CN108866000A - 一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系及其建立方法和应用 - Google Patents

一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系及其建立方法和应用。本发明从人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的肺癌患者的胸水中收集并确认含有癌细胞的沉淀物，体外培养后接种于小鼠腋下，成瘤后取肿瘤组织进行原代培养，再确认肿瘤细胞的纯度＞90％为耐药肿瘤细胞，得到人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系，保藏号为CCTCC NO：C2018121，该细胞系保留了主要临床生物学特征，能更为真实地反映耐药机制，成瘤率高，生物学性状稳定，活力强，是一种理想的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的基础研究和临床前期试验的细胞系材料。

Description

一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞 系及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及耐药细胞系技术领域，具体地说，涉及一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系及其建立方法和应用。
背景技术
近年来，随着现代工业的发展，人居住环境的恶化，以及不良生活习惯的影响和人口老龄化，肺癌的发病率逐年上升。2016年CA Cancer J Clin杂志发表了2015年中国癌症统计数据，2015年我国新发肺癌病例约73.33万，位居十大肿瘤发病率和致死率之首。尽管肺癌的诊治水平较以往有了很大的提高，但肺癌仍然是死亡率最高的恶性肿瘤之一，肺癌的5年生存率仅16.1％。因此，有关肺癌的发生、发展、侵袭转移以及耐药机制等基础研究和抗肿瘤新药的研制等始终是世界肿瘤学界的热点领域，而建立新的肺癌细胞系对于肺癌的基础研究和新药开发均有十分重要的意义。
目前，生物靶向治疗已成为继手术、化疗、放疗三大传统治疗方式之后的治疗肺癌的重要手段。这类药物可以针对肿瘤靶点进行精准治疗，且不良反应轻微。当前，在临床应用中最为成熟的靶向药是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)。相比传统的化疗，EGFR-TKIs可以取得更长的无进展生存期(PFS)且副作用相对较小，耐受性好，可显著提高患者的生活质量。然而靶向药的耐药问题相当严重，EGFR-TKIs治疗疗效维持时间短，中位疾病进展时间约为10-12个月，几乎所有EGFR-TKIs治疗有效的患者，最终难逃复发进展的厄运。因此，有关EGFR-TKIs耐药的研究意义重大。
对于EGFR-TKIs的获得性耐药机制的研究，一般选择EGFR-TKIs敏感的细胞株作为研究对象，采用靶向药物的浓度梯度筛选出获得性耐药细胞株，即诱导耐药细胞株。例如专利文献CN108118031A，公开日2018.06.05，公开了一种肺癌耐药细胞系及其制备方法，制备方法为：将肺癌细胞接种于含有21-93nM肺癌靶向药的培养基中培养，至细胞在该浓度下正常存活和增殖；以50nM的浓度差提升进行培养；至细胞增殖抑制浓度达到IC50的4倍时，按每100nM的浓度差提升进行培养；药物筛选浓度达到IC50的8倍时，按每1μM的浓度差提升培养，直至肺癌细胞能够在10μM奥希替尼的细胞培养体系中维持存活和增殖时，得到肺癌耐药细胞系。但通过这种方法筛选出的获得性耐药细胞株，仅能反应单一或部分的耐药机制，未能反应真实的耐药状况。如果选择获得性耐药患者的临床标本作为材料，进行原代培养，并将其接种于实验小鼠，那么研究结果就更能反应临床中真实的耐药机制。
专利文献CN105287632A，公开日2016.02.03，公开了一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)首先构建非小细胞肺癌PDX模型，具体为：首先，获得非小细胞肺癌病人的组织样本；其次，将所获得的人来源的非小细胞癌肿瘤样本处理后，植入SCID小鼠；当肿瘤被稳定传代至三代或三代以上时则认为该非小细胞肺癌PDX模型构建成功；(2)对步骤(1)中所构建的非小细胞肺癌PDX模型进行评价，筛选出吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型；具体为：首先，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤生长界限进行记录和判定，所述肿瘤生长界限即移植瘤在小鼠体内生长时坏死或者出现液化现象时的肿瘤体积临界值；其次，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤进行病理学和免疫组化染色评价；最后，对所构建的非小细胞肺癌PDX模型中肿瘤的EGFR基因进行突变检测；根据EGFR突变情况筛选出吉非替尼敏感的非小细胞癌PDX模型，(3)构建非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型，具体为：对步骤(2)中筛选获得的吉非替尼敏感的非小细胞肺癌PDX模型，给予吉非替尼灌胃处理，剂量从10-100mg/kg逐步增加给药，从而诱导获得非小细胞肺癌吉非替尼耐药PDX模型。该方法则获得了更能反应临床中真实的耐药机制的肺癌耐药细胞系。然而，仍有必要构建生物学性状更加稳定，活力更强，成瘤率更高的细胞系。
