WO2005028638A1 - 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法 - Google Patents

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WO2005028638A1
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Keiichi Fukuda
Yuji Itabashi
Kazuo Tsubota
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Keio University
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    • C12N2533/00Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50Proteins
    • C12N2533/56Fibrin; Thrombin

Definitions

  • composition for coating a support for preparing a cell sheet a support for preparing a cell sheet, and a method for producing a cell sheet TECHNICAL FIELD
  • the present invention relates to a composition for coating a support for producing a cell sheet, a support for producing a cell sheet, and a method for producing the cell sheet.
  • PIAAm poly (N-isopropylacrylamide)
  • myocardial cells it has already been reported that a myocardial tissue mass that can be used as a graft has been developed by laminating myocardial sheaths thus prepared (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-38170). Gazette, International Publication No. 01/068799 Pamphlet, Shimizu et. A1. Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation techni ue and temperature-responsive cell culture surface: Circ Res. 2002; 90: e40_e48) . The myocardial tissue mass produced in this way has been confirmed to perform electrical activities similar to normal myocardial tissue in vitro and in vivo.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of producing a cell sheet by a simple operation using a support coated with a familiar material that is commercially available and has been confirmed to be safe.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for coating a support for producing a cell sheet.
  • Another object of the present invention is to provide a support suitable for producing a cell sheet. Disclosure of the invention
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a cell sheet preparation support whose surface is coated with fipurin. (3) Cultivate the cells on the surface of the support that is coated with fipurin until saturation, continue the culture for sufficient time to decompose fipurin on the cell bottom, and then culture A method for producing a cell seed cocoon, comprising peeling the formed cells from the surface of the support in a sheet form.
  • cell sheets can be produced immediately and in large quantities by using commercially available fibrin glue without using expensive special culture dishes coated with PIAAm.
  • Figure 1 shows how rat cardiomyocytes are sheeted.
  • Figure 2 shows how C2C 12 cells are made into sheets.
  • Figure 3 shows how mature skeletal muscle cells are made into sheets.
  • Fig. 4 shows an electrocardiogram of the cardiomyocyte sheet.
  • Fig. 5 shows the state of a rat cardiomyocyte sheet transplanted into the skin.
  • FIG. 6 shows the results of immunostaining of lactin and connexin 43 on rat myocardial sheets 2 days after in vitro sequencing.
  • Fig. 7 shows the results of HE staining of a rat cardiomyocyte sheet 7 days after transplantation into nude rats subcutaneously.
  • FIG. 8 shows the results of immunostaining of lactin and connexin 43 in a rat cardiomyocyte sheet 7 days after transplantation into nude rats subcutaneously.
  • FIG. 9 is a representative scheme of the mechanism and operation of a cardiomyocyte sheet using a fibrin polymer-coated dish. Operation was performed in the order of A ⁇ B ⁇ C ⁇ D ⁇ E ⁇ F.
  • FIG. 10 shows the histological analysis results of MCS.
  • FIG. 11 shows the nature of MCS.
  • A Success rate of MCS production in PX-SO days sample.
  • B MCS diameter in the PX-SO sample.
  • C Percentage of MCS produced using a sample of PX-S3 days showing autonomous pulsation.
  • D Percentage of autonomous beating sheets in the P4-SX days sample rate.
  • E Percentage of MCS that gained human pacing in the P4-SX days sample.
  • F The pulsation period in the P4-SX days sample.
  • Figure 12 shows the electrocardiogram (ECG) recorded using a pair of contacted bipolar electrodes and the action potential recorded by opti cal mapping for the purpose of analyzing the electrical activity in two stacked MCSs. It is a state of propagation.
  • ECG electrocardiogram
  • FIG. 1 Schematic diagram of two stacked MCSs and the position of the bipolar electrode in contact.
  • B Microscopic image of two stacked MCS.
  • C Extracellular potential obtained from each MCS showing complete synchronization.
  • D The propagation of action potential observed by opti cal mapping is shown using an isochron. The interval between each isochron is 35 milliseconds. The action potential generated from the lower left part of sheet A bypassed the lower half of the joint that did not exhibit electrical excitement and propagated to the opposite sheet B through a limited area above the joint.
  • E The action potential progressed by tracing the top of the excitement wave. (Black curve with arrowhead in (D)).
  • Fig. 13 shows the results of observation of the action potential propagation of the superimposed MCS on the first day after co-culture of two partially overlapped MCS using opti cal mapping. .
  • Figure 14 shows the results of observation of the action potential propagation and electrical coupling of the superimposed MCS on the third day using optical mapping.
  • FIG. 15 shows the histological basis that a good electrical connection is formed between two cardiomyocyte sheets in vitro.
  • FIG. 16 shows the state of transplantation of the three-layer cardiomyocyte sheet in vivo.
  • FIG. 17 shows the results of observation of the rabbit corneal epithelial cells cultured on the fibrin sheet with an optical microscope (100 ⁇ magnification).
  • FIG. 18 shows a rabbit corneal epithelial cell sheet peeled off with a scraper.
  • Fig. 19 shows the results of observation of rabbit oral mucosal epithelial cells cultured on a fipuline sheet with an optical microscope (magnification 100 times).
  • FIG. 20 shows a rabbit rabbit mucosa cultured epithelial cell sheet peeled off by a scraper.
  • FIG. 21 shows the result of staining keratin 3/12 of the rabbit cornea and oral mucosa epithelium as a positive control.
  • FIG. 22 shows immunostaining of a cell sheet prepared using rabbit corneal epithelial cells and oral mucosal epithelial cells.
  • the corneal epithelium was stratified and stained with keratin 3/12.
  • the oral mucosal epithelium was stratified, and keratin 3/12 was stained only slightly.
  • Oral mucosal epithelium was stratified and expressed keratin, so cultured epithelium with characteristics similar to normal tissue It was shown that can be created.
  • the present invention provides a composition for coating the surface of a support for producing a cell sheet with fibrin, which comprises fibrinogen and thrombin.
  • Fibrin is a poorly soluble fraction that is produced when fibrinogen A and B chains are specifically hydrolyzed by thrombin to release fibrinopeptides A and B.
  • Reactive groups involved in fipurin aggregation form hydrogen bonds with each other to form a polymer, which gels with a certain arrangement.
  • Fibrinogen is a glycoprotein with a molecular weight of about 34,000, and the molecular weights are 650,000 ⁇ 0.1000, 550,000, 47,000 A chain, B j8 chain, and a chain, respectively. These three subunits form a pair and are S—S bonded to each other. Thrombin hydrolyzes the Arg_Gly bond, releasing fibrinopeptides A and B from the A chain and B / 3 chain and turning them into fipurin.
  • Thrombin is a type of proteolytic enzyme (protease) that acts on fibrinogen to produce fibrin.
  • proteolytic enzyme proteolytic enzyme
  • thrombin is preferably present in an amount effective as a catalyst for converting fipriinogen to fibrin.
  • Fibrinogen and thrombin are preferably derived from humans, considering that cell sheets produced by culturing cells on fibrin coating formed from them are used in rabbits, but are not limited thereto. Alternatively, it may be derived from other animals (for example, monkeys, buoys, mice, rats, baboons, dogs, cats, hidges, tusks, etc., which are already commercially available).
  • fipurinogen and thrombin can be used.
  • Example you can use a Tissir kit from Bax Yuichi.
  • the Tissille kit contains human fibrinogen, thrombin, calcium chloride dihydrate, and aprotinin.
  • composition of the present invention may further contain calcium chloride (may be a hydrate), abrotinin, physiological saline and the like.
  • composition 16 6 m 1 of the present invention An example of the composition in the composition 16 6 m 1 of the present invention is described below.
  • fibrin is generated when fibrinogen acts on fibrinogen. Therefore, fibrinogen and thrombin may be stored in separate containers and mixed at the time of use. Serum albumin, aminoacetic acid, aprotinin, tyloxapol, sodium chloride, sodium citrate may be added to fibrinogen. Serum albumin, amino acetic acid, and sodium chloride may be added to thrombin. Since calcium ions promote the hydrolysis of fibrinogen, calcium chloride dihydrate should also be stored in a separate container from fipurinogen and mixed at the time of use.
  • calcium chloride dihydrate may be dissolved in a solution for dissolving thrombin at the time of use (hereinafter referred to as “thrombin solution”) and stored in a container.
  • thrombin solution a solution for dissolving thrombin at the time of use
  • fibrinogen solution a solution for dissolving fibrinogen during use
  • fibrinogen solution a solution for dissolving fibrinogen during use
  • the surface of the support for preparing cell sieves can be coated with fibrin.
  • the present invention provides a cell sheet preparation support whose surface is coated with fipurin.
  • the support may be any material as long as cells can be cultured. Examples thereof include a culture dish, a petri dish, a 6-96 well culture dish, Cell Desk LF (SUMILON), and the like. Examples of the material for the support include, but are not limited to, glass, modified glass, polystyrene, polymethyl methacrylate, ceramics, and the like.
  • the composition of the present invention may be applied to the support to form a fipuline coating. Details of one example are described below.
  • fibrinogen, thrombin, calcium chloride dihydrate, aprotinin, and physiological saline are mixed, and the mixture is applied to the surface of the support.
  • Appropriate time usually 1 to 3 hours
  • fibrin is formed. It should be stored in 4 under aseptic conditions until it is used as a cell sheet support.
  • a method for producing a cell sheet comprising peeling cultured cells from a surface of a support in a sheet form.
  • a film-like sheet can be obtained by peeling cells that have grown to saturation without any gaps on the culture dish.
  • saturated state means a state in which cells are arranged without gaps, and this can be observed with a microscope.
  • Examples of cells to be cultured include cardiomyocytes, skeletal myoblasts, mature skeletal muscle cells, smooth muscle cells, bone marrow stromal cells, corneal epithelial cells, oral mucosal epithelial cells, skin cells, etc. It is not limited. There are two methods for saturating these cells on the culture dish: one is to spread only one type of cell, and the other is to spread multiple types of cells simultaneously. Among the methods of saturating a single type of cell, a method of growing a monoclonal cell with proliferative ability on a culture dish at first, until it becomes saturated, There is a method in which a large number of polyclonal cells are seeded and saturated immediately after adhering to the bottom of the culture dish. An example of the former is a mouse skeletal myoblast-derived cell line
  • C2C12 cells and CMG cells are grown and grown on a culture dish and wait for saturation.
  • immortalized cell lines such as C2C12 cells and CMG cells
  • examples of the latter include cardiomyocytes, skeletal myoblasts, bone marrow stromal cells, etc., collected from the myocardium, skeletal muscle, smooth muscle, bone marrow, etc., using the primary culture method.
  • cells are selectively collected using a separation method and the purity is increased, and then a sufficient amount is put on a culture dish.
