자 도메인이 돌연변이되거나 또는 결실된 세포 유전자로부터 유도된다. 상기 연구 과정에서 확인된 인자의 일부, 예를 들면, v-myc 또는 v-ras는 RB 및 p53 경로의 성분에 직접 영향을 준다. 기타 단백질, 예를 들면, v-src 또는 v-erbB는 침해하는 세포외 분열촉진물질을 모방하는 구성적으로 활성화된 (그리하여, 조절곤란한) 신호 변환기이다. 상기 인자에 대한 문제는 이들이 효율적인 형질전환에 필요한 몇 가지 경로 중 단지 하나를 표적화한다는 것이다. v-src 또는 v-myc의 존재는 세포를 형질전환하기 쉽게 하고, 완전한 형질전환을 위해 세포 내에 부가적이고, 자발적이며 예상할 수 없는 변경을 요한다. 레트로바이러스 종양유전자 중의 하나로 형질전환된 세포에 의해 부과된 환자의 위험은 그러므로 평가하기 어렵다.
기타 DNA 바이러스, 예를 들면, 파필로마바이러스 및 폴리오마바이러스는 또한 시험관 내에서 세포를 형질전환하다고 알려져 있다. 그러나, 선발된 트랜스진은 부주의하게 전달된 세포 DNA를 통한 생물학적 물질의 수용자에서 종양 유도의 위험을 최소화하기 위해 너무 공격적이어서는 안 된다. 상기 기준은 특히 종종 건강한 집단이 매우 어린 나이에 접종되는 백신 생산에 엄격하다. 정교한 최근의 정제 방법에서조차, 폴리오마바이러스 거대-T 항원은 인간 의학에 적용하기 위해 생성된 세포주에 이용하기에 너무 공격적인 것으로 고려된다. 90%의 자궁경부 암종이 파필로마바이러스 서열을 가지지만 (Munoz, N. et al., N. Engl., J. Med. 34816): 518-27 (2003)), C-유형 아데노바이러스 (유형 2 및 유형 5 포함)는 생체 내에서 종양을 유도하는 것으로 고려되지 않으며, 아데노바이러스는 인간 종양 조직에서 검출되지 않았다.
상기에서 보여준 형질전환 유전자의 상보적인 특징에 기초하여, 세포 주기 및 아폽토시스에서 단일 경로를 방해하는 각각 유전자의 조합은 현탁액에서 자라는 유전적으로 안정한 세포주를 수득하는데 필요하다는 것을 발견하였다.
아데노바이러스 5의 완전한 E1 영역이 상기 요건을 수행할 수 있다는 것을 보여주었다. Ad5 유래의 E1A의 12S 단백질이 조류 RB와 상호작용할 수 있다는 것을 보여준 반면 (Guilhot, C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993)), 조류 세포에서 55K 및 21K 단백질의 기능적 활성은 처음으로 본 발명에서 입증되었다. E1A의 12S 단백질을 발현하는 메추라기 세포의 동일한 클론이 형질전환된 특징을 나타낸다는 것은 놀랍지 않다 (Guilhot,. C. et al., Oncogene 8: 619-24 (1993)). 레트로바이러스 감염을 통한 극도로 효율적이고 안정한 형질도입은 개개의 세포가 세포 주기 봉쇄 또는 자발적인 게놈 변화에 의한 아폽토시스의 유도를 극복하도록 허용하는 충분히 큰 세포 풀을 생성한다. 상기 요구되나 미지의 변화는 의료 위험을 증가시키고, 생성된 세포주는 공지된 유전자에 기초해야 하는 변조 세포주로 고려될 수 없다. 더욱이, 트랜스펙션 기술은 자연적인 선발에 요구되는 큰 클론 풀을 생성하는데 충분하지 않다. 대신에 레트로바이러스 형질도입이 요구되었다. 상기 접근을 통해 도입된 형질전환 유전자는 LTR에 의해 플랭킹될 것이므로, 역전사효소를 발현하는 세포주에서 더욱이 움직일 수 있다.
최근에, 닭 아데노바이러스 유형 1 균주 CELO (chick embryo lethal orphan)라 명명된 조류 아데노바이러스는 더욱 상세히 기재되었다 (Chiocca, S. et al., J. Virol. 70: 2939-49(1996)). CELO의 긴, 중앙의 게놈 스트레치는 Ad5에 유사하나, 중요한 면에서 상이하다 - 기타 중에서, CELO는 E1-유사 영역으로 장착되지 않는다. 더욱이, CELO는 E1A에 돌연변이된 Ad5를 보충할 수 없고, 역으로, Ad5 El 단백질은 지연된 초기 CELO 유전자의 전사를 활성전환할(trans-activate) 수 없다 (Li, P. et al., J. Gen. Virol. 65(Pt 10): 1817-25 (1984)). 그리고 여전히, CELO는 시험관 내에서 햄스터 세포를 형질전환할 수 있다 (May, J. T. et al., Virology 68:483-9(1975)). 세포 주기 및 아폽토시스를 방해하는 유전자인 orf22 및 GAM-1이 CELO 바이러스에서 확인되었다 (Lehrmann, H., Cotton, M., J. Virol. 73: 6517-25(1999)). Orf22는 RB와 상호작용하는 단백질을 코딩하며, GAM-1은 원형의 21K 단백질과 유사한 방식으로 아폽토시스를 방해한다 (Chiocca, S. et al., J. Virol. 71: 3168-77(1997)).
CELO 바이러스 유래의 유전자 orf22 및 GAM-1이 E1A 및 E1B에 대한 적당한 대용물이라는 것을 지금 발견하였다. 조류 세포의 형질전환에 유용한 트랜스진의 스펙트럼은 그것으로 확장된다. 상기 단백질은 이전에 조류 세포를 형질전환하기 위해 이용되지 않았다.
더욱이, 상기 바이러스 유전자 중의 하나는 세포 유전자에 의해 대체될 수 있다. 상기 대체에 대한 후보는 아데노바이러스의 E1A 영역에 대해 E2F 패밀리 멤버 또는 D 그룹 사이클린이며, E1B 영역에 대해 mdm2 이다.
하기 세포주를 DMSZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Germany)에 기탁하였다:
1. DSM ACC2577로서 PBG04 (2002.9.18 기탁);
2. DSM ACC2695로서 12A07-A10 (2004.10.20 기탁).
본 발명은 하기 실시예를 참고하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
도 1: 1차 오리 세포의 증진된 불멸화에 이용된 발현 플라스미드의 모식도(실시예 2). 폴리아데닐화 신호는 명료하게 하기 위해 생략한다. 좌측의 문자 숫자식은 플라스미드에 대한 짧은 식별자이다. mPGK 및 hPGK, 각각 마우스 및 인간의 포스포글리세레이트 키나아제 프로모터; ad5, Ad5의 El-내재하는 프로모터; moCMV, 마우스 CMV 조기 발현 프로모터; tk, 단순포진바이러스 티미딘 키나아제 프로모터; orf22 및 gaml, CELO 바이러스 유전자; E1A 및 E1B, 아데노바이러스 5 E1 영역 유전자.
도 2: Ad5-El 트랜스펙션된 오리 배아 간 세포 (플라스미드 49E)에서 병터(focus) 형성의 예로서 위상차 현미경 사진. A, 노화한 1차 세포에 포매된 완전한 병터를 나타내기 위한 초기 4배 확대. B, 초기 20배 확대: 패널의 우측에 보이는 밀집한 단층에 배열된 작은 세포의 큰 둥근 병터의 주변, 좌측으로 진전된 노화 의 1차 세포.
도 3: E1A 및 ElB 55K 단백질에 대한 면역형광 분석 (실시예 3). 상단 2열, 플라스미드 49E-불멸화된 1차 오리 간 세포의 혼합물; 하단 2열, 293 양성 대조군 세포. 좌측 칼럼, 위상차 이미지; 중간 칼럼, 이미지에 표시된 E1A 또는 E1B 55K 단백질의 면역염색; 우측 칼럼, DAPI 염색. E1B 55K 단백질은 특징적으로 세포질에 국부화되며, 응집체로 축적되어 불균일한 스팟 분포를 수득한다. E1A는 핵 단백질이다. 형질전환된 오리 세포에서 DAPI로 밝게 염색되는 압축된 핵을 주목한다.
도 4: 레트로바이러스 활성의 검출을 위한 세포 상층액에 대한 Q-PERT 분석 (정량적인 PERT 분석)(실시예 4). 속이 찬 사각형, CHO 양성 대조군; 속이 빈 사각형, 물 음성 대조군; 속이 찬 다이아몬드, 병아리 배아 섬유모세포; 속이 찬 삼각형, 293 세포주 음성 대조군; 회색 원, 기질- 단지 음성 대조군; 속이 빈 삼각형, 플라스미드 49E로 불멸화된 오리 간 세포; 델타 Rn, 출발 배경 형광에 대해 리포터 염료의 방출.
