CN105255832A - 一种人胆管癌细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人胆管癌细胞系及其应用，所述的人胆管癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：C201452。所述人胆管癌细胞的应用为：该人胆管癌细胞系用于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生胆管癌的试剂。该人胆管癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，在动物体内具有成瘤性，可以成功制备胆管癌动物模型，可以用来分析体外对药物的敏感性和耐药性、体内动物实验对药物的敏感性和耐药性，进而建立体外、体内两个相关联的抗肿瘤药物活性检测平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性胆管癌细胞系，为进一步研究肿瘤的发生机制和药物检测提供了理想的材料。

Description

一种人胆管癌细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及细胞系领域，特别涉及一种人胆管癌细胞系及其应用。

背景技术

原发性胆管癌是一类起源于上皮细胞的肿瘤，诊断较晚，预后差。由于早期缺乏特异性的临床表现和诊断指标，因而临床上发现的原发性胆管癌多是中、晚期病例。胆管癌的发生率约占胃肠道恶性肿瘤的3％。发病的平均年龄大约为50岁，男性的发病率约为女性的1.5倍。亚洲人的发生率是黑人和白人的2倍。近三十年来，全世界范围内胆管癌的发病率在不断升高，但它的发病机理仍不清楚。已知胆管癌的危险因素与胆管慢性炎症、病毒感染、胆道先天畸形、环境或职业毒素暴露等状态的有关。

目前胆管癌的治疗方法以手术切除为主，但是总体效果欠佳，复发率高。大约80％的胆管癌由于转移或进展期只能行姑息治疗。虽然手术和肝移植可治疗部分肝门部胆管癌患者，但5年生存率仍然很低。化疗可用于不可切除的或复发转移的胆管癌患者，以控制疾病、延长生存期并提高生活质量。充分了解胆管癌的生物学机制、致病基因以及其肿瘤微环境之间复杂的相互作用可为患者选择最佳治疗方案并提高患者生存率。

目前报道的应用于研究的胆管癌细胞系非常少，生物多样性低。建立胆管癌细胞系，可以为进一步研究胆管癌的发生机制提供材料，也可以为检测治疗胆管癌的药物提供平台。但包括胆管癌细胞在内的许多肿瘤细胞的体外培养建系均非常困难，原发肿瘤组织由于离体后环境变化，细胞往往会发生衰退死亡，导致体外细胞建系的成功率极低，即使能在体外生存，也常发生某些生物学特性的改变或丢失，与临床上胆管癌的生物学性状相差较大。

另一方面，临床胆管癌患者确诊往往已是中晚期，无法进行手术，化疗是唯一的治疗方法。因此，建立胆管癌动物模型，对于肿瘤的药效学研究显得格外重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的人胆管癌细胞系存在的生物多样性低，与临床上胆管癌的生物学性状相差较大这一技术问题，提供一种新的人胆管癌细胞系及其应用。本发明的人胆管癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，在动物体内具有成瘤性，可以成功制备胆管癌动物模型，可以用来分析体外对药物的敏感性和耐药性、体内动物实验对药物的敏感性和耐药性，进而建立体外、体内两个相关联的抗肿瘤药物检测平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性胆管癌细胞系，使得通过原代培养建立的人源肿瘤细胞更接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的敏感性和耐药性将具有更好的预测性，可用于临床前抗肿瘤药物的活性检测，为进一步研究肿瘤的发生机制和药物抗肿瘤活性检测提供了理想的材料。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种人胆管癌细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201452。

本发明还提供如上所述的人胆管癌细胞系的子代细胞系。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：本发明所述的人胆管癌细胞系的用途，所述的人胆管癌细胞系用于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生胆管癌的试剂。

本发明所述的免疫缺陷哺乳动物为本领域常规的免疫缺陷哺乳动物，较佳的为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠较佳的为裸小鼠。所述的胆管癌为本领域常规的胆管癌，较佳地为低分化或中分化胆管癌细胞癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种药物的抑制胆管癌的活性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌活性的药物，其中所述的细胞模型是本发明所述的人胆管癌细胞系。

其中所述检测方法为本领域常规使用的检测方法，所述检测方法较佳地包括以下步骤：

(1)将一定数量的人胆管癌细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；

(2)将待测化合物稀释成不同浓度施用于细胞，待测化合物作用72小时后通过测定细胞的活力，计算不同浓度的待测化合物对细胞的增殖抑制能力，计算待测化合物半数抑制浓度，用以判断待测化合物的抑制肿瘤的活性。

