CN114196613A - 支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张药物中的应用 - Google Patents
支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114196613A CN114196613A CN202111437664.0A CN202111437664A CN114196613A CN 114196613 A CN114196613 A CN 114196613A CN 202111437664 A CN202111437664 A CN 202111437664A CN 114196613 A CN114196613 A CN 114196613A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cell
- subculture
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 444
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 40
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000007747 plating Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 64
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 55
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 46
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 46
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 37
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical group CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 36
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 34
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 34
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 34
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 33
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 32
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 28
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 20
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 17
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 15
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 15
- 101001056473 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 5 Proteins 0.000 claims description 14
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 claims description 11
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 8
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 8
- 102100028798 Homeodomain-only protein Human genes 0.000 claims description 7
- 101000839095 Homo sapiens Homeodomain-only protein Proteins 0.000 claims description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 6
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 6
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 6
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 6
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 claims description 4
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000000251 trophoblastic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 abstract description 9
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 abstract description 9
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 abstract description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 57
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 6
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 4
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 4
- 101150037996 KRT5 gene Proteins 0.000 description 4
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 4
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000009325 pulmonary function Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009798 acute exacerbation Effects 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000013116 chronic cough Diseases 0.000 description 2
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004202 respiratory function Effects 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 2
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 2
- NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N (2s)-2,5-bis(azanyl)-5-oxidanylidene-pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O NWNOWCGAHDFNFJ-RUCXOUQFSA-N 0.000 description 1
- PZSMUPGANZGPBF-UHFFFAOYSA-N 4-[5-(dithiolan-3-yl)pentanoylamino]butanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCNC(=O)CCCCC1CCSS1 PZSMUPGANZGPBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 241000197194 Bulla Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009126 Chronic respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010970 Cor pulmonale chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 101150029115 HOPX gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000616 Hemoptysis Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 229940110339 Long-acting muscarinic antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011130 autologous cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 208000026636 chronic pulmonary heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013170 computed tomography imaging Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000003172 expectorant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003419 expectorant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 108700016226 indium-bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 229940125389 long-acting beta agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- XZXHXSATPCNXJR-ZIADKAODSA-N nintedanib Chemical compound O=C1NC2=CC(C(=O)OC)=CC=C2\C1=C(C=1C=CC=CC=1)\NC(C=C1)=CC=C1N(C)C(=O)CN1CCN(C)CC1 XZXHXSATPCNXJR-ZIADKAODSA-N 0.000 description 1