도 5: 기재된 오리 세포주의 일부 및 CEFp에 대한 MVA 증폭 (실시예 5). 감염을 0.1의 MOI를 이용하여 수행하였다. 감염 후 48시간에 VERO 세포 상에서 역가측정을 수행하였다 (실시예 2). CEFp, 1차 병아리 배아 섬유모세포.
도 6: 플라스미드 49E를 이용하여 불멸화된 오리 망막 세포에 대한 MVA의 연속적인 계대 (실시예 5). 속이 찬 사각형, 방출수; 막대기, MOI 0.1로 조정된 투입 바이러스. 투입 바이러스는 방출수가 세포 수에서 실험적인 변동에 독립적이라 는 것을 증명하기 위한 기준으로서 제공된다 (차례로 MOI를 통해 투입 바이러스를 정의한다).
서열목록 - 자유 텍스트
서열번호 | 기재 - 자유 텍스트 |
1 | 프라이머 VS182 |
2 | 프라이머 VS183 |
3 | 프라이머 VS184 |
4 | 프라이머 VS185 |
5 | 프라이머 VintSA-F |
6 | 프라이머 VintSA-R |
7 | 플라스미드 pEFAd5E1A |
8 | 플라스미드 pEFAd5ElBSA |
9 | 플라스미드 49E |
10 | 플라스미드 25F |
11 | 프라이머 V206 |
12 | 프라이머 V207 |
13 | 프라이머 V208 |
14 | 프라이머 V209 |
15 | RT 프라이머 |
16 | 프라이머 cDNA 1 |
17 | 프라이머 cDNA 2 |
18 | 플라스미드 60E |
19 | 플라스미드 36E |
실시예
1:
아데노바이러스
5
E1A
, B를 이용한 1차 오리 세포의
불멸화
E1A 및 E1B에 대한 아데노바이러스 서열을 provestart 중합효소 (Qiagen)를 이용하여 야생형 바이러스로 심하게 오염된 HEK 293에서 키운 제1 세대 (El 결실된) 아데노바이러스 Admuc의 계대 8의 배양물로부터 증폭하였다.
하기 프라이머를 이용하였다:
ElA 영역을 증폭하기 위한
VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (서열번호 1)
VS183 CACACGCAATCACAGGTT (서열번호 2) 및
ElB 영역을 증폭하기 위한
VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (서열번호 3)
VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (서열번호 4)
2개의 단편을 먼저 pPCR4blunttopo (Invitrogene)에 클로닝하였다.
E1B 구축물은 E1B 메시지 유래의 스플라이스 수용체가 없다. 그러므로, 인간 면역글로불린 중쇄의 리더 인트론으로부터 프라이머를 이용하여 증폭된 합성 구축물에 의해 치환된다. 주형으로서, 뮤린-인간 이종하이브리도마인 PBG04 (DMSZ ACC2577) 유래의 게놈 DNA를 이용하였다.
프라이머:
VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA (서열번호 5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG (서열번호 6)
상기 스플라이스 수용체를 융합 단백질을 생성하기 위해 aEF1 알파 프로모터 및 myc 리더 펩티드를 포함하는 pEFmyc 내로 직접 클로닝하였다. E1A 영역을 EcoR I 및 Xho I 자리를 이용하여 ptopoElA로부터 제거하고, myc 리더 서열을 제거하고, 소성장호르몬 폴리 A에 E1A를 융합하면서, pEFmyc 내로 직접 클로닝하였다. E1B 영역을 다시 EcoR I 및 Xho I 제한효소를 이용하여 제거하고, 이종 스플라이스 수용체 자리를 포함하는 pEFmycSA 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pEFAd5ElA (서열번호 7) 및 pEFAd5ElBSA (서열번호 8)라 명명하였다.
오리 발육란을 12일 동안 37℃, 60% 공기 습도에서 부화시켰다 (더 늙은 배아는 더 많은 세포를 생산하나, 또한 더 많은 수의 오염시키는 분화된 섬유모세포 를 포함하였다). 껍질을 70% 이소프로판올로 멸균하고, 큰 말단에서 개방하고, 배아를 무균으로 멸균 페트리 접시로 제거하였다. 태아 뇌 및 신장을 제거하고, 트립신/EDTA로 충전된 별개의 페트리 접시로 옮기고, 잘게 썰었다. 간단한 인큐베이션 후에, 이의 현탁액을 10% 소태아혈청 (Biochrom) 및 2% Ultroser G (Ciphergen)로 보충된 과량의 F12 배지 (Gibco/Invitrogen)와 혼합하였다. 상기 현탁액을 페트리 접시로 옮기고, 배양을 (병아리의 생리학적 온도인 41.6℃보다 낮은) 37℃ 및 5% CO2에서 수행하였다. 비부착성 찌꺼기를 갖는 배양 배지를 다음날 대체하고, 3.5 cm 접시당 적어도 5 x 105 세포가 플라스미드 pEFAd5ElA 및 pEFAd5ElBSA의 트랜스펙션에 유용할 때까지 배양을 계속하였다.
리포좀(Effectene; Qiagen) 및 덴드로머(Polyfect; Qiagen) 트랜스펙션 시약을 비교하는 초기 실험은 Effectene을 이용하여 최상의 효율을 제안하였다. 트랜스펙션을 Effectene 시약을 이용하여 수행하였다; 간단히: 2 ㎍의 플라스미드 DNA를 16 ㎕ 인핸서를 포함하는 200 ㎕ EC 버퍼에서 희석하였다. 5분 동안 인큐메이션 기간 후에, 16 ㎕의 Effectene을 첨가하였다. 10분의 인큐베이션 기간 후에, 상층액을 3.5 cm 접시에서 배양물로부터 제거하고, 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 1 ml 신선한 배지로 대체하였다. 37℃ 및 5% C02에서 2시간의 인큐베이션 기간 후에, 부가적인 2.5 ml 신선한 배지를 배양물에 첨가하였다.
트랜스펙션된 세포를 컨플루언시에 도달하도록 허용하고, 트립신 처리하고, FCS/Ultroser G 보충된 F12 배지에서 재현탁하고, 2개의 6 웰 플레이트에 재접종하 였다 (12배 팽창에 해당함). 5 및 10일 후에, 상기 배지를 단지 5% FCS로 보충된 F12로 대체하였다. 플레이트를 변화된 형태 (전체 세포 크기의 감소, 핵의 증가된 크기, 위상차 하의 원형질막의 증가된 가시도)를 갖는 세포의 병터의 외관에 대해 스캔하고, 컨플루언시를 증가시켰다.
트랜스펙션 후 대략 14일에, 병터가 직경 1-3 mm에 도달할 때, 배지를 흡입하고, 배양물을 트립신/EDTA (Gibco)로 2회 세정하였다. 트립신을 적신 클로닝 디스크 (Sigma)를 3분 동안 흡입된 병터의 상단에 위치한 후, 5% FCS로 보충된 500㎕의 F12 배지로 충전된 24-웰 플레이트의 웰로 옮겼다.
클로닝된 형질전환된 세포를 컨플루언시까지 증식하도록 허용하고, 트립신 처리하고, 5% FCS로 보충된 F12 배지에서 재현탁하고, 6-웰 플레이트로 옮겼다. 배양물이 6-웰 플레이트에서 컨플루언시에 도달하면, 세포를 연속적인 계대를 위해 T25 플라스크에 옮겼다.
지정된 간격으로 냉동보존을 위해, 세포를 트립신 처리하고, 5% FCS를 포함하는 F12 배지에서 재현탁하고, 10분 동안 100g에서 원심분리에 의해 수합하고, 50% FCS 및 10% DMSO (Sigma)를 포함하는 F12 배지에서 대략 3 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁하고, -75℃의 이소프로판올 기재 냉각 장치에서 냉동바이얼에 위치하였다. 상기 냉각 장치는 분당 1℃의 일정한 냉각 속도를 보증한다. 24시간 후에, 세포를 영구 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.
실시예
2:
불멸화된
조류 세포주의 개선된 제조
a) 1차 세포의 제조
오리 알 기원의 무리는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 및 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium); 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum) 및 미코플라스마 시노비애(M. synoviae); 백혈병 케이스, 그물내피증, 앵무새병, 조류 인플루엔자, 오리 간염, 및 데르지 질환(Derzsy's disease)이 없는 것으로 인증되었다. 상기 동물은 고의로 파르보바이러스에 대해 예방접종하지 않았으며, 파르보바이러스 질병의 어떤 경우도 검출되지 않았다. 기원의 무리에서 동물은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 및 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium); 파스투렐라 물티코디카(Pasteurella multicodica); 폐렴후바이러스 칠면조 비기관염; 및 파라믹소바이러스 야기 뉴캐슬병에 대해 예방접종하였다.
