CN116064375A - 原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法 - Google Patents

原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法，涉及生物技术领域。本发明提供的原代猪肝细胞增殖培养基由液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子‑β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清组成，通过各个组分之间的协同配合作用，不仅可以实现猪肝细胞的体外长期培养，还能保持肝细胞的正常形态，维持肝细胞的部分生理特性及生物学功能，有助于促进猪肝细胞在生物人工肝中的应用。

Description

原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法。
背景技术
肝脏衰竭的治疗目前仍然是一个世界性的难题，生物人工肝(BAL)是目前肝衰竭治疗的主要有效手段之一和研究热点。选用合适的肝细胞是生物人工肝(BAL)的核心问题，目前用于生物人工肝的肝细胞主要有人肝细胞、肝肿瘤细胞株以及异种动物肝细胞，由于人肝细胞获取困难和肝肿瘤细胞株潜在的致瘤性，异种动物肝细胞被广泛应用于生物人工肝的研究中。其中，猪肝细胞由于其容易大量获取、大小及结构与人肝细胞相似、生理和代谢功能与人肝细胞最为接近等特点，已成为生物人工肝中应用最多的异种动物肝细胞。然而，原代猪肝细胞在体外存活时间短，不易在体外长期培养，这些都限制了其在生物人工肝中的应用。因此，一种稳定有效的原代猪肝细胞体外长期培养方法及培养基显得至关重要。
公开号为CN1869205A的中国发明专利申请公开了，采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原基因和人端粒酶逆转录酶导入到原代猪肝细胞，以此实现原代猪肝细胞的体外长期培养。但这种方法将整个病毒基因组导入了细胞，有潜在的致瘤性，因此在临床应用中受到限制。
公开号为CN109022348A的中国发明专利申请公开了，一种简单高效的分离培养猪原代肝细胞的方法，但该方法仅注重于分离获得数量多、活性高的原代猪肝细胞，所用培养基为H-DMEM培养基，含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5ug/ml的胰岛素，并不能让原代猪肝细胞在体外长期培养。公开号为CN107043738A的中国发明专利申请公开了，一种用于培养原代猪肝细胞的无血清培养基，该培养基能保持原代猪肝细胞的生物特性与生物学功能，但也无法令原代猪肝细胞在体外长期培养。
目前，尚未有专利报道一种用于原代猪肝细胞体外长期培养的培养基。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种原代猪肝细胞增殖培养基，该培养基能够实现肝细胞的体外长期培养，以解决上述问题。
本发明的第二目的在于提供一种原代猪肝细胞的增殖培养方法。
第一方面，本发明提供了一种原代猪肝细胞增殖培养基，由如下组分组成：
液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子-β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清。
作为进一步技术方案，所述液体基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、William’s E和RPMI1640中的至少一种；
优选地，所述血清的体积占比为1％-20％；
优选地，所述牛磺酸的浓度为0.1-10mM；
优选地，所述半乳糖的浓度为0.1-1g/L。
作为进一步技术方案，所述抗菌素包括青霉素-链霉素溶液、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液和青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液中的至少一种，所述抗菌素的体积占比为1％-3％。
作为进一步技术方案，所述细胞培养营养添加物包括L-丙氨酰-谷氨酰胺、N-2无血清添加剂和B-27无血清添加剂中的至少一种；
所述L-丙氨酰-谷氨酰胺的体积占比为0.1％-2％；
所述N-2无血清添加剂的体积占比为0.1％-3％；
所述B-27无血清添加剂的体积占比为0.1％-3％。
作为进一步技术方案，所述生长因子包括表皮生长因子、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子中的至少一种；
所述表皮生长因子的浓度为1-50ng/ml；
所述肝细胞生长因子的浓度为1-50ng/ml；
所述血小板衍生生长因子的浓度为1-100ng/ml；
作为进一步技术方案，所述转化生长因子-β通路抑制剂包括SB431542、LY364947、K02288和A-83-01中的至少一种；
所述SB431542的浓度为0.01-10uM；
所述LY364947的浓度为0.01-5uM；
所述K02288的浓度为0.01-10uM；
所述A-83-01的浓度为0.01-5uM。
作为进一步技术方案，所述WNT信号通路活化剂包括重组Wnt3a蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂中的至少一种；
所述糖原合成酶激酶3β抑制剂包括CHIR99021和TWS119中的至少一种；
所述重组Wnt3a蛋白的浓度为1-50ng/ml；