  • fibroblasts As an example of a method of saturating multiple types of cells, if fibroblasts are mixed when producing a sheet of cardiomyocytes or skeletal muscle cells, the number of cardiomyocytes and skeletal muscle cells is insufficient. However, fibroblasts with high proliferation ability enter the gaps between cardiomyocytes and skeletal muscle cells, and the entire bottom of the culture dish can be covered with any cell to be saturated. Thus, even for cells that are difficult to collect in a sufficient amount and have a low proliferative capacity, it is possible to easily produce a sheet by co-culturing cells that serve as a connection, such as fibroblasts. In this case, fibroblasts as well as smooth muscle cells and endothelial cells can be used as the cells to be used for connection. By changing the cells used for connection, the strength and expansion / contraction of the cell sheet produced according to the application sex Can be changed.
  • the cells may be derived from humans or from animals other than humans (eg, monkeys, pigs, mice, rats, baboons, dogs, cats, hidges, ushis, etc.).
  • the cells may be collected directly from a source such as an animal, or may be cultured cells that are established or not established.
  • the cells are cultured on the surface of the support that is coated with fipurin until saturation is reached, and the cells are cultured for a period of time sufficient to decompose the cell surface fipurin.
  • the cultured cells may be detached from the support surface in a sheet form.
  • the cells can be cultured under any method and conditions as long as they are performed on the surface of the support coated with fibrin.
  • the cells are saturated and the cells are formed into a sheet from the support surface. It may be continued until the fibrin is decomposed to such an extent that it can be peeled off.
  • cells when cells need to be cultured for a long period of time before they are made into sheets, they can be cultured without dissolving fipurin up to the required number of days by adding an appropriate amount of aprotinin to the culture solution until several days before sheeting. Can be extended.
  • the cells are cultured in a medium until the cells are saturated, and then the culture is continued for 3 to 4 days in a culture solution not containing aprotinin. During this time, fibrin on the cell bottom is naturally degraded by the cultured cells. At this time, the rate of degradation of fipurin on the cell bottom is intentionally controlled by adding a substance that degrades fipurin such as plasmin to the culture solution. It is also possible.
  • the culture solution is sucked and the membranous cell sheet is peeled off from the support using peeling means such as a scraper. After the cell sheet has been peeled off, the cell sheet can be extended by dropping a new culture solution onto the wrinkled cell sheet.
  • the peeled sheet-like cultured cells may be further laminated.
  • An example of a method for stacking cell sheets will be described below. Aspirate the culture medium from one cell sheet extended on the culture dish and leave it in a 37 ° C saturated water vapor incubator for an appropriate time (for example, 15 to 30 minutes). During this time, the first cell sheet adheres to the culture dish. Next, the second cell sheet immediately after peeling is aspirated with the culture solution and dropped onto the first cell sheet fixed on the culture dish. A state in which the second sheet is superimposed on the first sheet by slowly dripping a new culture solution onto the second sheet dripped in a contracted state on the stretched first sheet. Can be extended. Cell sheets can be laminated one after another by repeating the same procedure. By using the method of the present invention to seed various cells and laminating sheets, it is possible to construct a tissue mass in vitro for various organs. By using, an in vitro analysis method from the cell level to the tissue level can be established.
  • the cell sheet produced by the method of the present invention can be used for regenerative medicine or drug biological activity testing.
  • Examples of cell sheets used for regenerative medicine include myocardial cell sheets, corneal epithelial cell sheets, oral mucosal epithelial cell sheets, skin cell sheets, and the like.
  • the myocardial cell sheet can be used as a material for the treatment of heart failure or arrhythmia caused by myocardial infarction, various myocarditis, cardiomyopathy, etc., or as a material for cardiac muscle transplantation.
  • the corneal epithelial cell sheet and the oral mucosal epithelial cell sheet can be used as a material for corneal transplantation.
  • the skin cell sheet can be used for the treatment of wounds caused by burns, trauma and the like. It is also possible to use treatments that promote wound healing with fibroblast sheets.
  • Examples of biological activity tests of drugs include drug pharmacological activity tests, drug toxicity tests, drug binding activity tests, and the like.
  • Examples of the binding activity of the drug include ligand binding receptor binding activity and antibody-antigen binding activity.
  • cell sheets derived from various human organs are transplanted into immunodeficient animals (such as nude mice, skid mice, and nude rats), and after the drug is administered to the transplanted model animals, the state of the cell sheets is examined. It is possible to predict the effects of drugs on human organs in vivo.
  • candidate substances such as pharmaceuticals and agricultural chemicals having a desired biological activity can be selected.
  • candidate substances such as pharmaceuticals and agricultural chemicals having a desired biological activity can be selected.
  • Penicillin, streptomycin and amphotericin B (GIBCO 15240-062) med ium 199 (ICN Biomedical s 1023126)
  • DMEM (GIBCO 12100-046) C2C12 derived from mouse skeletal myoblasts (purchased from ATCC)
  • CMG cells (cell lines obtained by cloning an immortalized cell line obtained by adding 5-azacytidine to mouse bone marrow cells in Keio University School of Medicine)
  • Anti-rabbit IgG antibody derived from TRITC binding buyu (DAKO R 0156)
  • DMEM / F12 Gibco BRL D-MEM / F12 (1 bag for Z1L), 12400-016; 15.6g, HEPES included
  • Insulin SIGMA human recombinant expressed in E. coli; 1 -0259; 50mg (concentration at use 5 g / ml)
  • Human-EGF Gibco BRL Recombinant Human EGF; 13247-010; 100 g (concentration at use lO g / ml)
  • Ventricles were removed from 1-day-old Wistar rat neonates, treated with 0.03% trypsin, 0.03% collagenase, and 20 g / mL DNase I to isolate ventricular myocytes.
  • 10% FBS and penicillin (50 U / mL) / streptomycin (50 ng / mL) / amphotericin ⁇ (25 ⁇ ) per fibrin-coated 3.5 cm culture dish g / ml) -containing medium 199 / DMEM 2 ml and 2 ⁇ 10 6 cells were injected and cultured in an incubator at 37 ° C., 5% (: 0 2 ).
  • C2C12 cells were passaged by the method (2) were plated IX 10 7 cells in 75cm flask was added 5% Umachi supernatants containing DMEM20ml. While observing the state of the cells, the medium was changed once or twice a week.
  • Bone marrow is collected aseptically from the femur of a mouse, seeded with IX 10 7 nucleated cells per 3.5 cm fibrin-coated dish, and a growth medium for mesenchymal stem cells (PT -3001) 3ml was added and the medium was changed once / week.
  • Rat cardiomyocyte sheeting Figure 1 shows the situation.
  • the first sheet was spread on the culture dish by dropping the culture solution as described in Example 3. Thereafter, the culture solution was aspirated as much as possible and left in an incubator with 37 ° saturated water vapor for 15 minutes. During this time, the first cell sheet adhered to the culture dish with a weak force.
  • the second cell sheet immediately after peeling was aspirated with a 10 ml pipette together with the culture solution, and dropped onto the first cell sheet fixed on the culture dish.
  • the second sheet is made into the first sheet by gently dripping a new culture solution onto the second sheet that is dripped in a contracted state on the stretched first sheet. I was able to extend in a stacked state. Cell sheets were laminated one after another by repeating the same procedure.
  • rat myocardial sheets Two layers of rat myocardial sheets were transplanted subcutaneously into 5-week-old nude rats, and one week later, the skin was cut open and the myocardial sheets (Fig. 5) were observed. The rhythmic contraction of the myocardial sheet was confirmed macroscopically.
  • rat myocardial sheet In vitro, the tissue of rat myocardial sheet was immunostained two days after preparation of rat cardiac muscle sheet, actin, which is a typical contractile protein of cardiomyocytes, and connexin 43, which is a constituent protein of Gap junction. The result is shown in FIG.
  • actin which is a typical contractile protein of cardiomyocytes
  • connexin 43 which is a constituent protein of Gap junction
  • cardiomyocyte orientation was formed in the in vivo model compared to the in vitro model.
  • microvessels infiltrated between the transplanted myocardial sheets to supply blood flow.
  • Tiseal (containing human fibrinogen, thrombin, calcium chloride, caprotinin) was purchased from Baxter. Dilute human fibrinogen 90mg, human albumin 20mg, thrombin 0.4U, calcium chloride dihydrate 0.59mg, aprotinin 3000U into 15ml of physiological saline, 0.3m 1 was applied to a 35 dragon culture dish. After about 2 hours, a culture dish having a surface coated with fipurin polymer could be obtained. This culture dish can be stored aseptically at 4 ° C for about 1 month.
  • cardiomyocytes were obtained from the ventricular muscle of 1-day-old neonatal Wistar rats (Kodama H, Fukuda K, Pan J et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, activates the JAK / STAT pathway in rat cardiomyocytes. Circ Res. 1997; 81: 656-663.).
  • the obtained cardiomyocytes were seeded at a density of (2.8 X lOVcm 2 ) on a culture dish coated with fipurin.
  • a cardiomyocyte sheet could be obtained (Fig. 9D, H).
  • the contracted myocardial cell sheet was stretched by floating in the culture medium (Fig. 9E, 1), and then cut into a square shape.
  • two cardiomyocyte sheets were partially overlapped (Fig. 9F, J), and the previous method (Murata M, Fukuda K, Ishida H et al.
  • Leukemia inhibitory factor a potent cardiac hypertrophic cytokine, enhances L-type Ca2 + current and [Ca2 +] i transient in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol.
  • Co-culture was continued for 3 days on a culture dish coated with laminin.
  • Immunohistochemical staining was performed using anti-fibrin antibody (Monosan, Netherland), anti-actinin antibody (Sigma), and connexin 43 antibody (Sigma) as described above (Agbulut O, Menot ML, Li Z et al Temporal patterns of Done marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2003; 58: 451459.). These samples were subjected to secondary staining with Alexa 488-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes) or TRITC-labeled anti-rabbit IgG antibody (Dako).
  • the propagation of directional action potentials was recorded by an optical mapping system using a cell membrane potential sensitive dye di4-ANEPPS (Molecular probes), and the action potential propagation between two superposed myocardial sheets was evaluated.
  • Action potentials were recorded under autonomic pulsation and under intense basing with a bipolar silver chloride electrode. ⁇ 5 ⁇ even ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ (Koura T, Hara M, Takeuchi S et al. Anisotropic conduction properties in canine atria analyzed by high-resolution optical maDping: preferential direction of conduction block changes from longitudinal to transverse with increasing age Circulation. 2002; 105: 2092-2098)) and processed by an original analysis program created using Igor Pro software (Waveme tronics). result
  • Fig. 11 the ideal number of days from the start of primary culture of cardiomyocytes to the preparation of myocardial sheets was examined (Fig. 11).
  • the diameter of the obtained myocardial sheet gradually extended depending on the period from the primary culture to the time of sheet preparation due to the increase in cell density or the mechanism of cell extension (FIG. 11B).
  • FIG. 11B the proportion of myocardial sheets produced in different periods from the primary culture, which showed autonomous pulsation when the culture was continued for 3 days after the sheet was produced.
  • the number of days (PX) from primary culture to sheet preparation had no effect on the resumption rate of the autonomic pulsation of the myocardial sheet.
