CN115011540B - 一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞工程领域，公开了一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用。这种方法包括：对有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；将活化的有核细胞和活化蛋白混合孵育，使活化蛋白与活化的有核细胞偶联。该方法能高效地将蛋白连接在有核细胞表面，但不影响细胞活力，可用于提高有核细胞靶向迁徙能力，及特异性结合损伤组织的能力。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程领域，具体涉及一种有核细胞表面连接蛋白的方法及其应用。
背景技术
对于一些具有组织修复能力或抑制、清除能力的细胞，通常需要特异性结合或靶向迁徙到待修复或待抑制、清除的细胞周围，以发挥相应的作用。如间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的干细胞，具有易获得、易培养、低免疫原性等优点，MSCs能在宿主体内长期存活并在微环境诱导下迁徙到损伤部位分化形成组织细胞，参与组织修复，但是MSCs在体外扩增培养后存在靶向迁徙能力不足的缺陷。这主要是由于MSCs在体外培养的过程中，其表面丢失了靶向迁徙所需的表面分子，如选择素配体、整合素、趋化因子等。通过增加这些表面分子的表达水平，可以恢复MSCs的迁徙能力，传统的方法是增加MSCs对编码这些表面分子的基因的表达，但是这种方法较复杂，需要对细胞进行基因改造才能上调这些表面分子的表达，且这种方法产生的表面分子是通过非共价键(如氢键、疏水键或范德华力等)结合到细胞上的，这种结合的结合强度较低，细胞与靶组织结合不牢固。
因此，有必要提供一种在细胞表面高效连接蛋白的方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种有核细胞表面连接蛋白的方法，能够高效地将蛋白连接在有核细胞表面，但不影响细胞活力。
本发明还提出一种有核细胞。
本发明还提出有核细胞表面连接蛋白的方法或有核细胞在制备靶向组织损伤部位和/或肿瘤细胞的产品中的应用。
本发明还提出一种组合物。
根据本发明的一个方面，提出了一种有核细胞表面连接蛋白的方法，包括以下步骤：
S1：对有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；
S2：将所述活化的有核细胞和所述活化蛋白混合孵育，使所述活化蛋白与所述活化的有核细胞偶联。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明首先对待连接的蛋白进行马来酰亚胺化修饰，对有核细胞进行巯基化修饰，马来酰亚胺基团和巯基基团可以共价结合，这种通过化学修饰形成的共价结合的强度要高于细胞表面配体-受体之间的非共价结合(如氢键、疏水键、范德华力等)的强度；且在进行巯基化修饰时，可以使得有核细胞表面可同时连接大量的待连接的蛋白。
因此，本发明将有核细胞同时与大量的待连接蛋白通过共价结合而连接，实现了有核细胞表面高效率地连接蛋白，进而促进有核细胞高效发挥其相应的功能。
在本发明的一些实施方式中，所述有核细胞包括但不限于间充质干细胞、免疫细胞。
在本发明的一些实施方式中，用于所述马来酰亚胺化修饰的试剂包含NHS酯基团和与所述NHS酯基团相连的马来酰亚胺基团。
在本发明的一些实施方式中，所述NHS酯基团通过环己烷间隔臂连接所述马来酰亚胺基团。
在本发明的一些实施方式中，所述NHS酯基团为磺基-NHS酯基团。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂通过NHS酯基团与待连接的蛋白的氨基(-NH2)反应，从而对蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白。
在本发明的一些优选的实施方式中，用于对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰的试剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)。
