CN115105529A - 免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用 - Google Patents

免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115105529A
CN115105529A CN202210228526.XA CN202210228526A CN115105529A CN 115105529 A CN115105529 A CN 115105529A CN 202210228526 A CN202210228526 A CN 202210228526A CN 115105529 A CN115105529 A CN 115105529A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
proliferation
cells
immune
suppressing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210228526.XA
Other languages
English (en)
Inventor
朱雪晶
张洪丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd
Publication of CN115105529A publication Critical patent/CN115105529A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/365—Endothelin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/14—Coculture with; Conditioned medium produced by hepatocytes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用。本发明的所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。

Description

免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用。
背景技术
肝脏是个免疫特惠器官，由于肝脏内各种细胞表达低水平的MHC抗原，故肝脏的免疫原性较低。实验和临床研究表明，肝脏对排斥反应的敏感性低于皮肤，心脏，肺或肾脏，这是肝脏产生致耐受力的结果。
虽然肝脏移植的免疫排斥反应相对于其他器官移植较弱，但是在标准的免疫抑制剂使用下，仍然有10％-40％的肝移植患者会发生急性排斥反应，5％左右会发生慢性排斥反应，1％患者会发生宿主抗移植物反应并导致移植失败。
随着移植后存活率的提高，改善移植患者的长期生活质量并减少免疫抑制的副作用变得越来越重要。患者长期服用免疫排斥药物会增加患有多种疾病的风险。若能够诱导免疫耐受现象，撤除免疫抑制剂的使用，将极大地改善肝移植患者预后和生存情况。
因此，有必要开发新型的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂以解决现有技术中存在的上问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用，以通过抑制免疫细胞的增殖诱导受体建立有效的免疫耐受。
为实现上述目的，本发明的所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
优选的，所述免疫细胞为巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞的任意一种。
优选的，所述肝源细胞在体外培养基诱导下形成的条件培养上清能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
进一步优选的，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
优选的，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
优选的，所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂还包括重悬成分，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
本发明所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用包括使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞或干预体内动物模型，考察所述增殖抑制细胞制剂诱导免疫耐受的情况。
优选的，所述体内动物模型为ConA诱导且T细胞和NKT细胞介导的小鼠自身免疫性肝炎模型、肝细胞或肝组织移植后的免疫排斥大鼠模型以及肝移植后急性宿主抗移植物反应模型中的任意一种。
优选的，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，将所述增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，并控制所述增殖抑制细胞制剂中的肝源细胞与所述免疫相关细胞的数量比不低于1:20，以使所述增殖抑制细胞制剂对所述免疫相关细胞的增殖抑制率不低于50％。
优选的，所述免疫相关细胞为外周血单个核细胞和脾脏细胞的任意一种。
优选的，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，使用不同增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，所述不同增殖抑制细胞制剂中所含有的肝源细胞来源于不同供体。
附图说明
图1为实施例1的各肝前体相关标志物在HepLPCs细胞中的表达情况对比图；
图2为实施例1的经TEM培养基培养10天后得到的细胞进行明场拍照得到的HepLPCs的明场照片；
图3为实施例1采用流式细胞术考察阳性对照组、FK506对照组以及各共培养组中HepLPC对脾脏细胞的增殖抑制情况得到的对比图；