  • myocardial sheet preparation was set on the 4th day from the primary culture (P4), and it was observed whether autonomic pulsation was observed when the culture was continued after the sheet preparation. A significant increase in the rate of appearance of autonomous pulsations was observed from the 2nd eye.
  • S6 100% of myocardial sheets showed autonomous pulsations (6 days SX; Fig. 11C, D).
  • the rate of rhythmic contraction started to increase from S2 and reached 100% at S5 (FIG.
  • Fig. 11F shows the results of observing the pulsation cycle (heart rate) of the myocardial sheet showing autonomous contraction over time after the myocardial sheet was prepared. Based on these results, we used the myocardial sheet this time We decided to use a P4-S3 myocardial sheet for the air-physiological analysis.
  • FIG. 15 shows a fluorescent immunostained image of the P4-S3 myocardial sheet.
  • a clear striated structure is observed in the cardiomyocytes.
  • Cx43 is present at the junction between cardiomyocytes.
  • the thickness of the two stratified myocardial sheets was about 15 ⁇ 2 m. The two sheets were completely joined and it was impossible to determine the boundary between the two sheets.
  • FIG. 16D A myocardial sheet layered in three layers was transplanted subcutaneously into a nude rat and observed 14 days later, showing strong periodic contraction (Fig. 16). Transfer for HE staining and Azan staining The transplanted myocardial sheet was shown to be covered from above and below by connective tissue derived from the host (Figs. 16B and C). The thickness of the myocardial sheet was 102 ⁇ 11 m, which was thicker than when the three-layer cardiomyocyte sheet was continuously cultured in vitro. In observation with a confocal laser microscope, the size of each cardiomyocyte was larger than in the case of vi tro. Furthermore, abundant angiogenesis was observed in the transplanted myocardial sheet (FIG. 16D).
  • cell sheet engineering Since the production of a cell sheet using a sensitive culture dish coated with PIAAm was reported, cell sheet engineering has been developed as one of two-dimensional or three-dimensional tissue engineering techniques in various organs. As a result, cell sheet engineering has now become an important part of the field of regenerative medicine. So far, it has been reported that cell sheets using vascular endothelial cells, hepatocytes, renal epithelial cells, corneal cells, etc. were prepared using temperature-sensitive culture dishes (Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A et al. Cell). sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials. 2003; 24: 2309-2316.).
  • the technique reported by the present inventors has several characteristics. One is that it does not require special equipment, and it is possible to easily produce a cell sheet by using easily available fipurin. Therefore, it is possible to produce various cell sheets of ideal size and shape without the need for special procedures.
  • the second feature is that all types of adherent cells can be used. That's it. This is because normal cell culture dishes show extremely good adhesion to fibrin-coated culture dishes even if they do not adhere well to fibronectin-coated culture dishes.
  • the third feature is that cell sheets can be made quickly. When this method was first developed, there was a concern that the cell structure of the myocardial sheet could be destroyed when cells were collected into a sheet with a cell scraper.
  • Plasmin is well known as an enzyme that is secreted from the liver in vivo and has a strong proteolytic action (Ritchie DG, Levy BA, Adams MA et al. Regulation of fibrinogen synthesis by plasmin-derived fragments of fibrinogen and fibrin: an indirect feedback pathway.? roc Natl Acad Sci US A. 1982; 79: 1530-1534.). Therefore, even if there is residual fiplin in the myocardial sheet when the cell sheet is detached from the culture dish, it is considered that the residual fibrin disappears due to plasmin in vivo after transplantation. Based on the above results, the technology for producing various cell sheets using fibrin-coated culture dishes is considered to be a practical and simple technique in cardiomyocyte sheet engineering.
  • the action potential spreads and communicates well within or between myocardial sheets. Is required.
  • the optical mapping system was considered to be extremely useful as a means of examining the spread of the action potential in detail. Two myocardial sheaths that were confirmed to perform fully synchronized contraction under a microscope were also able to form good electrical connections at their joints by analysis using optical mapping syst em. It was shown that the action potential spread propagated in a detour through some areas.
  • a corneal epithelial cell sheet was prepared on a fibrin sheet coated on a tissue culture dish (IWAKI) by the following procedure.
  • DMEM + FCS (+) in which 3T3 cells are cultured is transferred to 2 ml SHEM (666 KIU / ml Change to tinin addition).
  • Figure 17 shows the appearance of a rabbit corneal epithelial cell cultured on a fibrin sheet observed with an optical microscope (X100 magnification).
  • Fig. 18 shows a photograph of the cultured epithelial sheet peeled off by a scraper. From rabbit corneal epithelial cells cultured on fibrin cough, a thick epithelial sheet could be produced by 3T3 co-culture and air lift.
  • An oral mucosal epithelial cell sheet was prepared on a fibrin sheet coated on a tissue culture dish (IWAKI) by the following procedure.
  • Figure 19 shows the observation of the rabbit mucosal epithelial cells cultured on the fibrin sheet with an optical microscope (X 100X).
  • X 100X A photograph of the cultured epithelial sheet peeled with a scraper is shown in FIG.
  • Thick epithelial sheets could be prepared from rabbit oral mucosal epithelial cells cultured on fibrin sheets by performing 3T3 co-culture and air f i t.
  • the epithelial sheet was embedded by Amex method according to the following procedure.
  • Paraffin sections prepared by Amex embedding were immunostained using the following procedure for samples of rabbit corneal tissue, oral mucosal tissue, cultured corneal epithelium, and cultured oral mucosal epithelium.
