CN111676187B - 分离的间充质干细胞群及其应用 - Google Patents

分离的间充质干细胞群及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供分离的间充质干细胞群及其应用。该述间充质干细胞群表达表面蛋白CD54、CD140a和SSEA‑4。申请人意外地发现，同时表达CD54、CD140a和SSEA‑4的间充质干细胞群在实验过程中表现出较强的组织损伤修复能力。使用这类间充质干细胞群用于增殖扩增制备MSCs产品可以有效保证制得的产品具有较为稳定的高组织损伤修复效果。

Description

分离的间充质干细胞群及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种分离的间充质干细胞群及其应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是中胚层来源的干细胞，具有免疫调节、抗炎、营养作用及自我更新和增殖能力，在适宜的微环境里具有向血管、脂肪、神经、软骨、骨等多个胚层组织细胞分化的潜能。与胎盘干细胞及其他组织特异性干细胞如血液干细胞、神经干细胞相比，MSCs具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活并可在微环境诱导下归巢到损伤部位并分化为特异的组织细胞，参与组织修复、易被外源基因转染并长期表达等优点。MSCs存在于人体多处组织与器官的间质中，如骨髓、脐血、脐带和脂肪组织等，已作为理想的种子细胞广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域，具有广阔的临床应用前景。
既往研究证明MSCs具有组织损伤修复活性，目前国际上已批准多个MSCs治疗组织损伤和炎症的产品，有超过800多项临床研究正在进行。尽管如此，MSCs的制备仍存在许多亟待解决的问题。临床研究发现，使用MSCs移植治疗组织损伤时，单次移植细胞数量要达到109这一数量级才能有效发挥治疗作用。为了达到这一要求，现有的医药级MSCs的制备过程较为复杂，需要进行多代次MSCs的增殖扩增，制备周期较长，成本高。但不同个体来源的MSCs有很大差异，其损伤修复活性也大不相同，这些差异最终可能会导致经历长周期制备得到的MSCs产品的治疗效果无法达到预期。因此，有必要提供一种具有较高组织损伤修复活性的间充质干细胞群。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有较高组织损伤修复活性的分离的间充质干细胞群及其应用。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种分离的间充质干细胞群，该述间充质干细胞群表达表面蛋白CD54、CD140a和SSEA-4。
本发明实施例的分离的间充质干细胞群至少具有如下有益效果：
申请人意外地发现，同时表达CD54、CD140a和SSEA-4的间充质干细胞群在实验过程中表现出较强的组织损伤修复能力。使用这类间充质干细胞群用于增殖扩增制备MSCs产品可以有效保证制得的产品具有较为稳定的高组织损伤修复效果。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群中，大于20％的间充质干细胞表达CD54、CD140a和SSEA-4。间充质干细胞群的组织损伤修复活性与上述三种表面蛋白的表达存在一定的相关性，当间充质干细胞群中有超过20％的间充质干细胞表达上述三种表面蛋白时，这些间充质干细胞群能够表现出较为显著的组织损伤修复效果。在MSCs产品的制备流程中，将从组织中分离出的MSCs通过上述表面蛋白表达情况的检测，筛选出具有组织损伤修复活性高的MSCs用于后续的增殖扩增，从而降低批间差异，有效提高MSCs产品的效价。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群中，大于40％的间充质干细胞表达CD54、CD140a和SSEA-4。当间充质干细胞群中有超过40％的间充质干细胞表达上述三种表面蛋白时，其具有优异的增殖能力和促血管生成能力等，因而可以极为高效地用于组织损伤修复。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群分离自脐带、脐血、胎盘、骨髓、脂肪组织中的任一种。分离自不同部位的间充质干细胞的生理活性特别是组织损伤修复活性有较大差异，而具有表达上述表面蛋白的间充质干细胞尽管来源部位不同，但都能够表现出较好的组织损伤修复活性。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群分离自胎盘。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群为哺乳动物间充质干细胞群。间充质干细胞是来源于哺乳动物中胚层性组织的成体干细胞，不同种属来源的间充质干细胞对于调节增殖和分化功能可能有相近的途径，因而表达上述表面蛋白的间充质干细胞都能够表现出较高的组织损伤修复活性。例如，根据哺乳动物来源的易获得性，可以是灵长目，如人源或其它非人灵长类；啮齿目，如小鼠、大鼠；偶蹄目，如猪、牛、羊；奇蹄目，如马等来源的间充质干细胞群。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群，该间充质干细胞群为人源间充质干细胞群。
