WO2021177407A1

WO2021177407A1 - 三次元組織体のヤング率を制御する方法、三次元組織体の製造方法、及び三次元組織体

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Publication number: WO2021177407A1
Application number: PCT/JP2021/008449
Authority: WO
Inventors: 典弥松▲崎▼; 尚子佐々木; 史朗北野; 新司入江
Original assignee: 国立大学法人大阪大学; 凸版印刷株式会社
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2021-09-10
Also published as: EP4095234A4; US20230110381A1; EP4095234A1; CN115298304A; JPWO2021177407A1

Abstract

細胞及び細胞外マトリックスを含む三次元組織体の製造において、細胞外マトリックスの平均径を調整することで、当該三次元組織体のヤング率を制御する方法、を開示する。

Description

三次元組織体のヤング率を制御する方法、三次元組織体の製造方法、及び三次元組織体

　本発明は、三次元組織体のヤング率を制御する方法、三次元組織体の製造方法、及び三次元組織体に関する。

　近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。生体組織を模倣した組織体を作製する際には、生体適合性の高い足場材料を用いることが好ましい。本発明者らはこれまで、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献２）等を提案している。また、本発明者らは、ホモジナイズしたコラーゲンを用いた、従来よりもコラーゲン濃度が高い三次元組織体の作製方法を提案している（特許文献３）。

国際公開第２０１５／０７２１６４号国際公開第２０１６／０２７８５３号国際公開第２０１８／１４３２８６号

　ところで、実際の生体内の組織においては、生体内の部位や、あるいは病変ごとに組織の「硬さ」が異なることが知られている。例えば、がん組織は正常組織と比較して硬い傾向にあることが分かっている。その組織の硬さが臓器や病態の特徴を生む一因となり得ることから、生体組織を模倣した組織体を作製する際には、その本来の硬さを再現することも重要である。

　しかしながら、これまで、再現する目的の組織にあわせて、生体適合性の高い足場材料を用いて製造する組織体の硬さを、所望の硬さに調整する方法について報告はない。例えば、ポリアクリルアミドゲル中で細胞を培養することにより、細胞の生育環境を硬く制御する方法が知られているが（R.W.Tilghman et al., PLoS One, 5(9) e12905 (2010).）、ポリアクリルアミドゲルは生体に存在する物質ではないため、生体組織の模倣という観点から好ましくない。

　そこで、本発明の一側面は、生体適合性の高い足場材料を用いて製造する三次元組織体において、三次元組織体のヤング率を制御する方法を提供することを目的とする。本発明の他の側面は、所望のヤング率を有する三次元組織体の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明の他の側面は、ヤング率が２０ｋＰａ以上の三次元組織体を提供することを目的とする。

　本発明者らは、水性媒体中に、平均径の小さい細胞外マトリックスと、平均径の大きい細胞外マトリックスを同じ濃度で含む組成物を比較すると、平均径の小さい細胞外マトリックスを含む組成物の方が、高いヤング率を示すことを見いだした。

　したがって、本発明は、例えば以下の各発明に関する。
〔１〕　細胞外マトリックスの平均径を調整することで、細胞及び細胞外マトリックスを含む三次元組織体のヤング率を制御する方法。
〔２〕　上記細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　上記細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、〔２〕に記載の方法。
〔４〕　上記細胞外マトリックスが、外因性の断片化細胞外マトリックスを含む、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　上記細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　上記細胞外マトリックスの平均径を２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下に調整することを含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　三次元組織体が、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の細胞外マトリックスに調整することを含む、〔７〕に記載の方法。
〔９〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いる、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の細胞外マトリックスを、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の細胞外マトリックスよりも重量換算で多く用いる、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕　三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径を調整した細胞外マトリックスを準備する工程、
　水性媒体中で上記細胞外マトリックスを細胞と混合して細胞懸濁液を得る工程、
　上記細胞懸濁液をインキュベートする工程を含む、
　三次元組織体の製造方法。
〔１３〕　上記細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕　上記細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕　上記細胞外マトリックスが、外因性の断片化細胞外マトリックスを含む、〔１２〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕　上記細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、〔１２〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕　上記平均径を調整した細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の細胞外マトリックスを含む、〔１２〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕　上記断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体が、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、〔１２〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕　三次元組織体が、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕　上記細胞懸濁液を得る工程と上記細胞懸濁液をインキュベートする工程との間に、上記胞懸濁液に外力を加えて上記細胞および上記細胞外マトリックスとを集積する工程をさらに含む、〔１２〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、〔１２〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕　細胞と、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である細胞外マトリックスとを含み、
　上記細胞の間に上記断片化細胞外マトリックスが配置されており、
　上記細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であり、
　ヤング率が２０ｋＰａ以上である、三次元組織体。
〔２３〕　上記細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔２２〕に記載の三次元組織体。
〔２４〕　上記細胞外マトリックスが、外因性の断片化細胞外マトリックスを含む、〔２２〕又は〔２３〕に記載の三次元組織体。
〔２５〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である細胞外マトリックスの含有率が、三次元組織体の全重量を基準として、５重量％以上９０重量％以下である、〔１９〕～〔２４〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔２６〕　平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の細胞外マトリックスをさらに含む、〔１９〕～〔２５〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔２７〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である細胞外マトリックス及び水性媒体を含む、三次元組織体形成剤であって、三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ以上である、形成剤。

　また、本発明は、例えば以下の各発明に関する。
〔１〕　細胞及び細胞外マトリックスを含む三次元組織体の製造において、断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することで、上記三次元組織体のヤング率を制御する方法。
〔２〕　上記断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　上記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕　上記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、〔３〕に記載の方法。
〔５〕　上記断片化細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　上記断片化細胞外マトリックスの平均径を２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下に調整することを含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　上記断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することが、三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕　上記三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、〔７〕に記載の方法。
〔９〕　上記三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び上記三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することが、
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることを含む、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕　上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスを含む、〔７〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕　上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、〔７〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いる、〔８〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕　三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程、
　水性媒体中で上記細胞外マトリックスを細胞と混合して細胞懸濁液を得る工程、
　上記細胞懸濁液をインキュベートする工程を含む、
　三次元組織体の製造方法。
〔１５〕　上記断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径及び含有量を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程である、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕　上記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔１４〕又は〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕　上記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕　上記断片化細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、〔１４〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕　上記平均径を調整した断片化細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、〔１４〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕　上記断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体が、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、〔１４〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕　上記三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕　上記三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び上記三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することが、
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることを含む、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕　上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスを含む、〔２０〕～〔２２〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕　上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、〔２０〕～〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いる、〔２１〕～〔２４〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、〔１４〕～〔２５〕のいずれかに記載の方法。
〔２７〕　細胞と、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックスとを含み、
　上記細胞の間に上記断片化細胞外マトリックスが配置されており、
　上記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であり、
　ヤング率が２０ｋＰａ以上である、三次元組織体。
〔２８〕　上記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、〔２７〕に記載の三次元組織体。
〔２９〕　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックスの含有率が、三次元組織体の全重量を基準として、５重量％以上９０重量％以下である、〔２７〕又は〔２８〕に記載の三次元組織体。
〔３０〕　平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスをさらに含む、〔２７〕～〔２９〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔３１〕　平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスをさらに含む、〔２７〕～〔２９〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔３２〕　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における比率が、重量換算で１：１００～１００：１である、〔２７〕～〔３１〕のいずれかに記載の三次元組織体。
〔３３〕　ヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、〔２７〕～〔３２〕のいずれかに記載の三次元組織体。

