CN1139655C - 一种人卵巢癌永生化细胞株及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人卵巢癌永生化细胞株的建立方法和依照该方法建立的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株，属于微生物动物细胞株领域。人卵巢癌永生化细胞株的建立方法是将永生化基因—SV40 T抗原基因导入人卵巢癌原代细胞，经筛选，抗性克隆扩大培养，得到永生化细胞株。依照该方法建立的人卵巢肉瘤样癌细胞株命名为BUPH：OVSC-2，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中(CGMCC)保藏，保藏号为NO.0606，其生物学特征在于：侵袭力强，细胞呈现为梭形肉瘤细胞形态，为上皮来源，异型性明显，保留其原始细胞的生物学特性。本发明的建系方法和建立的BUPH：OVSC-2细胞株，可用于研究人卵巢癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等。

Description

一种人卵巢癌永生化细胞株及其建立方法

技术领域：

本发明属于微生物动物细胞株领域，具体涉及一种人卵巢癌永生化细胞株的建立方法和依该方法建立的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株。

背景技术：

在女性生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌的发病率位居第二，但死亡率却居于首位。虽然手术、化疗和放疗技术不断改进，但近十年来卵巢癌的五年生存率仍徘徊在30％左右。主要原因在于卵巢癌病理类型复杂、恶性度高、个体差异大，其分子及细胞水平上的发生、发展机制不明。由于从患者体内获得的新鲜癌细胞寿命过短，无法解决临床上指导用药及生物治疗等研究的全过程。为加深对卵巢癌的理解，需要有大量的来源于不同类型及个体的卵巢癌细胞株作为体外研究的模型。目前建立卵巢癌细胞株的方法有经原代培养自发成系或经裸鼠体内种植传代成系，前者成系率非常低，在大量的原代培养标本中只有个别细胞成为细胞株；后者费事费力，且所建系的细胞存在人细胞表面抗原减弱或消失的缺点。因此，目前建立卵巢癌细胞株的方法远远不能满足体外研究的需求，以至限制了在细胞及分子生物学水平上对卵巢癌发病机理、耐药机制、转移相关因素等的理解，迫切需要建立一套可重复建立卵巢癌细胞株的方法。

细胞永生化(Immortalization)也称不死性，是细胞获得可持续生长与增殖能力的特性，永生化细胞具有无限生长和增殖的能力，长期传代不死。将SV40T抗原基因导入原代细胞内建立相应的细胞株是最常用的细胞永生化的方法，参考文献见Jha KK，BangaS，Palejwala V，et al.SV40-mediated immortalization.Exp Cell Res，1998，245：1-7。利用SV40 T抗原基因已先后使支气管、肝内胆管、宫颈等上皮细胞永生化。它可提高细胞永生化的效率，其永生化作用除使细胞生命周期延长外，还能够保留其原始细胞的分化表型，在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性，具有成系率高、可重复的特点，参考文献见Hopfer UJW，Jacobberger DC，Gruenert RL，et al.Immortalizationof epithelial cells.Am J Physiol，1996，270(Cell Physiol.39)：C1-C11。但是，目前国内外尚无利用SV40 T建立人卵巢癌永生化细胞株的报道。

关于由癌和肉瘤组成的恶性肿瘤的诊断名称多达119种，目前的统一名称是肉瘤样癌。医学界对这种恶性肿瘤缺乏认识，在临床诊治过程中容易引起混乱和争论。肉瘤样癌属上皮细胞源性，本质是一种分化差的癌。卵巢肉瘤样癌十分少见，易引起误诊，临床上病情进展很快，生长迅速，侵袭力强，5年生存率很低，多数在诊断后半年内死亡。肿瘤学家和病理医师对卵巢肉瘤样癌的临床诊治缺乏认识，对其生物学特性更是知之甚少。因此，极其需要建立相应病理类型的细胞株供体外深入研究，但目前国内外尚无一株建系的报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种建立人卵巢癌永生化细胞株的方法，其特征在于将永生化基因——SV40 T抗原基因导入人卵巢癌原代细胞，经筛选，抗性克隆扩大培养，及SV40 T基因在转染细胞中表达的鉴定，得到永生化细胞株。

本发明的另一目的还在于利用上述永生化的方法提供一种人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株，其生物学特征在于：侵袭力强，细胞呈现为梭形肉瘤细胞形态，为上皮来源，异型性明显，并保留其原始细胞的生物学特性。

本发明的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株，命名为BUPH：OVSC-2，该细胞株已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为NO.0606。

