CN107326011A - 一种人肺癌细胞原代培养的方法 - Google Patents

一种人肺癌细胞原代培养的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可以有效地从人新鲜肺癌组织标本分离肿瘤细胞，并传代培养至原代肿瘤细胞系的方法，本发明的方法包括如下以下步骤：对新鲜肺癌组织标本进行无菌处理，无菌处理后进行细胞培养，细胞培养后筛选出肿瘤细胞并进行传代培养，传代培养的过程中会对肿瘤细胞不断筛选，至此，若超过50代而没有衰老迹象，则收集细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验，如呈现恶性增殖现象，则证明建系成功。

Description

一种人肺癌细胞原代培养的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种能有效从人新鲜肺癌标本组织培养原代肺癌细胞的方法。
背景技术
最新研究报告显示，恶性肿瘤已成为仅次于心血管疾病的全世界第二大死因，是全球公共健康问题。而肺癌的发病率及死亡率占所有恶性肿瘤之首。尽管近年随着分子生物学的发展，研究者利用各种肺癌细胞系在肺癌的发病机制及治疗等方面取得了突破性进展，但由于遗传背景的差异，不同患者发病的分子机制及治疗均存在个体化的特点。因此，仅利用公用细胞系对肺癌进行分子机制及治疗研究，存在很大缺陷。
通过肿瘤患者自体的肿瘤组织培养的原代肿瘤胞能表现出肿瘤原来的特性，是肿瘤在体外研究的重要手段。肺癌细胞原代培养是指从肺癌患者体内取出的肿瘤组织或细胞的首次培养，由于原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能、分化及药物治疗等研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以有效地从人新鲜肺癌组织标本分离肿瘤细胞，并传代培养至原代肿瘤细胞系的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种有效地从新鲜肺癌组织培养肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(1)收集肺癌患者手术切除半小时内的新鲜组织标本，并进行无菌、切割处理；
(2)将经过无菌、切割处理后的肺癌组织块进行细胞培养；
(3)对培养后的细胞进行筛选、筛选后再进行传代培养，传代培养的过程中一直进行筛选处理，一直培养至≥50代。
(4)对50代以上的细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验，如呈现恶性增殖现象，则证明建系成功。
进一步的，所述的步骤(1)中无菌处理包含如下步骤：
收取肺癌患者手术切除半小时内的新鲜组织标本，置于含双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、10％FBS的DMEM/F12培养基的50ml离心管中，离心管置于冰上，无菌条件下转移至细胞培养间；
在生物安全柜中将肺癌组织取出，置于6cm培养皿中，用含2X双抗的PBS反复冲洗、浸泡肺癌组织10分钟；
将浸泡后的肺癌组织转移至一新的6cm培养皿中，加入约1ml含10％FBS的DMEM/F12将肺癌组织湿润。
进一步的，所述的步骤(1)中切割处理为：用无菌手术刀片、眼科剪将无菌处理后的肺癌组织切割成直径小于1mm的小碎块，并用剪掉尖部的1ml枪头反复吹打肺癌组织块。
进一步的，所述的步骤(2)中的细胞培养过程如下：
收集经过步骤(1)处理的肺癌组织块及培养基转移至一新的6cm培养皿或T25培养瓶中，每个培养皿或培养瓶中仅加入1ml完全培养1基湿润肿瘤组织，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；
每隔2-3天观察细胞贴壁情况，并适量补充完全培养基，直至有大量细胞贴壁并形成小克隆团后，更换完全培养基2；
培养至含有大量贴壁细胞时，1ml枪头轻轻吹打，将组织块吹打脱离培养皿或培养基底部后丢弃，并加入完全培养基2继续培养；
