CN115040543A - 外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用。所述应用包括使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本，以及通过所述离体样本考察所述外泌体制剂对肝组织的促再生作用。所述外泌体制剂包含人肝细胞来源外泌体或至少一种人肝细胞来源miRNA作为起效物质，能够有效促进肝细胞增殖。

Description

外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用。
背景技术
急性肝衰竭(Acute Liver Failure,ALF)是一种以广泛性肝细胞坏死，肝功能急性恶化及继发多功能脏器衰竭为特征的疾病，具有高发病率和死亡率。目前，原位肝移植是最有效的治疗手段，但由于供体缺乏，手术禁忌症以及严重并发症等原因导致等待肝移植的患者死亡。因此，寻找治疗急性肝衰竭的有效措施是亟待解决的临床问题。
因此，有必要开发外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，以有效促进肝细胞再生。
为实现上述目的，本发明的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用包括：
使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本；
通过所述离体样本考察所述外泌体制剂对肝组织的促再生作用；
所述外泌体制剂包含人肝细胞来源外泌体或至少一种人肝细胞来源miRNA作为起效物质；
所述外泌体制剂包含人肝细胞来源外泌体或至少一种人肝细胞来源miRNA作为起效物质。
本发明的所述外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用的有益效果在于：由于所述外泌体制剂包含人肝细胞来源外泌体或至少一种人肝细胞来源miRNA作为起效物质，能够有效促进肝细胞增殖。
优选的，所述肝衰竭体内动物模型为四氯化碳诱导的小鼠急性肝衰竭模型。
优选的，所述肝衰竭体内动物模型为乙酰氨基酚诱导的两种小鼠急性肝衰竭模型。
优选的，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：使用稀释剂对所述起效物质进行重悬得到所述外泌体制剂，控制每微升所述外泌体制剂含有1-200微克所述起效物质。
进一步优选的，所述稀释剂为生理盐水、复方电解质溶液和PBS溶液的至少一种。
进一步优选的，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：使用转染增强剂和所述稀释剂对所述起效物质进行重悬得到所述外泌体制剂。
优选的，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：以所述外泌体制剂的质量计，控制对每个所述肝衰竭体内动物模型的注射剂量为0.1微克-100毫克/公斤。
优选的，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：
使用含血清类物质培养基对人原代肝细胞、人肝前体细胞和人肝前体样细胞的任意一种进行体外培养至融合度不低于90％后，使用无血清类物质培养基替换所述含血清类物质培养基后继续体外培养得到培养上清，从所述培养上清中分离出所述起效物质；
所述含血清类物质培养基由所述无血清类物质培养基和血清类物质组成，所述血清类物质占所述含血清类物质培养基的体积含量为1-20％。
所述无血清类物质培养基包含基础培养基、无血清添加物、生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂和TGF-β信号抑制剂。
优选的，以占所述无血清类物质培养基的含量计，所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述无血清添加物的含量为不超过2％。
优选的，所述基础培养基由DMEM/F12细胞培养基、HepX培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种组成。
优选的，所述无血清添加物为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液细胞培养添加物、N2细胞培养营养添加物和B27细胞培养营养添加物的至少一种。
优选的，所述无血清类物质培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
优选的，所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6和抑瘤素的至少一种。
优选的，所述ROCK激酶抑制剂为Fasudil、Y-27632、Thiazovivin和SB-772077-B的至少一种。
优选的，所述Wnt信号通路激动剂为重组Wnt蛋白、重组R-spondin蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂的至少一种。
优选的，所述TGF-β信号抑制剂为RepSox、SB431542和A83-01的至少一种。