　本発明によれば、生体適合性の高い足場材料を用いて製造する三次元組織体において、三次元組織体のヤング率を制御する方法を提供することができる。また、それにより、所望のヤング率を有する三次元組織体の製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、ヤング率が２０ｋＰａ以上の三次元組織体を提供することができる。

　本発明によれば、所望のヤング率を有する三次元組織体を得ることができるため、生体のヤング率に近い様々な組織モデルを作成し、薬剤の評価及びスクリーニング等に用いることが可能となる。また、本発明によれば、生体適合性の高い足場材料を用いて従来製造することが難しかったヤング率の高い三次元組織体を得ることもできるため、生体におけるヤング率の高いがん組織モデルを作成し、薬剤の評価及びスクリーニング等に用いることが可能となる。

実施例２のコラーゲン分散液中の断片化コラーゲンの線維径分布を示すグラフである。実施例２のコラーゲン溶液中の断片化コラーゲンの線維径分布を示すグラフである。実施例３における、ＣＮＦゲルのＣＮＦ濃度に対するヤング率の変化を示すグラフである。実施例４における、ＣＮＦゲルとＣＭＦゲルのヤング率を比較した結果を示すグラフである。実施例５における、三次元組織体のヤング率を比較した結果を示すグラフである。

　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜三次元組織体のヤング率を制御する方法＞
　本実施形態に係る方法は、細胞外マトリックスの平均径を調整することで、細胞及び細胞外マトリックスを含む三次元組織体のヤング率を制御する。

　本明細書において、「三次元組織体」とは、細胞外マトリックスを介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。したがって、三次元組織体は、細胞及び細胞外マトリックスを含む。少なくとも一部の細胞間には細胞外マトリックスが配置されていてよい。三次元組織体において、細胞同士が直接接している部分があってもよい。三次元組織体は、細胞及び細胞外マトリックスが三次元的に分布し、細胞間に細胞外マトリックスが配置されたものであることが好ましく、細胞及び細胞外マトリックスが三次元的に均一に分布し、細胞間に細胞外マトリックスが配置されたものであることがより好ましい。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。また、三次元組織体は、支持体と接着した状態で塊状に集合したものであってもよく、支持体と接着していない状態で塊状に集合したものであってもよい。

　細胞は体細胞又は生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞腫に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞腫に分化する能力を持つ組織幹細胞（体性幹細胞とも呼ばれる）が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。

　三次元組織体を構成する細胞は、一種又は複数種の細胞を含んでよい。細胞としては、例えば、線維芽細胞（例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ））、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ））、等が挙げられる。

　本実施形態に係る三次元組織体を構成する細胞の総数は、特に限定されるものではなく、構築する三次元組織体の厚み、形状、構築に使用する細胞培養容器の大きさ等を考慮して適宜決定される。

　細胞外マトリックスは、三次元組織体において少なくとも一部の細胞間の隙間を埋める材料である。細胞外マトリックスは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体であってよい。細胞外マトリックス分子は、生物において細胞の外に存在する物質であってもよい。細胞外マトリックスは、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であることが好ましい。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックスは、例えば、コラーゲンを含んでいてよく、コラーゲンであってもよい。細胞外マトリックスがコラーゲンである場合、コラーゲンが細胞接着の足場として機能し、三次元的な細胞構造体の形成がより一層促進される。本実施形態における細胞外マトリックスは、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックスであることが好ましい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。

　細胞外マトリックスは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有していてよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なく、足場材としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックスにおいて、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックスは、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有する場合、細胞接着がより一層促進され、足場材としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックスには、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が含まれる。

　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。

　細胞外マトリックスは、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは線維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン、同株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。コラーゲンがＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンのように、複数の型の混合コラーゲンを用いる場合には、精製することにより、単一の型のコラーゲンに分離して用いてもよい。例えば、複数の型の混合コラーゲンを含む溶液に塩を添加し、遠心分離することで複数の型のコラーゲンを分離し、沈殿物又は上清を回収することで、目的の型のコラーゲンのみを得ることができる。得られた目的の型のコラーゲンは、さらに透析により塩を除去することもでき、透析の後、さらに凍結乾燥をしてもよい。
　細胞外マトリックスは、動物由来の細胞外マトリックスであってよい。細胞外マトリックスの由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックスの由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。

　細胞外マトリックスの形状としては、例えば、線維状が挙げられる。線維状とは、糸状の細胞外マトリックスで構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックスが分子間で架橋して構成される形状を意味する。細胞外マトリックスの少なくとも一部は、線維状であってよい。細胞外マトリックスの形状は、顕微鏡観察した際に観察されるひとかたまりの細胞外マトリックス（細胞外マトリックスの集合体）の形状であり、細胞外マトリックスは、好適には後述する平均径及び／又は平均長の大きさを有するものである。線維状の細胞外マトリックスには、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。形状が線維状である細胞外マトリックスを含むと、線維状の細胞外マトリックスではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されており、細胞接着のための足場材としてより一層効果的に機能することができる。

　「断片化」とは、細胞外マトリックスの集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化された細胞外マトリックス（「断片化細胞外マトリックス」とも称される）は、解繊された細胞外マトリックスを含んでもよい。解繊された細胞外マトリックスは、上述の細胞外マトリックスを物理的な力の印加により解繊したものである。例えば、解繊は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。

　断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスを少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスのみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックスであってよい。解繊された細胞外マトリックスは、解繊されたコラーゲン（解繊コラーゲン）を含むことが好ましい。解繊コラーゲンは、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲンは、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。断片化コラーゲンは、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。