상기 알을 실온에서 교반 없이 평형화하도록 허용하고, 2일 후에 습기 있는 챔버에서 38℃에서 인큐베이션하고, +45도 및 -45도 번갈아가면서 자주 회전하였다.
오리 배아를 인큐베이션 1주 또는 3주 후에 1차 세포의 분리를 위해 희생하였다. 알을 cGMP 단위 (Current Good Manufacturing Practices에 요약된 바와 같이 수행하는 폐쇄 실험실)로 옮기고, 껍질을 층류 후드하에 70% 이소프로판올로 닦아냄으로써 멸균시켰다. 모든 이은 단계를 지정된 용액 또는 배지를 이용하여 멸균 조건하에 GMP 단위에서 수행하였다.
알을 조심스럽게 개방하고, 배아를 큰 페트리 접시에 옮기고, 태아머리제거 에 의해 즉시 죽였다. 하기 기관 유래의 시료를 제거하였다: 뇌, 망막, 간, 식도, 심장, 및 배외막.
게다가, 체절 유래의 세포를 8일째 배아로부터 제조하였다.
모든 시료를 PBS(인산 인산완충식염수; Gibco/Invitrogen, USA)로 세정하고, 1 내지 10분 동안 트립신 (Gibco/Invitrogen, USA)으로 처리하고, 18G 주사기를 통한 반복된 통과에 의해 10% FCS (Biochrom AG, Germany)로 보충된 DMEM:F12 배양 배지 (Gibco/Invitrogen, USA)에서 분쇄하였다. 균질화된 시료를 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 찌꺼기를 다음날 배지의 교환에 의해 부착성 세포로부터 제거하였다.
b) 플라스미드 구축
E1A, E1B, Orf22, 및 Gaml에 대한 발현 플라스미드를 각각 아데노바이러스 혈청형 5 또는 CELO 야생형 바이러스의 게놈 DNA로부터 관련된 표적 영역의 추출 및 인간 또는 마우스 포스포글리세레이트 키나아제 (hPGK 또는 mPGK), 마우스 CMV (moCMV) 또는 tk 프로모터로 장착된 벡터 내로 PCR 및 삽입에 의해 구축하였다 (도 1).
E1A 및 E1B에 대한 아데노바이러스 서열을 ProofStart 중합효소 (Qiagen, Germany)를 이용하여 야생형 바이러스로부터 증폭하였다. 하기 프라이머를 이용하였다:
E1A 영역을 증폭하기 위한
VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (서열번호 1)
VS183 CACACGCAATCACAGGTT (서열번호 2) 및
E1B 영역을 증폭하기 위한
VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (서열번호 3)
VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (서열번호 4)
2개의 단편을 먼저 pPCR4-Blunt-TOPO (Invitrogene, USA) 내로 클로닝하였다.
E1B 구축물은 E1B 메시지 유래의 스플라이스 수용체가 없다. 그러므로, 인간 면역글로불린 중쇄의 리더 인트론으로부터 프라이머를 이용하여 증폭된 합성 구축물에 의해 치환된다. 주형으로서, 뮤린-인간 이종하이브리도마인 PBG04 (DMSZ ACC2577) 유래의 게놈 DNA를 이용하였다.
증폭에 이용된 프라이머:
VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA (서열번호 5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG (서열번호 6)
유전자 GAM-1 및 ORF-22를 각각 프라이머
V206 AAC CTC GAG ACC CCC CTG TAC ATT CTA (서열번호 11)
V207 GCC GTT AAC TTC AGG GAT TGG TTA CAG (서열번호 12), 및
V208 CAC CTC GAG TCC GGA TTA AGA TGA ACG (서열번호 13)
V209 CCA GTT AAC AGG TGA ACC ATT TAT ACA G (서열번호 14)
를 이용하여 야생형 CELO 바이러스로부터 증폭하였다.
생성된 플라스미드에 대한 대표적인 예는 플라스미드 49E (인간 PGK 및 마우스 CMV 프로모터의 조절하의 아데노바이러스 인자; 서열번호 9), 플라스미드 25F (마우스 및 인간 PGK 프로모터의 조절하의 CELO 인자; 서열번호 10), 플라스미드 60E(인간 PGK 및 tk 프로모터의 조절하의 아데노바이러스 인자; 서열번호 18) 및 플라스미드 36E (마우스 PGK 프로모터의 조절하의 CELO 인자; 서열번호 19)에 대해 제공된다 (또한 도 1 참고).
발현 플라스미드의 완전성은 서열결정에 의해 확인되었다. 상기 플라스미드는 진핵세포에서 항생제(에를 들면, 암피실린)에 대한 내성 인자를 발현하도록 장착되지는 않는다.
c)
트랜스펙션
1차 배양물을 분리 직후 또는 단일 계대배양 후에 E1 또는 Orf22/Gaml에 대한 발현 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 실험에 따라서, 플라스미드를 수퍼코일 또는 Sca I (New EnglandBiolabs, USA) 제한효소로 선형화 후에 트랜스펙션시켰다. 리포좀 (Effectene; Qiagen, Germany) 및 덴드로머 (Polyfect ; Qiagen, Germany) 트랜스펙션 시약을 비교하는 초기 실험은 Effectene에 대해 최상의 효율을 제시하였다. 트랜스펙션을 하기와 같이 수행하였다: 2㎍ 총 DNA를 200㎕ 제공된 EC 버퍼로 희석하고, 16㎕ 제공된 인핸서와 함께 혼합하였다. 실온에서 2-5분 동안 인큐베이션 후에, 20㎕ Effectene 시약을 첨가하였다. 실온에서 5-10분 후에, 상기 혼합물을 1 ml 배양 배지하에 8 cm2 접시에서 세포에 적용하였다. 2-5시간 후에, 부 가적인 1.5 ml 배양 배지를 첨가하였다. 다음날에, 배지를 2 ml 신선한 배양 배지로 교환하고, 그 이후에 1주에 한번 씩 교환하였다. 성공적인 트랜스펙션을 리포터 유전자를 이용한 비교 실험에서 확인하였다.
상기 세포를 10% FCS를 포함하는 DMEM:F12 배지에서 연속적으로 계대하였다.
트랜스펙션 후 20일에, 일부 배양물의 지정된 하부집단(병터; 도 2)에서 형태의 변화가 관찰되었으며; 기타 배양물에서, 병터는 나타나지 않았거나 또는 1차 세포의 탄탄한 증식과 경쟁할 수 없었으며; 다시 기타 배양물은 트랜스펙션 직후에 큰 세포 사멸 및 노화를 겪었다.
수많은 독립적인 병터가 간, 망막 및 배외막로부터 유래된 세포를 포함하는 플라스미드 49E-트랜스펙션된 배양물로부터 팽창되었다. 계대 10에서, 예를들면, 플라스미드 49E로 형질전환된 오리 배외막 세포로부터 유래된 세포주 12A07-A10을 분리하고, DSMZ에 기탁하였다.
병터를 또한 망막 및 체절 유래의 세포를 포함하는 플라스미드 60E-트랜스펙션된 배양물로부터 수득하였다.
플라스미드 49E에서, PGK 및 마우스 CMV 프로모터는 각각 E1A 및 E1B의 발현을 유도한다. 플라스미드 60E (서열번호 18)는 또한 완전한 Ad5-E1 영역을 코딩하나, 방어적인 E1B 영역의 발현은 tk, 즉, 마우스 CMV 프로모터만큼 강하지 않은(그러나, 천연 E1B 프로모터 보다는 강한) 프로모터에 의해 유도된다. E1B에 의해 부여된 방어 효과와 일치하여, 더 적은 세포 시료에서 훨씬 더 적은 병터가 플라스미드 49E에 대한 결과와 비교하여 상기 구축물에서 수득되었다.
1차 세포 외관 및 형질전환된 표현형 양자를 갖는 병터의 형성이 또한 CELO 플라스미드 36E (서열번호 19) 및 25F (서열번호 10)로 트랜스펙션된 간의 배양물에서 관찰되었다.
병터를 갖는 배양물은 2-3분 동안 트립신으로 처리 및 신선한 배양 용기로 전달을 위해 DMEM:F12 배지에서 재현탁에 의해 팽창되었다.