一、本发明的人卵巢癌永生化细胞株的建立方法：

1.SV40 T抗原基因真核表达载体的构建

pSV₃neo含SV40 T抗原(含大T和小T抗原)基因片段，pcD2为高效表达真核载体质粒。利用基因重组技术将SV40 T抗原基因片段克隆入pcD2载体中，构建成pcD2-SV40。重组质粒经酶切鉴定。

2.原代培养：

手术室无菌取材之卵巢癌新鲜标本，按原代培养常规处理组织。用终浓度200U/ml胶原酶I、100U/ml透明质酸酶消化组织。消化产物经45％和20％Percoll溶液进行密度梯度离心，来分离不同的细胞组分，收集所分离的细胞，接种至塑料培养瓶中。培养基为MCDB105∶M199 1∶1添加15％胎牛血清、0.2U/ml胰岛素、2mmol/ml L-谷氨酰胺培养，37℃、5％CO₂培养箱内培养，675U/ml胶原酶I消化细胞进行传代。

3.永生化细胞株的建立：

挑选生长状态良好、80％汇合的早期传代细胞以脂质体Lipofectin2000为载体转染质粒pcD2-SV40。转染后细胞经G418筛选，抗性克隆扩大培养，SV40 T抗原基因在转染细胞中表达的鉴定，建成永生化细胞株。转染后，细胞在稳定生长及传代一定时期后，换成含15％小牛血清的培养液培养及0.25％胰蛋白酶：0.02％ETDA 1∶1消化传代。成系后细胞按细胞培养的常规方法进行冻存与复苏。

二、人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株(BUPH：OVSC-2)

细胞来源于北京大学人民医院妇科住院手术患者，取材于人卵巢肉瘤样癌腹壁转移结节，术后HE染色、免疫组化及电镜证实腹壁转移结节性质与卵巢原发灶相同，为卵巢肉瘤样癌。

按照本发明的建立细胞株的方法建立的人卵巢肉瘤样癌永生化细胞株BUPH：OVSC-2，培养基为MCDB105∶M199 1∶1添加15％胎牛血清、0.2U/ml胰岛素、2mmol/ml L-谷氨酰胺培养，37℃、5％CO₂培养箱内培养，0.25％胰蛋白酶：0.02％ETDA 1∶1消化传代。按细胞培养的常规方法进行冻存与复苏，复苏后BUPH：OVSC-2细胞接种率约为80％。目前已传至80余代，能够长期生长及稳定传代。

经实验观察和验证，体外培养的BUPH：OVSC-2具有如下特征：

形态学观察：光镜下观察培养瓶内活细胞呈梭形和多角形，分裂期细胞变成圆形，传代后细胞单层贴壁散在生长，密度达0.5×10⁵/cm²时，见堆积现象，失去接触抑制(见附图1)。HE染色可见细胞大小不等，形态不规则，细胞核与细胞质比例增大，核内染色质增加，核仁增大，可见多个核仁。透射电镜观察，细胞间多为一般连接(见附图2)，可见桥粒(见附图3)、紧密连接、绒毛、胞膜下中间丝和张力丝，胞浆内存在分泌颗粒，证实细胞为上皮起源；细胞核形状不规则，核浆比例大，核内异染色质丰富，核仁大且边集，可见两个以上核仁；胞浆内细胞器少。

细胞倍增时间：约42小时。

克隆形成率：11.8％。

软琼脂培养：将第30代细胞进行双层软琼脂培养，于接种后12天见有细胞集落形成，说明该细胞具有集落形成能力。

染色体分析：观察第40代细胞染色体，随机计数50个分裂像，染色体在43-46条之间，众数为46条。随机挑选15个分散好的G显带标本，进行核型分析，全部缺少1条X染色体，多一条20号染色体，且每个核型都能见到3条标记染色体，其中两条为1q与12q相互易位，另一条为14p⁺。其染色体结构存在显著异常，而非正常二倍体核型，呈假二倍体(见附图4)。

凝集实验：细胞与刀豆球蛋白A有较强的凝集反应，并随着刀豆球蛋白浓度的增加，凝集反应逐渐增强，其具有凝集力。

支原体检测：细胞经肉汤培养法培养，支原体检测阴性。

异种动物接种：将35代1×10⁷细胞接种裸鼠皮下，7天见皮下小结节，30天肿瘤长至约1.5cm×1.5cm大小，说明其具有致瘤性。60天后切取肿瘤组织，HE染色显示种植肿瘤与原肿瘤组织类型及分化程度一致，细胞呈现梭形成束排列的肉瘤样形态，未见癌巢及腺上皮(见附图5、6)，说明该细胞株仍保留其原有的生物学特性。