　断片化細胞外マトリックスの平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックスの平均長は、厚い組織が形成しやすくなる観点から、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックスの平均長は、組織形成が安定しやすくなる観点及び再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックスの平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックスの平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックスは、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲンであることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲンであることがより好ましい。

　断片化細胞外マトリックスの平均径は、例えば、２０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。本実施形態の方法においては、三次元組織体に含まれる断片化細胞外マトリックスの平均径を小さくすることで三次元組織体のヤング率を増加させることができ、逆に平均径を大きくすることで三次元組織体のヤング率を低下させることができる。したがって、本実施形態の方法は、上記細胞外マトリックスの平均径を、以下に例示する平均径に調整することを含んでもよい。

　平均径がナノオーダー（１０００ｎｍ以下）の断片化細胞外マトリックスを、ナノファイバー（ＮＦ）とも称する。ナノファイバーの平均径は、例えば、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であってよく、４０ｎｍ以上１３０ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であってもよい。一方、平均径がマイクロオーダー（１０００ｎｍ超）の断片化細胞外マトリックスを、マイクロファイバー（ＭＦ）とも称する。マイクロファイバーの平均径は、例えば、１μｍ超３０μｍ以下であってよく、１μｍ超３０μｍ以下であってよく、１μｍ超１０μｍ以下であってよく、１．５μｍ以上８．５μｍ以下であってよく、２μｍ以上８．５μｍ以下であってよい。本実施形態において、ナノファイバーおよびマイクロファイバーの形状は、上述の断片化細胞外マトリックスである限り、線維状でなくともよい。

　本実施形態の方法は、三次元組織体に含まれる断片化細胞外マトリックスをすべてナノファイバー又はマイクロファイバーに調整することを含んでもよい。また、本実施形態の方法は、三次元組織体が、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含んでもよい。例えば、三次元組織体が上記ナノファイバー及びマイクロファイバーの両方を含むように調整してもよく、具体的には、例えば、三次元組織体が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含むように調整してもよい。また、異なる平均径のナノファイバーを含むように調整してもよく、具体的には、例えば、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び１００ｎｍ超２００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含むように調整してもよい。異なる平均径の断片化細胞外マトリックスについて、それぞれの重量換算での比率を調整することで、所望のヤング率の三次元組織体とすることができる。例えば、平均径の小さい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、ナノファイバー）及び平均径の大きい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、マイクロファイバー）を重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いてもよく、１：１０～１０：１の比率で用いてもよく、１：３～３：１の比率で用いてもよく、１：２～２：１の比率で用いてもよい。具体的には、例えば、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いることができる。また、平均径の小さい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、ナノファイバー）を平均径の大きい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、マイクロファイバー）よりも重量換算で多く用いてもよい。具体的には、例えば、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスよりも重量換算で多く用いてもよい。

　三次元組織体中の全断片化細胞外マトリックスの含有率は、例えば、断片化細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、又は５重量％以上であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、又は１質量％以下であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよく、１．０質量％以上９０質量％以下であってよく、５重量％以上９０重量％以下であってよく、５重量％以上４０重量％以下であってよい。本実施形態の方法において、断片化細胞外マトリックスの平均径及び含有率を調整することで、三次元組織体のヤング率を制御してもよい。したがって、本実施形態の方法は、三次元組織体における異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含むものであってもよい。例えば、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させること若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させることができる。逆に、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させること若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることができる。つまり、三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することは、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させること（若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させること）で、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させること（若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させること）で、三次元組織体のヤング率を低下させることを含むものであってもよい。

　上述の平均長及び平均径の範囲は、組織形成の観点から至適化されたものであるため、組織形成に用いる段階で上記の平均長又は平均径の範囲内に収まっていることが望ましい。

　断片化細胞外マトリックスの平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックスを測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。

　細胞外マトリックスを断片化する方法は、特に制限はなく、物理的な力の印加によって断片化してよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている。）。細胞外マトリックスを断片化する方法は、例えば、塊状の細胞外マトリックスを細かく砕く方法であってよい。細胞外マトリックスは、固相で断片化されてもよく、水性媒体中で断片化されてもよい。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックスを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックスをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することで断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することができる。特に平均径が小さい、ナノオーダー（１０００ｎｍ以下）の断片化細胞外マトリックスを作製するための方法としては、例えば、細胞外マトリックス（例えば、コラーゲン）を含む水性媒体に分散させた分散液をホモジナイズすること及びその後任意で水性媒体中で１０℃以下（例えば、４℃±１℃）でインキュベートすることが挙げられる。ホモジナイズすることの例としては、ホモジナイザーを用いてホモジナイズすること、攪拌すること、圧力をかけること等が挙げられ、スターラーを用いて攪拌してもよい。水性媒体は純水でもよく、リン酸を含有する水溶液（例えば、ＰＢＳバッファー）のような水溶液でもよい。また、ホモジナイズした後に１０℃以下（例えば、４℃±１℃）でインキュベートする時間は、例えば、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、又は７２時間以上であってもよい。ホモジナイズする際の水性媒体（第１の水性媒体）と、インキュベートする際の水性媒体（第２の水性媒体）は、同じでも違っていてもよい。また、水性媒体は塩を含んでも含まなくてもよい。

　細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化する場合、断片化された細胞外マトリックスは、例えば、細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化する工程と、断片化された細胞外マトリックス及び水性媒体を含む液から水性媒体を除去する工程（除去工程）とを含む方法によって製造することができる。除去工程は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。「水性媒体を除去する」とは、断片化された細胞外マトリックス成分中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。

　断片化細胞外マトリックスの少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。断片化された細胞外マトリックスは、断片化された細胞外マトリックスを構成する分子内で架橋されていてもよく、断片化された細胞外マトリックスを構成する分子間で架橋されていてよい。

　架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。

　断片化コラーゲンにおいて、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細線維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン分子の熱架橋を行う場合、解繊コラーゲンは、コラーゲン分子のアミノ基が同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を形成することにより、架橋されていてよい。

　断片化細胞外マトリックスは架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。

　架橋度の定量は、断片化細胞外マトリックスの種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。

　細胞外マトリックス分子中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、非特許文献２等に記載されているＴＮＢＳ法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。

　架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックスの場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。

