JP4284563B2 - 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法 - Google Patents
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Description
(1) 細胞シートを作製するための支持体の表面をフィブリンでコーティングするための組成物であって、フィブリノーゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物。
(2) 表面がフィブリンでコーティングされている細胞シート作製用支持体。
(3) 表面がフィブリンでコーティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィブリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、細胞シートの製造方法。
(4) 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、(3)記載の方法。
(5)細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、(3)又は(4)に記載の方法。
・トロンビン 0.2〜0.8 U
・塩化カルシウム2水和物 0.5〜1.0 mg
・アプロチニン 1500〜6000 U
・生理食塩水 16 ml
上記組成物において、フィブリノーゲンにトロンビンが作用するとフィブリンが生成してしまうので、フィブリノーゲンとトロンビンはそれぞれ別の容器に保存しておき、使用時に混合するとよい。フィブリノーゲンには、血清アルブミン、アミノ酢酸、アプロチニン、チロキサポール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムを添加してもよい。トロンビンには、血清アルブミン、アミノ酢酸、塩化ナトリウムを添加してもよい。カルシウムイオンはフィブリノーゲンの加水分解を促進するので、塩化カルシウム2水和物もフィブリノーゲンとは別の容器に保存しておき、使用時に混合するとよい。例えば、塩化カルシウム2水和物は、使用時にトロンビンを溶解するための液(以下、「トロンビン用溶解液」という。)に溶解させ、容器に保存しておくとよい。また、アプロチニンはフィブリノーゲンの重合を阻害するので、フィブリノーゲンに添加してもよいし、使用時にフィブリノーゲンを溶解するための液(以下、「フィブリノーゲン用溶解液」という。)に溶解させ、容器に保存しておいてもよい。上記組成物の使用方法の一例を以下に説明する。まず、アプロチニンを含有するフィブリノーゲン用溶解液にフィブリノーゲンを溶解し、A液とする。塩化カルシウム2水和物を含有するトロンビン用溶解液にトロンビンを溶解し、B液とする。A液、B液及び生理食塩水を混合し、混合液を細胞シート作製用支持体の表面に塗布する。
ウィスターラット(日本クレア販売)
2.5%トリプシン(GIBCO 15090-046)
コラゲナーゼ(SIGMA C-5138)
DNase I(SIGMA DN-25)
FBS(JRH Bioscience)
ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシンB(GIBCO 15240-062)
medium 199(ICN Biomedicals 1023126)
DMEM(GIBCO 12100-046)
マウス骨格筋芽細胞由来のC2C12(ATCCより購入)
CMG細胞(慶應義塾大学医学部呼吸循環器内科教室においてマウス骨髄細胞に5-アザシチジンを添加し、心筋へ形質転換ずる能力を獲得し不死化した細胞株をクローニングして得られた細胞株)
ヌードラット(日本クレア)
ウサギ由来抗マウスコネキシン抗体 (SIGMA C6219)
マウス由来抗アクチニン抗体 (SIGMA A7811)
TRITC結合ブタ由来抗ウサギIgG抗体 (DAKO R 0156)
Alexa 488結合ヤギ由来マウスIgG抗体 (Molecular Probes A-11029)
ウサギ(日本白色種(J.W., メス、約3Kg , 白石実験動物飼育所))
SHEM
・DMEM/F12:Gibco BRL D−MEM/F12(1袋/1L用),12400−016;15.6g入り;HEPES含
・NaHCO3:Waco(使用時の濃度 2.5g/l)
・Insulin:SIGMA human recombinant expressed in E.coli;I−0259;50mg入り(使用時の濃度 5μg/ml)
・Human−EGF:Gibco BRL Recombinant Human EGF;13247−010;100μg入り(使用時の濃度 10μg/ml)
・Cholera toxin:SIGMA c-3012;1mg入り(使用時の濃度 1μg/ml)
・0.5% DMSO :SIGMA DIMETHYL SULFOXIPE;D-2650 ; 5ml x 5本入り
・15% FCS : 三光純薬(Vitromex);VMS1500 ; Lot, F000210802 ; 500 ml
DMEM (Gibco)
ウシ胎児血清 (ニチレイ)
3T3細胞 (American Type Culture Collection)
アプロチニン (Wako)
ゲンタマイシン、ペニシリン、アンホテリシンB (Wako)
DispaseII (合同酒精)
DMEM/F12 (Gibco)
Trypsin (Gibco)
EDTA (Gibco)
Normal Donkey Serum(CHEMICON ; S30-100ML ; Lot, 23031387 ; 100 ml)
BSA (Sigma)
DAPI(Sigma)
[実施例1]ヒトフィブリンによる培養皿コーティング
ヒトフィブリノーゲン90 mg, トロンビン 0.4 U, 塩化カルシウム2水和物 0.59 mg, アプロチニン 3000 U(以上、Baxter社製 ティシール1 mlキットを使用),生理食塩水16 mlを混合し、3.5 cm培養皿1枚あたりに0.3 mlを培養皿底面に素早く塗布し、水平を保ったまま1時間室温で放置した。その後、フィブリンが形成され底面のティシール希釈液が固化した培養皿は無菌状態を保ったまま4℃で保存した。この状態で保存することにより2ヶ月ほど使用が可能となる。ティシール1 mlのキットより3.5 cm培養皿を40〜50枚作製することができた。
(1)ラット心筋細胞
1日齢のウィスターラット新生仔より心室を摘出し、0.03%トリプシン、0.03%コラゲナーゼ、20 μg/mL DNase Iで酵素処理を行い,心室筋細胞を単離した。フィブリンコートした3.5 cm 培養皿1枚当たりに、10% FBSおよびペニシリン (50 U/mL)/ストレプトマイシン (50 μg/mL) /アンホテリシンB(25 μg/ml)含有medium 199/DMEM 2 mlおよび本細胞を2×106個を注入し、37°C , 5% CO2のインキュベーターで培養を行った。
(2)マウス骨格筋芽細胞由来のC2C12細胞
ATCCより購入したマウス骨格筋芽細胞由来の細胞株C2C12を、10%FBS含有DMEM培地を用いて5% CO2 37度のインキュベーターで培養し、80% 飽和の状態で継代を行った。
(3)マウスC2C12細胞由来の成熟骨格筋様細胞
(2)の方法で継代したC2C12細胞を75cmフラスコに1×107細胞蒔き、5%ウマ血清含有DMEM20mlを添加した。細胞の状態を見ながら、1〜2回/週培地交換を行った。
(4)骨髄間質細胞
マウスの大腿骨より骨髄を無菌状態で採取し、3.5 cm フィブリンコートディッシュ1枚当たり1×107細胞の有核細胞を蒔き、三光純薬株式会社製間葉系幹細胞用増殖培地(PT-3001)3mlを添加し1回/週の頻度で培地交換を行った。
(1)ラット心筋細胞シートの作製
初代培養後4日目、細胞は培養皿底面に飽和状態となって拍動していた。培養液を吸引し、培養皿辺縁部より中心部へ向けてスクレイパーを用いて膜状に結合した心筋細胞を破れない様にゆっくり剥がした。すべて剥離し終わった後に、しわの寄った細胞シートにゆっくりと新たな培養液を滴下することによって細胞シートを培養皿上に伸展することができた。ラット心筋細胞のシート化の様子を図1に示す。
(2)C2C12細胞、成熟骨格筋細胞及び骨髄間質細胞による細胞シートの作製
実施例2の方法でフィブリンコート培養皿上に細胞が飽和状態になるまで培養を続けた。その後3〜4日培養を継続した後、同様にスクレイパーを用いて膜状の細胞シートを剥離した。C2C12細胞及び成熟骨格筋細胞のシート化の様子をそれぞれ図2及び3に示す。
1枚目のシートを実施例3に記載のように培養液を滴下することによって培養皿上に伸展した。その後培養液を極力吸引し37度飽和水蒸気のインキュベーターに15分放置した。この間に1枚目の細胞シートは培養皿上に弱い力で接着した。次に剥離した直後の2枚目の細胞シートを培養液と共に10 mlピペットで吸引し、培養皿上に固定された1枚目の細胞シートの上に滴下した。伸展した1枚目のシートの上に縮んだ状態で滴下された2枚目のシートに、さらに新たな培養液をゆっくり滴下することによって2枚目のシートを1枚目のシートに重ねた状態で伸展することができた。同様の手技を繰り返して細胞シートを次々積層化した。
(1)in vitroでの電気的活動
部分的に重ねた2枚の心筋細胞シートに1 mlの培養液を加え、毎日交換しながら培養を続けた。2日後にそれぞれのシートが同じ心拍数で自律収縮している様子が顕微鏡下で観察され、それぞれの心筋シートの両端より測定した心電図より同じ調律で収縮していることが確認された(図4)。
(2)In vivoでの生着
2枚に重ねたラット心筋シートを5週齢のヌードラットの皮下に移植し、1週間後に皮膚を切開し心筋シート(図5)を観察した。心筋シートの律動的な収縮が肉眼的に確認された。
(3)免疫組織染色による筋腫宿蛋白、Gap junctionの検討
in vitroにおいてラット心筋シート作製2日後の組織に対して、心筋細胞の代表的な収縮蛋白であるアクチニンとGap junctionの構成蛋白であるコネキシン43の免疫染色を行った。結果を図6に示す。またin vivoにおいて2層のラット心筋シートを3週齢のヌードラットの皮下に移植し7日後に摘出し、HE染色及びアクチニンとコネキシン43の免疫染色を行った。結果をそれぞれ図7及び8に示す。In vitro、in vivoにおいてアクチニンおよびコネキシン43の発現が良好に維持されていることが確認された。またin vivoのモデルに関してはin vitroのモデルに比して心筋細胞の配向成されていることがいることが確認できた。また、HE色の所見から、移植した心筋シート間に微小血管が浸入し、血流を供給している様が観察された。
材料及び方法
・心筋細胞シート作製法
ティシール(ヒトフィブリノーゲン、トロンビン、塩化カルシウム、アプロチニン含有)をバクスターより購入した。ヒトフィブリノーゲン90mg、ヒトアルブミン20mg、トロンビン0.4U、塩化カルシウム二水和物0.59mg、アプロチニン3000Uを15mlの生理食塩水に希釈し、そのうち0.3mlを35mm培養皿に塗布した。約2時間後にフィブリン重合体が表面にコートされた培養皿を得る事が出来た。この培養皿は4℃で1ヶ月程度は無菌的に保存する事が出来る。前出の手法で、生後1日齢の新生仔ウィスターラットの心室筋より心筋細胞を得る事が出来た(Kodama H, Fukuda K, Pan J et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, activates the JAK/STAT pathway in rat cardiomyocytes. Circ Res. 1997;81:656-663.)。得られた心筋細胞をフィブリンでコーティングされた培養皿上に(2.8 x 105/cm2)の密度で蒔いた。(図9A,B,G). 重合したフィブリンは培養細胞から分泌される非特異的プロテアーゼにより徐々に分解され、培養開始後3−7日後には細胞と培養皿表面との接触は次第に粗なものとなる (図9C) 。
全てに実験手技はthe Animal Care and Use Committees of the Keio University and conformed to the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsの主義に則って行われている。ジエチルエーテルの吸入後、1%塩酸プロカイン5-10mlを雄F344ヌードラット(8週令, n=10)の背部皮下に局注し、皮膚を切開した。同部に三層に重ねた心筋細胞シートを移植した。
抗フィブリン抗体(Monosan, Netherland)、抗α-アクチニン抗体(Sigma)、コネキシン43抗体(Sigma)を用い、前出の手法で免疫組織染色を行った( Agbulut O, Menot ML, Li Z et al. Temporal patterns of bone marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2003;58:451-459.)。これらの検体に対してアレキサ488標識抗マウスIgG抗体(Molecular Probes)もしくはTRITC標識抗ウサギIgG抗体(Dako)による二次染色を行った。いくつかの実験においてはアレキサ594標識ファロイジンによる染色を行った(Molecular Probes)。TOTO-3 (Sigma)により細胞核の染色を行った。染色された検体を共焦点レーザー顕微鏡で観察した(LSM510, Zeiss)。
2枚の心筋細胞シートを2mmの幅で互いに重ねあわせた。1組の双極電極を用いて、それぞれの心筋シートの両端で細胞外電位を測定した。
・フィブリンコートした培養皿により作製した心筋シートの組織学的解析
本手法により得られた心筋シートを解析するに当たり、本発明者らは心筋細胞をフィブリン培養皿上に蒔いてから様々な時間を経過した時点においてセルスクレイパーを用いたシート作製を行った(図10)。心筋細胞シートは3日以降より培養皿から剥がす事が可能となった。剥がした後の直径は元の培養皿に比べ38 ± 3.6% (n=30)に収縮した。通常の培養皿、ゼラチン、ラミニン、ファイブロネクチンをコーティングした培養皿上で心筋細胞を培養し、コンフルエントになった後同様の手技でセルスクレイパーを用いて細胞を剥がす試みを行ったが、これらのケースではシート状に細胞を回収する事は不可能であった(data not shown)。本実験において、本発明者らは初代培養からシート作製までの日数をPX days、シート作製からデータ採取までの日数をSX daysと定義した。初代培養から4日後に作製した心筋シートの底面には(P4-S0)残存フィブリンが認められた。しかし、初代培養から6日後に作製した心筋シート(P6-S0)には残存フィブリンは認められなかった。
まず始めに心筋細胞の初代培養開始から心筋シート作製までの理想的な日数の検討を行った(図11)。心筋シート作製時における成功率は3日後より上昇し4日目にピークに達した (成功率100%, 各n=12) (図11A)。得られる心筋シートの直径は初代培養からシート作製時までの期間に応じ、細胞密度の増加あるいは細胞の伸展の機序により徐々に伸張した (図11B)。次に初代培養から異なった期間において作製した心筋シートを、シート作製後から3日間培養を継続した時点で自律拍動を示している比率を調査した。初代培養からシート作製までの日数(PX)は心筋シートの自律拍動再開率に対して影響しなかった。しかし、心筋シート作製を初代培養から4日目に設定し(P4)、シート作製後培養を継続していった際に自律拍動がいつから認められるかを観察した所、シート作製後2日目より大幅な自律拍動出現率の増加を示し、さらに6日目(S6)においては100%の心筋シートが自律拍動を示した (6 days SX; 図11C,D)。ペーシング刺激に対して心筋シートが反応し律動収縮を示すかどうかを調べた所、律動収縮を示す割合はS2より増加し始めS5の時点では100%に達した (図11E) 。 図11Fは心筋シートを作製後、自律収縮を示す心筋シートの拍動周期(心拍数)を経時的に観察した結果である。これらの結果から、今回心筋シートを用いて電気生理学的解析を行うに当たり、P4-S3の心筋シートを用いる事に決定した。
次に心筋シート内での活動電位の伝播の様子を、また2枚の心筋シート間で接合部を通じて活動電位が伝播するかどうかを解析した。双極電極を接触させ心筋シートの心電図を記録した結果と、optical mapping systemにより計測された活動電位の記録とを比較した (図12)。心電図上ではA,B両方のシートが同期して自律拍動を行っている様子が記録された。心電図上、シートAとシートBのQRS complexは完全に同期し、2枚の心筋シートが電気的な結合が確立されている事が示唆された。しかし、予想に反してoptical mapping systemによる活動電位の記録においては、活動電位はシートAの左下方より右上方へ進行し、接合部の上部を通じてシートBへ伝播しシートB内を広がってゆく様子が記録された。すなわち、活動電位は2枚のシートの接合部においては最短距離を直線的に伝播しているわけではない事が判明した。図12Dにおける矢印上の活動電位伝導速度はシート間の接合部においても遅延無くスムーズに伝播している事が示された (図12E)。従って心筋シートの活動電位の伝播、心筋シート同志の電気的結合の様子を解析するのに際し、optical mapping systemは唯一の有用性の高い手法である事が判明した。
2枚の心筋シートの間において電気的結合がどのように確立されてゆくかを調査するために、本発明者らは部分的に重合させた心筋シートにおける活動電位の伝播の様子をoptical mapping systemにより解析した。P4-S1の心筋シート間において、活動電位は一方の心筋シートから他方の心筋シートへ伝播しなかった (図13)。興味深い事にいくつかのケースにおいては(3/10)シートBにおいて部分的な活動電位の捕捉が認められた(arrow in 図13D)。活動電位の伝播の様子を等時線で示したのが図13Fである。また図中ライン上で、興奮波の先頭が進行する際の伝導速度が図13Gに示されているが、活動電位の進行はt点で停止している事がわかる。
P4-S3心筋シートの蛍光免疫染色像を図15に示す。心筋細胞内には、はっきりとした横紋構造が認められる。心筋細胞間の接合部にはCx43が存在している。心筋細胞同志が接触する事により横紋構造の向きが同じ方向に向く傾向があった。2枚の重層化した心筋シートの厚さは約15±2 μmであった。2枚のシートは完全に結合しており、2枚のシートの境界を判別する事は不可能であった。
3層に重層化した心筋シートをヌードラットの皮下に移植し14日後に観察した所、力強い周期的な収縮を示した(図16)。HE染色およびアザン染色では移植された心筋シートは宿主由来の結合組織により上下から覆われている事が示された(図16B,C)。心筋シートの厚みは102±11 μmであり、vitroで3層の心筋シートの培養を継続した際に比べより厚くなっていた。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、1つ1つの心筋細胞の大きさはvitroのケースに比べ大きくなっていた。さらに移植された心筋シート内には豊富な血管新生が認められた (図16D)。これらの血管系は10-25 μmと、毛細血管レベルではなく微小血管レベルの経を有していた。心筋細胞内の横紋構造はよく発達しており心筋細胞の分布には同一方向を向く配向が認められた(図16E)。これらの所見はフィブリンコート培養皿を用いて作製された心筋シートは、組織での生着性がよく、正常心臓に似た組織構造を持ち、良好な収縮能を有しているものと考えられた。
PIAAmをコートした感応性培養皿を用いて細胞シートを作製する手技が報告されて以来、様々な臓器における二次元もしくは三次元の組織工学の手法の一つとして細胞シート工学が発展してきた。その結果、現在では細胞シート工学は再生医療の分野において重要な位置を占める様になってきた。これまで温度感応性培養皿を用いて血管内皮細胞、肝細胞、腎上皮細胞、角膜細胞などによる細胞シートを作製した報告がなされている(Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A et al. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials. 2003;24:2309-2316.)。
(1)角膜上皮細胞シートの作製
以下の手順で、組織培養皿(IWAKI)にコートしたフィブリンシート上に角膜上皮細胞シートを作製した。
1)綿棒でウサギのデスメと虹彩を擦り取り、結膜をカットする。
2)12分割し、上皮を下にしてfibrinをコートしたinner well上に置く。
3)666 KIU/mlのアプロチニンを添加した0.6 ml SHEMを加える。上皮が生えてきたら、SHEM(666 KIU/mlのアプロチニン添加)を1mlにする。
4)3T3細胞を培養しているDMEM+FCS(+)を2ml SHEM(666 KIU/mlのアプロチニン添加)に変更する。
5)上皮がコンフルエントになったら(コンフルエントになるまで1〜2週間かかる)、Air liftをおこなう(1週間程度)。培地はSHEMだが、アプロチニンは添加しない。
6)培養した上皮をスクレイパーで剥がす。
以下の手順で、組織培養皿(IWAKI)にコートしたフィブリンシート上に口腔粘膜上皮細胞シートを作製した。
1)ウサギの口腔粘膜を採取する(2mmx2mmx1mmを2箇所採取)。
2)組織を洗浄する(ゲンタマイシンと抗生剤-抗真菌剤入りのmedium で15分間x3回 RT、抗生剤入りのPBS(−)で15分間 RT)。
3)Dispas II処理をする(37℃ 1時間)。
4)上皮を実質から剥がし、DMEM/F12+FCS(−)へ入れる。
5)Trypsin-EDTA処理をする(8分間 RT)。
6)1500rpmで5分間遠心する(2x105個/1ml SHEM(666 KIU/mlのアプロチニン添加)でinner wellへ播く)。
7)3T3細胞を培養しているDMEM+FCS(+)を2ml SHEM(666 KIU/mlのアプロチニン添加)に変更する。
8)上皮がコンフルエントになったら(コンフルエントになるまで1〜2週間かかる)、Air liftをおこなう(1週間程度)。培地はSHEMだが、アプロチニンは添加しない。
9) 培養した上皮をスクレイパーで剥がす。
以下の手順で、上皮シートをAmex法にて包埋した。
1)上皮シートをメッシュに入れる。
2)4℃のアセトンに入れる。
3)アセトンごと-20℃に移し、一昼夜固定する。
4)4℃のアセトンに入れ替え、15分浸透させる。
5)室温のアセトンに入れ替え、15分浸透させる。
6)安息香酸メチルに入れ替え、15分浸透させる。この操作を2回行う。
7)キシレンに入れ替え、15分浸透させる。この操作を2回行う。
8)パラフィンを1時間浸透させる。この操作を3回行う。
9)パラフィンで包埋する。
ウサギの角膜組織、口腔粘膜組織、培養角膜上皮、培養口腔粘膜上皮のサンプルにつき、Amex 包埋法で作製したパラフィン切片を以下の手順で免疫染色した。
1)3% H2O2で30 分、室温にて処理する。
2)ブロッキング( 10% Nomal Donkey Serum - 1% BSA - 0.01M PBS )を1 時間、室温にて行う。
3)1次抗体 (AE5 : PROGEN 61807 : 1/1000 )と反応させる。Isotype control (mouse IgG1 : Dako : 1/500 ) O/N
4)2次抗体(Donkey anti Ms IgG - FITC 、Jackson : 711-095-152 : 1/50 )と 30 分、室温にて反応させる。
5)核染色 (DOJINDO : 1 ug/ml DAPI)を5 分、室温にて行う。
Claims (3)
- 表面がフィブリンでコーティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィブリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、フィブリンを実質的に含まない細胞シートの製造方法。
- 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、請求項1記載の方法。
- 細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、請求項1又は2に記載の方法。
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