CN112538513B - 细胞外基质mb生物蛋白及其制备试剂盒与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞外基质MB生物蛋白及其制备试剂盒与方法，所述蛋白包括10％～30％的一型胶原α1链、10％～20％一型胶原的α2链、10％～30％三型胶原α1链、10％～30％弹性蛋白、3％～15％的纤维黏连蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％层黏连蛋白；所述试剂盒包括0～20ng/mLbFGF；2～20ng/mLPDGF‑bb；160ng/mLIGF～1；1～100ng/mLTGF‑β1；1～30ng/mL地塞米松；0.5～1.5％ITS；30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中至少一种。该方案能产生大量含胶原细胞外基质。
Description
技术领域
本发明实施例属于细胞外基质的制备技术领域，涉及一种细胞外基质MB生物蛋白及其制备试剂盒与方法。
背景技术
细胞外基质是细胞生存的重要微环境，能够调控细胞增殖、分化等一系列行为和功能。细胞外基质主要由胶原、蛋白多糖和粘多糖等组成。一型胶原是皮肤、骨骼等组织细胞外基质中的主要胶原蛋白类型，对细胞粘附、增殖、迁移、增殖分化具有非常重要的作用。在软硬组织损伤修复过程中也发挥了不可或缺的作用，具有重要的医学应用价值。然而，到目前为止市场上运用的胶原多来自于动物，有过敏、组织排异等风险。到目前为止尚未有成熟的人源一型胶原蛋白，尤其是利用人源间充质干细胞作为生物反应器大量生产细胞外基质复合胶原蛋白等。
因此，如何开发能够产生更多的总细胞外基质MB生物蛋白的一种细胞外基质MB生物蛋白及其制备试剂盒与方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明实施例提供了一种细胞外基质MB生物蛋白及其制备试剂盒与方法，该方法能够使间充质干细胞产生8-10倍常规间充质干细胞培养能够产生的总细胞外基质MB生物蛋白。
在本发明实施例的第一方面，提供了一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质的试剂盒，所述试剂盒包括加药诱导剂；所述试剂盒包括加药诱导剂；所述加药诱导剂包括在a-MEM或者DMEM中加入如下浓度的组分：
0～20ng/mL细胞生长因子bFGF；
2～20ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；
1～60ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；
1～100ng/mL转化生长因子TGF-β1；
1～30ng/mL地塞米松；
0.5～1.5％细胞培养添加物ITS；
大分子刺激药物：包括30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一种。
进一步地，所述加药诱导剂包括在a-MEM或者DMEM中加入如下浓度的组分：
1～3ng细胞生长因子bFGF；
3～12ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；
5～15ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；
3～10ng/mL转化生长因子TGF-β1；
3～10ng/mL地塞米松，
0.5～1.5％细胞培养添加物ITS；
大分子刺激药物：包括30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一种。
在本发明实施例的第二方面，提供了一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入所述的加药诱导剂，进行诱导培养3～5天，获得诱导期细胞培养物；
将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入所述的大分子刺激药物进行维持培养3～5天，获得维持期细胞培养物；
将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入所述的大分子刺激药物进行加速培养2～4天，获得加速期细胞培养物；
将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得所述细胞外基质MB生物蛋白。
进一步地，所述维持期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清2～9份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
进一步地，所述加速期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清5～15份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
进一步地，所述加速培养中，还加入如下使用终浓度的组分：
0～4ng细胞生长因子bFGF，1～4ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb，1～2ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1，1～6ng/mL转化生长因子TGF-β1，1～3ng/mL地塞米松，1％细胞培养添加物ITS，大分子刺激药物。
进一步地，所述人源间充质干细胞为第3～10代；所述人源间充质干细胞包括人源脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞和脐带间充质干细胞中的一种。
进一步地，所述诱导培养、所述维持培养和所述加速培养均于5％CO2，温度37℃的条件下培养。
在本发明实施例的第三方面，提供了一种细胞外基质MB生物蛋白，所述细胞外基质MB生物蛋白以质量分数计包括：10％～30％的一型胶原α1链、10％～20％一型胶原的α2链、10％～30％三型胶原α1链、10％～30％弹性蛋白、3％～15％的纤维黏连蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％层黏连蛋白。