　三次元組織体における細胞外マトリックスの含有量は、三次元組織体の乾燥重量を基準として、０．０１質量％以上、０．０５質量％以上、０．１質量％以上、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上、９質量％以上、１０質量％、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、又は３０質量％以上であってよく、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、又は１５質量％以下であってよい。三次元組織体における細胞外マトリックスの含有量は、三次元組織体の乾燥重量を基準として、０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％、１０～８０質量％、１０～７０質量％、１０～６０質量％、１～５０質量％、１０～５０質量％、１０～３０質量％、又は２０～３０質量％であってよい。

　ここで、「三次元組織体における細胞外マトリックス」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックスを意味し、内因性細胞外マトリックスに由来していてもよく、外因性細胞外マトリックスに由来していてもよい。

　「内因性の細胞外マトリックス」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックスを意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、上述した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックスは、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。

　「外因性の細胞外マトリックス」とは、外部から供給される細胞外マトリックスを意味する。本実施形態に係る三次元組織体は、外因性の細胞外マトリックスである断片化された細胞外マトリックスを含む。外因性の細胞外マトリックスは、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックスと同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックスは、人工の細胞外マトリックスであってもよい。

　細胞外マトリックスがコラーゲンである場合には、外因性の細胞外マトリックスは「外因性コラーゲン」とも称され、外部から供給されるコラーゲンを意味する「外因性コラーゲン」は、複数のコラーゲン分子によって形成されている、コラーゲン分子の集合体であり、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

　外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックスは、異種細胞外マトリックスであってよい。

　すなわち、三次元組織体が内因性細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスを含む場合、上記三次元組織体を構成する細胞外マトリックス含有率は、内因性細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスの合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。

　例えば、三次元組織体に含まれる細胞外マトリックスがコラーゲンである場合、三次元組織体におけるコラーゲン量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。

　コラーゲン量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。

（サンプルの調製）
　凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。

（スタンダードの調製）
　スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ　ｉｎ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。

（アッセイ）
　３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　（ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。

　三次元組織体中に占めるコラーゲンを、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲンを既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。

　例えば、三次元組織体中のコラーゲンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン」については、上述したとおりである。三次元組織体を構成するコラーゲンの面積の割合は、内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンを合わせた面積の割合を意味する。コラーゲンの面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲンの面積の割合として算出することが可能である。

　三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。

　上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。

　上記三次元組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。三次元組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。

　ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。

　また、三次元組織体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。

　三次元組織体のヤング率は、１０℃～４５℃におけるものであってよく、１５℃～４０℃におけるものであることが好ましく、２０℃～３７℃におけるものであることがより好ましく、２５℃（±１℃）におけるものであることがさらに好ましい。

　本実施形態の方法によれば、所望のヤング率の三次元組織体が得られるため、三次元組織体のヤング率は、特に制限されないが、例えば、２０ｋＰａ～３００ｋＰａであってよく、２０ｋＰａ～２５０ｋＰａであってよく、３０ｋＰａ～１５０ｋＰａであってよく、４０ｋＰａ～１００ｋＰａであってよく、５０ｋＰａ～８０ｋＰａであってよく、５０ｋＰａ～７０ｋＰａであってよい。また、三次元組織体のヤング率は、特に制限されないが、例えば、１５０ｋＰａ以上であってよく、２００ｋＰａ以上であってよく、２５０ｋＰａ以上であってもよい。

　三次元組織体のヤング率は、小型卓上試験機ＥＺ－ｔｅｓｔ（島津製作所製）を用いて測定することができる。具体的には、一般的な培養容器に搭載したゲル（もしくは三次元組織体）に対し、試験機のロードセルにセットした棒状の冶具（先端面積：１１ｍｍ^２）により、温度２５℃、圧縮速度１．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で圧縮を行い、応力歪み線（Ｓｔｒｅｓｓ－Ｓｔｒａｉｎ曲線）を得る。得られた応力歪み線における応力立ち上がり初期の弾性変形領域の傾きからヤング率（ｋＰａ）を算出することができる。

＜三次元組織体の製造方法＞
　本実施形態の三次元組織体の製造方法は、三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程、水性媒体中で上記細胞外マトリックスを細胞と混合して細胞懸濁液を得る工程、及び上記細胞懸濁液をインキュベートする工程を含む。

（断片化細胞外マトリックスを準備する工程）
　本実施形態の製造方法は、三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程を含む。

　三次元組織体、ヤング率、断片化細胞外マトリックス、及びその平均径の調整方法等については、上述したとおりである。本実施形態の製造方法は、断片化細胞外マトリックスの平均径を調整する工程を含んでもよい。

　断片化細胞外マトリックスの平均径は、例えば、２０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。本実施形態の製造方法においては、三次元組織体に含まれる断片化細胞外マトリックスの平均径を小さくすることで三次元組織体のヤング率を増加させることができ、逆に平均径を大きくすることで三次元組織体のヤング率を低下させることができる。したがって、本実施形態の製造方法における平均径を調整した断片化細胞外マトリックスは、以下に例示する平均径に調整されたものを含んでもよい。

　平均径を調整した断片化細胞外マトリックスは、ナノファイバーであってよい。ナノファイバーの平均径は、例えば、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であってよく、４０ｎｍ以上１３０ｎｍ以下であってよく、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であってもよい。また、平均径を調整した断片化細胞外マトリックスは、マイクロファイバーであってもよい。マイクロファイバーの平均径は、例えば、１μｍ超３０μｍ以下であってよく、１μｍ超３０μｍ以下であってよく、１μｍ超１０μｍ以下であってよく、１．５μｍ以上８．５μｍ以下であってよく、２μｍ以上８．５μｍ以下であってよい。

　本実施形態の製造方法において、平均径を調整した断片化細胞外マトリックスは、すべてナノファイバー又はマイクロファイバーであってもよい。また、平均径を調整した断片化細胞外マトリックスは、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含んでもよい。例えば、上記ナノファイバー及びマイクロファイバーの両方を含んでもよく、具体的には、例えば、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含んでもよい。また、異なる平均径のナノファイバーを含んでもよい、具体的には、例えば、２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び１００ｎｍ超２００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含んでもよい。異なる平均径の断片化細胞外マトリックスについて、それぞれの重量換算での比率を調整することで、所望のヤング率の三次元組織体とすることができる。例えば、平均径の小さい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、ナノファイバー）及び平均径の大きい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、マイクロファイバー）を重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いてもよく、１：１０～１０：１の比率で用いてもよく、１：３～３：１の比率で用いてもよく、１：２～２：１の比率で用いてもよい。具体的には、例えば、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いることができる。また、平均径の小さい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、ナノファイバー）を平均径の大きい方の断片化細胞外マトリックス（例えば、マイクロファイバー）よりも重量換算で多く用いてもよい。具体的には、例えば、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスよりも重量換算で多く用いてもよい。