所述CHIR99021的浓度为1-10uM；
所述TWS119的浓度为1-50uM。
作为进一步技术方案，所述活性氧清除剂包括丙酮酸钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、DPI和维生素C中的至少一种；
所述丙酮酸钠的浓度为0.01-1uM；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为0.01-2uM；
所述DPI的浓度为0.01-5uM；
所述维生素C的浓度为1-20ug/ml。
作为进一步技术方案，原代猪肝细胞增殖培养基由如下组分组成：
William’s E液体基础培养基、N-2无血清添加剂1.5vol％、B-27无血清添加剂2vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺1.5vol％、表皮生长因子15ng/ml、肝细胞生长因子20ng/ml、A-83-01 2uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、重组Wnt3a蛋白2ng/ml、丙酮酸钠0.1uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.2uM、维生素C10ug/ml、牛磺酸1mM、半乳糖0.1g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清10vol％。
第二方面，本发明提供了一种原代猪肝细胞的增殖培养方法，包括：将原代猪肝细胞接种至预包被有胞外基质蛋白的培养支持物上，然后在所述的原代猪肝细胞增殖培养基中培养扩增。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的原代猪肝细胞增殖培养基由液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子-β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清组成，通过各个组分之间的协同配合作用，不仅可以实现肝细胞的长期培养(100天以上)，而且可以维持细胞的正常形态，表达正常的肝细胞标志物，如ALB和HNF4α等，保持一定的肝功能基因表达，如ALB、UGT1A1、CYP3A4等。该培养基有助于促进猪肝细胞在生物人工肝中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为刚分离的原代猪肝细胞；
图2为在体外培养9天的猪肝细胞；
图3为在体外培养第35代的猪肝细胞；
图4为体外培养第35代的猪肝细胞的肝细胞标志物(HNF4α、ALB)的免疫荧光结果；
图5为分别采用实施例1、实施例2、实施例3提供的培养基培养的，第30天的猪肝细胞明场照片；
图6为分别采用对比例1-5提供的培养基培养的，第10天的猪肝细胞明场照片。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
术语“原代细胞”，一般特指刚分出来的P0代细胞，不把传代细胞和经培养改变性状的细胞称作原代细胞。
术语“原代细胞的培养”通常是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行细胞培养。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。
第一方面，本发明提供了一种原代猪肝细胞增殖培养基，由如下组分组成：
液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子-β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清。
本发明提供的培养基，通过上述组分的协同配合作用，不仅可以实现肝细胞的体外长期培养，还能保持肝细胞的正常形态，维持肝细胞的部分生理特性及生物学功能，有助于促进猪肝细胞在生物人工肝中的应用。
需要说明的是，本发明提供的培养基适用于动物肝脏原代细胞的培养，动物肝脏为猪的肝脏组织。
在一些优选的实施方式中，所述液体基础培养基包括但不限于DMEM、DMEM/F12、William’s E和RPMI1640，或者选用本领域技术人员所熟知的其他能够用于动物细胞培养的液体培养基。
所述血清的体积占比例如可以为，但不限于1％、2％、4％、6％、10％或20％。
在一些优选的实施方式中，抗菌素用于抑制除肝细胞以外的菌体生长，本发明中抗菌素包括青霉素-链霉素溶液(即青霉素和链霉素的混合溶液，以下同理，试剂例如可以选择上海源培生物科技股份有限公司，货号为S110JV)、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(试剂例如可以选择北京索莱宝科技有限公司，货号为P7630)和青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液(试剂例如可以选择北京索莱宝科技有限公司，货号为P1410)中的至少一种，抗菌素的体积占比例如可以为，但不限于1％、2％或3％；
在一些优选的实施方式中，所述细胞培养营养添加物包括L-丙氨酰-谷氨酰胺、N-2无血清添加剂和B-27无血清添加剂中的至少一种；
所述L-丙氨酰-谷氨酰胺的体积占比例如可以为，但不限于0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％；
所述N-2无血清添加剂的体积占比例如可以为，但不限于0.1％、0.5％、1％、2％或3％；