在本发明的一些实施方式中，巯基化试剂与所述有核细胞的氨基反应，将巯基引入所述有核细胞中，实现对所述有核细胞的巯基化修饰，得到活化的有核细胞。可以理解的是，在其中一些具体的实施方式中，巯基化试剂与有核细胞表面的蛋白反应完成活化，有核细胞表面的蛋白例如可以是膜蛋白，例如外周膜蛋白、整合蛋白或脂锚定蛋白等其中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，用于巯基化修饰的试剂为2-氨基硫代乙烷盐酸盐(Trauts)试剂。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述有核细胞与所述Trants试剂的比例为100万个有核细胞：0.1～50μg Trants试剂，进一步，比例为100万个有核细胞：0.1～20μgTrants试剂、0.1～10μg Trants试剂、0.1～5μg Trants试剂、0.1～2μg Trants试剂、0.1～1μg Trants试剂。
在本发明的一些实施方式中，用于巯基化修饰的试剂的浓度为0.1～100μg/mL，进一步为0.1～50μg/mL、0.1～20μg/mL、0.1～10μg/mL、0.1～5μg/mL、0.1～2μg/mL。
在本发明的一些实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与蛋白混合的摩尔比为(10～100)：1。
在本发明的一些实施方式中，将所述待活化蛋白偶联到所述有核细胞表面后，所述有核细胞的存活率为80％～99％，例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。具体的，有核细胞的存活率在85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上。
本发明中巯基化试剂与有核细胞混合时，用于巯基化修饰的试剂的浓度只需要在0.1～100μg/mL范围内，即只需加入较低剂量的巯基化试剂即可完成对膜蛋白的巯基化修饰，该浓度范围不仅可以实现对膜蛋白的高效修饰，而且对有核细胞的活力的影响较小。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中将用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白混合加入缓冲液中，于23℃～26℃条件下反应1.9～2h，完成对蛋白的马来酰亚胺化修饰。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中将用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白混合加入缓冲液中，于25℃条件下反应2h。
在本发明的一些实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白反应1.9～2h后，再于4℃～6℃条件下透析过夜，期间需更换透析液2～3次。
在本发明的一些优选的实施方式中，用于马来酰亚胺化修饰的试剂与所述蛋白反应2h后，再于4℃条件下透析过夜，期间需更换透析液2次。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，将用于巯基化修饰的试剂与所述有核细胞混合后加入缓冲液中，于4℃～6℃条件下反应，每8～10min摇晃3～5次，共反应30～35min，完成对有核细胞的巯基化修饰。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，将用于巯基化修饰的试剂与所述有核细胞混合后加入缓冲液中，于4℃条件下反应，每8min摇晃3～5次，共反应30min。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，所述活化蛋白与所述活化的有核细胞混合后，于4℃～6℃条件下反应，每9～10min摇晃3～5次，共反应60～65min，完成所述活化蛋白与所述活化的有核细胞的偶联。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述活化蛋白与所述活化的有核细胞混合后，于4℃条件下反应，每10min摇晃3～5次，共反应60min。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液选自Hanks’平衡盐溶液(HBSS)或D–Hanks’平衡盐缓冲液中的任一种。
