JP6797389B1 - 細胞外マトリックス含有組成物及びその製造方法、並びに三次元組織体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]断片化された細胞外マトリックス成分と、断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着した化合物と、を含む、細胞外マトリックス含有組成物。
[2]断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、[1]に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
[3]断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が100nm以上200μm以下である、[1]又は[2]に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
[4]前記化合物が、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも1種である、[1]〜[3]のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
[5]断片化された細胞外マトリックス成分と、断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着可能な化合物と、を接触させる工程を備える、細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
[6]断片化された細胞外マトリックス成分が、細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化することにより得られるものである、[5]に記載の細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
[7]断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、[5]又は[6]に記載の細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
[8]水性媒体中において、[1]〜[4]のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞とを、接触させる第1の工程、及び細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する第2の工程を備える、三次元組織体の製造方法。
[9]第1の工程後、かつ、第2の工程前に、水性媒体中における、断片化された細胞外マトリックス成分と、断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着した化合物と、細胞と、を沈降させる工程を備える、[8]に記載の三次元組織体の製造方法。
[10]第1の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成した後に行われる、[8]又は[9]に記載の三次元組織体の製造方法。
[11]細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む、[8]〜[10]のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
[12]細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および、上皮細胞からなる群より選ばれる一種又は複数種の細胞を含む、[8]〜[11]のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
[13]前記断片化された細胞外マトリックス成分と前記化合物との合計含有量が、断片化された細胞外マトリックス成分、上記化合物及び細胞の合計質量を基準として、10質量%以上90質量%以下である、[8]〜[12]のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
[14]細胞と、[1]〜[4]のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物を含み、前記細胞の少なくとも一部が前記断片化された細胞外マトリックス成分と接触している、三次元組織体。
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、断片化された細胞外マトリックス成分(断片化細胞外マトリックス成分)と、断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着した化合物と、を含む。
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物の製造方法は、断片化された細胞外マトリックス成分と、断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着可能な化合物と、を接触させる工程(接触工程)を備える。接触工程としては、断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と化合物を含有する水性媒体とを混合する、断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に化合物を添加する、等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。また、接触工程には、断片化された細胞外マトリックス成分と化合物とを接触させた後で、一定時間インキュベートする工程が含まれてもよい。
細胞外マトリックス含有組成物は、三次元組織体を形成するための足場材等として好適であるため、本発明の一実施形態において、上述の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤が提供される。
本実施形態に係る三次元組織体は、上述の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞と、を含む。細胞の少なくとも一部が細胞外マトリックス含有組成物中の解繊細胞外マトリックス成分に接触していてよい。接触の一態様として、接着していてもよい。「三次元組織体」とは、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を6mol/l HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように6mol/l HClで適宜希釈した後、200μLを100μLの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは35μL用いる。
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12mol/l HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製する。4mol/l HCl90μLのみのS8(0μg/mL)も準備する。