进一步的，所述的步骤(3)中筛选的方法为在相差显微镜下观察贴壁细胞形态，挑选出肿瘤细胞，其中细胞形态为大小不等、细胞核大且多核、堆叠生长，则为肿瘤细胞；细胞形态为细长梭型、细胞核小则为成纤维细胞；细胞形态为规则圆形，细胞核小且排列整齐生长，则为内皮细胞。
进一步的，所述的步骤(3)中细胞传代培养及筛选细胞的方法如下：将挑选出的肿瘤细胞放入培养皿或培养瓶中，每个培养皿或培养瓶中加入5ml完全培养基2，继续培养至大量细胞克隆团，如成纤维细胞及内皮细胞较少，则不需特殊处理；如含大量成纤维细胞及内皮细胞，则需在显微镜下降肺癌细胞团挑选出后进行消化。
消化时，先用复温至常温的PBS冲洗2遍，后加入稀释2倍的含EDTA的0.25％的胰酶1ml，显微镜先观察待细胞变圆、变亮后加入完全培养基2终止消化，反复吹打至贴壁细胞完全脱离培养皿底壁，收集细胞至15ml离心管中，1200rpm离心5mins，弃上清，用完全培养基2重悬细胞，置于培养皿或培养基中继续培养，待细胞铺满至85％瓶壁时，进行传代培养和筛选细胞。
进一步的，如果经过多次传代后仍含有成纤维细胞和内皮细胞，则运用有限稀释法稀释细胞后种于96孔细胞培养板中，尽量保证每个孔中仅含有1个细胞，加入完全培养基2进行培养5-7天，显微镜下观察，选取单克隆团消化后，种于24孔板中继续培养，待细胞细胞铺满至85％瓶壁时反复传代于12孔板、6孔板、培养皿中扩大培养。
进一步的，在细胞培养的过程中，使用的完全培养基1为：DMEM/F12+15％FBS+20ng/mLEGFR，使用的完全培养基2为含10％FBS的DMEM/F12培养基。
细胞传代培养至超过50代而没有衰老迹象，收集细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验，如呈现恶性增殖现象，则证明建系成功。
附图说明
图1显微镜明场及HE染色观察培养原代肺癌细胞的形态，确定为恶性肿瘤细胞；
图2MTS实验测原代肺癌细胞系增殖曲线；
图3克隆形成实验检测原代肺癌细胞系的克隆形成能力；
图4裸鼠皮下移植瘤实验测原代肺癌细胞系在体内成瘤情况；
具体实施方式1
患者晏XX，男，47岁，于2014年12月10行“右肺上叶肿块切除术”，术后病理诊断为：肺腺癌。术后半小时将新鲜组织标本置于含双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、10％FBS的DMEM/F12培养基的50ml离心管中，离心管置于冰上，无菌条件下转移至细胞培养间；在生物安全柜中将肺癌组织取出，置于6cm培养皿中，用含2X双抗的PBS冲洗肺癌组织10分钟；将浸泡后的肺癌组织转移至一新的6cm培养皿中，加入约1ml含10％FBS的DMEM/F12将肺癌组织湿润；用无菌手术刀片将肺癌组织切割成直径小于1mm的小碎块，并用剪掉尖部的1ml枪头反复吹打肺癌组织块；收集肺癌组织块及培养基转移至一新的6cm培养皿中，每个培养皿或培养瓶中加入1ml完全培养基1湿润肿瘤组织(完全培养基为：DMEM/F12+15％FBS+20ng/mLEGFR)，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；第2天观察细胞贴壁情况，并适量补充完全培养基；第5天见有大量细胞贴壁并形成小克隆团，更换完全培养基2(完全培养基2为含10％FBS的DMEM/F12培养基)；第10天,含有大量贴壁细胞，1ml枪头轻轻吹打，将组织块吹打脱离培养皿或培养基底部后丢弃，并加入完全培养基2继续培养；
第12天，相差显微镜下观察贴壁细胞形态，见大部分细胞为大小不等、细胞核大且多核、堆叠生长的肿瘤细胞，少量成纤维细胞及内皮细胞；每个培养皿或培养瓶中加入5ml完全培养基2，继续培养至大量细胞克隆团，少量成纤维细胞及内皮细胞；第15天，细胞融合至90％左右时，先用复温至常温的PBS冲洗2遍，后加入稀释2倍的含EDTA的0.25％的胰酶1ml，显微镜先观察待细胞变圆、变亮后加入完全培养基2终止消化，反复吹打至贴壁细胞完全脱离培养皿底壁，收集细胞至15ml离心管中，1200rpm离心5mins，弃上清，用完全培养基2重悬细胞，置于培养皿或培养基中继续培养；第18天，细胞铺满至85％瓶壁时，胰酶消化细胞，运用有限稀释法稀释细胞后种于96孔细胞培养板中，尽量保证每个孔中仅含有1个细胞，加入完全培养基2进行培养5-7天，显微镜下观察，选取单克隆团消化后，种于24孔板中继续培养，待细胞铺满至85％瓶壁时反复传代于12孔板、6孔板、培养皿中扩大培养；以后每2-3天消化传代1次，细胞传代培养至超过50代而没有衰老迹象，收集细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验。