CN110898078A - 一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞分泌因子的制备方法。与其他来源的间充质干细胞相比，如脐带间充质干细胞，本发明使用的多能诱导干细胞来源的间充质干细胞，来源更稳定，体外传代不易衰老。本方法制备工艺简单，所获得的间充质干细胞分泌因子，成分为人源性干细胞的分泌因子，避免了干细胞本身潜在的致瘤隐患，不含有任何外源性添加剂及防腐剂，不含支原体及内毒素，不易诱发敏感，便于储存，有更强的促血管生成能力及促皮肤缺损愈合能力，并对血管细胞增殖及血管新生有明显的促进作用，通过外敷的方式使用，可促进皮肤修复，延缓皮肤衰老，在皮肤损伤治疗及美容护肤产品的开发中具有强大的应用前景。

Description

一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用

技术领域

本发明属于医疗健康领域，具体涉及一种基于多能诱导干细胞来源的间充质干细胞分泌因子的制备以及在促进血管新生及皮肤抗衰老修复方向的应用。

背景技术

衰老是机体生命活动发展的必经阶段，而皮肤衰老是机体衰老最外在的特征。研究表明，皮肤衰老是一个复杂的生理过程，是由多种机制综合作用的结果，除了广义上的胶原纤维合成减少和弹力纤维变性，血管老化也被认为是皮肤衰老的重要标志之一。减缓血管老化，促进血管新生将是皮肤年轻化治疗的新方向。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有组织修复能力强、自我更新能力强及多向分化，免疫原性低等特征，在临床应用中显示的极高的安全性，是组织工程学上理想的种子细胞。不同组织来源的MSC具有许多共同的生物学特性，但在免疫表型、分化潜能、转录组、蛋白质组和免疫调节活性等方面存在差异。来源于脐带的间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells，uMSC)取材方便，无道德伦理争议，具有极强的免疫调节能力，是极具临床应用潜力的细胞来源。然而，uMSC在体外传代的过程中容易衰老，表型发生变化，逐渐丧失分化能力成为均一化的“成纤维细胞”，影响了uMSC的临床应用及治疗效果。与之相比，多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)拥有无限的自我更新能力以及多胚层分化能力，可以在体外维持足量的细胞储备，更重要的是，iPSC在合适条件下可诱导分化为MSC(iMSC)，iPSC为MSC来源提供了新的选择。然而目前，尚未有关于iMSC的临床研究。

研究表明MSC可以通过促进血管新生，改善局部的血供，从而促进受损组织的修复和再生。MSC的组织修复功能在很大程度上是通过旁分泌实现的。MSC可以分泌细胞因子如血管生成素(angiogenin)，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)等，促进血管新生。

而目前，尚未有关于iMSC在促进血管新生及皮肤抗衰老修复的美容产品。

发明内容

本发明提供了一种间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括如下步骤：

1)选用多能诱导干细胞，加入间充质干细胞完全培养基进行分化，12-16天后，较优地，14天后，用对细胞进行分选，较优地，采取流式分选，得到CD105阳性的细胞群，使用间充质干细胞完全培养基进行扩增；优选地，所述的间充质干细胞完全培养基为低糖DMEM培养基，并进一步包含10％胎牛血清、100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM GlutaMAX，非必需氨基酸以及55μMβ巯基乙醇；更优地，所述间充质干细胞完全培养基还包含EGF和FGF，所述的EGF及FGF的浓度范围为2ng/mL-5ng/mL。

2)扩增至P4代次时对所得到的间充质干细胞进行表面标志物的鉴定，筛选具有间充质干细胞特征的细胞进行后续培养；在一些方案中，所述的表面标志物为CD11、CD34、CD45、CD73、CD90和/或CD105中的一种或多种，所述间充质干细胞特征为CD11、CD34、CD45表达阳性率在0～2％区间内，CD73、CD90、CD105表达阳性率在90％～100％区间内。