- 229960004378 nintedanib Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002640 oxygen therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229960003073 pirfenidone Drugs 0.000 description 1
- ISWRGOKTTBVCFA-UHFFFAOYSA-N pirfenidone Chemical compound C1=C(C)C=CC(=O)N1C1=CC=CC=C1 ISWRGOKTTBVCFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/42—Respiratory system, e.g. lungs, bronchi or lung cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/08—Bronchodilators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种临床级自体支气管基底层细胞制备方法以及细胞回输制剂在治疗支气管扩张中的应用。制备方法包括:取离体活性支气管刷检组织进行消化处理,终止消化后收集细胞;利用铺被滋养层细胞的培养板对消化后细胞进行铺板培养,收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养,待细胞长满至培养板表面积的50%‑90%时,进行传代培养。本发明首次确定适用于肺脏损伤修复的临床级细胞,制备工艺实现了该细胞的工业化制备,可在短期内获得满足临床细胞治疗数量和质量的支气管基底层细胞,该方法制得的支气管基底层细胞进入病灶后可稳定分化,实现对支气管扩张病灶的修复,有效改善肺通气功能和换气功能、修复受损肺结构、促进肺结构新生。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学技术领域,具体涉及一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺及其在治疗支气管扩张中的应用。
背景技术
肺脏是一个由上皮细胞和其它类型细胞共同构成的复杂器官,发挥着呼吸的重要功能。在执行呼吸任务的过程中,特别是当接触到一些外来的或内在的有害物质时,例如大气污染物、细菌病毒或血液中的毒性物质,肺内的细胞会大量死亡并诱发炎症反应,从而导致大规模的肺部组织损伤。这种大规模的损伤往往会引发各种肺部疾病,如支气管扩张(BE)、慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化等。
支气管扩张(BE)是由于支气管及其周围肺组织慢性化脓性炎症和纤维化,使支气管壁的肌肉和弹性组织破坏,导致支气管变形及持久扩张,患者的肺组织病理损伤不可逆。支气管扩张病程多呈慢性经过,可发生于任何年龄。典型症状为慢性咳嗽,咳大量脓痰和反复咯血。目前研究认为感染,先天性和遗传性疾病,纤毛异常,免疫缺陷,异物吸入等因素是引起支气管扩张的病因。在我国,支气管扩张的治疗目前仍集中在对症治疗及抗生素应用等,治疗手段单一,无法真正重建受损的肺组织结构,因此也无法恢复肺部的正常功能。
慢性阻塞性肺病(简称“慢阻肺”,COPD)是一类慢性气道阻塞性疾病的统称。这是一类发病率和死亡率都较高的疾病。慢阻肺发病学的中心环节是吸烟和其他有害气体或吸入颗粒刺激导致的慢性气道炎症,支气管由于慢性炎症造成粘膜肿胀、上皮细胞坏死、腺体增生、粘液增多、支气管扭曲塌陷,发生肺气肿时肺泡结构破坏、肺弹性降低。慢阻肺的临床表现为:慢性咳嗽、咳痰,严重时出现呼吸困难,活动能力降低,最终发展为慢性肺源性心脏病和慢性呼吸衰竭,导致丧失劳动能力和生活自理能力,甚至死亡。其临床特点为不完全可逆的气流受限,且病情呈进行性加重。目前临床上普遍采取的治疗方法是长期吸入长效M受体阻滞剂(LAMA)和/或长效β2受体激动剂+吸入型的糖皮质激素(LABA+ICS),同时辅以抗炎、祛痰和氧疗。但以上传统治疗方法仅为对症处理,未能从根本上解决肺部结构损毁的问题。肺减容术作为治疗终末期肺气肿的治疗方法,其开展的时间尚短,适应证及疗效均不明确,发生并发症几率较高。
肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变,也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常。绝大部分肺纤维化病人病因不明。肺纤维化严重影响人体呼吸功能,表现为干咳、进行性呼吸困难,且随着病情和肺部损伤的加重,患者呼吸功能不断恶化,存活时间仅3~5年。糖皮质激素和免疫抑制剂/细胞毒药物曾作为治疗肺纤维化的药物,但对于中晚期肺纤维化患者疗效不理想。吡非尼酮和尼达尼布对患者的肺功能下降有一定的延缓作用,但也难以逆转病程,无法真正阻止纤维化的发生。总的来看,目前针对肺纤维化全世界范围内都缺乏有效的治疗手段。
目前来说,这些与肺损伤相关的肺部疾病在临床中的治疗采用的治疗手段仅能延缓疾病的进展,无法真正阻断甚至逆转疾病的进程。分析其原因,现有的治疗手段均无法修复损伤的肺部结构,因此也无法阻断或逆转这些疾病的进程。
移植治疗,包括临床上应用成熟的器官移植、组织移植和新兴的细胞移植,是治疗难治性疾病和终末期器官衰竭性疾病的唯一选择。但器官和组织移植存在着不可替代的缺点:
1、器官或组织来源严重不足;
2、免疫排斥明显,器官或组织移植主要是同种异体移植,常常导致各种程度的免疫排斥反应,若使用免疫抑制剂治疗又增加各种机会性感染风险;
3、手术时间长,技术要求高,过程复杂等。
在肺病领域,全国每年能开展的肺移植手术不超过1000例,远远无法满足患者的巨大需求。因此细胞移植治疗技术,特别是在造血细胞移植、皮肤细胞移植和角膜细胞移植先后成功用于临床治疗之后,越来越受到医疗界的重视。近几年来该技术已经被运用到其他组织器官疾病的治疗中,例如皮肤细胞移植治疗烧伤,肝实质细胞移植治疗肝衰竭和其它肝代谢类疾病,角膜缘细胞移植治疗角膜损伤等。细胞移植治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性,采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后,使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效,从而达到治疗疾病的目的。
为了更好地解决细胞移植过程中的排异问题,自体细胞移植治疗能够更好地解决以上问题,并具有以下优点:
1、细胞来源于自身,不存在免疫排斥问题;
2、移植细胞来源于成体组织器官,本身即是身体的一部分,故不存在成瘤的风险;
3、细胞具有可塑性,其分裂和迁移能力活跃,在适当的环境中可以补充凋亡或坏死的同类组织或同类型细胞;
4、操作简单,移植细胞不具备器官的正常外形及解剖结构,不再是一完整的器官,而是一细胞群,移植时常制成细胞悬液,无须吻合血管,因此,移植是通过各种输注途径来实现的;
5、多种治疗机制,可通过迁移到组织受损部位并分化为正常组织细胞发挥修复作用,同时也通过旁分泌机制,分泌各种抗炎因子,抑制促炎因子分泌发挥作用。
总之,细胞移植以其疗效良好、副作用小、更个体化、更精准等优势,目前正被运用到包括血液系统疾病、肿瘤、糖尿病、心血管病、神经系统疾病等多种疾病治疗研究中。
现有技术中,经研究发现,在人体肺脏支气管基底层位置存在一群功能性的支气管基底层细胞,该群细胞表达Krt5标志基因和p63基因,具有干细胞的特性,能够不断自我更新和具有分化形成肺泡和支气管上皮组织细胞的潜能。2015年在世界级顶级学术期刊《Nature》上报道的《研究利用遗传谱系追踪的方法》,用Krt5基因驱动表达的LacZ 在小鼠体内跟踪支气管基底层细胞在流感病毒感染后的增殖、迁移和分化等过程。从而证明了Krt5阳性的支气管基底层细胞的确是具有肺脏修复功能。进一步的动物试验还证实,在小鼠体内用遗传学方法特异性剔除掉表达Krt5的支气管基底层细胞,小鼠的肺脏功能不仅无法修复,反而会发生组织纤维化。由此推断,维持体内足够的支气管基底层细胞数量对修复肺脏和抑制肺损伤的发生是必需的。进一步地,对于由于支气管基底层细胞缺乏而肺脏损伤无法自然修复的肺损伤小鼠,通过支气管基底层细胞移植,可以帮助其形态结构与功能的恢复。同时,在博来霉素处理的肺损伤小鼠中,移植支气管基底层细胞的损伤小鼠的存活期明显增加。
此外,在H1N1流感病毒损伤的小鼠肺损伤模型中,将支气管基底层细胞经过蓝色LacZ遗传标记之后,经气管移植到小鼠肺脏中。可观察到供体细胞在受体肺脏中大面积整合,并分化形成成熟的肺泡和支气管结构。值得注意的是,对于未发生损伤的健康小鼠肺脏,支气管基底层细胞移植完全无法成功,这在某种程度上也保障了移植的相对安全性。
目前,现有技术中未出现临床级的支气管基底层细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种临床级自体支气管基底层细胞回输制剂在制备治疗支气管扩张药物中的应用,具体技术方案为:
一种临床级自体支气管基底层细胞的制备方法在制备治疗支气管扩张的药物中的应用,所述临床级自体支气管基底层细胞的制备方法包括如下步骤:
组织准备:取离体活性支气管刷检组织备用;
酶解:对上述组织进行消化处理,终止消化后收集细胞;
