JP2016077411A - コラーゲンゲルの作製方法及びコラーゲンゲル - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コラーゲンを0.50質量%〜3.0質量%の濃度で含むコラーゲン水溶液に対しせん断速度0.20s-1〜30s-1の範囲のせん断を付与することによってコラーゲン線維を配向させる工程を有するコラーゲンゲルの作製方法であって、その工程が、コラーゲン線維の形成によってせん断応力が1秒あたり1%〜30%の速度で増加している2秒間〜120秒間の工程を含むことにより前記コラーゲン線維を配向させる、コラーゲンゲルの作製方法。
【選択図】なし
Description
(1)インプラントを作製するためには、配向コラーゲン線維体をmm〜cmスケールのサイズで立体的に成形された“線維束”とする必要がある。ところが、特許文献3並びに非特許文献5、7及び8に記載されているような、基板等に付着した配向線維を作製する従来の技術では、極めて薄い平面的な配向コラーゲン線維のシートが得られるにすぎない。このため、mm〜cmスケールのサイズで立体的に成形された“線維束”を製造するためには、多数の平面的な配向コラーゲン線維シートを、その配向軸を揃えて積層・複合化しなければインプラントを成形できないという問題がある。
(2)非特許文献6に記載されたような湿式紡糸の技術は、量産性が高いものの、コラーゲン線維の配向度が不十分である。
(3)特許文献3に記載されたような”ナノ織機”の技術も量産性が高いが、得られるコラーゲンゲルは極めて細く力学的に脆弱であるため、それらを複合化して線維束を作製することが困難である。
[1]コラーゲンを0.50質量%〜3.0質量%の濃度で含むコラーゲン水溶液に対しせん断速度0.20s-1〜30s-1の範囲のせん断を付与することによってコラーゲン線維を配向させる工程を有するコラーゲンゲルの作製方法であって、その工程が、コラーゲン線維の形成によってせん断応力が1秒あたり1%〜30%の速度で増加している2秒間〜120秒間の工程を含むことにより前記コラーゲン線維を配向させる、コラーゲンゲルの作製方法。
[2]前記コラーゲン水溶液を25℃以下の温度から32〜42℃へ加温することによって、前記コラーゲン線維を形成する、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[3]前記コラーゲン水溶液は無機塩を含み、その無機塩のイオン強度が0.40〜1.0である、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[4]前記無機塩がリン酸水素ナトリウムと塩化ナトリウムとを含有する、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[5]前記コラーゲン水溶液は、架橋剤を含む、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[6]前記コラーゲン水溶液のpHが6.0〜9.0である、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[7]前記コラーゲンが、哺乳類由来のテロペプチド除去型コラーゲンを含有する、上記のコラーゲンゲルの作製方法。
[8]配向したコラーゲン線維を含み、光路長1mmあたりかつコラーゲン濃度1質量%あたりの複屈折位相差が30°〜90°であるコラーゲンゲル。
[9]厚みが0.2mm〜5mmであり、コラーゲン線維が前記コラーゲンゲルの厚み方向の全層に亘って配向している、上記コラーゲンゲル。
[10]コラーゲン濃度が0.50質量%〜3.0質量%である、上記コラーゲンゲル。
せん断応力増加率(%)=(τ1−τ0)/τ0/T×100 (1)
式(1)中、τ0は、せん断応力増加率を算出する期間の始点でのせん断応力を示し、τ1は、せん断応力増加率を算出する期間の終点でのせん断応力を示し、「T」はせん断応力増加率を算出する期間の長さ(単位:秒)を示し、5.0≦T≦120の任意の範囲で算出される。せん断応力の増加は、ある時期のみ瞬間的に高くなってもコラーゲンの配向化に十分でないので、5.0秒以上の期間でせん断応力増加率を算出する。一方、せん断は120秒以下の期間で付与されるため、せん断応力増加率を算出する期間も同じく120秒以下である。
〔コラーゲン溶液の準備〕
濃度1.0質量%のブタ皮膚製コラーゲン溶液(テロペプチド除去型コラーゲン、日本ハム株式会社製、コラーゲンの変性温度:40℃)をコラーゲン原液として準備した。エバポレーター(水溶温度:29℃)を用いてコラーゲン溶液を濃縮し、濃度1.2質量%及び2.4質量%のコラーゲン溶液を得た。濃度0.6質量%のコラーゲン溶液は、コラーゲン原液を希塩酸水溶液(pH=3)で希釈して得た。
リン酸水素ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶媒として、そこに、ゲニピン(和光純薬工業株式会社製)を溶解し、ゲニピン水溶液を調製した。リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及びゲニピンの濃度は、最終的に得られるコラーゲン水溶液中のそれらの濃度が表1に示す濃度となるように調節した。
リン酸水素ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶媒として、そこに、EDC(同仁化学研究所製)及びNHS(和光純薬工業株式会社製)を溶解し、EDC/NHS水溶液を調製した。リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、及びEDC/NHSの濃度は、最終的に得られるコラーゲン水溶液中のそれらの濃度が表1に示す濃度となるように調節した。