免疫组化：单克隆细胞蜡块的免疫组化结果角蛋白和波形蛋白染色阳性，胞浆内呈现棕色不均匀颗粒，说明其为上皮起源。AB-PAS染色阳性，胞浆呈现蓝色颗粒，表明该细胞具有分泌粘液的功能。以上结果与原组织免疫组化结果一致，证实其保留了原始细胞的分化表型。

上清液标记物检测：ELISA法检测细胞分泌CEA、AFP、CA15-3、CA125、CA19-9抗原情况，细胞培养上清中可检测到CEA和CA19-9抗原。

本发明的利用SV40 T抗原基因进行原代细胞的永生化是一种可行的、可重复的建立人卵巢癌细胞株的方法，这种方法可使不同组织类型、不同分期、不同分化程度的人卵巢癌细胞获得永生，建立相应的人卵巢癌永生化细胞株，成系效率较高，能极大地丰富人卵巢癌体外细胞库。

本发明建立的细胞株BUPH：OVSC-2，恶性度高，在细胞水平上能够反映其原始细胞的生物学特性，为研究人卵巢肉瘤样癌的病因学、转移机制、耐药机理、新药筛选等提供理想的实验对象。

附图说明：

图1为倒置显微镜下BUPH：OVSC-2细胞形态(×200)照片。可见细胞呈梭形和多角形，可重叠生长，失去接触抑制。

图2为BUPH：OVSC-2细胞裸鼠种植瘤透射电镜观察照片。可见三个上皮细胞间的一般连接。

图3为BUPH：OVSC-2细胞裸鼠种植瘤透射电镜观察照片，箭头所示为桥粒结构。

图4为BUPH：OVSC-2细胞染色体核型分析照片。可见缺少1条X染色体，多一条20号染色体，能见到3条标记染色体，其中两条为1q与12q相互易位，另一条为14p⁺，呈假二倍体。

图5为取材部位肿瘤组织HE染色照片。可见细胞呈现梭形成束排列的肉瘤样形态，异型性明显，未见癌巢及腺上皮。

图6为BUPH：OVSC-2细胞裸鼠种植瘤HE染色照片。可见与取材部位肿瘤组织形态、分化一致。

实施例

一、SV40基因真核表达载体的构建

pSV₃neo含SV40 T抗原(含大T和小T抗原)基因片段，BamH I单酶切得到3kb的SV40 T基因片段，电泳回收。pcD2为高效表达真核载体质粒，经多克隆位点处的BamH I单酶切，电泳回收线性载体，再经小牛肠碱性磷酸酶处理，使其不会自连。将其与回收的SV40 T基因片段在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pcD2-SV40。重组质粒经酶切鉴定。经SmaI和HpaI双酶切，筛选出pcD2-SV40正向克隆。所述pSV₃neo和pcD2均为北京大学人民医院血液病研究所李惠萍博士惠赠。

二、人卵巢肉瘤样癌细胞的原代培养

细胞来源于北京大学人民医院妇科住院手术患者，取材于卵巢肉瘤样癌腹壁转移结节，术后HE染色、免疫组化及电镜证实腹壁转移结节性质与卵巢原发灶相同，为卵巢肉瘤样癌。于手术室无菌取材之新鲜标本，立即送回实验室。将人卵巢肉瘤样癌组织于PBS中清洗，剪去坏死组织、脂肪组织及包膜，切成1cm³小块，置入青霉素小瓶中。将组织块剪切成1mm³小块，加入5-6ml PBS吹打，令其自然沉降，吸出上清。于青霉素小瓶中加入终浓度200U/ml胶原酶I、100U/ml透明质酸酶及完全培养基，37℃以150转/分钟振摇1小时。离心收集消化产物，用PBS洗2次。重悬细胞，将其通过400目的滤网，以保证为单细胞悬液。于10ml塑料离心管中依次缓慢加入45％Percoll溶液、20％Percoll溶液以及单细胞悬液各3ml，3000g离心30分钟。将分出的上层细胞吸出，用PBS洗2次，接种入50ml塑料培养瓶中培养。以培养基MCDB105∶M199 1∶1添加15％胎牛血清、0.2U/ml胰岛素、2mmol/ml L-谷氨酰胺培养。5日后，见细胞呈梭型或多角型，无旋涡走向，继续培养。于接种11日后以675U/ml胶原酶I消化传代。当传至第10代，挑选生长状态良好、80％汇合的细胞用于转染。