　本実施形態の製造方法において、断片化細胞外マトリックスの平均径及び含有率を調整することで、三次元組織体のヤング率を制御してもよい。したがって、本実施形態の製造方法において、断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径及び含有量を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程であってもよい。例えば、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させること若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させることができる。逆に、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させること若しくは大きい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることができる。つまり、三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び上記三次元組織体における上記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することが、小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることを含むものであってもよい。また、本実施形態の製造方法は、準備した異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを混合する工程をさらに含んでもよい。細胞は、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを混合した後に添加してもよく、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスとともに混合してもよい。

　本実施形態の製造方法において用いる断片化細胞外マトリックスの含有率は、例えば、断片化細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、又は５重量％以上であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、又は１質量％以下であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックスの含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよく、１．０質量％以上９０質量％以下であってよく、５重量％以上９０重量％以下であってよく、５重量％以上４０重量％以下であってよい。

　断片化された細胞外マトリックスは上述した方法により得ることができる。断片化された細胞外マトリックスは、細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化することにより得られるものであってよい。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、断片化細胞外マトリックスを準備する工程において、細胞外マトリックスを水性媒体中で断片化する工程（断片化工程）を備えていてよい。

　断片化された細胞外マトリックスは、上記例示したものであってよく、断片化されたコラーゲンを含んでいてよい。

　本実施形態に係る製造方法は、さらに、断片化工程前に細胞外マトリックスを加熱して、細胞外マトリックスの少なくとも一部を架橋する工程を備えていてもよいし、断片化工程後かつ細胞懸濁液を得る工程前に、細胞外マトリックスを加熱して、細胞外マトリックスの少なくとも一部を架橋する工程を備えていてよい。細胞外マトリックスの少なくとも一部を架橋する工程においては、細胞外マトリックスの凍結乾燥体を加熱してもよい。

　架橋する工程において、細胞外マトリックスを加熱する際の温度（加熱温度）及び時間（加熱時間）は適宜定めることができる。加熱温度は、例えば１００℃以上であってよく、２００℃以下であってよく、２２０℃以下であってよい。加熱温度は、具体的には、例えば、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃、２２０℃等であってよい。加熱時間（上記加熱温度で保持する時間）は、加熱温度により適宜設定することができる。加熱時間は、例えば、１００℃～２００℃で加熱する場合、６時間以上７２時間以下であってよく、より好ましくは２４時間以上４８時間以下である。架橋する工程では、溶媒非存在下で加熱してよく、また、減圧条件下で加熱してもよい。

　本実施形態に係る製造方法は、断片化工程後に、断片化された細胞外マトリックスを乾燥する乾燥工程を備えていてよい。

　乾燥工程では、解繊された細胞外マトリックスを乾燥する。乾燥は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。解繊工程後に、乾燥工程を行うことで、断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液から、水性媒体が除去される。水性媒体が除去されるとは、断片化された細胞外マトリックス中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。

（細胞懸濁液を得る工程）
　本実施形態の製造方法は、水性媒体中で上記断片化細胞外マトリックスを細胞と混合して細胞懸濁液を得る工程を含む。

　断片化細胞外マトリックスは、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。

　水性媒体中において、断片化細胞外マトリックスを細胞と混合する方法としては、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に細胞を添加する方法、細胞を含む培養液に細胞外マトリックスを含有する水性媒体を加える方法、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス及び細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。また、水性媒体中において、断片化細胞外マトリックスと細胞をピペッティング等で攪拌してもよい。

　断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に細胞を添加する方法における、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体は、断片化細胞外マトリックスを水性媒体に分散させることで作製できる。細胞培養組成物の水性媒体は、上記細胞外マトリックスを細胞と混合する際の水性媒体と同じであってもよく、異なっていてもよい。水性媒体が同じ場合には、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に細胞を混合することで細胞懸濁液を得てもよい。水性媒体が異なる場合には、断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体における水性媒体を第１の水性媒体、細胞と混合する際の水性媒体を第２の水性媒体といってもよい。

　水性媒体に断片化細胞外マトリックスと細胞が分散することで細胞懸濁液が得られる。水性媒体は培地であってよい。培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。

　細胞懸濁液を得る工程における細胞外マトリックスの濃度は、目的とする三次元組織体のヤング率、形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、細胞懸濁液を得る工程における水性媒体中の細胞外マトリックスの濃度は、０．１～９０質量％であってもよいし、１～３０質量％であってもよい。

　細胞懸濁液を得る工程における断片化細胞外マトリックスの量は、例えば、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。

　細胞懸濁液を得る工程において、断片化細胞外マトリックスと細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス／細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。

　細胞懸濁液を得る工程、又は細胞懸濁液を得る工程後かつインキュベート工程前に、フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加することを含んでもよい。フィブリノゲン及びトロンビンの両方を添加する場合には、例えば、フィブリノゲン及びトロンビンは同時に添加してもよく、先にフィブリノゲンを添加した後にトロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加するタイミングは特に制限されず、例えば、細胞及び断片化細胞外マトリックスを含有する水性媒体に添加してもよく、細胞及び細胞外マトリックスを含有する水性媒体にフィブリノゲンを添加した後に脂肪細胞を添加し、その後トロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び／又はトロンビンを添加することにより、後述するインキュベート工程において生じ得るシュリンクを抑制し、三次元組織体の形状及び大きさを制御しやすくすることができる。また、細胞と断片化細胞外マトリックスとの懸濁液をゲル化することができるため、当該懸濁液を培養器（支持体）に滴下した後、培養器から剥離しやすくすることができる。また、細胞が成熟した脂肪細胞を含む場合、成熟した脂肪細胞内部の脂肪滴の影響で脂肪細胞が浮遊し、脂肪細胞とその他の細胞とが不均一になった状態で培養されてしまう可能性があるが、懸濁液をゲル化することにより、各細胞及び細胞外マトリックスが均一に混合した状態を維持し、細胞と細胞外マトリックスとを近接させた状態を維持しやすくなる。

　本実施形態の製造方法は、細胞懸濁液を得る工程後かつ細胞懸濁液をインキュベート工程前に、細胞懸濁液に外力を加えて、細胞及び断片化細胞外マトリックスを集積する工程を含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における断片化細胞外マトリックス及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、細胞外マトリックスと細胞とを含む細胞懸濁液を遠心操作する方法が挙げられる。

