CN106474157A - 一种肝干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝干细胞注射液及制备方法。所述注射液由肝干细胞、脐带间充质干细胞、聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺按照一定的分量比组成。本发明所述的肝干细胞注射液中，肝干细胞和脐带间充质干细胞相配合，对糖尿病治疗效果更佳；本发明所述的注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性，且无任何毒副成分，安全有效，成本低廉，可直接应用与糖尿病临床注射。使用本发明所述的肝干细胞培养方法及其专用培养基，能有效维持肝干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，同时保持肝干细胞的干性，且降低培养和收获过程中肝干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期。

Description

一种肝干细胞注射液及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种肝干细胞注射液及其制备方法。

背景技术

在20世纪早期，有学者通过一些实验现象推测成熟的肝脏具有很强的再生能力,因为其中存在着一群可分化为肝细胞和胆管细胞的“祖先”细胞。目前人们对肝干细胞的存在已形成广泛共识，它是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可以通过自身对称性和不对称性分裂产生表现型和基因型与自身完全相同的干细胞，也能产生肝脏组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞，如肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等。随着对其特性的深入了解，它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源，在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面均有着巨大的潜力，目前现有技术中已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞用于治疗糖尿病的先例，病取得了良好的疗效。

由肝干细胞制备的干细胞注射液在临床上可以用于治疗肝硬化或糖尿病等。然而与普通生物制品和药品不同，干细胞注射液的活性物质是细胞，细胞在离体环境中，活性会迅速下降，传统方法用含人血白蛋白的氯化钠注射液对肝干细胞进行保存，在8-24h以内，细胞活性即大幅下降，无法长期保证细胞活性，例如中国专利CN102948413B中公开的肝干细胞保存液，主要由人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和肝素钙组成，将肝干细胞重悬于所述保存液中即形成注射液，细胞保存能力较差。大量研究发现，用含有胎牛血清或细胞培养基的保存液可以解决细胞活性下降的问题，但是细胞接触胎牛血清时会内吞胎牛血清，进而引起细胞某些蛋白表达特性的变化，细胞回输人体后可能引起过敏反应，且血清中含有大量未知成分，不能临床使用。

目前，肝脏干细胞的分离、培养及扩增研究尚处于起步阶段，有关肝细胞的体外扩增及肝干细胞系的建设仍然是研究的重点。由于肝干细胞表面缺乏特异性标志，给肝干细胞的分离和鉴定带来一定的困难，因为分离纯化技术目前很不成熟，使得肝脏干细胞通过分离技术得到的数量很低，所以体外培养及扩增很重要。但肝脏干细胞体外培养时生长缓慢且很容易为成熟肝细胞而失去增殖能力，故肝干细胞的系的建立仍然是目前研究工作的难点及重点。肝干细胞是维持自我复制还是分化为成熟的功能细胞依赖于微环境、细胞生长因子、基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，虽然人们对肝干细胞的研究作出了巨大的努力，如中国专利申请CN104630135A公开的“大规模制备肝干细胞的方法与用途”，提供了肝干细胞体外扩增的一种方法；中国专利CN101851605B中公开了一种肝干细胞的选择培养基，由液体基础培养基内加胎牛血清、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素组成，并公开了一种选择性分离并扩增肝干细胞的方法；中国专利申请CN104818245A中公开的一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF，以及应用该培养基培养肝干细胞的方法。但至今尚未建立安全可靠、功能完全和永生化的人肝干细胞系。

发明内容

本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种肝干细胞注射液，能够长时间维持肝干细胞的活性，以及肝干细胞体外培养方法及专用培养基，达到抑制分化，同时给予适当的营养位置及生长因子以促进增殖的目的。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明一方面提供了肝干细胞在治疗糖尿病的注射液中的应用。

本发明另一方面提供了一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，该注射液包括肝干细胞、脐带间充质干细胞和注射混合液；每ml注射混合液含3×10⁵-1×10⁷个肝干细胞和1×10³-1×10⁴个脐带间充质干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：2-8％的聚乙二醇、2-5％的精氨酸、3-7％的赖氨酸、2-6％的甲硫氨酸、4-7％的缬氨酸、0.2-0.8％的冰醋酸、3-5％的胶原蛋白、2-5％的糖胺聚糖、0.3-0.5％的维甲酸和0.8-1.2％的乙醇胺；余量为生理盐水。

