WO2005028638A1

WO2005028638A1 - 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法

Info

Publication number: WO2005028638A1
Application number: PCT/JP2004/004161
Authority: WO
Inventors: Keiichi Fukuda; Yuji Itabashi; Kazuo Tsubota
Original assignee: Keio University
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-03-31
Also published as: US20060281173A1; EP1669440B1; CN1852972A; CA2539613A1; KR20060091301A; EP1669440A1; DE602004024429D1; JP4193184B2; JPWO2005028638A1; JP2009011322A; KR101001117B1; ATE450601T1; EP1669440A4; JP4284563B2

Abstract

表面がフィブリンでコーティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィブリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、細胞シートの製造方法。表面がフィブリンでコーティングされている細胞シート作製用支持体。細胞シートを作製するための支持体の表面をフィブリンでコーティングするための組成物であって、フィブリノーゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物。市販され、安全性も確認されている身近な材料でコーティングした支持体を用い、簡便な操作で細胞シートを製造できる。

Description

明細書細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シ一卜作製用支持体及び細胞シートの製造方法技術分野

本発明は、細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法に関する。背景技術

著しい機能不全に陥った心臓に対し、ドナー不足を抱える心臓移植に変わる治療法として、様々な幹細胞を利用した細胞移植が試みられてきた。近年になりこうした細胞移植から体外で心筋組織を 3次元的に構築した上で移植を行う組織移植の手法が盛んに開発されるようになった。例えば、電子線を用いてポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）（「PIAAm」と略記される）を市販のポリスチレン培養皿表面に塗布した温度感応性培養皿を用いることによって各種の細胞シートを作製することに成功し、中でも心筋細胞に関しては、こうして作製した心筋シー卜を積層化することにより移植片として利用可能な心筋組織塊を開発したことがすでに報告されている（特開 2003 - 38170号公報、国際公開 01/068799号パンフレツト、 Shimizu et. A1. ： Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation techni ue and temperature-responsive cell culture surface ： Circ Res. 2002; 90:e40_e48)。こうして作製された心筋組織塊は in vitroおよび in vivoで正常の心筋組織と同様の電気活動を行うことが確認されている。各種の組織に対する初代培養、特に心筋細胞の培養に関しては、その方法に於いて各施設間により多少の相違が見られる。しかるに上記の温度感応性培養皿を使用した細胞シートの作製法は、本特殊培養皿での培養に最適となる様に厳格な方法で初代培養を行った際には比較的安定して細胞シートを作製することが可能であるが、各施設で慣例的に行われてきた方法をそのまま適用した際には細胞のシート化は困難であった。

本発明は、市販され、安全性も確認されている身近な材料でコーティングした支持体を用い、簡便な操作で細胞シートを製造できる方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、細胞シートの製造に適した支持体を提供することも目的とする。発明の開示

本発明者らは、ほとんどの細胞により分解されるフイブリン糊をあらかじめ薄くコーティングした培養皿で細胞を数日間培養すると、細胞と培養皿表面との間のフイブリンが消失して細胞がシ一ト状に結合したまま宙づり状態となることを発見した。この状態の細胞シートをスクレイパーで剥離して回収することにより、安定した確率で細胞シートを作製する手法を確立した。本発明はこれらの知見により完成された。

本発明の要旨は以下の通りである。

( 1 ) 細胞シートを作製するための支持体の表面をフィプリンでコ一ティングするための組成物であって、フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物。

( 2 ) 表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シ一ト作製用支持体。 ( 3 ) 表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、細胞シー.卜の製造方法。

( 4 ) 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、（3 ) 記載の方法。

( 5 ) 細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、（3 ) 又は（4 ) に記載の方法。

本発明により、各施設がこれまで行ってきた細胞の初代培養の方法を変更することなく、同様の初代培養を行うことで、様々な細胞によるシートを作製することが可能となり、その成功率も安定している。

また、本発明により、 PIAAmをコーティングした高価な特殊培養皿を用いずとも、巿販のフイブリン糊を用いることで、即座にかつ大量に細胞シートを作製することができる。

本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2003 - 328340 号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、ラット心筋細胞のシート化の様子を示す。

図 2は、 C2C 12細胞のシート化の様子を示す。

図 3は、成熟骨格筋細胞のシート化の様子を示す.。

図 4は、心筋細胞シートの心電図を示す。

図 5は、皮膚に移植したラット心筋細胞シートの状態を示す。

図 6は、 in vi troにおけるシ一ト化後 2 日目のラット心筋シートのァクチ二ンおよびコネキシン 43の免疫染色の結果を示す。図 7は、ヌードラット皮下へ移植後 7日目のラット心筋細胞シートの HE染色の結果を示す。

図 8は、ヌードラット皮下へ移植後 7 日目のラット心筋細胞シートのァクチニンおよびコネキシン 43の免疫染色の結果を示す。

図 9は、フイブリンポリマーでコートされた皿を用いた心筋細胞シートの機構及び操作の代表的スキームである。操作は、 A→B→C→D→E→Fの順番で行つた。

初代培養新生児ラット心筋細胞をフイブリンポリマーでコートされた皿の上に広げた（A, B, G)。 4 日目に、フイブリンポリマーは、心筋細胞から分泌された種々のプロテアーゼにより分解した（C)。心筋細胞シート（myocardi al ce l l shee t s, 以下、「MCS」と記すこともある）をセルスクレイパーで引き裂かないように、細胞をゆっくりと端から皿の中央に向かって取り除いたところ（D， E)、縮んだ MCSが得られた（H)。縮んだシートに培養液を数滴垂らすと、シートが広がった（E, 1)。平らになった MCS の端をメスで切り取って正方形にした。いくつかの実験において、 2枚の MCSを 2 mm幅のマージンで重ね合わせ、ラミニンでコートされた培養皿の上で共培養した（F, J)。

図 10は、 MCSの組織学的解析結果を示す。

(A) MCSの作製と組織学的解析のプロトコール。（B- E， H, I) MCSの H&E染色。 (F, G, J, K) MCSの免疫蛍光染色。赤： F-ァクチン、緑：フイブリン、青： T0T0- 3 により染色された細胞核。プロトコールとスケールバーを図中に挿入して示した。

図 11は、 MCSの性質を示す。

(A) PX- SOの日数のサンプルにおける、 MCS作製の成功率。（B) PX-SOサンプルにおける MCSの直径。（C) PX- S3の日数のサンプルを用いて作製した MCSが自律拍動を示す百分率。（D) P4-SXの日数のサンプルにおける自律拍動シートの百分率。（E) P4-SXの日数のサンプルにおける人エペーシングを獲得した MCSの百分率。（F) P4- SXの日数のサンプルにおける拍動周期。

図 12は、 2枚の重ね合わせた MCSにおける電気的活動を解析する目的で 1対の接触させた双極電極を用いて記録した心電図（ECG)および op t i cal mapp ingにより記録した活動電位の伝播の様子である。