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属、QuickZyme Biosciences社)に加える。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、水性媒体中において、上述の細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる第1の工程、及び上述の細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する第2の工程を備えている。本実施形態に係る三次元組織体の製造方法において重要な点は、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とが接触する(すなわち第1の工程)前に、断片化細胞外マトリックス成分と化合物とが接触し、化合物が断片化細胞外マトリックス成分に結合又は吸着する点である。これにより、単に細胞培養液に化合物を添加して細胞を培養する場合と比べて、断片化細胞外マトリックス成分に有用な機能を付与又は増強することが可能になる。また、断片化細胞外マトリックス成分に化合物が結合又は吸着しているので、用いる化合物の量を抑制することができるという効果もある。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を、コラーゲン含有量が1質量%となるように超純水に懸濁した。超音波式ホモジナイザーを用いて、4℃の条件下、20秒間のサイクルを10回繰り返して、懸濁液をホモジナイズした。得られた液を孔径35μmのフィルターでろ過して、解繊されたコラーゲン成分(sCMF)を得た。
以下の化合物1〜4を準備した。
化合物1:フルオレセインアミン標識ヒアルロン酸ナトリウム(PGリサーチ,FAHA−H1)
化合物2:フルオレセインアミン標識へパラン硫酸ナトリウム(PGリサーチ,FAHS−P1)
化合物3:フルオレセインアミン標識コンドロイチン硫酸Aナトリウム(PGリサーチ,FACS−A1)
化合物4:ローダミン標識フィブロネクチン(Cytoskelton,Inc.,Rhodamine fibronectin)
化合物1〜4をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、化合物1〜4のいずれかを0.04mg/mlの濃度で含有する溶液を調製した。
化合物1(HA)、化合物2(CS)及び化合物3(HS)それぞれを0.04mg/mlの濃度になるように、PBSで希釈して調製した溶液(それぞれ溶液1〜3という。)を準備した。
1mgのsCMFを1.5mlサンプルチューブ(WATSON, 131−7155C)に入れて、化合物2を含む溶液を1ml加えた(8本作製する)。ROTATOR(TAITEC,RT−50)を用いて、室温で1時間、20rpmの速度で撹拌した。遠心分離器(eppendorf,minispin)で3500rpm、5分間遠心し、それぞれの上清の200μlの蛍光強度を分光蛍光光度計(日本分光, FP−8500)により測定した。得られた蛍光強度を検量線に当てはめて上清の蛍光試薬の濃度を算出した。これをXとする。それぞれの上清をアスピレートし、PBSを1ml加えた。5、20、40、60、120、300、1440、又は5760分後に1つずつ遠心分離器で3500rpm、5分間遠心し、それぞれの上清の200μlの蛍光強度を分光蛍光光度計により測定した。得られた蛍光強度を検量線に当てはめて上清の蛍光試薬の濃度を算出する。これをYとする。吸着安定性指標:(X−Y)/X×100の式より吸着安定性を評価した。図2は、5760分後における試験結果を示す顕微鏡写真である。
5mlの0.04%フィブロネクチン(SIGMA,F2006−5MG)in 50 mM tris−HClに5mgのsCMFを加えて、ROTATOR(TAITEC, RT−50)を用いて、室温で1時間、20rpmの速度で撹拌した。攪拌は、細胞と混ぜる直前に上記撹拌時間が終わるようにした。遠心分離器(eppendorf, minispin)で3500rpmの条件で、5分間遠心した。上清をアスピレートし、300μLの培地を加えた。これらの操作により作製したsCMFをsCMF−FNと呼ぶ。
試験例5と同様にして、三次元組織体を作製した。三次元組織体を用いて株式会社アプライドメディカルサービスにより、CD31の免疫染色とトルイジンブルー染色の切片をそれぞれ作製した。
Claims (14)
- 断片化された細胞外マトリックス成分と、前記断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着した化合物と、を含む、細胞外マトリックス含有組成物。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、請求項1に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が100nm以上200μm以下である、請求項1又は2に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
- 前記化合物が、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
- 断片化された細胞外マトリックス成分と、前記断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着可能な化合物と、を接触させる工程を備える、細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分が、細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化することにより得られるものである、請求項5に記載の細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、請求項5又は6に記載の細胞外マトリックス含有組成物の製造方法。
- 水性媒体中において、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物と、細胞とを、接触させる第1の工程、及び
前記細胞外マトリックス含有組成物が接触した前記細胞を培養する第2の工程を備える、三次元組織体の製造方法。 - 前記第1の工程後、かつ、前記第2の工程前に、前記水性媒体中における、前記断片化された細胞外マトリックス成分と、前記断片化された細胞外マトリックス成分に結合又は吸着した化合物と、前記細胞と、を沈降させる工程を備える、請求項8に記載の三次元組織体の製造方法。
- 前記第1の工程が、水性媒体中で前記細胞の層を形成した後に行われる、請求項8又は9に記載の三次元組織体の製造方法。
- 前記細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
- 前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および、上皮細胞からなる群より選ばれる一種又は複数種の細胞を含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分と前記化合物との合計含有量が、前記断片化された細胞外マトリックス成分、前記化合物及び前記細胞の合計質量を基準として、10質量%以上90質量%以下である、請求項8〜12のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
- 細胞と、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス含有組成物を含み、前記細胞の少なくとも一部が前記断片化された細胞外マトリックス成分と接触している、三次元組織体。
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