本发明所述的肝干细胞注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性，且无任何毒副成分，安全有效，成本低廉。

本发明另一方面还提供了注射液的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)肝干细胞的培养；

2)脐带间充质干细胞的培养；

3)将聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺溶于生理盐水中配制成复方溶液，4℃预冷备用；

4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带间充质干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中，制成单细胞悬液，使每毫升注射液中3×10⁵-1×10⁷个肝干细胞和1×10³-1×10⁴个脐带间充质干细胞，得到所述注射液。

进一步的，本发明还提供了培养所述肝干细胞的培养基，所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：6-9mg/ml透明质酸、60-80ng/ml肝细胞生长因子、50-75ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20μg/ml重组人骨形态发生蛋白、300-500μg/ml2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、7-12mg/ml柠檬酸铁、10-25mg/ml羧甲基纤维素钠和3-7mg/ml左旋肉碱。

本发明所提供的肝干细胞专用培养基，在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肝干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。

另一方面，本发明还提供了应用所述肝干细胞培养基培养肝干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a.取12-16周离体胚胎，无菌取出肝脏，去掉血管，将获得的肝脏剪碎成1-3mm³的碎块，不断漂洗，除去血细胞；加入含有5％双抗的生理盐水冲洗3遍，用胶原酶消化后，经免疫磁珠法筛选，得到初始肝干细胞；

b.将步骤a得到的初始肝干细胞加入肝干细胞培养基中，调节细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种到培养瓶中，于36.5℃、5％CO₂的潮湿空气条件中培养，每隔4天换新鲜培养液，15天后收获细胞，得到原代肝干细胞；

c.当细胞生长到密度90％时，采用胰酶消化法收集原代肝干细胞，并按照5×10⁵的密度加入肝干细胞培养基，接种于明胶包被的培养皿中，并向培养液中加入1g/L的二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯，缓慢送气混合均匀，于37℃、5％CO₂的潮湿空气的条件下培养5-7天，每隔天换新鲜培养液并缓慢送气混合均匀，收获后得到传代肝干细胞。

其中，双抗为细胞培养添加物：青霉素及链霉素溶液，是一种含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。

结合肝干细胞生长特性，通过大量试验总结出上述肝干细胞的培养方法及条件，能有效维持肝干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，且降低培养过程中肝干细胞的死亡率，缩短生长周期。

进一步的，所述步骤b的培养方法中，第1-4天的培养基中含有3％新生牛血清；第5-12天培养基中含有5％羊血清。

经试验发现，在培养初级阶段向培养基中加入3％新生牛血清，中后阶段更换为5％的羊血清的培养基条件下培养肝干细胞，能有效促进细胞生长和增殖，产量可进一步增加。

优选，所述步骤b原代肝干细胞培养过程中PH值保持7.4-7.6，步骤c传代肝干细胞培养过程中PH值保持7.2-7.4，所诉PH值由2M的NaOH调节。

进一步优选，所述培养皿的包被方法为：采用0.5％浓度的明胶去离子水溶液，37℃包被4h，吸弃溶液后加入含有5％双抗的PBS缓冲液冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍，吹干即得所述明胶包被培养皿。

进一步优选，所述传代肝干细胞收获方法为：所述传代肝干细胞收获方法为：加入PH为7.3的含有0.04％胶原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂的DMEM/F12培养液于37℃恒温消化7-9min，轻轻吹打后静置，待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯沉降后，分离上层液体；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的无Ca⁺和Mg⁺离子的PBS溶液，37℃温育15-20min，每隔2min搅拌一次，静置待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分离上层液体并与前一次上层液体合并，离心弃上清液，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，再次离心弃上清液，冻存备用。

采用上述收获方法收获传代肝干细胞，可最大程度的收集细胞，且降低细胞收获阶段损伤率。

进一步本发明还提供了所述的肝干细胞注射液在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明所述的肝干细胞注射液，其中肝干细胞和少量脐带间充质干细胞相配合，对糖尿病的治疗效果更佳；所述注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性，4℃下条件下，可有效期长达3天，且无任何毒副成分，安全有效，成本低廉。

使用本发明所述的肝干细胞培养方法及其专用培养基，能有效维持肝干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，且降低培养和收获过程中肝干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期；在能有效提高细胞扩增速度的同时保持肝干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。