(A) 2枚の重ね合わせた MCS の模式図及び接触させた双極電極の位置。（B) 2 枚の重ね合わせた MCSの顕微鏡観察像。（C)完全な同期化を示す各 MCSから得られた細胞外電位。（D) op t i cal mapp ingにより観察した活動電位の伝播の様子を等時線を用いて示した。各等時線の間隔は 35ミリ秒である。シート Aの左下部から発生した活動電位は、電気的な興奮を示さない接合部の下半分を迂回し、接合部の上方の限局した領域を通って対側のシート Bへ伝播した。（E)興奮波の先頭をトレースして活動電位が進行してゆく様子を示した。（（D)の矢じりを伴つた黒の曲線）。

図 13は、部分的に重ねた 2枚の MCSの共培養を開始後 1日目における、重ね合わせた MCSの活動電位の伝播の様子を op t i cal mapp ingを用いて観察した結果を示す。

1日目における代表的なデ一夕。（A)位相差顕微鏡による観察像。（B-D)それぞれ、シート Aの左端でのベーシング後 14、 108及び 164ミリ秒で得られた活動電位の観察像。シート Bの限局的な捕捉が観察できることに注意されたい（矢印を見よ）。（E) MCSの断面模式図及びべ一シング部位。（F)活動電位マップ。ここでは、各等時線の間隔は 7 ミリ秒である。接合部の左端で等時線が混みあつており、このあたりから伝導遅延が始まっている事を示唆している。活動電位の伝播は接合部の末端で遮断された。（G)興奮波の先頭に沿ってィンパルスが次々と伝播していく様子（（F)の矢じりを伴った赤の曲線）。（H)興奮波の先頭に沿った任意のボイントにおける活動電位のトレースを重ね合わせた。記号は、活動電位が記録された筋細胞の位置に対応する。

図 14は、 3日目における、重ね合わせた MCSの活動電位の伝播及び電気的結合の様子を opt ical mapp ingを用いて観察した結果を示す。

3日目における代表的なデ一夕。（A)位相差顕微鏡による観察像。（B- D)シ一ト Aの左端でのぺ一シング後 14、 84及び 150ミリ秒で得られた opt ical mapp ing 像。（E) MCSの断面模式図及びべ一シング部位。（F)計算された活動電位マップ（大きさは図 11Fと同じ）は、活動電位の伝播が 2枚の MCSの間で遅延がなく非常にスムーズに伝わっている事を示唆した。（G)興奮波の先頭が次々と伝播していく様子は、興奮波の進行に遅延が無く 2枚の MCS の間でタイトな電気伝達が形成されていることを示唆した。（H) 興奮波の先頭に沿った任意のポイントにおける活動電位のトレースを重ね合わせた。

図 15は、 in vi troでの 2枚の心筋細胞シート間で良好な電気的結合が形成される組織学的根拠を示す。

重ね合わせた MCS ( 3日目）に対して免疫組織染色を行った検体をレーザ一共焦点顕微鏡で観察した結果。 MCSは、抗ァクチニン（緑）、抗コネキシン 43 (赤）抗体及び T0T03 による核染色で三重染色を行った。（A)上方より観察したもの。 (B)側面を観察したもの。（C)高倍率で上方より観察したもの。心筋細胞が密に配置し、コネキシン 43は細胞の接合部に明らかに存在していることに注意されたい。

図 16は、 in vivoにおける 3層心筋細胞シートの移植の様子を示す。

3層の MCS をヌードラットの皮下組織に移植し、サンプルを 1 4日目に観察した。（A)移植領域（黒の点線）は周期的な自律拍動を示した（200 bpm)。（B) 3層 MCSグラフトの断面の H&E染色。 Sk:骨格筋、 Ct :結合組織、 Cs :移植された 3層の MCS。（C)同一検体のァザン染色。（D)高い倍率の断面図。移植された MCS 中に微小血管が見られることに注意されたい。 * :微小血管。（E)図 13 に記載した、移植された 3層の MCS の 3重染色。移植された心筋細胞はよく組織化された横紋構造を示し、この横紋構造は同一方向を向く配向性を示すことに注意されたい。

図 17は、フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察した結果を示す（倍率 100倍）。

図 18は、スクレイパーで剥がしたゥサギ角膜培養上皮細胞シートを示す。図 19は、フィプリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察した結果を示す（倍率 100倍）。

図、 20は、スクレイパーで剥がしたゥサギ口腔粘膜培養上皮細胞シートを示す。図 21は、ポジティブコントロールとしてゥサギ角膜と口腔粘膜上皮のケラチン 3 / 1 2を染色した結果を示す。

(A) 角膜上皮の核染像

(B) 角膜上皮の核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像

(0 口腔粘膜の核染像

(D) 口腔粘膜の核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像

図 22は、ゥサギ角膜上皮細胞および口腔粘膜上皮細胞を用いて作成した細胞シートの免疫染色を示す。

(A) 角膜上皮細胞シー卜の核染像

(B) 角膜上皮細胞シートの核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像

(0 口腔粘膜上皮細胞シ一卜の核染像

(D) 口腔粘膜上皮細胞シートの核およびケラチン 3 1 2の染色像

培養上皮シートにおいて、角膜上皮は重層化し、ケラチン 3/ 12で染色された。口腔粘膜上皮で重層化がみられ、ケラチン 3/12 の染色はわずかであるが染色された。フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮 · 口腔粘膜上皮は重層化し、ケラチンを発現していたことから、正常組織に近い特性を持つ培養上皮を作成できることが示された。発明を実施するための最良の形態

本発明は、細胞シートを作製するための支持体の表面をフイブリンでコーティングするための組成物であって、フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物を提供する。

フイブリンは、フイブリノーゲンの A a鎖と B 鎖がトロンビンにより特異的に加水分解され、フイブリノぺプチド A及び Bを放出して生じる難溶性画分である。フィプリンの凝集にあずかる反応基同士が水素結合してポリマーを形成し、一定の配列をとつてゲル化する。

フイブリノ一ゲンは、分子量約 3 4万の糖タンパク質であり、分子量がそれぞれ 6 . 5万 ± 0 . 1万、 5 . 5万、 4 . 7万の A 鎖、 B j8鎖及びァ鎖の 3 種類のサブユニットが対をなし、互いに S— S結合している。トロンビンにより Arg_Gly結合が加水分解され、 A 鎖及び B /3鎖からフイブリノペプチド A と Bを放出してフィプリンに転じる。

トロンビンは、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）の一種で、フイブリノーゲンに作用してフイブリンを生成する。本発明の組成物において、トロンビンはフィプリノーゲンをフイブリンに変換する触媒として有効な量で存在するとよい。

フイブリノーゲン及びトロンビンは、それらを用いて形成するフィプリンコ一ティング上で細胞を培養して作製する細胞シートがヒ卜に用いられることを考えると、ヒト由来のものが好ましいが、それに限定されるわけではなく、他の動物（例えば、既に市販されているサル、ブ夕、マウス、ラット、ヒヒ、ィヌ、ネコ、ヒッジ，ゥシなど）由来のものであってもよい。