图4为实施例2采用流式细胞术考察供体1来源HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制情况以及对应的阳性对照组中脾脏细胞增殖情况得到的对比图；
图5为实施例2采用流式细胞术考察供体2来源HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制情况以及对应的阳性对照组中脾脏细胞增殖情况得到的对比图；
图6为实施例2采用流式细胞术考察供体3来源HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制情况以及对应的阳性对照组中脾脏细胞增殖情况得到的对比图；
图7为实施例2采用流式细胞术考察供体4来源HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制情况以及对应的阳性对照组中脾脏细胞增殖情况得到的对比图；
图8为实施例3采用流式细胞术考察各供体来源HepLPC的PBMC共培养组对PBMC的增殖抑制情况与对应的阳性对照组中PBMC的增殖情况得到的对比图；
图9为实施例4的不同ConA注射剂量与小鼠生存率的关系曲线；
图10为实施例4对8毫克/公斤注射剂量组的小鼠在不同时间眼眶取血并通过血生化水平分析考察得到的各组ALT、AST和LDH指标水平对比图；
图11为实施例4对实验组1和对照组的各小鼠注射完毕的6小时后眼眶取血并通过血生化水平分析考察得到的各组ALT、AST、LDH和ALP指标水平对比图；
图12为实施例4对实验组2和对照组的各小鼠注射完毕的6小时后眼眶取血并通过血生化水平分析考察得到的各组ALT、AST和LDH指标水平对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明实施例提供了免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其制备方法和应用，以通过抑制免疫细胞的增殖诱导受体建立有效的免疫耐受。
本发明实施例的所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为肝前体样细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝来源前体细胞或鼠肝来源前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体细胞或鼠肝前体细胞。
一些实施例中，所述肝源细胞为人肝前体样细胞或鼠肝前体样细胞。
一些实施例中，所述免疫细胞为巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞的任意一种。
一些实施例中，所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂还包括重悬成分。
一些实施例中，所述重悬成分为生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
一些实施例中，所述肝源细胞在体外培养基诱导下形成的条件培养上清能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
一些实施例中，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基、HepX培养基的至少一种。
一些实施例中，所述体外培养基包括基础培养基和血清类物质。
一些实施例中，所述体外培养基由基础培养基和血清类物质组成。以占所述基础培养基的体积含量计，血清类物质的含量不超过20％。
一些实施例中，所述体外培养基由所述基础培养基、血清类物质和双抗组成。其中，以占所述基础培养基的体积含量计，双抗的含量不超过2％。
一些实施例中，所述肝源细胞的制备方法包括，使用转化扩增培养基(TEM培养基)对原代肝细胞进行体外培养。
一些实施例中，TEM培养基包括基础培养基、无血清添加物、血清类物质、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激动剂和ROCK激酶抑制剂。
以占所述基础培养基的含量计，所述生长因子的含量为0.1-100纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述Wnt信号通路激动剂的含量为0.1-50微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.1-100微摩尔，所述血清类物质的含量不超过20％，所述无血清添加物的体积含量不超过2％。
一些实施例中，TEM培养基还包括N-乙酰-L-半胱氨酸、抗坏血酸的至少一种。
一些实施例中，所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、白介素-6和抑瘤素的至少一种。
一些实施例中，所述ROCK激酶抑制剂为Fasudil、Y-27632、Thiazovivin和SB-772077-B的至少一种。
一些实施例中，所述Wnt信号通路激动剂为重组Wnt蛋白、重组R-spondin蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂的至少一种。
一些实施例中，所述TGF-β信号抑制剂为RepSox、SB431542和A83-01的至少一种。
一些实施例中，所述转化扩增培养基由基础培养基、N2添加剂、B27添加剂、丙酮酸钠、抗坏血酸、表皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂和血清类物质组成。
一些实施例中，所述体外培养基和所述TEM培养基中任意一种的血清类物质为动物源血清。
一些实施例中，所述体外培养基和所述TEM培养基中任意一种中的动物源血清可以用血清替代物替换。
一些实施例中，所述血清替代物为无动物源成份的血小板及其衍生物。
一些实施例中，所述血清替代物为一磷酸鞘氨酸和吲哚乙酸。
一些实施例中，所述动物源血清为胎牛血清。