发明内容
本发明主要就是针对当前肺癌细胞系原代培养中肿瘤组织获取不易的技术问题、当前采用的方法诱导获得的耐药细胞株不能反应真实的耐药机制的问题，以及耐药细胞株生物学性状稳定性欠佳的问题，提供了一种新的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系及其建立方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系，保藏号为CCTCC NO：C2018121。
第二方面，本发明提供了所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系的子代细胞。
第三方面，本发明提供了所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系或其子代细胞的用途，所述的用途选自下列任一种：
a)研究非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的机制；
b)寻找非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药逆转的靶点；
c)筛选治疗非小细胞肺癌的药物；
d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。
作为一个优选例，所述的非小细胞肺癌是肺腺癌。
作为另一优选例，所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼。
第四方面，本发明提供了所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系的建立方法，包括以下步骤：
a)取人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的肺癌患者的胸水，室温沉淀，收集沉淀物，离心去除上清液并洗涤，将确认含有癌细胞的沉淀物继续培养瓶中培养；
b)用培养基重悬细胞，调整细胞密度，取细胞悬液接种至BALB/c-nu小鼠腋下，待小鼠成瘤后，将荷瘤小鼠处死，取肿瘤组织进行原代培养；
c)取肿瘤组织的子代细胞以3000/孔密度接种于细胞培养板孔中，培养24小时，将吉非替尼稀释成0-80μM的梯度浓度，作用于细胞后继续培养72小时，然后利用HE染色，确认肿瘤细胞的纯度＞90％为耐药肿瘤细胞，即得。
作为一个优选例，步骤a)中，所述的继续培养瓶中培养具体为：用含10％FBS的DMEM培养基重悬含有癌细胞的沉淀物，移至底部用胶原IV蛋白预处理的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养4-6小时，轻轻将上清液去除，用吸管轻轻将已黏附在培养瓶底部的细胞吹打下来，PBS洗涤离心，收集细胞，再次PBS洗涤离心。
作为另一优选例，步骤b)中，调整细胞密度至1*107/ml。
作为另一优选例，步骤b)中，所述的取肿瘤组织进行原代培养具体为：在无菌条件下剥离肿瘤组织，剪切成大小3mm3的组织块，加入0.5％胰酶消化，PBS洗涤后移至培养瓶中，37℃、5％CO2培养。
更优选地，用胰酶消化培养传代重复5次。
本发明优点在于：
1、目前，肺癌细胞的原代培养多数都取材于手术以及各种有创操作中获取的肿瘤组织，考虑到中晚期肺癌患者较差的身体状况，很难进行此类有创操作以获取肿瘤组织，且通过此类方法获取的肿瘤组织成瘤率低，本申请人发明人选择通过胸腔闭式引流术引流出的体液标本进行原代细胞的培养，具有安全可靠、获取简便、可重复进行的优点，并且证明该胸水来源的癌细胞成瘤活性很高。
2、本发明成功建立了人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系，从众多细胞系筛选得到人肺腺癌细胞LCAd-001，该细胞系保留了主要临床生物学特征，成瘤率高，生物学性状稳定，活力强。
3、本发明丰富了肺腺癌细胞库，为非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的机制研究提供一种新的实验材料，更能反应真实的耐药机制；利用本发明的细胞系可以成功制备非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药动物模型，用于基础研究及药物筛选；还可将本发明的细胞系与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台。综上，本发明的细胞系是人非小细胞肺癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。