3)继续培养至P5、P6、P7或P8代，当细胞汇合度为60％-70％时，吸去所述间充质干细胞完全培养基，使用平衡液润洗后，加入低糖DMEM；优选地，所述低糖DMEM为无酚红低糖DMEM。在一些优选方案中，所述平衡液为0.9％生理盐水或PBS；在另一些方案中，润洗次数为2-5次，较优地，为3次。

4)继续培养12-36小时后，优选地，24小时后，收集细胞培养上清液，所述上清液经离心去除细胞碎片和杂质后过滤，即得包含所述间充质干细胞分泌因子的溶液；较优地，过滤采用滤膜过滤；更优地，滤膜孔径为0.22μm。

在一些方案中，对步骤1)-4)制备的间充质干细胞分泌因子进行支原体及内毒素检测，当结果为阴性时将制得的间充质干细胞分泌因子分装后冷冻保存；优选地，冷冻保存的温度为-30℃～0℃，更优地，为-20℃；较优地，使用前于4℃融化。

本发明还提供了一种通过上述制备方法制得的间充质干细胞分泌因子，以及所制备的间充质干细胞分泌因子在制备促进血管增殖或血管新生、或者促进皮肤创面修复或愈合的药物和/或化妆品中的应用。

本发明还提供了一种促进皮肤创面修复或愈合的组合物，其中包含以上述制备方法制得的间充质干细胞分泌因子。

本发明还提供了一种修复皮肤创面或促进创面愈合的方法，采用比皮肤创面稍大的无菌棉片，覆盖于皮肤创面上，向棉片滴注采用上述制备方法制得的间充质干细胞分泌因子。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种间充质干细胞分泌因子的制备方法，其以多能诱导干细胞为来源，该方法制作工艺简单，便于储存。

(2)本发明方法制备的间充质干细胞分泌因子，不含任何外源性添加剂及防腐剂，不易诱发敏感，在促血管生成因子的含量高、促血管新生能力和促皮肤缺损修复能力强，具有皮肤抗衰老及促进皮肤缺损修复的作用，可用于促进皮肤创面修复或愈合的药物和/或化妆品。

(3)本发明在间充质干细胞分泌因子的使用方式上，准备比皮肤创面稍大的无菌小棉片，覆盖于皮肤创面上，通过向小棉片滴注的方式给药，使用方法简单，无创，安全性高，且可促进血管新生及皮肤修复，适用于美容化妆品或皮肤疾病治疗药物的研发及应用。

附图说明：

图1为iMSC的诱导过程。

图2为uMSC及iMSC的鉴定情况，包括表面标志物(A)，细胞形态(B)及分化能力鉴定(C)结果图；

图3为uMSC-CdM/iMSC-CdM的制备流程示意图；

图4为细胞汇合度为60-70％及80-90％对制备的iMSC-CdM总蛋白浓度(A)及细胞因子含量(B)的影响(*p<0.05,**p<0.01)；

图5为uMSC-CdM/iMSC-CdM的总蛋白浓度及细胞因子含量测定(***p<0.001)；

图6为uMSC-CdM/iMSC-CdM对HUVEC细胞增殖作用的对比(*p<0.05)；

图7为uMSC-CdM/iMSC-CdM对HUVEC细胞成管作用的对比(*p<0.05,**p<0.01)；

图8为uMSC-CdM/iMSC-CdM对皮肤血管新生作用的对比：(A)在皮肤创面覆盖无菌小棉片后在小棉片上滴注药物，(B)uMSC-CdM及iMSC-CdM组新生血管标志物CD31的表达均高于对照组，且iMSC-CdM组新生血管标志物CD31的表达显著高于uMSC-CdM组。

具体实施方式：

除非另有说明，本发明的方法与技术通常依据本领域已知的传统方法进行；除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学及蛋白质与核酸化学所涉及的命名法与其技术均是本领域已知且常用的。