具体实施方式

实施例1

一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，每ml注射混合液含1×10⁷个肝干细胞和1×10³个脐带间充质干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：2％的聚乙二醇、2％的精氨酸、3％的赖氨酸、2％的甲硫氨酸、4％的缬氨酸、0.2％的冰醋酸、3％的胶原蛋白、2％的糖胺聚糖、0.3％的维甲酸和0.8％的乙醇胺；余量为生理盐水。

实施例2

一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，每ml注射混合液含3×10⁵个肝干细胞和1×10⁴个脐带间充质干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：8％的聚乙二醇、5％的精氨酸、7％的赖氨酸、6％的甲硫氨酸、7％的缬氨酸、0.8％的冰醋酸、5％的胶原蛋白、5％的糖胺聚糖、0.3-0.5％的维甲酸和1.2％的乙醇胺；余量为生理盐水。

制备方法：

1)肝干细胞的培养；

2)脐带间充质干细胞的培养；

3)将聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺溶于生理盐水中配制成复方溶液，4℃预冷备用；

4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带间充质干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中，制成单细胞悬液，使每毫升注射液中含有3×10⁵个肝干细胞和1×10⁴个脐带间充质干细胞，得到所述治疗糖尿病的注射液。

实施例3

一种肝干细胞培养基，以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：6mg/ml透明质酸、60ng/ml肝细胞生长因子、50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10μg/ml重组人骨形态发生蛋白、300μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、7mg/ml柠檬酸铁、10mg/ml羧甲基纤维素钠和3mg/ml左旋肉碱。

实施例4

一种肝干细胞培养基，以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：8mg/ml透明质酸、73ng/ml肝细胞生长因子、62ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、14μg/ml重组人骨形态发生蛋白、410μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、10mg/ml柠檬酸铁、21mg/ml羧甲基纤维素钠和5mg/ml左旋肉碱。

实施例5

一种肝干细胞的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

a.取12-16周离体胚胎，无菌取出肝脏，去掉血管，将获得的肝脏剪碎成1mm³的碎块，不断漂洗，除去血细胞；加入含有5％双抗的生理盐水冲洗3遍，用胶原酶消化后，经免疫磁珠法筛选，得到肝干细胞；

b.将步骤a得到的肝干细胞加入肝干细胞培养基，调节细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种到培养瓶中，于36.5℃、5％CO₂的潮湿空气条件中培养，每隔4天换新鲜培养液，15天后收获细胞，得到原代肝干细胞；

c.当细胞生长到密度90％时，采用胰酶消化法收集原代肝干细胞，并按照5×10⁵的密度加入肝干细胞培养基，接种于明胶包被的培养皿中，并向培养液中加入1g/L的二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯，缓慢送气混合均匀，于37℃、5％CO₂的潮湿空气的条件下培养7天，每隔天换新鲜培养液并缓慢送气混合均匀，收获后得到传代肝干细胞。

其中，

所述肝干细胞培养基为包含浓度组分为：含有9mg/ml透明质酸、80ng/ml肝细胞生长因子、75ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20μg/ml重组人骨形态发生蛋白、500μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、12mg/ml柠檬酸铁、25mg/ml羧甲基纤维素钠和7mg/ml左旋肉碱的DMEM/F12培养基。

实施例6

一种肝干细胞的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

a.取12-16周离体胚胎，无菌取出肝脏，去掉血管，将获得的肝脏剪碎成3mm³的碎块，不断漂洗，除去血细胞；加入含有5％双抗的生理盐水冲洗3遍，用胶原酶消化后，经免疫磁珠法筛选，得到肝干细胞；

b.将步骤a得到的肝干细胞加入肝干细胞培养基，调节细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种到培养瓶中，于36.5℃、5％CO₂的潮湿空气条件中培养，每隔4天换新鲜培养液，15天后收获细胞，得到原代肝干细胞；期间由2M的NaOH调节PH值，保持7.4-7.6；

c.当细胞生长到密度90％时，采用胰酶消化法收集原代肝干细胞，并按照5×105的密度加入肝干细胞培养基，接种于明胶包被的培养皿中，并向培养液中加入1g/L的二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯，缓慢送气混合均匀，于37℃、5％CO2的潮湿空气的条件下培养5天，每隔天换新鲜培养液并缓慢送气混合均匀，；期间由2M的NaOH调节PH值，保持7.2-7.4；收获后得到传代神经干细胞。