HE染色(图1)见细胞大小异型性明显，核浆比例倒置，核仁清晰、多个，病理诊断为肺癌细胞；MTS实验(图2)细胞呈对数生长；克隆形成实验(图3)示200个以上细胞培养2周即可在六孔板中形成较多克隆，说明细胞具有较强的克隆形成能力；裸鼠成瘤实验(图4)表明细胞可在裸鼠体内恶性增殖、生长成瘤。
具体实施方式2
患者凡XX，女，53岁，于2015年06月18行“右肺上叶肿块切除术”，术后病理诊断为：肺腺癌(低分化)。术后半小时将新鲜组织标本，置于含双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、10％FBS的DMEM/F12培养基的50ml离心管中，离心管置于冰上，无菌条件下转移至细胞培养间；在生物安全柜中将肺癌组织取出，置于6cm培养皿中，用含2X双抗的PBS反复冲洗、浸泡肺癌组织10分钟；将浸泡后的肺癌组织转移至一新的6cm培养皿中，加入约1ml含10％FBS的DMEM/F12将肺癌组织湿润；用无菌手术刀片、眼科剪将肺癌组织切割成直径小于1mm的小碎块，并用剪掉尖部的1ml枪头反复吹打肺癌组织块；收集肺癌组织块及培养基转移至一新的6cm培养皿中，每个培养皿或培养瓶中仅加入1ml完全培养1基湿润肿瘤组织(完全培养基为：DMEM/F12+15％FBS+20ng/mLEGFR)，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；第3天观察细胞贴壁情况，有少量细胞贴壁并形成小克隆团后，并适量补充完全培养基1；第5天，贴壁细胞增多，克隆团增大；第7天，见大量克隆团形成，更换完全培养基2(完全培养基2为含10％FBS的DMEM/F12培养基)；第9天，1ml枪头轻轻吹打，将组织块吹打脱离培养皿或培养基底部后丢弃，并加入完全培养基2继续培养；
第11天，相差显微镜下观察贴壁细胞形态，见部分克隆团为大小不等、细胞核大且多核、堆叠生长的肿瘤细胞，部分细胞为细长梭型的成纤维细胞；显微镜下挑选肿瘤细胞团，先用复温至常温的PBS冲洗2遍，后加入稀释2倍的含EDTA的0.25％的胰酶1ml，显微镜先观察待细胞变圆、变亮后加入完全培养基2终止消化，反复吹打至贴壁细胞完全脱离培养皿底壁，收集细胞至15ml离心管中，1200rpm离心5mins，弃上清，用完全培养基2重悬细胞，运用有限稀释法稀释细胞后种于96孔细胞培养板中，尽量保证每个孔中仅含有1个细胞，加入完全培养基2进行培养天，显微镜下观察，选取单克隆团消化后，种于24孔板中继续培养，待细胞铺满至85％瓶壁时反复传代于12孔板、6孔板、培养皿中扩大培养；每2-3天观察并胰酶消化传代细胞，细胞传代培养至超过50代而没有衰老迹象，收集细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验。HE染色见细胞大小异型性明显，核浆比例倒置，核仁清晰、多个，病理诊断为肺癌细胞；MTS实验细胞呈对数生长；克隆形成实验示细胞具有较强的克隆形成能力；裸鼠成瘤实验表明细胞可在裸鼠体内恶性增殖、生长成瘤。
以上所述实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种人肺癌细胞原代培养的方法，包括以下步骤：
(1)收集肺癌患者手术切除半小时内的新鲜组织标本，并进行无菌、切割处理；
(2)将经过无菌、切割处理后的肺癌组织块进行细胞培养；
(3)对培养后的细胞进行筛选、筛选后再进行传代培养，传代培养的过程中一直进行筛选处理，一直培养至≥50代。
(4)对50代以上的细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验，如呈现恶性增殖现象，则证明建系成功。
2.如权利要求1所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中无菌处理包含如下步骤：