除非另有说明，否则下列术语具有如下定义：

“多能诱导干细胞”，induced pluripotent stem cell,又称人工诱导多能干细胞，常简称为iPS细胞(iPSC)，是一种由哺乳动物成体细胞经转入转录因子等手段脱分化形成的多能干细胞，拥有无限的自我更新能力以及多胚层分化能力，可以在体外维持足量的细胞储备，可以进行基因编辑。多能诱导干细胞的“代次”是指细胞传代的次数，常规定义是细胞用消化酶消化一次，细胞代数就增加一代。

“间充质干细胞”，mesenchymal stem cell，MSC，是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞。事实上，MSC广泛存在于全身多种组织中，几乎来源于机体所有的组织器官，如骨髓、骨膜、脂肪组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊水及胎儿组织等，比如，来源于脐带的间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells)简写作uMSC。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性方面，如可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。MSC除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。MSC可以通过旁分泌或自分泌发挥治疗作用，其疗效与血管生成、免疫调节及细胞凋亡有关。对于基于多能诱导干细胞来源的间充质干细胞(iMSC)而言，在iPSC中加入MSC完全培养开始诱导时，“代次”记为P0，以后每用消化酶消化一次，细胞代数增加一代。

“间充质干细胞分泌因子”，简写作MSC-CdM，即MSC所分泌的生物活性分子的总和，包括细胞因子、趋化因子和生长因子等多种活性成分，对损伤组织的修复、再生及功能恢复等许多生理过程具有调控作用。在本专利中，iMSC分泌因子简写作“iMSC-CdM”，uMSC分泌因子简写为“uMSC-CdM”。

“细胞汇合度”是细胞体外培养环节中的重要参数。当细胞平均铺在培养瓶上后，呈单个独立的状态，随着细胞增殖，就会向周围平铺，出现在细胞间的粘连和排列状态，达到某种状态用汇合度％表示。细胞汇合度指是指贴壁细胞占据培养瓶表面积的比例。

“表面标志物”是指镶嵌在细胞膜脂质双层结构中的膜蛋白，包括膜抗原、膜受体及其他分子，不仅是免疫细胞之间相互识别的物质基础，也是细胞间或细胞与基质间相互识别的物质基础。包括受体、MHC分子、协调刺激分子等。CD分子是最常用的细胞表面标记物之一，指应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原，包括细胞的特定形态、特定功能和发育阶段。间充质干细胞的表面标记物，根据国际细胞治疗学会的定义，通常为具有关键表面标志分子，包括：CD29、CD44、CD73、CD105和CD146，并且不具有如下表面标志分子：CD34、CD45、CD14、CD11b，CD79α，CD19和HLA-DR。

“血管生成素”，angiogenin，是一个与血管新生密切相关的蛋白家族。

“表皮生长因子”，epidermal growth factor，EGF，是人体内一种重要的活性蛋白质多肽物质，能够快速修复受损皮肤，以及改善性的提高皮肤的修复、护理。

“成纤维细胞生长因子”，即fibroblast growth factor，FGF。它有几种异构体，其中包括“碱性成纤维细胞生长因子”，(basic fibroblast growth factor，bFGF)。bFGF可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌，是一个传递发育信号、能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂的多肽，具有强烈的血管生成作用。

“血管内皮生长因子”，vascular endothelial growth factor，VEGF，又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

“肝细胞生长因子”，hepatocyte growth factor，HGF，是一种多功能细胞生长因子，可促进血管再生，增强细胞抗凋亡活力，并减轻组织修复中纤维化程度。

“DMEM”，dulbecco's modified eagle medium，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。

“非必需氨基酸”是指可在生物体内合成，作为营养源不需要从外部补充的氨基酸。非必需氨基酸的添加有助于促进干细胞的增殖。在本专利中，非必需氨基酸指几种氨基酸的合剂，包括Glycine，L-Alanine，L-Asparagine，L-Aspartic acid，L-Glutamic Acid，L-Proline，L-Serine；以上各种氨基酸的工作浓度为100μM。

“双抗”，是一种专门用于细胞培养的青链霉素混合液，可以直接添加到细胞培养液内。常用的双抗青霉素的含量为10000unit/mL，链霉素的含量为10000μg/mL，在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100units/mL青霉素及100μg/mL链霉素。