一些实施例的所述转化扩增培养基中，以占基础培养基的含量计，所述表皮细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，所述肝细胞生长因子的含量为5-25纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为5-20微摩尔/升，所述Wnt信号通路激动剂的含量为1-5微摩尔/升，所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-2微摩尔/升，所述一磷酸鞘氨酸的含量为0.5-2微摩尔/升，所述吲哚乙酸的含量为2-10微摩尔/升，所述N2添加剂和所述B27添加剂的体积百分比不超过1％。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，控制所述原代肝细胞的接种密度为0.5-2×104/cm2。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，将原代肝细胞接种于胶原蛋白I或Matrigel基质包被的培养支持物中，经含血清的WE培养基培养至贴壁后更换为TEM培养基进行7-10天的培养，且每2-3天更换一次TEM培养基。
一些实施例的肝源细胞培养方法中，所述原代肝细胞在经TEM培养前经Percoll密度梯度离心联合流式分选排除掉CD24阳性和EpCAM阳性的前体细胞。
本发明实施例提供了所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，包括，将所述增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，并使用刺激剂诱导所述免疫相关细胞的增殖，考察所述增殖抑制细胞制剂对所述免疫相关细胞的增殖抑制作用。
一些实施例中，所述免疫相关细胞为外周血单个核细胞PBMC。
一些具体的实施例中，所述免疫相关细胞为人PBMC。人PBMC主要由淋巴细胞组成，其中淋巴细胞包括B细胞和T细胞。
一些实施例中，所述免疫相关细胞为脾脏细胞。脾脏细胞中的大量细胞为淋巴细胞，主要是B细胞和T细胞。
本发明实施例还提供了所述免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用包括使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞或干预体内动物模型，考察所述增殖抑制细胞制剂诱导免疫耐受的情况。
一些实施例中，将所述增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，以此来考察所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞增殖的效果。
一些实施例中，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，将所述增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，并控制所述增殖抑制细胞制剂中的肝源细胞与所述免疫相关细胞的数量比不低于1:20，以使所述增殖抑制细胞制剂对所述免疫相关细胞的增殖抑制率不低于50％。
一些实施例中，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，使用不同增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，所述不同增殖抑制细胞制剂中所含有的肝源细胞的培养上清来源于不同供体的肝源细胞。
一些实施例中，所述体内动物模型为ConA诱导且T细胞和NKT细胞介导的小鼠自身免疫性肝炎模型、肝细胞或肝组织移植后的免疫排斥大鼠模型以及肝移植后急性宿主抗移植物反应模型中的任意一种。
本发明各实施例中，如无特别说明，细胞培养均在37摄氏度环境下且二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中进行。细胞培养使用的培养基以及处理细胞所使用的各类试剂，例如缓冲液使用前均经无菌化处理以及0.22微米滤器过滤以去除杂质。
本发明各实施例中涉及统计学分析的数据均为三次独立重复，实验数据以均值±标准差
Figure BDA0003537225850000081
表示。正态分布数据,对两组数据间差异分析使用Student’st-test统计法；多组数据比较分析使用one-way ANOVA，和Dunnett校正进行多重比较，必要时选用Tukey校正方法。偏态分布的数据,采用两组间Mann-Whitney U test统计法进行非参数统计分析。P值小于0.05为差异有统计学意义。所有数据均通过SPSS软件(25.0版)选取合适的统计分析方法进行分析。
以下通过具体的实施例进行详细说明：
实施例1
本实施例将来源于Invitrogen公司的供体1来源人原代肝细胞分别体外培养为肝前体样细胞HepLPC，然后将HepLPC与ConA刺激的小鼠脾脏细胞共培养，考察HepLPC-CM对脾脏细胞的增殖抑制作用。
HepLPC的体外培养方法包括：将人原代肝细胞经Percoll密度梯度离心联合流式分选排除掉CD24阳性和EpCAM阳性的前体细胞后，先以2×104个细胞/cm2的密度接种于Matrigel(Corning公司)包被的细胞培养6孔板中经含10％血清的WE培养基(Invitrogen公司)培养至贴壁，然后以2×104/cm2的接种密度转移至TEM培养基中进行10天的培养，且每隔一天更换一次TEM培养基。
本实施例的TEM培养基组成和各组成成分的来源如下：DMEM/F12基础培养基(Invitrogen公司)，以及以占DMEM/F12基础培养基的含量计：体积含量1％的N2添加剂和体积含量1％的B27添加剂(Invitrogen公司)，1mmol/L丙酮酸钠(Invitrogen公司)，10μg/mL抗坏血酸(Sigma-Aldrich公司)，20ng/mL肝细胞生长因子HGF(Peprotech公司)，20ng/mL表皮细胞生长因子EGF(Peprotech公司)，10μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632(TargetMol公司)，3μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021(TargetMol公司)，1μmol/L TGF-β信号抑制剂A83-01(TargetMol公司)，1μmol/L一磷酸鞘氨酸S1P(Santa Cruz公司)以及5μmol/L吲哚乙酸LPA(Santa Cruz公司)。