根据本发明的第二个方面，提出了有核细胞，所述有核细胞通过巯基-马来酰亚胺基团的方式连接有蛋白。具体的，可以是在有核细胞上修饰有巯基，在蛋白上修饰马来酰亚胺基团，蛋白通过巯基-马来酰亚胺基团的方式连接到有核细胞上。
在本发明的一些实施方式中，所述有核细胞包括间充质干细胞。可以理解的，间充质干细胞分离自脐带、脐血、胎盘、骨髓、脂肪组织等其中的至少一种。上述这些分离自不同部位的间充质干细胞的各项生理活性存在一定区别，而组织损伤修复活性也各有不同。具体的，间充质干细胞可以是原代细胞或传代培养至少一代的细胞，例如传代1～3代的间充质干细胞。此外，间充质干细胞可以是来源于哺乳动物的间充质干细胞，根据哺乳动物来源的易获得性，可以是灵长目，如人源或其它非人灵长类；啮齿目，如小鼠、大鼠；偶蹄目，如猪、牛、羊；奇蹄目，如马等来源的间充质干细胞。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述蛋白包括靶向组织损伤特异性表达分子的抗体、配体、受体中的至少一种。其中，组织损伤特异性表达分子是指在正常组织中无表达、极低或较低表达水平，而仅在出现损伤的组织部位的细胞中出现具有差异性的高水平表达的生物分子。具体的，差异性的高水平表达例如可以是具有统计学意义上的差异；生物分子可以是任选类型的生物大分子，例如蛋白等。通过这种方式可以将有核细胞靶向运输到组织损伤部位。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述组织损伤特异性表达分子包括细胞间黏附分子-1。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，又称CD54，属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成员，是介导黏附反应的一个重要黏附分子。正常组织中仅有骨髓和脾脏细胞低表达ICAM-1，是免疫细胞在骨髓和脾脏储存的分子基础，当组织受到损伤时，发炎的内皮细胞高表达ICAM-1，可募集免疫细胞到损伤组织发挥功能。因此，偶联有靶向ICAM-1抗体的有核细胞例如间充质干细胞可以快速迁移到损伤部位附近，发挥组织损伤修复作用。
具体的，例如所述细胞间黏附分子-1用于与所述间充质干细胞表面连接的抗细胞间黏附分子-1的抗体结合，所述细胞间黏附分子-1引导所述间充质干细胞特异性结合炎症性血管内皮细胞，以对所述炎症性血管内皮细胞进行修复。所述细胞间黏附分子-1与所述间充质干细胞表面连接的抗细胞间黏附分子-1的抗体结合，所述细胞间黏附分子-1引导所述间充质干细胞靶向迁徙到缺血心肌组织处，以对所述缺血心肌组织进行修复。
可以理解的是，其它具有组织损伤特异性表达的分子也可以作为ICAM-1的补充或替代。
在本发明的一些实施方式中，所述有核细胞包括免疫细胞。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述蛋白包括靶向肿瘤特异性抗原的抗体、配体、受体中的至少一种。利用偶联有靶向肿瘤特异性抗原的蛋白可以引导免疫细胞与肿瘤细胞的特异结合。
根据本发明的第三方面，提出了所述有核细胞表面连接蛋白的方法或所述有核细胞在制备靶向组织损伤部位和/或肿瘤细胞的产品中的应用。在本发明的一些实施方式中，靶向组织损伤部位的产品可以是通过有核细胞的靶向迁徙来对组织损伤进行修复的产品，靶向肿瘤细胞的产品同样也可以是通过免疫细胞靶向迁徙到肿瘤部位抵抗肿瘤细胞。
根据本发明的第四方面，提出了组合物，所述组合物包括所述有核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述组合物为药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和所述有核细胞。具体的，所述有核细胞包括间充质干细胞或免疫细胞中的至少一种。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的过程示意图；
图2为本发明实施例1中对MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的效率的流式细胞检测图；
图3为本发明实施例1中对MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的效率的细胞免疫荧光检测图；其中，左代表FITC荧光图，是对抗ICAM-1的二抗的定位图；中代表DAPI荧光图，是对MSCs细胞核的定位图；右代表左和中合在一起的结果图；标尺为20μm；