铺板、扩增培养:取部分经消化处理后的细胞,利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养,收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养,待细胞长满至培养板表面积的50%-90%时,进行传代培养;
收集细胞:待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,消化并收集贴壁细胞,洗涤即可。
所述治疗支气管扩张包括改善肺通气功能、换气功能、修复受损肺结构和/或促进肺结构新生。
所述组织消化液包含99v%的DMEM/F12,1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;所述消化处理的温度为37℃,时间为0.5-2h。
所述终止液包含90v%DMEM和10v%FBS。
进一步地,支气管刷检组织来自于至少一个部位。
对经酶解后的细胞、经铺板培养后的细胞进行冻存;
优选在冻存细胞前,进行菌检和支原体检测。
进一步地,快速解冻细胞,进行铺板培养和/或扩增培养。
铺板培养包括以下步骤:
取待进行铺板培养的细胞,用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中,培养板中加入抗生素;优选,取待进行铺板培养的细胞,1/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板一孔中,3/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板另一孔中(由于每次刷检的细胞总量波动范围比较大,铺被两个不同密度的孔以保证获得合适密度的培养细胞);
在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5 个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时,收集细胞。
利用铺被滋养层细胞的培养板于37℃进行扩增培养;同时对细胞形态进行观察和检测,随机观察5个视野,A级和B级克隆超过50%;
所述铺被有滋养层细胞的培养板中,滋养层细胞铺满培养板面积的50%-70%。
所述A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;
所述B级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松。
所述传代培养为n次(n大于1且不大于7),其中,利用铺被滋养层细胞的培养皿进行n-1次传代培养,至n-1次传代培养后细胞长满至培养皿表面积的50%-90%;
利用铺被基质胶的培养皿进行第n次传代后的铺板培养。
在n次传代培养中,每一次传代培养至细胞长满至培养皿表面积的50%-90%。
所述传代培养的具体操作为:
第一次传代培养,利用铺被滋养层细胞的培养皿对待培养细胞进行培养,待长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养,隔天换液;
第二次至第n-1次传代培养,待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养,隔天换液;
第n次传代培养,待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入胰酶和1×DPBS,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于包被基质胶的培养皿上进行培养,隔天换液。
在进行第n-2次传代培养后,取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%;
在第n-1次传代培养后,取0.8mL细胞培养上清进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb。
培养基的配方为:225mL DMEM、225mL F12、20-70mL FBS、0.2-2mM L-谷氨酰胺、1-14ng/mL胰岛素、0.1-1ng/mL表皮生长因子、5-30ug/mL腺嘌呤、2-20ug/mL氢化可的松。
本发明还提供上述制备方法制备的临床级自体支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张的药物中的应用。
本发明进一步提供一种临床级自体支气管基底层细胞回输制剂,包括上述的临床级自体支气管基底层细胞和临床级的注射液。
进一步地,临床级的注射液为注射用生理盐水。
本发明进一步提供临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备工艺,用1×DPBS 洗涤经扩增培养后的细胞2-4次,最后一次加入1×DPBS重悬细胞后离心,弃剩余上清,将细胞沉淀弹起,加入临床级的注射液,至细胞浓度为1-22×106/mL,混匀,同时取1mL细胞制剂留样。
进一步地,最后一次加入1×DPBS重悬细胞后,取10ul细胞悬液进行台盼蓝染色,活细胞比例≥90%。
本发明临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂的制备工艺所使用的试剂耗材均需符合无菌、无支原体和低内毒素含量的标准。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明首次确定了可以适用于肺脏损伤修复的临床级细胞,并且通过选择合适的制备工艺实现了该细胞的工业化制备,可以在短期(4-8周)内获得满足临床细胞治疗数量和质量的支气管基底层细胞(2╳108),且无菌和支原体污染,具有低链霉素残余和内毒素含量,具有分化形成肺组织细胞的分化潜能,90%以上的细胞表达支气管基底层细胞的标记物KRT5,使其在自体细胞治疗的临床应用中具有安全性和有效性,经临床验证显示,该方法制备得到的支气管基底层细胞进入病灶后可以稳定分化,实现对肺脏的明显修复,提升患者肺功能。
此外,支气管基底层细胞制备成液体制剂,便于临床细胞移植;该液体制剂含有高纯度和高活率支气管基底层细胞,这对临床应用中自体细胞移植的成功起着关键作用。
2、本发明自体支气管基底层细胞及回输制剂在制备流程上更加完整、简便和可控。细胞冻存操作,一方面可以使细胞有备份,另一方面也使细胞及细胞制剂的制备工艺变得更加灵活可控。中间过程的控制点可实现对细胞质量的全程监控。
本发明自体支气管基底层细胞的制备通过细胞培养基、与滋养层细胞共培养保证细胞的增殖活性,进而实现细胞短期内大量增殖。
3、本发明所制备临床级的自体支气管基底层细胞回输制剂,可以在临床治疗中从根本上再生肺部结构,修复损伤的肺组织,恢复肺脏功能,从而达到治疗慢性阻塞性肺病、支气管扩张、间质性肺病等肺损伤性疾病的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例4中临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备流程图;
图2是本发明实施例4细胞克隆形态图;
图3是本发明实施例4中细胞克隆分级的典型形态图,其中,图A为A级细胞克隆形态图,图B为B级细胞克隆形态图;
图4是本发明实验例2自体支气管基底层细胞回输制剂移植前后支气管扩张患者HR-CT检查结果图;
图5是本发明实验例4自体支气管基底层细胞回输制剂移植前后间质性肺病患者的 CT检查结果图(肺大疱结构);
图6是本发明实验例4自体支气管基底层细胞回输制剂移植前后间质性肺病患者的 CT检查结果图(肺毁损结构)。
具体实施方式
本发明中FBS表示胎牛血清;
DMEM表示高糖型DMEM培养基;
F12表示F12营养混合物;
DPBS表示磷酸盐缓冲液;
HOPX表示肺组织细胞的标记物;
KRT5表示支气管基底层细胞的标记物。
实施例1
本实施例提供了一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺,具体包括如下步骤:
取离体活性支气管刷检组织备用,在本实施例中选择取位于支气管两个不同部位的组织。之所以选择两个或者多个部位,是为了保证分离的成功率。
取组织消化液和终止液备用;其中组织消化液中,99v%为DMEM/F12,其余为1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;终止液中90v%为DMEM, 10v%为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理,利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。
取培养基备用,其中培养基中225mL DMEM,225mL F12,20-70mL FBS,0.2-2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine),1-14ng/mL胰岛素,0.1-1ng/mL表皮生长因子,5-30ug/mL 腺嘌呤,2-20ug/mL氢化可的松。
铺被滋养层细胞的培养板备用,其中滋养层细胞的铺板的过程为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟后,铺上已经辐照灭活的滋养层细胞,放在细胞培养箱中培养(37℃,5%CO2),1-2天后可使用,细胞的密度以1-2天后细胞铺展到培养板底表面的50-70%为宜。
取部分经消化处理后的细胞,用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板一孔中;每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素),在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时,收集细胞。
一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现,根据克隆的形态,可以分为A、B和C三级。其中,A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;B 级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松;C级克隆轮廓不规则,克隆边界不清晰,克隆内细胞排列疏松,体态肥大。
若克隆数量较少,在10倍镜下观察5个视野,其中3个视野中均无A级或B级克隆时,需将孔中细胞消化下来,再按照1:1的比例铺板到提前一天准备的滋养层细胞上继续进行培养。