所述B-27无血清添加剂的体积占比例如可以为，但不限于0.1％、0.5％、1％、2％或3％。
在一些优选的实施方式中，所述生长因子包括但不限于表皮生长因子、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子；
所述表皮生长因子的浓度例如可以为，但不限于5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、40ng/ml或50ng/ml；
所述肝细胞生长因子的浓度例如可以为，但不限于1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml或50ng/ml；
所述血小板衍生生长因子的浓度例如可以为，但不限于1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml或100ng/ml；
在一些优选的实施方式中，所述转化生长因子-β通路抑制剂包括SB431542、LY364947、K02288和A-83-01中的至少一种；
所述SB431542的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、1uM、5uM、8uM或10uM；
所述LY364947的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、1uM、2uM或5uM；
所述K02288的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、1uM、5uM、8uM或10uM；
所述A-83-01的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、1uM、2uM或5uM。
在一些优选的实施方式中，所述WNT信号通路活化剂包括重组Wnt3a蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂中的至少一种；
所述糖原合成酶激酶3β抑制剂包括CHIR99021和TWS119中的至少一种；
所述重组Wnt3a蛋白的浓度例如可以为，但不限于1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml或50ng/ml；
所述CHIR99021的浓度例如可以为，但不限于1uM、5uM、8uM或10uM；
所述TWS119的浓度例如可以为，但不限于1uM、5uM、10uM、20uM、40uM或50uM。
在一些优选的实施方式中，所述活性氧清除剂包括丙酮酸钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、DPI和维生素C中的至少一种；
所述丙酮酸钠的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、0.5uM或1uM；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、0.5uM、1uM或2uM；
所述DPI的浓度例如可以为，但不限于0.01uM、0.1uM、0.5uM、1uM、2uM或5uM；
所述维生素C的浓度例如可以为，但不限于1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml或20ug/ml。
在一些优选的实施方式中，所述牛磺酸的浓度例如可以为，但不限于0.1mM、0.5mM、1mM、5mM或10mM。
在一些优选的实施方式中，所述半乳糖的浓度例如可以为，但不限于0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L或1g/L。
在一些优选的实施方式中，原代猪肝细胞增殖培养基由如下组分组成：
William’s E液体基础培养基、N-2无血清添加剂1.5vol％、B-27无血清添加剂2vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺1.5vol％、表皮生长因子15ng/ml、肝细胞生长因子20ng/ml、A-83-01 2uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、重组Wnt3a蛋白2ng/ml、丙酮酸钠0.1uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.2uM、维生素C10ug/ml、牛磺酸1mM、半乳糖0.1g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清10vol％。
通过对原代猪肝细胞增殖培养基中各个组分的进一步优化和调整，使得在保持肝细胞的正常形态，维持肝细胞的部分生理特性及生物学功能的前提下，延长肝细胞的培养时间。
第二方面，本发明提供了一种原代猪肝细胞的增殖培养方法，包括：将原代猪肝细胞接种至预包被有胞外基质蛋白的培养支持物上，然后在所述的原代猪肝细胞增殖培养基中培养扩增。
本发明对于增殖培养方法的细节步骤不作具体限制，增殖培养方法例如可以如下：
①选用胞外基质蛋白对培养支持物进行预包被；
所述胞外基质蛋白可以是胶原蛋白Ⅰ、Matrigel基质胶等胞外基质蛋白。
优选的，所述的胶原蛋白Ⅰ，包被浓度为0.1-10ug/cm2。
优选的，所述的Matrigel基质胶，包被浓度为0.1％-10％。
所述培养支持物是指培养瓶或培养孔板等。
②用普通完全培养基制备原代细胞悬液，将细胞悬液接种于步骤①中经过预包被的培养支持物中，置于5％CO2、37℃孵箱中培养，使其贴壁；
