CN107541494A - 一种人胆管癌细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人胆管癌细胞系及其应用。该人胆管癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201662。该人胆管癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了人胆管癌细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内体外实验提供新的试验材料。
Description
技术领域
本发明属于细胞系领域，特别涉及一种人胆管癌细胞系及其应用。
背景技术
胆管癌是一类起源于上皮细胞的恶性肿瘤，根据其解剖部位可分为以下几种类型：肝内胆管癌、肝门部胆管癌和肝外胆管癌。尽管胆管癌并不常见，占各种癌的比例不到2％，然而其发病在全球有增多趋势。胆管癌发病率在我国消化道恶性肿瘤中居第5位，发病年龄多在50-70岁之间，男性略多于女性。胆管癌中约2/3位于肝门部，即肝门部胆管癌，其包括肝总管、左右肝管汇合部、左右肝管的癌肿；1/4位于远端胆管，其余为肝内胆管细胞癌。胆管癌虽不常见，但恶性程度高，预后极差，手术治疗是可治愈胆管癌的手段，但是患者术后5年生存率仅10％。因此，亟待新的治疗策略来解决这个问题。
在胆管癌治疗当中，手术治疗是首选。吉西他滨-顺铂联合化疗方案则通常用于不能手术的患者及术后辅助治疗，但由于胆管癌高度促结蹄组织增生能力、丰富的肿瘤微环境，以及患者之间存在极大的异质性及肿瘤基因演进导致的耐药性，很难找到实体瘤的治疗方法，极大提高了药物治疗的难度。因此找出胆管癌的突变基因，并针对这些突变基因进行靶向治疗，是提高患者生存率的主流的研究方向。
研究人员已经发现一些参与胆管癌肿瘤形成的信号通路及针对这些信号通路的靶向药物，但是胆管癌细胞系却十分有限，更不具备中国人遗传背景、保留胆管癌的主要临床生物学特征的胆管癌细胞系。因此建立人胆管癌细胞系，对于有效指导临床研究具有必不可少的重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有胆管癌细胞系十分有限、不拥有中国人遗传背景、与临床胆管癌的生物学性状相差较大的不足，而提供一种人胆管癌细胞系及其应用。该人胆管癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了人胆管癌细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内体外实验提供新的试验材料。并且该人胆管癌细胞系所成的裸鼠肿瘤还具有胆管癌的临床特性，是研究胆管癌药物作用机制的良好试验材料，具有很高的科研价值和开发意义。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人胆管癌细胞，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201662。
本发明中，所述的保藏编号为CCTCC NO:C201662的人胆管癌细胞为肝胆腺癌细胞。
本发明还提供上述的人胆管癌细胞的子代细胞。
本发明还提供上述的人胆管癌细胞的用途，其用于制备在非人类的哺乳动物中产生胆管癌肿瘤的试剂。
本发明中，所述的非人类的哺乳动物为本领域常规的非人类的哺乳动物，较佳地为免疫缺陷小鼠。所述的免疫缺陷小鼠为本领域常规的免疫缺陷小鼠。较佳地为改造的免疫缺陷小鼠，如免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。更佳地包括裸小鼠或SCID鼠。
本发明还提供一种上述人胆管癌细胞系的建立方法，其包括以下的步骤：
1)获得新鲜的临床人胆管癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；
2)穿刺接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
其中，所述的哺乳动物、所述的胆管癌都如上所述。
本发明中，所述的新鲜的临床人胆管癌切除标本较佳地用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种。更佳地用新鲜的HBSS缓冲液漂洗，所述HBSS缓冲液含有500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B。
所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳地包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱5％(v/v)CO2条件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入RPMI-1640培养液静置培养。所述RPMI-1640培养液包含10％(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B。待细胞铺展到占培养瓶表面70％满时进行传代培养和纯化。
本发明中，所述的纯化是本领域常规的哺乳动物细胞的纯化方法。较佳地为利用肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，将消化下来的细胞接种于新的培养瓶后静置培养20分钟，细胞悬液中的成纤维细胞大部分贴壁生长，所以细胞悬液中的肿瘤细胞得到了纯化，将上述步骤重复多次，即达到了纯化肿瘤细胞的目的。