利用铺被滋养层细胞的6cm培养皿对收集细胞进行培养,待长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,进行第一次传代培养。去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入1mL0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液, 1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞,最后将约5-10×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿上进行培养,隔天换液。
待第一次传代细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第二次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞。取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%。同时按每个培养皿5-20×105的数量将重悬细胞铺于铺被滋养层细胞的4个10cm 培养皿上进行培养,隔天换液。取第二次传代培养后的细胞培养上清0.8mL进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb。
待第二次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第三次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.05%(质量体积比0.05g/100mL)胰酶,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心5min 去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于包被基质胶的12个10cm培养皿上进行培养,隔天换液。
其中,基质胶包被培养皿的操作为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟。
待第三次传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,每个培养皿加入 1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶,在37℃中放置 5-15min,待大部分细胞变圆变亮后,用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,再用2mL终止液终止消化,收集细胞悬液,再用2mL终止液冲洗10cm培养皿表面,收集所有的细胞悬液。由于本步骤中细胞的数量较多,每次操作不多于5个培养皿,细胞悬液收集后在2-8℃暂时存放。待该批次所有的细胞悬液都收集起来后, 1200rpm离心5min,去上清,用1×DPBS洗涤2-4次即可,每次洗涤步骤为用40ml 1 ×DPBS重悬细胞沉淀,1200rpm离心5min,去上清。
实施例2
本实施例提供了一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺,具体包括如下步骤:
取离体活性支气管刷检组织备用,在本实施例中选择取位于支气管两个不同部位的组织。之所以选择两个或者多个部位,是为了保证分离的成功率。
取组织消化液和终止液备用;其中组织消化液中,99v%为DMEM/F12,其余为1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;终止液中90v%为DMEM, 10v%为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理,利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。经酶解后的细胞进行菌检和支原体检测后部分冻存。
取出冻存的酶解后的细胞,复苏细胞,具体操作为在37℃水浴中快速溶解后,收集所有液体在15ml管中,并逐滴加入2ml已经在37℃温育过的终止液,1200rpm离心3min,去上清后用培养基重悬细胞成细胞悬液。
取培养基备用,其中培养基中225mL DMEM,225mL F12,20-70mL FBS,0.2-2mM L-glutamine,1-14ng/mL胰岛素,0.1-1ng/mL表皮生长因子,5-30ug/mL腺嘌呤, 2-20ug/mL氢化可的松。
铺被滋养层细胞的培养板备用,其中滋养层细胞的铺板的过程为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟后,铺上已经辐照灭活的滋养层细胞,放在细胞培养箱中培养(37℃,5%CO2),1-2天后可使用,细胞的密度以1-2天后细胞铺展到培养板底表面的50-70%为宜。
取复苏酶解后细胞所得的细胞悬液,1/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板一孔中,3/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板另一孔中;每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素),在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B 级克隆时,收集细胞。
一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现,根据克隆的形态,可以分为A、B和C三级。其中,A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;B 级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松;C级克隆轮廓不规则,克隆边界不清晰,克隆内细胞排列疏松,体态肥大。
若克隆数量较少,在10倍镜下观察5个视野,其中3个视野中均无A级或B级克隆时,需将孔中细胞消化下来,再按照1:1的比例铺板到提前一天准备的滋养层细胞上继续进行培养。
细胞冻存前收集1.1ml细胞培养上清进行菌检和支原体检测。
待长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,进行第一次传代培养。去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞,最后将约 5-10×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿上进行培养,隔天换液。
待第一次传代细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第二次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞。取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%。同时按每个培养皿5-20×105的数量将重悬细胞铺于铺被滋养层细胞的4个10cm 培养皿上进行培养,隔天换液。取第二次传代培养后的细胞培养上清0.8mL进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb。
待第二次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第三次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.05%(质量体积比0.05g/100mL)胰酶和1.6mL 1×DPBS,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS 洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液, 1200rpm离心5min去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于包被基质胶的12个 10cm培养皿上进行培养,隔天换液。
其中,基质胶包被培养皿的操作为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟。
待第三次传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,每个培养皿加入 1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶,在37℃中放置 5-15min,待大部分细胞变圆变亮后,用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,再用2mL终止液终止消化,收集细胞悬液,再用2mL终止液冲洗10cm培养皿表面,收集所有的细胞悬液。由于本步骤中细胞的数量较多,每次操作不多于5个培养皿,细胞悬液收集后在2-8℃暂时存放。待该批次所有的细胞悬液都收集起来后,1200rpm离心5min,去上清,用1×DPBS洗涤2-4次即可,每次洗涤步骤为用40ml 1 ×DPBS重悬细胞沉淀,1200rpm离心5min,去上清。
实施例3
本实施例提供了一种临床级自体支气管基底层细胞的制备工艺,具体包括如下步骤:
取离体活性支气管刷检组织备用,在本实施例中选择取位于支气管两个不同部位的组织。之所以选择两个或者多个部位,是为了保证分离的成功率。
取组织消化液和终止液备用;其中组织消化液中,99v%为DMEM/F12,其余为1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;终止液中90v%为DMEM, 10v%为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理,利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。经酶解后的细胞进行菌检和支原体检测后部分冻存。
取培养基备用,其中培养基中225mL DMEM,225mL F12,20-70mL FBS,0.2-2mM L-glutamine,1-14ng/mL胰岛素,0.1-1ng/mL表皮生长因子,5-30ug/mL腺嘌呤, 2-20ug/mL氢化可的松。