所述普通完全培养基为含10％-15％血清、1％-3％二抗(青霉素和链霉素)的DMEM。
所述原代细胞为胶原酶灌注法分离的原代猪肝细胞。
③数小时后换液，去除未贴壁的肝细胞，换成前述的猪肝细胞增殖培养基培养；
所述数小时以2-4小时为佳。
④置于5％CO2、37℃孵箱中培养。
⑤每隔2-3天换一次液，所用培养基为前述的猪肝细胞增殖培养基。
⑥细胞生长至铺满培养支持物后进行传代，传代步骤如下：如步骤①对新的培养支持物进行预包被半小时以上；吸弃旧培养基，用无菌PBS洗两遍，加入适量胰蛋白酶进行消化；置于5％CO2、37℃孵箱中消化2-3分钟；加入等量普通DMEM全培终止消化；所有液体转移至离心管中，离心1400RPM、3分钟；吸弃上清，加入适量前述的猪肝细胞增殖培养基制备成细胞悬液，将细胞悬液转移至新的培养皿中，十字法摇匀。
⑦继续置于5％CO2、37℃孵箱中培养。
本发明提供的培养方法简单，能够实现猪肝细胞的体外长期培养，并保持肝细胞的正常形态并维持肝细胞的部分生理特性及生物学功能。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
一种原代猪肝细胞增殖培养基，由以下组分组成：
William’s E液体基础培养基、N-2无血清添加剂1.5vol％、B-27无血清添加剂2vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺1.5vol％、表皮生长因子15ng/ml、肝细胞生长因子20ng/ml、A-83-01 2uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、重组Wnt3a蛋白2ng/ml、丙酮酸钠0.1uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.2uM、维生素C10ug/ml、牛磺酸1mM、半乳糖0.1g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清10vol％。
实施例2
一种原代猪肝细胞增殖培养基，由以下组分组成：
DMEM液体基础培养基、N-2无血清添加剂1vol％、B-27无血清添加剂1vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺0.5vol％、表皮生长因子10ng/ml、肝细胞生长因子10ng/ml、A-83-01 1uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、丙酮酸钠0.5uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.5uM、维生素C5ug/ml、牛磺酸5mM、半乳糖0.2g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清20vol％。
实施例3
一种原代猪肝细胞增殖培养基，由以下组分组成：
RPMI1640液体基础培养基、N-2无血清添加剂0.5vol％、B-27无血清添加剂0.5vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺1vol％、表皮生长因子10ng/ml、肝细胞生长因子10ng/ml、A-83-01 2uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、重组Wnt3a蛋白2ng/ml、丙酮酸钠0.1uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.1uM、维生素C 20ug/ml、牛磺酸2mM、半乳糖0.5g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清10vol％。
对比例1
一种培养基，与实施例1的区别在于，不含表皮生长因子和肝细胞生长因子。
对比例2
一种培养基，与实施例1的区别在于，不含丙酮酸钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、维生素C。
对比例3
一种培养基，与实施例1的区别在于，不含A-83-01和LY364947。
对比例4
一种培养基，与实施例1的区别在于，不含重组Wnt3a蛋白和CHIR99021。
对比例5
一种培养基，与实施例1的区别在于，不含牛磺酸和半乳糖。
试验例1
采用实施例1-3和对比例1-7提供的培养基培养肝细胞，方法如下：
1.采用2％的Matrigel基质胶包被培养瓶，以覆盖培养瓶底部为宜，放置于37℃孵箱中半小时后使用。
2.采用胶原酶灌注法分离原代猪肝细胞，刚分离的原代猪肝细胞如图1所示。
3.用含10％-15％血清、1％-3％二抗的DMEM制备原代猪肝细胞悬液，接种于包被好了的培养瓶中，置于5％CO2、37℃孵箱中培养。
4.2小时后换液，去除未贴壁的原代猪肝细胞，换成实施例1-3和对比例1-5的培养基，于5％CO2、37℃孵箱中培养。
5.每隔2-3天换一次液，所用培养基为前述的猪肝细胞增殖培养基。
6.待细胞生长至铺满培养皿后进行传代，传代步骤如下：如步骤①对新的培养皿进行预包被半小时以上；吸弃旧培养基，用无菌PBS洗两遍，加入适量胰蛋白酶消化；置于5％CO2、37℃孵箱中消化2-3分钟；加入等量普通DMEM全培终止消化；所有液体转移至离心管中，离心1400RPM、3分钟；吸弃上清，加入适量前述的猪肝细胞增殖培养基制备成细胞悬液，将细胞悬液转移至新的培养皿中，十字法摇匀。
7.继续置于5％CO2、37℃孵箱中培养。