本发明中，所述的传代培养方法是本领域常规的哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳地，其包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.25％(w/w)胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的RPMI-1640培养液，所述RPMI-1640培养液包含10％(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B。仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶。
本发明提供一种筛选治疗胆管癌候选药物的体内实验方法，所述的体内实验方法包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胆管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胆管癌候选化合物。所述的动物模型具有上述的人胆管癌细胞所导致的胆管癌肿瘤。
本发明中，所述的动物模型为本领域常规的动物模型，较佳地为裸小鼠。所述的裸小鼠为本领域常规的裸小鼠，较佳地为Nu/Nu裸小鼠。建立动物模型的方法为本领域常规的方法。较佳地，可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于胆管癌荷瘤动物。较佳地，所述方法还包括使用对照的步骤。所述对照为本领域常规的对照，较佳地，为不含所述测试化合物的溶剂施用于胆管癌荷瘤动物。
本发明还提供一种筛选治疗胆管癌候选药物的体外实验方法，所述的体外实验方法包括以下步骤：将测试化合物以不同浓度直接施用于肿瘤细胞，根据对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断测试化合物对胆管癌的抗肿瘤能力。
具体的，本发明所述的体外实验方法包括以下步骤：
(1)将所述的胆管癌细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；
(2)将测试化合物稀释后施用于细胞，药物作用72小时后通过测定细胞的活力，通过化合物对细胞的增殖抑制能力，计算出化合物的半数抑制浓度，从而判断测试化合物的抗肿瘤能力。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明所述的人胆管癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，为胆管癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料；
2、本发明所述的人胆管癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了人胆管癌细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内实验针对临床抗癌药物敏感性的测试提供新的试验材料；
3、本发明所述的人胆管癌细胞系可以成功制备胆管癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选，是研究胆管癌药物作用机制的良好试验材料，具有很高的科研价值和开发意义。具体地，所述的人胆管癌细胞系通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台。
4、本发明所述的人胆管癌细胞系所成的裸鼠肿瘤还具有胆管癌的临床特性，是研究胆管癌药物作用机制的良好试验材料，具有很高的科研价值和开发意义。
生物材料保藏信息
本发明的人胆管癌细胞系，于2016年4月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学邮编430072，保藏编号为CCTCC NO：C201662，培养物名称为人胆管癌细胞LIXC-127。
附图说明
图1A～图1B为LIXC-127细胞的形态学观察(分别为100×和200×)的结果。
图2A～图2B为LIXC-127细胞的染色体分析的结果。
图3A～图3I为LIXC-127细胞的短片段重复序列(STR)分析结果。其中A～I分别为STR位点Amelogenin、THO1、TPOX、D13S317、vWA、D16S539、D5S818、CSF1PO和D7S820。
图4A～图4D为细胞免疫组化染色(DAB法，200×)的结果。其中A为阴性对照、B为癌胚抗原(CEA)、C为糖类抗原19-9(CA19-9)、D为上皮膜抗原(EMA)。
图5为LIXC-127细胞的倍增时间曲线。
图6为LIXC-127细胞的生长曲线。
图7为LIXC-127细胞的细胞周期分析的结果。
图8A～图8F为体外测试多个抗癌药物对LIXC-127细胞增殖的抑制作用的结果。其中A为厄洛替尼，B为5-氟尿嘧啶，C为PI3K抑制剂PI-103，D为吉西他滨，E为奥沙利铂，F为顺铂。
图9为LIXC-127细胞的成瘤性的结果。
图10A～图10C为LIXC-127细胞在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片(100×)。其中A为正常肝组织；B为对应标本移植瘤块；C为LIXC-127细胞接种瘤块。
图11A～图11B分别为体内测试吉西他滨、顺铂对LIXC-127细胞裸小鼠模型的肿瘤生长抑制作用的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1LIXC-127细胞的制备
从上海东方医院获得新鲜的临床肝癌切除标本(肝内胆管低至中分化腺癌，女，汉族，中国人，73岁)，临床诊断结果为肝癌，病理诊断为肝内胆管低至中分化腺癌伴肝内转移。