其中，

所述肝干细胞培养基为：以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：7mg/ml透明质酸、70ng/ml肝细胞生长因子、62ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、13μg/ml重组人骨形态发生蛋白、425μg/ml2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、8mg/ml柠檬酸铁、13mg/ml羧甲基纤维素钠和4mg/ml左旋肉碱。其中肝干细胞培养步骤b中，第1-4天的培养基中含有3％(v/v)新生牛血清；第5-12天培养基中含有5％(v/v)羊血清。

所述培养皿的包被方法为：采用0.5％浓度的明胶去离子水溶液，37℃包被4h，吸弃溶液后加入含有5％双抗的PBS缓冲液冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍，吹干即得所述明胶包被培养皿。

实施例7

一种肝干细胞的培养方法，与实施例6不同的是：

进一步限定的传代肝干细胞收获方法为：加入PH为7.3的含有0.04％胶原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂的DMEM/F12培养基溶液于37℃恒温消化7min，轻轻吹打后静置，待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯沉降后，分离上层液体；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的无Ca⁺和Mg⁺离子的PBS溶液，37℃温育15min，每隔2min搅拌一次，静置待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分离上层液体并与前一次上层液体合并，离心弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，再次离心弃上清，冻存备用。

实施例8

一种肝干细胞的培养方法，与实施例7不同的是：

传代肝干细胞收获方法为：加入PH为7.3的含有0.04％胶原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂的DMEM/F12培养基溶液于37℃恒温消化9min，轻轻吹打后静置，待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯沉降后，分离上层液体；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的无Ca⁺和Mg⁺离子的PBS溶液，37℃温育20min，每隔2min搅拌一次，静置待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分离上层液体并与前一次上层液体合并，在1200rmp的转速下离心，弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，再次离心弃上清，冻存备用。

实施例9

一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，每ml注射混合液含1×10⁶个肝干细胞和7×10³个脐带间充质干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：6％的聚乙二醇、4％的精氨酸、5％的赖氨酸、3％的甲硫氨酸、5％的缬氨酸、0.5％的冰醋酸、4％的胶原蛋白、3％的糖胺聚糖、0.4％的维甲酸和0.9％的乙醇胺；余量为生理盐水；

制备方法：

1)实施例4所述的培养方法培养肝干细胞；

2)脐带间充质干细胞的培养；

3)复方溶液的配制：

将聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺溶于生理盐水中配制成复方溶液，4℃预冷备用；

4)肝干细胞注射液的配制：

将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带间充质干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中，制成单细胞悬液，使每毫升注射液中含有1×10⁶个肝干细胞和7×10³个脐带间充质干细胞，得到所述注射液。

对照实施例

一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，每ml注射混合液含1×10⁷个肝干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：2％的聚乙二醇、2％的精氨酸、3％的赖氨酸、2％的甲硫氨酸、4％的缬氨酸、0.2％的冰醋酸、3％的胶原蛋白、2％的糖胺聚糖、0.3％的维甲酸和0.8％的乙醇胺；余量为生理盐水。

试验1：含有本发明方法获得的肝干细胞注射液在糖尿病动物模型中的应用

1)分组

A组：取实施例1所述的肝干细胞注射液；

B组：取对照实施例所述的肝干细胞注射液；

C组：中国专利CN101851605B中提供的肝干细胞注射液；

D组：空白组，0.9％的氯化钠溶液。

2)试验方法

将购自北京大学医学部的I型糖尿病鼠模型，随机分为A、B、C、D四组，每组10只。A、B和C两组在第0天给鼠尾静脉注射1ml注射液(内含1×10⁷个肝干细胞)，第7天和第14天以相同剂量再次注射；D组于相同时间点在尾静脉注射同体积生理盐水并计算鼠模型血糖大小。分别于最后一次注射后的第7天、第14天、第21天和第28天监测鼠模型空腹血糖水平，结果如下表1所示。