铺被滋养层细胞的培养板备用,其中滋养层细胞的铺板的过程为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟后,铺上已经辐照灭活的滋养层细胞,放在细胞培养箱中培养(37℃,5%CO2),1-2天后可使用,细胞的密度以1-2天后细胞铺展到培养板底表面的50-70%为宜。
取部分经消化处理后的细胞,1/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板一孔中,3/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板另一孔中;每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素),在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过 80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时,收集细胞。
一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现,根据克隆的形态,可以分为A、B和C三级。其中,A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;B 级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松;C级克隆轮廓不规则,克隆边界不清晰,克隆内细胞排列疏松,体态肥大。
若克隆数量较少,在10倍镜下观察5个视野,其中3个视野中均无A级或B级克隆时,需将孔中细胞消化下来,再按照1:1的比例铺板到提前一天准备的滋养层细胞上继续进行培养。
细胞冻存前收集1.1ml细胞培养上清进行菌检和支原体检测。均合格后进行后续步骤。
在接到细胞扩增的生产指令后,取出冻存细胞,每个部位一管,在37℃水浴中快速溶解后,收集所有液体在15mL管中,并逐滴加入2mL已经在37℃温育过的终止液, 1200rpm离心3min,去上清后用培养基重悬细胞后,利用铺被滋养层细胞的6孔细胞培养板对细胞进行培养,培养过程中需对细胞克隆的形态进行观察和监测,合格标准为随机观察的5个视野中A级和B级克隆均超过50%,合格后进行后续步骤。其中滋养层细胞铺满培养板面积的50%-70%。
待解冻细胞长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,进行第一次传代培养。去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞,最后将约5-10×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿上进行培养,隔天换液。
待第一次传代细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第二次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞。取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%。同时按每个培养皿5-20×105的数量将重悬细胞铺于铺被滋养层细胞的3个10cm 培养皿上进行培养,隔天换液。取第二次传代培养后的细胞培养上清0.8mL进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb。
待第二次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第三次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.05%(质量体积比0.05g/100mL)胰酶,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心5min 去上清,并用培养基重悬细胞,最后将所有细胞铺于12个包被基质胶的培养皿上进行培养,隔天换液。
其中,基质胶包被培养皿的操作为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟。
待第三次传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,每个培养皿加入 1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶,在37℃中放置 5-15min,待大部分细胞变圆变亮后,用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,再用2mL终止液终止消化,收集细胞悬液,再用2mL终止液冲洗10cm培养皿表面,收集所有的细胞悬液。由于本步骤中细胞的数量较多,每次操作不多于5个培养皿,细胞悬液收集后在2-8℃暂时存放。待该批次所有的细胞悬液都收集起来后, 1200rpm离心5min,去上清,用1×DPBS洗涤2-4次即可,每次洗涤步骤为用40ml 1 ×DPBS重悬细胞沉淀,1200rpm离心5min,去上清。
实施例4
本实施例提供了一种临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备工艺如图1所示,具体包括如下步骤:
取离体活性支气管刷检组织备用,在本实施例中选择取位于支气管两个不同部位的组织。之所以选择两个或者多个部位,是为了保证分离的成功率。
取组织消化液和终止液备用;其中组织消化液中,99v%为DMEM/F12,其余为1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;终止液中90v%为DMEM, 10v%为FBS。
利用组织消化液对上述刷检组织进行消化处理,利用终止液对经消化处理后的组织进行终止消化后收集细胞。经酶解后的细胞进行菌检和支原体检测后部分冻存。
取培养基备用,其中培养基中225mL DMEM,225mL F12,20-70mL FBS,0.2-2mM L-glutamine,1-14ng/mL胰岛素,0.1-1ng/mL表皮生长因子,5-30ug/mL腺嘌呤, 2-20ug/mL氢化可的松。
铺被滋养层细胞的培养板备用,其中滋养层细胞的铺板的过程为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟后,铺上已经辐照灭活的滋养层细胞,放在细胞培养箱中培养(37℃,5%CO2),1-2天后可使用,细胞的密度以1-2天后细胞铺展到培养板底表面的50-70%为宜。
取部分经消化处理后的细胞,1/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板中,3/4用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的6孔培养板中;每个孔加200ul双抗(10000u/mL青霉素和10000ug/mL链霉素),在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团(如图2所示),细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5个视野中有3个视野中均有A级和 B级克隆时(A级克隆和B级克隆形态图分别如图3-A和图3-B所示,圈出细胞为体积稍大的细胞),收集细胞并按照取样部位进行冻存。
一般在4-7天后即可见到细胞克隆出现,根据克隆的形态,可以分为A、B和C三级。其中,A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;B 级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松;C级克隆轮廓不规则,克隆边界不清晰,克隆内细胞排列疏松,体态肥大。
若克隆数量较少,在10倍镜下观察5个视野,其中3个视野中均无A级或B级克隆时,需将孔中细胞消化下来,再按照1:1的比例铺板到提前一天准备的滋养层细胞上继续进行培养,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞时,收集细胞进行冻存。细胞冻存前收集细胞培养上清进行菌检和支原体检测(控制点1),经检测合格后进行后续步骤。
在接到细胞扩增的生产指令后,取出冻存细胞,每个部位一管,在37℃水浴中快速溶解后,收集所有液体在15mL管中,并逐滴加入2mL已经在37℃温育过的终止液,1200rpm离心3min,去上清后用培养基重悬细胞后,铺到前一天准备好的滋养层细胞上进行培养(6个孔中1孔),每天观察,隔天换液。其中滋养层细胞铺满培养板面积的 50%-70%。在培养过程中需对细胞克隆的形态进行观察和监测,合格标准为随机观察的5 个视野中A级和B级克隆均超过50%,合格后进行后续步骤。
待解冻细胞长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,进行第一次传代培养。去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞,最后将约5-10×105细胞铺于1个铺被滋养层细胞的6cm培养皿上进行培养,隔天换液。
待第一次传代细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第二次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入1mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶37℃消化5-10min,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用1mL终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心3min去上清,并用培养基重悬细胞。取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%(控制点3)。同时按每个培养皿5-20×105的数量将重悬细胞铺于铺被滋养层细胞的3个10cm培养皿上进行培养,隔天换液。取第二次传代培养后的细胞培养上清0.8mL 进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb (控制点3)。