附图说明
图1.胸水癌细胞在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片HE染色结果示意图(400×)。
图2.人肺腺癌细胞LCAd-001的形态学观察(100×)。
图3.人肺腺癌细胞LCAd-001的成瘤性。
图4.人肺腺癌细胞LCAd-001在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片(100×)。
图5.吉非替尼对不同细胞的IC50值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1实验材料
DMEM培养基：购买于HyClone公司；
胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)为GIBCO公司产品；
BALB/c-nu小鼠：购买于上海斯莱克实验动物有限公司；
吉非替尼原料药：购买于大连美仑生物技术有限公司；
基质胶：购买于Corning；
其他试剂来源为：
2实验方法
在上海市肺科医院住院患者中，寻找口服吉非替尼治疗一年后出现获得性耐药的肺癌患者，抽取患者胸水400-500ml(胸水中找到非小细胞肺癌细胞：腺癌)，室温沉淀1小时。收集沉淀物，以1500rpm离心10min，小心去除上清液。加入PBS，1500rpm离心10min洗涤三次。取少量沉淀物涂于玻片上，HE染色，显微镜下观察，寻找确认癌细胞。将确认含有癌细胞的沉淀物，用含10％FBS的DMEM培养基重悬，移至底部用胶原IV蛋白预处理的75cm2培养瓶中。置于37℃、5％CO2培养箱中，培养4-6小时，轻轻将上清液去除，用吸管轻轻将已黏附在培养瓶底部的细胞吹打下来，PBS洗涤离心，此过程重复一次。用PBS将取得的细胞重悬，调整细胞密度至1*107/ml，取100μl悬液接种至BALB/c-nu小鼠腋下，SPF级条件饲养，观察成瘤情况。待小鼠成瘤后，处死荷瘤小鼠，无菌条件下剥离肿瘤组织，用剪刀处理成大小3mm3左右的组织块，加入0.5％胰酶消化30min，PBS洗涤后移至25cm2培养瓶中，37℃、5％CO2培养。肿瘤组织固定石蜡包埋，切片并进行HE染色(图1)。待细胞长满后，用胰酶消化传代，此过程重复5次。取上述肺癌细胞子代细胞以3000/孔密度接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时：将吉非替尼稀释成梯度浓度(0-80μM)，作用于细胞后继续培养72小时。最后利用HE染色，确认肿瘤细胞的纯度(＞90％为耐药肿瘤细胞)。
体外培养和收集人肺腺癌细胞LCAd-001(于2018年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学，430072)，培养物名称为人肺腺癌细胞LCAd-001，保藏编号为CCTCC NO：C2018121)，细胞悬液和基质胶1∶1混合，每只BALB/C NUDE小鼠腋下直接接种200μl，接种6只动物，每周记录动物体重和肿瘤大小。收获肿瘤组织继续转接F2代裸小鼠。
为考察人肺腺癌细胞LCAd-001的耐药性，将人肺腺癌细胞LCAd-001进行体外培养，给予不同浓度的吉非替尼干预。MTT法测定吉非替尼对建成后人肺腺癌细胞LCAd-001和ATCC人肺腺癌细胞系PC-9(EGFR-TKI敏感株)的IC50。将人肺腺癌细胞LCAd-001于-80℃冰柜冻存1个月、6个月后复苏，再次检测吉非替尼对人肺腺癌细胞LCAd-001的IC50。MTT法检测细胞增殖的方法为：胰酶消化各组肺腺癌细胞，以5×103个/孔接种到96孔细胞培养板中，培养24h；弃培养基，加入含不同浓度吉非替尼的培养基继续培养72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃培养4h，倾去上清液，加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀；采用酶标仪检测570nm处的吸光度(A)值，每组设4个复孔；[(空白组吸光度平均值-DMSO空白组平均值)-(各组平均值-DMSO空白组平均值)]/(空白组平均值-DMSO空白组平均值)×100％＝抑制率。相同实验重复三次。
为考察人肺腺癌细胞LCAd-001的成瘤稳定性，将人肺腺癌细胞LCAd-001于-80℃冰柜冻存1个月、6个月后复苏，制成1×108/ml浓度的细胞悬液，与基质胶1∶1混合，每只BALB/C NUDE小鼠腋下直接接种200μl，接种10只动物，50天后统计成瘤率，同时收获肿瘤组织继续转接F2代裸小鼠，按照以上方法，直至F5代裸小鼠，统计各代小鼠的成瘤率。
3实验结果
将体外培养的人肺腺癌细胞LCAd-001的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，结果见图2，可见人肺腺癌细胞LCAd-001细胞呈上皮样形态，部分呈纤维样改变，呈克隆性覆层生长，密度较大时可表现粘附性聚集。