“GlutaMAX”，即谷氨酰胺二肽，是一种L-谷氨酰胺衍生物，后者是细胞培养中细胞进行能量生成以及蛋白质和核酸合成所必需的一种营养素。GlutaMAX在水溶液中较L-谷氨酰胺更稳定，不会自发降解。

“β巯基乙醇”是干细胞培养中较为重要的添加物，主要原理是防止二硫键被氧化，从而保护蛋白不被自由基氧化。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 iMSC的诱导，扩增及鉴定

选用状态良好的iPSC，更换iPSC培养基为MSC完全培养基。每2-3天更换培养基，持续约14天。使用MSC标志物CD105对分化细胞进行流式分选，得到CD105阳性的细胞。使用MSC完全培养基继续扩增培养。MSC完全培养基组分为：低糖DMEM，10％胎牛血清，非必需氨基酸，双抗(含100units/mL青霉素及100μg/mL链霉素)，2mM GlutaMAX，2ng/mL EGF,2ng/mLFGF,55μMβ巯基乙醇。分化流程见图1。

将汇合度为90％的P4代细胞消化(使用Tryple E进行细胞消化)后，计数，并配制成密度为1×10⁶个细胞/mL的细胞悬液，用40μm细胞筛网过滤，分别取1mL滤液，向滤液中分别加入10μL含荧光标记的细胞表面标志物抗体，置于4℃，避光条件下孵育20分钟。使用的抗体有包括CD11，CD34，CD45，CD73，CD90和CD105，这些抗体均购自BD公司。孵育完成后，用PBS清洗一次，于1200rpm离心5分钟，弃上清，向细胞沉淀中加入250μL 0.9％的生理盐水混匀，然后再加入250μL 4％的多聚甲醛固定，然后采用Beckman公司的流式细胞分析仪进行检测分析，检测结果见图2A。iMSC与uMSC均不表达造血细胞表面标志如CD11、CD34、CD45，表达阳性率<0.5％；表达MSC阳性标志物如CD73、CD90、CD105，表达阳性率>99％(表1)。

表1 uMSC/iMSC表面标志物表达阳性率

iMSC及uMSC镜下形态呈梭形，如图2B所示。iMSC及uMSC经适当的培养基诱导(成脂培养基，Thermo Fisher，A1007001；成骨培养基Thermo Fisher，A1007201；成软骨培养基，Thermo Fisher，A1007101)后，可向脂肪，骨及软骨分化，如图2C所示。实验步骤按照相应的说明书进行。

实施例2 iMSC-CdM的制备及储存

选用P5-P8代，增殖能力旺盛的iMSC进行细胞因子上清液的制备；iMSC-CdM的制备步骤为：P5-P8代的iMSC，细胞汇合度为60％-70％时，吸去完全培养基，使用0.9％生理盐水润洗3遍后，按照培养皿面积加入适量无酚红低糖DMEM(Gibco，#11054)(具体参照表2)；培养24小时后，收集细胞培养上清，1200rpm离心5分钟去除细胞碎片及杂质，使用0.22μm滤膜进行过滤后，分装；经上述步骤制备的iMSC-CdM经支原体及内毒素检测(第三方检测公司)，结果为阴性。

经上述步骤制备的iMSC-CdM分装后冻存于-20℃，使用前于4℃融化，在4℃中可保存2周。

uMSC-CdM的制备及储存方法与iMSC-CdM相同。

以上所述步骤可见图3。

表2 iMSC-CdM制备---培养皿大小及培养基体积参考

实施例3不同细胞汇合度对iMSC-CdM总蛋白及关键组分的影响

分别在细胞汇合度为60-70％时及80-90％时进行iMSC-CdM的制备，制备步骤如实施例2所述。

使用BCA法对iMSC-CdM中的总蛋白浓度进行测定。

使用蛋白芯片或Elisa法对iMSC-CdM中的关键组分包括angiogenin，bFGF，HGF，VEGF进行浓度的测定。

如图4(A，B)所示，细胞汇合度为60％-70％时进行iMSC-CdM的制备，iMSC-CdM中的总蛋白含量约为汇合度80％-90％的1.2倍，且其中促血管生成因子含量，包括angiogenin，bFGF，HGF，VEGF，较汇合度80％-90％时高。细胞汇合度为60％-70％较80％-90％更利于富集iMSC-CdM中的蛋白组分。