待第二次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,进行第三次传代培养。去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.05%(质量体积比0.05g/100mL)胰酶,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,1200rpm离心5min 去上清,并用培养基重悬细胞,最后将所有细胞铺于12个包被基质胶的10cm培养皿上进行培养,隔天换液。
其中,基质胶包被培养皿的操作为,先加入20%的基质胶包被细胞培养板,待基质胶溶液铺满培养板底表面后,吸弃多余的液体,再将细胞培养板在37℃中放置15分钟。
待第三次传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,每个培养皿加入 1×DPBS洗涤一次,加入2mL 0.25%(质量体积比0.25g/100mL)胰酶,在37℃中放置 5-15min,待大部分细胞变圆变亮后,用1mL枪头轻轻将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,再用2mL终止液终止消化,收集细胞悬液,再用2mL终止液冲洗10cm培养皿表面,收集所有的细胞悬液。由于本步骤中细胞的数量较多,每次操作5个培养皿,细胞悬液收集后在2-8℃暂时存放。待该批次所有的细胞悬液都收集起来后,1200rpm 离心5min,去上清。
用45mL 1×DPBS重悬细胞沉淀后将所有的细胞悬液收集到一个50mL离心管中。1200rpm离心,5min,去上清,将细胞沉淀弹起,再加入45mL 1×DPBS重悬细胞后,1200rpm离心,5min,去上清,将细胞沉淀弹起,再加入45mL 1×DPBS重悬细胞后,上下颠倒混匀管中细胞,并取10ul细胞悬液进行进行台盼蓝染色,活细胞比例≥90%(控制点4)。管中细胞1200rpm离心,5min。弃剩余上清,用手指轻轻将细胞沉淀弹起,加入15mL 生理盐水,使细胞浓度为1-22×106/mL,混匀,同时取1mL细胞制剂进行留样。回输制剂外观检测结果为无色或白色细胞悬液,无明显肉眼可见杂质(控制点5)。
上述菌检采用培养法进行检测;
支原体检测采用PCR的方法进行检测;
内毒素检测采用鲎试剂凝胶法;
链霉素残余检测利用竞争酶联免疫吸附测定法检测;
生物学效应检测利用体外诱导培养法,细胞在诱导后进行HopX染色;
细胞鉴别与细胞纯度检测采用免疫荧光染色法;
活细胞比例检测采用台盼蓝染色法。
实验例1
用于肺组织再生医疗的临床级自体支气管基底层细胞回输制剂出库后,通过2-8℃冷链运输,在12h内运往细胞回输医院,再通过支气管镜回输至患者体内。具体如下:
(1)待受试者经皮血氧饱和度为92%以上且生命体征平稳后,再次经纤维支气管镜将临床级自体支气管基底层细胞回输制剂注入病灶部位的叶或段支气管。
(2)人支气管基底层细胞自体回输制剂回输完成后,先取出给药管,后取出纤维支气管镜。必要时可加用无创正压通气治疗,以便人支气管基底层细胞和肺组织充分结合。术后禁食水2小时,嘱受试者尽量减少咳嗽,必要时可给予可待因口服。
(3)完成回输之后要求受试者持平卧状态两小时左右,以保证细胞与肺部炎症和创面区域建立紧密的粘附。
实验例2
叶某,女,43岁,患有支气管扩张、肺气肿、疑伴有陈旧性结核,其治疗共分为两阶段,第一阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备,第二阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的回输。
(1)自体支气管基底层细胞回输制剂的制备:叶某于2016年9月接受支气管镜检查并通过刷检获取微量的刷检组织。并按照实施例4所述制备工艺制备自体支气管基底层细胞回输制剂。
(2)自体支气管基底层细胞回输制剂的回输
2016年4月,该患者在第三军医大学附属西南医院按照实验例1所述步骤接受了以上临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的移植。
从细胞移植到2018年8月,受试者未出现与制剂相关的不良反应。在肺功能检测中,细胞移植一个月后,肺通气能力FVC由治疗前预计值的49.5%提升到58.0%。三个月后FVC继续提升到63.6%并保持到移植后一年。换气弥散功能DLCO-SB也由治疗前的 56.3%提升到一年后的68.2%。患者六分钟步行距离由治疗前的447米提升到治疗后的 495米(表1)。患者自述治疗前只能爬1-2层楼,治疗后可以爬上5楼。气促气喘咳嗽等症状也大为改善。更重要的是比较该受试者细胞移植治疗前后的HR-CT结果,发现在随着移植细胞的时间增加,在患者右肺的毁损部位明显新生出了新的肺结构,因此患者的肺脏结构损伤有所修复(图4)。这与患者在其他检测中的指标提升,以及自述各种症状的明显缓解等现象相一致,说明自体支气管基底层细胞回输制剂的移植对该患者的治疗有了效果。
表1移植前后患者肺功能和6分钟步行实验检测结果汇总
实验例3
2016年上半年,一名慢阻肺(慢性支气管炎)受试者在西南医院在西南医院接受了临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的移植治疗。其治疗共分为两阶段,第一阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备,第二阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的回输。
(1)自体支气管基底层细胞回输制剂按照实施例4所述制备工艺制备
(2)自体支气管基底层细胞回输制剂的回输
该患者按照实验例1所述步骤接受了以上临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的移植。治疗半年后,受试者未出现与制剂相关的不良反应,同时受试者的FEV1,FEV1/FVC,DLCO,MMEF,MVV等肺功能指标明显提升,圣乔治呼吸问卷评分中受试者的症状明显改善(表2)。
表2移植前后患者肺功能、6分钟步行实验、圣乔治问卷评分检测结果
实验例4
梁某,男,被诊断患有间质性肺病,CT影像显示其右下肺明显具肺大疱。2016年 11月在上海市东方医院接受支气管基底层细胞自体回输制剂移植治疗。其治疗共分为两阶段,第一阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的制备,第二阶段为临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的回输。
(1)自体支气管基底层细胞回输制剂按照实施例4所述制备工艺制备
(2)自体支气管基底层细胞回输制剂的回输
该患者按照实验例1所述步骤接受了以上检测的临床级自体支气管基底层细胞回输制剂的移植。移植一月和三月后CT影像学显示其右下肺的肺大疱情况明显好转(图5)。受试者自述症状明显有所缓解。移植后半年,各项肺功能指标显著上升,急性加重的症状由移植前年平均急性加重4-5次减少至几乎没有。受试者细胞移植后6个月的CT结果显示,受试者左肺毁损区域明显显示出新生的肺结构,原有的肺脏结构损伤在很大程度上得到了恢复(图6)。这与该受试者其他指标的提升和自述症状明显缓解相一致,说明临床级支气管基底层细胞自体回输制剂移植对该患者的治疗有了明显的效果。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (20)
1.一种临床级自体支气管基底层细胞的制备方法在制备治疗支气管扩张的药物中的应用,其特征在于,所述临床级自体支气管基底层细胞的制备方法包括如下步骤:
组织准备:取离体活性支气管刷检组织备用;
酶解:对上述组织进行消化处理,终止消化后收集细胞;
铺板、扩增培养:取部分经消化处理后的细胞,利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养,收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养,待细胞长满至培养板表面积的50%-90%时,进行传代培养;
收集细胞:待传代培养细胞长满至培养皿表面积的85%-95%时,消化并收集贴壁细胞,洗涤即可。
2.根据权利要求1所述的应用,其中所述治疗支气管扩张包括改善肺通气功能、换气功能、修复受损肺结构和/或促进肺结构新生。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述组织消化液包含99v%的DMEM/F12,1-20ng/mL的DNA酶,0.1-4mg/mL蛋白酶XIV和10-200ng/mL胰酶;所述消化处理的温度为37℃,时间为0.5-2h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于,所述终止液包含90v%DMEM和10v%FBS。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于,支气管刷检组织来自于至少一个部位。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用,其特征在于,对经酶解后的细胞、经铺板培养后的细胞进行冻存;
优选在冻存细胞前,进行菌检和支原体检测。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,快速解冻细胞,进行铺板培养和/或扩增培养。
8.根据权利要求1-7任一所述的应用,其特征在于,铺板培养包括以下步骤:
取待进行铺板培养的细胞,用培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中,培养板中加入抗生素;
在37℃,CO2浓度为4%-8%条件下培养,隔天更换培养基,待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团,细胞克隆长大至超过80%的克隆中有40-100个细胞,且随机观察的5个视野中有3个视野均有A级和B级克隆时,收集细胞。
9.根据权利要求1-8任一项所述的应用,其特征在于,利用铺被滋养层细胞的培养板于37℃进行扩增培养;同时对细胞形态进行观察和检测,随机观察5个视野,A级和B级克隆超过50%;
所述铺被有滋养层细胞的培养板中,滋养层细胞铺满培养板面积的50%-70%。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于,所述A级克隆轮廓规则圆滑,克隆边界清晰,克隆内细胞排列紧致,大小均一;