以实施例1提供的培养基在体外培养9天的猪肝细胞如图2所示，培养至第35代的猪肝细胞如图3所示，免疫荧光结果如图4所示，免疫荧光结果表明，猪肝细胞在体外培养至第35代时，肝细胞标志物HNF4α、ALB呈现较高水平的表达。
以实施例1、实施例2、实施例3提供的培养基培养至第30天的猪肝细胞明场照片如图5所示，结果表明，利用实施例1-3中的培养基培养猪肝细胞，细胞可长期培养(超过30天)，并且保持良好的增殖能力。
采用对比例1-5提供的培养基培养至第10天的猪肝细胞明场照片如图6所示，可以看出，减组分后的培养基培养的细胞生长增殖不良，存活时间缩短，细胞形态和状态不佳，利用对比例1-5中的培养基培养猪肝细胞，肝细胞最多存活10天，并且失去正常的细胞形态。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，由如下组分组成：
液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子-β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清。
2.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述液体基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、William’s E和RPMI1640中的至少一种；
优选地，所述血清的体积占比为1％-20％；
优选地，所述牛磺酸的浓度为0.1-10mM；
优选地，所述半乳糖的浓度为0.1-1g/L。
3.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述抗菌素包括青霉素-链霉素溶液、青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液和青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液中的至少一种，所述抗菌素的体积占比为1％-3％。
4.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述细胞培养营养添加物包括L-丙氨酰-谷氨酰胺、N-2无血清添加剂和B-27无血清添加剂中的至少一种；
所述L-丙氨酰-谷氨酰胺的体积占比为0.1％-2％；
所述N-2无血清添加剂的体积占比为0.1％-3％；
所述B-27无血清添加剂的体积占比为0.1％-3％。
5.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述生长因子包括表皮生长因子、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子中的至少一种；
所述表皮生长因子的浓度为1-50ng/ml；
所述肝细胞生长因子的浓度为1-50ng/ml；
所述血小板衍生生长因子的浓度为1-100ng/ml。
6.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述转化生长因子-β通路抑制剂包括SB431542、LY364947、K02288和A-83-01中的至少一种；
所述SB431542的浓度为0.01-10uM；
所述LY364947的浓度为0.01-5uM；
所述K02288的浓度为0.01-10uM；
所述A-83-01的浓度为0.01-5uM。
7.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述WNT信号通路活化剂包括重组Wnt3a蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂中的至少一种；
所述糖原合成酶激酶3β抑制剂包括CHIR99021和TWS119中的至少一种；
所述重组Wnt3a蛋白的浓度为1-50ng/ml；
所述CHIR99021的浓度为1-10uM；
所述TWS119的浓度为1-50uM。
8.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述活性氧清除剂包括丙酮酸钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、DPI和维生素C中的至少一种；
所述丙酮酸钠的浓度为0.01-1uM；
所述N-乙酰基-L-半胱氨酸的浓度为0.01-2uM；
所述DPI的浓度为0.01-5uM；
所述维生素C的浓度为1-20ug/ml。
9.根据权利要求1-8任一项所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，由如下组分组成：
William’s E液体基础培养基、N-2无血清添加剂1.5vol％、B-27无血清添加剂2vol％、L-丙氨酰-谷氨酰胺1.5vol％、表皮生长因子15ng/ml、肝细胞生长因子20ng/ml、A-83-012uM、LY364947 1uM、CHIR99021 5uM、重组Wnt3a蛋白2ng/ml、丙酮酸钠0.1uM、N-乙酰基-L-半胱氨酸0.2uM、维生素C10ug/ml、牛磺酸1mM、半乳糖0.1g/L、青霉素-链霉素2vol％和血清10vol％。
10.一种原代猪肝细胞的增殖培养方法，其特征在于，包括：将原代猪肝细胞接种至预包被有胞外基质蛋白的培养支持物上，然后在权利要求1-9任一项所述的原代猪肝细胞增殖培养基中培养扩增。
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