在本发明实施例的第四方面，提供了所述的细胞外基质MB生物蛋白在细胞移植、再生医学或者组织工程中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质的试剂盒、方法及制得的细胞外基质，将将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入所述的加药诱导剂，诱导2～4天，获得诱导期细胞培养物的细胞形态相对于不加药培养组发生明显变化细胞从细长的梭形变成宽胖的梭形；该方法，相对于其他已报道的单纯血清培养加大分子药物刺激的方法，能够产生更多的细胞外基质MB生物蛋白，这是由于间充质干细胞本身分泌的细胞外基质胶原有限，而诱导培养基中生长因子组合能将间充质干细胞初步诱导分化成能够分泌含更多细胞外基质胶原蛋白的前体细胞，在大分子药物的刺激下能够产生大量的含胶原细胞外基质。Real-time PCR检测显示本发明实施例的技术方案相对于仅加入胎牛血清培养的方案能够增加2-4倍一型胶原和20-30倍弹性蛋白的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1-实施例3和对比例4在培养后的显微镜下照片；其中，图1A为实施例1-实施例5和对比例4在培养1天后的显微镜下细胞照片；图1B为实施例1-实施例5和对比例1在培养6天后的显微镜下照片；
图2为实施例1-实施例3和对比例4中脱细胞后获得的细胞外基质膜片的显微镜下图片；
图3为对比例1-对比例3和实施例1-实施例3脱细胞后获得的细胞外基质膜片的显微镜下图片；
图4为实施例1、实施例3获得的细胞外基质MB生物蛋白和对比例4的细胞外基质蛋白进行的SDS-PAGE电泳图；
图5为对比例1-对比例3的细胞外基质蛋白和实施例1-实施例3脱细胞后获得的细胞膜片细胞外基质MB生物蛋白组分运用ImageJ定量分析结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。本发明实施例中的使用终浓度是指加入到a-MEM或者DMEM后的浓度。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明实施例的一种典型实施方式，提供了一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质的试剂盒，所述试剂盒包括加药诱导剂；所述加药诱导剂包括在a-MEM或者DMEM中加入如下浓度的组分：
0～20ng/mL细胞生长因子bFGF；
2～20ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；
1～60ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；
1～100ng/mL转化生长因子TGF-β1；
1～30ng/mL地塞米松；
0.5～1.5％细胞培养添加物ITS；
大分子刺激药物：包括30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一种。
该实施方式中，
所述细胞培养添加物ITS，购买自milipore；
本申请的发明人经过试验发现：添加所述大分子刺激药物和0～20ng/mL细胞生长因子bFGF；2～20ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；1～60ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；1～100ng/mL转化生长因子TGF-β1；各组分之间可以产生协同作用，缺少任一组分，或者各组分不在本发明实施例的浓度范围内，均难以得到本发明实施例的细胞外基质MB生物蛋白。
作为优选的实施方式，所述加药诱导剂包括在a-MEM或者DMEM中加入如下浓度的组分：
1～3ng细胞生长因子bFGF；
3～12ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；
5～15ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；
3～10ng/mL转化生长因子TGF-β1；
3～10ng/mL地塞米松；
0.5～1.5％细胞培养添加物ITS；
大分子刺激药物：包括30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一种。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入所述的加药诱导剂，进行诱导培养3～5天，获得诱导期细胞培养物；
将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入所述的大分子刺激药物进行维持培养3～5天，获得维持期细胞培养物；
将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入所述的大分子刺激药物进行加速培养2～4天，获得加速期细胞培养物；
将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得所述细胞外基质MB生物蛋白。
该实施方式中，先加如诱导剂诱导，后将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，再进行加速培养，这样有利于产生大量的含胶原细胞外基质。本申请发明人经实验发现：在仅有10％FBS培养体系中，大分子药物(卡拉胶、硫酸葡聚糖、黄原胶)的体积挤出效果并不明显；而本申请的阶段诱导刺激方案，同样的大分子药物刺激情况下，我们分阶段加入生长因子诱导新方案中细胞外基质形成的更多。这是由于间充质干细胞本身分泌的细胞外基质胶原有限，而诱导培养基中生长因子组合能将间充质干细胞初步诱导分化成能够分泌含更多细胞外基质胶原蛋白的前体细胞，在大分子药物的刺激下能够产生大量的含胶原细胞外基质。
此外，本发明实施例还具有以下优点：
利用人源间充质干细胞作为表达载体，排除异种细胞残留造成的排异和过敏。
利用人源重组细胞因子和物理方法进行刺激，而非采用质粒或者病毒转基因的方法促进胶原等细胞外基质的表达，具有较高的安全性。
因为反应体系中只采用人源细胞、人源重组细胞因子及物理方法刺激胶原蛋白的产生，使得细胞外基质复合胶原蛋白的提取和纯化变得简单，大大降低了提取、纯化时间和成本。
作为一种可选的实施方式，所述完全培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM100份；
胎牛血清9.5～10.5份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
作为一种可选的实施方式，所述维持期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清2～9份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
作为一种可选的实施方式，所述加速期培养基按体积份数计包括：
所述加速期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清5～15份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
作为一种可选的实施方式，所述人源间充质干细胞为第3～10代；所述人源间充质干细胞包括人源脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞和脐带间充质干细胞中的一种。
作为一种可选的实施方式，所述诱导培养、所述维持培养和所述加速培养均于5％CO2，温度37℃的条件下培养。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了一种细胞外基质MB生物蛋白，所述细胞外基质MB生物蛋白以质量分数计包括：10％～30％的一型胶原α1链、10％～20％一型胶原的α2链、10％～30％三型胶原α1链、10％～30％弹性蛋白、3％～15％的纤维黏连蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％层黏连蛋白。
所述细胞外基质MB生物蛋白的全称为matrix biologics蛋白。
采用所述方法制备得到的细胞外基质MB生物蛋白，Real-time PCR检测显示本发明实施例的技术方案相对于仅加入胎牛血清培养的方案能够增加2-4倍一型胶原和20-30倍弹性蛋白的产量。这样有利于将所述细胞外基质MB生物蛋白进行应用，其中的胶原蛋白在生物医学材料与临床应用、美容与保健中有着广泛的应用；由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度、又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，又有较好的平滑性和弹性缝合结头不易松散，操作过程中不易损伤机体组织。
根据本发明实施例的另一种典型实施方式，提供了所述的细胞外基质在细胞移植、再生医学或者组织工程中的应用。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。
实施例1：卡拉胶组
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养4天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：
10ng bFGF，20ng/mL PDGF-bb，30ng/mL IGF-1，20ng/mL TGF-β1，6ng/mL地塞米松，1％ITS，30ug/mL卡拉胶；
所述完全培养基的配方为：α-MEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为150uM。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：30ug/mL卡拉胶，进行维持培养4天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清7份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；终浓度为150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物：30ug/mL卡拉胶，进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例2：黄原胶组
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养3天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：10ng bFGF，20ng/mL PDGF-bb，30ng/mL IGF-1，20ng/mL TGF-β1，6ng/mL地塞米松，1％ITS，0.5mg/mL黄原胶；
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：0.5mg/mL黄原胶，进行维持培养3天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：α-MEM或者DMEM 100份；胎牛血清2份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物：0.5mg/mL黄原胶，进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸；
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例3：硫酸葡聚糖组
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养5天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：0ng bFGF，5ng/ml PDGF-bb，30ng/ml IGF-1，40ng/ml TGF-β1，2ng/ml地塞米松，1％ITS,30ug/ml硫酸葡聚糖。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入30ug/ml硫酸葡聚糖进行维持培养5天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：α-MEM或者DMEM 100份；胎牛血清2份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入30ug/ml硫酸葡聚糖，进行加速培养5天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸；
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例4：卡拉胶+黄原胶
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养4天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：
20ng bFGF，20ng/mL PDGF-bb，60ng/mL IGF-1，100ng/mL TGF-β1，30ng/mL地塞米松，1.5％ITS，100ug/mL卡拉胶+1mg/mL黄原胶；
所述完全培养基的配方为：α-MEM或DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为150uM。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：100ug/mL卡拉胶+1mg/mL黄原胶，进行维持培养4天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清7份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；终浓度为150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物：100ug/mL卡拉胶+1mg/mL黄原胶，还加入如下使用终浓度的组分：
2ng细胞生长因子bFGF，3ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb，1.5ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1，3ng/mL转化生长因子TGF-β1，2ng/mL地塞米松，1％细胞培养添加物ITS和所述大分子刺激药物；
后进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例5：卡拉胶+硫酸葡聚糖
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养4天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：
10ng bFGF，2ng/mL PDGF-bb，1ng/mL IGF-1，1ng/mL TGF-β1，1ng/mL地塞米松，0.5％ITS，50ug/mL卡拉胶+0.1mg/mL硫酸葡聚糖；
所述完全培养基的配方为：α-MEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为150uM。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：50ug/mL卡拉胶+0.1mg/mL硫酸葡聚糖，进行维持培养4天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清7份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；终浓度为150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物50ug/mL卡拉胶+0.1mg/mL硫酸葡聚糖，还加入如下使用终浓度的组分：
2ng细胞生长因子bFGF，3ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb，1.5ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1，3ng/mL转化生长因子TGF-β1，2ng/mL地塞米松，1％细胞培养添加物ITS和所述大分子刺激药物；
后进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例6：黄原胶+硫酸葡聚糖
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养4天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：
2ng bFGF，10ng/mL PDGF-bb，10ng/mL IGF-1，7ng/mL TGF-β1，7ng/mL地塞米松，0.5％ITS，0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖；
所述完全培养基的配方为：α-MEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为150uM。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖，进行维持培养4天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清7份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；终浓度为150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物：0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖，还加入如下使用终浓度的组分：
2ng细胞生长因子bFGF，3ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb，1.5ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1，3ng/mL转化生长因子TGF-β1，2ng/mL地塞米松，1％细胞培养添加物ITS和所述大分子刺激药物；
后进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
实施例7：卡拉胶+黄原胶+硫酸葡聚糖
本实施例提供一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，所述方法包括：
S1、将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入加药诱导剂，进行诱导培养4天，获得诱导期细胞培养物；其中，所述加药诱导剂包括如下使用终浓度的组分：
2ng bFGF，10ng/mL PDGF-bb，10ng/mL IGF-1，7ng/mL TGF-β1，7ng/mL地塞米松，0.5％ITS，50ug/mL卡拉胶+0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖；
所述完全培养基的配方为：α-MEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为150uM。
S2、将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物：50ug/mL卡拉胶+0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖，进行维持培养4天，获得维持期细胞培养物；所述维持期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清7份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；终浓度为150uM抗坏血酸。
S3、将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物：50ug/mL卡拉胶+0.01mg/mL黄原胶+0.05mg/mL硫酸葡聚糖，还加入如下使用终浓度的组分：
2ng细胞生长因子bFGF，3ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb，1.5ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1，3ng/mL转化生长因子TGF-β1，2ng/mL地塞米松，1％细胞培养添加物ITS和所述大分子刺激药物；
后进行加速培养3天，获得加速期细胞培养物；所述加速期培养基按体积份数计包括：DMEM 100份；胎牛血清10份；青链霉素混合液1份；谷氨酰胺1份；150uM抗坏血酸。
S4、将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得细胞外基质。
对比例1：10FBS+卡拉胶
该对比例的方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入30ug/mL卡拉胶，培养7～10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料。
对比例2：10FBS+黄原胶
该对比例的方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入0.5mg/mL黄原胶，培养7～10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料。
对比例3：10FBS+硫酸葡聚糖
该对比例的方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，后加入30ug/ml硫酸葡聚糖，培养7～10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料。
对比例4：10FBS普通培养组
该对比例的方法为：将脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，密度75％～90％时，加入完全培养液培养7-10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液，构建成细胞外基质生物材料；所述完全培养基组分同实施例1。
对比例5
该对比例中的所述加药诱导剂不含PDGF-bb，其他步骤均同实施例1；无法制备得到本发明实施例1的细胞外基质蛋白。
对比例6
该对比例中的所述加药诱导剂不含IGF-1，其他步骤均同实施例1；无法制备得到本发明实施例1的细胞外基质蛋白。
对比例7
该对比例中的所述加药诱导剂TGF-β1，其他步骤均同实施例1；无法制备得到本发明实施例1的细胞外基质蛋白。
实验例1
1、实施例1-实施例3和对比例4的普通培养组进行比较：
实施例1-实施例3和对比例4的普通培养组在培养1天后的电镜图如图1A所示，实施例1-实施例5和对比例1在培养6天后的电镜图如图1B所示，可知加药组细胞形态相对于普通培养组发生明显变化：获得诱导期细胞培养物的细胞形态相对于不加药培养组发生明显变化细胞从细长的梭形变成宽胖的梭形。
2、实施例1-实施例3和对比例4获得的完整的细胞外基质(extracellularmatrix)膜片的电镜图如图2所示，由图2可知，显微镜下可以明显看到加药刺激组(实施例1-实施例3)的细胞外基质明显多于对比例4中常规10％FBS培养的细胞外基质。
2、实施例1-实施例3和对比例1-3培养组进行比较：
对比例1-3分别为：10％胎牛血清培养(FBS)加大分子药物(卡拉胶、硫酸葡聚糖、黄原胶)刺激；对比例1-对比例3和实施例1-实施例3脱细胞后获得的细胞外基质膜片的显微镜下图片如图3可知：在仅有10％FBS培养体系中，大分子药物(卡拉胶、硫酸葡聚糖、黄原胶)的体积挤出效果并不明显(excluded-volume effect)；
图5为细胞膜片细胞外基质蛋白组分运用ImageJ定量分析结果，表明本发明实施例1-3的方案相比较对比例1-3，能够产生更多的细胞外基质。相对于本发明实施例1-3的方案来看，同样的大分子药物刺激情况下，我们分阶段加入生长因子诱导新方案中细胞外基质形成的更多。
这是由于间充质干细胞本身分泌的细胞外基质胶原有限，而诱导培养基中生长因子组合能将间充质干细胞初步诱导分化成能够分泌含更多细胞外基质胶原蛋白的前体细胞，在大分子药物的刺激下能够产生大量的含胶原细胞外基质。
3、将实施例1、实施例3和对比例4获得的细胞外基质MB生物蛋白进行SDS-PAGE电泳实验，结果图4，表明本发明实施例1-3生产的细胞外基质MB生物蛋白浓度更好，并且除了含有一型胶原的α1和α2链之外还含有其他的细胞外基质MB生物蛋白成分：弹性蛋白、纤维黏连蛋白、核心蛋白聚糖和层黏连蛋白；
综上可知，对于单纯血清培养加大分子药物刺激的方法，本发明实施例的方法能够产生更多的细胞外基质蛋。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
将人源间充质干细胞于完全培养基中培养至细胞汇合度为75％～90％，加入加药诱导剂，进行诱导培养3～5天，获得诱导期细胞培养物，所述加药诱导剂包括在a-MEM或者DMEM中加入如下浓度的组分：
1～3ng细胞生长因子bFGF；
3～12ng/mL血小板衍生因子PDGF-bb；
5～15ng/mL胰岛素样生长因子IGF-1；
3～10ng/mL转化生长因子TGF-β1；
3～10ng/mL地塞米松；
0.5～1.5％细胞培养添加物ITS；
将所述诱导期细胞培养物于维持期培养基中，并加入大分子刺激药物进行维持培养3～5天，获得维持期细胞培养物；
将所述维持期细胞培养物于加速期培养基中，并加入大分子刺激药物进行加速培养2～4天，获得加速期细胞培养物；
将所述加速期细胞培养物加入脱细胞液，获得所述细胞外基质MB生物蛋白；所述维持期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清2～9份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM；
所述大分子刺激药物包括30～100ug/mL卡拉胶、0.01～1mg/mL黄原胶和0.03～0.1mg/mL硫酸葡聚糖中的至少一种；
所述细胞外基质MB生物蛋白以质量分数计包括：10％～30％的一型胶原α1链、10％～20％一型胶原的α2链、10％～30％三型胶原α1链、10％～30％弹性蛋白、3％～15％的纤维黏连蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％层黏连蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述加速期培养基按体积份数计包括：
α-MEM或者DMEM 100份；
胎牛血清5～15份；
青链霉素混合液0.5～1.5份；
谷氨酰胺0.5～1.5份；
抗坏血酸；所述抗坏血酸的终浓度为100～200uM。
3.根据权利要求1所述的一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述人源间充质干细胞为第3～10代；所述人源间充质干细胞包括人源脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞和脐带间充质干细胞中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法，其特征在于，所述诱导培养、所述维持培养和所述加速培养均于5％CO2，温度37℃的条件下进行。
5.一种细胞外基质MB生物蛋白，其特征在于，所述细胞外基质MB生物蛋白根据权利要求1-4中任一项所述的利用人间充质干细胞生产细胞外基质MB生物蛋白的方法制备获得，所述细胞外基质MB生物蛋白以质量分数计包括：10％～30％的一型胶原α1链、10％～20％一型胶原的α2链、10％～30％三型胶原α1链、10％～30％弹性蛋白、3％～15％的纤维黏连蛋白、3％～15％的核心蛋白聚糖和1％～8％层黏连蛋白。
6.权利要求5所述的细胞外基质MB生物蛋白在细胞移植、再生医学或者组织工程中的应用。
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