所述B级克隆轮廓基本规则,克隆边界平滑清晰,克隆内细胞大部分紧致均一,有少量细胞体积稍大,排列略显疏松。
11.根据权利要求1-10任一所述的应用,其特征在于,所述传代培养为n次(n大于1且不大于7),其中,利用铺被滋养层细胞的培养皿进行n-1次传代培养,至n-1次传代培养后细胞长满至培养皿表面积的50%-90%;
利用铺被基质胶的培养皿进行第n次传代后的铺板培养。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,在n次传代培养中,每一次传代培养时细胞长满至培养皿表面积的50%-90%。
13.根据权利要求11或12所述的应用,其特征在于,所述传代培养的具体操作为:
第一次传代培养,利用铺被滋养层细胞的培养皿对待培养细胞进行培养,待长满至细胞培养板表面积的50%-90%时,去细胞培养上清,1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养,隔天换液;
第二次至第n-1次传代培养,待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于铺被滋养层细胞的培养皿上进行培养,隔天换液;
第n次传代培养,待上一次传代培养细胞长满至培养皿表面积的50%-90%时,去培养上清,加入1×DPBS洗涤一次,加入胰酶和1×DPBS,在37℃中放置1-2min,将滋养层细胞吹打下来,再用1×DPBS洗涤一次,加入胰酶消化,待大部分细胞变圆变亮后,将贴壁细胞吹打下来并吹打成单细胞悬液,用终止液终止消化,收集细胞悬液,离心去上清,并用培养基重悬细胞,最后将细胞铺于包被基质胶的培养皿上进行培养,隔天换液。
14.根据权利要求1-13任一项所述的应用,其特征在于,在进行第n-2次传代培养后,取1.1mL细胞培养上清和3-16×105细胞进行菌检和支原体检测为阴性,生物学效应检测HOPX阳性率≥30%、细胞鉴别为KRT5阳性和细胞纯度分析结果为KRT5细胞比例≥90%;
在第n-1次传代培养后,取0.8mL细胞培养上清进行内毒素含量检测和链霉素残余检测,内毒素含量<0.125Eu/mL,链霉素残余<4ppb。
15.根据权利要求1-14的应用,其特征在于,培养基的配方为:225mL DMEM、225mL F12、20-70mL FBS、0.2-2mM L-谷氨酰胺、1-14ng/mL胰岛素、0.1-1ng/mL表皮生长因子、5-30ug/mL腺嘌呤、2-20ug/mL氢化可的松。
16.权利要求1-15任一项所述应用制备的临床级自体支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张的药物中的应用。
17.权利要求1-16任一项所述的应用,其中所述药物包括临床级自体支气管基底层细胞和临床级的注射液。
18.根据权利要求17所述的应用,其中所述临床级的注射液为注射用生理盐水。
19.根据权利要求17或18的应用,其中所述药物的制备方法还包括用1×DPBS洗涤经扩增培养后的细胞2-4次,最后一次加入1×DPBS重悬细胞后离心,弃剩余上清,将细胞沉淀弹起,加入临床级的注射液,至细胞浓度为1-22×106/mL,混匀,同时取1mL细胞制剂留样。
20.根据权利要求19所述的应用,其中最后一次加入1×DPBS重悬细胞后,取10ul细胞悬液进行台盼蓝染色,活细胞比例≥90%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111437664.0A CN114196613B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910407062.7A CN111944737B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
CN202111437664.0A CN114196613B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张药物中的应用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910407062.7A Division CN111944737B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114196613A true CN114196613A (zh) | 2022-03-18 |
CN114196613B CN114196613B (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=73289325
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111437664.0A Active CN114196613B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 支气管基底层细胞在制备治疗支气管扩张药物中的应用 |
CN202111437551.0A Active CN114196612B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
CN201910407062.7A Active CN111944737B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111437551.0A Active CN114196612B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
CN201910407062.7A Active CN111944737B (zh) | 2019-05-16 | 2019-05-16 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220226390A1 (zh) |
EP (1) | EP3954760A4 (zh) |
CN (3) | CN114196613B (zh) |
WO (1) | WO2020228819A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114196612A (zh) * | 2019-05-16 | 2022-03-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113940951A (zh) | 2020-07-15 | 2022-01-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | Regend001细胞自体回输制剂的新用途 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107267437A (zh) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法 |
CN107326011A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-07 | 信雅生物科技(苏州)有限公司 | 一种人肺癌细胞原代培养的方法 |
CN108486059A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-09-04 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 一种细胞培养液及人原代肺癌细胞株的建立方法 |
CN111944737A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
CN113827617A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-12-24 | 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心) | 气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用 |
CN113940951A (zh) * | 2020-07-15 | 2022-01-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | Regend001细胞自体回输制剂的新用途 |
CN115786243A (zh) * | 2023-01-31 | 2023-03-14 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 一种肺前体细胞的分化培养基、培养方法及其应用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011019520A (ja) * | 2010-08-13 | 2011-02-03 | Walter Gehring | Notch経路を用いた組織型または器官型の操作 |
CN105647850A (zh) * | 2016-03-01 | 2016-06-08 | 赛百慷(上海)生物技术股份有限公司 | 一种上皮培养体系 |
JP6840774B2 (ja) * | 2016-05-16 | 2021-03-10 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 肺上皮エンジニアリングにおけるヒト気道幹細胞 |
CN107974429B (zh) * | 2017-11-29 | 2021-06-29 | 宁夏医科大学总医院 | 一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基 |
CN108624561B (zh) * | 2018-05-26 | 2021-09-17 | 复旦大学 | 原代肿瘤细胞培养基、培养方法以及应用 |
AU2020207252A1 (en) * | 2019-01-08 | 2021-08-19 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | A method of treating cystic fibrosis |
CN112175908A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 同济大学 | 一种具有抗菌能力的肺脏干细胞及其应用 |