实施例4 uMSC-CdM及iMSC-CdM的总蛋白及关键组分浓度的比较

uMSC-CdM及iMSC-CdM制备步骤如实施例2所述。

使用BCA法对uMSC-CdM及iMSC-CdM的总蛋白浓度进行测定。

使用蛋白芯片或Elisa法对uMSC-CdM及iMSC-CdM中的关键组分包括angiogenin，bFGF，HGF，VEGF进行浓度的测定。

如图5(A，B)所示，iMSC-CdM较同样条件制备的uMSC-CdM，含有更高浓度的促血管生成因子，iMSC-CdM组分中含有angiogenin(≥250pg/mL)，bFGF(≥9000pg/mL)，HGF(≥4000pg/mL)，VEGF(≥50pg/mL)。

实施例5 iMSC-CdM对血管新生的促进作用

iMSC-CdM对血管新生的促进作用优于uMSC-CdM，主要表现为促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖以及成管，促进皮肤新生血管的生成。

1.iMSC-CdM对HUVEC增殖的促进作用

实验分三组：a)对照组：无酚红低糖DMEM+1％FBS，b)uMSC-CdM组：uMSC-CdM+1％FBS；c)iMSC-CdM组：iMSC-CdM+1％FBS；

HUVEC细胞消化并计数，使用不用组别对应的培养基重悬成细胞悬液(3×10⁴/mL)，以细胞密度约为3×10³个/孔接种于96孔板。每组3个复孔，每孔100μL。

在37℃，5％CO₂培养箱中培养。4小时细胞贴壁后，更换完全培养基为高糖DMEM，每孔100μL，每孔加入10μL CCK8试剂，在培养箱中放置2小时后，于酶标仪下读取450nm处吸光值，记为第0天。

此后每天同一时间段按照上述步骤检测并记录。持续4天，分别记为第1天，第二天，第3天，第4天。

绘制第0天-第4天的细胞增殖曲线，如图6所示，与对照组相比，uMSC-CdM及iMSC-CdM可促进细胞增殖，且iMSC-CdM较uMSC-CdM具有更显著的促增殖效果(在day 4时最为明显)。

2.iMSC-CdM对HUVEC细胞成管的促进作用

实验分为三组：a)对照组：无酚红低糖DMEM；b)uMSC-CdM组：uMSC-CdM；c)iMSC-CdM组：iMSC-CdM。每组设3个复孔。

将-20℃保存的matrigel基质胶(Corning，#356234)置于4℃冰箱中溶解过夜。次日将溶解成液体状的matrigel置于冰上。用预冷的枪头向预冷的96孔板中加入matrigel胶，每孔40μL。在冰上轻轻晃动培养板，使matrigel胶平铺于板底。随后将96孔板置于37℃培养箱静置30分钟，使matrigel胶凝固。

HUVEC细胞消化并计数，使用不用组别对应的培养基重悬HUVEC细胞，每孔铺HUVEC1×10⁴；

在37℃，5％CO₂培养箱中孵育3小时。拍照记录，应用ImagePro-Plus软件分析图像，计算形成血管腔的数目。

如图7所示，3小时后uMSC及iMSC-CdM组均有促成管效果，且iMSC-CdM的效果显著优于uMSC-CdM。

实施例6 iMSC-CdM对皮肤血管新生的促进作用

实验分三组：a)对照组：无酚红低糖DMEM，b)uMSC-CdM组：uMSC-CdM；c)iMSC-CdM组：iMSC-CdM。

皮肤缺损模型：选取6-8周龄，雄性BalB/C小鼠为实验动物，对动物背部进行脱毛，消毒等步骤后，剪除直径为1.0cm的圆形皮肤，构建皮肤缺损模型，每组6只；

准备边长为1.1cm的无菌正方形小棉片，覆盖于皮肤缺损部位(图8A)，对照组、uMSC-CdM及iMSC-CdM组分别向小棉片滴注50μL的对应液体；

以上处理每天进行，每天需更换新的小棉片，持续9天；

取皮肤缺损部位及周边部位的组织，切片检测新生血管标志物CD31的表达情况。如图8B所示，uMSC-CdM组及iMSC-CdM组CD31表达较对照组升高，且iMSC-CdM组的CD31表达量显著高于uMSC-CdM组，说明iMSC-CdM组对皮肤血管新生的促进作用显著优于uMSC-CdM组。

实施例7 iMSC-CdM对皮肤缺损修复的促进作用

小鼠皮肤缺损模型的实验分组、构建方法及术后处理实施例6；术后每天测量皮肤缺损部位直径，持续9天。

表3 iMSC-CdM对皮肤缺损修复的促进作用

如表3所示，uMSC-CdM及iMSC-CdM组皮肤创片愈合情况较对照组好，且iMSC-CdM组皮肤创面愈合情况显著优于uMSC-CdM组(*p<0.05vs对照组，#p<0.05vs uMSC-CdM)。

特别的，本发明所述的对小鼠皮肤缺损模型的处理，是先在皮肤创面覆盖稍大的无菌正方形小棉片，再向小棉片上滴注液体，主要考虑出于两方面考虑：1)液体滴注于小棉片上，有助于液体均匀分布，不易扩散到其他部位，延长作用时间；2)我们准备的是比创面稍大的小棉片，这样不仅能作用于创面，且能覆盖创面周边区域，有助于提高uMSC-CdM/iMSC-CdM对皮肤缺损修复的效果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)选用多能诱导干细胞，加入间充质干细胞完全培养基进行分化，12-16天后用对细胞进行分选，得到CD105阳性的细胞群，使用间充质干细胞完全培养基对获得的阳性细胞进行扩增；

2)扩增至P4代次时对所得到的间充质干细胞进行表面标志物的鉴定，筛选具有间充质干细胞特征的细胞进行后续培养；

3)继续培养至P5、P6、P7或P8代，当细胞汇合度为60％-70％时，吸去所述间充质干细胞完全培养基，使用平衡液润洗后，加入低糖DMEM；

4)继续培养12-36小时后，收集细胞培养上清液，所述上清液经离心去除细胞碎片和杂质后过滤，即得包含所述间充质干细胞分泌因子的溶液。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述的表面标志物为CD11、CD34、CD45、CD73、CD90和/或CD105中的一种或多种，所述间充质干细胞特征为CD11、CD34、CD45表达阳性率在0～2％区间内，CD73、CD90、CD105表达阳性率在90％～100％区间内。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

对步骤1)-4)制备的间充质干细胞分泌因子进行支原体及内毒素检测，当结果为阴性时将制得的间充质干细胞分泌因子分装后冷冻保存。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述的间充质干细胞完全培养基为低糖DMEM培养基，并且进一步包含10％胎牛血清、100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM GlutaMAX、非必需氨基酸以及55μMβ巯基乙醇。

5.如权利要求4所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞完全培养基还包含EGF和FGF，所述的EGF及FGF的浓度范围为2ng/mL-5ng/mL。

6.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述低糖DMEM为无酚红低糖DMEM。

7.一种间充质干细胞分泌因子，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法制备得到。

8.如权利要求7所述的间充质干细胞分泌因子在制备促进血管增殖或血管新生、或者促进皮肤创面修复或愈合的药物和/或化妆品中的应用。

9.一种促进皮肤创面修复或愈合的组合物，其特征在于，包含权利要求7所述的间充质干细胞分泌因子。

10.一种修复皮肤创面或促进创面愈合的方法，其特征在于，采用比皮肤创面稍大的无菌棉片，覆盖于皮肤创面上，向棉片滴注如权利要求7所述的间充质干细胞分泌因子。

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