加入刺激剂的小鼠脾脏细胞悬液的制备方法为：断颈处死1周龄的C57BL/6小鼠后取脾脏在200目筛网研磨后使用淋巴分离液冲洗，收集包含淋巴细胞的分离液并使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬后在800g离心力下低温离心30分钟；离心结束后吸取淋巴细胞层后使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬后在250g离心力下低温离心10分钟，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基再次重悬得到的淋巴细胞层并加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬的刀豆蛋白A(ConA)悬液作为刺激剂。
共培养步骤包括：前述TEM培养结束后细胞融合率达90％，再将得到的细胞按1×104个/平方厘米的接种密度在TEM培养基中以1：3的比例进行连续传代培养至第三代；使用0.05％胰酶/EDTA液消化前述传代培养至第三代且细胞汇合率达80％的HepLPC后，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基终止消化并重悬为单细胞悬液；使用PBS反复洗涤单细胞悬液以确保去除消化液；使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬并调整细胞浓度；将前述加入刺激剂的小鼠脾脏细胞悬液接种于6孔板，通过控制加入刺激剂的小鼠脾脏细胞悬液的加入量调整HepLPC和小鼠脾脏细胞的数量比分别为1:1，1:2，1:5，1:10和1:20，从而得到若干共培养组。另外，以不添加HepLPC的共培养组作为阳性对照组，以添加终浓度10nM免疫抑制药物他克莫司FK506的共培养组作为FK506对照组。
本实施例分别使用qPCR和流式细胞术分析了供体1的人原代肝细胞和经TEM培养得到的HepLPC的基因表达情况，结果如图1和图2所示。参照图1，人原代肝细胞在TEM培养基作用下，肝祖细胞基因Ck7、Ck19和Sox9的表达显著增加，而Alb、Cyp3a4和Hnf4α这类肝实质细胞标志物表达显著下降。参照图2，Human-HepLPCs的肝细胞标志物HNF4α以及肝干细胞/肝祖细胞标志物CD24 and CK19显著表达，造血干细胞抗原CD34、白细胞共同抗原CD45以及肝胎儿细胞标志物AFP的表达水平均小于2％。Human-HepLPCs不表达MHC II类抗原HLA-DP，HLA-DQ和HLA-DR，表现出低免疫原性。
本实施例中，共培养72小时后，使用CFSE细胞增殖检测试剂盒对阳性对照组、FK506对照组以及各共培养组进行处理后上流式仪检测，考察各共培养组中HepLPC和FK506对脾脏细胞的增殖抑制情况，结果如图3所示。根据图3所示阳性对照组、FK506对照组和各共培养组的增殖脾脏细胞占比情况可知，HepLPC和小鼠脾脏细胞的数量比分别为1:1，1:2，1:5，1:10和1:20的条件下，HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制率分别为90％、87％、85％、80％和50％，可见HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性。尤其值得注意的是，FK506对照组对脾脏细胞增殖的抑制率为82％，当HepLPC和小鼠脾脏细胞的数量比在1:1-1:5的宽范围内，HepLPC所显示出的对小鼠脾脏细胞的增殖抑制效果与FK506相当甚至强于FK506的增殖抑制效果。
实施例2
本实施例将来源于Invitrogen公司的不同供体来源人原代肝细胞分别体外培养为肝前体样细胞HepLPC，将不同供体来源的HepLPC分别与ConA刺激的小鼠脾脏细胞共培养，考察HepLPC对脾脏细胞的增殖抑制作用。
人原代肝细胞体外培养方法、条件培养上清制备方法、加入刺激剂的小鼠脾脏细胞悬液制备方法以及共培养方法请参见实施例1。共培养步骤中控制每种供体来源的HepLPC与小鼠脾脏细胞的数量比分别为1:5。
本实施例中，共培养72小时后，使用CFSE细胞增殖检测试剂盒对阳性对照组以及含不同供体来源HepLPC的共培养组进行处理后上流式仪检测，考察各供体来源HepLPC的共培养组对脾脏细胞的增殖抑制情况与对应的的阳性对照组中脾脏细胞的增殖情况，结果如图4至图7所示。参照图4至图7所示的阳性对照组和各共培养组的增殖脾脏细胞占比情况可知，供体1、供体2、供体3和供体4来源的HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制率分别为91％、93％、85％和89％。可见，不同供体来源HepLPC对脾脏细胞增殖的抑制效果体现出差异性，有利于后续开展免疫耐受药物的异质性研究。
实施例3
本实施例使用实施例2得到的四种供体来源的HepLPC分别与人外周血单个核细胞(PBMC)共培养，并使用植物血凝素PHA刺激PBMC中T细胞的增殖，考察HepLPC对PBMC的增殖抑制作用。
首先，取健康男性外周血用适量D-PBS和Histopaque-1077稀释后在2000rpm下离心25分钟，吸取中间的白膜层加入D-PBS反复离心洗涤并弃上清，得到细胞沉淀；使用含10微克/毫升PHA、10％PBS、2mMGlutaMAX的RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，得到PBMC悬液。
本实施例的共培养过程如下：取实施例1的经传代培养和消化后得到的HepLPC，使用PBS重悬为单细胞悬液；使用PBS反复洗涤单细胞悬液以确保去除消化液；使用含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬并调整细胞浓度；将含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬的HepLPC接种于6孔板，加入PBMC悬液，通过控制PBMC悬液和HepLPC悬液用量以及各悬液浓度，使得HepLPC和PBMC的数量比为1:5，PHA的终浓度为5μg/ml。以不加入HepLPC悬液的PBMC培养组作为阳性对照组。
本实施例中，共培养72小时后，使用CFSE细胞增殖检测试剂盒对阳性对照组以及含不同供体来源HepLPC的PBMC共培养组进行处理后上流式仪检测，考察各供体来源HepLPC的PBMC共培养组对PBMC的增殖抑制情况与对应的的阳性对照组中PBMC的增殖情况，结果如图8所示。参照图8所示的阳性对照组和各共培养组的增殖PBMC占比情况可知，供体1、供体2、供体3和供体4来源的HepLPC对PBMC增殖的抑制率分别为85％、83％、64％和44％。可见，不同供体来源HepLPC对PBMC增殖的抑制效果体现出差异性，有利于后续开展免疫耐受药物的异质性研究。