附图说明
图1为实施例1的PHH Exo样本的透射电镜照片；
图2为实施例1的Hep Exo样本的透射电镜照片；
图3为实施例1的PHH Exo样本和Hep Exo样本中外泌体平均粒径对比图；
图4为实施例1通过流式分析检测不同细胞来源外泌体的CD63和CD81表达情况对比图；
图5为实施例1通过蛋白质印迹测试考察的不同细胞以及不同细胞来源外泌体的CD63和TSG101的表达情况；
图6为实施例2的PHH Exo样本和Hep Exo样本在标记后、染色后以及共培养后的免疫荧光共聚焦检测结果；
图7为实施例3的Hep Exo治疗组和PBS对照组各小鼠造模完毕后生存率随时间的变化情况；
图8为实施例3的正常对照组、PBS对照组和Hep Exo治疗组小鼠造模后24小时和48小时的肝组织切片HE染色照片；
图9为实施例3的PBS对照组和Hep Exo治疗组小鼠肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图；
图10为实施例3的正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组各小鼠肝脏组织石蜡切片中Ki67阳性细胞百分比对比图；
图11为实施例3的正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组各小鼠在不同时间的ALT水平对比结果；
图12为实施例3的正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组各小鼠在不同时间的AST水平对比结果；
图13为实施例4的不同细胞来源外泌体miRNA测序表达聚类图；
图14为实施例4的原代肝细胞体外转染hsa-miR-182，hsa-miR-183，hsa-miR-149，hsa-miR-215，hsa-miR-574，hsa-miR-654和hsa-miR-675的48小时后使用ELISA检测各转染细胞的BrdU掺入作用对比图；
图15为实施例4的原代肝细胞分别转染hsa-miR-182，hsa-miR-183和hsa-miR-574的48小时后分别进行EdU染色后得到的EdU荧光显微照片；
图16为实施例4的原代肝细胞分别转染hsa-miR-182，hsa-miR-183和hsa-miR-574的48小时后，使用EdU荧光法检测得到的各转染细胞EdU掺入率对比情况；
图17为实施例5的CCl4模型各组小鼠的生存率随时间的变化情况；
图18为实施例5的APAP模型各组小鼠的生存率随时间的变化情况；
图19为实施例5所示的CCl4模型各小鼠造模后不同时间的AST水平对比图；
图20为实施例5所示的CCl4模型各小鼠造模后不同时间的ALT水平对比图；
图21为实施例5的CCl4模型各小鼠的AST水平和ALT水平对比图；
图22为实施例5的CCl4模型各小鼠造模后不同时间的病理组织切片对比图；
图23为实施例5的APAP模型各小鼠造模后24小时的病理组织切片对比图；
图24为实施例5的CCl4-NC agomir组小鼠和CCl4-miRNA 183-5p agomir组小鼠造模完成后不同时间肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图；
图25为实施例5的APAP-NC agomir组和APAP-miRNA 183-5p agomir组小鼠造模完成后24小时的肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图；
图26为实施例5的造模完成后不同时间CCl4-NC agomir组小鼠和CCl4-miRNA183-5p agomir组小鼠肝组织切片的Ki67阳性细胞百分比对比情况示意图；
图27为实施例5的CCl4-miRNA 183-5p agomir组小鼠在造模后不同时间的肝组织细胞周期相关蛋白表达情况对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例提供了肝前体样细胞在肝再生微环境重塑方面的应用，包括：获得肝前体样细胞，或肝前体样细胞的培养分泌物并作用于至少一种肝病适应症的相关细胞，以对所述相关细胞起到调控作用。
一些具体的实施例中，所述肝病适应症为肝衰竭。
本发明实施例中，所述培养分泌物为胞外囊泡和分泌蛋白的至少一种。
一些实施例中，所述胞外囊泡具体为外泌体。所述外泌体为人肝细胞来源的外泌体。
更具体的，所述人肝细胞为人原代肝细胞、人肝前体细胞和人肝前体样细胞的任意一种。
一些实施例中，所述外泌体包含至少一种microRNA(简记为miRNA)，包括miRNA-182、miRNA-183、miRNA-149、miRNA-215、miRNA-574、miRNA-654和miRNA-675的至少一种。所述至少一种miRNA通过加快原代肝细胞由G1期向S期及G2/M期转化的细胞周期进程来促进肝细胞增殖。
本发明实施例提供了一种外泌体制剂，包含稀释剂和所述至少一种miRNA。
一些实施例中，所述外泌体制剂还包含转染增强剂，以提高所述至少一种miRNA的稳定性和作用效率。
一些实施例中，所述稀释剂为生理盐水、复方电解质溶液和PBS溶液的至少一种，使所述外泌体制剂作为注射液使用，每微升所述外泌体制剂含有1-200微克所述外泌体。
本发明实施例还提供了所述外泌体的制备方法，包括：使用含血清类物质培养基对所述人肝细胞培养至融合度不低于90％后，更换无血清类物质培养基继续培养至少24小时并得到培养上清，从所述培养上清中提取所述外泌体。
本发明实施例中，所述含血清类物质培养基由所述无血清类物质培养基和血清组成，所述血清占所述含血清类物质培养基的体积含量为1-20％。
本发明实施例中，所述无血清类物质培养基由基础培养基、营养补充剂、生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂和TGF-β信号抑制剂组成。
一些实施例中，含血清类物质培养基中血清类物质为动物源血清。
一些实施例中，所述动物源血清为胎牛血清。
一些实施例中，所述含血清类物质培养基可以用血清替代物替换。
一些实施例中，所述血清替代物为无动物源成份的血小板及其衍生物。
一些实施例中，所述血清替代物为一磷酸鞘氨酸和吲哚乙酸。
具体的，以占所述无血清类物质培养基的体积计：所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述营养补充剂的含量为0.1-20％。
一些具体的实施例中，所述基础培养基为Hep-X基础培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基、William’s Medium E培养基、Ham’s F-10培养基、Ham’s F-12培养基、IMDM培养基、McCoy’5A培养基、RPMI-1640培养基、BME培养基、M-199Medium培养基和Leibovitz Medium培养基的至少一种。
一些具体的实施例中，所述ROCK激酶抑制剂为Fasudil、Y-27632、Thiazovivin和SB-772077-B的至少一种。
一些具体的实施例中，所述Wnt信号通路激动剂为重组Wnt蛋白、重组R-spondin蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂的至少一种。所述糖原合成酶激酶3β抑制剂为CHIR99021、BIO和TWS119的任意一种。
一些具体的实施例中，所述TGF-β信号抑制剂为RepSox、SB431542和A83-01的至少一种。
一些具体的实施例中，所述营养补充剂为N2、B27和双抗的至少一种。
本发明还提供了所述外泌体制剂在体外培养方面的应用，所述外泌体制剂与原代肝细胞共培养以促进肝细胞增殖。
本发明还提供了所述外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型以促进肝组织再生。
本发明一些实施例中，所述外泌体使用标记物质进行标记，所述标记物质包括PKH67、PKH26、DiO、DiI、DiR、FM 4-64、DiD、萤火虫荧光素酶(Fluc)、GFP-荧光素酶(Gluc)和RFP-荧光素酶(Rluc)的任意一种。
本发明一些实施例中，体内诱导实验使用的回输液注射量按实验动物的体重计，每公斤注射量为0.1微克-100毫克。
本发明各实施例中，如无特别说明，细胞培养均在37摄氏度环境下且二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中进行。
本发明各实施例中涉及统计学分析的数据，每组实验至少重复3次，实验结果数据利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。两组数据间比较使用双尾非配对t检验来计算统计学差异，多组数据间差异的比较使用用ANOVA方差分析计算统计学差异。p<0.05被认为具有统计学差异。
以下通过具体的实施例进行详细说明：
实施例1
本实施例分别以人原代肝细胞(简记为PHHs)和人肝前体样细胞(简记为HepLPCs)作为种子细胞，采用含血清类物质培养基和无血清类物质培养基进行培养后成功分离出粒径100纳米左右，并表达外泌体标志蛋白TSG101、CD63和CD81的外泌体。
本实施例的PHHs购自广州深圳立沃科技有限公司，批号为Lot#201904001；HepLPCs来源于赛立维生物科技有限公司，批号为XLV-19006；Hep-X基础培养基来源于上海源培生物科技有限公司；胎牛血清、1％青霉素-链霉素溶液以及鼠尾胶原均来源于Gibco；肝细胞生长因子HGF来源于近岸生物；上皮细胞生长因子EGF来源于近岸生物；ROCK激酶抑制剂Y-27632来源于陶术生物；Wnt信号通路激动剂CHIR-99021来源于陶术生物；TGF-β信号抑制剂A-8301来源于陶术生物；CD63-FITC和CD81-PE流式抗体均来源于美国BDbioscience。
使用的含血清类物质培养基组成如下：Hep-X基础培养基，以及以占Hep-X基础培养基体积计，含量为1％的N2营养补充剂(100X)，含量为1％的B27营养补充剂(50X)、10％胎牛血清FBS、含量为1％的1％青霉素-链霉素溶液；含量为20ng/mL的肝细胞生长因子HGF，含量为50ng/mL的上皮细胞生长因子EGF，含量为10μM的ROCK激酶抑制剂Y-27632，含量为3μM的Wnt信号通路激动剂CHIR-99021，含量为1μM的TGF-β信号抑制剂A-8301。
使用的无血清类物质培养基组成为所述含血清类物质培养基去除胎牛血清后的组成成分。
上述含血清类物质培养基和无血清类物质培养基使用前均经0.22微米滤器过滤以去除杂质。
本实施例提供了从两种种子细胞中分别获取包含外泌体的沉淀物质的过程，具体为：
以1×105个/平方厘米的接种密度将种子细胞接种于15cm培养皿中，每孔加2毫升含血清类物质培养基培养至细胞融合度不低于95％且生长状态良好，完成扩增培养。所述扩增培养的过程中，每2-3天更换一次含血清类物质培养基。
所述扩增培养完成后，将15cm培养皿中的培养基更换为无血清类物质培养基继续培养48小时后收取培养上清。使用美国System Biosciences公司的外泌体分离试剂盒ExoQuick
Figure BDA0003537424770000101
ULTRA EV Isolation从培养上清中分离出来源于的PHHs的沉淀物质以及来源于HepLPCs的沉淀物质。具体的操作步骤记载于外泌体分离试剂盒附带的说明中，在此不做赘述。
本实施例利用透射电镜、纳米颗粒追踪检测和流式分析对上述两种沉淀物质进行分析。来源于的PHHs的沉淀物质简记为PHH Exo样本，来源于HepLPCs的沉淀物质简记为HepExo样本。
将PHH Exo样本和Hep Exo样本稀释后使用含1％戊二醛，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液固定后滴加在铜网格上，然后使用1％的醋酸铀酰负染，室温干燥后用透射电镜观察拍照，得到图1和图2分别所示的PHH Exo和Hep Exo样本中的透射电镜对比照片，磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
利用德国Particle Metrix的PMX110纳米颗粒跟踪分析仪分别对PHH Exo样本和Hep Exo样本进行分析，得到图3所示的两种样本中颗粒平均粒径对比图。具体的检测和分析方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图1和图2，PHH Exo样本和Hep Exo样本中颗粒直径大小约100纳米，且呈现形态规则的类圆形，进一步的参照图3，PHH Exo样本中颗粒平均粒径为135±9.103nm，HepExo样本中颗粒平均粒径为136.4±4.323nm，符合外泌体的形态特征。
使用PBS溶液对PHH Exo样本和Hep Exo样本分别稀释并混匀后，对一部分用CD63-FITC和CD81-PE流式抗体染色，另一部分未染色的PHH Exo样本和Hep Exo样本作为阴性对照。将上述样本在美国BD bioscience的Accuri C6flow cytomenter进行上机检测，得到图4所述的流式分析结果。具体操作和分析步骤为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
本实施例对经体外培养后得到的两种细胞产物(简记为PHH和Hep)、PHH Exo样本以及Hep Exo样本和培养上清产物通过BCA法进行蛋白定量分析，并进行蛋白质印迹(Western Blotting，WB)测试，得到图5所示的各样品的CD63、CD81、TSG101、EEA1、GRP78和β-actin的表达情况对比照片。其中，对细胞产物进行裂解的方法为：吸除培养上清后对细胞沉淀物使用PBS缓冲液洗涤入12孔板并加入适量RIPA裂解液后收集细胞，并在冰上裂解后于4摄氏度下12000rpm离心10min以收集上清作为测试样品。其中，蛋白定量使用碧云天生物技术有限公司的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)以及美国Thermo Fisher的PierceTMBCAProteinAssay Kit试剂盒；使用南京诺唯赞生物科技有限公司的高敏型ECL化学发光检测试剂盒和美国BIO-RAD的ChemiDoc化学发光成像仪进行WB测试。具体操作和分析步骤为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图4，PHH Exo样本和Hep Exo样本均阳性表达外泌体标志蛋白CD63和CD81，经统计PHH Exo样本和Hep Exo样本的CD63阳性率分别为61.85±3.465％和90.85±2.475％，PHH Exo样本和Hep Exo样本的CD81阳性率分别为69.90±4.95％和89.40±1.273％。参照图5，相较于PHH和Hep，PHH Exo样本和Hep Exo样本均阳性表达了外泌体标志蛋白CD63和TSG101。
实施例2
本实施例对实施例1的PHH Exo样本和Hep Exo样本进行标记，然后与PHHs共培养，考察外泌体在肝细胞胞质内的表达情况，证明来源于PHHs和HepLPCs的外泌体可成功被肝细胞摄取。
以加入PBS缓冲溶液的PHHs为阴性对照，PHH Exo样本和Hep Exo样本使用PBS缓冲溶液进行稀释，使用美国Sigma的PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit试剂盒分别标记稀释后的PHH Exo样本和不同浓度的Hep Exo样本，然后分别与PHHs共孵育24小时以完成共培养。共培养完毕后，取含细胞的培养物使用含1％戊二醛，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液固定后进行DAPI染色，然后在荧光显微镜下观察，得到图6所示的PHH Exo样本和Hep Exo样本在标记后、染色后以及共培养后的免疫荧光共聚焦检测结果。具体的标记步骤由试剂盒提供。