用新鲜的HBSS缓冲液(含500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B)漂洗上述标本后，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种于免疫缺陷动物SCID鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)；穿刺接种70～90天后，用过量二氧化碳气体将荷瘤动物麻醉处死，无菌解剖，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
原代培养：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱5％(v/v)CO2条件下培养。次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入RPMI-1640培养液[含有10％(w/w)胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B]，静置培养。待细胞铺展到培养瓶表面70％满时进行传代培养和纯化，纯化的方法是将消化下来的细胞接种于新的培养瓶后，37℃、5％(v/v)CO2的条件下静置培养20分钟后吸取上清转移到新的培养瓶，重复2-3次，去除成纤维细胞。
传代培养：吸弃旧培养液，向瓶中加入2mL新鲜的0.25％(w/w)胰蛋白酶溶液，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，终止消化，加入5mL新鲜的RPMI-1640培养液，吹打使之脱离瓶壁形成细胞悬液；少量在瓶壁上变圆但没有脱落的细胞，用无菌细胞刮刀轻轻刮擦培养瓶表面，收集全部细胞，离心，分别接种于新的培养瓶。细胞生长良好，形态较为均一。传代至30代以上。
在本发明中，将该来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞系命名为LIXC-127，于2016年4月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C201662，培养物名称为人胆管癌细胞LIXC-127。其中，提交保藏的是传代30代后的细胞。
实施例2LIXC-127细胞的生物学特性及应用
本发明采用RPMI1640培养并用差速贴壁法纯化LIXC-127细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第30-50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的LIXC-127具有典型的上皮样形态，主体为扁平不规则多角形，中有圆形核，呈覆层生长，细胞贴壁且彼此紧密相连，生长时呈膜状移动。遗传学研究证实该细胞为异倍体。该细胞能在裸小鼠体内可形成肿瘤，具有致瘤性。该细胞和其来源的临床肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可为研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性的相关性提供新的试验材料。具体如下：
a.形态学观察
将培养LIXC-127细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，结果见图1。图1可见LIXC-127细胞主体呈扁平不规则多角形，中有圆形核，呈覆层生长，细胞贴壁且彼此紧密相连，生长时呈膜状移动。
b.染色体的鉴定
将培养的LIXC-127细胞在37℃细胞培养箱培养12小时后，加入秋水仙素，使其终浓度为0.2μg/mL，再于37℃孵箱中继续培养过夜。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemsa染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2。图2可见，LIXC-127细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，染色体众数(M)集中在40～70之间，占78.05％，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体(图2A，1000×)；而裸小鼠的染色体数2n＝40，且均为顶端着丝粒(图2A，1000×)，据此可与人类染色体相区别。可见该LIXC-127细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
c.短片段重复序列(STR)鉴定
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
收集新鲜培养的LIXC-127细胞，用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(购自Axygen公司的AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，货号为AP-MN-MS-GDNA)提取细胞基因组DNA，用5’端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，分析包括Amelogenin、THO1、TPOX、D13S317、vWA、D16S539、D5S818、CSF1PO以及D7S820等各个STR位点的序列重复数，其中STR位点的引物序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～18所示)及拷贝数如表1～3和图3所示。上述序列和ATCC，DSMZ等细胞保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的遗传图谱，在美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库中，进行STR序列检索，也未发现相同STR检测结果，由此可以证明其独一无二性，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染。
表1STR位点的引物序列
表2STR位点的引物序列及拷贝数
表3STR位点的数据结果
d.组织来源鉴定
将LIXC-127细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％(v/v)甲醛固定，进行免疫组化染色(DAB显色法)。
结果显示，癌胚抗原(CEA)为强阳性，提示其具有相当的恶性程度；糖类抗原19-9(CA19-9)为强阳性；上皮膜抗原(EMA)为强阳性；最后，结合来源组织的临床信息和病理诊断结果，判断LIXC-127细胞的组织来源为肝内胆管低中分化腺癌。
e.细胞倍增时间
将LIXC-127细胞以2000个/孔的密度接种在96孔板中，于37℃培养箱5％(v/v)CO2条件下培养，分别在12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和96小时使用CellTiter Glo试剂盒测定(测定方法参见试剂盒说明书)每孔中的活细胞数。其中，倍增时间的计算公式为：倍增时间＝Log2/曲线斜率。
结果为图5所示。图5中倍增时间(X)与Log荧光信号(Y)的曲线方程为：Y＝0.0069X+4.9848；其中R2＝0.9883。由图5的细胞倍增时间研究结果显示，LIXC-127细胞的群体倍增时间为43.6小时。
f.细胞生长曲线
将LIXC-127细胞以1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔的密度接种在96孔板中，于37℃培养箱5％(v/v)CO2条件下培养，分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天试用MTT法测定每孔的细胞活力。结果如图6所示，图6说明，当细胞接种密度为1000个/孔，第7天到达平台期；当细胞接种密度为2000、3000、4000个/孔，第5天到达平台期；当细胞接种密度为5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，第4天到达平台期。
g.细胞周期分布
收集约106个细胞于1.5mL离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用1mL保存于-20℃的75％(v/v)乙醇重悬，室温固定1个小时。离心弃上清，加入500μL PI染色液。混匀，室温孵育30分钟。用流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测每孔细胞数和每个细胞的总DNA含量(每个细胞的总DNA含量和该细胞的总PI荧光强度呈正比)；并根据不同细胞周期时，细胞总DNA含量的变化，计算各个细胞周期的细胞总数。检测得到周期分布图如图7所示，各周期分布比例如表4所示。根据细胞增殖指数(PI)公式PI＝(G2/M+S)÷(G0/G1+S+G2/M)×100％，计算结果：LIXC-127细胞PI＝46.34％。
表4LIXC-127细胞周期分布比例
| 周期 | 比例(％) |
| G0/G1 | 53.66 |
| S | 27.67 |
| G2/M | 18.67 |
h.体外细胞毒实验
体外测定胆管癌临床常用化疗药物：厄洛替尼、5-氟尿嘧啶、PI3K抑制剂PI-103、吉西他滨、奥沙利铂或顺铂(厄洛替尼购自LC LABORATORIES、5-氟尿嘧啶购自Sigma、PI-103购自TOCRIS、吉西他滨购自Chemiceuticals、奥沙利铂购自Sigma、顺铂购自江苏豪森)的抗增殖作用。将受试细胞以3000个/孔的密度接种在96孔板中，给不同浓度的药物三天后，用Promega公司的CellTiter Glo试剂盒测定各药物浓度下的细胞活力，经XLFit软件计算IC50(半数抑制浓度)。测定细胞活力的步骤按照试剂盒的说明书进行。其结果如图8和表5～6所示。表5的结果说明厄洛替尼、吉西他滨和顺铂对LIXC-127有较好的抑制效果。表6的结果说明厄洛替尼、吉西他滨和顺铂对于LIXC-127细胞的IC50均小于10μM，抑制效果最好。
表5体外测试多个抗癌药物对LIXC-127细胞增殖的抑制作用
表6各种药物对LIXC-127的半数抑制浓度(IC50)
| 药物名称 | 厄洛替尼 | 5-氟尿嘧啶 | PI3K抑制剂PI-103 | 吉西他滨 | 奥沙利铂 | 顺铂 |
| IC50 | 2.622 | 39.19 | >10 | 8.541 | >200 | 5.432 |
i.细胞的成瘤性
体外培养和收集LIXC-127细胞，皮下接种NU/NU裸小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，将细胞悬液和Matrigel基质胶以1:1的体积比混合，每只动物接种2.0×106个细胞，接种5只动物，双侧接种，N＝10，每周调查动物体重和肿瘤大小。接种约1周后，肿瘤开始形成并生长，成瘤率高达90％以上。绘制肿瘤生长曲线，其中公式肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×宽径(mm)2×0.5(见图9和表7)。可见LIXC-127细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤并生长均一快速，具有高致瘤性。
表7接种LIXC-127细胞后的肿瘤体积
| 接种后天数 | 11 | 18 | 25 | 32 | 39 |
| 肿瘤体积(mm3) | 180.23 | 210.57 | 582.12 | 887.19 | 1094.16 |
j.肿瘤的病理学鉴定
将实施例1中同一患者的癌旁正常肝组织(女，汉族，中国人，73岁)、实施例1中的临床肝癌切除标本和上述i步骤中LIXC-127细胞在裸小鼠皮下接种10天后形成的肿瘤，分别固定后石蜡包埋，取出肿瘤固定后石蜡包埋，制备切片并进行H&E染色。结果如图10和表8所示，其病理诊断结果为肝内胆管低中分化腺癌。
表8各标本的病理诊断结果
k.体内药效学实验
体外培养和收集LIXC-127细胞，皮下接种NU/NU裸小鼠(细胞悬液和Matrigel以1:1的体积比混合，每只动物接种2.0×106个细胞)。每周调查动物体重和肿瘤大小。当肿瘤体积达到100-150mm3时进行随机分组，30只动物随机分为3组：组A给予120mg/kg的吉西他滨，给药量0.1mL/10g体重，腹腔给药，每周给药一次；组B给予5mg/kg的顺铂，给药量0.1mL/10g体重，腹腔给药，每周给药一次；组C设为对照，给予生理盐水，给药量0.1mL/10g体重，腹腔注射，每周一次。
根据公式肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×宽径(mm)2×0.5，计算肿瘤体积(图11A和表9)。结果说明，对照组(组C)肿瘤生长最快，而吉西他滨和顺铂分别对组A和组B的肿瘤生长有显著的抑制作用。
表9肿瘤生长情况
用公式TGI％评价药物治疗效果：TGI％＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％。其中，T为给药组肿瘤体积，T0为D0天给药组肿瘤体积；C为对照组肿瘤体积，C0为D0天对照组肿瘤体积(结果见图11B和表10)。结果表明经过二十八天给药后，体内用吉西他滨、顺铂进行治疗，能显著抑制LIXC-127肿瘤的体内生长；据此可见，LIXC-127细胞在体内表现出显著的药物敏感性。
表10肿瘤生长抑制率情况
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种人胆管癌细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201662。
2.如权利要求1所述的人胆管癌细胞的子代细胞。
3.如权利要求1或2所述的人胆管癌细胞的用途，其特征在于，用于制备在非人类的哺乳动物中产生胆管癌肿瘤的试剂。
4.如权利要求3所述的人胆管癌细胞的用途，其特征在于，所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠。
5.如权利要求4所述的人肝癌细胞的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠为免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。
6.如权利要求4所述的人肝癌细胞的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠包括裸小鼠或SCID鼠。
7.一种如权利要求1或2所述的人胆管癌细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤，
1)获得新鲜的临床肝癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；
2)穿刺接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
8.如权利要求7所述的方法，进行所述皮下穿刺接种前，所述的新鲜的临床人肝癌切除标本用HBSS缓冲液漂洗，所述的HBSS缓冲液包括500U/ml的青霉素G、500μg/ml的硫酸链霉素和1.25μg/ml的两性霉素B；
所述的原代培养方法包括以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37℃孵箱下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入RPMI-1640培养液，所述RPMI-1640培养液包含10％胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B，静置培养；待细胞铺展到占培养瓶表面70％满时进行传代培养和纯化；
所述传代培养包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的0.25％胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，加入新鲜的RPMI-1640培养液，所述RPMI-1640培养液包含10％胎牛血清、10μg/mL重组人胰岛素、2μM氢化可的松、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素和0.25μg/mL两性霉素B，所述百分比为质量百分比；所述纯化的方法为差速贴壁。
9.一种筛选治疗胆管癌候选药物的体内实验方法，其特征在于，其包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致胆管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗胆管癌候选化合物，所述的动物模型具有权利要求1或2项所述的人胆管癌细胞所导致的胆管癌肿瘤。
10.一种筛选治疗胆管癌候选药物的体外实验方法，其特征在于，其包括以下步骤：将测试化合物以不同浓度直接施用于权利要求1或2所述的人胆管癌细胞，根据对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断测试化合物对胆管癌的抗肿瘤能力。
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