实施例4
本实施例使用实施例1的HepLPC进行细胞移植，考察HepLPC对ConA诱导的，T细胞和NKT细胞介导的小鼠自身免疫性肝炎模型的作用。
首先，按8毫克/公斤、20毫克/公斤和30毫克/公斤的注射剂量对不同组(每组8只)的6周龄、体重20-30g的C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射PBS重悬的ConA，考察ConA浓度为小鼠生存的影响，得到图9所示的不同ConA注射剂量与小鼠生存率的关系曲线。从图9可以看到，ConA的致死剂量不低于20毫克/公斤，而8毫克/公斤为非致死剂量。
本实施例对8毫克/公斤注射剂量组的小鼠在不同时间眼眶取血，通过血生化水平分析考察了各组的ALT、AST和LDH指标，得到图10所示的ALT、AST、LDH指标水平对比图。参照图10，对于非致死剂量ConA处理的小鼠，血ALT、AST、LDH在注射后6h时血转氨酶最高。因此，按8毫克/公斤注射剂量尾静脉注射的小鼠在注射结束后的第6小时建模成功。本实施例的对照组NC的8只小鼠尾静脉注射同等剂量的PBS。
本实施例取实施例1的经传代培养和消化后得到的HepLPC，使用PBS进行反复重悬洗涤以确保纯化效果后，使用PBS重悬HepLPC，并分组如下：
实验组1：对8只C57BL/6雄性小鼠分别尾静脉注射PBS重悬的HepLPC悬液以及PBS重悬的ConA，控制HepLPC的注射剂量为106/只，ConA的注射剂量为8毫克/公斤的非致死剂量。
实验组2：与实验组1的区别在于，ConA的注射剂量为20毫克/公斤的致死剂量。
对照组：每只C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射同等体积的PBS。
各组小鼠在注射完毕的6小时后仍存活。
本实施例在注射完毕的6小时后，对实验组1和对照组的各小鼠眼眶取血，通过血生化水平分析考察了各组的ALT、AST、LDH和ALP指标，得到图11所示的各指标水平对比图。参照图11，HepLPC的移植显著改善了小鼠的ALT、AST和LDH水平。
本实施例在注射完毕的6小时后，对实验组2和对照组的各小鼠眼眶取血，通过血生化水平分析考察了各组的ALT、AST和LDH指标，得到图12所示的各指标水平对比图。参照图12，尽管ConA的注射剂量为致死剂量，HepLPC的移植也显著改善了小鼠的ALT、AST和LDH水平。

Claims (11)

1.一种免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，包含肝源细胞，所述肝源细胞具有前体细胞特征，能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，所述免疫细胞为巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞的任意一种。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，所述肝源细胞在体外培养基诱导下形成的条件培养上清能够通过抑制所述免疫细胞的增殖来诱导受体建立有效的免疫耐受。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，所述体外培养基包括基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12细胞培养基、William’s E细胞培养基、Neurobasal Medium细胞培养基、MEM细胞培养基、DMEM细胞培养基、1640RPMI细胞培养基和F12细胞培养基的至少一种。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，所述肝源细胞为肝前体细胞或肝前体样细胞。
6.根据权利要求1所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂，其特征在于，还包括重悬成分，所述重悬成分包括生理盐水、复方电解质溶液、缓冲溶液和基础培养基的至少一种。
7.根据权利要求1所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，其特征在于，包括使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞或干预体内动物模型，考察所述增殖抑制细胞制剂诱导免疫耐受的情况。
8.根据权利要求7所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，其特征在于，所述体内动物模型为ConA诱导且T细胞和NKT细胞介导的小鼠自身免疫性肝炎模型、肝细胞或肝组织移植后的免疫排斥大鼠模型以及肝移植后急性宿主抗移植物反应模型中的任意一种。
9.根据权利要求7所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，其特征在于，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，将所述增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，并控制所述增殖抑制细胞制剂中的肝源细胞与所述免疫相关细胞的数量比不低于1：20，以使所述增殖抑制细胞制剂对所述免疫相关细胞的增殖抑制率不低于50％。
10.根据权利要求7所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，其特征在于，所述免疫相关细胞为外周血单个核细胞和脾脏细胞的任意一种。
11.根据权利要求7所述的免疫细胞的增殖抑制细胞制剂在制备免疫耐受相关药物方面的应用，其特征在于，使用所述增殖抑制细胞制剂体外抑制免疫细胞的步骤包括，使用不同增殖抑制细胞制剂与所述免疫相关细胞共培养，所述不同增殖抑制细胞制剂中所含有的肝源细胞来源于不同供体。
CN202210228526.XA 2021-03-08 2022-03-08 免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用 Pending CN115105529A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021102495437 2021-03-08