表1 I型糖尿病鼠治疗前后的血糖水平比较

从表1可已看出，与对照组C组相比可看出，A组、B组和C组均对I型糖尿病鼠模型具有良好的治疗效果，说明肝干细胞在治疗糖尿病方便有着较好的疗效。与B组相比，A组疗效更佳，说明本发明所述的用于治疗糖尿病的肝干细胞注射液中肝干细胞与脐带间充质干细胞相配合，对糖尿病的治疗效果更佳；与C组相比，B组的疗效更佳，说明本发明所述的注射液中对肝干细胞的保存和活性保持较好；经试验，本发明所述的肝干细胞注射液静脉注射小鼠未引起急性毒理及排斥反应。

试验2：注射液中肝干细胞活率检测

1)分组

试验组：取实施例1、2和9所述的肝干细胞注射液；

对照组：中国专利CN102948413B制成的肝干细胞重悬液。

2)试验方法

取试验组和对照组的肝干细胞注射液，检测在4℃下保存24h，48h，72h的细胞活率；并将本发明所述的注射液冻存1年后，在37℃水浴复苏，测试细胞活率；检测方法为台盼蓝经典染色法，检测结果见表2。

表2肝干细胞注射液中肝干细胞的活率检测结果

由表2可以看出，本发明所述的肝干细胞注射液和对照组在0h时，细胞活率相差不大，但对照组在4℃下保存24h后降低到接近国家最低标准，48h后细胞活率已经不能达到国家的86％标准；而本发明所述的肝干细胞注射液在4℃下条件下，可有效期长达3天，大大方便临床使用；另外本发明所述肝干细胞注射液无常用细胞冻存液DMSO，毒性小，但在冻存条件下也可以较好的保持肝干细胞的生命力，长时间保持细胞高存活率，各组间无差异。

试验3：肝干细胞体外培养扩增情况

1)分组

试验组：本发明所述的肝干细胞培养基；

对照组：中国专利申请CN104818245A中所提供的肝干细胞培养基；2)试验方法

体外培养扩增方法，选实施例6所述的方法。

3.1肝干细胞的干性和分化情况

取第10代肝干细胞，采用实施例6所述的方法收集细胞沉淀，沉淀用1mL PBS重悬计数。取6份50μL(每份含1×10⁶个细胞)上述的传代得到细胞悬液，分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用PBS洗涤一次，加入2％甲醛固定3分钟，用0.5％曲通100(Triton-100)的PBS溶液洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入PBS以及用PBS稀释的DAPI、PBS稀释的鼠抗人ALB单抗、PBS稀释的鼠抗人CK19单抗、PBS稀释的鼠抗人AFP单抗和PBS稀释的鼠抗人Nestin单抗，在4℃冰箱过夜进行染色/结合。染色/结合后用0.5％Triton-100的PBS洗涤3次，向鼠抗人ALB单抗的孔中加入用PBS稀释的二抗IgG1-FITC，并向鼠抗人CK19单抗、鼠抗人AFP单抗、鼠抗人Nestin单抗的孔中加入用PBS稀释的二抗IgG1-PE，在37℃下孵育1h，孵育后用PBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90％甘油封闭。

荧光显微镜下观测，结果显示，试验组95％以上的细胞呈现DAPI、CK19、AFP和Nestin为阳性，ALB为阴性，符合肝干细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的选择培养基传代培养的肝干细胞第10代也较少出现分化变性的现象，保持了原代肝干细胞的细胞性状；而对照组只有62％以上的细胞呈现上述特性，传10代后肝干细胞分化相对严重。

3.2肝干细胞体外扩增情况

采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，按照实施例6的方法培养扩增肝干细胞，接种时细胞为5×10⁶个/ml，分别统计原代干细胞、第3代、第6代和第9代干细胞的数量，结果见表3。

表3肝干细胞体外培养扩增细胞数量

由表4可以看出，本发明所述的肝干细胞的培养方法可以有效的体外培养肝干细胞，而本发明所提供的肝干细胞专用培养基对肝干细胞的扩增培养非常高效，较对照组有非常显著的差异。

结论

由上述试验可知，本发明所述的肝干细胞注射液可有效保持肝干细胞活性，4℃下条件下，可有效期长达3天，且在冻存条件下也可以较好的保持肝干细胞的生命力，长时间保持细胞高存活率，大大方便临床使用。

使用本发明所述的肝干细胞培养方法及其专用培养基，可以有效的体外培养肝干细胞，而本发明所提供的肝干细胞专用培养基对肝干细胞的扩增培养非常高效，而且有效保持肝干细胞未分化状态，第10代也较少出现分化变性的现象，保持了原代肝干细胞的细胞性状。