일정한 간격으로 냉동보존을 위해, 세포를 트립신으로 제거하고, 10% FCS를 포함하는 DMEM:F12 배지에서 재현탁하고, 10분 동안 200 x g에서 원심분리에 의해 수합하고, 50% FCS 및 10% DMSO (Sigma, USA)를 포함하는 DMEM: F12 배지에서 대략 3 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁하고, 분당 1℃의 속도로 -80℃로 냉각하였다. 24시간 후에, 세포를 영구 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.
실시예
3: 안정한
트랜스펙션에
대한
면역형광
분석
잠재적으로 불멸화된 세포의 배양물을 유리 슬라이드 상에 접종하고, 10분 동안 빙냉 메탄올로 고정 전에 며칠 동안 증식하도록 허용하였다. 고정된 세포를 표준 면역형광 방법에 따라 E1A 및 E1B 55K 단백질에 대한 항체, 2차 항체, 및 2차 항체에 대해 특이적인 형광 염료와 함께 인큐베이션하였다 (Becton Dickinson, UK, 1:30으로 희석한 E1A에 대한 #554155 항체; 종양유전자, USA, 1:30으로 희석한 E1B 55K에 대한 #DP08-100UG 항체; 각각 마우스 또는 래트에 대한 것이며, 바이오틴에 접합된 2차 항체, 양자는 1:80으로 희석한 Jackson Immuno Research, USA 유래; 1:100으로 희석한 Jackson Immuno Research, USA, #016-070-084 스트렙트아비딘- Texas Red 접합체를 이용하여 가시화). 여전히 초기에 풍부하나, 아직 완전히 확립된 불멸화된 세포주가 아니며 형태에 의해 용이하게 구별가능한 1차 세포는 항체 특이성에 대한 편리한 내부 음성 대조군을 제공하였다. Ad5 E1-영역을 안정하게 발현하는 293 세포 (인간 배아 신장 세포)는 양성 대조군으로서 이용하였다. 1㎍/ml의 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌; Sigma, USA)를 배향 목적을 위해 세포의 핵을 염색하기 위해 최종 인큐베이션 단계에 첨가하였다.
E1A 및 55K에 대한 강한 신호가 트랜스펙션된 플라스미드에 의한 성공적인 불멸화를 확인하면서, 형태의 특징적인 변화를 겪은 세포에서 단지 관찰되었다 (도 3). 더욱이, 형식적인 가능성인 자발적인 형질전환은 변경된 표현형을 갖는 모든 세포가 E1-양성이었으므로 관찰되지 않았다. 1차 표현형을 갖는 세포의 어느 것도 E1-단백질을 발현하지 않았다. 삽입 과정에서 플라스미드의 선형화가 무작위 위치에서 일어나는 수퍼코일의 트랜스펙션에서 가능하지만, 조사된 병터의 어느 것도 E1B 발현의 부재하에 E1A 발현을 나타내지 않았으며, 불멸화를 위한 이중 경로 파괴에 대한 요건을 강조하였다.
실시예
4: 내재하는 및 외래의 레트로바이러스에 대한 분석
백신을 1차 병아리 섬유모세포에서 생산할 때 만나는 공통적인 문제는 외래의 또는 내재하는 레트로바이러스로의 오염이다. 레트로바이러스 패밀리의 다양성은 너무 복잡하여 제공된 종이 레트로바이러스에 대한 운반체인지를 예상할 수 없다. 상기 문헌으로부터 보고는 그러므로 통상적으로 레트로바이러스 패밀리의 서브세트, 예를 들면, EAV-HP/ALV 하위그룹 J (Smith,L. M. et al., J. Gen. Virol. 80(ptl): 261-8(1999)), 및 이어서 단지 조류 종의 서브세트에 제한된다.
그러므로, 레트로바이러스로의 오염의 신뢰할만한 확인은 상기 바이러스에 존재하는 공통의 모티프에 집중해야 한다. 서열 다양성은 핵산 기재 검출 방법을 배제한다. 그러나, 모든 레트로바이러스에 공통적인 것은 역전사효소의 존재이다. 플라스미드 49E로 불멸화된 오리 간 세포 유래의 팽창된 병터의 상층액을 역전사효소에 대한 정량적인 프로브 기재 산물 증진된 PCR(Q-PERT)에 의해 분석하고, 몇 가지 대조군, 특히 양성 대조군으로서 CHO 및 음성 대조군으로 293 세포 (하기 및 도 4 참고)과 비교하여, 내재하는 레트로바이러스 활성 또는 유리 레트로바이러스로의 오염 양자를 검출하였다. 상기 분석은 문헌 (Lovatt, A. et al., J. Virol. Methods 82(2): 185-200(1999))으로부터의 변형이다. 간단히: 레트로바이러스를 PBS 중의 20% 수크로스 장벽을 통해 100000 x g에서 초원심분리에 의해 배양 상층액으로부터 농축하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 비리온 (존재한다면)을 용해 버퍼(50 mM Tris pH 7.8, 80 mM KCl, 2.5 mM DTT, 0.75 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)에 재현탁하고, RT 활성이 시료에 존재한다면 역전사되는 모델 RNA(5㎍/ml 브롬 모자이크 바이러스 RNA [Promega Corp, USA, #D1541])를 포함하는 기질 버퍼 (각각 10 mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP; 15 μM 특이적 프라이머 [GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG; 서열번호 15]; 및 0.5 mg/ml 단편화된 청어 정자 DNA [Promega Corp, #D1811])와 혼합하였다. 모델 RNA로부터의 cDNA를 프라이머(AAA CAC TGT ACG GCA CCC GCA TT; 서열번호 16) 및 (GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG; 서열번호 17)를 이용한 PCR에 의해 증폭하고, 제조자의 지시에 따라, QPCR SYBR Green ROX Mix #AB- 1163(Abgene, UK)을 이용하여 AB 7000 서열 검출 시스템에서 SYBR 녹색 형광을 통해 검출하였다.
도 4는 문헌에서 보고로부터 예상된 바와 같이 CHO 세포에서 강한 RT 활성을 증명한다 (예를 들면, Anderson, K. P. et al., Virology 181(1): 305-311 (1991)). 양성 대조군으로서 상기 세포 및 음성 대조군으로서 레트로바이러스 활성이 없는 인간 293 세포에 대해, 세포 배양물의 상층액에서 미지의 RT 활성의 해석을 허용하는 그룹이 정의된다 (도 4, 속이 찬 사각형 및 속이 찬 삼각형).
우리는 병아리 배아 섬유모세포에서 적당한 RT-활성을 발견하였다 (도 4, 속이 찬 다이아몬드 기호).
오리 세포 상층액에서 RT 활성에 대한 신호는 293 세포에서 RT 활성에 대한 신호와 부합하였으며, 양자는 다시 모델 RNA로 이루어지나 RT와 함께 인큐베이션되지 않은 우리의 분석에 대한 검출 한계를 나타내는 대조군과 부합하였다 (도 4, 속이 빈 및 속이 찬 삼각형 및 회색 원을 갖는 곡선 비교). 동등한 수준의 신호 강도 (델타 Rn)를 CHO 세포 및 병아리 배아 섬유모세포 유래의 시료(상기 실험을 위해, 단지 약하게 RT-양성으로 알려진 공급원으로부터 유래됨) 사이의 적어도 2 주기 수 및 CHO 세포 및 293 음성 대조군 및 오리 세포 배양물 유래의 시료 사이의 적어도 4 주기 수에 의해 분리하였다. 그리하여, 병아리 세포와 대조적으로, 기재된 오리 세포는 RT 활성을 나타내지 않으므로, 약학 적용에 적합한 본질적인 특성을 수행한다.
실시예
5: 변형된 우두 바이러스 Ankara(
MVA
)
MVA의 증폭을 위한 기질로서 팽창된 병터의 적합성은 간, 망막, 체절 및 배외막 세포주에 대해 측정되었다. 표 1 및 도 5는 CEFp, 1차 병아리 배아섬유모세포에 대한 MVA (ATCC #VR-1508)의 대규모 제제로부터 제조된 접종물을 이용한 세포주의 감염에 의해 수득된 결과를 보여준다. 0.1 MOI(감염다중도 또는 숙주 세포당 감염성 입자수)를 갖는 감염에 의해 수득된 표에서 데이타는 망막 및 체절 세포의 바이러스 생산(ml 당 플라크 형성 단위)이 CEFp 세포에 대해 수득된 생산과 필적할만하거나 또는 초과한다.
MVA 수율(pfu/ml)
(48시간 후, 0.1 MOI로 감염)
CEFp | 3.54 x 107 |
망막 | 2.06 x 107 |
간 | 3.20 x 104 |
체절 | 4.60 x 107 |
막 | 4.03 x 103 |
표 1: 24-웰 플레이트의 웰에서 1 내지 5 x 105 세포의 비교 감염에서 수득된 바이러스 역가의 비교. 투입 바이러스를 0.1 MOI로 조절하였다. CEFp, 신선한 1차 병아리 배아섬유모세포; 막, 배외막.