（細胞懸濁液をインキュベートする工程）
　本実施形態の製造方法は、細胞懸濁液をインキュベートする工程を含む。

　本実施形態に係る製造方法において、インキュベート工程は、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞をインキュベートする工程である。インキュベートすることで、断片化細胞外マトリックスが接触した細胞を培養することができる。したがって、本工程を以下、「培養工程」とも称することがある。

　インキュベートの方法は、特に制限はなく、細胞の種類に応じて好適な方法で行うことができる。例えば、インキュベート温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。細胞懸濁液のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベート時間は、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。

　細胞懸濁液をインキュベートする際に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。

　培養工程における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養工程における培地中の細胞密度は、１～１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０^３～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。また、培養工程における培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。

　本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。

　収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
　上記の例では収縮率を、培養後１日目の三次元組織体と培養３日目の細胞組織体から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での三次元組織体から算出してもよい。例えば、培養後１日目の三次元組織体と培養２日目の三次元組織体から算出してもよく、培養後１日目の三次元組織体と培養５日目の三次元組織体から算出してもよく、培養後１日目の三次元組織体と培養８日目の三次元組織体から算出してもよい。

　上記培養工程（以下、「第１の培養工程」とも表す。また、最初の接触工程を「第１の接触工程」とも表す。）の後、さらに細胞を接触させる工程（第２の接触工程）、細胞を培養する工程（第２の培養工程）を含んでもよい。第２の接触工程及び第２の培養工程によける上記細胞は、第１の接触工程及び第１の培養工程で用いた細胞と同種であってよく、異種であってもよい。第２の接触工程及び第２の培養工程により、二層構造の三次元組織体を作製することができる。また、さらに、接触工程及び培養工程を繰り返し含むことで複数層の三次元組織体を作製することができ、より複雑な生体に近い組織を作製することもできる。

　上記培養工程は、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で培養することを含んでもよい。これにより、支持体に接着していない状態で塊状に集合した三次元組織体を製造することができる。上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が支持体に接着している場合には、上記培養工程は、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含んでもよい。上記培養工程において上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が最初から支持体に接着していない場合には、そのまま培養することで支持体に接着していない状態で塊状に集合した三次元組織体を製造することができる。

　支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離す方法は、特に制限されず、例えば、低接着性の支持体を使用し、培養液を追加することで細胞を支持体から引き離してもよく、器具等を利用して直接細胞を物理的に支持体から引き離してもよく、振動を与えることにより細胞を支持体から引き離してもよく、熱及び光等の刺激に反応することで支持体と細胞の結合が外れる機能性材料を表面に塗布した支持体を用い、刺激を与えることで細胞を支持体から引き離してもよい。培養液を追加することで細胞を支持体から引き離す場合の培養液には、上記に例示した培地等を使用することができる。

　培養工程において、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を最初から支持体に接着していない状態で培養する方法としては、例えば、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を含む懸濁液をゲル化させ、培養液中にそっと滴下して培養する方法、及び高粘度の溶媒中において上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞の形状をある程度固定したのち、溶媒のみを取り除いて培養容器に移す方法が挙げられる。

　上記培養工程において、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すタイミングは、特に制限されず、例えば、培養開始から１日～７日に行ってもよく、１時間～２４時間に行ってもよく、１分～６０分に行ってもよく、５分～３０分に行ってもよく、１０分～２０分に行ってもよい。

　支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離した後の培養期間は、特に制限されず、１日以上であってよく、１日～２１日であってよく、３日～１４日であってよく、７日～１４日であってよい。

　本実施形態の製造方法で作製される三次元組織体のヤング率は、１０℃～４５℃におけるものであってよく、１５℃～４０℃におけるものであることが好ましく、２０℃～３７℃におけるものであることがより好ましく、２５℃（±１℃）におけるものであることがさらに好ましい。

　本実施形態の製造方法によれば、所望のヤング率の三次元組織体が得られるため、三次元組織体のヤング率は、特に制限されないが、例えば、１ｋＰａ以上であってよく、５ｋＰａ以上であってよく、１０ｋＰａ以上であってよく、２０ｋＰａ以上であってよく、４０ｋＰａ以上であってよく、５０ｋＰａ以上であってよく、７５ｋＰａ以上であってよく、１００ｋＰａ以上であってよく、１５０ｋＰａ以上であってよく、２０ｋＰａ～２５０ｋＰａであってよく、３０ｋＰａ～１５０ｋＰａであってよく、４０ｋＰａ～１００ｋＰａであってよく、５０ｋＰａ～８０ｋＰａであってよく、５０ｋＰａ～７０ｋＰａであってよい。

　本実施形態の製造方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。

＜三次元組織体＞
　本発明の一実施形態は、細胞と、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックスとを含み、断片化細胞外マトリックスが少なくとも一部の細胞の間に配置されており、断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であり、ヤング率が２０ｋＰａ以上である、三次元組織体、を提供することができる。

　断片化細胞外マトリックス、ヤング率の測定等については、上述したとおりである。

　本実施形態の三次元組織体は、ヤング率が２０ｋＰａ以上であり、４０ｋＰａ以上、５０ｋＰａ以上、７５ｋＰａ以上、１００ｋＰａ以上、１５０ｋＰａ以上、２００ｋＰａ以上、又は２５０ｋＰａ以上であってもよい。また、ヤング率は、１０ｋＰａ～３００ｋＰａであってよく、１０ｋＰａ～２５０ｋＰａであってよく、２０ｋＰａ～１５０ｋＰａであってよく、３０ｋＰａ～１００ｋＰａであってもよい。

　断片化細胞外マトリックスの含有率は、例えば、三次元組織体の全質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよく、１．０質量％以上９０質量％以下であってよく、５重量％以上９０重量％以下であってよく、５重量％以上４０重量％以下であってよい。

　本実施形態の三次元組織体は、平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックス、例えば、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスをさらに含んでいてもよい。平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックス（例えば、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックス）を含む場合には、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックス（例えば、平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックス）を、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いてもよい。

　本実施形態の三次元組織体における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。

＜三次元組織体組織体形成剤＞
　本発明の一実施形態は、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックス及び水性媒体を含む、三次元組織体形成剤であって、三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ以上である、形成剤、を提供することができる。

　三次元組織体、断片化細胞外マトリックス、水性媒体、ヤング率の測定等については、上述したとおりである。

　本実施形態における三次元組織体形成剤は、ヤング率が２０ｋＰａ以上の三次元組織体の形成に用いることができる。この三次元組織体形成剤を細胞と混合して細胞懸濁液を得て、細胞懸濁液をインキュベートすることで三次元組織体を製造してもよい。

　三次元組織体のヤング率は１ｋＰａ以上、５ｋＰａ以上、１０ｋＰａ以上、２０ｋＰａ以上、４０ｋＰａ以上、５０ｋＰａ以上、７５ｋＰａ以上、１００ｋＰａ以上、１５０ｋＰａ以上、２００ｋＰａ以上、又は２５０ｋＰａ以上であってもよい。また、ヤング率は、１０ｋＰａ～３００ｋＰａであってよく、１０ｋＰａ～２５０ｋＰａであってよく、２０ｋＰａ～１５０ｋＰａであってよく、３０ｋＰａ～１００ｋＰａであってもよい。

　本実施形態における三次元組織体形成剤のヤング率は、三次元組織体と同様に測定することができ、２０ｋＰａ以上、４０ｋＰａ以上、５０ｋＰａ以上、７５ｋＰａ以上、１００ｋＰａ以上、２００ｋＰａ以上、又は２５０ｋＰａ以上であってもよい。また、ヤング率は、１０ｋＰａ～３００ｋＰａであってよく、１０ｋＰａ～２００ｋＰａであってよく、２０ｋＰａ～１５０ｋＰａであってよく、３０ｋＰａ～１００ｋＰａであってもよい。また、ヤング率は、１０℃～４５℃におけるものであってよく、１５℃～４０℃におけるものであることが好ましく、２０℃～３７℃におけるものであることがより好ましく、２５℃（±１℃）におけるものであることがさらに好ましい。

　上述した平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスと、水性媒体を含ませることで、２５℃（±１℃）におけるヤング率が２０ｋＰａ以上の細胞培養組成物を作製することができる。平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを準備する方法については、上述したとおりである。

　断片化細胞外マトリックスの含有率は、例えば、三次元組織体形成剤の全質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよく、１．０質量％以上９０質量％以下であってよく、５重量％以上９０重量％以下であってよく、５重量％以上４０重量％以下であってよい。

　本実施形態の形成剤における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。

［実施例１：Ｉ型コラーゲン精製］
　５００ｍＬの超純水に１ｇの日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型及びＩＩＩ型混合コラーゲンを添加し、４℃で１２時間インキュベートし、０．２重量％のコラーゲン溶液を作製した。その後コラーゲン溶液に対し、０．４５Ｍ　ＮａＣｌ及び５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加し、４℃で１２時間インキュベートした後、１．２Ｍ　ＮａＣｌを添加してさらに４℃で１２時間インキュベートした。インキュベート後に１００００ｒｐｍで１５分遠心分離し、上清を回収して精製Ｉ型コラーゲン溶液を得た。

　得られたＩ型コラーゲン溶液を超純水で７日間透析（分画分子量（ＭＷＣＯ）：１５ｋＤａ）し、その後３日間凍結乾燥し、精製Ｉ型コラーゲンを得た。

［実施例２：コラーゲンマイクロファイバー及びコラーゲンナノファイバーの調製と線維径評価］
　実施例１にて得られた精製Ｉ型コラーゲン５０ｍｇを１×ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）５ｍＬに懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて室温で６分間ホモジナイズすることにより、断片化コラーゲンを含有する分散液を得た。図１は、当該分散液中の断片化コラーゲンの線維径分布を示すグラフである。得られた断片化コラーゲンの平均径は、５．０３±３．１１μｍであった（サンプル数：２５）。これらの断片化コラーゲンを、以下、コラーゲンマイクロファイバー（ＣＭＦ）とも称する。

　また、実施例１にて得られた精製Ｉ型コラーゲン５０ｍｇを１×ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）５ｍＬに懸濁し、撹拌式ホモジナイザーを用いて室温で６分間ホモジナイズした後、さらに４℃で３日間インキュベートすると、断片化コラーゲンがさらに細かくなった。図２は、当該溶液中の断片化コラーゲンの線維径分布を示すグラフである。得られた断片化コラーゲンの平均径は、８４．４±４３．０ｎｍであった（サンプル数：２５）。これらの断片化コラーゲンを、以下、コラーゲンナノファイバー（ＣＮＦ）とも称する。

［実施例３：コラーゲンナノファイバーを用いたゲルの作製とヤング率評価］
　実施例２と同様の方法により、所定の濃度（０．１～３．０重量％）で作製したＣＮＦ含有液を２４トランズウェルに３００μＬ／ウェルずつ滴下し、さらに３７℃で３時間インキュベートしてゲル化し、８～９ｍｍ程の厚さのＣＮＦゲルを得た。

　比較のため、株式会社ニッピ製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン酸溶液を用い、製造元提供のプロトコルに基づき、０．１重量％コラーゲンゲルを作製した（Ｎｉｐｐｉゲル）。

　各ゲルのヤング率は２５℃で以下のように測定した。

　小型卓上試験機ＥＺ－ｔｅｓｔ（島津製作所製）を用いて測定した。具体的には、２４ウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に搭載したゲルに対し、試験機のロードセルにセットした棒状の冶具（先端面積：１１ｍｍ^２）により、温度２５℃、圧縮速度１．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で圧縮を行い、応力歪み線（Ｓｔｒｅｓｓ－Ｓｔｒａｉｎ曲線）を得た。得られた応力歪み線における応力立ち上がり初期の弾性変形領域の傾きからヤング率（ｋＰａ）を算出した。

　結果を図３に示す。ＣＮＦの濃度（重量％）を増加させることにより、ＣＮＦのヤング率を高くすることができることが示された。市販のＮｉｐｐｉゲルの１６０倍ものヤング率を有するゲルを作製することも可能であった。

［実施例４：コラーゲンマイクロファイバーを用いたゲルの作製とヤング率の比較］
　実施例２と同様の方法により、所定の濃度（０．２～２．０重量％）で作製したＣＭＦ含有液を２４トランズウェルに３００μＬ／ウェルずつ滴下し、さらに３７℃で３時間インキュベートしてゲル化し、８～９ｍｍ程の厚さのＣＭＦゲルを得た。このＣＭＦゲルの２５℃におけるヤング率を実施例３で作製したＣＮＦゲルのヤング率と比較した。

　結果を図４に示す。ＣＮＦゲルは、ＣＭＦゲルと比較して、同じ濃度でより高いヤング率を示した。また、１重量％のＣＮＦゲルの透過率（５００ｎｍ）は０．１２（％）であり、同じ濃度のＣＭＦゲルの透過率（５００ｎｍ）０．０３（％）と比較して高かった。

［実施例５：コラーゲンマイクロファイバーを用いた三次元組織体の作製とヤング率の比較］
　実施例２において作製したコラーゲンマイクロファイバー（ＣＭＦ）及びコラーゲンナノファイバー（ＣＮＦ）を用いて以下のように三次元組織体を作製した。

　まず、ＣＭＦ及び／又はＣＮＦをＤＭＥＭに分散させ、２ｗｔ％　ＣＮＦ分散液、１ｗｔ％　ＣＮＦ分散液、０．５％　ＣＮＦ分散液、１．３３ｗｔ％　ＣＮＦ＋０．６６％　ＣＭＦ分散液、及び０．６６ｗｔ％　ＣＮＦ＋１．３３％　ＣＭＦ分散液を準備した。

　常法により１０ｃｍディッシュ内で継代培養したヒト結腸直腸腺がん細胞株（ＨＴ２９）（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－２４７）を１０ｃｍディッシュから剥がして回収した。ＨＴ２９を４００μＬあたり１×１０^６個となるように上記各分散液に懸濁し、細胞懸濁液を得た。

　ディープウェルプレート（ＥＶＥＲＧＲＥＥＮ製　＃２２２－８６３６－０１０）に、細胞懸濁液を４００μＬ播種した。３７℃でインキュベートし、播種から１日後の各三次元組織体の２５℃におけるヤング率を実施例３及び４と同様に測定した。

　結果を図５に示す。図５における（ｔｏｔａｌ　２ｍｇ）、（ｔｏｔａｌ　４ｍｇ）及び（ｔｏｔａｌ　８ｍｇ）の記載は、それぞれ形成された三次元組織体中に含まれる断片化コラーゲン（ＣＭＦ及び／又はＣＮＦ）の総量を示す。なお、細胞懸濁液の比重は１μＬあたり１ｍｇで計算している。図５のグラフにおいて左から１～３番目は、ＣＮＦの最終濃度がそれぞれ２ｗｔ％、１ｗｔ％及び０．５ｗｔ％となるようにＣＮＦ分散液とＨＴ２９を混合し、得られた細胞懸濁液を培養した結果を示す。左から４番目は、２ｗｔ％　ＣＮＦ分散液と２ｗｔ％　ＣＭＦ分散液を順に６６．６％及び３３．３％の容量割合で混合したことを示す。すなわち、ＣＮＦとＣＭＦを６６．６：３３．３（約１．３ｗｔ％：約０．７ｗｔ％）の割合で含む細胞懸濁液を培養した結果を示す。左から５番目は、２ｗｔ％　ＣＮＦ分散液と２ｗｔ％　ＣＭＦ分散液を順に３３．３％及び６６．６％の容量割合で混合したことを示す。すなわち、ＣＮＦとＣＭＦを３３．３：６６．６（約０．７ｗｔ％：約１．３ｗｔ％）の割合で含む細胞懸濁液を培養した結果を示す。

　これにより、断片化コラーゲンの総量が同じであっても、線維径が異なる断片化コラーゲンを混合することで、その混合比率に応じて作製される三次元組織体の硬さ（ヤング率）が異なることが示された。具体的には、ＣＮＦとＣＭＦを含む三次元組織体を作製する場合、断片化コラーゲンの総量が同じであっても、線維径の小さいＣＮＦの比率を増加させることで、ヤング率が向上し、逆に線維径の大きいＣＭＦの比率を増加させることで、ヤング率が低下することが分かった（図５の左から１番目、４番目及び５番目の比較）。また、ＣＮＦを２ｗｔ％以上含むことにより、２００ｋＰａ以上のヤング率の三次元組織体を作製できること（図５の左から１番目）、ＣＮＦを約１．３ｗｔ％以上含むことにより、１００ｋＰａ以上のヤング率の三次元組織体を作製できることも示された（図５の左から４番目）。さらに、作製された三次元組織体は、三次元的に細胞間にコラーゲンが配置され、細胞及びコラーゲンが均一に分布した三次元組織体であった。

Claims

　細胞及び細胞外マトリックスを含む三次元組織体の製造において、断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することで、前記三次元組織体のヤング率を制御する方法。
　前記断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、請求項３に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスの平均径を２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下に調整することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスの平均径を調整することが、三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記三次元組織体における前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
　前記三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び前記三次元組織体における前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することが、
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることを含む、請求項８に記載の方法。
　前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
　前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いる、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程、
　水性媒体中で前記細胞外マトリックスを細胞と混合して細胞懸濁液を得る工程、
　前記細胞懸濁液をインキュベートする工程を含む、
　三次元組織体の製造方法。
　前記断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体の所望のヤング率にあわせて平均径及び含有量を調整した断片化細胞外マトリックスを準備する工程である、請求項１４に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、請求項１４又は１５に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料である、請求項１６に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
　前記平均径を調整した断片化細胞外マトリックスが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
　前記断片化細胞外マトリックスを準備する工程が、三次元組織体が、異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整することを含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
　前記三次元組織体における前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
　前記三次元組織体が異なる平均径の断片化細胞外マトリックスを含むように調整すること及び前記三次元組織体における前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスの含有量を調整することが、
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を増加させることで、三次元組織体のヤング率を上昇させること、又は
　小さい平均径の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における含有量を減少させることで、三次元組織体のヤング率を低下させることを含む、請求項２１に記載の方法。
　前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスが、平均径が１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
　前記異なる平均径の断片化細胞外マトリックスがが、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の断片化細胞外マトリックス及び平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスを含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスを、重量換算で１：１００～１００：１の比率で用いる、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
　三次元組織体のヤング率が２０ｋＰａ～２５０ｋＰａである、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の方法。
　細胞と、平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックスとを含み、
　前記細胞の間に前記断片化細胞外マトリックスが配置されており、
　前記断片化細胞外マトリックスが、生体内に存在する分子と同一の分子である生体親和性材料であり、
　ヤング率が２０ｋＰａ以上である、三次元組織体。
　前記断片化細胞外マトリックスが、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドである、請求項２７に記載の三次元組織体。
　平均径が２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である断片化細胞外マトリックスの含有率が、三次元組織体の全重量を基準として、５重量％以上９０重量％以下である、請求項２７又は２８に記載の三次元組織体。
　平均径が１０００ｎｍ超の断片化細胞外マトリックスをさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の三次元組織体。
　平均径が１．５μｍ以上８．５μｍ以下の断片化細胞外マトリックスをさらに含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の三次元組織体。
　平均径が小さい方の断片化細胞外マトリックス及び平均径が大きい方の断片化細胞外マトリックスの三次元組織体における比率が、重量換算で１：１００～１００：１である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の三次元組織体。