其中步骤(1)所述人胆管癌细胞系或其子代细胞的接种量较佳地为5000/孔。步骤(2)所述检测不同化合物半数抑制浓度，用以判断待测化合物的抗肿瘤能力的方法为本领域常规检测和计算方法。其中所述半数抑制浓度检测方法较佳地包括ATP生物发光法或MTT法，本发明所述检测方法优选地为ATP生物发光法。所述的ATP生物发光法是通过对细胞中的ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法，其中所述的ATP是反应活细胞新陈代谢能力的一个重要指标。

本发明还提供一种药物的治疗胆管癌的活性的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胆管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胆管癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人胆管癌细胞系所导致的胆管癌肿瘤。本发明所述检测方法较佳地包括以下步骤：

(1)将所述的胆管癌细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人胆管癌动物模型；

(2)观察和测量动物的体重与肿瘤生长情况；

(3)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胆管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胆管癌的候选化合物。

其中，所述的动物模型较佳地为免疫缺陷动物，优选地为裸小鼠。较佳的可采用细胞悬液注射方法来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于胆管癌荷瘤动物。较佳的使用对照实验，一种优选的对照实验方式是：同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于胆管癌荷瘤动物作为对照。

本发明还提供了一种人胆管癌细胞系的建立方法，所述的建立方法包括以下步骤：

(1)获得新鲜的临床人胆管癌手术切除标本，剪切成小块，接种免疫缺陷哺乳动物；

(2)接种60～80天后，将荷瘤动物安乐死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。

其中步骤(1)所述小块的重量较佳地为20～50mg，所述免疫缺陷哺乳动物较佳地为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠较佳地为裸小鼠。

其中步骤(1)所述的新鲜的临床胆管癌手术切除标本较佳的用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B)漂洗后，再进行接种。所述的接种的方法为本领域常规方法，较佳地为皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种，优选地为皮下穿刺接种。

其中步骤(2)所述的肿瘤组织的体积较佳地为300mm³～500mm³，所述原代培养为本领域常规的原代培养技术。其中步骤(2)所述的原代培养方法为本领域常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳的所述的原代培养方法包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱5％CO₂条件下培养；6-8小时后，向培养瓶内加入1640完全培养液(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素G、100μg/mL)，静置培养。

其中步骤(2)所述的传代培养方法为本领域常规哺乳动物细胞的传代培养方法。所述的传代培养方法较佳地包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的完全培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明的人胆管癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，该细胞系的甲胎蛋白，细胞角蛋白，胆管癌细胞特异性蛋白表达阳性，为胆管癌研究提供了一种新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料；

2、本发明的人胆管癌细胞系可以用来分析体外对药物的敏感性和耐药性、体内动物实验对药物的敏感性和耐药性，进而建立体外、体内两个相关联的抗肿瘤药物活性检测平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人原发性胆管癌细胞系

生物材料保藏信息

本发明的人胆管癌细胞系，于2014年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学邮编430072，培养物名称为人胆管癌细胞LIPF155C，保藏编号为CCTCCNO：C201452。

附图说明

图1为细胞的形态学观察结果图(100×)。

图2为细胞生长曲线图。

图3为细胞倍增时间曲线图。

图4为细胞周期图。

图5为细胞免疫组化结果图。图5(A)为阴性对照组；图5(B)为细胞角蛋白CK19；图5(C)为细胞角蛋白CKpan；图5(D)为胆管癌细胞特异性蛋白(200×)。

图6为LIPF155C细胞的成瘤性。图6(A)为LIPF155C细胞在裸小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；图6(B)为LIPF155C细胞移植瘤对小鼠体重影响结果图。

图7为LIPF155C细胞裸鼠移植瘤组织病理学结果图。图7(A)临床手术标本；图7(B)：裸小鼠体内传代亲本肿瘤；图7(C)：LIPF155C细胞在裸小鼠体内所成肿瘤。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1LIPF155C细胞系的建立

SCID小鼠：5只SCID小鼠，雌性，体重16.0±1.0克，鼠龄5周，饲养于SPF环境。SCID小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

从上海交通大学医学院附属仁济医院获得新鲜的临床胆管癌切除标本(女，79岁，原发性胆管癌，民族：汉族，籍贯安徽)，病理诊断结果为：肝内胆管腺癌，低中分化)，立即浸入预冷的无菌HBSS缓冲液中(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B)。在生物安全柜中，用新鲜的该无菌HBSS缓冲液冲洗标本，切成20～50mg的小块，穿刺接种SCID小鼠腋背部皮下。接种20天后，通过触摸发现在接种部位皮下有肿瘤小结节，小结节于接种40天后开始生长明显，至接种后60天时，肿瘤体积超过300mm³。

原代培养：皮下穿刺接种人胆管癌癌60～80天后，将荷瘤裸小鼠用过量二氧化碳气体麻醉安乐死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行原代培养，方法如下：用HBSS缓冲液(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B)漂洗肿瘤组织块3次，去除结缔组织和坏死组织；用无菌手术刀片将肿瘤组织剪切成约1mm³小块；将剪切好的组织块用接种针送入培养瓶，并均匀摆置，间隔0.5cm，盖好瓶盖；轻轻翻转培养瓶，使瓶底向上，于37℃孵箱内，在5％CO₂条件下培养；次日，向瓶内加入5mL的1640完全培养液(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素G、100μg/mL)，静置培养；原代培养每3-4天换液1次，去除已漂浮的组织块和细胞。

传代培养：当由组织块中长出的细胞布满培养瓶底部后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，向瓶中加入1mL新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入1mL新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，于37℃孵箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入3mL新鲜的完全培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；收集全部细胞，离心，计数，分别接种于新的培养瓶。传代至30代以上。

在本发明中，来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈不规则多边形，细胞形态较为均一，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将原代培养传代30代以上，得到细胞系，将该细胞系命名为LIPF155C。本发明所得胆管癌细胞系于2014年6月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学邮编430072，培养物名称为人胆管癌细胞LIPF155C，保藏编号为CCTCCNO：C201452。

实施例2LIPF155C细胞的生物学特性及应用

本发明采用含有胎牛血清的RPMI1640培养液培养实施例1所得LIPF155C细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至15代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第30代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的LIPF155C细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈不规则多边形，失去接触生长抑制，呈恶性生长。该LIPF155C细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。该LIPF155C细胞和其来源的临床胆管癌癌肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可以为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性，以及胆管癌癌的发生、发展和生物标志物提供新的试验材料。具体如下：

a.形态学观察

将LIPF155C细胞接种于盖玻片中贴壁培养，然后使用HE染色，拍照。结果见图1所示：细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状为不规则多边形形，具有上皮样细胞特征。

b.短片段重复序列(STR)鉴定

短串联重复序列又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

收集新鲜培养的LIPF155C细胞和同一患者来源的LIPF155动物模型的肿瘤样品，抽提基因组DNA，由苏州金维智生物科技有限公司提供STR检测服务，分别使用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括Amelogenin，THO1，TPOX，D13S317，vWA，D16S539，D5S818，CSF1PO以及D7S820等各个STR位点的序列重复数，STR位点的核苷酸序列如表1所示，STR位点的核苷酸序列及其拷贝数如表2所示。上述序列和ATCC，DSMZ等细胞保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的遗传图谱。LIPF155C细胞和同一患者来源的动物模型的STR结果一致，说明细胞来源于同一肿瘤样品，并且在培养过程中没有被其它细胞污染。

表1STR位点的核苷酸序列

STR位点	性染色体
		Amelogenin	x

表2STR位点的核苷酸序列及其拷贝数

c.细胞生长曲线

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬，分别接种2000、3000、4000、5000、6000细胞/孔的细胞密度在细胞培养板中，放入37℃的CO₂培养箱中培养，分别在1、24、48、72小时，取出一块板，按照发光法细胞活性检测试剂盒(该试剂盒采购自Promega，货号为G7573)的说明书，加CELLTITER-GLO试剂(简称：CTG，是发光法细胞活性检测试剂盒的主要成分，该试剂通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目和状态)，测生物发光值。将5天的测量值汇总绘制细胞生长曲线，如图2所示，以测定的时间为横坐标，测出的生物发光值为纵坐标。由图2可知：可见在5天的观察期内，细胞浓度从2000/孔增加至6000/孔，其生长速度呈浓度依赖性，根据体外药效学的实验要求，结合该生长曲线，可以确定：4000/孔的细胞密度为细胞毒实验最适接种密度。

d.细胞动力学

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬。接种2000细胞/孔的细胞密度于37℃CO₂培养箱中培养，在24、48、72、96小时四个时间点分别取出一块板，加CTG，分析并计算其倍增时间。将4天的测量值汇总绘制增殖曲线，如图3所示。

倍增时间的计算公式为：倍增时间＝Log2/曲线斜率；图4中倍增时间(X)与Log荧光信号(Y)的曲线方程为：y＝0.0081x+4.726(R²＝0.9998)。根据公式可知斜率为0.0081；由此可以得到LIPF155C细胞的群体倍增时间为37小时。

e.细胞周期检测

利用碘化吡啶标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。消化细胞后用PBS清洗重悬细胞，用冰乙醇固定，-20℃过夜保存。离心并用PBS清洗和重悬细胞，加入RNA酶重悬细胞，37℃条件消化30分钟，以除去RNA酶。加入碘化吡啶，4℃避光染色30分钟。转入流式检测管，分析细胞周期。

检测结果：如图4所示：LIPF155C细胞G₁期为76.14％，S期为11.72％，G₂/M期为12.14％。

f.免疫组化蛋白表达

将LIPF155C细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫组化染色(DAB显色法)。检测结果如图5所示，图5(A)为阴性对照组；图5(B)为细胞角蛋白CK19；图5(C)为细胞角蛋白CKpan；图5(D)为胆管癌细胞特异性蛋白(200×)。阴性对照图(5A)显示该方法不造成背景。该结果显示了LIPF155C符合胆管癌细胞胆管癌的特征：细胞角蛋白CK19图5(B)、细胞角蛋白CKpan图5(C)和Glypican-3图(5D)的染色均为阳性。Glypican-3在肝细胞和胆管细胞中表达，CKpan在上皮细胞中表达，CK19只在胆管细胞中表达，肝细胞不表达。结合三种抗原在LIPF155C中的表达情况判断，该细胞为胆管来源的细胞。

g.细胞的成瘤性

体外大规模培养和收集LIPF155C细胞，皮下接种BALB/c裸小鼠(每只动物接种1.0×10⁷个细胞)，接种后约3周，肿瘤形成并开始生长，选取5只成瘤小鼠调查肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，LIPF155C细胞的成瘤性如图6所示。图6(A)为LIPF155C细胞在裸小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；图6(B)为LIPF155C细胞移植瘤对小鼠体重影响结果图。其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2。肿瘤生长较快，接种后80天肿瘤体积平均值达到700mm³，如图6(A)所示，上述结果表明该胆管癌细胞系细胞能在裸小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

h.荷瘤裸小鼠的体重变化

对上述g步骤成瘤性实验的小鼠每周进行称重，绘制体重变化曲线，其结果表明荷瘤小鼠体重在后期会随着肿瘤体积变大而减轻，说明肿瘤对小鼠体重的增长有一定的抑制作用，上述结果如图6(B)所示。

i.肿瘤的病理学鉴定

将实施例1所述从上海交通大学医学院附属仁济医院获得新鲜的临床胆管癌切除标本、穿刺接种于裸小鼠背部皮下长出的肿瘤、和上述g步骤中LIPF155C细胞在裸小鼠皮下接种后形成的肿瘤，进行石蜡包埋切片和H&E染色，结果如图7所示，其中图7(A)临床手术标本；图7(B)：裸小鼠体内传代亲本肿瘤；图7(C)：LIPF155C细胞在裸小鼠体内所成肿瘤。病理诊断结果见表3所示，从病理诊断结果可见临床标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤和LIPF155C细胞系细胞在裸小鼠体内所成肿瘤的结构类似，形成对应关系。裸小鼠体内所成肿瘤癌组织细胞异型明显，血管生长丰富，排列致密，染色质增加，核内常有多个核仁，核大深染，嗜苏木素。

表3各肿瘤标本的病理诊断结果

标本名称	病理诊断结果
		临床手术标本图7(A)	肝内胆管腺癌，低中分化
裸小鼠体内传代亲本肿瘤图7(B)	低中分化胆管腺癌
		LIPF155C细胞在裸小鼠体内所成肿瘤图7(C)	低中分化胆管腺癌

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种人胆管癌细胞系，其特征在于，所述的人胆管癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201452。

2.如权利要求1所述的人胆管癌细胞系的子代细胞系。

3.如权利要求1或2所述的人胆管癌细胞系的用途，其特征在于，所述的人胆管癌细胞系用于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生胆管癌的试剂。

4.如权利要求3所述的人胆管癌细胞系的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷哺乳动物为免疫缺陷小鼠。

5.如权利要求4所述的人胆管癌细胞系的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠为裸小鼠。

6.如权利要求3所述的人胆管癌细胞系的用途，其特征在于，所述的胆管癌为低分化或中分化胆管癌。

7.一种药物的抑制胆管癌的活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的药物为具有抑制胆管癌活性的药物，其中所述的细胞模型是权利要求1～2任一项所述的人胆管癌细胞系。