CN202110249543 2021-03-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115105529A true CN115105529A (zh) 2022-09-27

Family

ID=83119816

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210228528.9A Active CN115025123B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用
CN202210228526.XA Pending CN115105529A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用
CN202210228527.4A Pending CN115105530A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 免疫细胞的增殖抑制剂及其制备方法和应用
CN202210229013.0A Pending CN115094020A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 抗肝纤维化制剂及其制备方法和应用
CN202210229034.2A Pending CN115109740A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 肝细胞调控制剂及其制备方法和应用
CN202210229000.3A Active CN115322946B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 抗肝纤维化的细胞制剂及其制备方法和应用
CN202210229015.XA Pending CN115040543A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用
CN202210229036.1A Active CN115105531B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 细胞治疗剂及其制备方法和应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210228528.9A Active CN115025123B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 肝巨噬细胞调节剂及其制备方法和应用

Family Applications After (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210228527.4A Pending CN115105530A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 免疫细胞的增殖抑制剂及其制备方法和应用
CN202210229013.0A Pending CN115094020A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 抗肝纤维化制剂及其制备方法和应用
CN202210229034.2A Pending CN115109740A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 肝细胞调控制剂及其制备方法和应用
CN202210229000.3A Active CN115322946B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 抗肝纤维化的细胞制剂及其制备方法和应用
CN202210229015.XA Pending CN115040543A (zh) 2021-03-08 2022-03-08 外泌体制剂在制备肝衰竭治疗类药物方面的应用
CN202210229036.1A Active CN115105531B (zh) 2021-03-08 2022-03-08 细胞治疗剂及其制备方法和应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230414676A1 (zh)
CN (8) CN115025123B (zh)
WO (1) WO2022188788A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115521914B (zh) * 2022-10-12 2024-04-19 西北工业大学 一种人原代自然杀伤细胞体外扩增体系及方法
CN116064375A (zh) * 2023-02-27 2023-05-05 广东乾晖生物科技有限公司 原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法
CN116426648B (zh) * 2023-03-27 2024-03-08 艾一生命科技(广东)有限公司 一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qRCR引物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233900A (ja) * 2000-02-25 2001-08-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc 免疫抑制物質
CN110438157A (zh) * 2019-08-05 2019-11-12 上海赛立维生物科技有限公司 肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用
WO2020134179A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种免疫耐受剂