图6显示，无论是PHHs来源还是HepLPCs来源的外泌体在肝细胞胞质内都有明显表达，即可以成功被肝细胞摄取。
实施例3
本实施例提供了包含外泌体的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用。具体的，构建四氯化碳诱导的小鼠急性肝衰竭模型后，尾静脉注射包含Hep Exo样本的注射液作为外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型，以促进肝组织再生。
首先，使用若干6-8周龄，体重22-25g的C57BL/6小鼠构建四氯化碳诱导的小鼠急性肝衰竭模型以及对照模型。具体的，腹腔注射四氯化碳与橄榄油按照1：4稀释的诱导注射液以构建小鼠急性肝衰竭模型，腹腔注射同等体积的橄榄油以构建正常组，两种模型的腹腔注射剂量均为1mL/kg。
然后，诱导注射液注射完毕的6小时后，对部分小鼠急性肝衰竭模型尾静脉注射PBS缓冲液和Hep Exo样本混匀的治疗注射液，形成Hep Exo治疗组；对部分小鼠急性肝衰竭模型尾静脉注射与治疗注射液等体积的PBS缓冲液，形成PBS对照组。治疗注射液中，HepExo样本浓度为2微克/微升。Hep Exo治疗组和PBS对照组的注射剂量均为15毫克/kg。
一些其他的实施例中，Hep Exo治疗组和PBS对照组的注射剂量为1-100毫克/公斤。
以上所有注射液以及缓冲液注射前均灭菌并经0.22μm滤器过滤。
本实施例考察了造模完毕后7天内Hep Exo治疗组和PBS对照组各小鼠的生存情况。具体的，使用卡普兰-迈尔(Kaplan-meier)法进行生存分析绘制生存曲线并进行行对数秩检验(Log-Rank)，p<0.05被认为具有统计学差异，得到图7所示的Hep Exo治疗组和PBS对照组各小鼠的生存情况对比图，其中各组用于分析的小鼠数目为15。具体的分析方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图7，PBS对照组小鼠24小时死亡率为25％，并且在48小时内死亡率超过50％，而Hep Exo治疗组小鼠24小时死亡率为20％，48小时内死亡率仅为30％，并且72小时后再无死亡(p<0.05)，说明人肝前体样细胞来源外泌体可以改善小鼠7天生存率，对急性肝衰竭具有明显的治疗作用。
本实施例在造模后的24小时和48小时取正常对照组、PBS对照组和Hep Exo治疗组小鼠的肝脏组织进行H&E(hematoxylin-eosin staining)染色后制片，于显微镜下观察，得到图8所示的各组小鼠病理损伤情况对比图。具体的制片和观察步骤为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
参照图8，正常组小鼠肝组织呈正常肝细胞形态，肝小叶结构完整清晰，无炎性细胞浸润。PBS对照组小鼠造模24h和48h均发生明显的肝细胞肿胀，细胞核碎裂，空泡增多，局部有炎症细胞浸润，肝索正常接结构破坏，肝窦淤血严重。然而，Hep Exo治疗组小鼠造模24h和48h均变现出程度较轻的肝细胞损伤，空泡形成及炎症细胞浸润都较对照组少，肝损伤在一定程度上得到减轻。
本实施例在造模后的24小时和48小时取正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组小鼠的肝脏组织进行石蜡切片后进行Ki67免疫组化染色，考察肝组织的再生情况，得到图9所示的PBS对照组和Hep Exo治疗组小鼠肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图以及图10所示的各组小鼠肝脏组织石蜡切片中Ki67阳性细胞百分比，每组用于统计的小鼠数目为8。具体的Ki67免疫组化染色步骤请参见实施例3。图10每个造模时间对应的两个柱形图从左至右依次为PBS对照组和Hep Exo治疗组。
参照图9和图10，Hep Exo治疗组小鼠在48小时切片中，Ki67阳性表达细胞与PBS对照组相比明显增多，经统计Hep Exo治疗组和PBS对照组的Ki67阳性表达细胞百分比分别为16.587±3.381％和7.021±2.415％，说明肝再生被有效启动。可见，Hep Exo样本在急性肝衰竭中具有重要的治疗作用，能够提高小鼠生存率，减轻肝脏损伤，有效促进肝脏组织再生。
本实施例在造模后的24小时和48小时利用七氟烷吸入麻醉小鼠，摘掉小鼠眼球取血，让血液自然流出，采集的血液收集到1.5mL EP管中，常温放置30min后在4℃，3000rpm下离心10min，然后缓慢吸取上清液为小鼠的血清。采用美国Beckman Coulter的丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒进行ALT和AST的生化指标检测，根据每分钟的平均吸光度ΔA计算AST水平和ALT水平，得到图11和12所示的正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组各小鼠在不同时间的AST水平和ALT水平对比结果，每组用于统计的小鼠数目为8。图11和图12的每个造模时间对应的三个柱形图从左至右依次为正常组、PBS对照组和Hep Exo治疗组。