  • Figure 21 shows the immunostaining (AE5) of the rabbit corneal epithelial tissue and the oral mucosal epithelial tissue.
  • Blue Nuclear staining (DAPI).
  • Green AE5 staining (keratin 3/12).
  • Figure 22 shows immunostaining (AE5) of rabbit cornea cultured epithelial cells and oral mucosa cultured epithelial cells.
  • AE5 immunostaining
  • the corneal epithelium was stratified and stained with keratin 3/12 (FIGS. 22B and D). Although stratification was observed in the oral mucosal epithelium, keratin 3/12 was stained only slightly.
  • the rabbit corneal epithelium and oral mucosa epithelium cultured on the fibrin sheet were stratified and expressed keratin, indicating that a cultured epithelium having characteristics close to that of normal tissue can be produced.
  • an analysis model for various pathological conditions for example, cardiac arrhythmia
  • tissue transplantation can be performed at a clinical level such as regenerative medicine. It becomes possible.
  • a biological activity test of a drug can be performed, so that candidate substances such as pharmaceuticals and agricultural chemicals having a desired biological activity are selected.

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Abstract

表面がフィブリンでコーティングされている支持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、細胞底面のフィブリンが分解されるのに十分な時間培養を継続した後、培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを含む、細胞シートの製造方法。表面がフィブリンでコーティングされている細胞シート作製用支持体。細胞シートを作製するための支持体の表面をフィブリンでコーティングするための組成物であって、フィブリノーゲン及びトロンビンを含むことを特徴とする前記組成物。市販され、安全性も確認されている身近な材料でコーティングした支持体を用い、簡便な操作で細胞シートを製造できる。

Description

明 細 書 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、 細胞シ 一卜作製用支持体及び細胞シートの製造方法 技術分野
本発明は、 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組 成物、 細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法に関する。 背景技術
著しい機能不全に陥った心臓に対し、 ドナー不足を抱える心臓移植に変わる 治療法として、 様々な幹細胞を利用した細胞移植が試みられてきた。 近年にな りこうした細胞移植から体外で心筋組織を 3次元的に構築した上で移植を行う 組織移植の手法が盛んに開発されるようになった。 例えば、 電子線を用いてポ リ (N—イソプロピルアクリルアミド) (「PIAAm」 と略記される) を市販のポ リスチレン培養皿表面に塗布した温度感応性培養皿を用いることによって各種 の細胞シートを作製することに成功し、 中でも心筋細胞に関しては、 こうして 作製した心筋シー卜を積層化することにより移植片として利用可能な心筋組織 塊を開発したことがすでに報告されている (特開 2003 - 38170号公報、 国際公開 01/068799号パンフレツト、 Shimizu et. A1. : Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation techni ue and temperature-responsive cell culture surface : Circ Res. 2002; 90:e40_e48)。 こうして作製された心筋組織塊は in vitroお よび in vivoで正常の心筋組織と同様の電気活動を行うことが確認されている。 各種の組織に対する初代培養、 特に心筋細胞の培養に関しては、 その方法に 於いて各施設間により多少の相違が見られる。 しかるに上記の温度感応性培養 皿を使用した細胞シートの作製法は、 本特殊培養皿での培養に最適となる様に 厳格な方法で初代培養を行った際には比較的安定して細胞シートを作製するこ とが可能であるが、 各施設で慣例的に行われてきた方法をそのまま適用した際 には細胞のシート化は困難であった。
本発明は、 市販され、 安全性も確認されている身近な材料でコーティングし た支持体を用い、 簡便な操作で細胞シートを製造できる方法を提供することを 目的とする。
また、 本発明は、 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするた めの組成物を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 細胞シートの製造に適した支持体を提供することも目的 とする。 発明の開示
本発明者らは、 ほとんどの細胞により分解されるフイブリン糊をあらかじめ 薄くコーティングした培養皿で細胞を数日間培養すると、 細胞と培養皿表面と の間のフイブリンが消失して細胞がシ一ト状に結合したまま宙づり状態となる ことを発見した。 この状態の細胞シートをスクレイパーで剥離して回収するこ とにより、 安定した確率で細胞シートを作製する手法を確立した。 本発明はこ れらの知見により完成された。
本発明の要旨は以下の通りである。
( 1 ) 細胞シートを作製するための支持体の表面をフィプリンでコ一ティン グするための組成物であって、 フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むことを 特徴とする前記組成物。
( 2 ) 表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シ一ト作製用支持体。 ( 3 ) 表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を 飽和状態になるまで培養し、 細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時 間培養を継続した後、 培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離すること を含む、 細胞シー.卜の製造方法。
( 4 ) 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、 (3 ) 記 載の方法。
( 5 ) 細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、 (3 ) 又は (4 ) に記載の方法。
本発明により、 各施設がこれまで行ってきた細胞の初代培養の方法を変更す ることなく、 同様の初代培養を行うことで、 様々な細胞によるシートを作製す ることが可能となり、 その成功率も安定している。
また、 本発明により、 PIAAmをコーティングした高価な特殊培養皿を用いず とも、 巿販のフイブリン糊を用いることで、 即座にかつ大量に細胞シートを作 製することができる。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願、 特願 2003 - 328340 号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ラット心筋細胞のシート化の様子を示す。
図 2は、 C2C 12細胞のシート化の様子を示す。
図 3は、 成熟骨格筋細胞のシート化の様子を示す.。
図 4は、 心筋細胞シートの心電図を示す。
図 5は、 皮膚に移植したラット心筋細胞シートの状態を示す。
図 6は、 in vi troにおけるシ一ト化後 2 日目のラット心筋シートのァクチ二 ンおよびコネキシン 43の免疫染色の結果を示す。 図 7は、 ヌードラット皮下へ移植後 7日目のラット心筋細胞シートの HE染色 の結果を示す。
図 8は、 ヌードラット皮下へ移植後 7 日目のラット心筋細胞シートのァクチ ニンおよびコネキシン 43の免疫染色の結果を示す。
図 9は、 フイブリンポリマーでコートされた皿を用いた心筋細胞シートの機 構及び操作の代表的スキームである。 操作は、 A→B→C→D→E→Fの順番で行つ た。
初代培養新生児ラット心筋細胞をフイブリンポリマーでコートされた皿の上 に広げた(A, B, G)。 4 日目に、 フイブリンポリマーは、 心筋細胞から分泌され た種々のプロテアーゼにより分解した(C)。 心筋細胞シート(myocardi al ce l l shee t s, 以下、 「MCS」 と記すこともある)をセルスクレイパーで引き裂かないよ うに、 細胞をゆっくりと端から皿の中央に向かって取り除いたところ(D, E)、 縮んだ MCSが得られた(H)。 縮んだシートに培養液を数滴垂らすと、 シートが広 がった(E, 1)。 平らになった MCS の端をメスで切り取って正方形にした。 いく つかの実験において、 2枚の MCSを 2 mm幅のマージンで重ね合わせ、 ラミニン でコートされた培養皿の上で共培養した(F, J)。
図 10は、 MCSの組織学的解析結果を示す。
(A) MCSの作製と組織学的解析のプロトコール。 (B- E, H, I) MCSの H&E染色。 (F, G, J, K) MCSの免疫蛍光染色。 赤: F-ァクチン、 緑:フイブリン、 青: T0T0- 3 により染色された細胞核。 プロトコールとスケールバーを図中に挿入して示し た。
図 11は、 MCSの性質を示す。
(A) PX- SOの日数のサンプルにおける、 MCS作製の成功率。 (B) PX-SOサンプル における MCSの直径。 (C) PX- S3の日数のサンプルを用いて作製した MCSが自律 拍動を示す百分率。 (D) P4-SXの日数のサンプルにおける自律拍動シートの百分 率。 (E) P4-SXの日数のサンプルにおける人エペーシングを獲得した MCSの百分 率。 (F) P4- SXの日数のサンプルにおける拍動周期。
図 12は、 2枚の重ね合わせた MCSにおける電気的活動を解析する目的で 1対 の接触させた双極電極を用いて記録した心電図(ECG)および op t i cal mapp ingに より記録した活動電位の伝播の様子である。
(A) 2枚の重ね合わせた MCS の模式図及び接触させた双極電極の位置。 (B) 2 枚の重ね合わせた MCSの顕微鏡観察像。 (C)完全な同期化を示す各 MCSから得ら れた細胞外電位。 (D) op t i cal mapp ingにより観察した活動電位の伝播の様子を 等時線を用いて示した。 各等時線の間隔は 35ミリ秒である。 シート Aの左下部 から発生した活動電位は、 電気的な興奮を示さない接合部の下半分を迂回し、 接合部の上方の限局した領域を通って対側のシート Bへ伝播した。 (E)興奮波の 先頭をトレースして活動電位が進行してゆく様子を示した。 ((D)の矢じりを伴 つた黒の曲線)。
図 13は、 部分的に重ねた 2枚の MCSの共培養を開始後 1日目における、 重ね 合わせた MCSの活動電位の伝播の様子を op t i cal mapp ingを用いて観察した結 果を示す。
1日目における代表的なデ一夕。 (A)位相差顕微鏡による観察像。 (B-D)それ ぞれ、 シート Aの左端でのベーシング後 14、 108及び 164ミリ秒で得られた活 動電位の観察像。シート Bの限局的な捕捉が観察できることに注意されたい(矢 印を見よ)。 (E) MCSの断面模式図及びべ一シング部位。 (F)活動電位マップ。 こ こでは、 各等時線の間隔は 7 ミリ秒である。 接合部の左端で等時線が混みあつ ており、 このあたりから伝導遅延が始まっている事を示唆している。 活動電位 の伝播は接合部の末端で遮断された。 (G)興奮波の先頭に沿ってィンパルスが 次々と伝播していく様子 ((F)の矢じりを伴った赤の曲線)。 (H)興奮波の先頭に 沿った任意のボイントにおける活動電位のトレースを重ね合わせた。 記号は、 活動電位が記録された筋細胞の位置に対応する。
図 14は、 3日目における、 重ね合わせた MCSの活動電位の伝播及び電気的結 合の様子を opt ical mapp ingを用いて観察した結果を示す。