오리 세포에 대한 MVA의 플라크 형성 단위를 하기와 같이 측정하였다: MVA 바이러스를 상층액으로부터 48시간 후에 감염된 세포 및 반복된 동결-융해에 의해 개방된 부착성 세포로부터 회수하였다. VERO (아프리카녹색원숭이 신장) 세포를 96 웰 플레이트에 접종하고 (2 x 104 세포/웰), 다음 날에 MVA 함유 현탁액의 연속 적인 10배 희석액으로 감염시켰다. 2일 후에, 배양물을 메탄올로 고정하고, 감염된 세포를 37℃에서 1시간 동안 다클론 우두 바이러스 항체(Quartett, Germany, #9503-2057, 1% 소태아혈청을 포함하는 PBS에서 1:1000 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 2회의 세정 단계를 0.05% Tween 20 (Sigma Corp, USA)를 포함하는 PBS를 이용하여 수행하고, 우두 특이적 항체에 대한 2차 항체를 1% 소태아혈청을 포함하는 PBS에서 1:1000 희석으로 첨가하였다. 상기 2차 항체를 AEC 시약(3-아미노-9-에틸카르보졸; 0.015% H2O2를 포함하는 0.1 M 아세테이트 버퍼 pH 5.0 중의 0.3 mg/ml)과 인큐베이션시 색깔 반응을 촉매하는 퍼옥시다아제 효소에 커플링한다. 감염된 병터를 광학 현미경관찰로 확인하고, 플라크 형성 단위를 양성 염료 반응을 생성하는 MVA 현탁액의 최대 희석으로부터 계산한다.
도 5는 세포당 바이러스의 생산을 나타낸다. 세포당 바이러스의 생산은 특정 바이러스에 대해 제공된 숙주 세포의 증식허용과 관련된다. 증식허용은 수용체 밀도 또는 바이러스 구조 단백질의 가공 효율과 같은 생화학적 특성에 의해 영향을 받는다. 도 5는 망막 세포 또는 체절 세포당 방출된 감염성 입자의 수가 병아리 배아 섬유모세포당 수득된 감염성 입자와 호의적으로 비교된다는 것을 증명한다.
"MOI"로 "세포당 생산 바이러스"를 나누면 방출수, 즉 생산 바이러스에 대한 투입 바이러스의 비를 수득한다. 방출수는 바이러스의 증폭과 동등하므로, 대규모 생산을 위한 비용 및 필요한 자원을 평가하는데 중요하다. 기재된 실시예에서 측정된 방출수는 CEFp에 대해 374, 망막 세포에 대해 513, 및 체절 유래 세포에 대해 1108이다. 망막 세포 및 체절 세포는 신선한 1차 병아리 배아 섬유모세포보다 양호한 값을 수득하므로, MVA의 대규모 생산을 위한 우수한 기질을 제공해야 한다.
간 또는 배외막으로부터 유래된 세포에 대해 수득된 MVA 증폭에 대한 불만족스러운 결과는 기타 바이러스 패밀리로 확장될 수 없다: 기타 바이러스, 예를 들면, 백신 관련 인플루엔자 바이러스의 증폭이 상기 세포에 대해 극도로 성공적일 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
제공된 숙주 세포에서 바이러스의 이은 계대로 생산 역가는 감소한다는 것을 생각할 수 있다. 상기 경우는 숙주 세포가 감염 주기의 다양한 단계에서 모든 단계가 아닌 대부분 단계를 지지한다면 일어날 수 있다. 상기 문제에 겨냥하기 위해, MVA의 연속적인 계대를 플라스미드 49E로 형질전환된 오리 망막 세포에서 수행하였다. 도 6의 데이타는 MVA가 상기 세포상에서 계대시 상실되지 않는다는 것을 증명한다: MOI 0.3 (도 6에서 막대기로 제시함)으로 조정된 투입 바이러스의 유사한 수준에서, 방출수 (속이 찬 사각형)는 35에서 315로 9배 증가한다. 방출수의 증가 이유는 계대수가 증가할 때 숙주 세포의 개선된 특성에 기인할 수 있다.
결론적으로, cGMP 조건하에 Ad5-E1 영역의 트랜스펙션에 의해 수득된 오리 망막 및 체절 유래 세포는 1차 병아리 배아 섬유모세포와 필적할만하거나 또는 양호한 효율로 MVA의 증폭을 안정하게 지지한다. MVA의 매우 약독화된 특성으로 인해, 바이러스의 대규모 생산을 위한 통상적인 세포주는 적합하지 않다. 디자인된 오리 세포주가 MVA의 증식에서 1차 병아리 세포보다 양호하게 수행하므로, 상기 중요한 백신 후보에 대한 신규 생산 플랫폼을 제공할 수 있다는 것은 놀라운 발견이 다. 기재된 세포주를 cGMP 조건하에 생성하였으므로, 약학 적용에 적합하다.
SEQUENCE LISTING
<110> Probiogen AG
<120> Immortalized Avian Cell Lines for Virus Production
<130> 042666wo/JH/PCH
<140>
<141>
<150> 03025158.1
<151> 2003-11-03
<160> 19
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer VS182
<400> 1
actcgagctg acgtgtagtg tatt 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer VS183
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
VintSA-F
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aaggtaccct ccctagtccc agtga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer Vint
SA-R
<400> 6
caatgtacag agtgggctcc tgtgg 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Plasmid
pEFAd5E1A
<400> 7
gtaccgaatt caagcttcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc 60
cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg 120
gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg 180
gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc 240
cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta 300
tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctccag tacgtgattc ttgatcccga 360
gctggagcca ggggcgggcc ttgcgcttta ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag 420
gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc 480
gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt 540
ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caggatctgc acactggtat ttcggttttt 600
gggcccgcgg ccggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc 660
ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg 720
gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg 780
gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctccagg gggctcaaaa 840
tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc 900
tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac 960
ctcgattagt tctggagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat 1020
gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg 1080
atgtaattct ccttggaatt tggccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct 1140
cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaacact cgagctgacg 1200
tgtagtgtat ttatacccgg tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag 1260
agttttctcc tccgagccgc tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac 1320
ggaggtgtta ttaccgaaga aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta 1380
ctggctgata atcttccacc tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat 1440
gatttagacg tgacggcccc cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc 1500
gactctgtaa tgttggcggt gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc 1560
ggttctccgg agccgcctca cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg 1620
ggtccggttt ctatgccaaa ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct 1680
ggctttccac ccagtgacga cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg 1740
gagcaccccg ggcacggttg caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca 1800
gatattatgt gttcgctttg ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga 1860
aaattatggg cagtgggtga tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt 1920
ttacagtttt gtggtttaaa gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg 1980
aacctgagcc tgagcccgag ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa 2040
tggcgcctgc tatcctgaga cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta 2100
cggatagctg tgactccggt ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc 2160
tgtgccccat taaaccagtt gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta 2220
tcgaggactt gcttaacgag cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc 2280
cataaggtgt aaacctgtga ttgcgtgtgg aattctagaa gctcgctgat cagcctcgac 2340
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 2400
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 2460
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 2520
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgg cccgggctct atggcttctg aggcggaaag 2580
aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 2640
gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 2700
tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 2760
tcggggcatc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 2820
tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 2880
gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 2940
ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg gggatttcgg cctattggtt 3000
aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag 3060
ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca ggcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 3120
caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 3180
aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 3240
cctaactccg cccagttccg cccattctcc gcccctaggc tgactaattt tttttattta 3300
tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 3360
tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggaggtcca caatgattga acaagatgga 3420
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 3480
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 3540
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tccaggacga ggcagcgcgg 3600
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 3660
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 3720
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 3780
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 3840
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 3900
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgtatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 3960
actcatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 4020
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 4080
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 4140
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 4200
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 4260
attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct 4320
ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 4380
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 4440
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 4500
gtataccgga tctttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 4560
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 4620
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 4680
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 4740
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 4800
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 4860
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 4920
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 4980