图4为本发明实施例2中对连接抗ICAM-1抗体的MSCs的流式细胞凋亡分析结果图；
图5为本发明实施例2中细胞重贴壁实验的检测结果图；
图6为本发明实施例2中MSCs表面标志物的流式细胞检测结果图；
图7为本发明实施例3中连接抗ICAM-1抗体的MSCs特异性结合激活的静脉内皮细胞的流程示意图；
图8为本发明实施例3中MSCs结合静脉内皮细胞情况的显微成像图；其中，绿色荧光表征MSCs，红色荧光表征人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，蓝色荧光表征细胞核；MSCs代表加入正常MSCs组，aICAM1-MSCs代表加入连接抗ICAM-1抗体的MSCs；标尺为20μm；
图9为本发明实施例3对小鼠进行心肌梗塞手术和注射MSCs的流程示意图；
图10为本发明实施例3中两种MSCs迁徙到缺血心肌组织的显微成像图；其中，绿色荧光表征MSCs，红色荧光表征凋亡的心肌细胞(TUNEL标记法)，蓝色荧光表征细胞核；MSCs代表注射正常MSCs，aICAM1-MSCs代表注射连接抗ICAM-1抗体的MSCs；标尺为20μm；
图11为本发明实施例4中注射两种MSCs对缺血心肌组织进行修复的超声影像观察图；
图12为本发明实施例4中注射两种MSCs后小鼠的心脏照片图；
图13为本发明实施例4中注射两种MSCs后小鼠的心肌组织的HE染色结果图；标尺为50μm；
图14为本发明实施例5中在MSCs表面形成选择素配体HCELL的过程示意图；
图15为本发明实施例5中MSCs表面抗ICAM-1抗体结合的强度和糖基化产生选择素配体HCELL的效率的流式细胞检测结果图；其中，上为不同MSCs处理组中MSCs表面结合抗ICAM-1抗体的水平，下为不同MSCs处理组中糖基化产生选择素配体HCELL的水平；CON-未做处理的间充质干细胞，MSCs-反应缓冲液处理的间充质干细胞，HCELL-MSCs-表面糖基化产生选择素配体HCELL的MSCs，aICAM1-MSCs-表面连接抗ICAM-1抗体的MSCs，aICAM1-HCELL-MSCs-表面同步结合抗ICAM-1抗体和糖基化产生选择素配体HCELL的MSCs。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，孵育、离心等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
本实施例在间充质干细胞表面高效连接了抗ICAM-1抗体，具体过程为：
(1)从正常人(产妇，年龄24岁)足月产胎盘中分离得到MSCs，以10000细胞/cm2的密度接种MSCs，在90％汇合度时弃去培养皿中的培养液，将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，随后用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞成单细胞悬液，用PBS洗去残留的培养液。
(2)MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的过程示意图如图1所示。取100μg抗ICAM-1抗体(购自美国Bioxcell公司)和10μg Sulfo-SMCC(购自美国Sigma-Aldrich公司)于200μLHBSS缓冲液(购自美国Thermo Fisher公司)中，室温反应2h，4℃透析过夜，期间更换透析液2次，完成对抗ICAM-1抗体的马来酰亚胺化修饰；
将1×106MSCs与2μg/mL Trauts试剂(购自美国Sigma-Aldrich公司)混合，于500μLHBSS缓冲液中冰上反应30min(盛有上述混合液的离心管在冰上倾斜15°放置)，每8min轻摇3～5次，反应结束后于1300rpm/min条件下离心5min，弃上清，加入HBSS缓冲液洗涤，于1300rpm/min条件下离心，重复洗涤1次，完成对MSCs的膜蛋白的巯基化修饰；
(3)将步骤(2)中经马来酰亚胺化修饰的抗ICAM-1抗体与膜蛋白经巯基化修饰的MSCs混合于盛有500μL HBSS缓冲液的离心管中，将离心管倾斜15°放置于冰上，每10min轻摇3～5次，共反应1h，反应结束后于1300rpm/min条件下离心5min，弃上清，加入HBSS缓冲液洗涤，于1300rpm/min条件下离心，重复洗涤1次，此时在MSCs表面连接了抗ICAM-1的抗体。
接着，对MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的效果进行了分析：
a.通过流式细胞实验进行分析：
所用细胞表面非特异性结合蛋白封闭液为含3％牛血清白蛋白(BSA，购自美国Sigma-Aldrich公司)的磷酸缓冲液(PBS，购自美国康宁公司)；孵育抗体缓冲液为含1％BSA的PBS，将这些缓冲液置于冰上或4℃冰箱备用。
为需要检测的MSCs准备3组细胞样品：空白对照组(MSCs)、同型对照组(MSCs+ICAM-1抗体)和实验组(MSCs-巯基+马来酰亚胺-抗ICAM-1抗体)。将0.5μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗ICAM-1的二抗(购自美国Biolegend)与1×106MSCs混合于100μL PBS缓冲液中反应30min，于1300rpm/min条件下离心5min，弃上清，加PBS缓冲液洗涤，于1300rpm/min条件下离心5min。用美国BD公司C6 Plus流式细胞仪测定，分别收集空白对照组、同型对照组和实验组的各10000个MSCs进行测定，BD AccuriTM C6 Plus软件分析MSCs表面抗ICAM-1抗体的结合率，分析结果如图2所示。
图2显示，与空白对照组相比，同型对照组中MSCs结合抗ICAM-1抗体的特异性较高，但结合效率较低；而实验组中FITC的荧光值较大，表明实验组中通过马来酰亚胺基团和巯基基团将抗ICAM-1抗体连接在MSCs表面的效率是很高的。
b.通过细胞免疫荧光实验进行分析：
取1滴浓度为1×106个/ml的MSCs滴加到载玻片上，于甩片机上以1500rpm/min的转速甩片8min，PBS缓冲液洗涤3次，用1％多聚甲醛(PFA，购自美国Sigma-Aldrich公司)固定15min。然后经0.1％Triton X-100(购自中国上海生工生物公司)透化后，用封闭液(含3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)室温下封闭2h，滴加1滴100倍稀释的FITC标记的抗ICAM1的二抗(免疫荧光抗体)37℃反应2h，滴加1滴4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反应液5min，PBS缓冲液洗3次，每次5min，封片后用激光共聚焦显微镜(FV1000，购自日本奥林巴斯公司)观察拍照，结果如图3所示。
图3中，左代表FITC荧光图，是对抗ICAM-1的二抗的定位图；中代表DAPI荧光图，是对MSCs细胞核的定位图；右代表左和中合在一起的结果图；可见视野内的抗ICAM-1的二抗均定位于MSCs上，表明MSCs表面高效连接了抗ICAM-1抗体。
实施例2
本实施例对实施例1中连接抗ICAM-1抗体的MSCs的活力及其特性进行了分析，具体过程为：
1.Annexin V/PI流式细胞凋亡分析：
为需要检测的MSCs准备2组细胞样品：空白对照组(MSCs)和实验组(MSCs-巯基+马来酰亚胺-抗ICAM-1抗体)。按照Annexin V/PI流式细胞凋亡试剂盒(购自中国四正柏公司)的说明书操作，取100μL浓度为1×106个/ml的MSCs，加1μL Annexin V避光反应10min，加1μL PI避光反应5min，再加1mL PBS缓冲液于1300rpm/min下离心5min，洗1次；用BD C6 Plus流式细胞仪分析细胞凋亡情况，结果如图4所示。图4显示，空白对照组中MSCs的存活率为95.5％，实验组中MSCs的存活率为93％，说明实施例1中的方法几乎不引起细胞死亡。
2.细胞重贴壁实验分析：
通过细胞重贴壁实验检测细胞活力，为需要检测的MSCs准备2组细胞样品：空白对照组(MSCs)和实验组(MSCs-巯基+马来酰亚胺-抗ICAM-1抗体)。取1×106个MSCs种在12孔培养皿上，37℃培养3h，消化细胞计算细胞重贴壁情况，统计结果图如图5所示。图5显示，空白对照组MSCs的重贴壁率为80％，实验组MSCs的重贴壁率接近80％，表明用实施例1的方法连接抗ICAM-1抗体后MSCs仍可以保持较高活力。
3.MSCs表面标志物的流式细胞仪分析：
MSCs的表面标志物选取CD44、CD73、CD90，为需要检测的MSCs准备2组细胞样品：空白对照组(MSCs)和实验组(MSCs-巯基+马来酰亚胺-抗ICAM-1抗体)。所用细胞表面非特异性结合蛋白封闭液为含3％牛血清白蛋白(BSA，购自美国Sigma-Aldrich公司)的磷酸盐缓冲液(PBS，购自美国康宁公司)；孵育抗体缓冲液为含1％BSA的PBS，将这些缓冲液置于冰上或4°冰箱备用。
取100μL浓度为1×106个/ml的MSCs，分别加MSCs的标志物CD44、CD73、CD90，加入流式抗体1μL(购自美国Biolegend公司)，4℃避光反应30min，加1mL PBS缓冲液，于1300rpm/min转速下离心洗1次，于BD C6 Plus流式细胞仪上样分析，结果如图6所示。图6显示，实验组的MSCs中CD44、CD73、CD90的表达情况与空白对照组保持一致，表明抗ICAM-1抗体连接MSCs后并不影响细胞特性。
实施例3
本实施例对实施例1中连接抗ICAM-1抗体的MSCs靶向损伤组织的能力进行了分析，具体过程为：
1.连接抗ICAM-1抗体的MSCs特异性结合激活的静脉内皮细胞情况分析：
具体流程如图7所示，取人脐静脉内皮细胞贴壁培养，在90％汇合度时加入浓度为10μg/mL的肿瘤坏死因子TNF-a(购自美国PeproTech公司)刺激6h，去激活血管内皮细胞炎症。弃掉培养基，PBS洗一遍，分别加入PBS重悬的浓度为1×106个/ml的MSCs和连接抗ICAM1抗体的MSCs，放入80rpm/min的摇床中30min，PBS洗去未结合静脉内皮细胞的MSCs，1％多聚甲醛(PFA,购自美国Sigma-Aldrich公司)固定细胞，在荧光显微镜(Axio A1，购自德国蔡司公司)下观察MSCs结合静脉内皮细胞的情况，结果如图8所示。图8显示，与加入正常MSCs组(MSCs少量结合静脉内皮细胞)相比，加入连接抗ICAM-1抗体的MSCs组的MSCs大量结合在静脉内皮细胞的表面，表明连接抗ICAM-1抗体的MSCs可特异性结合损伤内皮细胞。
2.连接抗ICAM-1抗体的MSCs靶向迁徙到缺血心肌组织的情况分析：
构建小鼠心肌梗塞模型，取7～8周大、体重20～23克的雄性BALB/C小鼠(购自广东省实验动物中心)，用1％戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，用剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发(充分暴露手术区)，用碘酒和75％乙醇给手术区消毒。麻醉后，夹趾检测无反应即可进行心肌梗塞MI手术。打开外置冷光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数(呼吸频率110bpm)，将气管插管沿声门插入气管，接上呼吸机，观察小鼠呼吸状况，胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功，即可进行MI手术。小鼠采用右侧卧位，在左前肢腋下用显微剪于第三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支(LAD)或所在区域。于显微镜下找到LAD走向或可能在的位置，持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘2mm处进针，缝线穿过LAD，以完全阻断LAD血流。结扎完成后，6-0缝线完全缝合胸腔开口(保证无缝隙、无错位)以关闭胸腔，由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。术后密切关注小鼠状态，有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，正常饲养。
取100万个浓度为5×106个/ml的两种MSCs(MSCs和连接抗ICAM-1抗体的MSCs)，分别于心肌梗塞手术后24h和48h，给心肌梗塞小鼠(分为两组)尾静脉注射一次MSCs(见图9)，其中一组小鼠注射MSCs，另外一组小鼠注射连接抗ICAM-1抗体的MSCs；24h后麻醉小鼠，解剖，取20mL生理盐水灌注，取心脏切片分析，通过免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察MSCs靶向心肌梗塞小鼠心脏的情况，结果如图10所示。图10显示，连接抗ICAM-1抗体的MSCs靶向心肌梗塞小鼠心肌组织的数量明显多于MSCs的数量。
实施例4
本实施例对实施例1中连接抗ICAM-1抗体的MSCs对损伤组织修复的能力进行了分析，具体过程为：