三、人卵巢肉瘤样癌细胞的转染及筛选

1.转染第一天，取上述80％左右汇合的第10代人卵巢癌细胞，换成无青、链霉素的完全培养基，继续培养24小时。

2.第二天，在无菌玻璃管中制备下列质粒与脂质体混合液，用于转染6孔培养板内(50ml塑料培养瓶内)培养的细胞。溶液A：将2μg(4μg)质粒DNA溶于250μl(500μl)无血清培养基中。溶液B：将6μl(12μl)Lipofectin2000试剂溶于250μl(500μl)无血清培养基中，室温5～30分钟。合并溶液A和溶液B，轻轻混合，置室温20～50分钟。弃去细胞培养液。加2ml(4ml)无青、链霉素完全培养基至Lipofectin2000-DNA混合液中，混匀后加至细胞上，37℃、5％CO₂培养箱培养24小时。第三天，弃去转染液，继续培养。

3.转染细胞的筛选

(1)转染后48～72小时，待细胞生长接近汇合时按1∶4比例传代。

(2)继续培养，至细胞密度达50％～70％汇合。

(3)弃去培养液，更换成浓度为100μg/ml的G418培养液，同时用未加转染液的细胞作对照。

(4)此后每3～4天更换一次含100μg/ml的G418培养液，2～3周后，可见抗性克隆形成而对照细胞全部死亡，待克隆逐渐增大，将其逐一移至24孔板继续培养。

4.克隆细胞株的转移与扩增

(1)将已形成的克隆于显微镜下，用记号笔标记出克隆的位置。

(2)在超净台内，倾去培养基，用PBS洗一次。

(3)以长柄镊子，夹取一块0.2cm×0.3cm的无菌滤纸片，醮取消化液，覆于细胞克隆之上，约10秒左右。

(4)将滤纸取出(取出时在原处涂擦一下)，立即置于含培养基的24孔板中，继续培养。

(5)待细胞长满后，转移至6孔板继续扩增培养。

四、SV40 T基因在转染的人卵巢癌永生化细胞株中的表达

1.SV40 T基因片段的PCR

根据SV40大T抗原cDNA基因序列内部设计一对特异引物，扩增片段应为372bp大小。pcD2-SV40作阳性对照，未转染的原代细胞作阴性对照，以人卵巢癌永生化细胞株的基因组DNA为模板扩增。经30个循环，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。可见两样品分别在370bp处有一特异扩增条带，与阳性对照条带相同，而未转染的原代细胞基因组DNA中无扩增条带。说明SV40 T基因已成功导入细胞内。

2.SV40 T基因片段的RT-PCR

利用随机引物进行转染细胞和未转染的原代细胞mRNA的反转录，以pcD2-SV40作阳性对照，未转染的原代细胞作阴性对照。用SV40大T抗原cDNA基因序列内部设计的一对特异引物(同PCR引物)，对这些反转录产物进行扩增，产物为372bp大小。同时另管以内参引物GAPDH进行扩增。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果经转染的永生化细胞及阴性对照均可见300bp左右的内参引物的扩增条带，证实反转录成功；永生化细胞可见370bp的SV40 T基因特异引物的扩增条带，与阳性对照条带相同，而未转染的原代细胞未见条带。说明转染的永生化细胞株存在SV40 T基因在转录水平的表达。

3.SV40 T基因片段PCR产物的Sothern Blot

切取载体pcD2-SV40中的SV40 T基因片段，采用随机引物法标记上地高辛(DIG)作为探针。将永生化细胞基因组DNA中SV40 T特异引物的扩增产物及质粒pcD2-SV40的扩增产物(阳性对照)于1％琼脂糖凝胶中电泳，经转膜、预杂交、杂交、洗膜、显色，结果两样品均出现棕黑色的显色带，与阳性对照相同。说明所扩增出的产物能够与SV40基因杂交，两细胞内表达的基因为SV40 T基因。

Claims (2)

1.人卵巢癌永生化细胞株CGMCC NO.0606。

2.人卵巢癌永生化细胞株CGMCC NO.0606的建立方法，步骤如下：

(1)利用基因重组技术将pSV₃neo中的SV40 T抗原基因片段克隆入高效表达真核载体质粒pcD2中，构建成pcD2-SV40，重组质粒经酶切鉴定；

(2)用终浓度200U/ml胶原酶I和100U/ml透明质酸酶消化卵巢癌组织标本，消化产物经45％和20％Percoll溶液进行密度梯度离心，以培养基MCDB105∶M1991∶1添加15％胎牛血清、0.2U/ml胰岛素、2mmol/ml L-谷氨酰胺培养，675U/ml胶原酶I消化细胞进行传代；

(3)挑选生长状态良好、80％汇合的早期传代细胞以脂质体Lipofectin2000为载体转染质粒pcD2-SV40，转染后细胞经G418筛选，抗性克隆扩大培养，及SV40T基因在转染细胞中表达的鉴定，由此获得能在体外长期稳定生长和传代的卵巢癌细胞株。

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