上記のようにして準備したコラーゲン溶液を、15mL遠心チューブに6gずつ入れ、庫内温度を4℃に調整した冷蔵庫内に静置した。チューブ内には撹拌を促進するためのマグネティックスターラー(10.8g、内径10mm×39mm)を収容した。次いで、室温のゲニピン水溶液又はEDC/NHS水溶液2mLをマイクロピペットで吸い上げ、コラーゲン溶液の入った遠心チューブに添加して、その遠心チューブを激しく振り混ぜて撹拌した。およそ30秒間で撹拌の後の遠心チューブを遠心分離機の所定位置にセットして、3200rpm、1.5分間の条件で遠心分離を行い、気泡を液上面に集め、架橋剤を含有するコラーゲン水溶液を得た。このコラーゲン水溶液の調製作業は室温にて4分以内に終えた。なお、コラーゲン水溶液のpHを、pHメータ(HORIBA社製、商品名「NAVIh F−71」)により測定した結果、及びコラーゲン水溶液における無機塩のイオン強度を表1に示す。
上記のようにして調製したコラーゲン水溶液を、内径60mmのパラレルプレート型センサーを取り付けた動的粘弾性測定装置(Thermofisher Scientific社製、商品名「HAAKE MarsIII」)のボトムプレート上(23℃)に流し、ボトム及びアッパープレートの間(ギャップ=1mm)にコラーゲン水溶液を挟み込んだ(図1の(A)を参照)。次いで、そのコラーゲン水溶液に対し、一定のせん断ひずみ0.005を周波数1Hzで付与することで、微小振動をさせながら温度調節を行い、貯蔵弾性率(G’)の時間変化を追跡した。図2の(A)において、実線は、測定開始後180秒までのG’の時間変化を示し、破線は、測定開始後180秒までのコラーゲン水溶液の加温プロファイルを示す。また、図2の(B)は、測定開始後180秒までに微小振動及び回転せん断を付与した期間を示す。回転せん断のせん断速度は0.10s-1〜50s-1の範囲で変化させた。図2の(A)に示す結果は、図2の(B)の条件Iによるものである。加温プロファイルは、まず、23℃にて60秒経過した後、30秒間に37℃まで昇温し、その後、37℃に一定に保持した。温度が37℃に到達した直後からG’が急激に増加し、60秒以内に1000Paを超えた。図2の(B)に示すように180秒の微小振動を継続した後、さらに37℃の微小振動を14分間継続し、プレート間に作製された円盤状コラーゲンゲルを回収した。得られたコラーゲンゲルは、本発明の作製方法に基づく回転せん断を付与しないで作製したサンプルとして分析に供した。このようなコラーゲンゲルを「ランダムコラーゲン線維ゲル」と呼ぶ。
上記の微小振動によるコラーゲンゲルの作製と同様にして、コラーゲン水溶液をボトム及びアッパープレートの間(ギャップ=1mm)に挟み込み、図2の(A)に示す温度プロファイルを用いて、図2の(B)に示す条件II、III、IV、V及びVIにて回転せん断を加えた。回転せん断を終了した後、微小振動に移行した。回転せん断を行っても、微小振動の場合と同様に、プレート間に円盤状コラーゲンゲルが非破壊的に作製された(図1の(B)を参照)。加温及び回転せん断の条件を表2に示す。
ゲニピンの濃度を2.5mMから0mM、1.25mM、3.75mM又は5.0mMに変更した以外は実施例1と同様にして、ゲニピンを含むコラーゲン水溶液を得た。得られたコラーゲン水溶液について、動的粘弾性測定装置(商品名「HAAKE MARS III」、Thermofisher Scientific社製)を用いて、条件Iでの貯蔵弾性率G’の変化を追跡した。得られたゲル化曲線を図10に示す。図10中、「1」の曲線は0mM、「2」の曲線は1.25mM、「3」の曲線は2.5mM、「4」の曲線は3.75mM、「5」の曲線は5.0mMのゲニピン濃度のコラーゲン水溶液によるゲル化曲線である。本発明に係るコラーゲン水溶液にゲニピンを添加すると、貯蔵弾性率G’の増加速度が速くなり、短時間に高強度のコラーゲンゲルを得ることが可能であると分かった。かかる高強度のコラーゲンゲルは、そのゲルを回収する際の破壊を抑制することができるので、製造効率向上の点から好ましい。
Claims (10)
- コラーゲンを0.50質量%〜3.0質量%の濃度で含むコラーゲン水溶液に対しせん断速度0.20s-1〜30s-1の範囲のせん断を付与することによってコラーゲン線維を配向させる工程を有するコラーゲンゲルの作製方法であって、
その工程が、コラーゲン線維の形成によってせん断応力が1秒あたり1%〜30%の速度で増加している2秒間〜120秒間の工程を含むことにより前記コラーゲン線維を配向させる、コラーゲンゲルの作製方法。 - 前記コラーゲン水溶液を25℃以下の温度から32〜42℃へ加温することによって、前記コラーゲン線維を形成する、請求項1記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 前記コラーゲン水溶液は無機塩を含み、その無機塩のイオン強度が0.40〜1.0である、請求項1又は2に記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 前記無機塩がリン酸水素ナトリウムと塩化ナトリウムとを含有する、請求項3記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 前記コラーゲン水溶液は、架橋剤を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 前記コラーゲン水溶液のpHが6.0〜9.0である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 前記コラーゲンが、哺乳類由来のテロペプチド除去型コラーゲンを含有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のコラーゲンゲルの作製方法。
- 配向したコラーゲン線維を含み、光路長1mmあたりかつコラーゲン濃度1質量%あたりの複屈折位相差が30°〜90°である、コラーゲンゲル。
- 厚みが0.2mm〜5mmであり、コラーゲン線維が前記コラーゲンゲルの厚み方向の全層に亘って配向している、請求項8記載のコラーゲンゲル。
- コラーゲン濃度が0.50質量%〜3.0質量%である、請求項8又は9に記載のコラーゲンゲル。
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