フィプリノーゲン及びトロンビンは市販のものを使用することができる。例えば、バクス夕一社のティシールキットを使用することができる。ティシールキットは、ヒトフイブリノ一ゲン、トロンビン、塩化カルシウム 2水和物、ァプロチニンを含有する。

本発明の組成物は、さらに、塩化カルシウム（水和物であってもよい）、アブロチニン、生理食塩水などを含有するとよい。

本発明の組成物 1 6 m 1中の組成の一例を以下に記載する。

フイブリノ一ゲン 45〜180 mg

トロンビン 0. 2〜0. 8 U

塩化カルシウム 2水和物 0. 5〜1. 0 mg

ァプロチニン 1500〜6000 U

生理食塩水 16 ml

上記組成物において、フイブリノ一ゲンにトロンビンが作用するとフイブリンが生成してしまうので、フイブリノ一ゲンとトロンビンはそれぞれ別の容器に保存しておき、使用時に混合するとよい。フイブリノ一ゲンには、血清アルブミン、ァミノ酢酸、ァプロチニン、チロキサポール、塩化ナトリウム、クェン酸ナトリウムを添加してもよい。トロンビンには、血清アルブミン、ァミノ酢酸、塩化ナトリウムを添加してもよい。カルシウムイオンはフイブリノーゲンの加水分解を促進するので、塩化カルシウム 2水和物もフィプリノーゲンとは別の容器に保存しておき、使用時に混合するとよい。例えば、塩化カルシゥム 2水和物は、使用時にトロンビンを溶解するための液（以下、「トロンビン用溶解液」という。）に溶解させ、容器に保存しておくとよい。また、ァプロチニンはフイブリノ一ゲンの重合を阻害するので、フイブリノ一ゲンに添加してもよいし、使用時にフイブリノ一ゲンを溶解するための液（以下、「フイブリノ一ゲン用溶解液」という。）に溶解させ、容器に保存しておいてもよい。上記組成物の使用方法の一例を以下に説明する。まず、ァプロチニンを含有するフイブリノ一ゲン用溶解液にフイブリノ一ゲンを溶解し、 A液とする。塩化カルシゥム 2水和物を含有するトロンビン用溶解液にトロンビンを溶解し、 B液とする。 A液、 B液及び生理食塩水を混合し、混合液を細胞シート作製用支持体の表面に塗布する。

本発明の組成物を用いて、細胞シ一卜作製用支持体の表面をフイブリンでコ一ティングすることができる。

本発明は、表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シ一ト作製用支持体を提供する。

支持体は、細胞の培養が可能である限り、いかなるものであってもよいが、培養皿、シャーレ、 6〜9 6穴ゥエル培養皿、セルデスク LF (SUMILON)などを例示することができる。支持体の材質としては、ガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、セラミックス類などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。

本発明の細胞シート作製用支持体を製造するには、本発明の組成物を支持体に塗布してフィプリンの被膜を形成させればよい。その一例の詳細を以下に説明する。

まず、フイブリノ一ゲン、トロンビン、塩化カルシウム 2水和物、ァプロチニン、生理食塩水を混合し、混合液を支持体の表面に塗布する。適当な時間（通常、 1〜3時間）室温で放置すると、フイブリンが形成される。これを細胞シート作製用支持体として使用するまで、無菌条件下、 4でで保存しておくとよい。本発明は、表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシ一ト状に剥離することを含む、細胞シートの製造方法を提供する。培養皿上で隙間無く飽和状態まで増殖した細胞を剥がすことにより、膜状のシートを得ることが出来る。本明細書において、「飽和状態」とは、細胞が隙間無く並んだ状態をいい、これは顕微鏡で観察することができる。

培養する細胞としては、心筋細胞、骨格筋芽細胞、成熟骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨髄間質細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、皮膚細胞などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。これらの細胞を培養皿上で飽和状態にするに当たり、単一種類の細胞のみを敷き詰める事による方法と、複数種類の細胞を同時に敷き詰める方法がある。単一種類の細胞を飽和状態にする方法の中にも、増殖能を持ったモノクローナルな細胞を培養皿上に始めは少数蒔き飽和状態になるまで増殖させる方法と、増殖能の低い細胞でも始めからポリクローナルな細胞を多数蒔き培養皿底面に接着した直後に飽和状態にする方法がある。前者の例としては、マウス骨格筋芽細胞由来の細胞株

C2C12 細胞や CMG細胞の様な不死化した細胞株を少数蒔いて培養皿上で増殖させて飽和状態になるのを待つ方法がある。後者の例としては心筋、骨格筋、平滑筋、骨髄などからそれぞれ心筋細胞、骨格筋芽細胞、骨髄間質細胞などを初代培養の手法で採取し、セルソー夕一、パ一コール、接着分離法などを用いて細胞を選択収集し純度を上げた後に十分量を培養皿に蒔く方法がある。複数種類の細胞を飽和状態にする方法の例としては、心筋細胞や骨格筋細胞でシートを作製する際に線維芽細胞を混合すると仮に心筋細胞や骨格筋細胞の数が不十分であっても、心筋細胞同士、骨格筋細胞同士の隙間に増殖能の高い線維芽細胞が入り込み全体として培養皿の底面を全ていずれかの細胞で覆い飽和状態にすることが出来る。こうして十分量の採取が困難でかつ増殖能の低い細胞によつても、線維芽細胞などのつなぎとなる細胞を共培養することにより容易にシ —トを作製することが可能となる。この際つなぎに使う細胞としては、線維芽細胞のほか平滑筋細胞、内皮細胞などが使用可能と考えられ、つなぎに用いる細胞を変えることにより、用途に応じて作製される細胞シートの強度や伸縮性を変えることが可能である。

細胞は、ヒト由来のもの、ヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、マウス、ラット、ヒヒ、ィヌ、ネコ、ヒッジ，ゥシなど）由来のものであってもよい。細胞は、動物などの供給源から直接採取したものであっても、株化された培養細胞あるいは株化されていない培養細胞であってもよい。

細胞シートを製造するには、表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離すればよい。細胞の培養は、表面がフイブリンでコーティングされている支持体の表面上で行なう限り、いかなる方法及び条件下で行なってもよく、細胞が飽和状態となり、かつ支持体表面から細胞がシート状に剥離できる程度にフイブリンが分解されるまで継続すればよい。また、細胞をシート化するまでに長期間培養する必要がある際には、シート化を行う数日前まで培養液に適当量のァプロチニンを加えることにより、必要な日数までフィプリンを溶解させることなく培養を延長することが出来る。通常、細胞が飽和状態になるまで培地で培養し、その後ァプロチニンを含まない培養液で 3〜4日培養を継続する。この間に細胞底面のフィプリンは培養細胞により自然に分解されるが、その際プラスミンなどのフィプリンを分解する物質を培養液に添加することにより細胞底面のフィプリンが分解する速度を意図的に調節することも可能である。次いで、培養液を吸引し、スクレイパーなどの剥離手段を用いて支持体から膜状の細胞シートを剥離するとよい。細胞シートを剥離し終わった後に、しわの寄った細胞シートに新たな培養液を滴下することによって、細胞シートを伸展することができる。

剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化してもよい。細胞シートを積層化する手法の一例を以下に説明する。培養皿上で伸展させた 1枚の細胞シートから培養液をさらに吸引し、 3 7 °C 飽和水蒸気のインキュベーターに適当な時間（例えば、 1 5〜3 0分間）放置する。この間に 1枚目の細胞シートは培養皿上に接着する。次に剥離した直後の 2枚目の細胞シートを培養液と共にピペットで吸引し、培養皿上に固定された 1枚目の細胞シートの上に滴下する。伸展した 1枚目のシートの上に縮んだ状態で滴下された 2枚目のシートに、さらに新たな培養液をゆっくり滴下することによって 2枚目のシートを 1枚目のシートに重ねた状態で伸展することができる。同様の手技を繰り返して細胞シートを次々積層化することができる。本発明の手法を用いて各種の細胞をシー卜化し、またシートを積層化することにより、様々な臓器に対して in vi troでの組織塊構築が可能となり、こうして作製した組織塊を用いることによつて細胞レベルから組織レベルでの in vi troでの解析手法が確立できる。

本発明の方法により製造された細胞シートは、再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いることができる。

再生医療に用いる細胞シートとしては、心筋細胞シート、角膜上皮細胞シ一ト、口腔粘膜上皮細胞シート、皮膚細胞シート、などを挙げることができる。心筋細胞シートは、心筋梗塞や各種の心筋炎、心筋症などにより生じた心不全、不整脈などの治療や心筋移植用材料として用いることができる。角膜上皮細胞シート及び口腔粘膜上皮細胞シートは、角膜移植用材料として用いることができる。皮膚細胞シートは、熱傷、外傷などによる創傷の治療などに用いることができる。また線維芽細胞シートによる創傷の治癒を促進する治療法などの利用も可能と考えられる。

薬剤の生物学的活性試験としては、薬剤の薬理活性試験、薬剤の毒性試験、薬剤の結合活性試験などを挙げることができる。薬剤の結合活性としては、リガンドー受容体の結合活性、抗体一抗原の結合活性などを例示することができる。これまで行われていたような、細胞培養の培養液に各種の薬物を添加し細胞の変化を検討する方法に比べ、細胞シートの培養液に各種の薬物を添加して細胞シートへの影響を検討した場合は、細胞単体への影響のみならず細胞間の構造、構築などへの影響を検討する事が可能となり、薬剤の細胞レベルだけでなく臓器レベルへの影響を検討する事が可能となる。また、各種のヒト臓器由来の細胞シートを免疫不全贓物（ヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットなど）に移植し、この移植モデル動物に薬剤を投与した後に細胞シートの状態を検討する事により生体内でのヒト臓器に対する薬剤の影響を予測する事が可能となる。

本発明の方法により製造された細胞シートを用いた薬剤の生物学的活性試験により、所望の生物学的活性を有する医薬、農薬などの候補物質を選別することができる。以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本実施例で使用した材料の入手先と調製方法は以下の通りである。

培養皿 (FALCON 35 3001、直径 3. 5 cm)

ウィスターラット（日本クレア販売）

2 . 5 %トリプシン（GIBC0 15090-046)

コラゲナ一ゼ (SIGMA C - 5138)

DNase I (SIGMA DN-25)

FBS (JRH B iosc i ence)

ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシン B (GIBCO 15240-062) med ium 199 (ICN Biomed ical s 1023126)

DMEM (GIBCO 12100-046) マウス骨格筋芽細胞由来の C2C12 (ATCCより購入）

CMG 細胞（慶應義塾大学医学部呼吸循環器内科教室においてマウス骨髄細胞に 5 -ァザシチジンを添加し、心筋へ形質転換ずる能力を獲得し不死化した細胞株をクロ一ニングして得られた細胞株）

ヌードラット (日本クレア）

ゥサギ由来抗マウスコネキシン抗体（SIGMA C6219)

マウス由来抗ァクチニン抗体（SIGMA A7811)

TRITC結合ブ夕由来抗ゥサギ IgG抗体（DAKO R 0156)

Alexa 488結合ャギ由来マウス IgG抗体（Molecular Probes A- 11029) ゥサギ（日本白色種（J.W.，メス、約 3Kg , 白石実験動物飼育所））

SHEM

• DMEM/F12： Gibco BRL D-MEM/F12 (1袋 Z1L用) , 12400-016； 15.6g入り； HEPES含

- NaHC0₃： Waco (使用時の濃度 2.5g/l)

• Insulin： SIGMA human recombinant expressed in E. col i； 1 -0259； 50mg 入り（使用時の濃度 5 g/ml)

• Human -EGF： Gibco BRL Recombinant Human EGF； 13247-010 ; 100 g入り（使用時の濃度 lO g/ml)

• Cholera toxin： SIGMA c-3012； lmg入り（使用時の濃度 l ig/ml)

• 0.5% DMS0 ： SIGMA DIMETHYL SULF0XIPE； D-2650 ； 5ml x 5本入り

• 15% FCS ：三光純薬（Vitromex) ； VMS1500 ； Lot, F000210802 ； 500 ml DMEM (Gibco)

ゥシ胎児血清（ニチレイ）

3T3細胞 (American Type Culture Collection)

ァプロチニン（Wako) ゲンタマイシン、ペニシリン、アンホテリシン B (Wako)

D i spasel l (合同酒精)

DMEM/F12 (Gibco)

Tryps in (Gibco)

EDTA (Gibco)

Normal Donkey Serum (CHEMICON ； S30-100ML ； Lot, 23031387 ； 100 ml ) BSA (S igma)

DAP I (Sigma)

[実施例 1 ] ヒトフイブリンによる培養皿コーティング

ヒトフイブリノ一ゲン 90 mg，トロンビン 0. 4 ϋ, 塩化カルシウム 2 水和物 0. 59 mg, ァプロチニン 3000 U (以上、 Baxter社製ティシール 1 mlキットを使用），生理食塩水 16 mlを混合し、 3. 5 cm培養皿 1枚あたりに 0. 3 mlを培養皿底面に素早く塗布し、水平を保ったまま 1 時間室温で放置した。その後、フィプリンが形成され底面のティシール希釈液が固化した培養皿は無菌状態を保つたまま 4 で保存した。この状態で保存することにより 2ヶ月ほど使用が可能となる。ティシール 1 mlのキットより 3. 5 cm培養皿を 40〜50枚作製することができた。

[実施例 2 ] フイブリンコ一ティング培養皿での細胞培養

( 1 ) ラット心筋細胞

1日齢のウィスターラット新生仔より心室を摘出し、 0. 03%トリプシン、 0. 03% コラゲナーゼ、 20 g/mL DNase Iで酵素処理を行い，心室筋細胞を単離した。フイブリンコートした 3. 5 cm 培養皿 1枚当たりに、 10% FBSおよびぺニシリン（50 U/mL) /ストレプトマイシン（50 n g/mL) /アンホテリシン Β (25 ιι g/ml)含有 medium 199/DMEM 2 mlおよび本細胞を 2X10⁶個を注入し、 37° C , 5% (：0₂のィンキュベータ一で培養を行った。

(2) マウス骨格筋芽細胞由来の C2C12細胞

ATCCより購入したマウス骨格筋芽細胞由来の細胞株 C2C12を、 10%FBS含有 DMEM培地を用いて 5% C0₂ 37度のインキュベーターで培養し、 80% 飽和の状態で継代を行った。

(3) マウス C2C12細胞由来の成熟骨格筋様細胞

(2)の方法で継代した C2C12細胞を 75cmフラスコに IX 10⁷細胞蒔き、 5%ゥマ血清含有 DMEM20mlを添加した。細胞の状態を見ながら、 1〜2回/週培地交換を行つた。

(4) 骨髄間質細胞

マウスの大腿骨より骨髄を無菌状態で採取し、 3.5 cm フイブリンコートディッシュ 1枚当たり IX 10⁷細胞の有核細胞を蒔き、三光純薬株式会社製間葉系幹細胞用増殖培地（PT- 3001) 3mlを添加し 1回/週の頻度で培地交換を行った。

[実施例 3] 細胞のシート化

(1) ラット心筋細胞シートの作製

初代培養後 4 日目、細胞は培養皿底面に飽和状態となって拍動していた。培養液を吸引し、培養皿辺縁部より中心部へ向けてスクレイパーを用いて膜状に結合した心筋細胞を破れない様にゆつくり剥がした。すべて剥離し終わった後に、しわの寄った細胞シートにゆつくりと新たな培養液を滴下することによつて細胞シートを培養皿上に伸展することができた。ラット心筋細胞のシート化の様子を図 1に示す。

( 2 ) C2C 12細胞、成熟骨格筋細胞及び骨髄間質細胞による細胞シートの作製実施例 2の方法でフィプリンコート培養皿上に細胞が飽和状態になるまで培養を続けた。その後 3〜4日培養を継続した後、同様にスクレイパーを用いて膜状の細胞シートを剥離した。 C2C12細胞及び成熟骨格筋細胞のシート化の様子をそれぞれ図 2及び 3に示す。

[実施例 4 ] 細胞シートの多層化

1 枚目のシートを実施例 3に記載のように培養液を滴下することによって培養皿上に伸展した。その後培養液を極力吸引し 37度飽和水蒸気のィンキュベー夕一に 15分放置した。この間に 1枚目の細胞シートは培養皿上に弱い力で接着した。次に剥離した直後の 2枚目の細胞シートを培養液と共に 10 ml ピペットで吸引し、培養皿上に固定された 1 枚目の細胞シートの上に滴下した。伸展した 1枚目のシートの上に縮んだ状態で滴下された 2枚目のシートに、さらに新たな培養液をゆつくり滴下することによって 2枚目のシートを 1枚目のシートに重ねた状態で伸展することができた。同様の手技を繰り返して細胞シートを次々積層化した。

[実施例 5 ] 心筋細胞シートの機能解析

( 1 ) in vi troでの電気的活動

部分的に重ねた 2枚の心筋細胞シートに 1 mlの培養液を加え、毎日交換しながら培養を続けた。 2日後にそれぞれのシートが同じ心拍数で自律収縮している様子が顕微鏡下で観察され、それぞれの心筋シートの両端より測定した心電図より同じ調律で収縮していることが確認された（図 4 )。 (2) In vivoでの生着

2枚に重ねたラット心筋シートを 5週齢のヌードラットの皮下に移植し、 1週間後に皮膚を切開し心筋シート（図 5) を観察した。心筋シートの律動的な収縮が肉眼的に確認された。

(3) 免疫組織染色による筋腫宿蛋白、 Gap junctionの検討

in vitroにおいてラット心筋シート作製 2日後の組織に対して、心筋細胞の代表的な収縮蛋白であるァクチニンと Gap junctionの構成蛋白であるコネキシン 43の免疫染色を行った。結果を図 6に示す。また in vivoにおいて 2層のラット心筋シートを 3週齢のヌ一ドラットの皮下に移植し 7日後に摘出し、 HE染色及びァクチニンとコネキシン 43の免疫染色を行った。結果をそれぞれ図 7及び 8に示す。 In vitro, in vivoにおいてァクチニンおよびコネキシン 43の発現が良好に維持されていることが確認された。また in vivoのモデルに関しては in vitroのモデルに比して心筋細胞の配向成されていることがいることが確認できた。また、 HE色の所見から、移植した心筋シート間に微小血管が浸入し、血流を供給している様が観察された。

[実施例 6] 心筋細胞シートの作製、移植、組織学的解析及び電気活動解析材料及び方法

•心筋細胞シート作製法

ティシール（ヒトフイブリノ一ゲン、トロンビン、塩化カルシウム、ァプロチニン含有）をバクスターより購入した。ヒトフイブリノ一ゲン 90mg、ヒトアルブミン 20mg、トロンビン 0. 4U、塩化カルシウム二水和物 0. 5 9mg、ァプロチニン 3000Uを 15mlの生理食塩水に希釈し、そのうち 0.3m 1を 35龍培養皿に塗布した。約 2時間後にフィプリン重合体が表面にコートされた培養皿を得る事が出来た。この培養皿は 4°Cで 1ケ月程度は無菌的に保存する事が出来る。前出の手法で、生後 1日齢の新生仔ウィスターラットの心室筋より心筋細胞を得る事が出来た（Kodama H, Fukuda K, Pan J et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, activates the JAK/STAT pathway in rat cardiomyocytes. Circ Res. 1997;81 :656-663.)。得られた心筋細胞をフィプリンでコ一ティングされた培養皿上に（2. 8 X lOVcm²)の密度で蒔いた。（図

9A, B, G) . 重合したフィブリンは培養細胞から分泌される非特異的プロテア一ゼにより徐々に分解され、培養開始後 3— 7日後には細胞と培養皿表面との接触は次第に粗なものとなる（図 9C) 。

従って、 4日目には、セルスクレイパ一を用いて心筋を培養皿表面から剥がす事が可能となり、心筋細胞シートを得る事が出来た（図 9D, H)。縮んだ心筋細胞シートは培養液の中に浮遊させる事により伸展し（図 9E, 1)、その後正方形の形にカットした。その後の解析のために、二枚の心筋細胞シートを部分的に重ね合わせ（図 9F， J)、前出の手法（Murata M, Fukuda K, Ishida H et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, enhances L-type Ca2+ current and [Ca2+]i transient in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol.

1999;31 :237-245.)でラミニンをコートした培養皿上で共培養を卜 3 日間継続した。

•心筋細胞シートグラフトの成獣ラット皮下組織への移植

全てに実験手技は the An imal Care and Use Commi t t ees o f the Ke i o Un ivers i ty and conf ormed to the NIH Gu i de f or the Care and Use of Laborat ory An ima l sの主義に則って行われている。ジェチルエーテルの吸入後、 ^塩酸プロ力イン 5- 10mlを雄 F344ヌードラット（8週令， n= 10)の背部皮下に局注し、皮膚を切開した。同部に三層に重ねた心筋細胞シートを移植した。

•組織学的解析

抗フイブリン抗体（Monosan, Netherland) , 抗ひ-ァクチニン抗体（Sigma)、コネキシン 43抗体（Sigma)を用い、前出の手法で免疫組織染色を行った（Agbulut O, Menot ML, Li Z et al. Temporal patterns of Done marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin - induced cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2003;58:451459.)。これらの検体に対してァレキサ 488標識抗マウス IgG抗体 (Molecular Probes)もしくは TRITC標識抗ゥサギ IgG抗体（Dako)による二次染色を行った。いくつかの実験においてはァレキサ 594標識ファロィジンによる染色を行った（Molecular Probes)。 TOTO- 3 (Sigma)により細胞核の染色を行つた。染色された検体を共焦点レーザー顕微鏡で観察した（LSM510, Zeiss)

- Optical mapping systemによる心筋シートの電気活動の解析

2枚の心筋細胞シートを 2mmの幅で互いに重ねあわせた。 1組の双極電極を用いて、それぞれの心筋シートの両端で細胞外電位を測定した。

細胞膜電位感応性色素 di4-ANEPPS (Molecular probes)を用いた optical maping system によりに方向性の活動電位の伝播を記録し 2枚の重ね合わされた心筋シート間での活動電位の伝播を評価した。

d i_4_ANEPPSの保存用溶液 20mMを、 20% pluronic F-127 (P-3000, Molecular probes)を含有した DMS0に溶解し、 di- 4- ANEPPSの最終濃度が 10 / Mとなるように培養液に希釈した。検体を 37° Cのィンキュベ一ター内に 30分間安置した後、夕イロ一ド液（NaCl 140, KC14, MgCl₂0.5, CaCl₂1.8, HEPES 5, D - glucose 55 mmol/L, (pH adjusted to 7.4 with NaOH) and 100 mg/L BSA) で培養液を置換した。心筋細胞シートの乗った培養皿を恒温灌流装置（37° C)にセットし、蛍光顕微鏡のステージに乗せた。（BX50WI, Olympus, Japan)高解像度 CCD カメラシステム（MiCAMO l, Bra in Vi s ion, 192 x 128 po int s, 3. 5 msec t ime resolut ion)を用い、励起波長を 6 1 0 MI以上、興奮波を 520 nmで検体からの信号を記録した。心筋シートはサイトカラシン- D (25 ζ Μ)で不動化した。自律拍動下および双極塩化銀電極によるべ一シング剌激下で活動電位を記録した。得られに ·5—夕【¾刖出 (Koura T, Hara M, Takeuchi S et al. Anisotropic conduction properties in canine atria analyzed by high-resolution optical maDping: preferential direction of conduction block changes from longitudinal to transverse with increasing age. Circulation. 2002; 105:2092 - 2098·) の方法で、 Igor Pro sof tware (Waveme t r ics)を用いて作製した独自の解析プログラムにより処理した。結果

• フィプリンコ一トした培養皿により作製した心筋シートの組織学的解析本手法により得られた心筋シートを解析するに当たり、本発明者らは心筋細胞をフイブリン培養皿上に蒔いてから様々な時間を経過した時点においてセルスクレイパーを用いたシート作製を行った（図 10)。心筋細胞シートは 3日以降より培養皿から剥がす事が可能となった。剥がした後の直径は元の培養皿に比ベ 38 士 3. 6% (n=30)に収縮した。通常の培養皿、ゼラチン、ラミニン、フアイブロネクチンをコーティングした培養皿上で心筋細胞を培養し、コンフルェントになった後同様の手技でセルスクレイパ一を用いて細胞を剥がす試みを行つたが、これらのケースではシート状に細胞を回収する事は不可能であった（data not shown)。本実験において、本発明者らは初代培養からシート作製までの日数を PX days、シート作製からデ一夕採取までの日数を SX daysと定義した。初代培養から 4日後に作製した心筋シートの底面には（P4- SO)残存フィプリンが認められた。しかし、初代培養から 6日後に作製した心筋シート（P6 - SO)には残存フイブリンは認められなかった。

P4-S 1の心筋シート間にはまだ残存したフイブリンが認められた。しかし、さらに培養を継続した 2日後の P4- S3 の心筋シートにおいてはフイブリンは完全に消失していた。興味深い事に、 600 KIU/ml のァプロチニンを培養液に加えると相当量のフィプリンが分解されずに心筋シートの間に残存し続ける事が判明した（H-K)。これらの実験結果から心筋シート内の残存フィプリンを完全に分解するためには 6日間を要する事が示唆された。

• フイブリンコート培養皿により作製した心筋シートの性質

まず始めに心筋細胞の初代培養開始から心筋シート作製までの理想的な日数の検討を行った（図 11)。心筋シート作製時における成功率は 3日後より上昇し 4日目にピークに達した（成功率 100%, 各 n= 12) (図 11A)。得られる心筋シー卜の直径は初代培養からシート作製時までの期間に応じ、細胞密度の増加あるいは細胞の伸展の機序により徐々に伸張した（図 11B)。次に初代培養から異なつた期間において作製した心筋シートを、シート作製後から 3日間培養を継続した時点で自律拍動を示している比率を調査した。初代培養からシ一ト作製までの日数（PX)は心筋シートの自律拍動再開率に対して影響しなかった。しかし、心筋シ一ト作製を初代培養から 4日目に設定し（P4)、シート作製後培養を継続していった際に自律拍動がいっから認められるかを観察した所、シート作製後 2曰目より大幅な自律拍動出現率の増加を示し、さらに 6日目（S6)においては 100 %の心筋シートが自律拍動を示した（6 days SX ; 図 11C, D)。ベーシング刺激に対して心筋シートが反応し律動収縮を示すかどうかを調べた所、律動収縮を示す割合は S2より増加し始め S5の時点では 100%に達した（図 11E) 。図 11Fは心筋シートを作製後、自律収縮を示す心筋シートの拍動周期（心拍数）を経時的に観察した結果である。これらの結果から、今回心筋シートを用いて電気生理学的解析を行うに当たり、 P4- S3の心筋シートを用いる事に決定した。

•活動電位の伝播を解析するに当たっての opt ical mapping sys t emと双極電極を用いた手法との比較

次に心筋シート内での活動電位の伝播の様子を、また 2枚の心筋シート間で接合部を通じて活動電位が伝播するかどうかを解析した。双極電極を接触させ心筋シートの心電図を記録した結果と、 opt ical mapp ing sys temにより計測された活動電位の記録とを比較した（図 12)。心電図上では Α, Β両方のシートが同期して自律拍動を行っている様子が記録された。心電図上、シート Αとシート B の QRS compl exは完全に同期し、 2枚の心筋シートが電気的な結合が確立されている事が示唆された。しかし、予想に反して opt i cal mapp ing sys temによる活動電位の記録においては、活動電位はシート Aの左下方より右上方へ進行し、接合部の上部を通じてシート Bへ伝播しシート B内を広がってゆく様子が記録された。すなわち、活動電位は 2枚のシートの接合部においては最短距離を直線的に伝播しているわけではない事が判明した。図 12D における矢印上の活動電位伝導速度はシート間の接合部においても遅延無くスムーズに伝播している事が示された（図 12E)。従って心筋シートの活動電位の伝播、心筋シート同志の電気的結合の様子を解析するのに際し、 opt ical mapp ing sys temは唯一の有用性の高い手法である事が判明した。

• 2枚の心筋シート間で電気的結合が確立されてゆく過程

2枚の心筋シートの間において電気的結合がどのように確立されてゆくかを調査するために、本発明者らは部分的に重合させた心筋シートにおける活動電位の伝播の様子を opt i cal map ing sys t emにより解析した。 P4- SIの心筋シート間において、活動電位は一方の心筋シートから他方の心筋シー卜へ伝播しなかった（図 13)。興味深い事にいくつかのケースにおいては（3/ 10)シ一ト Bにおいて部分的な活動電位の捕捉が認められた（arrow in 図 13D)。活動電位の伝播の様子を等時線で示したのが図 13F である。また図中ライン上で、興奮波の先頭が進行する際の伝導速度が図 13Gに示されているが、活動電位の進行は t点で停止している事がわかる。

これらの実験結果から、 P4-S 1の心筋シートにおいては電気的結合は限局的に形成されているものの、 2枚のシート間にはまだ安定した電気的結合が確立されていない事が示唆される。

一方、 P4- S3の心筋シートにおいては活動電位はシ一ト Aからシート Bに伝導遅延無く伝播した（図 14) 。全ての実験検体において、 2枚の心筋シートの間には良好な電気的結合が形成されており（n= 10/ 10)、伝導速度の解析においても伝導遅延は認められなかった。これらの実験結果からは重層化した心筋シート間に安定した電気的結合が形成されるためには 3日（S3)以上の共培養期間が必要と考えられた。

• 2枚の心筋シートの結合に関する組織学的検討（生体外のモデルにおいて） P4 - S3心筋シートの蛍光免疫染色像を図 15に示す。心筋細胞内には、はっきりとした横紋構造が認められる。心筋細胞間の接合部には Cx43が存在している。心筋細胞同志が接触する事により横紋構造の向きが同じ方向に向く傾向があつた。 2枚の重層化した心筋シートの厚さは約 15 ± 2 mであった。 2枚のシートは完全に結合しており、 2枚のシートの境界を判別する事は不可能であった。

• 3層に重ねた心筋シートの生体内移植モデルとその組織学的検討

3層に重層化した心筋シートをヌードラッ卜の皮下に移植し 1 4日後に観察した所、力強い周期的な収縮を示した（図 16)。 HE染色およびァザン染色では移植された心筋シートは宿主由来の結合組織により上下から覆われている事が示された（図 16B， C)。心筋シートの厚みは 102 ± 1 1 mであり、 vi troで 3層の心筋シートの培養を継続した際に比べより厚くなつていた。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、 1つ 1つの心筋細胞の大きさは vi tro のケースに比べ大きくなっていた。さらに移植された心筋シート内には豊富な血管新生が認められた（図 16D)。これらの血管系は 10- 25 mと、毛細血管レベルではなく微小血管レベルの経を有していた。心筋細胞内の横紋構造はよく発達しており心筋細胞の分布には同一方向を向く配向が認められた（図 16E)。これらの所見はフイブリンコート培養皿を用いて作製された心筋シートは、組織での生着性がよく、正常心臓に似た組織構造を持ち、良好な収縮能を有しているものと考えられた。

PIAAm をコートした感応性培養皿を用いて細胞シートを作製する手技が報告されて以来、様々な臓器における二次元もしくは三次元の組織工学の手法の一つとして細胞シート工学が発展してきた。その結果、現在では細胞シー卜工学は再生医療の分野において重要な位置を占める様になつてきた。これまで温度感応性培養皿を用いて血管内皮細胞、肝細胞、腎上皮細胞、角膜細胞などによる細胞シートを作製した報告がなされている（Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A et al. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials . 2003;24:2309-2316.)。

今回本発明者らが報告した手法はいくつかの特徴を有する。一つは特別な設備を必要とせず、容易に入手可能なフィプリンを用いる事だけで手軽に細胞シートの作製が可能となる事である。従って、理想的なサイズ、形の様々な細胞シートを特別な手技を必要とせずに作製する事が可能となる。二つ目の特徴は接着系細胞のあらゆる種類のもので、細胞シ一卜を作製する事が可能であるという事である。なぜならば、通常の細胞培養皿ゃファイブロネクチンをコートした培養皿に接着しにくい様な細胞でもフイブリンをコートした培養皿には極めて良好な接着性を示すからである。 3つ目の特徴は細胞シートを素早く作製する事が可能となった事である。本手法を開発した当初はセルスクレイパーで細胞をシート状に回収する際に、心筋シートの細胞構造が破壌されてしまう可能性が危惧された。しかし顕微鏡による観察では明らかな細胞の壊死像などは観察されなかった。この理由は、心筋細胞から分泌される非特異的なタンパク分解酵素によってフィプリンが分解されてゆくに従って、細胞と培養皿との接着が次第に緩くなつてゆくこと、またわずかに残存したフィプリンが細胞を回収する際の物理的な刺激から細胞を守るクッションの様な働きをするためではないかと予想している。本発明者らは心筋の初代培養を行ってから合計 7日目に残存フイブリンは全て消失する事を確認している。しかし、この期間に関しては、細胞自体が分泌するタンパク分解酵素の性質やコンフルェントとなった際の細胞密度などによって変動し得るものと考えられる。

生体内において肝臓から分泌され、強力なタンパク分解作用を有する酵素としてプラスミンがよく知られている（Ritchie DG, Levy BA, Adams MA et al. Regulation of fibrinogen synthesis by plasmin-derived fragments of fibrinogen and fibrin: an indirect feedback pathway.？ roc Natl Acad Sci U S A. 1982;79: 1530-1534.)。従って、細胞シートを培養皿から剥がした時点において心筋シート内に残存フィプリンが存在していたとしても、移植後は生体内のプラスミンにより残存フイブリンは消失するものと考えられる。以上、今回示した結果からフイブリンをコートした培養皿により各種の細胞シ一トを作製する技術は心筋細胞シ一ト工学において現実的かつ簡便な手法であると考えられる。

心筋組織工学の分野で有用な移植用グラフ卜として心筋シートを用いるためには、心筋シート内あるいは心筋シート間での活動電位の広がり、伝達が良好であるという事が要求される。この点に関して、 opt ical mapping sys temは活動電位の広がりを詳細に検討する手段として極めて有用であると考えられた。顕微鏡下で完全に同期した収縮を行っている事が確認された 2枚の心筋シー卜も、 opt ical mapping sys t emを用いた解析により、その結合部においては良好な電気的結合が形成された一部の領域を介して、活動電位の広がりは迂回する様に伝播している事が示された。従って心臓に心筋シートを移植した際の宿主とグラフトとの電気的結合の有無を解析するに当たっては opt ical mapping systemによる電気生理学的な検討が極めて有用であると考えられた。今回の実験では、 2枚の心筋シート間で十分な電気的結合が形成されるためには 3日間を要する事が示された。同様に、 opt ical mapping systemを用いる事により心筋シート移植モデルにおいて電気的結合が形成されてゆく過程を検討する実験が現在進行中である。

結論として、今回示した心筋シ一卜作製手法および心筋シートの電気生理学的解析手法は心臓その他の臓器における再生医学の領域において大きな前進をもたらすものになると考えられる。

[実施例 6 ] 細胞のシート化

( 1 ) 角膜上皮細胞シートの作製

以下の手順で、組織培養皿（IWAKI) にコートしたフイブリンシート上に角膜上皮細胞シートを作製した。

1)綿棒でゥサギのデスメと虹彩を擦り取り、結膜をカツ卜する。

2) 12分割し、上皮を下にして f ibr inをコートした inner wel l上に置く。

3) 666 ΚΙϋ/mlのァプロチニンを添加した 0. 6 ml SHEMを加える。上皮が生えてきたら、 SHEM (666 KIU/mlのァプロチニン添加）を 1mlにする。

4) 3T3細胞を培養している DMEM+FCS ( + ) を 2ml SHEM (666 KIU/ml のァプロチニン添加) に変更する。

5)上皮がコンフルェントになったら（コンフルェントになるまで 1〜 2週間かかる）、 Air liftをおこなう（1週間程度）。培地は SHEMだが、ァプロチニンは添加しない。

6)培養した上皮をスクレイパーで剥がす。

フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察した様子（X100倍）を図 1 7に示す。スクレイパーで剥がした培養上皮シートの写真を図 1 8に示す。フイブリンシー卜上に培養したゥサギ角膜上皮細胞からは、 3T3共培養と Air lift を行なうことで厚みのある上皮シートを作製することができた。

(2) 口腔粘膜上皮細胞シートの作製

以下の手順で、組織培養皿（IWAKI) にコートしたフイブリンシート上に口腔粘膜上皮細胞シートを作製した。

1)ゥサギの口腔粘膜を採取する（2mmx2匪 xlmmを 2箇所採取）。

2)組織を洗浄する（ゲン夕マイシンと抗生剤-抗真菌剤入りの medium で 15分間 x3回 RT、抗生剤入りの PBS (-) で 15分間 RT)。

3) Dispasen処理をする（37°C 1時間）。

4)上皮を実質から剥がし、 DMEM/F12 + FCS (—）へ入れる。

5) Trypsin- EDTA処理をする（8分間 RT)。

6) 1500rpmで 5分間遠心する（2xl0⁵個/ lml SHEM (666 KIU/mlのァプロチニン添加）で inner wellへ播く）。

7) 3T3細胞を培養している DMEM + FCS ( + ) を 2ml SHEM (666 KIU/ml のァプロチニン添加）に変更する。

8)上皮がコンフルェントになったら（コンフルェントになるまで 1〜 2週間かかる）、 Air liftをおこなう（1週間程度）。培地は SHEMだが、ァプロチニンは添加しない。 .

9) 培養した上皮をスクレイパーで剥がす。

フイブリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察した様子（X 100倍）を図 1 9に示す。スクレイパーで剥がした培養上皮シートの写真を図 2 0に示す。フイブリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細胞からは、 3T3共培養と Ai r l i f t を行なうことで厚みのある上皮シートを作製することができた。

( 3 ) フイブリンシート培養の Amex包埋固定法

以下の手順で、上皮シートを Amex法にて包埋した。

1)上皮シートをメッシュに入れる。

2) 4°Cのアセトンに入れる。

3)アセトンごと- 20°Cに移し、一昼夜固定する。

4) 4 T:のアセトンに入れ替え、 1 5分浸透させる。

5)室温のアセトンに入れ替え、 1 5分浸透させる。

6)安息香酸メチルに入れ替え、 1 5分浸透させる。この操作を 2回行う。

7)キシレンに入れ替え、 1 5分浸透させる。この操作を 2回行う。

8)パラフィンを 1時間浸透させる。この操作を 3回行う。

9)パラフィンで包埋する。

( 4 ) フイブリンシート培養の免疫染色

ゥサギの角膜組織、口腔粘膜組織、培養角膜上皮、培養口腔粘膜上皮のサンプルにつき、 Amex 包理法で作製したパラフィン切片を以下の手順で免疫染色した。

1 ) 3¾ H₂0₂で 30 分、室温にて処理する。

2 ) ブロッキング（ 10% Nomal Donkey Serum - 1% BSA - 0. 01M PBS ) を 1 時間、室温にて行う。 3 ) 1次抗体（AE5 ： PR0GEN 61807 ： 1/1000 )と反応させる。 I sotype cont rol (mouse IgGl ： Dako ： 1/500 ) 0/N

4 ) 2次抗体 (Donkey ant i Ms IgG 一 FITC 、 Jackson ： 711-095-152 ： 1/50 ) と 30 分、室温にて反応させる。

5 ) 核染色（D0J IND0 ： 1 ug/ml DAP I)を 5 分、室温にて行う。

ゥサギ角膜上皮組織と口腔粘膜上皮組織の免疫染色（AE5) の様子を図 21に示す。 Blue : 核染色（DAPI)。 Green： AE5染色（ケラチン 3/12 )。ポジティブコントロールとして角膜と口腔粘膜の上皮のケラチン 3/12を染色したものは、ともに上皮細胞で染色性が示された（図 21B及び D)。

ゥサギ角膜培養上皮細胞と口腔粘膜培養上皮細胞の免疫染色（AE5) の様子を図 22に示す。培養上皮において、角膜上皮は重層化し、ケラチン 3/12で染色された（図 22B及び D)。口腔粘膜上皮で重層化はみられたが、ケラチン 3/12 の染色はわずかであるが染色された。

以上のことから、フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮 · 口腔粘膜上皮は重層化し、ケラチンを発現していたことから、正常組織に近い特性を持つ培養上皮を作製できることが示された。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

産業上の利用可能性

本発明の方法で製造された細胞シ一卜を用いることにより、各種病態（例えば、心筋細胞での不整脈）の解析モデルを作製すること、再生医療などの臨床レベルで組織移植をすることが可能となる。また、本発明の方法で製造された細胞シートを用いることにより、薬剤の生物学的活性試験を行うことができるので、所望の生物学的活性を有する医薬、農薬などの候補物質の選別を行うこ

00請 Zdf/ェ:) d 8C98Z0/S00Z OAV

Claims

請求の範囲

1 . 細胞シートを作製するための支持体の表面をフイブリンでコ一ティングするための組成物であって、フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物。

2 . 表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シート作製用支持体。

3 . 表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、細胞シートの製造方法。

4 . 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、請求項 3 記載の方法。

5 . 細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、請求項 3又は 4に記載の方法。