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080181869A1 (en) * 2006-03-12 2008-07-31 Devore Dianna Louise Therapeutics to facilitate cell transplantation for liver disease
CN101962629B (zh) * 2009-07-24 2014-09-10 北京大学 肝脏前体细胞及其制备方法与应用
CN102641296B (zh) * 2011-02-21 2015-11-25 杨子江 一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病（gvhd）制剂及其制备方法
JP6580329B2 (ja) * 2014-03-31 2019-09-25 シスメックス株式会社 未分化細胞から分化細胞および／または分化細胞の産生物を取得する方法
CN103977029A (zh) * 2014-04-11 2014-08-13 中国人民解放军第四军医大学 经典激活的巨噬细胞在治疗肝纤维化的应用
US10568945B2 (en) * 2014-04-25 2020-02-25 University Of Cincinnati Compositions and methods for inducing liver regeneration by administering hepatocyte-derived exosomes
CN106754636B (zh) * 2015-11-19 2019-08-30 中国人民解放军第二军医大学 体外诱导原代肝细胞胆管化并长期培养、扩增和分化的方法及其应用
CN105535022A (zh) * 2016-01-12 2016-05-04 浙江生创精准医疗科技有限公司 外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途和药物组合物
JP6807095B2 (ja) * 2016-07-20 2021-01-06 国立大学法人千葉大学 肝前駆細胞の製造方法
US20190352610A1 (en) * 2017-01-05 2019-11-21 Agency For Science, Technology And Research Methods of generating hepatic macrophages and uses thereof
CN107326026A (zh) * 2017-07-12 2017-11-07 河南师范大学 miR‑182的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用
JP7072770B2 (ja) * 2018-03-13 2022-05-23 ロート製薬株式会社 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット
CN110317775B (zh) * 2018-03-30 2022-06-10 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基
CN109337858B (zh) * 2018-09-20 2022-03-15 中国人民解放军第二军医大学 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用
CN117802031A (zh) * 2018-09-30 2024-04-02 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 肝细胞的体外扩增培养方法及应用
JP7193121B2 (ja) * 2018-10-15 2022-12-20 日本メナード化粧品株式会社 マクロファージの機能低下抑制剤
CN109394779B (zh) * 2018-10-17 2021-11-02 河南师范大学 一种肝脏细胞的miR-183调节物及其在制备治疗调节肝脏细胞药物中的应用
JP7284985B2 (ja) * 2019-03-29 2023-06-01 国立大学法人 長崎大学 肝前駆細胞を含む細胞集団を製造する方法
CN110129255B (zh) * 2019-05-24 2021-10-08 上海赛立维生物科技有限公司 细胞培养基、试剂盒及细胞培养方法
CN110904026B (zh) * 2019-11-18 2021-10-26 中国人民解放军第二军医大学 一种不同来源肝前体样细胞的制备方法及其应用
CN111088214A (zh) * 2019-12-03 2020-05-01 华中科技大学同济医学院附属同济医院 干细胞源的肝样细胞外泌体、其制备方法及其应用
WO2021211594A2 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 University Of Massachusetts Compositions and methods for treatment of acute liver failure
CN112522178B (zh) * 2020-11-27 2023-05-16 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种在体外长期培养和扩增成熟肝细胞的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001233900A (ja) * 2000-02-25 2001-08-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc 免疫抑制物質
WO2020134179A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种免疫耐受剂
CN110438157A (zh) * 2019-08-05 2019-11-12 上海赛立维生物科技有限公司 肝前体样细胞系、构建方法以及在生物人工肝领域的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEFANIA BRUNO ET AL.: "Human Liver Stem Cells SuppressT-Cell Proliferation, NK Activity, and Dendritic Cell Differentiation", 《STEM CELLS INT》, 4 April 2016 (2016-04-04), pages 1 - 2 *
STEFANIA BRUNO ET AL.: "Human Liver Stem Cells SuppressT-Cell Proliferation, NK Activity, and Dendritic Cell Differentiation", 《STEM CELLS INT》, pages 1 - 2 *
傅恭博: "人原代肝细胞来源的肝前体样细胞扩增、分化及疾病模拟", 《中国博士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》, 15 November 2019 (2019-11-15), pages 52 - 53 *
傅恭博: "人原代肝细胞来源的肝前体样细胞扩增、分化及疾病模拟，傅恭博", 《中国博士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》, pages 52 - 53 *
刘剑戎;杨扬;张英才;杨卿;潘国政;台艳;陈规划;张琪;: "HGF与CTLA-4Ig双基因修饰增强脐带间充质干细胞的免疫抑制和促增殖作用", 中山大学学报(医学科学版), no. 06 *
朱金海;陈燕凌;: "人肝细胞生长因子修饰的BMSCs对大鼠同种异体肝移植免疫排斥的影响", 中国修复重建外科杂志, no. 07 *
王新国;刘杞;孙航;: "人肝再生增强因子对体外单个核细胞PKCα-NF-κB及IL-2的影响", 第三军医大学学报, no. 21 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115322946A (zh) 2022-11-11
US20230414676A1 (en) 2023-12-28
CN115109740A (zh) 2022-09-27
CN115094020A (zh) 2022-09-23
CN115025123A (zh) 2022-09-09
WO2022188788A1 (zh) 2022-09-15
CN115105530A (zh) 2022-09-27
CN115040543A (zh) 2022-09-13
CN115105531B (zh) 2024-10-18
CN115105531A (zh) 2022-09-27
CN115322946B (zh) 2024-06-07
CN115025123B (zh) 2024-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115105529A (zh) 免疫细胞的增殖抑制细胞制剂及其应用
McKenzie et al. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system
JP5431146B2 (ja) 免疫学的寛容および調節性前駆細胞
JP6047403B2 (ja) 幹細胞免疫変調の使用方法及び装置
KR101766203B1 (ko) 재프로그래밍된 성숙 성체 세포를 이용한 치료
US20040063202A1 (en) Neurogenesis from hepatic stem cells
US20230106769A1 (en) Serum-free medium and culturing method suited for culturing blood cells such as human hematopoietic stem cells
WO2012133948A1 (ja) 生体組織から単離できるssea-3陽性の多能性幹細胞を含む他家移植用細胞治療用組成物
WO2021049617A1 (ja) ヒト造血幹細胞を培養するために適したアルブミンフリーの無血清培地およびアルブミンフリーの培養方法
JP2011520470A (ja) 哺乳動物プロジェニター細胞をインスリン産生膵島細胞に分化させる方法
WO2011048222A1 (en) Cell populations having immunoregulatory activity, methods for the preparation and uses thereof
US20170112879A1 (en) Methods of protection against ischemia reperfusion injury
WO2019070021A1 (ja) ｉＰＳ細胞由来の遺伝的多様性を有するＴ細胞集団の製造方法
US20230021683A1 (en) Preparation, expansion, and uses of adult pluripotent stem cells
AU2019345279B2 (en) Human pluripotent adult stem cells
JP2018035149A (ja) 臍帯血造血幹細胞支持物
WO2013123607A1 (zh) 用于成体干细胞的体外无血清培养的方法和培养基
US20210299173A1 (en) Enhancement of Production of NK Cells From Stem Cells
JP2006067858A (ja) 共培養による造血幹細胞の増幅方法
JP2023091619A (ja) 腫瘍を縮小、又は消失させるための組成物
WO2023200882A1 (en) Compositions and methods for treating post acute sequelae of sars-cov-2 infection (long covid)
CN115477691A (zh) 活性肽及间充质干细胞在促进脐带造血干细胞增殖中的应用
Bellio Oxygen Concentration Modulates Cardiac Stem Cell Proliferation and Migration
KR20230004559A (ko) 연골 유래 Tie2 양성 세포를 포함하는 세포 집단의 배양 방법 및 그 이용
JP2023546155A (ja) 尿由来の上皮細胞培養物、当該培養物由来の腎球体、ならびに当該腎球体の作製及び使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination