JPH09504968A

JPH09504968A - 可溶性因子による上皮細胞の付着刺激及びヘミデスモソーム構成刺激

Info

Publication number: JPH09504968A
Application number: JP7513968A
Authority: JP
Inventors: クアランタ，ビトー; ホーミア，マーケッタ
Original assignee: デスモスインコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 1997-05-20
Also published as: US5658789A; WO1995013103A2; EP0728023A1; AU685576B2; SG44536A1; AU1469995A; CA2174735A1; US5422264A; WO1995013103A3

Abstract

(57)【要約】 804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌される可溶性タンパク質を使用してインビボで上皮細胞を成長させる方法。これらのタンパク質は該タンパク質と接触させて成長させた細胞で細胞付着及びヘミデスモソーム形成を刺激することができる。804Ｇ培養上清液から得られるこれらタンパク質の精製は低血清条件下で細胞を培養することによって極めて容易になる。その可溶性タンパク質で被覆した経上皮器具及びヒト組織のエクスビボ維持における可溶性タンパク質の使用も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性因子による上皮細胞の付着刺激及びヘミデスモソーム構成刺激発明の背景身体器官が形成されるとき、これらの器官はきちんと組織化された配列で発達する。しばしば、１つの種類の細胞群は基底膜と呼ばれる結合組織の平板細片によってもう１種類の細胞から分離されている。例えば皮膚では、表皮細胞の浅層は下部にある基底膜に接着している。この皮膚基底膜は外側の表皮細胞と下部真皮細胞との間のバリヤーとして機能する。腸の内面でも同様な細胞配列が生じる。基底膜は上部にある上記細胞集団の成長、付着(attachment)、移動、修復及び分化に関係している。基底膜では３つの層、すなわち、ａ）淡明層、即ち上部にある細胞に近接して存在する電子顕微鏡で明るい領域、ｂ）稠密層、即ち幅20〜 300nmの電子密度の濃い領域、及びｃ）固定細繊維、ミクロフィブリル束及びコラーゲン繊維を含有する稠密下層、が区分されている。現在基底膜には多くの異なるタイプの化合物の存在が確認されている。これらの化合物のなかにはラミニン、コラーゲンIV及びヘパリン硫酸プロテオグリカンがある(Verrando等、Exp.Cell Res.(1987年);170:116〜128)。加えて、特定の基底膜はニドゲン及びエンタクチンのような他の化合物を有することが見い出されている。表皮細胞が基底膜との付着に使用する主要な細胞接着レセプターはα₆β₄と呼ばれる。このトランスメンブランレセプターは、２つのタンパク質部分α₆とβ₄ の組合せによって形成される。α₆及びβ₄タンパク質は異なる遺伝子から誘導され、それらはインテグリンファミリーの１部であることが見い出されている。インテグリンは細胞接着レセプターの多目的ファミリーである。これまでのところ、概ね20個のインテグリンファミリーのメンバーが発見されている。これらの分子は身体内の多くのタイプの細胞接着現象に関与する。インテグリンは周囲の合図を細胞指令に翻訳できる信号送付分子である。更に、インテグリンはシグナルを細胞の内部から外部に逆方向に伝達することもできる。これはリンパ球のような非接着細胞で示されている。Ｔ細胞抗原レセプター又はＣＤ３コンプレックスを刺激すると、それらのそれぞれのリガンドに対する或るインテグリンの親和性が高まる。残念なことに、接着細胞ではインテグリンの親和性の変化を証明することは一層困難であった。しかし乍ら、表皮ケラチノサイトの分化における１つのインテグリンの親和性調節がアダムス（Adams）等（Cell(1990年);63:425〜435）によって記載されている。このため、他のレセプターの活性化又は分化によって開始される細胞状態の変化はインテグリンの親和性に、そして究極的には細胞の接着挙動に影響を与えると思われる。更に、表面に接着した結果、インテグリンは細胞形状又は移動の変化に能動的に寄与し得るものと思われる。多くの上皮細胞はヘミデスモソームと呼ばれる連結部を介して下部にある細胞外マトリックスと相互作用する(Staehelin、（1974年）Structure and Function of Intercellular Junctions、191〜283)。最近の２、３年で、この連結部の生化学的な特徴がかなり判明した(Schwartz等、（1990年）Annu.Rev.Cell Biol.、6 :461〜491)。ヘミデスモソームは、中間フィラメントや固定細繊維(anchoring fibril)のようなヘミデスモソームと関係のある構造と共に接着コンプレックスを形成する。上皮と結合組織の相互作用の破壊はしばしば、ヘミデスモソームコンプレックスの破壊を伴う。例えば、上皮細胞−結合組織の相互作用が異常である結合表皮水疱症(junctional epidermolysis bullosa)のような或る種の水疱性皮膚疾患では、ヘミデスモソームの基底膜領域関連成分が生化学的に修飾されているか又は欠失していることが報告されている。ヘミデスモソームの２つの高分子量細胞内成分は、水泡性類天疱瘡に罹っている患者の抗血清を使用して同定されそして特徴が明らかにされている。この自己免疫疾患は上皮細胞と結合組織間の相互作用の破壊を生じさせ、同時にヘミデスモソームの完全性を消失させる(Chapman等、Br.J.Dermatol(1990年);123:137〜1 44)。従って、水泡性類天疱瘡患者はヘミデスモソーム成分に対する抗体を産生していることが発見された。２つのヘミデスモソーム関連水泡性類天疱瘡（ＢＰ）抗原がこれまでに記載されている（Klatte等、1989年）。１つのＢＰ抗原は、ヘミデスモソームプラーク中の細胞骨格要素のアンカーとして機能し得る230ｋＤのポリペプチドである(Jones及びGreen、（1991年）Curr .Opin.Cell Biol.、3:127〜132)。もう１つのＢＰ抗原は、コラーゲン様の細胞外ドメインを有するII型膜タンパク質である(Giudice等、（1991年）J.Clin.Inv est.、87:734〜738;Hopkinson等、（1992年）J.Invest.Dermatol.、3:264〜270) 。加えて、ヘミデスモソームと下部にある結合組織との相互作用はα₆β₄インテグリンヘテロダイマーに関係があることが証明されている（Stepp等、（1990年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:8970〜8974;Jones等、（1991年）Cell Regulati on、2:427〜438;Sonnenberg等、（1991年）J.Cell Biol.、113:907〜917;Kurpak us等、（1991年）J.Cell Biol.、115:1737〜1750）。α₆β₄ヘテロダイマーは、ラット膀胱癌細胞系804Ｇの基底表面に沿ったヘミデスモソームに局在している( Jones等、Cell Regulation(1991年);2:427〜438)。これらの結果によって、インテグリン（例えば、α₆β₄）がヘミデスモソームの構成及び接着機能に重要な役割を果たし得ることが示唆された。これまでの努力は基底膜中に見られる接着促進タンパク質の精製に焦点が当てられていた。例えば、Burgeson等の特許協力条約（ＰＣＴ）出願公開番号ＷＯ92 /17498及びＷＯ94/05316は彼等がカリニンと称するタンパク質を開示している。カリニンは基質に対する細胞接着を促進すると言われている。しかし乍ら、この物質はヘミデスモソーム形成に関しては明らかに不活性である。Marinkovich等、J.Cell Biol.(1992年);119:695〜703（ｋ−ラミニン）、Rouselle等、J.Cell Biol.(1991年);114:567〜576（カリニン）及びMarinkovich等、J.Biol.Chem.(19 92年);267:17900〜17906（カリニン）も参照。同様に、93.5ｋＤから150ｋＤの範囲のポリペプチドを含んでいる約600ｋＤの基底糖タンパク質が同定され、そしてＧＢ3又はナイセインとして知られている。例えば、Verrando等、Biochim.Biophys.Acta(1988年);942:45〜56;及びHsi等、Placenta(1987年);8:209〜217参照。これら物質はいずれも、インビトロ又はインビボのどちらでもヘミデスモソーム形成誘発に有効ではなかった。上皮細胞を組織培養プラスチック上でインビトロで培養すると、これら細胞は上記した全てのヘミデスモソームプラーク及びトランスメンブラン成分を発現すると思われるという事実にも拘わらず、殆どの上皮細胞は真正のヘミデスモソームを構成しない。実際、804Ｇのような細胞系が通常の培養条件下でインビトロで容易にヘミデスモソームを構成する能力を有していることが発見されたのはつい最近のことである(Riddelle等、（1991年）J.Cell Biol.、112:159〜168;Hied a等、（1992年）J.Cell Biol.、116:1497〜1506)。このような細胞によって、ヘミデスモソーム構成の動力学の詳細な細胞及び生化学的分析がようやく可能になろうとしている。例えば、抗ヘミデスモソーム抗体による基層関連染色は、インビトロで外傷部位に入る804Ｇ細胞培養物では非常に減少することが報告された(Riddelle等、J. Cell Sci.(1982年);103:475〜490)。しかし乍ら、上記外傷が完全に閉鎖されると、基層付着表面に沿った上記細胞の抗ヘミデスモソーム染色が明らかであった。しかし乍ら、種々の成長因子で処理した後であっても、通常の態様では組織培養皿に付着しない多数の上皮細胞が存在する。これらの細胞は正常なヘミデスモソームを産生しないか又はそれらのインビボ表現型に類似しては成長しない。インビトロで上皮細胞の成長を維持できそしてこれら上皮細胞が正常な表現型を維持できる系を得ることは素晴らしい利点を提供するであろう。エクスビボ(ex vivo)で組織や器官を維持することも非常に望まれている。組織置換治療法はヒト疾病の治療で十分に確立されている。例えば、概ね42,000の角膜移植が1993年に米国で実施された。ヒト表皮細胞は既に、インビトロで成長させることが可能でありそして火傷部位や慢性皮膚潰瘍に定着させるために使用することが可能である。しかし乍ら、多数の一次細胞及び組織を通常の組織培養プラスチック上でインビトロで確立することは困難である。この問題は細胞外マトリックスで被覆した細胞支持体を使用することによって部分的に軽減されるが、これは一時的な解決にすぎない。それ自体では通常ヘミデスモソームを誘発できない細胞中でヘミデスモソームを誘発する必要がある。組織及び器官をエクスビボで効果的に維持する必要もある。本発明はこれらを満たすものである。発明の概要本発明の第１の特徴は、可溶性因子を分泌する804Ｇラット膀胱癌細胞を、この因子の分泌を促進する条件下で培地中で成長させること、804Ｇ細胞から上記培地を分離すること、及び、上記培地を上皮細胞と接触させ、この接触によって上皮細胞中のヘミデスモソーム形成を促進させることを含む、インビトロで上記上皮細胞を成長させる方法を提供することである。好ましくは、上皮細胞は哺乳類動物細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞である。この好ましい態様のもう１つの特徴によれば、上記細胞はヒト皮膚細胞である。本発明はまた、哺乳類動物においてインビボ使用に適合した生物適合成形品、及び、上記成形品上のヘミデスモソーム形成促進タンパク質組成物を含む物品も提供する。好ましくは、上記タンパク質組成物は上皮細胞起源の腫瘍細胞系によって分泌され、最も好ましくは、上記細胞系はラット膀胱癌細胞系804Ｇ又はＮＢＴ−II である。本発明のもう１つの態様は、それ自体ではヘミデスモソームを形成できない上皮細胞を、ヘミデスモソームの形成を促進するのに有効な量の可溶性因子の存在下水溶液中で培養する段階を含んでおり、この可溶性因子は804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌されるヘミデスモソーム誘発可溶性因子である、インビトロで上記上皮細胞中にヘミデスモソーム形成を誘発する方法である。有利には、ヘミデスモソーム誘発因子は804Ｇ又はＮＢＴ−II細胞のどちらかから得ることができる。加えて、804Ｇ細胞を低血清培地中で成長するように順応させてもよい。好ましくは、上皮細胞はヒト細胞である。この態様のもう１つの特徴によれば、上記可溶性因子は実質的に細胞不含の培地中で細胞に提供される。或いは、上記可溶性因子は低血清培地中で細胞に提供される。本発明の更にもう１つの特徴は、804Ｇ細胞によって産生され、上皮細胞中でヘミデスモソーム形成を促進する、細胞成長促進又はヘミデスモソーム形成促進に有効な量の可溶性因子を含有する細胞不含水性培地を準備し、有効量の可溶性因子を産生しない上皮細胞を上記水性培地と接触させる段階を含む、上記上皮細胞の成長促進方法又は上記上皮細胞によるヘミデスモソーム形成促進方法である。好ましくは、上記上皮細胞はヒト細胞である。本発明のもう１つの特徴によれば、低血清培地中で成長するように順応させた、可溶性ヘミデスモソーム形成誘発因子を分泌する804Ｇ細胞系が提供される。本発明の尚もう１つの態様は、細胞系804Ｇによって産生され実質的に単離されたか又は精製された形態の活性のヘミデスモソーム誘発可溶性因子である。好ましくは、この可溶性因子は医薬的に許容可能な担体中で提供される。本発明はまた、経上皮器具(trans-epithelial appliance)、及び、上記器具上に付着した、ヘミデスモソームを誘発する804Ｇ可溶性因子であるヘミデスモソーム形成誘発組成物を含む物品を提供する。好ましくは、上記器具は、留置カテーテル、針、金属ピン、金属棒、人工肛門形成管(colostomy tube)、歯科用支台片(dental abutment piece)又は外科用メッシュ(surgical mesh)である。有利には、上記組成物は804Ｇ細胞によって分泌される可溶性因子であり、そして上記物品は更に、上記ヘミデスモソーム形成誘発組成物上に付着した上皮細胞を含む。上記器具はインビボ用でもよく、そして生物適合性金属、好ましくはステンレス鋼又はチタンで製造するか又は被覆してもよい。或いは、上記器具はセラミック材料、好ましくはヒドロキシアパタイトで製造するか又は被覆してもよい。上記器具はまた、ポリマー、好ましくはポリエステル、ポリグリコール酸又はポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーで製造するか又は被覆してもよい。本発明のもう１つの態様は、上皮細胞と共にインキュベートする前に経上皮器具をヘミデスモソーム形成誘発組成物で被覆することを含み、この組成物はヘミデスモソーム誘発804Ｇマトリックスタンパク質である、上記器具への上記上皮細胞の付着を誘導する方法である。好ましくは、上記組成物は804Ｇ細胞によって分泌される可溶性因子であり、そして上記器具は留置カテーテル、針、金属ピン、金属棒、人工肛門形成管、歯科用支台片又は外科用メッシュのいずれかである。上記器具を、ポリマー好ましくはポリエステル、ポリグリコール酸又はポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーで製造するか又は被覆することが好ましい。本発明はまた、ヘミデスモソーム誘発タンパク質因子を含有する培地中で角膜外移植片を培養することを含んでおり、この因子は804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌されるヘミデスモソーム誘発可溶性因子である、エクスビボで上記角膜外移植片を保存する方法も提供する。好ましくは、培地は804Ｇコンディションドメディウムである。本発明はまた、ヘミデスモソーム誘発組成物を表面に塗布することを含み、この組成物はヘミデスモソーム誘発804Ｇ可溶性因子である、上記表面への上皮細胞の付着を誘発する方法も提供する。発明の詳細な説明本発明には、或る種の細胞系によって成長培地中に分泌される可溶性因子が上皮細胞における細胞接着及びヘミデスモソーム構成(assembly)を刺激できるという知見に基づく。この能力を有する細胞の１つのタイプはラット膀胱癌細胞系80 4Ｇである。この細胞系は、Izumi等、Cancer Res.(1981年);41:405〜409に記載されており、そして発明者ジョナサンC.R.ジョーンズ（Jonathan C.R.Jones）の研究室で永久コレクション中に維持されており、そしてこの細胞系は彼から容易に入手することができる。この細胞系はまた、イリノイ州シカゴのノースウェスターン医科大学病理学科のリョウイチオヤス（Ryoichi Oyasu）から入手することもできる。804Ｇ細胞系はまた、メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）によって、1994年2月24日になされた受託番号ATCC CRL 11555のブタペスト条約による特許寄託物としても維持されている。更に、これらの可溶性因子の精製は、低血清条件下で804Ｇ細胞を培養することによって、血清タンパク質が事実上夾雑しないため、大いに促進される。804 Ｇ細胞はダルベッコの修正イーグル培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（１：１））中１％のウシ胎児血清の存在下で培養したが、他の培地及び他の濃度、好ましくは約0. 1％から約５％までのウシ胎児血清もまた考えられる。 804Ｇ可溶性因子が、多数の異なる細胞型が成熟ヘミデスモソームを発現しそしてそれらの成長基質に付着するように誘導し得ることを証明する超微細構造データが明らかにされている。804Ｇ細胞のような細胞によって分泌される因子を有し、非関連細胞中でヘミデスモソーム抗原の組織化を調節できる溶液を調製することができる。この効果は、接着プラーク成分が、804Ｇ可溶性因子で処理した細胞におけるヘミデスモソーム要素の局在化を明白には変えないので、ヘミデスモソーム要素に特異的であるように思われる。本発明者の新しい知見を証明するために、本発明者は、ネズミ804Ｇ因子がヒトＨaＣaＴ細胞で「成熟」ヘミデスモソームの構成を誘発できたという証拠を提供する。ヒト組織に対して上記のような顕著な影響を有する化合物をネズミ細胞から見い出すことは通常のことでないと理解することができよう。以下で一層詳細に記載する実験で、ＨaＣaＴ細胞をラット尾部コラーゲン上で成長させた対照実験と比較して、804Ｇ成長培地で処理したＨaＣaＴ細胞中でのヘミデスモソーム様構造体数の増加が見られた。更に、上記処理細胞中のヘミデスモソーム様構造体の大部分は細胞基質に接触しておりそして稠密な基底板を有していた。稠密な基底板構造体はしばしば、成熟するか又は形成されたヘミデスモソームの指標として使用される(Krawczyk及びWilgram、（1973年）J.Ultrastruct.Res.、45:9 3〜101)。 804Ｇ可溶性因子の製造及び単離に関する方法を開示するが、インビトロでの細胞接着及びヘミデスモソーム構成を支援する能力を伝達する化合物を分泌する任意の細胞は本発明の範囲内であると理解することができよう。他の細胞型から得られる可溶性因子、例えばネズミ膀胱癌細胞系ＮＢＴ−II（ATCC CRL 1655）も、インビトロでの付着及びヘミデスモソーム構成を誘発できよう。ＮＢＴ−II 細胞系もブタペスト条約による特許寄託物として受託番号ATCC CRL 11556でＡＴＣＣによって維持されている。「804Ｇ因子」という用語は、本願明細書では、細胞付着及びヘミデスモソーム形成を刺激する能力を有する任意の分泌細胞因子を総称的に指すことに注意すべきである。可溶性物質の活性成分に関して意図される１つの主要な用途は細胞の成長及び付着におけるものである。細胞を成長させる基質は可溶性因子を含む溶液で被覆される。次に、成長すべき細胞を基質にまくか又は適用する。インビトロ及びインビボでのヒト細胞を含む上記の細胞は基質上で組織化された形態で成長しそしてヘミデスモソームを形成する。ヘミデスモソーム形成は基質への細胞の付着を大いに高めるので、ヘミデスモソーム形成は主要な利点である。更に、可溶性因子による細胞の組織化は、本発明の分泌因子中の活性成分で刺激しないで成長させた細胞より一層顕著に進展しそして一層組織様であるように思われる。使用される基質は任意の所望の基質でよい。実験室的な使用では、基質はガラス又はプラスチックのように単純なものでよい。インビボで使用するためには、基質は細胞が成長できる任意の生物学的に適合性の材料であってもよい。適当な基質材料には、コラーゲン、再生コラーゲン、ポリ乳酸、ステンレス鋼やチタンのような生物適合性金属、ヒドロキシルアパタイトのような補綴材料を含むセラミック材料、ポリエステルやナイロンを含む合成ポリマー、及び生物学的分子が容易に接着する実際上任意の他の材料のような材料で製造するか又は被覆した成形品が含まれる。本発明の１つの特別の用途は標的表面への表皮細胞の接着を高めることである。例えば、歯科用支台片のような歯科移植用補綴を804Ｇ可溶性因子で被覆して歯根膜細胞の付着を刺激することができる。歯肉炎のような歯肉（結合上皮）疾患の治療として、現存する歯を同様に被覆することができる。基質が、織られるか若しくは結合したコラーゲン、ポリ乳酸、ラクチド、グリコリド、グルタミン酸、コラーゲン又はアルブミンのようなシート又は織物の形態の天然又は合成生物侵食性材料で製造されている場合、マトリックス材料は基質表面に適用するか又は上記組成の上記材料中に混合することができる。次に、細胞（例えば、表皮細胞）をエクスビボでマトリックス上で成長させて移植又は埋め込み可能な材料を形成することができる。或いは、これらの材料を埋め込みそして細胞をインビボで付着させることができる。 804Ｇ細胞によって分泌される可溶性804Ｇヘミデスモソーム誘発因子を使用して、本願明細書で「経上皮」器具と称する他の器具を被覆することもできる。経上皮器具は、上皮に入れることができる任意の器具であり、これらには生体適合材料で製造されている針、金属ピン又は棒、留置カテーテル、人工肛門形成管及び外科用メッシュが含まれるがこれらに限定されない。上記マトリックスの個々のタンパク質成分を単離しそしてそれを使用して上記器具を被覆することができる。或いは、804Ｇ細胞から得られるコンディションドメディウムを使用して器具を被覆することができる。更に、可溶性因子のタンパク質成分を組み換え法で産生させそして器具被覆物として使用することができる。804Ｇ可溶性因子又はその任意のタンパク質成分で細胞接着を助けることのできる任意の所望の表面を被覆することは本発明の範囲内である。上記器具は、低いか又は通常の血清条件下で成長させた804Ｇ細胞から得られるコンディションドメディウム中に浸漬するか、インキュベートするか又はこの培地を噴霧することができる。低血清条件下で804Ｇ細胞を成長させると、以下の実施例６で記載するように培地からの因子精製が容易になる。精製したか又は組み換え法で産生した可溶性因子を、上記に記載した方法と同様にして上記器具に塗布することもできる。好ましい態様では、上記器具の被覆に使用される因子の濃度は約20μg／lから約200μg／lの間である。特に好ましい実施態様では、濃度は約50μg／lから約150μg／lの間である。コンディションドメディウムを使用してエクスビボで組織及び器官の成長を助けることもできる。ヒト組織外移植培養物では、804Ｇマトリックスが細胞によって利用されそして存在する基底膜中に取り込まれる。例えば、ヒト角膜縁では、角膜での上皮細胞付着を維持し（実施例11）そして同じ組織での必須の上皮細胞−マトリックス付着デバイスの構成を誘発するために、可溶性ラミニン変異体を含有する804Ｇ細胞コンディションドメディウムが使用されている。角膜は804Ｇ細胞から得られるコンディションドメディウムに直接入れるか又は804Ｇコンディションドメディウムを補足した慣用の培地に入れることができる。エクスビボで角膜を最適に維持するのに必要な804Ｇコンディションドメディウムの量は、10％から100％の間のコンディションドメディウム（残りは通常の培地である）の使用が考えられるが、細胞の集密度、継代数及び特別の成長条件に依存して変動する。当該技術分野の通常の技倆を有する者は定型的な実験法を使用することによってコンディションドメディウムの使用量の最適化を行うことができる。804Ｇコンディションドメディウム及び804Ｇコンディションドメディウムを補足した通常の培地中での他の組織及び器官のエクスビボでの維持も本発明の範囲内である。 804Ｇ可溶性因子の産生及び単離に関連した方法を特に開示するが、細胞接着、伸展及びヘミデスモソーム形成を助ける能力を有する任意の可溶性因子は本発明の範囲内であると理解されよう。 804Ｇ可溶性因子は、ヘミデスモソーム形態形成及びα₆β₄インテグリンと上皮細胞外マトリックスとの相互作用に関する研究においても大いに役立つであろう。実際、804Ｇ細胞によって分泌される活性因子は、分子レベルでの上皮細胞とそれらの下部にある結合組織間のヘミデスモソーム介在性相互作用の分析を可能にする手段であることが理解される。可溶性因子及びその活性成分に加えて、本発明にはそれら材料で被覆された成形品も含まれる。好ましくは、これらの成形品はガラス以外の材料で形成されており、そしてこれらにはシート、織物、補綴、金属物品、生物浸食性(bioeridib le)物品及び移植可能物品のような形態が含まれる。更に、可溶性因子を有する医薬製剤が意図される。これらの製剤は任意の適当な形態であることができ、そして一般的に、周知の医薬的に許容可能な担体の任意のものと組み合わせて活性成分を含んでいる。この可溶性因子は、適当な細胞を成長させた成長培地から単離することができる。或いは、可溶性因子は合成によるか若しくは組換えＤＮΛ技術によって、又は成長培地から単離したタンパク質の精製によって製造することができる。担体は、注射用担体、局所用担体、経皮用担体等であってもよい。製剤は有利には、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、分散液、懸濁液又はペーストのような局所適用用の形態である。これらの製剤は更に有利には、保存剤、抗菌剤、抗真菌剤、酸化防止剤、浸透剤及び同様な材料を慣用の組成及び量で含有する。本発明の組成物の製剤化の参考には、レミントンズファーマシューティカルサイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第15版、マックパブリッシングカンパニー(Mack Publishing Co.)、ペンシルベニア州イーストン（1975年）を参照する。また、本願明細書で意図される組成物によって種々のタイプの上皮細胞を接触させて成長させることができる。 804Ｇ可溶性因子の特性を明らかにする最初の段階として、ＨaＣaＴ細胞を、成長中の804Ｇ細胞から得られる培地で処理した。実施例１ＨaＣaＴ細胞の可溶性因子処理ドイツ国ハイデルベルグのノルバートフセニッヒ（Norbert Fusenig）博士から提供された不死化ヒトケラチノサイト細胞系ＨaＣaＴ（Boukamp等（1988年）J .Cell Biol.、106:761〜771）を、10％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Bio−Whittaker ）及び抗生物質を補足したＤＭＥＭ培地（Bio−Whittaker、メリーランド州ウォーカーズビル）中で培養した。ＨaＣaＴ細胞系はインビトロで通常の角化特性を有しており、インボルクリン、フィラグリン、サイトケラチン1、10、5、6、14 、16／17、7、8及び19について陽性であり、そしてビメンチンについて陰性である。それ故、上記細胞系は一次ケラチノサイトに非常に類似した特徴を有している。ラット膀胱癌細胞系、804Ｇ及びヒト胚線維芽細胞系ＷI−38（ＡＴＣＣＣＣＬ 75）も同じ補足物を有するＤＭＥＭ培地中で培養した。 804Ｇ細胞の培養上清液は、約70％集密でありそして48時間かけて集密に到達させた培養物から集めた。この時間の終了時に15mlの上清液を75cm²の培養フラスコから集めた。ＨaＣaＴ及びＷI−38細胞の上清液を同様な方法で48時間かけて集めた。通常の培地中の組織培養プラスチック上にまいたＨaＣaＴ細胞は、付着し、非常にゆっくり伸展し、そして接種して２時間後でも依然として丸く見える。対照的に、この細胞を804Ｇ細胞の培養上清液中に接種すると、それら細胞は成長基層(growth substratum)に付着しそして30分以内に平板形態となった。24時間後、通常の培地中の細胞は類上皮島を形成し、一方804Ｇの上清液中に接種した細胞は伸展した形態学を示しそして成長基層を均一に覆うように移動するように見えた。804Ｇ培養上清液効果は、たとえこれらの細胞を、上清液と通常培地との１：１希釈物中にまいたとしても、明白であった。対照として、ＨaＣaＴ細胞をこの細胞自体の培養上清液及びヒト線維芽細胞（ＷI-38）の培養物から集めた培地中にもまいた。ＨaＣaＴ細胞自体の培地か又はＷI−38培地のいずれにまいたＨaＣaＴ細胞も、804Ｇ培地にまいたＨaＣaＴ細胞の成長及び形態を示さなかった。次に、本発明者らは次の実験を行って、ＨaＣaＴ細胞中のヘミデスモソーム要素に与える804Ｇ上清液の影響を分析した。実施例２ 804Ｇ上清液で処理した後のヘミデスモソーム発現の分析 α₆β₄インテグリンの分布に与える804Ｇ培養物上清液の効果を研究するために、ＨaＣaＴ細胞をガラス製のカバースリップ上で成長させ、固定しそしてα₆ 及びβ₄インテグリンサブユニット、ヘミデスモソーム成分又は上皮マトリックス要素を免疫標識した。ＨaＣaＴ細胞を免疫蛍光顕微鏡法用にガラス製のカバースリップ上で、通常の培地中、804Ｇ細胞で48時間条件づけした培地中、又は804Ｇ細胞との共培養（１：１）のいずれかで24時間成長させた。これらの細胞を−20℃のメタノール中で５分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄しそして次の抗体で免疫標識した。（１）ＡＡ３；ヒトβ₄インテグリンサブユニットに対するマウスモノクローナル抗体(Tamura等、J.Cell Biol.1990年;111:1593〜1604)。この抗体はヒトインテグリン分子と特異的に結合する。（２）ＧＯＨ３；α₆インテグリンサブユニットに対するラットモノクローナル抗体(AMAC、メーン州ウェストブルック)。この抗体はヒト及びマウスのインテグリン分子と反応するがラットインテグリン分子とは反応しない。（３）6844；α₆インテグリンサブユニットの細胞質末端の15アミノ酸に対するウサギポリクローナル抗血清。（４）Ｊ１８；804Ｇ細胞の可溶化マトリックスに対するウサギ抗血清(Langho fer等、（1993年）J.Cell Sci.、105:753〜764)。（５）５Ｃ５；804Ｇ細胞の可溶化マトリックスに対するマウスモノクローナル抗体。（６）Ｊ１７；180ｋＤのヘミデスモソームタンパク質に対するウサギ抗血清( Riddelle等、（1992年）J.Cell Sci.、103:475〜490)。（７）Ｐ１Ｅ１；エピリグリンに対するマウスモノクローナル抗体(ワシントン州シアトルのFred Hutchinson Cancer ResearchのDr.William G.Carterから、 Carter等、1991年)。（８）ＢＭ１６５；カリニンに対するマウスモノクローナル抗体(オレゴン州ポートランドのOregon Health Sciences大学のDr.Robert E.Burgesonから、Rous selle等、1991年、Marinkovich等、1992年)。（９）ＧＢ３；ヒト基底膜に対するマウスモノクローナル抗体(Accurate Chem ical and Scientific Corporation、ニューヨーク州ウェストベリー)。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）との複合体にした抗マウス及び抗ウサギ抗体はジャクソン免疫研究所（Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.）（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から購入した。ＦＩＴＣ又はＴＲＩＴＣとの複合体にした抗ラット抗体はシグマケミカルコーポレーション（Sigma Chemical C orporafion）（ミズーリー州セントルイス）からのものであった。単一又は二重免疫標識した後、細胞は、エピフルオレセンス及び位相差光学系を備えたツァイスアクスロフォット（Zeiss Axlophot）顕微鏡下で試験した。ライツオルトマート（Leitz Orthomat）Ｅ自動カメラシステム及びＥI800でコダック（Kodak）TMY 400フィルムを用いて写真を撮影した。生存細胞の視覚化及び写真撮影は、位相差光学系を備えたツァイスアクシオバート（Axiovert）顕微鏡及び上記と同じカメラシステムを用いて実施した。通常培地で成長させた細胞では、α₆及びβ₄インテグリンサブユニットは細胞島の縁で最もはっきり視覚化されたパッチ状で微細な顆粒状の分布を有していた。804Ｇ上清液中で成長させた細胞では、α₆及びβ₄サブフニットは粗い顆粒状か又は「スイスチーズ」タイプのパターンに再構成された。同じパターンが上皮マトリックス要素に対する抗体（Ｐ１Ｅ１、ＧＢ３、ＢＭ165）のすべて及び180 ｋＤのヘミデスモソームタンパク質に対する抗体（Ｊ１７）による免疫標識化で見られた。実施例３培養培地の電気泳動分析培養培地から得られたポリペプチド試料並びに804Ｇ及びＨaＣaＴ細胞から得られた可溶化マトリックスを、ノベックス（ＮＯＶＥＸ）（Encinitas、カリフォルニア州）電気泳動システムを用いて６％の分離ゲル（Laemmli 1974年）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。分離された培養培地のポリペプチド、又は精製されたラミニン及びフィブロネクチン（対照として、Te lios Pharmaceuticals／ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド）は電気泳動的にイモビロン（Immobilon)−Ｐ膜（Millipore Corporation、マサチューセッツ州ベッドフォード）に移しそしてＪ１８及び５Ｃ５抗体でイムノブロットするために処理した。対照として、ポリペプチドを、ラットラミニン又はラットフィブロネクチンに対するウサギ抗血清（Telios Pharmaceuticals、カリフォルニア州サンジエゴ）でイムノブロットした。ベクタスタインＡＢＣイムノパーオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼを使用して結合を検出した。（Vect or Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）。ポリクローナル抗体、Ｊ18はイムノブロット実験で上記のポリペプチドと反応した。イムノブロットによって更に、抗体が、２つの通常の細胞外マトリックス分子、すなわち、ラミニン又はフィブロネクチンと交差反応しないことが明らかにされた。しかし乍ら、804Ｇ細胞マトリックスと培地はフィブロネクチンを含有しているが、痕跡量のラミニン関連材料しか含有していない。モノクローナル抗体５Ｃ５も804Ｇマトリックス中の主要なポリペプチドと反応する。ＨaＣaＴマトリックスのイムノブロットによって、約130ｋＤの分子量を有する更なるポリペプチドを有する804Ｇマトリックスと同様に、同じ３つの1 60〜138ｋＤのポリペプチドが明らかになる。５Ｃ５抗体はラットタンパク質に特異的であるので、通常の条件下で成長させたＨaＣaＴ細胞とは反応しない。 804Ｇ細胞の培養培地においては、分子量160〜138のポリペプチドは、タンパク質染色では明白に識別できないが、その代わりに、代謝的に³⁵Ｓ−標識したタンパク質のフルオログラフィーによって同定することができる。実施例４ 804Ｇ細胞の代謝標識 ³⁵Ｓ−メチオニンによる代謝標識は、細胞を先ず枯渇培地（１％の透析ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン及び抗生物質を補足したメチオニン不含ＭＥＭ−培地、ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で30分間インキュベートし、そして次にこの培地を１％の透析ＦＣＳと250μＣiの³⁵Ｓ−メチオニン（Trans−Label ICN Biomedicals Inc.、カリフォルニア州コスタメサ）を補足したメチオニン不含の新たなＭＥＭ３mlで10時間置き換えた。放射線標識したポリペプチドを有するゲルは、ボナー（Bonner）及びラスキー（Laskey）（1974年）に従ってフルオログラフィー用に処理し、そしてハイパーフイルム（Hyperfilm）（Amersham Corporation、イリノイ州アーリントンハイツ）を感光させた。 ³⁵Ｓ−メチオニンを導入すると、細胞によってポリペプチドが合成され、そして培養培地からマトリックスに単に沈着しただけでないことが示された。更に、これらのポリペプチドはＪ18及び５Ｃ５抗体によるイムノブロットによって視覚化することができる。ＨaＣaＴ細胞を804Ｇ細胞の上清液中で成長させこれらのマトリックスを５Ｃ５でイムノブロット用に処理すると、２つの反応性ポリペプチドを同定することができ、これは、804Ｇ上清液から得られる可溶性免疫反応性材料がＨaＣaＴ細胞のマトリックスに結合し得ることを示している。ＨaＣaＴ細胞に与える可溶性804Ｇ細胞成分の効果もこの超微構造レベルで明白であった。ＨaＣaＴ細胞を通常の培養培地中の細胞培養プラスチック上で成長させると、これら細胞は未成熟ヘミデスモソームに類似する細胞外マトリックス接触部によって成長基層に付着する。或いは、細胞を804Ｇ細胞上清液中で成長させたとき、これら細胞は、形態学的規準で成熟ヘミデスモソームである接着コンプレックスを形成した。実施例５Ｊ18抗体による804Ｇ上清液の免疫枯渇(immunodepletion) 細胞を、Ｊ18抗体で免疫枯渇させた804Ｇ上清液中で成長させたとき、ヘミデスモソームは腹側原形質膜でまれにしか見出すことができない。804Ｇ上清液の免疫枯渇は、上清液１mlを50μlのプロテインＡセファロースビーズ（２μg抗血清／10μlの充填ビーズ、Sigma Chemical Corporation）にカップリングさせたＪ18抗体で連続的に３回処理して実施した。対照として、804Ｇ上清液もプロテインＡセファロースにカップリングさせた通常のウサギ血清で枯渇させた。細胞を修正カルノウスキー（Karnowsky）固定液（１％のパラホルムアルデヒド、0.1Ｍのカコジル酸ナトリウム、1.75％のグルタールアルデヒド、2.5mＭのＣaＣl）中で固定し、そして通常の方法で電子顕微鏡用に処理した。薄い切片を細胞層に直角に切り出し、そして日立Ｈu−12Ａ顕微鏡で75kＶで試験した。この効果の特異性は、通常のウサギ血清による免疫枯渇が804Ｇ上清液のヘミデスモソーム誘発能力には影響を与えないという事実によって証明される。分泌されたタンパク質の精製を容易にするために、804Ｇ細胞系は以下の実施例に記載したように、低血清条件下で成長するように順応させた。実施例６低血清条件下での804Ｇ細胞の成長 804Ｇ細胞は、１％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、100μg／mlのペニシリン及び50μg／mlのストレプトマイシンを補足した１：１のＤＭＥＭ：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で成長するように徐々に順応させた。得られた804Ｇ細胞のサブ集団は804ＧＭＨと命名した。製造業者によれば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭは、分子量がそれぞれ80及び６ｋＤaの少量のトランスフェリン及びインスリンを含有しているが他のタンパク質は含有していない。培養培地中に血清タンパク質が実質的に存在しないことによって、以下に記載するようにヘミデスモソーム誘発可溶性因子の精製が簡単になる。実施例７ 804ＧＭＨ培養培地から可溶性因子の精製血清不含培養上清液を採取するために、低血清条件下で成長させた集密な804 ＧＭＨ細胞をトリプシン処理（0.02％）して取り出し、10％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで１度洗浄しそしてＦＣＳを添加していない１：６の比のＤＭＥＭ：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で成長させた。804ＧＭＨ細胞が24時間で集密になった時、培養上清液を採取した。上清液を5,000×ｇで10分間遠心しそして使用するまで−20 ℃で貯蔵した。分泌されたタンパク質は、40％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させて精製した。培養上清液（１リットル）は10,000×ｇで30分間遠心して微粒子物質を除去しそして氷上の別の容器に移した。撹拌し乍ら、硫酸アンモニウムを徐々に加えて30％飽和とした。次に、上清液を４℃で一夜放置して完全に沈殿させた。この試料を10,000×ｇで30分間遠心しそして硫酸アンモニウムを加えて最終濃度を40％飽和とした。沈殿させそして遠心した後、上清液を廃棄しそしてペレットを１mlのＰＢＳに再懸濁した。このタンパク質をＰＢＳで透析し、280nmでの吸光度によってタンパク質濃度を推定し、そして一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。240、150及び140kＤaのバンドが観察された。かくして本発明者らは、804Ｇ細胞によって産生される可溶性因子が哺乳類動物細胞で付着及びヘミデスモソーム構成を誘発できそして培養培地から得られるこれらのタンパク質の精製が低血清条件下で細胞を成長させることによってきわめて容易になることを証明した。実施例８可溶性因子で被覆した歯科インプラントに対する上皮細胞の接着使用した３つのタイプのチタンインプラントは次のとおりであった。プラズマスプレーしたＩＭＺチタン(Interpore International、カリフォルニア州アービン)、ＨＡ−被覆チタンインプラント（Calcitek、カリフォルニア州カールスバッド）及びスクリューベント（screw−vent）チタンインプラント(Dentsply,Inc .、カリフォルニア州エンシノ)。インターポア（Interpore）のインプラントは、チタンスプレーで被覆されていない光沢のあるチタンカラーを有しておりそしてカルシテック（Calcitek）のインプラントは光沢のあるチタン治療用スクリューを有していた。これらのインプラントは洗剤溶液で完全に洗浄し、水道水、続いて脱イオン水で十分にすすぎ、そして乾燥させた。インプラントを95％のエタノールに浸漬して滅菌し、カルシウム及びマグネシウム不含の無菌ＰＢＳ（Bio−Whittaker）中ですすぎそして無菌ペトリ皿中で風乾した。各タイプのインプラントの１つの試料は処理しないでおき、１つは804Ｇ培養培地（ＤＭＥＭＣ＝10％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、100単位／mlのペニシリン及び100μg／mlのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）で被覆し、そして１つは細胞成長４日後に集めた804Ｇコンディションドメディウムで被覆した。被覆はインプラントを、ＤＭＥＭＣ若しくは100μlの804Ｇコンディションドメディウムを含有するか又は何も含有しない（非処理対照）無菌の0.65ml 管に入れて実施した。インプラントは上記溶液中にさかさまにして入れてインターポア及びカルシテックのインプラントの露出した光沢のあるチタンを確実に被覆した。次に、これらの試料を４℃で一夜置いた(約16時間)。これらのインプラントを被覆溶液から取り出し、そして６ウエルの組織培養プレートに１ウエル当たり１個のインプラントを入れた。各インプラントの非特異的結合部位は、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５mlを用いて室温で５時間ブロックした。ブロック溶液を除去し、そしてインプラントをＰＢＳで３回洗浄した。上皮細胞系のＦＧmet2ヒトすい臓癌細胞を使用して被覆インプラントに対する急速な細胞接着について試験した。細胞をトリプシン処理しそして1500rpmで５分間遠心した。細胞ペレットをＤＭＥＭ中１％のＢＳＡに再懸濁して２回洗浄しそして遠心した。細胞ペレットをＤＭＥＭ中１％のＢＳＡに再懸濁して2.2×10⁶ 個の細胞／mlの最終濃度にした。６ウエルのプレートを傾けて中身をあけてインプラントをウエルの一端に置きそしてインプラントの上を細胞懸濁物１mlで覆った。細胞はインプラントと共に37℃で30分間インキュベートし、吸引して除去し、そしてインプラントをＰＢＳで３回洗浄した。細胞はＰＢＳ中３％のパラホルムアルデヒド及び２％のスクロースを用いて固定し、そして20％のメタノール中 0.5％のクリスタルバイオレットで15分間染色した。過剰の染料を水道水で洗浄しそしてインプラントは倒立相顕微鏡(inverted phase microscope)を使用して検査した。顕著なＦＧmet2細胞付着及び伸展は、804Ｇコンディションドメディウムで被覆したインプラントだけで観察された。この結果は、804Ｇ細胞によって分泌されるヘミデスモソーム形成誘発因子が成形された経上皮器具上で上皮細胞付着及び伸展を誘発できることを示している。 804Ｇマトリックスが吸収性及び非吸収性の外科用メッシュを被覆する能力及びその後の迅速な接着及び細胞成長を助けるマトリックスの能力を以下の２つの実施例に記載したようにして評価した。実施例９外科用メッシュに対する上皮細胞の迅速な接着 804Ｇコンディションドメディウムを可溶性マトリックスタンパク質源として使用した。ポリプロピレン(PROLENE（登録商標）)、ポリエステル（MERSILENE（登録商標））及びポリグラクチン（Vicryl(登録商標)、90％のグリコリド、ポリグリコール酸誘導体と10％のグラクチド、ポリガラクトース誘導体を含む生物分解性コポリマー）のメッシュ（これらは全てEthicon,Inc.から）は各々、804Ｇコンディションドメディウム１mlか又はＤＭＥＭ完全培地１mlのどちらかを含有する24ウエル組織培養プレートのウエルに入れ、そして４℃で一夜インキュベートした。これらのメッシュを、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ）で２回洗浄しそして非特異的結合部位をＰＢＳ＋ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ＤＭＥＭ＋１％ＢＳＡ＋25mＭＨＥＰＥＳ中４×10⁵個のＦＧmet 2細胞を上記メッシュの頂部にピペットで移しそして37℃で35分間インキュベートした。次に、これらのメッシュを６ウエル組織培養プレートに移しそして５ml のＰＢＳ中で各々を５分間３回洗浄した。メッシュは、ＰＢＳ中３％のパラホルムアルデヒド＋２％のスクロース１ml中室温で５分間固定し、そして接着細胞は 20％メタノール中0.5％のクリスタルバイオレットを用いて室温で15分間染色した。メッシュを水で十分に洗浄して非特異的染色を除いた。これらの結果は、804Ｇで処理したメルシレン（Mersilene）（登録商標）とビクリル（Vicryl）（登録商標）メッシュが共に対照で処理したメッシュより可視的に暗く染色されることを示した。かくして、ポリエステル及びポリグラクチン 910メッシュは804Ｇマトリックス接着を助け、そして、更に重要なことには、これらの材料に対する上皮細胞の迅速な接着を促進した。対照的に、804Ｇで処理したプロレン（Prolene）（登録商標）メッシュでは検出可能な細胞染色は観察されず、これはポリプロピレンのタンパク質結合能力が低いという観察と一致する。実施例１０ 804Ｇマトリックスで予め被覆した外科用メッシュ上での上皮細胞の成長メルシレン（登録商標）とビクリル（登録商標）メッシュを、脱気した804Ｇコンディションドメディウム又は25mＭのＨＥＰＥＳを含有する脱気したＤＭＥＭ完全培地１ml中４℃で一夜予め被覆した。両培地は23mmＨg真空に吸引するベーンポンプを用いて室温で30分間脱気した。これらのメッシュを無菌ＰＢＳで２回洗浄し、そして８×10⁴個のＦＧmet2上皮細胞を含有するＲＰＭＩ完全培地１m lをメッシュの頂部にピペットで移しそして37℃でインキュベートした。成長１日後に、ＦＧmet2細胞は804Ｇ処理メッシュ上ではっきり付着しそして伸展した。メルシレン（登録商標）メッシュの目の粗い織り方は、ビクリル（登録商標）メッシュの目の詰まった織り方より細胞の良好に視覚化した。２日後、メッシュを新しいプレートに移し、新鮮な培地を加えそしてインキュベーションを継続した。５日後、細胞はメルシレン（登録商標）メッシュ繊維に沿って広範に成長し、そして繊維表面の50％より広く覆っているように見えた。対照的に、対照処理したメッシュ上で成長する細胞はボール形の構造に成長しそして繊維表面に沿った顕著な成長は示さなかった。これらの結果は、可溶性804Ｇマトリックスが医学的に重要な表面に吸着しそしてこれらの材料上での細胞の付着及び増殖を促進する独特の能力を証明している。実施例１１ 804Ｇ可溶性因子による角膜外移植片の保存全層角膜移植によって入手したヒトドナー角膜縁を、ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−）又は接着コンプレックス関連マトリックス成分を含み804Ｇ細胞によって大量に分泌される可溶性因子を補足した同じ培地（ＤＭＥＭ＋）中で維持した。72時間後、組織は、種々の接着コンプレックス抗体を使用して電子及び免疫蛍光顕微鏡用に処理した。ＤＭＥＭ−で維持した角膜縁では上皮層が下部支質から分離するようになった。この分離は接着コンプレックス及びそれらのタンパク質成分の損失と関係があった。対照的に、ＤＭＥＭ＋中72時間後では、上皮層は細胞支質間付着領域の多数の接着コンプレックスに関して健常であるように思われる。この外傷モデルでは、形態学的ヘミデスモソームは、ＤＭＥＭ−中で維持した組織材料の「創傷」に再増殖している上皮細胞では観察されなかった。しかし乍らＤＭＥＭ＋培地中では、上皮細胞と創傷ベッドとの相互作用領域の露出支質に沿って形態学的ヘミデスモソームが見られた。本発明は詳細な説明で記載した上記の実施態様だけに限定されるものでないことに注意すべきである。本発明の精神を保持する任意の実施態様は本発明の範囲内であると考えるべきである。本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。本発明は詳細な説明で記載した上記の実施態様だけに限定されるものでないことに注意すべきである。本発明の精神を保持する任意の実施態様は本発明の範囲内であると考えるべきである。本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１０月１１日【補正内容】（第２９頁の翻訳文）１４．前記ポリマーが、ポリエステル、ポリグリコール酸及びポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーからなる群から選択される請求項１３に記載の物品。１５．それ自体ではヘミデスモソームを形成できない上皮細胞を、ヘミデスモソーム形成を促進するのに有効な量の、804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌されるヘミデスモソーム誘発可溶性因子である可溶性因子の存在下、水溶液中で培養する段階を含むことを特徴とするインビトロでの上皮細胞の成長又は上皮細胞によるヘミデスモソーム形成を誘発する方法。１６．前記ヘミデスモソーム誘発因子がＮＢＴ−IIラット膀胱癌細胞から得られている請求項１５に記載の方法。１７．前記ヘミデスモソーム誘発因子が804Ｇ細胞から得られている請求項１５に記載の方法。１８．前記804Ｇ細胞が低血清培地中で成長するように順応されている請求項１７に記載の方法。１９．前記上皮細胞がヒト細胞である請求項１５に記載の方法。２０．前記可溶性因子を実質的に細胞不含の培地中で前記細胞に提供する請求項１５に記載の方法。２１．前記可溶性因子を低血清培地中で前記細胞に提供する請求項１５に記載の方法。２２．約５％以下の血清を含む培地中で成長するように順応され、可溶性ヘミデスモソーム形成誘発因子を分泌する804Ｇ細胞系。２３．細胞系804Ｇによって産生され、実質的に単離されるか又は精製された形態の活性ヘミデスモソーム誘発可溶性因子。２４．医薬的に許容可能な担体中の請求項２３に記載の可溶性因子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物におけるインビボ使用に適合した生物適合成形品、及び、前記成形品上に付着したヘミデスモソーム形成促進可溶性因子を含むことを特徴とする物品。２．前記可溶性因子が上皮起源の腫瘍細胞系によって分泌されるタイプである請求項１に記載の物品。３．前記腫瘍細胞系がラット癌腫細胞系804Ｇである請求項２に記載の物品。４．前記腫瘍細胞系がラット膀胱癌細胞系ＮＢＴ−IIである請求項２に記載の物品。５．前記成形品が経上皮器具である請求項１に記載の物品。６．前記経上皮器具が留置カテーテル、針、金属ピン、金属棒、人工肛門形成管、歯科用支台片及び外科用メッシュからなる群から選択される請求項５に記載の物品。７．更に前記ヘミデスモソーム形成誘発可溶性因子上に付着した上皮細胞を含む請求項１に記載の物品。８．前記器具がインビボで使用される請求項５に記載の物品。９．前記器具が生物適合金属で製造されるか又は被覆される請求項５に記載の物品。１０．前記金属がステンレス鋼又はチタンである請求項９に記載の物品。１１．前記器具がセラミック材料で製造されるか又は被覆される請求項５に記載の物品。１２．前記材料がヒドロキシアパタイトである請求項１１に記載の物品。１３．前記器具がポリマーで製造されるか又は被覆される請求項５に記載の物品。１４．前記ポリマーが、ポリエステル、ポリグリコール酸及びポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーからなる群から選択される請求項１３に記載の物品。１５．それ自体ではヘミデスモソームを形成できない上皮細胞を、ヘミデスモソーム形成を促進するのに有効な量の、804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌されるヘミデスモソーム誘発可溶性因子である可溶性因子の存在下、水溶液中で培養する段階を含むことを特徴とするインピトロでの上皮細胞の成長又は上皮細胞によるヘミデスモソーム形成を誘発する方法。１６．前記ヘミデスモソーム誘発因子がＮＢＴ−IIラット膀胱癌細胞から得られている請求項１５に記載の方法。１７．前記ヘミデスモソーム誘発因子が804Ｇ細胞から得られている請求項１５に記載の方法。１８．前記804Ｇ細胞が低血清培地中で成長するように順応されている請求項１７に記載の方法。１９．前記上皮細胞がヒト細胞である請求項１５に記載の方法。２０．前記可溶性因子を実質的に細胞不含の培地中で前記細胞に提供する請求項１５に記載の方法。２１．前記可溶性因子を低血清培地中で前記細胞に提供する請求項１５に記載の方法。２２．低血清培地中で成長するように順応され、可溶性ヘミデスモソーム形成誘発因子を分泌する804Ｇ細胞系。２３．細胞系804Ｇによって産生され、実質的に単離されるか又は精製された形態の活性ヘミデスモソーム誘発可溶性因子。２４．医薬的に許容可能な担体中の請求項２３に記載の可溶性因子。２５．上皮細胞と共にインキュベートする前に、ヘミデスモソームを誘発する 804Ｇ可溶性因子であるヘミデスモソーム形成誘発組成物で経上皮器具を被覆することを含むことを特徴とする、経上皮器具に対する上皮細胞の付着を誘発する方法。２６．前記組成物が前記804Ｇ細胞によって分泌される可溶性因子である請求項２５に記載の方法。２７．前記器具が、留置カテーテル、針、金属ピン、金属棒、人工肛門形成管、歯科用支台片及び外科用メッシュからなる群から選択される請求項２５に記載の方法。２８．前記器具がポリマーで製造されるか又は被覆される請求項２５に記載の方法。２９．前記ポリマーが、ポリエステル、ポリグリコール酸及びポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーからなる群から選択される請求項２８に記載の方法。３０．804Ｇラット膀胱癌細胞によって分泌されるヘミデスモソーム誘発可溶性因子であるヘミデスモソーム誘発タンパク質因子を含有する培地中で角膜外移植片を培養することを含むことを特徴とする前記外移植片をエクスビボで保存する方法。３１．前記培地が804Ｇコンディションドメディウムである請求項３０に記載の方法。