收取肺癌患者手术切除半小时内的新鲜组织标本，置于含双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、10％FBS的DMEM/F12培养基的50ml离心管中，离心管置于冰上，无菌条件下转移至细胞培养间；
在生物安全柜中将肺癌组织取出，置于6cm培养皿中，用含2X双抗的PBS反复冲洗、浸泡肺癌组织10分钟；
将浸泡后的肺癌组织转移至一新的6cm培养皿中，加入约1ml含10％FBS的DMEM/F12将肺癌组织湿润。
3.如权利要求1所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中切割处理为：用无菌手术刀片、眼科剪将无菌处理后的肺癌组织切割成直径小于1mm的小碎块，并用剪掉尖部的1ml枪头反复吹打肺癌组织块。
4.如权利要求1所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的细胞培养过程如下：
收集经过步骤(1)处理的肺癌组织块及培养基转移至一新的6cm培养皿或T25培养瓶中，每个培养皿或培养瓶中仅加入1ml完全培养1基湿润肿瘤组织，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；
每隔2-3天观察细胞贴壁情况，并适量补充完全培养基，直至有大量细胞贴壁并形成小克隆团后，更换完全培养基2；
培养至含有大量贴壁细胞时，1ml枪头轻轻吹打，将组织块吹打脱离培养皿或培养基底部后丢弃，并加入完全培养基2继续培养。
5.如权利要求1所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中筛选的方法为在相差显微镜下观察贴壁细胞形态，挑选出肿瘤细胞，其中细胞形态为大小不等、细胞核大且多核、堆叠生长，则为肿瘤细胞；细胞形态为细长梭型、细胞核小则为成纤维细胞；细胞形态为规则圆形，细胞核小且排列整齐生长，则为内皮细胞。
6.如权利要求1所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中细胞传代培养及筛选细胞的方法如下：将挑选出的肿瘤细胞放入培养皿或培养瓶中，每个培养皿或培养瓶中加入5ml完全培养基2，继续培养至大量细胞克隆团，如成纤维细胞及内皮细胞较少，则不需特殊处理；如含大量成纤维细胞及内皮细胞，则需在显微镜下降肺癌细胞团挑选出后进行消化。
7.如权利要求6所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：消化时，先用复温至常温的PBS冲洗2遍，后加入稀释2倍的含EDTA的0.25％的胰酶1ml，显微镜先观察待细胞变圆、变亮后加入完全培养基2终止消化，反复吹打至贴壁细胞完全脱离培养皿底壁，收集细胞至15ml离心管中，1200rpm离心5mins，弃上清，用完全培养基2重悬细胞，置于培养皿或培养基中继续培养，待细胞铺满至85％瓶壁时，进行传代培养和筛选细胞。
8.如权利要求7所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：经过多次传代后仍含有成纤维细胞和内皮细胞，则运用有限稀释法稀释细胞后种于96孔细胞培养板中，尽量保证每个孔中仅含有1个细胞，加入完全培养基2进行培养5-7天，显微镜下观察，选取单克隆团消化后，种于24孔板中继续培养，待细胞细胞铺满至85％瓶壁时反复传代于12孔板、6孔板、培养皿中扩大培养。
9.如权利要求7所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：细胞传代培养至超过50代而没有衰老迹象，收集细胞进行HE染色、MTS增殖实验、克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验，如呈现恶性增殖现象，则证明建系成功。
10.如权利要求1～9中任一所述的人肺癌细胞原代培养的方法，其特征在于：细胞培养的过程中，使用的完全培养基1为：DMEM/F12+15％FBS+20ng/mLEGFR，使用的完全培养基2为含10％FBS的DMEM/F12培养基。
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