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 5040
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 5100
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 5160
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 5220
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 5280
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 5340
aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 5400
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 5460
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 5520
gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 5580
caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 5640
ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 5700
attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 5760
ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 5820
gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 5880
ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 5940
tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 6000
gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 6060
cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 6120
gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 6180
tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 6240
ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 6300
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Plasmid
pEFAd5E1BSA
<400> 8
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ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Plasmid 25F
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cgaaagaatc gtaacacagt agctgatagg catgaagcgg cgtcggcatc tgaagaccgt 1140
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ggcggcgctg ctggtgctgc agcaccatct ccaggatctg ctcgtcgttc atcttaatcc 1260
ggactcgaga aaggcccgga gatgaggaag aggagaacag cgcggcagac gtgcgctttt 1320
gaagcgtgcg agaatgccgg gcctccggag gaccttcggg cgcccgcccc gcccctgagc 1380
ccgcccctga gcccgccccc ggacccaccc cttcccagcc tctgagccca gaaagcgaag 1440
gagcaaagct gctattggcc gctgccccaa aggcctaccc gcttccattg ctcagcggtg 1500
ctgtccatct gcacgagact agtgagacgt gctacttcca tttgtcacgt cctgcacgac 1560
gcgagctgcg gggcgggggg gaacttcctg actaggggag gagtagaagg tggcgcgaag 1620
gggccaccaa agaacggagc cggttggcgc ctaccggtgg atgtggaatg tgtgcgaggc 1680
cagaggccac ttgtgtagcg ccaagtgcca gcggggctgc taaagcgcat gctccagact 1740
gccttgggaa aagcgcctcc cctacccggt agaattcgcg gcctcgacgg cctcggtggc 1800
cagtctagtc aataatcaat gtccgagctc gaatacactc cgctatcgct acgtgactgg 1860
gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 1920
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 1980
ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagccggatc ataatcagcc ataccacatt 2040
tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa 2100
aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 2160
caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 2220
gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcgaa gctctagagc ggccaacttc 2280
agggattggt tacagagaat ggtaggggtg gtgccgagac ccgagtcccc gcctactcat 2340
acgtaggcag gtttccatga cacccagtct tgcccaatct tggagagaat ggggatttct 2400
gggttcattt ctctcggggg cggggctatc cccgccgaga gtcatacacc aaatttctgt 2460
agaaaacgga tttttgccag tcttgatggc acaaacttcg ggagtttggt taaaaaatcg 2520
gctgaagaat ggttctggaa gtgttctttt cagatctttt ttggtgaaaa ctccagtggt 2580
caggagccga tattgtcggg gggctttgat ggtggtggtc ccacagagac cctcatagcc 2640
agggaccccc actccgcgag ggacatggat cttcagtgtg tctagcgcca tcttcagggc 2700
atgcacggaa ccaatgggga agcccaggtc ccccacgtgg gttatgccgt gggggagggg 2760
atccgagtat tccctggcca cccaatcagg aaccgcgaac gcgccacgga ccgccttctc 2820
catcataatg agggcctcac tgggggtctt gggttccgcg gagcgccccc taatggtaac 2880
gtggataatg cgctggggac cctcgtagtc tgcgaagatt gcctttctcc ccatggacac 2940
tagggggctg aatgagtatt cccgcagttg ctcgccggtc aggttagggt taaaaatcag 3000
gccggtggtc accatttctc taaggctagt ggtgggattc cgctggctag ggtccacagg 3060
gaccaccgaa gtaaaggaaa tggtccccat gtagtatgga aggtccccag ggaacatgcg 3120
gaatgggttg cgggccatac ctgtagaatg tacagggggg tctcgagaac gagggagccg 3180
actgccgacg tgcgctccgg aggcttgcag aatgcggaac accgcgcggg caggaacagg 3240
gcccacacta ccgccccaca ccccgcctcc cgcaccgccc cttcccggcc gctgctctcg 3300
gcgcgccctg ctgagcagcc gctattggcc acagcccatc gcggtcggcg cgctgccatt 3360
gctccctggc gctgtccgtc tgcgagggta ctagtgagac gtgcggcttc cgtttgtcac 3420
gtccggcacg ccgcgaaccg caaggaacct tcccgactta ggggcggacg aggaagcgtc 3480
gccggggggc ccacaagggt agcggcgaag atccgggtga cgctgcgaac ggacgtgaag 3540
aatgtgcgag acccagggtc ggcgccgctg cgtttcccgg aaccacgccc agagcagccg 3600
cgtccctgcg caaacccagg gctgccttgg aaaaggcgca accccaacca ttaataacta 3660
atgcatggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatggt 3720
acggcagttt aaggtttaca cctataaaag agagagccgt tatcgtctgt ttgtggatgt 3780
acagagtgat attattgaca cgccggggcg acggatggtg atccccctgg ccagtgcacg 3840
tctgctgtca gataaagtct cccgtgaact ttacccggtg gtgcatatcg gggatgaaag 3900
ctggcgcatg atgaccaccg atatggccag tgtgccggtc tccgttatcg gggaagaagt 3960
ggctgatctc agccaccgcg aaaatgacat caaaaacgcc attaacctga tgttctgggg 4020
aatataaatg tcaggcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttcacgta 4080
gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg 4140
gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg 4200
atagctagac tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc 4260
ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat 4320
ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 4380
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 4440
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 4500
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 4560
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 4620
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 4680
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 4740
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 4800
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 4860
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga 4920
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 4980
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 5040
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 5100
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 5160
gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 5220
gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 5280
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 5340
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 5400
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 5460
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 5520
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 5580
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 5640
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 5700
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 5760
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 5820
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 5880
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 5940
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 6000
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 6060
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 6120
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 6180
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 6240
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 6300
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 6360
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 6420
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 6480
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 6540
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 6600
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 6660
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 6720
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 6780
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 6840
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 6900
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 6960
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 7020
ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 7080
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 7140
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaag 7174
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer V206
<400> 11
aacctcgaga cccccctgta cattcta 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer V207
<400> 12
gccgttaact tcagggattg gttacag 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer V208
<400> 13
cacctcgagt ccggattaag atgaacg 27
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer V209