将200μl人肺腺癌细胞LCAd-001和基质胶的混合液直接接种于BALB/CNUDE小鼠腋下，接种后约1个月左右，肿瘤开始形成并生长，收获肿瘤组织继续转接F2代裸小鼠，其结果如图3所示，人肺腺癌细胞LCAd-001能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤并生长均一快速，具有致瘤性，可成功构建裸鼠移植瘤模型。统计F2代裸小鼠成瘤率(成瘤率计算公式：成瘤率＝(成瘤数/接种瘤体数)*100％)，结果为100％。裸小鼠皮下成瘤后，取出肿瘤组织固定石蜡包埋，切片并进行HE染色，图4中A为原组织瘤块细胞，图4中B为人肺腺癌细胞LCAd-001小鼠瘤块细胞，病理结果为肺腺癌，组织类型高度接近原组织瘤块。
经检测，吉非替尼对PC-9细胞IC50为0.02μM，而本申请建成后人肺腺癌细胞LCAd-001同为人肺腺癌株，其IC50为12.5μM，为吉非替尼敏感细胞株PC-9的625倍，表现出明显的吉非替尼体外耐药特性。对冻存1个月、6个月后复苏的人肺腺癌细胞LCAd-001的IC50分别为11.8μM、10.97μM(图5)。
考察人肺腺癌细胞LCAd-001的成瘤稳定性，各代小鼠的成瘤率统计结果见表1。对各代小鼠移植瘤进行HE染色，病理结果均为肺腺癌，组织类型仍高度接近原组织瘤块。
表1 各代小鼠的成瘤率统计结果
综上所述，本发明成功建立了人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系，人肺腺癌细胞LCAd-001是从众多细胞系中筛选而来，本发明同期筛选并测试了其他6株细胞系，这6株细胞系建成后最大IC50分别为2.5μM、0.275μM、0.34μM、4.5μM、0.04μM、6.1μM，冻存1个月、冻存6个月后接种BALB/CNUDE小鼠，各代裸小鼠的成瘤率均未超过65％，可见人肺腺癌细胞LCAd-001具有最为优异的耐药性、致瘤性和生物形状稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系，其特征在于，保藏号为CCTCC NO：C2018121。
2.权利要求1所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系的子代细胞。
3.权利要求1所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系或权利要求2所述的子代细胞的用途，其特征在于，所述的用途选自下列任一种：
a)研究非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的机制；
b)寻找非小细胞肺癌人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂耐药逆转的靶点；
c)筛选治疗非小细胞肺癌的药物；
d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的非小细胞肺癌是肺腺癌。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂是吉非替尼。
6.权利要求1所述的人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药肺癌细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)取人表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的肺癌患者的胸水，室温沉淀，收集沉淀物，离心去除上清液并洗涤，将确认含有癌细胞的沉淀物继续培养瓶中培养；
b)用培养基重悬细胞，调整细胞密度，取细胞悬液接种至BALB/c-nu小鼠腋下，待小鼠成瘤后，将荷瘤小鼠处死，取肿瘤组织进行原代培养；
c)取肿瘤组织的子代细胞以3000/孔密度接种于细胞培养板孔中，培养24小时，将吉非替尼稀释成0-80μM的梯度浓度，作用于细胞后继续培养72小时，然后利用HE染色，确认肿瘤细胞的纯度＞90％为耐药肿瘤细胞，即得。
7.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤a)中，所述的继续培养瓶中培养具体为：用含10％FBS的DMEM培养基重悬含有癌细胞的沉淀物，移至底部用胶原IV蛋白预处理的培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养4-6小时，轻轻将上清液去除，用吸管轻轻将已黏附在培养瓶底部的细胞吹打下来，PBS洗涤离心，收集细胞，再次PBS洗涤离心。
8.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤b)中，调整细胞密度至1*107/ml。
9.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤b)中，所述的取肿瘤组织进行原代培养具体为：在无菌条件下剥离肿瘤组织，剪切成大小3mm3的组织块，加入0.5％胰酶消化，PBS洗涤后移至培养瓶中，37℃、5％CO2培养。
10.根据权利要求9所述的建立方法，其特征在于，用胰酶消化培养传代重复5次。
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