Claims (10)

1.肝干细胞在制备治疗糖尿病的注射液中的应用。

2.一种治疗糖尿病的肝干细胞注射液，其特征在于，包括肝干细胞、脐带间充质干细胞和注射混合液；每ml注射混合液含3×10⁵-1×10⁷个肝干细胞和1×10³-1×10⁴个脐带间充质干细胞；所述注射混合液由以下质量百分比成分组成：2-8％的聚乙二醇、2-5％的精氨酸、3-7％的赖氨酸、2-6％的甲硫氨酸、4-7％的缬氨酸、0.2-0.8％的冰醋酸、3-5％的胶原蛋白、2-5％的糖胺聚糖、0.3-0.5％的维甲酸和0.8-1.2％的乙醇胺；余量为生理盐水。

3.一种权利要求2所述肝干细胞注射液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1)肝干细胞的培养；

2)脐带间充质干细胞的培养；

3)将聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺溶于生理盐水中配制成复方溶液，4℃预冷备用；

4)将步骤1)所得的肝干细胞和步骤2)所得的脐带间充质干细胞重悬于步骤3)所得的复方溶液中，制成单细胞悬液，使每毫升注射液中含有3×10⁵-1×10⁷个肝干细胞和1×10³-1×10⁴个脐带间充质干细胞，得到所述注射液。

4.一种用于培养如权利要求2所述肝干细胞注射液中肝干细胞的培养基，其特征在于，

所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：6-9mg/ml透明质酸、60-80ng/ml肝细胞生长因子、50-75ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10-20μg/ml重组人骨形态发生蛋白、300-500μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、7-12mg/ml柠檬酸铁、10-25mg/ml羧甲基纤维素钠和3-7mg/ml左旋肉碱。

5.一种应用如权利要求4所述肝干细胞培养基培养肝干细胞的方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

a.取12-16周离体胚胎，无菌取出肝脏，去掉血管，将获得的肝脏剪碎成1-3mm³的碎块，不断漂洗，除去血细胞；加入含有5％双抗的生理盐水冲洗3遍，用胶原酶消化后，经免疫磁珠法筛选，得到初始肝干细胞；

b.将步骤a得到的初始肝干细胞加入所述肝干细胞培养基中，调节细胞浓度为5×10⁶个/ml，接种到培养瓶中，于36.5℃、5％CO₂的潮湿空气条件中培养，每隔4天换新鲜培养基，15天后收获细胞，得到原代肝干细胞；

c.当细胞生长到密度90％时，采用胰酶消化法收集原代肝干细胞，并按照5×10⁵的密度加入所述肝干细胞培养基，接种于明胶包被的培养皿中，并向培养液中加入1g/L的二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯，缓慢送气混合均匀，于37℃、5％CO₂的潮湿空气的条件下培养5-7天，每隔天换新鲜培养基并缓慢送气混合均匀，收获后得到传代肝干细胞。

6.如权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述步骤b的培养方法中，第1-4天的所述肝干细胞培养基中加有3％新生牛血清；第5-12天的所述肝干细胞培养基中加有5％羊血清。

7.如权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述步骤b培养过程中PH值保持7.4-7.6，步骤c培养过程中PH值保持7.2-7.4，所诉PH值由2M的NaOH调节。

8.如权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述培养皿的包被方法为：采用0.5％浓度的明胶去离子水溶液，37℃包被4h，吸弃溶液后加入含有5％双抗的PBS缓冲液冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍，吹干即得所述明胶包被培养皿。

9.如权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述步骤c收获肝干细胞的方法为：加入PH为7.3的含有0.04％胶原酶I和0.6mg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂的DMEM/F12培养液于37℃恒温消化7-9min，轻轻吹打后静置，待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯沉降后，分离上层液体；向沉淀物中加入含有0.25％胰酶的无Ca⁺和Mg⁺离子的PBS溶液，37℃温育15-20min，每隔2min搅拌一次，静置待二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯再次沉淀后，分离上层液体并与前一次上层液体合并，离心弃上清液，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，再次离心弃上清液，冻存备用。

10.一种权利要求2所述的肝干细胞注射液在制备治疗糖尿病的药物中的应用。