CN114480260B (zh) * | 2022-01-24 | 2024-02-09 | 同济大学 | 一种成体肺干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-05-16 CN CN202111437664.0A patent/CN114196613B/zh active Active
- 2019-05-16 CN CN202111437551.0A patent/CN114196612B/zh active Active
- 2019-05-16 CN CN201910407062.7A patent/CN111944737B/zh active Active
-
2020
- 2020-05-15 US US17/609,571 patent/US20220226390A1/en active Pending
- 2020-05-15 WO PCT/CN2020/090512 patent/WO2020228819A1/zh unknown
- 2020-05-15 EP EP20806297.6A patent/EP3954760A4/en active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107267437A (zh) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 用于分离获得肺脏干细胞的试剂盒及方法 |
CN107326011A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-07 | 信雅生物科技(苏州)有限公司 | 一种人肺癌细胞原代培养的方法 |
CN108486059A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-09-04 | 深圳市因诺转化医学研究院 | 一种细胞培养液及人原代肺癌细胞株的建立方法 |
CN111944737A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 |
CN114196612A (zh) * | 2019-05-16 | 2022-03-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
CN113940951A (zh) * | 2020-07-15 | 2022-01-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | Regend001细胞自体回输制剂的新用途 |
CN113827617A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-12-24 | 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心) | 气道基底层干细胞在良性气道狭窄治疗中的应用 |
CN115786243A (zh) * | 2023-01-31 | 2023-03-14 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 一种肺前体细胞的分化培养基、培养方法及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
FENGJUN SUN等: "Application of autologous SOX9+ airway basal cells in patients with bronchiectasis", CLIN RESPIR J, vol. 14, no. 9, pages 839 - 848 * |
QIWANG MA等: "Regeneration of functional alveoli by adult human SOX9+ airway basal cell transplantation", PROTEIN CELL, vol. 9, no. 3, pages 272 * |
程林等: "自体支气管基底层细胞治疗慢性阻塞性肺疾病的小样本探索性研究", 重庆医学, vol. 48, no. 23, pages 4012 - 4016 * |
马煜;瞿介明;左为;: "呼吸系统干细胞临床研究进展", 中国细胞生物学学报, no. 1, pages 107 - 116 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114196612A (zh) * | 2019-05-16 | 2022-03-18 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
CN114196612B (zh) * | 2019-05-16 | 2024-03-12 | 苏州吉美瑞生医学科技有限公司 | 支气管基底层细胞在制备治疗copd药物中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220226390A1 (en) | 2022-07-21 |
CN114196612B (zh) | 2024-03-12 |
EP3954760A1 (en) | 2022-02-16 |
CN111944737A (zh) | 2020-11-17 |
WO2020228819A1 (zh) | 2020-11-19 |
CN111944737B (zh) | 2023-12-26 |
CN114196613B (zh) | 2024-03-12 |
CN114196612A (zh) | 2022-03-18 |
EP3954760A4 (en) | 2022-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2076588B1 (en) | Expansion method for adult stem cells from blood, particularly peripheral blood, and relative application in medical field | |
RU2323252C1 (ru) | Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo | |
CN106754674A (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
WO2014075593A9 (zh) | 间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 | |
WO2020228819A1 (zh) | 一种临床级自体支气管基底层细胞及回输制剂和制备工艺 | |
EP2670414A2 (en) | Pluripotent stem cells and method of stimulating and extracting non-embryonic pluripotent stem cells from mammal blood and using reconstituted pluripotent stem cells to treat diseases including chronic obstructive pulmonary disease | |
CN103881973A (zh) | 一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法 | |
CN108865986A (zh) | 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
CN106701682A (zh) | 由脐血分离造血干细胞并扩增cd34阳性细胞的方法 | |
WO2013071469A1 (zh) | 使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞和自体视网膜细胞的方法、试剂盒及用途 | |
JP2801085B2 (ja) | ヒト細胞を植えた気道上の異種移植片を有する非ヒト動物 | |
WO2014089397A1 (en) | Compositions and methods of treating and preventing pulmonary fibrosis | |
CN109182261A (zh) | 一种培养羊膜间充质干细胞的方法 | |
CN108753681B (zh) | 一种鼻上皮干细胞培养方法及鼻上皮干细胞增殖培养基 | |
WO2022012567A1 (zh) | Regend001细胞自体回输制剂治疗特发性肺纤维化的新用途 | |
Hong et al. | Comparison and improvement in primary airway fibroblast culture across different mammalian species | |
CN114480260A (zh) | 一种成体肺干细胞外泌体及其制备方法和应用 | |
CN115491344A (zh) | 一种小鼠原代肺成纤维细胞分离、纯化及体外激活模型构建的方法 | |
CN111944747A (zh) | 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途 | |
CN106474157A (zh) | 一种肝干细胞注射液及其制备方法 | |
Reza Mokhber Dezfouli et al. | The therapeutic potential of differentiated lung cells from embryonic stem cells in lung diseases | |
CN114657119B (zh) | 一种初生仔猪肠神经胶质细胞的分离和原代培养方法 | |
US20220396767A1 (en) | Preparation method for olfactory precursor cell | |
JP7556025B2 (ja) | 嗅覚前駆細胞の作製方法 | |
TWI837722B (zh) | 肺類器官的製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |