CN112522178A - 一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法 - Google Patents

一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法。本发明所述的方法通过在合适的细胞培养和传代的时机进行培养基的更替，细胞增殖速度明显提高，细胞均为典型的上皮样形态。在更替培养基后，细胞度过增殖瓶颈期，继续培养至细胞稳定期恢复原培养基，细胞形态维持不变，细胞仍继续增殖。本发明的技术方案有利于帮助细胞度过增殖瓶颈期。所述方法获得的肝细胞具有典型的肝前体细胞的特征，通过去分化为肝前体细胞来实现成熟肝细胞的体外增殖，进而实现成熟肝细胞的体外长期培养，可至少培养至第30代。本发明为肝细胞移植提供足够数量的供体肝细胞提供了新的途径。

Description

一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法。
背景技术
由病毒持续感染、长期酗酒、胆汁淤积、严重脂肪肝、自身免疫性肝病或遗传代谢疾病等导致的终末期肝病，在临床上具有病情严重、进展迅速、病死率高等特征。据不完全统计，全球每年终末期肝病新增例数约600万，死亡约100万例，其中中国死亡超过30余万例。中国是肝病大国，与病毒性肝炎相关的肝硬化、肝癌等发病率和死亡率居世界之首，由此造成的劳动力丧失和巨大的医疗负担不可估量，严重威胁国家的经济和社会发展。原位肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但原位肝移植的应用由于高成本和健康供体器官的数量短缺而受到限制。在中国，每年等待肝移植的30万患者中，只有约3000人能够有幸获得移植。而且，免疫抑制相关的并发症阻碍了患者的长期生存。因此，对于那些不能及时获得供体肝脏的急性肝衰竭和终末期肝病患者，有必要寻找新的治疗方法。
肝实质细胞拥有很强的再生能力，肝损伤后数周可以通过细胞增殖再生肝脏。研究表明，成熟肝细胞能在12次连续移植的过程中至少增殖和分裂130次而没有衰减。因此，肝细胞移植可作为一种有前景的替代治疗来代替原位肝移植。肝细胞移植已被证实可以治疗肝脏功能衰竭或为肝衰竭患者赢得肝移植的时间窗口。此外，肝细胞移植在遗传性代谢性肝病中的治疗效果已被证实，例如鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征、酪氨酸血症I型、Ia和Ib型糖原贮存病等。肝细胞移植比原位肝移植有几个优点：(1)一个供肝脏可用于多个患者的治疗；(2)手术侵入性小，可反复进行；(3)供肝来源的肝细胞可长期冷冻保存；(4)移植即使失败不会立即危及生命；(5)自体肝脏得以保留，以防细胞移植失败，并可让急性肝功能衰竭病人有机会实现肝脏再生；(6)无需终生接受免疫抑制治疗。此外，肝细胞移植可以在一定程度上缓解患者在等待肝源过程中的死亡风险，减轻免疫排斥反应，降低患者死亡率。然而，人类肝细胞的应用也受限于供体肝脏的短缺。因此，研究移植肝细胞的可用和可再生来源是非常有必要和迫切的。
成熟肝细胞在体外的增殖能力有限，因此肝干细胞成为可行的用于提供足够数量供体细胞的来源。肝干细胞(LSCs)被定义为能够自我更新和分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的一类细胞。经典观点认为LSCs是高度增殖的祖细胞，它们可以分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞。急性和慢性肝损伤后LSCs表现出增殖潜能。一些研究发现胆管相关的干细胞能够持续再生肝细胞和胆管上皮细胞，而且它们还能维持肝实质细胞的更新。当发生严重肝损伤时，机体固有的LSCs被激活，并从门静脉周围区域延伸到中心周围区域，发生代表肝再生的胆管反应。LSCs由一群增殖的异质细胞组成，部分细胞表达胆管上皮细胞特异性标志物如CK19和OV6，部分表达不成熟的胎肝细胞特异性标志物如AFP，还有些表达干细胞标志物如Sox9、CD34、C-kit、Sca-1和CD90，部分还表达NCAM、CD133和EpCAM等。研究表明，移植后LSCs的植入和肝脏再生效率低于成熟肝细胞。近年已有不少研究报道，不同于肝再生取决于肝干细胞理论的描述，肝再生中所有新生的肝细胞更可能是来源于本身既存的成熟肝细胞。他们证实成年肝脏中肝细胞更新和再生的主要来源是成熟肝细胞，而非LSCs。这些数据表明，在生理状态及肝损伤情况下，肝脏的更新和修复主要是通过成熟肝细胞进行的。因此，肝干细胞在肝脏的更新和修复中的作用争议较大，且正常肝脏中肝干细胞的数量极少，正常肝脏实质细胞中仅有约0.3～0.7％为肝干细胞，直接获取也比较困难，直接作为临床中细胞移植的可再生来源也是备受争议的。
同时，原代肝细胞具有最佳的肝细胞功能，是肝细胞移植细胞来源的最优选择。然而，原代肝细胞的体外培养极其困难，短时间内肝细胞形态就会改变，肝细胞功能急剧降低甚至完全丢失，进而发生细胞衰老和死亡。多年来全世界研究者都在努力试图攻克这一难题，然而一直未能得以有效解决。研究表明肝细胞在体内可转化为胆管样前体细胞来逃避损伤，这些细胞在损伤因素减轻后又可重新分化为肝细胞来修复肝脏，提示肝细胞可向肝前体样细胞转化。细胞重编程可以使分化成熟的细胞在特定条件下去分化为未成熟的更原始细胞。因此，通过诱导成熟肝细胞去分化为肝前体细胞是为肝细胞移植提供充足细胞来源的很有前景的方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法。
本发明的目的还在于提供一种用于体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞的试剂组合或试剂盒，以及提供所述试剂组合或试剂盒的用途。
在本发明的第一方面，提供一种体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞的方法，包括：以原代肝细胞为出发细胞进行传代培养；在原代培养至传代第3～4代时，以培养基A进行培养；在培养的第3～4代后，以培养基B进行培养；其中，所述培养基A包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、N2添加物、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸；所述培养基B包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、血清、N2添加物、B27添加物。
在一个优选例中，所述的血清为胎牛血清。
在另一优选例中，所述基础培养基包括选自：Advanced DMEM/F12、低糖(葡萄糖浓度是1.0g/L)DMEM、高糖(葡萄糖浓度是4.5g/L)DMEM；较佳地，所述低糖为葡萄糖浓度0.5～1.5g/L(如1±0.2g/L)；较佳地，所述高糖为葡萄糖浓度3.5～6g/L(如4±0.5g/L或4±0.2g/L)。
在另一优选例中，所述培养基A中，添加组分包括：
Figure BDA0002803708260000031
Figure BDA0002803708260000041
在另一优选例中，所述培养基B中，添加组分包括：
Figure BDA0002803708260000042
在另一优选例中，所述的培养基A含有1×抗青霉素-链霉素。
在另一优选例中，所述的培养基B含有1×抗青霉素-链霉素-抗真菌素。
在另一优选例中，使用培养基A培养时，以Gelatin包被培养板，使用培养基B培养时，以Matrigel包被培养板。
在另一优选例中，所述细胞的增殖速度为1天增长1～2倍。
在另一优选例中，所述细胞的倍增时间为12～24小时。
在另一优选例中，所述方法获得的细胞形态均一；较佳的所述细胞形态为大小均一的典型“铺路石样”上皮形态和较高的核质比(为肝前体细胞的特征之一)。
在另一优选例中，所述方法获得的细胞为传代1～30代的细胞。
在另一优选例中，所述细胞从原代肝细胞起始，培养后去分化为肝前体细胞；较佳地，其高表达肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM，低或常规表达成熟肝细胞标志物ALB和HNF4A。
在本发明的另一方面，提供一种用于体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞的试剂盒，其中包括：培养基A和培养基B；其中，所述培养基A包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A83-01、N2添加物、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸；所述培养基B包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、胎牛血清、N2添加物、B27添加物。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、从原代培养开始，利用培养基A组进行培养，细胞在不同传代代数的增殖情况。利用培养基A组进行培养，从原代培养开始，细胞数量逐渐减少，形态逐渐变成各种不规则的形状，无肉眼可见的增殖，培养至传代4代后，细胞逐渐全部凋亡，无法继续传代。表明此时的细胞进入增殖瓶颈期，无法度过即逐渐凋亡。原代培养第1天：P0 Day 1；第1代培养第1天：P1 1:2 Day 1(1:2是指1:2传代，1瓶细胞接种到2个等体积的细胞培养瓶内，后同)；第2代培养第1天：P2 1:2 Day 1；第3代培养第1天：P3 1:2 Day 1；第4代培养第1天：P4 1:2Day 1；其中5×表示显微镜放大50倍，10×表示显微镜放大100倍；后同。
图2、从原代培养开始，利用培养基A组进行培养；在第4代时，更换培养基B组后细胞在不同传代代数的增殖情况。同时，以第4代时不替换培养基B组的细胞作为对照。在第4代更换培养基B组后，原先濒临凋亡的细胞状态明显好转，肉眼可见的增殖明显，倍增速度明显加快，倍增时间明显缩短。而且至传代30代后，细胞形态仍保持均一，类似肝前体细胞的上皮样形态，细胞倍增时间为12～24小时。在多次的重复试验中，发现原代肝细胞在培养基A组中最多可传代至4代，若不更换培养基B组，培养数天后细胞慢慢的几乎全部死亡，无法传到第5代。第4代当原代肝细胞在培养基A组中进入生长瓶颈期前更换培养基B组，可促进细胞度过生长瓶颈期，实现良好地继续增殖。其中5×表示显微镜放大50倍，10×表示显微镜放大100倍，20×表示显微镜放大200倍。
图3、从原代培养开始，利用培养基A组进行培养；在第4代时，换用培养基B组，继续培养至细胞稳定期(第7～8代)后恢复由培养基A组进行培养，细胞在不同传代代数的增殖情况。在第7代及后续培养中，细胞形态维持不变，细胞继续增殖，细胞倍增时间为48～72小时。表明更换培养基B组的作用更倾向于帮助细胞度过早期的增殖瓶颈期，并获得显著加快的细胞增殖速度；在添加胎牛血清后经过若干代培养后再撤去血清，可以实现细胞继续稳定增殖，可长期培养传代30代。其中10×表示显微镜放大100倍。
图4、不同类型胶包被的培养板对细胞增殖和形态的作用分析。分别使用0.2％Gelatin包被培养板，培养基A组培养；Matrigel胶包被培养板，培养基A组培养；Matrigel胶包被培养板，培养基B组培养，比较0.2％Gelatin和Matrigel胶包被培养板对细胞增殖和形态的作用。0.2％Gelatin包被培养板，培养基A组培养，细胞形态逐渐拉伸为各种不规则形状，传代后细胞数量明显变少，无肉眼可见的增殖，细胞逐渐凋亡；Matrigel胶包被培养板，培养基A组培养，细胞形态好于0.2％Gelatin包被培养板组，细胞并无明显拉伸的不规则形状，但细胞仍有部分凋亡；Matrigel胶包被培养板，培养基B组培养，细胞增殖明显，无细胞凋亡，形态均一，均为典型的上皮样形态。表明使用Matrigel胶包被培养板能为肝细胞提供更适合的生长环境。其中10×表示显微镜放大100倍。
图5、添加不同浓度的胎牛血清，对细胞增殖和形态的作用不同。所述培养基中添加不同浓度的胎牛血清，对细胞增殖和形态的作用不同。不添加血清时，细胞形态逐渐拉伸为不规则形态，快速凋亡；添加1％胎牛血清时，几乎无细胞增殖，细胞形态仍逐渐拉伸为不规则形态，逐渐凋亡；添加2.5％胎牛血清时，肉眼可见的细胞开始增殖，部分细胞的形态也逐渐由不规则形态转变为上皮样形态；添加5％胎牛血清时，细胞开始明显增殖，大部分细胞的形态均为上皮样形态，无明显的不规则形态细胞，可见5％胎牛血清显著促进细胞增殖；添加10％胎牛血清后细胞增殖最快，形态均一，几乎所有细胞均类似肝前体细胞的上皮样形态。其中5×表示显微镜放大50倍。
图6、原代培养时添加血清对细胞增殖和形态的作用分析。从原代起即以培养基B组进行培养，结果发现，原代添加血清时，细胞增殖没有第4代添加时明显，细胞形态差异不明显。提示由于原代培养时细胞还未完全去分化为肝前体细胞。初始培养时细胞形态变化不大，增殖比较缓慢。其中10×表示显微镜放大100倍。
图7、选取不同代数的细胞进行冻存后再复苏后的显微照片。利用前述培养基A组更换(第4代时更换)培养基B组的方案(培养基A+B组)，培养细胞，取不同培养代数(5、7、12代)的细胞进行低温冻存和再复苏培养，显微镜下对复苏后培养的细胞进行拍照，选取不同视野和目镜，观察复苏后细胞的活性、增殖速度和细胞形态。发现冻存后再复苏的细胞，细胞活性、形态和增殖速度不受影响。其中5×表示显微镜放大50倍，10×表示显微镜放大100倍。
图8、培养基B组培养的细胞从成熟肝细胞去分化为肝前体细胞的免疫细胞化学染色检测分析。对培养基A组更换(第4代时更换)培养基B组的方案(培养基A+B组)所培养的肝细胞的表面标志物进行检测，检测原代、第1和2代细胞的成熟肝细胞标志物和肝前体细胞标志物的表达和分布。结果显示，培养基A+B组所培养的细胞，成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达明显下调，肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM表达明显上调，表明培养后成熟肝细胞已经去分化为肝前体细胞(培养至第1代发生去分化)。
图9、培养基A+B组和培养基A组培养的细胞从成熟肝细胞去分化为肝前体细胞的免疫细胞化学染色检测分析。如图9所示，培养基A+B组培养的细胞与培养基A组培养的细胞相比，成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达无明显差异，但肝前体细胞标志物CK19和EpCAM差异较大，培养基A+B组的表达量明显高于培养基A组，表明培养基A+B组可能促进成熟肝细胞向肝前体细胞去分化。
图10、培养基B组培养的肝前体细胞再分化为成熟肝细胞的免疫细胞化学染色检测分析。对利用培养基A组更换培养基B组的方案(培养基A+B组)所培养的细胞中成熟肝细胞和肝前体细胞标志物的表达和分布进行免疫细胞化学染色检测，第4代的细胞生长至90％以上的密度时，进行分化培养21天。如图10所示，培养基A+B组培养的细胞，往成熟肝细胞方向分化后，成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达明显上调，肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM表达明显下调，表明肝前体细胞分化培养后可以分化为成熟肝细胞，此为肝前体细胞的特性之一，更佐证了本发明的培养方案可使成熟肝细胞去分化为肝前体细胞。
具体实施方式
针对现有技术中难于体外长期培养成熟肝细胞的问题，本发明人经过深入的研究，揭示了一种体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法。本发明所述的方法通过在合适的细胞培养和传代的时机，进行培养基的更替，来实现成熟肝细胞的长期培养。本发明获得的肝细胞具有典型的肝前体细胞的特征。本发明为肝脏细胞移植提供足够数量供体肝细胞提供了新的途径。
如本发明所用，所述的“长期培养和扩增”是指肝细胞(如原代肝细胞)经过多代培养，使肝细胞在多代后维持典型的成熟肝细胞或肝前体细胞特征和活性。所述的“长期”例如维持5代以上、10代以上、15代以上、20代以上、25代以上或30代以上。在持续的传代过程中，所述的肝细胞的数量大大增加。
如本发明所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
本发明提供了一种可在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法，通过在适当的培养阶段进行培养基的调整(更换)，促使细胞度过增殖瓶颈期。更具体的，本发明的方法包括：以初始的成熟肝细胞(如原代肝细胞)为出发细胞进行传代培养；在培养至传代第3～4代时，以培养基A进行培养；在培养的第3～4代后，以培养基B进行培养。
本发明人经过多次重复试验发现，在不运用本发明的培养基更换策略的情况下，细胞无法度过增殖的瓶颈期，原代培养至多不超过P4代，细胞几乎不增殖并在短时间内凋亡。本发明优化了调整培养基的最佳时间节点，即原代培养至P4代时添加，帮助度过细胞增殖的瓶颈期，后续可持续培养至P30代或更多的代数。
本发明中，初始的成熟肝细胞可以是来自个体分离出的原代肝细胞，可以是本领域在先技术已经分离、冻存或商业化的成熟肝细胞，或为已经过一定培养/改造(如基因工程改造)的成熟肝细胞。
本发明人优化了适用于本发明的培养策略的培养基。根据细胞扩增和传代的不同阶段，提供适合于不同阶段的培养基。
本发明所述的培养基A包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、N2添加物、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸。
本发明所述的培养基B包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、胎牛血清、N2添加物、B27添加物。
上述各组分以适合的时机培养肝细胞中，可为肝细胞提供适合的环境，克服其传代过程中的瓶颈。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基A的各组分的用量如表1所示。
表1
Figure BDA0002803708260000091
Figure BDA0002803708260000101
表1配方的组分被溶于细胞培养基(基础培养基)中，得到所述的培养基A，从而为前期的细胞培养提供适宜的环境。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基B的各组分的用量如表2所示。
表2
组分 含量 用量举例 优选量
EGF 15～25ng/ml 16、18、20、22ng/ml 19～21ng/ml
HGF 15～25ng/ml 16、18、20、22ng/ml 19～21ng/ml
CHIR-99021 2～4μM 2.5、3、3.5μM 2.8～3.2ng/ml
Y-27632 7～12μM 8、9、10、11μM 9～11μM
鞘氨醇磷酸盐S1P 0.7～2μM 0.8、0.9、1、1.2、1.5μM 0.8～1.2μM
LPA 3～7μM 4、5、6μM 4.5～5.5μM
A 83-01 0.7～2μM 0.8、1、1.2、1.5μM 0.8～1.2μM
胎牛血清 5～12％ 6、7、8、9、10、11％ 5～10％
N2添加物 0.5±0.1× 0.5× 0.5×
B27添加物 0.5±0.1× 0.5× 0.5×
表2配方的组分被溶于细胞培养基(基础培养基)中，得到所述的培养基B，从而为肝细胞的可持续生长提供了优选的生长环境。
本发明中，上述用于配制培养基的各种组分，均是本领域技术人员易于获得的，例如可通过商业途径购买，或可通过人工合成或重组表达获得。应理解，尽管单独的组分为本领域已知的，然而它们之间的不同组合、或以不同用量来进行组合时，所能实现的技术效果是显著不同的，尤其是对于体外培养较为困难的成熟肝细胞而言尤是如此。
本发明中，所述的基础培养基可以为本领域可商业购买的培养基，或可以为实验室自行配制的基础培养基。所述基础培养基可以包括选自：Advanced DMEM/F12、低糖(葡萄糖浓度0.5～1.5g/L)DMEM、高糖(葡萄糖浓度3.5～6g/L)DMEM。应理解，本领域技术人员熟悉所述的基础细胞培养基或无血清培养基的配制或购买途径，因此，基础细胞培养基或无血清培养基并不限于本发明中所举例的这些。
本发明的培养策略，在培养过程中，初始的成熟肝细胞可被去分化为肝前体细胞，可在体外快速增殖从而维持良好的扩增，可以在体外稳定扩增30余代而基本保持细胞形态不变，细胞形态维持均一。而该方法扩增获得的细胞，在体外可以进一步向下游分化为成熟肝细胞，并在移植入个体受损肝脏后可以再生损伤肝脏，此为肝前体细胞的特性，进一步证实初始的成熟肝细胞在本发明的培养方法中已被去分化为肝前体细胞。成熟肝细胞去分化为具有肝向分化潜能并可以扩增的肝前体细胞，为临床中肝细胞移植提供足够数量供体肝细胞提供了一条途径，为肝病的临床细胞治疗的一种很有前景的方案。
本发明还表明，运用本发明的培养基更换策略后，细胞增殖速度明显加快、倍增时间明显缩短，度过增殖的瓶颈期后，培养数代至细胞状态稳定后撤掉血清，细胞形态基本保持不变，增殖速度较之前有所减慢，表明调整培养基不仅帮助细胞度过早期的增殖瓶颈期，而且可明显加快细胞增殖速度。
培养基中胎牛血清的用量对细胞增殖和形态的作用不同，其中不添加血清、添加1％和2.5％的胎牛血清作用非常微弱，无法促进细胞增殖，细胞逐渐凋亡；添加5％胎牛血清的效果较好，肉眼可见地可促进细胞增殖；添加10％胎牛血清后细胞增殖效果相对最为理想。因此，作为本发明的优选方式，所述的胎牛血清的用量在5～10％。作为本发明的优选方式，应用于本发明的胎牛血清为Ausbian血清。
本发明还表明，运用本发明的培养基更换策略可促进成熟肝细胞加快去分化为肝前体细胞。由此，本发明提供了一种为细胞移植提供足够数量供体肝细胞的新方法。通过诱导成熟肝细胞去分化为肝前体细胞是为肝细胞移植提供充足细胞来源的很有前景的方案。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
培养基
本发明涉及的培养基包括培养基A和培养基B，如表3。
表3
Figure BDA0002803708260000121
后续实验中，主要设置培养基A组与培养基B组。与培养基A组相比，培养基B组中添加了胎牛血清(购自上海威正翔禹生物有限公司，Ausbian血清，货号VS500T)；把0.2％Gelatin包被培养板更换为Matrigel胶包被培养板；把N2添加物(1×)和胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸(1×)更换为N2添加物(0.5×)和B27添加物(0.5×)；1×抗青霉素-链霉素(双抗)更换为1×三抗，除抗细菌污染外还可以抗真菌污染，原代培养时使用5×，减少各种细胞污染的可能性。
实施例1、成熟肝细胞进入增殖瓶颈期的发现以及解决方案探索
初始细胞来源于8～10周大小的C57BL/6J野生型雄性小鼠(购自南京模式生物有限公司)，处理方法为两步酶消化法，具体操作步骤如下：
1.三种灌流液于37℃水浴锅中预热；
2.将输液管固定在蠕动泵中，一端置于溶液I液面下，另一端接上针头，打开蠕动泵，调节转速为8～12ml/min，使液体充盈管道；
3.小鼠麻醉，腹腔注射6mg/ml戊巴比妥(10ul/g体重)；
4.小鼠麻醉后将四肢固定在泡沫垫上，泡沫垫下面放置托盘。由腹下部至颈部纵向剪开腹侧皮毛，将皮毛固定于左右两侧。由腹下部横向剪开腹腔壁，沿身体左右两侧向上剪开至颈部下(中间要剪断隔膜和肋骨)，将腹腔壁固定于头部右侧，充分暴露心脏和肝脏，用棉棒拨开腹部脂肪和小肠，暴露下腔静脉和肝门静脉；
5.将针头由心窦刺入上腔静脉(不刺破上腔静脉)，打开蠕动泵电源，即可见肝脏，下腔静脉和肝门静脉充盈鼓起，剪断肝门静脉，用止血钳夹住下腔静脉，开始灌流；
6.溶液I灌流50～100ml，肝脏不见血色后换溶液II。溶液II灌流50～100ml，后换溶液III(换灌流液时暂停蠕动泵)；
7.溶液III灌流100ml，至肝脏组织具有一定流动性，表皮与肝实质脱离时止；
8.关掉蠕动泵，拔出针头，将肝脏剪下，置于6cm Dish中，加入2ml细胞培养基，用黄枪头挤压肝脏，将肝细胞挤出，弃掉肝表皮；
9.将肝细胞悬液加入10ml培养基，吹打使细胞散开，转移入离心管中，1000rpm，5min，弃上清；
10.9ml percoll+1ml 10×EBSS+10ml DMEM混匀，将沉淀下来的肝细胞悬起，1000rpm，5min，弃上清；
11.细胞如有团块，用Sterile cell strainer nylon mesh(70micron)过滤，用培养基将细胞悬起，转移到0.2％Gelatin/Matrigel胶包被的培养板里培养。
0.2％Gelatin包被培养板方法如下：称取1g Gelatin粉末(购自Sigma，货号V900863-100g)溶于蒸馏水，高压灭菌后，置于4℃冰箱可短期使用。使用时用预冷的PBS 1:10稀释成0.2％Gelatin使用溶液，0.1mL/cm2均匀包被培养板，37℃培养箱中静置半小时后弃上清，低糖DMEM(葡萄糖浓度1.0g/L)漂洗1次后更换培养基A组。
Matrigel胶包被培养板方法如下：Matrigel基底胶(购自Corning，货号356234)小分量分装后，待在冰上融化后用预冷的基础培养基按照1:40稀释，0.1mL/cm2均匀包被培养板，37℃培养箱中静置半小时后弃上清，低糖DMEM(葡萄糖浓度1.0g/L)漂洗1次后更换培养基B组。
原代小鼠肝细胞用培养基(基础培养基加10％胎牛血清和5×三抗)悬浮后，转移到Matrigel胶包被的培养板里，37℃培养箱中静置2小时，待细胞基本贴壁后用低糖DMEM(葡萄糖浓度1.0g/L)漂洗，换培养基A组培养，过夜后再次换液，更换新的培养基A组，以后每2天换一次液。约10～15天后，待细胞密度长到90％左右时，低糖DMEM(葡萄糖浓度1.0g/L)漂洗2次后弃上清，加入预热的Acctuase酶(1×，0.1mL/cm2)消化细胞进行传代，37℃培养箱中静置数分钟，显微镜下观察细胞消化状态，待细胞皱缩变松散，部分细胞开始漂浮时(约3～5分钟)，加入高糖DMEM(葡萄糖浓度4.5g/L)加10％胎牛血清和1×抗青霉素-链霉素-抗真菌素终止消化，重悬细胞液转移至15mL离心管，70g 5分钟，弃上清，沉淀用培养基A组重悬，细胞1:2转移至新的包被培养板继续培养，约7～15天需传代(每一代传代时间根据传代时种植的细胞密度和细胞增殖速度而定)。在第4代时，换用培养基B组，消化方法相同，时间要稍微长一点，约6～10分钟，显微镜下观察细胞消化状态，及时终止消化，重悬细胞液转移至15mL离心管，70g 5分钟，弃上清，沉淀用培养基B组重悬，细胞1:2甚至更高比例(1:4)转移至新的包被培养板继续培养，约3～4天需传代。传代剩余的细胞沉淀用干细胞冻存液重悬，置于-80℃一天后转移至液氮罐里长期储存。
显微镜下对培养基A组中培养、在培养基A组培养若干代后换培养基B组培养的细胞进行拍照，选取不同视野和目镜，观察细胞增殖速度和细胞形态。
利用培养基A组进行培养，如图1，从原代培养开始，细胞逐渐减少，形态逐渐变成各种不规则的形状，无肉眼可见的增殖，培养基A组培养至至多传代4代后，逐渐全部凋亡，无法继续传代。说明此时的细胞进入增殖瓶颈期，无法度过即逐渐凋亡。
从原代培养开始，利用培养基A组进行培养；在第4代时，换用培养基B组，结果如图2。在第4代替换培养基后，原先濒临凋亡的细胞状态明显好转，增殖明显，倍增速度明显加快，倍增时间明显缩短。令人意外地是：至传代30代后，细胞形态仍保持均一，类似肝前体细胞的上皮样形态，细胞倍增时间为12～24小时。这一结果提示，在培养若干代后，进行培养基的替换，可以促进细胞改善状态并快速增殖。
在多次的重复试验中，发明人发现，原代肝细胞在培养基A组中最多可传代至4代，若不更换培养基B组，培养数天后细胞慢慢的几乎全部死亡，无法撑到传第5代。第4代时更换，在原代肝细胞在培养基A组中进入生长瓶颈期时更换培养基B组，促进细胞度过生长瓶颈期，可实现良好地继续增殖。
发明人也测试了从原代起即以培养基B组进行培养。结果发现，原代添加血清时，细胞增殖没有第4代添加时明显，细胞形态差异不明显，如图6。该结果提示：这是由于原代培养时细胞还未完全去分化为肝前体细胞，初始培养时细胞形态变化不太大，增殖比较缓慢。
进一步地，本发明人研究了从原代培养开始利用培养基A组进行培养，在第4代时，换用培养基B组，培养至细胞状态稳定后(第7～8代)，恢复由培养基A组进行培养，结果如图3。根据图3，在第7代及后续培养中，细胞形态维持不变，细胞也仍继续增殖，细胞倍增时间为48～72小时。说明更换培养基B组在培养体系中的作用更倾向于帮助细胞度过早期的增殖瓶颈期，以及显著加快细胞增殖速度；在添加胎牛血清后经过若干代培养后再撤去血清，可以实现细胞继续地稳定增殖。
同时，原代细胞培养时，使用常用包被孔板的0.2％Gelatin包被培养板，利用培养基A组进行培养；此后在第2～4代沿用0.2％Gelatin包被培养板，在第4代观测细胞生长。如图4，细胞形态逐渐拉伸成不规则的形状，传代后细胞数量变少，无肉眼可见的增殖，细胞逐渐死亡。更换使用Matrigel胶包被培养板，利用培养基B组进行培养，细胞增殖明显，形态均一，均为典型的上皮样形态。说明使用Matrigel胶包被培养板能为肝细胞提供更适合的生长环境。
根据上述，利用培养基A组进行培养，细胞数量逐渐减少，形态逐渐变成各种不规则的形状，无肉眼可见的增殖，至多传代4代后，逐渐全部凋亡，无法继续传代。说明此时的细胞进入增殖瓶颈期，无法度过即逐渐凋亡。在若干代后更换培养基B组，原先濒临凋亡的细胞状态明显好转，增殖明显，倍增速度明显加快，倍增时间明显缩短。至传代30代后细胞形态仍保持均一，类肝前体细胞的上皮样形态。提示在适当时机更换培养基，可以促进细胞改善状态并快速增殖。
实施例2、培养基中添加不同浓度的胎牛血清的分析
对培养基A组更换培养基B组的方案，进行不同浓度胎牛血清的作用分析。如图5所示，所述培养基中添加不同浓度的胎牛血清，对细胞增殖和形态的作用不同，不添加胎牛血清时，细胞形态逐渐拉伸为不规则形，快速凋亡；添加1％胎牛血清时，无细胞增殖，细胞形态仍逐渐拉伸为不规则形，逐渐凋亡；添加2.5％胎牛血清时，细胞开始增殖，部分细胞的形态也逐渐由不规则形转变为上皮样形态；添加5％胎牛血清时，细胞开始明显增殖，大部分细胞的形态均为上皮样形态，无明显的不规则形态细胞，可见5％胎牛血清显著促进细胞增殖；添加10％胎牛血清后细胞增殖最快，形态均一，几乎所有细胞均类似肝前体细胞的上皮样形态，效果相对最为理想，故后续的实施例中培养基B组优选例选择添加10％胎牛血清。
因此，不同浓度的胎牛血清对细胞增殖的作用不同。
实施例3、本发明培养的细胞可脱离体外完全不增殖的成熟肝细胞
利用前述培养基A组更换(第4代时更换)培养基B组的方案(培养基A+B组)，培养细胞，取不同培养代数(5、7、12代)的细胞进行超低温冻存和再复苏培养，显微镜下对复苏后培养的细胞进行拍照，选取不同视野和目镜，观察复苏后细胞的活性、增殖速度和细胞形态。
如图7所示，选取不同代数的细胞进行冻存后再复苏，细胞活性、形态和增殖速度不受影响。表明本发明培养的细胞可脱离体外完全不增殖的成熟肝细胞，接近于可持续增殖的细胞系。
实施例4、本发明的培养方案可使成熟肝细胞去分化为肝前体细胞
本实施例中，对不同传代时期所培养的肝细胞的表面标志物进行检测，包括检测成熟肝细胞标志物和肝前体细胞标志物的表达和分布，探索成熟肝细胞何时去分化为肝前体细胞。运用免疫细胞化学染色检测，步骤如下(采用的是原代、传代第1和2代的细胞)：
细胞经过铺片，4％PFA固定，0.3％的Triton X-100破膜(表面抗原无需破膜)，10％山羊血清封闭，依次加入相应的一抗4℃过夜和二抗，DAPI复染细胞核，抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察。
如图8所示，免疫荧光表明，与原代肝细胞相比，传代第1代时的细胞，成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达较原代肝细胞已明显下调，肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM较原代肝细胞明显上调，表明培养后传代第1代时成熟肝细胞已经去分化为肝前体细胞。
实施例5、本发明的培养方案可促进成熟肝细胞向肝前体细胞去分化
对利用培养基A组更换培养基B组的方案(培养基A+B组)所培养的细胞中的成熟肝细胞和肝前体细胞标志物的表达和分布进行了免疫细胞化学染色检测，步骤如下：
细胞(传代第1和5代的细胞)经过铺片，4％PFA固定，0.3％的Triton X-100破膜(表面抗原无需破膜)，10％山羊血清封闭，依次入相应的一抗4℃过夜和二抗，DAPI复染细胞核，抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察。
结果如图9所示，免疫荧光表明，培养基A+B组培养的细胞与培养基A组培养的细胞相比，成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达无明显差异，但肝前体细胞标志物CK19和EpCAM差异较大，培养基A+B组的表达量明显高于培养基A组，表明培养基A+B组可能促进成熟肝细胞向肝前体细胞去分化。
实施例6、本发明的培养方案中去分化后的肝前体细胞可以向下游分化为成熟肝细胞
对利用培养基A组更换培养基B组的方案(培养基A+B组)所培养的细胞中成熟肝细胞和肝前体细胞标志物的表达和分布进行免疫细胞化学染色检测，步骤如下：
传代第4代的细胞生长至90％以上的密度时，进行分化培养：将培养基更换分化培养基(Advanced DMEM/F12，0.5×N2添加物，0.5×B27添加物，10uM DAPT，20ng/mL OSM，10uM Dexamethasone，10uM SB431542)，第1次更换时为分化第1天，以后每2天换液(分化过程中不需传代)。
经上述分化培养的细胞进行铺片，4％PFA固定，0.3％的Triton X-100破膜(表面抗原无需破膜)，10％山羊血清封闭，依次入相应的一抗4℃过夜和二抗，DAPI复染细胞核，抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察。
如图10所示，免疫荧光表明，培养基A+B组培养的细胞，往成熟肝细胞方向分化21天后，与未分化组相比，分化后的细胞中成熟肝细胞的标志物ALB和HNF4A表达明显上调，肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM表达明显下调，表明肝前体细胞分化培养后可以往下游分化为成熟肝细胞，此为肝前体细胞的特性之一，更佐证了本发明的培养方案可使成熟肝细胞去分化为肝前体细胞。
2、免疫细胞化学染色
对培养基A+B组培养的细胞中成熟肝细胞和肝前体细胞标志物的表达和分布进行了免疫细胞化学染色检测，步骤如下：
细胞(原代、传代第1、2、4和5代的细胞)经过铺片，4％PFA固定，0.3％的Triton X-100破膜(表面抗原无需破膜)，10％山羊血清封闭，依次加入相应的一抗4℃过夜和二抗，DAPI复染细胞核，抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察。表达成熟肝细胞和肝前体细胞标志物结果数据与实施例4-6的结果相符。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞的方法，包括：以原代肝细胞为出发细胞进行传代培养；在原代培养至传代第3～4代时，以培养基A进行培养；在培养的第3～4代后，以培养基B进行培养；其中，
所述培养基A包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、N2添加物、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸；
所述培养基B包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、血清、N2添加物、B27添加物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血清为胎牛血清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础培养基包括选自：Advanced DMEM/F12、低糖DMEM、高糖DMEM；较佳地，所述低糖为葡萄糖浓度0.5～1.5g/L；较佳地，所述高糖为葡萄糖浓度3.5～6g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基A中，添加组分包括：
Figure FDA0002803708250000011
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基B中，添加组分包括：
Figure FDA0002803708250000021
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用培养基A培养时，以Gelatin包被培养板，使用培养基B培养时，以Matrigel包被培养板。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞的增殖速度为1天增长1～2倍；
所述细胞的倍增时间为12～24小时；
所述方法获得的细胞形态均一；较佳的所述细胞形态为大小均一的典型“铺路石样”上皮形态和较高的核质比；或
所述方法获得的细胞为传代1～30代的细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞从原代肝细胞起始，培养后去分化为肝前体细胞；较佳地，其高表达肝前体细胞标志物CK19、CK7和EpCAM，低或常规表达成熟肝细胞标志物ALB和HNF4A。
9.一种用于体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞的试剂盒，其中包括：培养基A和培养基B；其中，
所述培养基A包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、N2添加物、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸；
所述培养基B包括：基础培养基以及添加组分；所述添加组分包括：EGF、HGF、CHIR-99021、Y-27632、鞘氨醇磷酸盐S1P、LPA、A 83-01、胎牛血清、N2添加物、B27添加物。
10.权利要求9所述的试剂盒的用途，用于体外长期培养和扩增成熟肝细胞和/或肝前体细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115011550A (zh) * 2022-07-14 2022-09-06 广东乾晖生物科技有限公司 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法
CN115040543A (zh) * 2021-03-08 2022-09-13 上海赛立维生物科技有限公司 外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754636A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
CN109890956A (zh) * 2016-10-28 2019-06-14 国立研究开发法人国立癌研究中心 人肝前体细胞的制备方法
CN110904026A (zh) * 2019-11-18 2020-03-24 中国人民解放军第二军医大学 一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用
WO2020056935A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN110982776A (zh) * 2018-09-30 2020-04-10 中国科学院上海生命科学研究院 肝细胞的体外扩增培养方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106754636A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
CN109890956A (zh) * 2016-10-28 2019-06-14 国立研究开发法人国立癌研究中心 人肝前体细胞的制备方法
WO2020056935A1 (zh) * 2018-09-20 2020-03-26 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN110982776A (zh) * 2018-09-30 2020-04-10 中国科学院上海生命科学研究院 肝细胞的体外扩增培养方法及应用
CN110904026A (zh) * 2019-11-18 2020-03-24 中国人民解放军第二军医大学 一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN WU ET AL.: "Reversible transition between hepatocytes and liver progenitors for in vitro hepatocyte expansion", 《CELL RESEARCH》 *
LINJIE LV ET AL.: "Self-Renewal of Hepatoblasts Under Chemically Defined Conditions by Iterative Growth Factor and Chemical Screening", 《HEPATOLOGY》 *
YOHAN KIM ET AL.: "Small molecule-mediated reprogramming of human hepatocytes into bipotent progenitor cells", 《JOURNAL OF HEPATOLOGY 》 *
景宏舒等: "脐带脱细胞支架培养鼠肝前体样细胞功能研究", 《肝脏》 *
陈超 等: "《新技术与精准医学》", 31 December 2017, 上海交通大学出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115040543A (zh) * 2021-03-08 2022-09-13 上海赛立维生物科技有限公司 外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用
CN115011550A (zh) * 2022-07-14 2022-09-06 广东乾晖生物科技有限公司 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法
CN115011550B (zh) * 2022-07-14 2024-04-26 广东乾晖生物科技有限公司 一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法

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