具体为连接抗ICAM-1抗体的MSCs对实施例3中的缺血心肌组织进行修复，取用MSCs(MSCs和连接抗ICAM-1抗体的MSCs)尾静脉注射治疗心肌梗塞小鼠14天后，对小鼠进行麻醉，行小动物超声系统Vevo 2100(购自加拿大Visual Sonics公司)检测，在左心室长轴进行M型超声检查并采集图像，测量计算左心室射血分数(LVEF)，结果如图11所示。图11显示，注射MSCs的小鼠左心室射血分数为36.1％，注射连接抗ICAM-1抗体的MSCs的小鼠左心室射血分数提升到43.8％，心肌梗塞小鼠的心功能明显得到改善。
随后解剖小鼠取20mL生理盐水灌注，取心脏拍照，如图12所示，注射MSCs组小鼠较注射连接抗ICAM-1抗体的MSCs组小鼠的心脏肥大，心肌细胞坏死严重。
小鼠心脏用4％多聚甲醛固定过夜，OCT包埋机包埋，切片(厚度为8μm)后进行组织学分析，组织切片通过苏木素-伊红(HE)染色观察心肌损伤情况。方法是将心脏组织切片用PBS洗3次，切片入苏木素染液中染色5min，PBS洗3次，1％的盐酸酒精分化2s，PBS洗3次，0.6％氨水返蓝，PBS洗3次，切片入伊红染液中染色1min，将切片依次放入90％酒精1min，95％酒精5min，无水乙醇1min，二甲苯1min中脱水透明，将切片从二甲苯中拿出来晾干，中性树胶封片，显微镜观察，结果如图13显示。图13显示，注射MSCs组小鼠的心肌细胞大量凋亡，间隙明显増大，心肌横纹严重破坏，肌纤维断裂溶解坏死，炎性细胞大量浸润；注射连接抗ICAM-1抗体的MSCs组小鼠的心肌细胞整体改善，心肌细胞形态较完整，肌纤维分布有序，损伤程度明显好转。
实施例5
本实施例分析了抗ICAM-1抗体连接MSCs后是否会影响其他膜蛋白结合分子结合在MSCs表面，具体过程为：
(1)同实施例1，用Sulfo-SMCC试剂对抗ICAM-1抗体进行马来酰亚胺化修饰，用Traut试剂对MSCs的膜蛋白进行巯基化修饰；
(2)将浓度为5×106个/ml的MSCs加入HBSS缓冲液(无Ca2+、Mg2+)中，然后加入浓度为60mU/mL的盐藻糖转移酶FTVI，1mM的GDP岩藻糖(GDP-fucose)，马来酰亚胺化的抗ICAM1抗体，20mM的HEPES，0.1％的人血清白蛋白，37℃反应60min，每隔10min用移液器轻轻吹打6次。反应结束后于1300rpm/min条件下离心5min，弃上清，加入HBSS缓冲液洗涤，于1300rpm/min条件下离心，重复洗涤1次，即完成在MSCs表面连接抗ICAM-1抗体的同时，糖基化形成了选择素配体HCELL(形成过程如图14所示)，可特异性结合选择素。用流式细胞仪分析MSCs表面抗ICAM1抗体结合的强度，和MSCs表面岩藻糖化产生选择素配体HCELL的效率，结果如图15所示。
图15显示，上为不同MSCs处理组中MSCs表面结合抗ICAM-1抗体的水平，下为不同MSCs处理组中糖基化产生选择素配体HCELL的水平。MSCs表面同步结合抗ICAM1抗体和糖基化产生选择素配体HCELL组与MSCs表面只结合抗ICAM1抗体组相比，抗ICAM-1抗体的结合效率基本一致；MSCs表面同步结合抗ICAM1抗体和糖基化产生选择素配体HCELL组与MSCs表面只糖基化产生选择素配体HCELL组相比，选择素配体HCELL产生效率基本一致。
因此本实施例的方法中抗体结合强度和糖基化产生选择素配体的效率是不会互相影响的，表明采用本发明的方法将抗ICAM-1抗体连接在MSCs表面后，不影响其他膜蛋白分子结合在MSCs表面。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (2)
1.一种有核细胞表面连接蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对所述有核细胞进行巯基化修饰，得到活化的有核细胞；对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰，得到活化蛋白；
S2：将所述活化的有核细胞和所述活化蛋白混合孵育，使所述活化蛋白与所述活化的有核细胞偶联；
其中，所述S1中采用Trauts试剂进行巯基化修饰，所述有核细胞与所述Trauts试剂的比例为100万个有核细胞：0.1～50μg Trauts试剂；用于对所述蛋白进行马来酰亚胺化修饰的试剂为Sulfo-SMCC；
所述有核细胞为间充质干细胞；
所述蛋白包括靶向组织损伤特异性表达分子的抗体、配体、受体中的至少一种。
2.权利要求1所述的方法在制备靶向组织损伤部位的产品中的应用。
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