CN109161531A - 一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法，通过从患者肿瘤组织中建立的类器官模型，体外对肿瘤细胞模型进行高通量筛选，从而指导患者个体化治疗。具体的，本发明利用手术切除的肺癌新鲜组织进行类器官培养，建立个体化肺癌原代细胞模型并加以鉴定，为肺癌精准治疗评价提供基础。

Description

一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法。
背景技术
肺癌是危害我国人民身体健康的重大疾病，发病率和死亡率分别高达53.37/10万和45.57/10万，肺癌治疗正由循证医学向精准医学发展，肺癌治疗的个性化也是大势所趋。医生根据患者的肿瘤的生物学特征数据来制定疗效最佳，毒性最小的“个体化的”治疗方案。让患者最大化临床获益。精准医疗下肺癌肿瘤治疗模式将是基于临床特点、病理数据和生物学分子细胞特征的个体化治疗。目前肺癌的个体化精准治疗是建立在是建立在已基因测序为预测药物治疗效果的基础上，基因测序技术在肿瘤诊断和指导用药领域，正被迅速临床应用。医务人员从肿瘤患者的肿瘤组织中提取基因组DNA，通过检测一组基因的序列是否存在突变，对肿瘤患者进行用药指导。这一技术已在临床中得到广泛的应用，正逐渐发展成为分子病理的重要组成部分。但是由于肿瘤的异质性和患者的个体差异，在肿瘤这种复杂疾病中，单纯的基因测序常常不能准确的预测患者对药物的临床相应。并且基因测序对于化疗、中药等治疗无法预估疗效。需要一个包含多种全身药物治疗的预测评估体系，完善精准治疗。
类器官(organoid)培养是一种体外三维培养技术。可以在体外培养人的组织细胞，形成保留原器官组织结构和生物信息的“微组织”。这种三维体外培养系统与传统二维培养比较，可模拟患者体内的组织或微环境相似，肿瘤细胞形成类似器官的组织结构，很好地保留了细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的作用情况。肿瘤类器官培养技术被国际顶级杂志《Cell》评为2015年十大科技进展。该肿瘤原代细胞培养的突破性技术，使得原代肿瘤细胞可以高效率的形成模型。肿瘤类器官技术也推动了肿瘤精准医疗的发展。
发明内容
本发明通过肺癌类器官培养技术，使肿瘤原代细胞培养的技术得到突破，使得原代肿瘤细胞可以高效率的形成模型。肿瘤类器官是一种非体外转化肿瘤细胞模型，并没有转入致癌基因使细胞永生化，因此保留肿瘤基因组和表达谱的原始信息，可以长期放大培养，基因组稳定，不易突变，表型稳定。解决原代细胞培养建立模型建立速度慢，成功率低，基因组不稳定，使肺癌的基础及临床研究不仅局限于稳定传代的细胞株，具有高成功率和高临床相关性。
本发明提供一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法，通过从患者肿瘤组织中建立的类器官模型，体外对肿瘤细胞模型进行高通量筛选，从而指导患者个体化治疗。具体的，本发明利用手术切除的肺癌新鲜组织进行类器官培养，建立个体化肺癌原代细胞模型并加以鉴定，为肺癌精准治疗评价提供基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
从手术中获取的组织标本例，迅速转运到实验室，进行单细胞化和三维培养。通过培养，建立肺癌标本库。通过ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation SystemPCR，扩增阻滞突变系统PCR)技术，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同。通过短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列和来自类器官模型DNA的短串联重复序列完全一致，通过验证确认类器官模型建立。
进一步的，手术中获取的组织标本例的步骤为:术后，在较短的时间内，选择生长旺盛，无坏死肿瘤组织区域，取体积约为200mm3～400mm3的肿瘤组织块。用镊子或止血钳夹住切下的肿瘤组织，放入组织样品清洗液中，轻轻涤荡4～5下，用镊子或止血钳取出。放进组织标本保存液中，标注样品信息(病案号，姓名)，封紧管盖，置于4℃冰箱。
进一步的，肿瘤组织经过除菌处理和高活性转运后到达实验室，在实验室中，肿瘤细胞用含有复合抗生素的磷酸盐缓冲液清洗，加入适量酶解复合物溶液，用机械里粉碎成细小碎片。在37度，200rpm摇床中酶解1小时。孵育1小时后，细胞通过细胞筛后得到单细胞或寡细胞悬液。细胞悬液200g离心两次后，用PBS重悬，加入蔗糖层上，离心分离肿瘤细胞层。
进一步的，分离的肿瘤细胞加入三维培养基质中，在低温下种植于特制的细胞培养器中，在37度孵育30分钟后，待肿瘤层形成后，加入培养基层，培养层中有经过优化的生长因子和营养成分。可以提供肿瘤类器官快速生长的微环境。
进一步的，放大培养的肺癌类器官通过蛋白酶酶解，重新变成单细胞。离心分离后用培养基重悬，重悬的细胞进行技术，重新离心后，按照2x10E6细胞/管的标准加入类器官冻存液。之后通过程序降温，最终转移到液氮中超低温保存。
进一步的，确认类器官模型建立，通过ARMS-PCR技术，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同。通过短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列和来自类器官模型DNA的短串联重复序列完全一致。
本发明具有以下有益效果：肿瘤类器官是一种非体外转化肿瘤细胞模型，并没有转入致癌基因使细胞永生化，因此保留肿瘤基因组和表达谱的原始信息。可以长期放大培养，基因组稳定，不易突变，表型稳定。肿瘤治疗正由循证医学向精准医学发展，肿瘤治疗的个性化是大势所趋。基因测序技术和以肿瘤类器官技术(Organoids)是推进肿瘤精准医疗的前沿技术。类器官一种体外3D组织培养技术，可以在体外培养人的原代组织细胞，形成保留原器官组织结构和生物信息的“微组织”。利用患者肿瘤组织，建立体外肺癌类器官模型，对评价各种化疗和靶向药物的敏感性的研究具有重要的意义。应用类器官技术进行原代肺癌细胞培养，突破原有技术模型建立速度慢，成功率低，基因组不稳定的缺点。本发明首次国内建立有一定规模的个体化肺癌类器官模型，与肺癌细胞株相比，更好的模拟多样性个体，具有更高的临床相关性
附图说明
图1为肿瘤类器官技术的应用。
图2为非小细胞肺癌类器官模型明场照片。
图3为ARMS-PCR技术鉴定非小细胞肺癌类器官模型和组织中的EGFR L858R突变。
图4为基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的路线图。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1类器官培养
从手术中获取的组织标本100例，迅速转运到实验室，进行单细胞化和三维培养。通过培养，建立肺癌标本库。通过ARMS-PCR技术，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同。通过短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列和来自类器官模型DNA的短串联重复序列完全一致，通过验证确认类器官模型建立。
标本来源：
(1)标本来源患者入选标准：
1)组织样品清洗液(无色)。
2)组织样品保存液(红色)。(4℃保存,)
3)一次性使用真空采血管(5ml,肝素钠)
4)外科剪(或手术刀片)，镊子(或止血钳)。
(2)标本来源排除标准：
1)无法通过手术获得足够肿瘤组织者。
2)同时参与其他研究者。
3)具有其他恶性肿瘤病史。
4)手术禁忌证：麻醉禁忌、手术无法切除的局部广泛病变。
5)研究者认为不适合参加该项研究。
标本采集步骤
(1)试剂耗材准备：
1)组织样品清洗液(无色)。
2)组织样品保存液(红色)。(4℃保存,)
3)一次性使用真空采血管(5ml,肝素钠)
4)外科剪(或手术刀片)，镊子(或止血钳)。
(2)采集步骤：
1)外周血采集：术中采集5ml外周血于肝素钠抗凝管中。标记好样品信息，存放在指定位置的4℃冰箱中。
2)组织样品采集：术后，在较短的时间内，选择生长旺盛，无坏死肿瘤组织区域，取体积约为200mm3～400mm3的肿瘤组织块。
3)组织样品清洗：用镊子或止血钳夹住切下的肿瘤组织，放入组织样品清洗液中，轻轻涤荡4～5下，用镊子或止血钳取出。
4)组织样品保存：放进组织标本保存液中，标注样品信息(病案号，姓名)，封紧管盖，至于指定位置的4℃冰箱，通知样品采集人员。
5)信息采集：肿瘤患者的病理资料等临床信息采集。
类器官培养步骤
(1)酶解单细胞和肿瘤细胞分离
肿瘤组织经过除菌处理和高活性转运后到达实验室，在实验室中，肿瘤细胞用含有复合抗生素的磷酸盐缓冲液清洗2次后，加入适量酶解复合物溶液，用机械里粉碎成细小碎片。在37度，200rpm摇床中酶解1小时。孵育1小时后，细胞通过细胞筛后得到单细胞或寡细胞悬液。细胞悬液200g离心两次后，用PBS重悬，加入蔗糖层上，离心分离肿瘤细胞层。
(2)类器官放大培养步骤
分离的肿瘤细胞加入三维培养基质中，在低温下种植于特制的细胞培养器中，在37度孵育30分钟后，待肿瘤层形成后，加入培养基层，培养层中有经过优化的生长因子和营养成分。可以提供肿瘤类器官快速生长的微环境。
(3)类器官建库步骤
放大培养的肺癌类器官通过蛋白酶酶解，重新变成单细胞。离心分离后用培养基重悬，重悬的细胞进行技术，重新离心后，按照2x10E6细胞/管的标准加入类器官冻存液。之后通过程序降温，最终转移到液氮中超低温保存。
(4)个体化类器官库验证：
确认类器官模型建立，通过ARMS-PCR技术，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同。通过短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列和来自类器官模型DNA的短串联重复序列完全一致。
表1短串联重复序列(short tandem repeats,STR)鉴定
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (6)

1.一种基于类器官技术个体化肺癌原代细胞培养的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
从手术中获取的组织标本，进行单细胞化和三维培养；
通过ARMS-PCR技术，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同；
通过短串联重复序列鉴定，证明来自肿瘤组织DNA中的短串联重复序列和来自类器官模型DNA的短串联重复序列完全一致，通过验证确认类器官模型建立。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组织标本为术后在较短的时间内，选择生长旺盛，无坏死肿瘤组织区域，取体积约为200mm3~400mm3的肿瘤组织块。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单细胞化的步骤为：肿瘤组织经过除菌处理和高活性转运，用含有复合抗生素的磷酸盐缓冲液清洗2次后，加入适量酶解复合物溶液，用机械里粉碎成细小碎片，在37度，200rpm摇床中酶解1小时，孵育1小时后，细胞通过细胞筛后得到单细胞或寡细胞悬液，细胞悬液200g离心两次后，用PBS重悬，加入蔗糖层上，离心分离肿瘤细胞层。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述分离肿瘤细胞加入三维培养基质中，在低温下种植于特制的细胞培养器中，在37度孵育30分钟后，待肿瘤层形成后，加入培养基层。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：培养层中有经过优化的生长因子和营养成分，提供肿瘤类器官快速生长的微环境。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述肿瘤层通过蛋白酶酶解，重新变成单细胞，离心分离后用培养基重悬，重悬的细胞进行技术，重新离心后，按照2x10E6细胞/管的标准加入类器官冻存液，之后通过程序降温，最终转移到液氮中超低温保存。
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