<400> 14
ccagttaaca ggtgaaccat ttatacag 28
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: RT primer
<400> 15
gcctttgaga gttactcttt g 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer cDNA 1
<400> 16
aaacactgta cggcacccgc att 23
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer cDNA 2
<400> 17
gcctttgaga gttactcttt g 21
<210> 18
<211> 8681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Plasmid 60E
<400> 18
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctca 240
gaattaaccc tcactaaagg gactagtcct gcaggtttct agtcctgcag gtttaaacga 300
attcgccctt aatcttaagc tgccgccccg acgttggctg cgagccctgg gccttcaccc 360
gaacttgggg ggtggggtgg ggaaaaggaa gaaacgcggg cgtattggcc ccaatggggt 420
ctcggtgggg tatcgacaga gtgccagccc tgggaccgaa ccccgcgttt atgaacaaac 480
gacccaacac cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc 540
ggtattgtct ccttccgtgt tatcctcaat ctgtatcttc atcgctagag ccaaactcag 600
cgcgggtgca ggccagcacc aagtgatcgg gcctcagctc ctcggtcaca tccagcatca 660
caggctggtt cctaatatgt ttaccgccac actcgcaggg tctgcacctg gtgcgggtct 720
catcgtacct cagcaccttc cagatcttca tggtcatgtc aaacaccccg ttcaggttca 780
ccttggacat gctctcgggc tcaagcaata tcttagtgtg actcaaattg cattggtaag 840
gtaggaacac ccccctcctg ttacccaaat gcaaggaaca gcgggtcagt atgttatgct 900
caaacactgg ccaggccttg cgagagtggc tggctacgtg aatggtcttc agcaggtgac 960
agttgccgtc cgagcaggtc agcatctgag aggccctgtc ctcgcagttg ccacatacca 1020
tgttatgctt aatcacagcc acgcttttca ctagcatgaa gcaaccacag tcggaggcca 1080
cattgtggcg caccctggag ttaccctcag acaggatacc caaggtacac ctttcaaaga 1140
ggcatttctt aattgaagcc ctgcttttgg ggcgacacac cacccccttc cagcagcagt 1200
aaaaggcaca gccccgaacc cttacatcgg tccaggcttc cacacaggta ttgttaaacc 1260
catagaagct tacaccgtgt aggataaggt tggtattggc caggaaaacc gtaccgctaa 1320
aattggggcc agtaaacctt acattcataa taaccacccc gtccatgcca agcacccccg 1380
gccacatatt tatcatgcta catctaaagg ccaccctatc ctccgtatct atctccacct 1440
cggccccgtt cccagaaatg tagcaacaat tcctgatatt tacaagtttg ctgatcttgt 1500
acttgcaatc tggcctaagt gccacctttg catataccct aatagcctcc tcaaaatcat 1560
cccctggctg cagccagtaa gtggtcagct gctctatgga atacttctgc gccagcagat 1620
caagctcatt agcgcaatta tccttgatct gttgaaaagt aatacactca ggacggtgtc 1680
tggtcattaa gctaaaagct agattcctag cctcctctgt agcctcacaa gccccccgct 1740
ccctctttac cccctttagc ccctgcccat cctctgtaat tgtcaaaatg cgtctcagtt 1800
ctggatacag ttcagccacc tgtacaacat tcattcccga gggtccaggc cggctctcgg 1860
gttccatggg ctctgctcct gccgccgccg cctggcttcc tcctgctgct gctgctgctc 1920
ctccgtcggt attatcgccg ggcggacgga agacaacagt agcaggcgat tcttgtgtct 1980
cacaaccgct ctccacagat gcatggccag aaaatccagc aggtaccccc cgctcagatg 2040
ggtttcttcg ctccatttat cctttataaa actcaaaaaa gcaacagcag ccgcagcgcg 2100
ccccggtgtg gaaaaatcca aagtcttgat gaccttctct tggaaaagcg cctggtgacc 2160
cagattcaaa gaatcaaaca gctcaccaca ggatttcaaa agctcttcaa attcccactt 2220
gtaatcctcc ttaattctgc agactaactt tgcctgggat gagccccaca gaaacctcca 2280
aaaccaagag gtactgttag agctctgttc cagcaagtta cgcacagcag aaaaatcttc 2340
caaacactcc caagcctcca tgctcgagat ccttcctcct cgggcgggtg tggaccaccg 2400
cctcgcctct ctccggaaaa aaaaaatgaa ataaacaaca aaaccgaaca aaagcgaaac 2460
gccacggatg gagcgcaaaa ccctcttcga agttctgcga ctgcacacag acagtcaaat 2520
ggagcagagc caggcgagcg accgcccgag ccgcagtagc gcgcaggtct ggggaagaga 2580
ggcgcaggta ggggatctga gtccggtagc gatctgcggc acgctgttga cgctgttaag 2640
cgggtcgctg cagggtcgct cggtattcga ggccacacgc gtcaccttaa tatgcgaagt 2700
ggacctggga ccgcgccgcc ccgactgcat ctgcgtgttc gaattcgcca atgacaagac 2760
gctgggcggg gtttgtgtca tcatagaact aaagacatgc aaatatattt cttccgggga 2820
caccgccagc aaacgcgagc aacgggccac ggggatgaag cagctgcgcc actccctgaa 2880
gctcctgcag tccctcgcgc ctccgggtga caagatagtg tacctgtgcc ccgtcctggt 2940
gtttgtcgcc caacggacgc tccgcgtcag ccgcgtgacc cggctcgtcc cgcagaaggt 3000
ctccggtaat atcaccgcag tcgtgcggat gctccagagc ctgtccacgt atacggtccc 3060
cattgagcct aggacccagc gagcccgtcg ccgccgcggc ggcgccgccc gggggtctgc 3120
gagcagaccg aaaaggtcac actctggggc gcgcgacccg cccgagtcag cggcccgcca 3180
gttaccaccc gccgaccaaa cccccacctc cacggagggc gggggggtgc ttaagaggat 3240
cgcggcgctc ttctgcgtgc ccgtggccac caagaccaaa ccccgagccg cctccgaatg 3300
agagtgtttc gttccttccc cctccccccg cgtcagacaa accctaacca ccgcttaagc 3360
ggcccccgcg aggtccgaag actcatttgg atccactaga aacgaattcg taaccaagat 3420
tagcccacgg cgcattatat accctttaag ccccgcccca tttaacacgc catgcaagtt 3480
aaacattatc tcacccttta ttaaacttac atcaactcat tcagcaaaca aaggcgttaa 3540
ccacacacgc aatcacaggt ttacacctta tggcctgggg cgtttacagc tcaagtccaa 3600
aggttgccca ggctcgttaa gcaagtcctc gatacattcc acagcctggc gacgcccacc 3660
aactctcacg gcaactggtt taatggggca cagcgggacc accgggtgta tctcaggagg 3720
tgtgttagaa ggaccggagt cacagctatc cgtactacta ttgcattctc tagacacagg 3780
tgatgtcggg cgtctcagga tagcaggcgc cattttagga cggcgggtag gtcttgcagg 3840
ctccggttct ggctcgggct caggctcagg ttcagacaca ggacctttta aaaaaatcac 3900
aatacaaaat tctttaaacc acaaaactgt aaaaattaaa aaaaaaatta ccacaccaaa 3960
cccaccactc tatcacccac tgcccataat tttcacttac tgtagacaaa catgccacag 4020
gtcctcatat agcaaagcga acacataata tctgggtccc ccgtattcct ccggtgataa 4080
tgacaagacc tgcaaccgtg cccggggtgc tccacataat ctaacacaaa ctcctcaccc 4140
tcttcatcct cgtcgtcact gggtggaaag ccagcctcgt ggcaggtaag atcgatcacc 4200
tccggtacaa ggtttggcat agaaaccgga cccaaggctc tctgctccgg ctgctcgggc 4260
tgccgggaaa ggtgaggcgg ctccggagaa ccgggcgccg gcggaaaagt gagtaagtca 4320
atcccttcct gcaccgccaa cattacagag tcgggaaaaa tctgcgaaac cgcctcctcg 4380
ttgggatctt cgggggccgt cacgtctaaa tcatacagtt cgtgaagggt aggtggttca 4440
aaatggctag gaggtggaag attatcagcc agtacctctt cgatcagctg gtccaaaaga 4500
ctggcggcca tttcttcggt aataacacct ccgtggcaga taatatgtct cattttcagt 4560
cccggtgtcg gagcggctcg gaggagaaaa ctctactcgc tggcactcaa gagtggcctc 4620
ttgaggaact caccgggtat aaatacacta cacgtcagct gactataact cgagaacgag 4680
ggagccgact gccgacgtgc gctccggagg cttgcagaat gcggaacacc gcgcgggcag 4740
gaacagggcc cacactaccg ccccacaccc cgcctcccgc accgcccctt cccggccgct 4800
gctctcggcg cgccctgctg agcagccgct attggccaca gcccatcgcg gtcggcgcgc 4860
tgccattgct ccctggcgct gtccgtctgc gagggtacta gtgagacgtg cggcttccgt 4920
ttgtcacgtc cggcacgccg cgaaccgcaa ggaaccttcc cgacttaggg gcggacgagg 4980
aagcgtcgcc ggggggccca caagggtagc ggcgaagatc cgggtgacgc tgcgaacgga 5040
cgtgaagaat gtgcgagacc cagggtcggc gccgctgcgt ttcccggaac cacgcccaga 5100
gcagccgcgt ccctgcgcaa acccagggct gccttggaaa aggcgcaacc ccaaccatta 5160
ataactaatg catggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 5220
acatggtacg gcagtttaag gtttacacct ataaaagaga gagccgttat cgtctgtttg 5280
tggatgtaca gagtgatatt attgacacgc cggggcgacg gatggtgatc cccctggcca 5340
gtgcacgtct gctgtcagat aaagtctccc gtgaacttta cccggtggtg catatcgggg 5400
atgaaagctg gcgcatgatg accaccgata tggccagtgt gccggtctcc gttatcgggg 5460
aagaagtggc tgatctcagc caccgcgaaa atgacatcaa aaacgccatt aacctgatgt 5520
tctggggaat ataaatgtca ggcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 5580
tcacgtagaa agccagtccg cagaaacggt gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg 5640
ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta 5700
catggcgata gctagactgg gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg 5760
gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct ttctcgccgc 5820
caaggatctg atggcgcagg ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc 5880
gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat 5940
tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt 6000
cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac 6060
tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg 6120
tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc 6180
aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa 6240
tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc 6300
gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg 6360
aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg 6420
acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa 6480
atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg 6540
acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct 6600
tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc 6660
ttgacgagtt cttctgaatt attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta 6720
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 6780
aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 6840
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 6900
tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 6960
gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 7020
ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 7080
gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 7140
gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 7200
agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 7260
gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 7320
cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 7380
gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 7440
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 7500
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 7560
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 7620
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 7680
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 7740
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 7800
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 7860
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 7920
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 7980
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 8040
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 8100
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 8160
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 8220
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 8280
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 8340
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 8400
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 8460
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 8520
tttacggttc ctgggctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 8580
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 8640
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa g 8681
<210> 19
<211> 5428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Plasmid 36E
<400> 19
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaagccc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1140
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1200
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1260
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 1860
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 1980
tcaggaaatt gtaagcgtta ataattcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 2040
tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 2100
cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 2160
cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 2220
gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg ctcgccttga 2280
gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 2340
cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 2400
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atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 2580
ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcttg cagttcattc agggcaccgg 2640
acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 2700
catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 2760
cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcatcctg 2820
tctcttgatc agagcttgat cccctgcgcc atcagatcct tggcggcgag aaagccatcc 2880
agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc cccagctggc aattccggtt 2940
cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gctatcgcca tgtaagccca ctgcaagcta 3000
cctgctttct ctttgcgctt gcgttttccc ttgtccagat agcccagtag ctgacattca 3060
tccggggtca gcaccgtttc tgcggactgg ctttctacgt gaaaaggatc taggtgaaga 3120
tcctttttga taatctcatg cctgacattt atattcccca gaacatcagg ttaatggcgt 3180
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ggtaaagttc acgggagact ttatctgaca gcagacgtgc actggccagg gggatcacca 3360
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caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 3600
ccagtgaatt gtaatacgac tcactatagg gcgaattgaa tttagcggcc gcgaattcta 3660
ccgggtaggg gaggcgcttt tcccaaggca gtctggagca tgcgctttag cagccccgct 3720
ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg cctcgcacac attccacatc caccggtagg 3780
cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc ttcgcgccac cttctactcc tcccctagtc 3840
aggaagttcc cccccgcccc gcagctcgcg tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca 3900
cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc accgctgagc aatggaagcg ggtaggcctt 3960
tggggcagcg gccaatagca gctttgctcc ttcgctttct gggctcagag gctgggaagg 4020
ggtgggtccg ggggcgggct caggggcggg ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc 4080
tccggaggcc cggcattctc gcacgcttca aaagcgcacg tctgccgcgc tgttctcctc 4140
ttcctcatct ccgggccttt ctcgagtccg gattaagatg aacgacgagc agatcctgga 4200
gatggtgctg cagcaccagc agcgccgcca acaggaagcg gagcgcgagg aggaagttgg 4260
ggatgacatg gaagacgacg aagatgatga cggtcttcag atgccgacgc cgcttcatgc 4320
ctatcagcta ctgtgttacg attctttcga acttcatttc gggggatgcg cttgccacgg 4380
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atcatgccgg tatcgattcc agtagcaccg gccccacgct gacaacccac tcttgcagcg 5040
ttagcagcgc ccctcttaac aagccgaccc ccaccagcgt cgcggttact aacactcctc 5100
tccccggggc atccgctact cccgagctta agattaaggg cgaattcgtt taaacctgca 5160
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gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 5340
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 5400
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgc 5428
Claims (20)
- 망막모세포종 단백질의 기능에 영향을 주는 하나 이상의 제1 유전자와 p53 단백질 또는 이의 패밀리 멤버에 영향을 주는 하나 이상의 제2 유전자인 바이러스 또는 세포 유전자 (유전자(들))의 조합을 이용한 비바이러스성 트랜스펙션에 의해 불멸화된 조류 세포주로서,상기 제1 유전자는 마스트아데노바이러스 유래의 아데노바이러스 E1A 유전자, 파필로마바이러스의 E7 유전자, 조류 아데노바이러스의 orf22 유전자 및 양의 아트아데노바이러스 유래의 E43 개방형 해독틀로 이루어진 군으로부터 선택되는, 망막모세포종 단백질과 E2F 전사 인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 바이러스 유전자이거나, 또는 사이클린 D1, 사이클린 D2, 사이클린 D3 및 pl6INK4a에 의한 불활성화에 감수성이 아닌 돌연변이된 CDK4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 망막모세포종 단백질과 E2F 전사 인자 사이의 복합체의 파괴를 매개하는 세포 유전자이고,상기 제2 유전자는 모든 그룹의 아데노바이러스 E1B 55K 단백질, CELO의 GAM-1 및 파필로마바이러스의 E6 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스의 유도를 막는 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자이거나, 또는 p53에 의한 성장 정지 및 아폽토시스를 막는 세포 유전자 mdm2인 것인 조류 세포주.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 Gl 체크포인트 조절을 극복하고, 상기 제2 유전자는 제1 유전자에 의해 유도된 아폽토시스를 막는 것을 특징으로 하는 조류 세포주.
- 제1항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 조류 세포주:(i) 상기 세포주는 배아 또는 부화된 병아리, 오리, 거위, 또는 메추라기로부터 유래되고; 및(ii) 상기 불멸화시킨 세포는 섬유모세포, 신경, 뇌, 망막, 신장, 간, 심장, 근육 및 배아를 보호하는 배외 조직 및 막을 포함하는 단리된 신체 단편(체절) 또는 분리된 개개의 기관 유래의 세포를 포함하는 1차 세포이며; 및(iii) 비바이러스성 트랜스펙션에 의한 불멸화는 리포좀-매개 트랜스펙션 또는 덴드리머-매개 트랜스펙션 또는 전기천공에 의해 수행되며; 및(iv) 상기 제1 유전자 및 제2 유전자는 이종 서열에 의해 공간적으로 분리되거나 또는 상이한 핵산 절편 또는 플라스미드에 위치한다.
- 제3항에 있어서, 하기를 이용하여 불멸화된 것을 특징으로 하는 조류 세포주:(i) 마스트아데노바이러스 속 유래의 아데노바이러스의 E1A (제1 유전자) 및 E1B (제2 유전자) 영역; 또는(ii) 아데노바이러스 유래의 유전자 orf22 (제1 유전자) 및 GAM-1 (제2 유전자); 또는(iii) 상기 (i) 및 (ii)에서 정의된 GAM-1 또는 Orf22를 갖는 E1A 또는 E1B를 코딩하는 핵산의 조합; 또는(iv) 상기 (i) 및 (ii)에서 정의된 GAM-1 및 Orf22를 갖는 E1A 및 E1B를 코딩하는 핵산의 조합.
- 제1항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 조류 세포주:(i) 비천연 기능적 서열을 부가적으로 가지고; 및(ii) 백신 균주 및 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 생물학적 물질 또는 바이러스의 생산에 적합하다.
- 제1항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 조류 세포주:(i) 역전사효소 활성이 없거나; 또는(ii) 오리 배아 또는 부화된 오리에서 기원하는 1차 세포의 불멸화로부터 유래되거나; 또는(iii) 배외막으로부터 유래되거나; 또는(iv) 동물 혈청이 없는 합성 배지에서 배양된다.
- 제1항에 있어서, 조류 세포주 12A07-A10 (DSM ACC2695)인 것을 특징으로 하는 조류 세포주.
- 출발 세포를 제1 및 제2 유전자로 형질전환/트랜스펙션시키는 것을 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조류 세포주의 제조 방법.
- 제 8 항에 있어서, 출발 세포의 비바이러스성 트랜스펙션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조류 세포 주를 사용하는 단계를 포함하는 생물학적 물질 또는 바이러스를 제조하는 방법.
- 하기 단계를 포함하는 바이러스의 제조 방법:(i) 상기 바이러스를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조류 세포주와 접촉시키는 단계; 및(ii) 상기 바이러스를 상기 세포주에서 배양하는 단계.
- 제11항에 있어서, 오리 세포주에서 폭스 바이러스를 제조하는 것인, 바이러스의 제조 방법.
- 하기 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법:(i) 프로모터에 작동가능하게 연결된 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 제 1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조류 세포주 내로 도입하는 단계,(ii) 상기 변형된 세포주를 배양하는 단계; 및(iii) 상기 재조합 단백질을 수확하는 단계.
- 제4항에 있어서, 상기 (i) E1A 및 E1B 영역은 아데노바이러스 5로부터 유래되고, 상기 E1A 영역은 서열번호 7의 1193-2309 bp의 서열 또는 서열번호 9의 4230-3113bp에 상보적인 서열을 가지며, 상기 E1B 영역은 서열번호 8의 1145-3007 bp의 서열 또는 서열번호 9의 2345-550bp에 상보적인 서열을 갖는 것인, 조류 세포주.
- 제4항에 있어서, 상기 (ii) 유전자 orf22와 GAM-1은 아비아데노바이러스 CELO 속 유래의 아데노바이러스로부터 유래하고, 각각 서열번호 10의 1252-635bp에 상보적인 서열, 및 서열번호 10의 3138-2290bp에 상보적인 서열을 갖는 것인, 조류 세포주.
- 제5항에 있어서, 상기 (i) 비천연 기능적 서열은 트랜스진, 프로모터, 인핸서 또는 선택 마커를 포함하는 것인, 조류 세포주.
- 제16항에 있어서, 상기 트랜스진은 결손 바이러스를 보충하는 유전자인 것인, 조류 세포주.
- 제17항에 있어서, 상기 트랜스진은 EBNA1 트랜스진인 것인, 조류 세포주.
- 제12항에 있어서, 상기 폭스 바이러스는 균주 MVA인 것인, 바이러스의 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 오리 세포주는 오리 체절, 오리 신경 조직, 또는 오리 망막에서 기원한 세포주인 것인, 바이러스의 제조 방법.
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