第二方面，本发明的一个实施例提供上述间充质干细胞群在制备组织损伤修复产品中的应用。本发明实施例所提供的具有上述特性的间充质干细胞群具有较强的组织损伤修复活性，因而可以作为组织损伤修复产品的原料使用，使其能够具有较好的使用效果。
第三方面，本发明的一个实施例提供一种组合物，该组合物包括以下至少一种：
a.上述的间充质干细胞群；
b.上述的间充质干细胞群分泌的胞外囊泡或胞外基质；
c.上述的间充质干细胞群的条件培养基。
间充质干细胞的生理活性很大程度上与其旁泌作用相关，其不仅能分泌一些可溶性的生物活性因子，还可以分泌胞外囊泡。因此，表达上述表面蛋白的间充质干细胞群、其分泌的胞外囊泡或胞外基质、条件培养基等以有效剂量形成的组合物都能够具有较好的组织损伤修复活性。
第四方面，本发明的一个实施例提供一种间充质干细胞群的组织损伤修复活性的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
步骤一、将间充质干细胞与检测物混合，检测物用于与间充质干细胞的表面蛋白发生特异性结合，表面蛋白为CD54、CD140a和SSEA-4；
步骤二、确定间充质干细胞群中表达上述表面蛋白的间充质干细胞的百分比；
步骤三、根据百分比判断间充质干细胞群的组织损伤修复活性。
表达上述表面蛋白的间充质干细胞群具有较强的组织损伤修复活性，因而可以将这些表面蛋白作为标志物进行检测，通过对间充质干细胞是否表达以及表达量的多少来准确判断间充质干细胞的组织损伤修复活性。其中，根据检测方法的不同，检测物可以是能够与上述表面蛋白特异性结合的抗体；同时，对抗体进行了如荧光标记的手段以方便表面蛋白的检出。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群的组织损伤修复活性的检测方法，该间充质干细胞分离自胎盘。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群的组织损伤修复活性的检测方法，该间充质干细胞为人源间充质干细胞。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群的组织损伤修复活性的检测方法，步骤四具体为：当该间充质干细胞群中表达上述表面蛋白的间充质干细胞的百分比大于20％时，判断间充质干细胞群具有高损伤修复活性。间充质干细胞群的组织损伤修复活性与上述三种表面蛋白的表达存在一定的相关性，当间充质干细胞群中有超过20％的间充质干细胞表达上述三种表面蛋白时，这些间充质干细胞群能够表现出较为显著的组织损伤修复效果。
根据本发明的一些实施例的间充质干细胞群的组织损伤修复活性的检测方法，步骤四具体为：当该间充质干细胞群中表达上述表面蛋白的间充质干细胞的百分比大于40％时，判断间充质干细胞群具有高组织损伤修复活性。当间充质干细胞群中有超过40％的间充质干细胞表达上述三种表面蛋白时，其具有优异的增殖能力和促血管生成能力等，因而可以极为高效地用于组织损伤修复。
附图说明
图1是本发明的实施例2的不同个体胎盘来源的MSCs的克隆形成能力和增殖能力的检测结果。
图2是本发明的实施例3的不同个体胎盘来源的MSCs的促血管生成能力的检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
不同个体胎盘来源的MSCs的表面蛋白表达分析
实验材料：
封闭液：含3％牛血白蛋白(BSA，购自美国Sigma-Aldrich公司)的磷酸缓冲液(PBS，购自美国康宁公司)，冰上或4℃冰箱备用；
孵育抗体缓冲液：含1％牛血白蛋白(BSA，购自美国Sigma-Aldrich公司)的磷酸缓冲液(PBS，购自美国康宁公司)，冰上或4℃冰箱备用；
荧光标记一抗：抗CD73-PE抗体、抗CD90-PE抗体、抗CD105-PE抗体、抗CD45-FITC抗体、抗CD54-488抗体、抗CD140a-PE抗体，以上抗体购自美国Biolegend公司；抗SSEA-4-488抗体购自美国赛默飞世尔公司(eBioscience)；
间充质干细胞群：从不同正常人(产妇年龄24-28岁)足月产胎盘组织中分离得到，分别记为来源于胎盘1～6。
实验步骤：
1.分离出的MSCs用PBS洗去残留的培养液，消化后得到单细胞悬液，封闭液封闭30min。
2.所有荧光标记一抗均设置空白对照组、同型对照组和实验组三组，样本(含107个细胞和100μL封闭液)按照抗体说明书中推荐的抗体使用量，实验组分别加入CD73、CD90、CD105、CD45、CD54、CD140a、SSEA-4的荧光标记一抗，空白对照组不加入抗体，同型对照组加入和荧光标记一抗种属相同的同型对照IgG。
3.置于冰上避光孵育30分钟，用PBS洗去游离抗体，100μL PBS重悬MSCs。
4.分别收集空白对照组、同型对照组和实验组的10000个间充质干细胞，利用美国BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪测定结果。
实验结果见下表1，从表中可以看出，不同个体胎盘来源的MSCs的细胞表面均表达高水平CD73、CD90，不表达CD45，符合MSCs的特点。但不同个体胎盘来源的MSCs表面CD54、CD140a和SSEA-4蛋白的表达率有很大差异。其中，来源于胎盘1、5和6的MSCs均有40％以上的细胞表达CD54、CD140a和SSEA-4，而来源于胎盘3的MSCs只有20％以下的细胞表达以上膜蛋白。该结果表明，尽管不同个体胎盘来源的MSCs均符合公认的MSCs表面特征，但对某些额外蛋白的表达水平存在较大差别。
表1.不同个体胎盘来源的MSCs的表面蛋白的表达情况
Figure BDA0002499929990000051
实施例2
不同个体胎盘来源的MSCs的克隆形成能力和增殖能力分析
实验材料：
6孔板培养皿，购自美国康宁公司；
培养基：含10％胎牛血清(购自以色列BI公司)的DMEM(购自美国康宁公司)；
4％多聚甲醛(PFA)，购自美国Sigma-Aldrich公司；
0.1％结晶紫，购自美国Sigma-Aldrich公司。
实验方法：
一、克隆形成能力
1.将来源于胎盘1～6的MSCs按每孔200个细胞的密度接种于6孔板培养皿中培养，每组3个复孔，每3天换培养基一次。连续培养两周，观察克隆形成过程并拍照。
2.两周时将培养的细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗3次，0.1％结晶紫染色10分钟后拍照，计数每孔中细胞成克隆(直径大于等于2mm)的数量。
二、增殖能力
1.将相同数量的来源于6个不同胚胎的P2代MSCs接种到6孔板培养皿中培养，每组3个复孔。
2.当其中生长最快的MSCs到达90％密度时，全部细胞进行传代，收集每孔中的细胞进行计数，然后再接种相同数量的MSCs进行培养，重复传代到P7代，计数每代MSCs的累积数量。
MSCs的克隆形成能力反映了MSCs作为干细胞的自我更新能力，符合目前采用的MSCs的特征的细胞群中，含有部分非干细胞，只有真正的MSCs具有克隆形成能力。另一方面，在目前广泛采用的贴壁培养条件下(含10％FBS的DMEM)，MSCs经过几代次培养后，会逐渐呈现衰老现象，表现为细胞增殖速度变慢、细胞体积增大等。不同组织和个体来源的MSCs出现衰老的时间有差别，通常是来自老年个体或有某些疾病的个体的MSCs出现衰老早。因此，本实施例通过对MSCs的克隆形成能力和增殖能力的检测来间接反映MSCs的组织损伤修复活性。
克隆形成能力和增殖能力的实验结果参考图1。图1是本发明的实施例2的不同个体胎盘来源的MSCs的克隆形成能力和增殖能力的检测结果。图1中的A是不同个体胎盘来源的MSCs的结晶紫染色结果，结晶紫染色后克隆呈紫色可以看到，来源于胎盘1～6的MSCs形成了数量不等的克隆。图1中的B是克隆数量统计结果，可以看到，来源于胎盘3的MSCs形成的克隆数量显著少于其它胎盘的MSCs(P<0.001)。图1中的C是来源于胎盘1～6的MSCs的生长曲线，从中可以看到，来源于胎盘3的MSCs的增殖速度显著慢于来源于其它胎盘的MSCs(P<0.001)。
实施例3
选择表面蛋白CD54、CD140a和SSEA-4表达率低于20％且增殖能力最差的来源于胎盘3和表面蛋白表达率在40％以上且增殖能力突出的来源于胎盘1的MSCs进行对比分析。
1.条件培养基的制备：将这两种来源的MSCs培养至第5代(也即通常用于MSCs产品制备的培养代次)后，以10000细胞/cm2的密度分别接种到培养皿中，培养至80％汇合度时，去掉培养液，将细胞用PBS洗涤3次，然后添加等量的无血清DMEM培养基(购自美国康宁公司)，孵育24小时，收集培养液，离心去掉细胞碎片后用3kD微孔的分子筛(购自美国Millipore公司)进行30倍浓缩(离心)，浓缩液用于伤口血管形成和愈合实验。
2.伤口血管形成和愈合实验
(1)将7-8周大、体重20-23克的雌性BALB/C小鼠(购自广东省实验动物中心)随机分为3组，每组6只，分别为对照组(血清DMEM)、胎盘1实验组(胎盘1来源的MSCs条件培养液)、胎盘3实验组(胎盘3来源的MSCs条件培养液)。
(2)首先将小鼠背部脱毛，1％戊巴比妥钠(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)麻醉后，用直径5mm的活检器在小鼠背部中线两侧制造两个直径5mm的圆形全层皮肤缺损伤口，用6mm孔径的硅胶圈固定伤口以防止小鼠皮肤收缩造成伤口闭合，每个伤口分别注射100μl浓缩的MSCs条件培养基或对照培养基(无血清DMEM)，其中80μl注射到伤口周围组织内，其余20μl连同Matrigel(购自美国BD Biosciences公司)敷在伤口创面，用3M膜覆盖伤口后，再用弹性敷料包扎。
(3)一周和两周后分别处死小鼠，使用直径10mm的皮肤活检器采集含伤口和少量周围皮肤的全层皮肤组织，将皮肤平贴到塑料培养皿上(真皮面朝下)，拍照，统计分析血管数量。
(4)将以上皮肤组织用4％多聚甲醛中固定过夜，OCT包埋剂包埋，切片(8微米厚)后进行组织学分析，免疫荧光染色观察血管形成情况。具体为：将皮肤组织切片用封闭液(含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液)室温下封闭2小时，然后用含1：100稀释的抗兔CD31抗体(购自美国Abcam公司)4℃孵育过夜，用PBS洗3次后，用1：200稀释的TRITC标记的羊抗兔二抗(购自美国Jackson ImmunoResearch)探测CD31阳性细胞。细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，购自中国碧云天公司)染色，封片后用激光共聚焦显微镜(FV1000，购自日本奥林巴斯公司)观察拍照，用Image J软件测量新生毛细血管密度。
新生血管是组织损伤修复的基础，既往研究证明，MSCs通过分泌促进血管形成的因子促进损伤组织的血管形成，进而促进组织损伤修复，如伤口愈合。因此，本实施例通过对不同个体胎盘来源的MSCs所分泌的因子(条件培养基)对伤口内血管形成和伤口愈合的影响来直接反映间充质干细胞的组织损伤修复活性。
结果参考图2，图2是本发明的实施例3的不同个体胎盘来源的MSCs的促血管生成能力的检测结果。图2中的A是处理伤口的第7天和第14天的对照组、胎盘3实验组和胎盘1实验组的伤口状况，从中可以看到，相比对照组而言，胎盘3实验组和胎盘1实验组的伤口都有较为明显的愈合，其中，胎盘1实验组的伤口愈合显著加快。图2中的B是处理伤口的第7天和第14天的对照组、胎盘3实验组和胎盘1实验组的血管分支的生长情况，从图中可以看出，相比对照组而言，胎盘3实验组和胎盘1实验组的血管分支形成更快，而胎盘1实验组的血管分支又与胎盘3实验组有明显差异。图2中的C是伤口组织切片免疫荧光染色结果，从图中可以看出，相比于对照组，胎盘3和胎盘1来源的MSCs的条件培养基的使用使得伤口血管数量显著增加。图2中的D是处理伤口的第14天的对照组、胎盘3实验组和胎盘1实验组的毛细血管密度，从图中可以看出，胎盘3实验组和胎盘1实验组相比于对照组(P<0.01)以及两者之间(P<0.01)的毛细血管密度都有明显差异。
这些结果表明，胎盘3来源的MSCs产生的促血管形成因子水平较低，具有一定促血管形成和促进组织修复作用但相对有限。而胎盘1来源的MSCs能够产生更强的促血管形成的因子，具有更强的促血管形成和促进损伤组织修复的作用。
实施例4
一种组织损伤修复治疗剂，包括间充质干细胞片层，该间充质干细胞片层由表面蛋白CD54、CD140a和SSEA-4表达量在60％的人源胎盘间充质干细胞经传代培养获得。该治疗剂具有较好的组织损伤修复活性，使用后能够高效地与周围组织共同参与修复组织损伤、促进再生。
实施例5
一种组织损伤修复治疗剂，包括经分离得到的间充质干细胞分泌的外泌体，该间充质干细胞由表面蛋白CD54、CD140a和SSEA-4表达量在60％的人源脐带间充质干细胞经传代培养获得。该治疗剂具有较好的组织损伤修复活性，能够有效促进损伤部位的血管生成，修复损伤组织。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (3)

1.分离的间充质干细胞群在制备组织损伤修复产品中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞群中，大于40%的间充质干细胞表达CD54、CD140a和SSEA-4。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞群分离自胎盘。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞群为人源间充质干细胞群。
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