3日目における代表的なデ一夕。 (A)位相差顕微鏡による観察像。 (B- D)シ一 ト Aの左端でのぺ一シング後 14、 84及び 150ミリ秒で得られた opt ical mapp ing 像。(E) MCSの断面模式図及びべ一シング部位。(F)計算された活動電位マップ(大 きさは図 11Fと同じ) は、 活動電位の伝播が 2枚の MCSの間で遅延がなく非常 にスムーズに伝わっている事を示唆した。 (G)興奮波の先頭が次々と伝播してい く様子は、 興奮波の進行に遅延が無く 2枚の MCS の間でタイトな電気伝達が形 成されていることを示唆した。 (H) 興奮波の先頭に沿った任意のポイントにお ける活動電位のトレースを重ね合わせた。
図 15は、 in vi troでの 2枚の心筋細胞シート間で良好な電気的結合が形成さ れる組織学的根拠を示す。
重ね合わせた MCS ( 3日目) に対して免疫組織染色を行った検体をレーザ一共 焦点顕微鏡で観察した結果。 MCSは、 抗ァクチニン (緑)、 抗コネキシン 43 (赤) 抗体及び T0T03 による核染色で三重染色を行った。 (A)上方より観察したもの。 (B)側面を観察したもの。 (C)高倍率で上方より観察したもの。 心筋細胞が密に 配置し、 コネキシン 43は細胞の接合部に明らかに存在していることに注意され たい。
図 16は、 in vivoにおける 3層心筋細胞シートの移植の様子を示す。
3層の MCS をヌードラットの皮下組織に移植し、 サンプルを 1 4日目に観察 した。 (A)移植領域 (黒の点線) は周期的な自律拍動を示した (200 bpm)。 (B) 3層 MCSグラフトの断面の H&E染色。 Sk:骨格筋、 Ct :結合組織、 Cs :移植された 3層の MCS。 (C)同一検体のァザン染色。 (D)高い倍率の断面図。 移植された MCS 中に微小血管が見られることに注意されたい。 * :微小血管。 (E)図 13 に記載し た、 移植された 3層の MCS の 3重染色。 移植された心筋細胞はよく組織化され た横紋構造を示し、 この横紋構造は同一方向を向く配向性を示すことに注意さ れたい。
図 17は、 フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮細胞を光学顕微鏡で 観察した結果を示す (倍率 100倍)。
図 18は、 スクレイパーで剥がしたゥサギ角膜培養上皮細胞シートを示す。 図 19は、 フィプリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細胞を光学顕微 鏡で観察した結果を示す (倍率 100倍)。
図、 20は、スクレイパーで剥がしたゥサギ口腔粘膜培養上皮細胞シートを示す。 図 21は、 ポジティブコントロールとしてゥサギ角膜と口腔粘膜上皮のケラチ ン 3 / 1 2を染色した結果を示す。
(A) 角膜上皮の核染像
(B) 角膜上皮の核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像
(0 口腔粘膜の核染像
(D) 口腔粘膜の核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像
図 22は、 ゥサギ角膜上皮細胞および口腔粘膜上皮細胞を用いて作成した細胞 シートの免疫染色を示す。
(A) 角膜上皮細胞シー卜の核染像
(B) 角膜上皮細胞シートの核およびケラチン 3 Z 1 2の染色像
(0 口腔粘膜上皮細胞シ一卜の核染像
(D) 口腔粘膜上皮細胞シートの核およびケラチン 3 1 2の染色像
培養上皮シートにおいて、 角膜上皮は重層化し、 ケラチン 3/ 12で染色された。 口腔粘膜上皮で重層化がみられ、 ケラチン 3/12 の染色はわずかであるが染色 された。 フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮 · 口腔粘膜上皮は重層 化し、 ケラチンを発現していたことから、 正常組織に近い特性を持つ培養上皮 を作成できることが示された。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 細胞シートを作製するための支持体の表面をフイブリンでコーテ ィングするための組成物であって、 フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むこ とを特徴とする前記組成物を提供する。
フイブリンは、 フイブリノーゲンの A a鎖と B 鎖がトロンビンにより特異 的に加水分解され、 フイブリノぺプチド A及び Bを放出して生じる難溶性画分 である。 フィプリンの凝集にあずかる反応基同士が水素結合してポリマーを形 成し、 一定の配列をとつてゲル化する。
フイブリノ一ゲンは、 分子量約 3 4万の糖タンパク質であり、 分子量がそれ ぞれ 6 . 5万 ± 0 . 1万、 5 . 5万、 4 . 7万の A 鎖、 B j8鎖及びァ鎖の 3 種類のサブユニットが対をなし、 互いに S— S結合している。 トロンビンによ り Arg_Gly結合が加水分解され、 A 鎖及び B /3鎖からフイブリノペプチド A と Bを放出してフィプリンに転じる。
トロンビンは、 蛋白質分解酵素 (プロテアーゼ) の一種で、 フイブリノーゲ ンに作用してフイブリンを生成する。 本発明の組成物において、 トロンビンは フィプリノーゲンをフイブリンに変換する触媒として有効な量で存在するとよ い。
フイブリノーゲン及びトロンビンは、 それらを用いて形成するフィプリンコ 一ティング上で細胞を培養して作製する細胞シートがヒ卜に用いられることを 考えると、 ヒト由来のものが好ましいが、 それに限定されるわけではなく、 他 の動物 (例えば、 既に市販されているサル、 ブ夕、 マウス、 ラット、 ヒヒ、 ィ ヌ、 ネコ、 ヒッジ, ゥシなど) 由来のものであってもよい。
フィプリノーゲン及びトロンビンは市販のものを使用することができる。 例 えば、 バクス夕一社のティシールキットを使用することができる。 ティシール キットは、 ヒトフイブリノ一ゲン、 トロンビン、 塩化カルシウム 2水和物、 ァ プロチニンを含有する。
本発明の組成物は、 さらに、 塩化カルシウム (水和物であってもよい)、 アブ ロチニン、 生理食塩水などを含有するとよい。
本発明の組成物 1 6 m 1中の組成の一例を以下に記載する。
フイブリノ一ゲン 45〜180 mg
トロンビン 0. 2〜0. 8 U
塩化カルシウム 2水和物 0. 5〜1. 0 mg
ァプロチニン 1500〜6000 U
生理食塩水 16 ml
上記組成物において、 フイブリノ一ゲンにトロンビンが作用するとフイブリ ンが生成してしまうので、 フイブリノ一ゲンとトロンビンはそれぞれ別の容器 に保存しておき、 使用時に混合するとよい。 フイブリノ一ゲンには、 血清アル ブミン、 ァミノ酢酸、 ァプロチニン、 チロキサポール、 塩化ナトリウム、 クェ ン酸ナトリウムを添加してもよい。 トロンビンには、 血清アルブミン、 ァミノ 酢酸、 塩化ナトリウムを添加してもよい。 カルシウムイオンはフイブリノーゲ ンの加水分解を促進するので、 塩化カルシウム 2水和物もフィプリノーゲンと は別の容器に保存しておき、 使用時に混合するとよい。 例えば、 塩化カルシゥ ム 2水和物は、 使用時にトロンビンを溶解するための液 (以下、 「トロンビン用 溶解液」 という。) に溶解させ、 容器に保存しておくとよい。 また、 ァプロチニ ンはフイブリノ一ゲンの重合を阻害するので、 フイブリノ一ゲンに添加しても よいし、 使用時にフイブリノ一ゲンを溶解するための液 (以下、 「フイブリノ一 ゲン用溶解液」 という。) に溶解させ、 容器に保存しておいてもよい。 上記組成 物の使用方法の一例を以下に説明する。 まず、 ァプロチニンを含有するフイブ リノ一ゲン用溶解液にフイブリノ一ゲンを溶解し、 A液とする。 塩化カルシゥ ム 2水和物を含有するトロンビン用溶解液にトロンビンを溶解し、 B液とする。 A液、 B液及び生理食塩水を混合し、 混合液を細胞シート作製用支持体の表面 に塗布する。
本発明の組成物を用いて、 細胞シ一卜作製用支持体の表面をフイブリンでコ 一ティングすることができる。
本発明は、 表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シ一ト作製用支 持体を提供する。
支持体は、 細胞の培養が可能である限り、 いかなるものであってもよいが、 培養皿、 シャーレ、 6〜9 6穴ゥエル培養皿、 セルデスク LF (SUMILON)などを例 示することができる。 支持体の材質としては、 ガラス、 改質ガラス、 ポリスチ レン、 ポリメチルメタクリレート、 セラミックス類などを例示することができ るが、 これらに限定されるわけではない。
本発明の細胞シート作製用支持体を製造するには、 本発明の組成物を支持体 に塗布してフィプリンの被膜を形成させればよい。 その一例の詳細を以下に説 明する。
まず、 フイブリノ一ゲン、 トロンビン、 塩化カルシウム 2水和物、 ァプロチ ニン、 生理食塩水を混合し、 混合液を支持体の表面に塗布する。 適当な時間 (通 常、 1〜3時間) 室温で放置すると、 フイブリンが形成される。 これを細胞シー ト作製用支持体として使用するまで、無菌条件下、 4でで保存しておくとよい。 本発明は、 表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細 胞を飽和状態になるまで培養し、 細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分 な時間培養を継続した後、 培養した細胞を支持体表面からシ一ト状に剥離する ことを含む、 細胞シートの製造方法を提供する。 培養皿上で隙間無く飽和状態 まで増殖した細胞を剥がすことにより、 膜状のシートを得ることが出来る。 本 明細書において、 「飽和状態」 とは、 細胞が隙間無く並んだ状態をいい、 これは 顕微鏡で観察することができる。
培養する細胞としては、 心筋細胞、 骨格筋芽細胞、 成熟骨格筋細胞、 平滑筋 細胞、 骨髄間質細胞、 角膜上皮細胞、 口腔粘膜上皮細胞、 皮膚細胞などを例示 することができるが、 これらに限定されるわけではない。 これらの細胞を培養 皿上で飽和状態にするに当たり、 単一種類の細胞のみを敷き詰める事による方 法と、 複数種類の細胞を同時に敷き詰める方法がある。 単一種類の細胞を飽和 状態にする方法の中にも、 増殖能を持ったモノクローナルな細胞を培養皿上に 始めは少数蒔き飽和状態になるまで増殖させる方法と、 増殖能の低い細胞でも 始めからポリクローナルな細胞を多数蒔き培養皿底面に接着した直後に飽和状 態にする方法がある。 前者の例としては、 マウス骨格筋芽細胞由来の細胞株
C2C12 細胞や CMG細胞の様な不死化した細胞株を少数蒔いて培養皿上で増殖さ せて飽和状態になるのを待つ方法がある。 後者の例としては心筋、 骨格筋、 平 滑筋、 骨髄などからそれぞれ心筋細胞、 骨格筋芽細胞、 骨髄間質細胞などを初 代培養の手法で採取し、 セルソー夕一、 パ一コール、 接着分離法などを用いて 細胞を選択収集し純度を上げた後に十分量を培養皿に蒔く方法がある。 複数種 類の細胞を飽和状態にする方法の例としては、 心筋細胞や骨格筋細胞でシート を作製する際に線維芽細胞を混合すると仮に心筋細胞や骨格筋細胞の数が不十 分であっても、 心筋細胞同士、 骨格筋細胞同士の隙間に増殖能の高い線維芽細 胞が入り込み全体として培養皿の底面を全ていずれかの細胞で覆い飽和状態に することが出来る。 こうして十分量の採取が困難でかつ増殖能の低い細胞によ つても、 線維芽細胞などのつなぎとなる細胞を共培養することにより容易にシ —トを作製することが可能となる。 この際つなぎに使う細胞としては、 線維芽 細胞のほか平滑筋細胞、 内皮細胞などが使用可能と考えられ、 つなぎに用いる 細胞を変えることにより、 用途に応じて作製される細胞シートの強度や伸縮性 を変えることが可能である。
細胞は、 ヒト由来のもの、 ヒト以外の動物 (例えば、 サル、 ブタ、 マウス、 ラット、 ヒヒ、 ィヌ、 ネコ、 ヒッジ, ゥシなど) 由来のものであってもよい。 細胞は、 動物などの供給源から直接採取したものであっても、 株化された培養 細胞あるいは株化されていない培養細胞であってもよい。
細胞シートを製造するには、 表面がフィプリンでコ一ティングされている支 持体の表面上で細胞を飽和状態になるまで培養し、 細胞底面のフィプリンが分 解されるのに十分な時間培養を継続した後、 培養した細胞を支持体表面からシ ート状に剥離すればよい。 細胞の培養は、 表面がフイブリンでコーティングさ れている支持体の表面上で行なう限り、 いかなる方法及び条件下で行なっても よく、 細胞が飽和状態となり、 かつ支持体表面から細胞がシート状に剥離でき る程度にフイブリンが分解されるまで継続すればよい。 また、 細胞をシート化 するまでに長期間培養する必要がある際には、 シート化を行う数日前まで培養 液に適当量のァプロチニンを加えることにより、 必要な日数までフィプリンを 溶解させることなく培養を延長することが出来る。 通常、 細胞が飽和状態にな るまで培地で培養し、 その後ァプロチニンを含まない培養液で 3〜4日培養を 継続する。 この間に細胞底面のフィプリンは培養細胞により自然に分解される が、 その際プラスミンなどのフィプリンを分解する物質を培養液に添加するこ とにより細胞底面のフィプリンが分解する速度を意図的に調節することも可能 である。 次いで、 培養液を吸引し、 スクレイパーなどの剥離手段を用いて支持 体から膜状の細胞シートを剥離するとよい。細胞シートを剥離し終わった後に、 しわの寄った細胞シートに新たな培養液を滴下することによって、 細胞シート を伸展することができる。
剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化してもよい。 細胞シートを積層 化する手法の一例を以下に説明する。 培養皿上で伸展させた 1枚の細胞シートから培養液をさらに吸引し、 3 7 °C 飽和水蒸気のインキュベーターに適当な時間 (例えば、 1 5〜3 0分間) 放置 する。 この間に 1枚目の細胞シートは培養皿上に接着する。 次に剥離した直後 の 2枚目の細胞シートを培養液と共にピペットで吸引し、 培養皿上に固定され た 1枚目の細胞シートの上に滴下する。 伸展した 1枚目のシートの上に縮んだ 状態で滴下された 2枚目のシートに、 さらに新たな培養液をゆっくり滴下する ことによって 2枚目のシートを 1枚目のシートに重ねた状態で伸展することが できる。 同様の手技を繰り返して細胞シートを次々積層化することができる。 本発明の手法を用いて各種の細胞をシー卜化し、 またシートを積層化するこ とにより、 様々な臓器に対して in vi troでの組織塊構築が可能となり、 こうし て作製した組織塊を用いることによつて細胞レベルから組織レベルでの in vi troでの解析手法が確立できる。
本発明の方法により製造された細胞シートは、 再生医療又は薬剤の生物学的 活性試験に用いることができる。
再生医療に用いる細胞シートとしては、 心筋細胞シート、 角膜上皮細胞シ一 ト、 口腔粘膜上皮細胞シート、 皮膚細胞シート、 などを挙げることができる。 心筋細胞シートは、心筋梗塞や各種の心筋炎、心筋症などにより生じた心不全、 不整脈などの治療や心筋移植用材料として用いることができる。 角膜上皮細胞 シート及び口腔粘膜上皮細胞シートは、 角膜移植用材料として用いることがで きる。 皮膚細胞シートは、 熱傷、 外傷などによる創傷の治療などに用いること ができる。 また線維芽細胞シートによる創傷の治癒を促進する治療法などの利 用も可能と考えられる。
薬剤の生物学的活性試験としては、 薬剤の薬理活性試験、 薬剤の毒性試験、 薬剤の結合活性試験などを挙げることができる。 薬剤の結合活性としては、 リ ガンドー受容体の結合活性、 抗体一抗原の結合活性などを例示することができ る。 これまで行われていたような、 細胞培養の培養液に各種の薬物を添加し細 胞の変化を検討する方法に比べ、 細胞シートの培養液に各種の薬物を添加して 細胞シートへの影響を検討した場合は、 細胞単体への影響のみならず細胞間の 構造、 構築などへの影響を検討する事が可能となり、 薬剤の細胞レベルだけで なく臓器レベルへの影響を検討する事が可能となる。 また、 各種のヒト臓器由 来の細胞シートを免疫不全贓物 (ヌードマウス、 スキッドマウス、 ヌードラッ トなど) に移植し、 この移植モデル動物に薬剤を投与した後に細胞シートの状 態を検討する事により生体内でのヒト臓器に対する薬剤の影響を予測する事が 可能となる。
本発明の方法により製造された細胞シートを用いた薬剤の生物学的活性試験 により、 所望の生物学的活性を有する医薬、 農薬などの候補物質を選別するこ とができる。 以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、 これらの実施例は、 本発明を説明するためのものであって、 本発明の範囲を限定するものではない。 本実施例で使用した材料の入手先と調製方法は以下の通りである。
培養皿 (FALCON 35 3001、 直径 3. 5 cm)
ウィスターラット (日本クレア販売)
2 . 5 %トリプシン (GIBC0 15090-046)
コラゲナ一ゼ (SIGMA C - 5138)
DNase I (SIGMA DN-25)
FBS (JRH B iosc i ence)
ペニシリン、 ストレプトマイシン及びアンホテリシン B (GIBCO 15240-062) med ium 199 (ICN Biomed ical s 1023126)
DMEM (GIBCO 12100-046) マウス骨格筋芽細胞由来の C2C12 (ATCCより購入)
CMG 細胞 (慶應義塾大学医学部呼吸循環器内科教室においてマウス骨髄細胞に 5 -ァザシチジンを添加し、 心筋へ形質転換ずる能力を獲得し不死化した細胞株 をクロ一ニングして得られた細胞株)
ヌードラット (日本クレア)
ゥサギ由来抗マウスコネキシン抗体 (SIGMA C6219)
マウス由来抗ァクチニン抗体 (SIGMA A7811)
TRITC結合ブ夕由来抗ゥサギ IgG抗体 (DAKO R 0156)
Alexa 488結合ャギ由来マウス IgG抗体 (Molecular Probes A- 11029) ゥサギ (日本白色種(J.W., メス、 約 3Kg , 白石実験動物飼育所))
SHEM
• DMEM/F12: Gibco BRL D-MEM/F12 (1袋 Z1L用) , 12400-016; 15.6g入り ; HEPES含
- NaHC03: Waco (使用時の濃度 2.5g/l)
• Insulin: SIGMA human recombinant expressed in E. col i; 1 -0259; 50mg 入り (使用時の濃度 5 g/ml)
• Human -EGF: Gibco BRL Recombinant Human EGF; 13247-010 ; 100 g入り (使 用時の濃度 lO g/ml)
• Cholera toxin: SIGMA c-3012; lmg入り (使用時の濃度 l ig/ml)
• 0.5% DMS0 : SIGMA DIMETHYL SULF0XIPE; D-2650 ; 5ml x 5本入り
• 15% FCS : 三光純薬(Vitromex) ; VMS1500 ; Lot, F000210802 ; 500 ml DMEM (Gibco)
ゥシ胎児血清 (ニチレイ)
3T3細胞 (American Type Culture Collection)
ァプロチニン (Wako) ゲンタマイシン、 ペニシリン、 アンホテリシン B (Wako)
D i spasel l (合同酒精)
DMEM/F12 (Gibco)
Tryps in (Gibco)
EDTA (Gibco)
Normal Donkey Serum (CHEMICON ; S30-100ML ; Lot, 23031387 ; 100 ml ) BSA (S igma)
DAP I (Sigma)
[実施例 1 ] ヒトフイブリンによる培養皿コーティング
ヒトフイブリノ一ゲン 90 mg, トロンビン 0. 4 ϋ, 塩化カルシウム 2 水和物 0. 59 mg, ァプロチニン 3000 U (以上、 Baxter社製 ティシール 1 mlキットを 使用) ,生理食塩水 16 mlを混合し、 3. 5 cm培養皿 1枚あたりに 0. 3 mlを培養 皿底面に素早く塗布し、 水平を保ったまま 1 時間室温で放置した。 その後、 フ ィプリンが形成され底面のティシール希釈液が固化した培養皿は無菌状態を保 つたまま 4 で保存した。この状態で保存することにより 2ヶ月ほど使用が可能 となる。 ティシール 1 mlのキットより 3. 5 cm培養皿を 40〜50枚作製すること ができた。
[実施例 2 ] フイブリンコ一ティング培養皿での細胞培養
( 1 ) ラット心筋細胞
1日齢のウィスターラット新生仔より心室を摘出し、 0. 03%トリプシン、 0. 03% コラゲナーゼ、 20 g/mL DNase Iで酵素処理を行い, 心室筋細胞を単離し た。 フイブリンコートした 3. 5 cm 培養皿 1枚当たりに、 10% FBSおよびぺニシ リン (50 U/mL) /ストレプトマイシン (50 n g/mL) /アンホテリシン Β (25 ιι g/ml)含有 medium 199/DMEM 2 mlおよび本細胞を 2X106個を注入し、 37° C , 5% (:02のィンキュベータ一で培養を行った。
(2) マウス骨格筋芽細胞由来の C2C12細胞
ATCCより購入したマウス骨格筋芽細胞由来の細胞株 C2C12を、 10%FBS含有 DMEM培地を用いて 5% C02 37度のインキュベーターで培養し、 80% 飽和の状態で 継代を行った。
(3) マウス C2C12細胞由来の成熟骨格筋様細胞
(2)の方法で継代した C2C12細胞を 75cmフラスコに IX 107細胞蒔き、 5%ゥマ血 清含有 DMEM20mlを添加した。 細胞の状態を見ながら、 1〜2回/週培地交換を行つ た。
(4) 骨髄間質細胞
マウスの大腿骨より骨髄を無菌状態で採取し、 3.5 cm フイブリンコートディ ッシュ 1枚当たり IX 107細胞の有核細胞を蒔き、 三光純薬株式会社製間葉系幹細 胞用増殖培地(PT- 3001) 3mlを添加し 1回/週の頻度で培地交換を行った。
[実施例 3] 細胞のシート化
(1) ラット心筋細胞シートの作製
初代培養後 4 日目、 細胞は培養皿底面に飽和状態となって拍動していた。 培 養液を吸引し、 培養皿辺縁部より中心部へ向けてスクレイパーを用いて膜状に 結合した心筋細胞を破れない様にゆつくり剥がした。 すべて剥離し終わった後 に、 しわの寄った細胞シートにゆつくりと新たな培養液を滴下することによつ て細胞シートを培養皿上に伸展することができた。 ラット心筋細胞のシート化 の様子を図 1に示す。
( 2 ) C2C 12細胞、 成熟骨格筋細胞及び骨髄間質細胞による細胞シートの作製 実施例 2の方法でフィプリンコート培養皿上に細胞が飽和状態になるまで培 養を続けた。 その後 3〜4日培養を継続した後、 同様にスクレイパーを用いて膜 状の細胞シートを剥離した。 C2C12細胞及び成熟骨格筋細胞のシート化の様子を それぞれ図 2及び 3に示す。
[実施例 4 ] 細胞シートの多層化
1 枚目のシートを実施例 3に記載のように培養液を滴下することによって培 養皿上に伸展した。 その後培養液を極力吸引し 37度飽和水蒸気のィンキュベー 夕一に 15分放置した。 この間に 1枚目の細胞シートは培養皿上に弱い力で接着 した。 次に剥離した直後の 2枚目の細胞シートを培養液と共に 10 ml ピペット で吸引し、 培養皿上に固定された 1 枚目の細胞シートの上に滴下した。 伸展し た 1枚目のシートの上に縮んだ状態で滴下された 2枚目のシートに、 さらに新 たな培養液をゆつくり滴下することによって 2枚目のシートを 1枚目のシート に重ねた状態で伸展することができた。 同様の手技を繰り返して細胞シートを 次々積層化した。
[実施例 5 ] 心筋細胞シートの機能解析
( 1 ) in vi troでの電気的活動
部分的に重ねた 2枚の心筋細胞シートに 1 mlの培養液を加え、 毎日交換しな がら培養を続けた。 2日後にそれぞれのシートが同じ心拍数で自律収縮してい る様子が顕微鏡下で観察され、 それぞれの心筋シートの両端より測定した心電 図より同じ調律で収縮していることが確認された (図 4 )。 (2) In vivoでの生着
2枚に重ねたラット心筋シートを 5週齢のヌードラットの皮下に移植し、 1週 間後に皮膚を切開し心筋シート (図 5) を観察した。 心筋シートの律動的な収 縮が肉眼的に確認された。
(3) 免疫組織染色による筋腫宿蛋白、 Gap junctionの検討
in vitroにおいてラット心筋シート作製 2日後の組織に対して、 心筋細胞の 代表的な収縮蛋白であるァクチニンと Gap junctionの構成蛋白であるコネキシ ン 43の免疫染色を行った。 結果を図 6に示す。 また in vivoにおいて 2層のラ ット心筋シートを 3週齢のヌ一ドラットの皮下に移植し 7日後に摘出し、 HE染 色及びァクチニンとコネキシン 43の免疫染色を行った。 結果をそれぞれ図 7及 び 8に示す。 In vitro, in vivoにおいてァクチニンおよびコネキシン 43の発 現が良好に維持されていることが確認された。 また in vivoのモデルに関して は in vitroのモデルに比して心筋細胞の配向成されていることがいることが確 認できた。また、 HE色の所見から、移植した心筋シート間に微小血管が浸入し、 血流を供給している様が観察された。
[実施例 6] 心筋細胞シートの作製、 移植、 組織学的解析及び電気活動解析 材料及び方法
•心筋細胞シート作製法
ティシール (ヒトフイブリノ一ゲン、 トロンビン、 塩化カルシウム、 ァプロ チニン含有) をバクスターより購入した。 ヒトフイブリノ一ゲン 90mg、 ヒ トアルブミン 20mg、 トロンビン 0. 4U、 塩化カルシウム二水和物 0. 5 9mg、 ァプロチニン 3000Uを 15mlの生理食塩水に希釈し、 そのうち 0.3m 1を 35龍培養皿に塗布した。 約 2時間後にフィプリン重合体が表面にコートさ れた培養皿を得る事が出来た。この培養皿は 4°Cで 1ケ月程度は無菌的に保存す る事が出来る。 前出の手法で、 生後 1日齢の新生仔ウィスターラットの心室筋 より心筋細胞を得る事が出来た(Kodama H, Fukuda K, Pan J et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, activates the JAK/STAT pathway in rat cardiomyocytes. Circ Res. 1997;81 :656-663.)。得られた心筋細胞をフ ィプリンでコ一ティングされた培養皿上に(2. 8 X lOVcm2)の密度で蒔いた。 (図
9A, B, G) . 重合したフィブリンは培養細胞から分泌される非特異的プロテア一 ゼにより徐々に分解され、 培養開始後 3— 7日後には細胞と培養皿表面との接 触は次第に粗なものとなる (図 9C) 。
従って、 4日目には、 セルスクレイパ一を用いて心筋を培養皿表面から剥が す事が可能となり、 心筋細胞シートを得る事が出来た(図 9D, H)。 縮んだ心筋細 胞シートは培養液の中に浮遊させる事により伸展し(図 9E, 1)、 その後正方形の 形にカットした。 その後の解析のために、 二枚の心筋細胞シートを部分的に重 ね合わせ(図 9F, J)、 前出の手法(Murata M, Fukuda K, Ishida H et al. Leukemia inhibitory factor, a potent cardiac hypertrophic cytokine, enhances L-type Ca2+ current and [Ca2+]i transient in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol.
1999;31 :237-245.)でラミニンをコートした培養皿上で共培養を卜 3 日間継続し た。
•心筋細胞シートグラフトの成獣ラット皮下組織への移植
全てに実験手技は the An imal Care and Use Commi t t ees o f the Ke i o Un ivers i ty and conf ormed to the NIH Gu i de f or the Care and Use of Laborat ory An ima l sの主義に則って行われている。 ジェチルエーテルの吸入後、 ^塩酸プロ 力イン 5- 10mlを雄 F344ヌードラット(8週令, n= 10)の背部皮下に局注し、 皮膚 を切開した。 同部に三層に重ねた心筋細胞シートを移植した。
•組織学的解析
抗フイブリン抗体(Monosan, Netherland) , 抗 ひ-ァクチニン抗体(Sigma)、 コ ネキシン 43抗体(Sigma)を用い、 前出の手法で免疫組織染色を行った(Agbulut O, Menot ML, Li Z et al. Temporal patterns of Done marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin - induced cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2003;58:451459.)。 これらの検体に対してァレキサ 488標識抗マウス IgG抗体 (Molecular Probes)もしくは TRITC標識抗ゥサギ IgG抗体(Dako)による二次染 色を行った。 いくつかの実験においてはァレキサ 594標識ファロィジンによる 染色を行った(Molecular Probes)。 TOTO- 3 (Sigma)により細胞核の染色を行つ た。 染色された検体を共焦点レーザー顕微鏡で観察した(LSM510, Zeiss)
- Optical mapping systemによる心筋シートの電気活動の解析
2枚の心筋細胞シートを 2mmの幅で互いに重ねあわせた。 1組の双極電極を用 いて、 それぞれの心筋シートの両端で細胞外電位を測定した。
細胞膜電位感応性色素 di4-ANEPPS (Molecular probes)を用いた optical maping system によりに方向性の活動電位の伝播を記録し 2枚の重ね合わされ た心筋シート間での活動電位の伝播を評価した。
d i_4_ANEPPSの保存用溶液 20mMを、 20% pluronic F-127 (P-3000, Molecular probes)を含有した DMS0に溶解し、 di- 4- ANEPPSの最終濃度が 10 / Mとなるよ うに培養液に希釈した。 検体を 37° Cのィンキュベ一ター内に 30分間安置した 後、 夕イロ一ド液 (NaCl 140, KC14, MgCl20.5, CaCl21.8, HEPES 5, D - glucose 55 mmol/L, (pH adjusted to 7.4 with NaOH) and 100 mg/L BSA) で培養液を 置換した。 心筋細胞シートの乗った培養皿を恒温灌流装置(37° C)にセットし、 蛍光顕微鏡のステージに乗せた。 (BX50WI, Olympus, Japan)高解像度 CCD カメ ラシステム (MiCAMO l, Bra in Vi s ion, 192 x 128 po int s, 3. 5 msec t ime resolut ion)を用い、 励起波長を 6 1 0 MI以上、 興奮波を 520 nmで検体からの 信号を記録した。 心筋シートはサイトカラシン- D (25 ζ Μ)で不動化した。 自律 拍動下および双極塩化銀電極によるべ一シング剌激下で活動電位を記録した。 得られに ·5—夕【¾刖出 (Koura T, Hara M, Takeuchi S et al. Anisotropic conduction properties in canine atria analyzed by high-resolution optical maDping: preferential direction of conduction block changes from longitudinal to transverse with increasing age. Circulation. 2002; 105:2092 - 2098·) の 方 法 で 、 Igor Pro sof tware (Waveme t r ics)を用いて作製した 独自の解析プログラムにより処理した。 結果
• フィプリンコ一トした培養皿により作製した心筋シートの組織学的解析 本手法により得られた心筋シートを解析するに当たり、 本発明者らは心筋細 胞をフイブリン培養皿上に蒔いてから様々な時間を経過した時点においてセル スクレイパーを用いたシート作製を行った(図 10)。 心筋細胞シートは 3日以降 より培養皿から剥がす事が可能となった。 剥がした後の直径は元の培養皿に比 ベ 38 士 3. 6% (n=30)に収縮した。 通常の培養皿、 ゼラチン、 ラミニン、 フアイ ブロネクチンをコーティングした培養皿上で心筋細胞を培養し、 コンフルェン トになった後同様の手技でセルスクレイパ一を用いて細胞を剥がす試みを行つ たが、 これらのケースではシート状に細胞を回収する事は不可能であった(data not shown)。 本実験において、 本発明者らは初代培養からシート作製までの日 数を PX days、 シート作製からデ一夕採取までの日数を SX daysと定義した。 初 代培養から 4日後に作製した心筋シートの底面には(P4- SO)残存フィプリンが 認められた。 しかし、 初代培養から 6日後に作製した心筋シート(P6 - SO)には残 存フイブリンは認められなかった。
P4-S 1の心筋シート間にはまだ残存したフイブリンが認められた。 しかし、 さ らに培養を継続した 2日後の P4- S3 の心筋シートにおいてはフイブリンは完全 に消失していた。 興味深い事に、 600 KIU/ml のァプロチニンを培養液に加える と相当量のフィプリンが分解されずに心筋シートの間に残存し続ける事が判明 した(H-K)。 これらの実験結果から心筋シート内の残存フィプリンを完全に分解 するためには 6日間を要する事が示唆された。
• フイブリンコート培養皿により作製した心筋シートの性質
まず始めに心筋細胞の初代培養開始から心筋シート作製までの理想的な日数 の検討を行った(図 11)。 心筋シート作製時における成功率は 3日後より上昇し 4日目にピークに達した (成功率 100%, 各 n= 12) (図 11A)。 得られる心筋シー 卜の直径は初代培養からシート作製時までの期間に応じ、 細胞密度の増加ある いは細胞の伸展の機序により徐々に伸張した (図 11B)。 次に初代培養から異な つた期間において作製した心筋シートを、 シート作製後から 3日間培養を継続 した時点で自律拍動を示している比率を調査した。 初代培養からシ一ト作製ま での日数(PX)は心筋シートの自律拍動再開率に対して影響しなかった。 しかし、 心筋シ一ト作製を初代培養から 4日目に設定し(P4)、 シート作製後培養を継続 していった際に自律拍動がいっから認められるかを観察した所、 シート作製後 2曰目より大幅な自律拍動出現率の増加を示し、 さらに 6日目(S6)においては 100 %の心筋シートが自律拍動を示した (6 days SX ; 図 11C, D)。 ベーシング刺 激に対して心筋シートが反応し律動収縮を示すかどうかを調べた所、 律動収縮 を示す割合は S2より増加し始め S5の時点では 100%に達した (図 11E) 。 図 11Fは心筋シートを作製後、 自律収縮を示す心筋シートの拍動周期 (心拍数) を 経時的に観察した結果である。 これらの結果から、 今回心筋シートを用いて電 気生理学的解析を行うに当たり、 P4- S3の心筋シートを用いる事に決定した。
•活動電位の伝播を解析するに当たっての opt ical mapping sys t emと双極電極 を用いた手法との比較
次に心筋シート内での活動電位の伝播の様子を、 また 2枚の心筋シート間で 接合部を通じて活動電位が伝播するかどうかを解析した。 双極電極を接触させ 心筋シートの心電図を記録した結果と、 opt ical mapp ing sys temにより計測さ れた活動電位の記録とを比較した (図 12)。心電図上では Α, Β両方のシートが同 期して自律拍動を行っている様子が記録された。心電図上、 シート Αとシート B の QRS compl exは完全に同期し、 2枚の心筋シートが電気的な結合が確立され ている事が示唆された。 しかし、 予想に反して opt i cal mapp ing sys temによる 活動電位の記録においては、活動電位はシート Aの左下方より右上方へ進行し、 接合部の上部を通じてシート Bへ伝播しシート B内を広がってゆく様子が記録 された。 すなわち、 活動電位は 2枚のシートの接合部においては最短距離を直 線的に伝播しているわけではない事が判明した。 図 12D における矢印上の活動 電位伝導速度はシート間の接合部においても遅延無くスムーズに伝播している 事が示された (図 12E)。 従って心筋シートの活動電位の伝播、 心筋シート同志 の電気的結合の様子を解析するのに際し、 opt ical mapp ing sys temは唯一の有 用性の高い手法である事が判明した。
• 2枚の心筋シート間で電気的結合が確立されてゆく過程
2枚の心筋シートの間において電気的結合がどのように確立されてゆくかを 調査するために、 本発明者らは部分的に重合させた心筋シートにおける活動電 位の伝播の様子を opt i cal map ing sys t emにより解析した。 P4- SIの心筋シー ト間において、 活動電位は一方の心筋シートから他方の心筋シー卜へ伝播しな かった (図 13)。興味深い事にいくつかのケースにおいては(3/ 10)シ一ト Bにお いて部分的な活動電位の捕捉が認められた(arrow in 図 13D)。 活動電位の伝播 の様子を等時線で示したのが図 13F である。 また図中ライン上で、 興奮波の先 頭が進行する際の伝導速度が図 13Gに示されているが、 活動電位の進行は t点 で停止している事がわかる。
これらの実験結果から、 P4-S 1の心筋シートにおいては電気的結合は限局的に 形成されているものの、 2枚のシート間にはまだ安定した電気的結合が確立さ れていない事が示唆される。
一方、 P4- S3の心筋シートにおいては活動電位はシ一ト Aからシート Bに伝導 遅延無く伝播した (図 14) 。 全ての実験検体において、 2枚の心筋シートの 間には良好な電気的結合が形成されており(n= 10/ 10)、 伝導速度の解析において も伝導遅延は認められなかった。 これらの実験結果からは重層化した心筋シー ト間に安定した電気的結合が形成されるためには 3日(S3)以上の共培養期間が 必要と考えられた。
• 2枚の心筋シートの結合に関する組織学的検討 (生体外のモデルにおいて) P4 - S3心筋シートの蛍光免疫染色像を図 15に示す。 心筋細胞内には、 はっき りとした横紋構造が認められる。心筋細胞間の接合部には Cx43が存在している。 心筋細胞同志が接触する事により横紋構造の向きが同じ方向に向く傾向があつ た。 2枚の重層化した心筋シートの厚さは約 15 ± 2 mであった。 2枚のシー トは完全に結合しており、 2枚のシートの境界を判別する事は不可能であった。
• 3層に重ねた心筋シートの生体内移植モデルとその組織学的検討
3層に重層化した心筋シートをヌードラッ卜の皮下に移植し 1 4日後に観察 した所、 力強い周期的な収縮を示した(図 16)。 HE染色およびァザン染色では移 植された心筋シートは宿主由来の結合組織により上下から覆われている事が示 された(図 16B, C)。 心筋シートの厚みは 102 ± 1 1 mであり、 vi troで 3層の心 筋シートの培養を継続した際に比べより厚くなつていた。 共焦点レーザー顕微 鏡による観察では、 1つ 1つの心筋細胞の大きさは vi tro のケースに比べ大き くなっていた。 さらに移植された心筋シート内には豊富な血管新生が認められ た (図 16D)。 これらの血管系は 10- 25 mと、 毛細血管レベルではなく微小血 管レベルの経を有していた。 心筋細胞内の横紋構造はよく発達しており心筋細 胞の分布には同一方向を向く配向が認められた(図 16E)。これらの所見はフイブ リンコート培養皿を用いて作製された心筋シートは、 組織での生着性がよく、 正常心臓に似た組織構造を持ち、 良好な収縮能を有しているものと考えられた。
PIAAm をコートした感応性培養皿を用いて細胞シートを作製する手技が報告 されて以来、 様々な臓器における二次元もしくは三次元の組織工学の手法の一 つとして細胞シート工学が発展してきた。 その結果、 現在では細胞シー卜工学 は再生医療の分野において重要な位置を占める様になつてきた。 これまで温度 感応性培養皿を用いて血管内皮細胞、 肝細胞、 腎上皮細胞、 角膜細胞などによ る細胞シートを作製した報告がなされている(Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A et al. Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstruction. Biomaterials . 2003;24:2309-2316.)。
今回本発明者らが報告した手法はいくつかの特徴を有する。 一つは特別な設 備を必要とせず、 容易に入手可能なフィプリンを用いる事だけで手軽に細胞シ ートの作製が可能となる事である。 従って、 理想的なサイズ、 形の様々な細胞 シートを特別な手技を必要とせずに作製する事が可能となる。 二つ目の特徴は 接着系細胞のあらゆる種類のもので、 細胞シ一卜を作製する事が可能であると いう事である。 なぜならば、 通常の細胞培養皿ゃファイブロネクチンをコート した培養皿に接着しにくい様な細胞でもフイブリンをコートした培養皿には極 めて良好な接着性を示すからである。 3つ目の特徴は細胞シートを素早く作製 する事が可能となった事である。 本手法を開発した当初はセルスクレイパーで 細胞をシート状に回収する際に、 心筋シートの細胞構造が破壌されてしまう可 能性が危惧された。 しかし顕微鏡による観察では明らかな細胞の壊死像などは 観察されなかった。 この理由は、 心筋細胞から分泌される非特異的なタンパク 分解酵素によってフィプリンが分解されてゆくに従って、 細胞と培養皿との接 着が次第に緩くなつてゆくこと、 またわずかに残存したフィプリンが細胞を回 収する際の物理的な刺激から細胞を守るクッションの様な働きをするためでは ないかと予想している。 本発明者らは心筋の初代培養を行ってから合計 7日目 に残存フイブリンは全て消失する事を確認している。 しかし、 この期間に関し ては、 細胞自体が分泌するタンパク分解酵素の性質やコンフルェントとなった 際の細胞密度などによって変動し得るものと考えられる。
生体内において肝臓から分泌され、 強力なタンパク分解作用を有する酵素と してプラスミンがよく知られている(Ritchie DG, Levy BA, Adams MA et al. Regulation of fibrinogen synthesis by plasmin-derived fragments of fibrinogen and fibrin: an indirect feedback pathway.? roc Natl Acad Sci U S A. 1982;79: 1530-1534.)。 従って、 細胞シートを培養皿から剥がした時点において心筋シート内に残存フ ィプリンが存在していたとしても、 移植後は生体内のプラスミンにより残存フ イブリンは消失するものと考えられる。 以上、 今回示した結果からフイブリン をコートした培養皿により各種の細胞シ一トを作製する技術は心筋細胞シ一ト 工学において現実的かつ簡便な手法であると考えられる。
心筋組織工学の分野で有用な移植用グラフ卜として心筋シートを用いるため には、 心筋シート内あるいは心筋シート間での活動電位の広がり、 伝達が良好 であるという事が要求される。 この点に関して、 opt ical mapping sys temは活 動電位の広がりを詳細に検討する手段として極めて有用であると考えられた。 顕微鏡下で完全に同期した収縮を行っている事が確認された 2枚の心筋シー卜 も、 opt ical mapping sys t emを用いた解析により、 その結合部においては良好 な電気的結合が形成された一部の領域を介して、 活動電位の広がりは迂回する 様に伝播している事が示された。 従って心臓に心筋シートを移植した際の宿主 とグラフトとの電気的結合の有無を解析するに当たっては opt ical mapping systemによる電気生理学的な検討が極めて有用であると考えられた。 今回の実 験では、 2枚の心筋シート間で十分な電気的結合が形成されるためには 3日間 を要する事が示された。 同様に、 opt ical mapping systemを用いる事により心 筋シート移植モデルにおいて電気的結合が形成されてゆく過程を検討する実験 が現在進行中である。
結論として、 今回示した心筋シ一卜作製手法および心筋シートの電気生理学 的解析手法は心臓その他の臓器における再生医学の領域において大きな前進を もたらすものになると考えられる。
[実施例 6 ] 細胞のシート化
( 1 ) 角膜上皮細胞シートの作製
以下の手順で、 組織培養皿 (IWAKI) にコートしたフイブリンシート上に角膜 上皮細胞シートを作製した。
1)綿棒でゥサギのデスメと虹彩を擦り取り、 結膜をカツ卜する。
2) 12分割し、 上皮を下にして f ibr inをコートした inner wel l上に置く。
3) 666 ΚΙϋ/mlのァプロチニンを添加した 0. 6 ml SHEMを加える。 上皮が生えて きたら、 SHEM (666 KIU/mlのァプロチニン添加) を 1mlにする。
4) 3T3細胞を培養している DMEM+FCS ( + ) を 2ml SHEM (666 KIU/ml のァプロ チニン添加) に変更する。
5)上皮がコンフルェントになったら (コンフルェントになるまで 1〜 2週間か かる)、 Air liftをおこなう (1週間程度)。 培地は SHEMだが、 ァプロチニンは 添加しない。
6)培養した上皮をスクレイパーで剥がす。
フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察した 様子 (X100倍) を図 1 7に示す。 スクレイパーで剥がした培養上皮シートの写 真を図 1 8に示す。 フイブリンシー卜上に培養したゥサギ角膜上皮細胞からは、 3T3共培養と Air lift を行なうことで厚みのある上皮シートを作製することが できた。
(2) 口腔粘膜上皮細胞シートの作製
以下の手順で、 組織培養皿 (IWAKI) にコートしたフイブリンシート上に口腔 粘膜上皮細胞シートを作製した。
1)ゥサギの口腔粘膜を採取する (2mmx2匪 xlmmを 2箇所採取)。
2)組織を洗浄する(ゲン夕マイシンと抗生剤-抗真菌剤入りの medium で 15分間 x3回 RT、 抗生剤入りの PBS (-) で 15分間 RT)。
3) Dispasen処理をする (37°C 1時間)。
4)上皮を実質から剥がし、 DMEM/F12 + FCS (—) へ入れる。
5) Trypsin- EDTA処理をする (8分間 RT)。
6) 1500rpmで 5分間遠心する (2xl05個/ lml SHEM (666 KIU/mlのァプロチニン 添加) で inner wellへ播く)。
7) 3T3細胞を培養している DMEM + FCS ( + ) を 2ml SHEM (666 KIU/ml のァプロ チニン添加) に変更する。
8)上皮がコンフルェントになったら (コンフルェントになるまで 1〜 2週間か かる)、 Air liftをおこなう (1週間程度)。 培地は SHEMだが、 ァプロチニンは 添加しない。 .
9) 培養した上皮をスクレイパーで剥がす。
フイブリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細胞を光学顕微鏡で観察 した様子 (X 100倍) を図 1 9に示す。 スクレイパーで剥がした培養上皮シート の写真を図 2 0に示す。 フイブリンシート上に培養したゥサギ口腔粘膜上皮細 胞からは、 3T3共培養と Ai r l i f t を行なうことで厚みのある上皮シートを作製 することができた。
( 3 ) フイブリンシート培養の Amex包埋固定法
以下の手順で、 上皮シートを Amex法にて包埋した。
1)上皮シートをメッシュに入れる。
2) 4°Cのアセトンに入れる。
3)アセトンごと- 20°Cに移し、 一昼夜固定する。
4) 4 T:のアセトンに入れ替え、 1 5分浸透させる。
5)室温のアセトンに入れ替え、 1 5分浸透させる。
6)安息香酸メチルに入れ替え、 1 5分浸透させる。 この操作を 2回行う。
7)キシレンに入れ替え、 1 5分浸透させる。 この操作を 2回行う。
8)パラフィンを 1時間浸透させる。 この操作を 3回行う。
9)パラフィンで包埋する。
( 4 ) フイブリンシート培養の免疫染色
ゥサギの角膜組織、 口腔粘膜組織、 培養角膜上皮、 培養口腔粘膜上皮のサン プルにつき、 Amex 包理法で作製したパラフィン切片を以下の手順で免疫染色し た。
1 ) 3¾ H202で 30 分、 室温にて処理する。
2 ) ブロッキング ( 10% Nomal Donkey Serum - 1% BSA - 0. 01M PBS ) を 1 時 間、 室温にて行う。 3 ) 1次抗体 (AE5 : PR0GEN 61807 : 1/1000 )と反応させる。 I sotype cont rol (mouse IgGl : Dako : 1/500 ) 0/N
4 ) 2次抗体 (Donkey ant i Ms IgG 一 FITC 、 Jackson : 711-095-152 : 1/50 ) と 30 分、 室温にて反応させる。
5 ) 核染色 (D0J IND0 : 1 ug/ml DAP I)を 5 分、 室温にて行う。
ゥサギ角膜上皮組織と口腔粘膜上皮組織の免疫染色 (AE5) の様子を図 21に 示す。 Blue : 核染色 (DAPI)。 Green: AE5染色( ケラチン 3/12 )。 ポジティブ コントロールとして角膜と口腔粘膜の上皮のケラチン 3/12を染色したものは、 ともに上皮細胞で染色性が示された (図 21B及び D)。
ゥサギ角膜培養上皮細胞と口腔粘膜培養上皮細胞の免疫染色 (AE5) の様子を 図 22に示す。 培養上皮において、 角膜上皮は重層化し、 ケラチン 3/12で染色 された (図 22B及び D)。 口腔粘膜上皮で重層化はみられたが、 ケラチン 3/12 の染色はわずかであるが染色された。
以上のことから、 フイブリンシート上に培養したゥサギ角膜上皮 · 口腔粘膜 上皮は重層化し、 ケラチンを発現していたことから、 正常組織に近い特性を持 つ培養上皮を作製できることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考とし て本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明の方法で製造された細胞シ一卜を用いることにより、 各種病態 (例え ば、 心筋細胞での不整脈) の解析モデルを作製すること、 再生医療などの臨床 レベルで組織移植をすることが可能となる。 また、 本発明の方法で製造された 細胞シートを用いることにより、 薬剤の生物学的活性試験を行うことができる ので、 所望の生物学的活性を有する医薬、 農薬などの候補物質の選別を行うこ
00請 Zdf/ェ:) d 8C98Z0/S00Z OAV

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 細胞シートを作製するための支持体の表面をフイブリンでコ一ティング するための組成物であって、 フイブリノ一ゲン及びトロンビンを含むことを特 徴とする前記組成物。
2 . 表面がフィプリンでコ一ティングされている細胞シート作製用支持体。
3 . 表面がフィプリンでコ一ティングされている支持体の表面上で細胞を飽 和状態になるまで培養し、 細胞底面のフィプリンが分解されるのに十分な時間 培養を継続した後、 培養した細胞を支持体表面からシート状に剥離することを 含む、 細胞シートの製造方法。
4 . 剥離したシート状の培養細胞をさらに積層化することを含む、 請求項 3 記載の方法。
5 . 細胞シートが再生医療又は薬剤の生物学的活性試験に用いられる、 請求項 3又は 4に記載の方法。
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