参照图11和图12，PBS对照组和Hep Exo治疗组的血清AST和ALT的水平均在造模后逐渐上升，并在48h达到峰值。Hep Exo治疗组小鼠血清的AST和ALT水平与PBS对照组相比，均出现明显降低，可见HepLPC来源的外泌体可以有效降低血清中ALT和AST的水平，对小鼠急性肝脏损伤起到保护作用。
实施例4
本实施例对实施例1的PHH Exo和Hep Exo样本中外泌体的miRNA进行了提取，并通过外泌体miRNA高通量测序分析、测序生信分析以及miRNAmimic体外转染原代肝细胞后的BrdU ELISA测试和EdU增殖分析证明，外泌体中表达显著升高且能够有效促进肝细胞增殖的miRNA为hsa-miR-182、hsa-miR-183以及hsa-miR-574。
使用美国Invitrogen的Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit进行miRNA的提取，得到PHH Exo来源的分析样本PHH-Exo-mi和Hep Exo来源的分析样本HepExo-mi，然后使用南京诺唯赞生物科技有限公司的miRNA 1st Strand cDNA SynthesisKit、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix以及HiScript III 1st Strand cDNASynthesis Kit和ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix先后连接3’端和5’的接头，反转录成cDNA，再进行PCR扩增。PCR扩增后切胶回收目的片段文库，将质检合格的文库通过美国Illumina的Illumina HiSeqTM 2500高通量测序仪测序分析，得到图13所示的聚类热图，提供了上调或下调差异表达前15个miRNA。
本实施例选取了7个表达明显上调的miRNA，分别记为hsa-miR-182，hsa-miR-183，hsa-miR-149，hsa-miR-215，hsa-miR-574，hsa-miR-654和hsa-miR-675，通过原代肝细胞体外转染miRNAmimic增强miRNA表达，然后进行BrdU ELISA检测BrdU掺入作用，得到图14所示的转染各miRNA细胞的BrdU掺入作用对比图，其中NC mimic为空白转染组。体外转染使用广州锐博生物技术公司的miRNAmimic/inhibitor)，BrdU ELISA检测BrdU掺入作用的过程以及使用的试剂盒请参见实施例3。
本实施例进一步对转染hsa-miR-182，hsa-miR-183和hsa-miR-574的原代肝细胞分别进行EdU染色后，通过EdU荧光法检测EdU掺入率，得到图15所示的EdU荧光显微照片以及图16所示的EdU掺入率对比图。具体的检测用试剂盒请参见实施例3。
参照图14，7个表达明显上调的miRNA中，hsa-miR-182，hsa-miR-183和hsa-miR-574对原代肝细胞增殖具有明显的促进作用(p<0.05)。参照图15和图16，与NC mimic转染组相比，hsa-miR-183mimic体外转染的EdU掺入率明显增多，且明显高于hsa-miR-182和hsa-miR-574mimic转染组，NC mimic、hsa-miR-182、hsa-miR-183以及hsa-miR-574mimic转染组的EdU掺入率分别为10.04±2.946％，18.22±2.67％，29.46±4.799％和14.6±3.173％，
实施例5
实施例5筛选出了对肝细胞增殖作用显著的miRNA-182，miRNA-183和miRNA-574。本实施例以miRNA-183为例，提供了包含miRNA-183的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用。
具体的，构建四氯化碳以及乙酰氨基酚诱导的两种小鼠急性肝衰竭模型以分别模拟不同的肝损伤机制，尾静脉注射包含miRNA-183的注射液作为外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型，以促进肝组织再生。
四氯化碳诱导的急性肝衰竭模型(简记为CCl4模型)构建方法为：对6-8周，体重22-25g的C57BL/6小鼠腹腔注射四氯化碳与橄榄油按照1：4稀释的四氯化碳诱导注射液，注射剂量为1mL/kg。相应正常对照组腹腔注射等体积的橄榄油(简记为CCl4正常组)。四氯化碳诱导注射液注射前使用0.22微米滤器进行除菌过滤。
对乙酰氨基酚诱导的急性肝衰竭模型(简记为APAP模型)构建方法为：对6-8周，体重22-25g的C57BL/6小鼠腹腔注射乙酰氨基酚与PBS缓冲液混合形成的对乙酰氨基酚诱导注射液，注射剂量为1mL/kg。相应正常对照组腹腔注射等体积的PBS缓冲液(简记为APAP正常组)。乙酰氨基酚诱导注射液注射前使用0.22微米滤器进行除菌过滤。
对造模6小时后的部分CCl4模型和部分APAP模型尾静脉注射分别用CCl4和PBS缓冲液稀释，含15纳摩尔的miRNA-183agomir的阴性对照注射液各200微升(分别简记为CCl4-NC agomir组和APAP-NC agomir组)。
使用EntransterTM-in vivo RNA转染试剂包裹Cy5标记miRNA-183agomir，并分别用CCl4和PBS缓冲液稀释，然后对造模6小时后的部分CCl4模型和部分APAP模型进行尾静脉注射(分别简记为CCl4-miRNA 183-5p agomir组和APAP-miRNA 183-5p agomir组)。其中，注射液中每微升转染试剂含2微克核酸，注射液每只注射量为200微升，miRNA-183agomir的含量为15纳摩尔。EntransterTM-in vivo RNA转染试剂来源于北京英格恩生物技术公司，Cy5标记miRNA-183agomir来源于广州锐博生物技术公司。
造模后的不同时间点取各组肝组织和血样样本进行肝损伤和再生相关指标检测。每组用于检测的小鼠数目为8。具体如下：
本实施例考察了不同处理小鼠造模后的7天生存率，得到图17和图18分别所示的CCl4模型各组小鼠的7天生存率情况以及APAP模型各组小鼠的7天生存率情况。具体操作和分析过程请参见实施例3。
参照图17，CCl4-NC agomir组小鼠24小时死亡率为20％，并且在48小时内死亡率超过70％，而CCl4-miRNA 183-5p agomir组小鼠24小时无死亡，48小时内死亡率仅为20％(p<0.05)；参照图18，APAP-NC agomir组小鼠24小时死亡率高达80％，而APAP-miRNA 183-5p agomir组小鼠24小时内死亡率仅50％。图17和图18均说明miRNA 183-5p可以明显改善小鼠7天生存率，对急性肝衰竭具有明显的治疗作用。
本实施例对造模后的72小时内的不同时间点取CCl4模型各小鼠外周血进行ALT和AST检测，造模后的第24小时取APAP模型各小鼠外周血进行ALT和AST检测，得到图19和图20分别所示的CCl4模型各小鼠的AST水平和ALT水平对比图，以及图21所示的APAP模型各小鼠的AST水平和ALT水平对比图。具体的ALT和AST检测过程请参见实施例3。图19和图20的每个造模时间对应的三个柱形图从左至右依次为正常组、CCl4-NC agomir组和CCl4-miRNA183-5p agomir组。图21和图22的每个因子(ALT或AST)对应的三个柱形图从左至右依次为正常组、APAP-NC agomir组和APAP-miRNA 183-5p agomir组。
参照图19和图20，CCl4-NC agomir组小鼠和CCl4-miRNA 183-5p agomir组小鼠的AST和ALT的水平均在造模后逐渐上升，并在48h达到峰值，而在72h有所降低，且CCl4-miRNA183-5p agomir组小鼠的AST和ALT的水平相较CCl4-NC agomir组小鼠有明显降低。参照图21，APAP-miRNA 183-5p agomir组小鼠的AST和ALT水平显著低于APAP-NC agomir组各小鼠。图19至图21均说明miRNA 183-5p能够有效降低血清中ALT和AST的水平。
本实施例在造模后的不同时间点取CCl4模型各小鼠肝脏组织进行病理HE染色考察肝损伤情况，并在造模后的第24小时取APAP模型各小鼠肝脏组织进行病理HE染色考察肝损伤情况，得到图22和图23分别所示的CCl4模型各小鼠和APAP模型各小鼠造模后的病理组织切片对比图。具体的操作过程请参见实施例3。
本实施例进一步通过免疫组化检测Ki67的表达，对不同处理的小鼠肝组织再生情况进行评价，得到图24所示的造模完成后不同时间CCl4-NC agomir组小鼠和CCl4-miRNA183-5p agomir组小鼠肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图，以及图25所示的造模完成的24小时后APAP-NC agomir组和APAP-miRNA183-5p agomir组小鼠肝组织切片免疫组化Ki67染色对比图。具体操作过程请参见实施例3。
图26统计了造模完成后不同时间CCl4-NC agomir组小鼠和CCl4-miRNA183-5pagomir组小鼠肝组织切片的Ki67阳性细胞百分比。其中：每个造模完成时间对应的两个柱状图从左自右依次为CCl4-NC agomir组和CCl4-miRNA183-5p agomir组。
参照图22至图26，CCl4正常组和APAP正常组小鼠肝组织均呈正常肝细胞形态，肝小叶结构完整清晰，无炎性细胞浸润。CCl4-NC agomir组和APAP-NC agomir组小鼠造模24h出现明显肝损伤，在48h出现严重的肝细胞坏死，细胞核碎裂，空泡增多，大量炎症细胞浸润，肝窦淤血严重。然而，CCl4-miRNA 183-5p agomir组和APAP-miRNA 183-5p agomir组小鼠造模24小时也出现肝损伤，但造模48小时后肝脏损伤程度明显减轻，空泡形成及炎症细胞浸润都较对应的NC agomir组少。
与CCl4-NC agomir组相比，CCl4-miRNA 183-5p agomir组小鼠在48小时切片中，Ki67阳性表达细胞明显增多(p<0.05)；与APAP-NC agomir组相比，APAP-miRNA 183-5pagomir组小鼠在24小时切片中，Ki67阳性表达细胞明显增多(p<0.05)，说明肝再生被有效启动。
本实施例通过Westernblotting法考察了CCl4-miRNA 183-5p agomir组各小鼠在完成造模后的不同时间的细胞周期相关分子的蛋白表达情况，得到图27所示的示意图。具体的操作方法请参见实施例1。
参照图27，CCl4-miRNA 183-5p agomir组的肝组织细胞周期相关蛋白Cyclin A2，Cyclin D，Cyclin E表达上调,而p27 kip1表达下调，说明miRNA-183-5p可能通过增加cyclin家族蛋白同时抑制p27蛋白表达，促进细胞周期进程，从而促进肝细胞增殖。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (10)

1.一种外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，包括：
使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本；
通过所述离体样本考察所述外泌体制剂对肝组织的促再生作用；
所述外泌体制剂包含人肝细胞来源外泌体或至少一种人肝细胞来源miRNA作为起效物质。
2.根据权利要求1所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，所述肝衰竭体内动物模型为四氯化碳诱导的小鼠急性肝衰竭模型。
3.根据权利要求1所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，所述肝衰竭体内动物模型为乙酰氨基酚诱导的两种小鼠急性肝衰竭模型。
4.根据权利要求1所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：
使用稀释剂对所述起效物质进行重悬得到所述外泌体制剂，控制每微升所述外泌体制剂含有1-200微克所述起效物质。
5.根据权利要求4所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，所述稀释剂为生理盐水、复方电解质溶液和PBS溶液的至少一种。
6.根据权利要求4所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：
使用转染增强剂和所述稀释剂对所述起效物质进行重悬得到所述外泌体制剂。
7.根据权利要求1所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：
以所述外泌体制剂的质量计，控制对每个所述肝衰竭体内动物模型的注射剂量为0.1微克-100毫克/公斤。
8.根据权利要求1所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，使用所述外泌体制剂干预肝衰竭体内动物模型后获取离体样本的步骤包括：
使用含血清类物质培养基对人原代肝细胞、人肝前体细胞和人肝前体样细胞的任意一种进行体外培养至融合度不低于90％后，使用无血清类物质培养基替换所述含血清类物质培养基后继续体外培养得到培养上清，从所述培养上清中分离出所述起效物质；
所述含血清类物质培养基由所述无血清类物质培养基和血清类物质组成，所述血清类物质占所述含血清类物质培养基的体积含量为1-20％。
所述无血清类物质培养基包含基础培养基、无血清添加物、生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂和TGF-β信号抑制剂。
9.根据权利要求8所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于，以占所述无血清类物质培养基的含量计：
所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述无血清添加物的含量不超过2％。
10.根据权利要求9所述的外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用，其特征在于：
所述基础培养基由DMEM/F12细胞培养基、HepX培养基、William’s E细胞培养基、NeurobasalMedium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种组成；
所述无血清添加物为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合液细胞培养添加物、N2细胞培养营养添加物和B27细胞培养营养添加物的至少一种；
所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6和抑瘤素的至少一种；
所述ROCK激酶抑制剂为Fasudil、Y-27632、Thiazovivin和SB-772077-B的至少一种；
所述Wnt信号通路激动剂为重组Wnt蛋白、重组R-spondin蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂的至少一种；
所述TGF-β信号抑制剂为RepSox、SB431542和A83-01的至少一种。
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