JP7478099B2

JP7478099B2 - コラーゲン生体材料及びコラーゲン生体材料を製造する方法

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Publication number: JP7478099B2
Application number: JP2020564316A
Authority: JP
Inventors: ルースエリザベスキャメロン; セリーナミッシェルベスト; デイビッドジェームズバレット; マシューリンリー
Original assignee: ケンブリッジエンタープライズリミティッド
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2024-05-02
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: WO2019219916A3; GB201808106D0; WO2019219916A2; WO2019219916A8; JP2021524288A; EP3793623A2; US20210187156A1

Description

［資金提供］
本発明につながる研究は、欧州連合の第７フレームワークプログラム（European Union's Seventh Framework Programme）（ＦＰ７／２００７－２０１３）のＥＲＣ助成契約番号３２０５９８に基づく欧州研究評議会から資金提供を受けた。

本発明は、コラーゲン生体材料及びコラーゲン生体材料を製造する方法に関する。

脊椎動物に見られる最も豊富なタンパク質の１つであるコラーゲンは、低い免疫原性、高い生体適合性を有し、細胞増殖及び創傷治癒のための足場として働くことができることから、多数の形態で生体材料として広く使用されてきた。

天然コラーゲンは、動物組織から直接採取することができ、強く、高度に組織化されている。例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）が生体材料として広く使用されている（１）。しかしながら、天然コラーゲン組織は、細胞を含有せず、特定の要件に合わせて容易に改変又は調整することができない。

殆どのコラーゲン組織の主要画分は、大直径コラーゲン原線維の形態の自然架橋したトロポコラーゲンから構成される不溶性三重らせんコラーゲン（ポリマーコラーゲン（ＰＣ）とも称する）である。ポリマーコラーゲンは、ポリマーを低ｐＨで透明な溶液／懸濁液へと膨潤させた後、中和によってコラーゲン線維を再凝縮／再凝集することで天然コラーゲン組織から精製することができる（２、３、４）。

モノマーコラーゲンは、単離されたコラーゲン三重らせんから構成され、可溶性である。可溶性モノマーコラーゲンの原線維形成（ゲル化）によりゲルを生成することができる。これらのゲルは、比較的弱く、ランダムな原線維構成を有する。しかしながら、生体機能模倣材料がコラーゲンゲルの塑性圧縮によって調製されている（５）。

溶液流延及び風乾によって作製されるコラーゲン膜が創傷包帯（６）、組織再生誘導法（７）及び障壁層（８）等の様々な用途において生体材料として使用されている。しかしながら、溶液流延は、長い乾燥時間を必要とし、均一な層の作製が大規模では困難な可能性があり、望ましくない放出プロファイルをもたらす、組み込まれる薬物の不均一な負荷が起こり得る（９）。

コラーゲン膜は、電気化学的圧縮のプロセスにより、電場を用いて可溶性モノマーコラーゲンの溶液から作製されている。幾つかの報告されている方法では、モノマーコラーゲンが等電点へと移動し、そこで原線維形成が誘導され、コラーゲン線維又はフィルムが作製される。他の報告されている方法では、モノマーコラーゲンは、電極へと移動し、そこで原線維形成が誘導される（３８）。

本発明者らは、緻密な再現性のあるコラーゲン層（膜等）を製造することが有利であることに気付いた。かかる層が制御可能な、好ましくは均一な厚さを有すれば有利である。かかる層を種々の要件に適合する寸法及び／又は形状で作製することができれば更に有利である。

電気泳動堆積（ＥＰＤ）は、コーティング及び自立フィルムを作製する迅速、低コスト、拡張可能かつ高度に再現性のある技法としてセラミック加工に広く用いられているコロイド処理方法であり、水性懸濁媒体を用いたキトサン（１０、１１、１２、１３、１４、１５）及びヒドロキシアパタイト（１４、１６、１７、１８、１９、２０）等のポリマー系及び生物系への使用が現在調査されている。コラーゲンモノマーに対する電場の影響を調べた論文は少数あるが（２１、２２、２３、２４）、執筆時点で本発明者らの知る限りでは、ＥＰＤによるポリマーコラーゲンからのフィルム又はコーティングの作製に関する報告は見られなかった。

セラミック系の殆どのＥＰＤでは、高い印加電位を可能にする有機液体が懸濁媒体として使用されるが、生体材料のＥＰＤでは水溶液系等の非毒性懸濁媒体の使用が必要とされる（２５）。ＥＰＤにおける水性懸濁媒体の使用は、多数の問題、特に水の電気分解を伴う。２５℃で１．２３Ｖを超える電位を水性液体全体に印加すると、通例、電気分解が生じ、カソード及びアノードのそれぞれで水素ガス及び酸素ガスの放出をもたらす（２６）。電極でのこれらのガスの発生は、堆積物の形成を妨げ、堆積物を損傷し、堆積速度を低下させ、堆積物内に捕捉される可能性がある気泡の形成を引き起こす（２７）。水素吸蔵パラジウム電極の使用（２８）、堆積のための基板としての電極間に位置する隔膜の付加（２９）、生成した酸素と反応するハイドロキノンの添加（３０）、ＡＣ電場の使用（３１、３２、３３）、及びパルス電場の印加（パルスＥＰＤ）（２７、３４、３５）を含む多数の異なるアプローチが、水性媒体中の電極でのガス発生を回避するために用いられている。

ＥＰＤを用いてコラーゲン生体材料を生成する信頼性の高い調整可能な方法は、様々な組織工学及び他の用途に有用である。

したがって、本発明の第１の態様では、コラーゲンの線維の配列を含むコラーゲンの層であって、該層が該層内に広がる平面に対して垂直な厚さ方向を有し、該厚さ方向に対して垂直であり、該層内に広がる平面内にある、或る範囲の面内方向が規定され、該層の極限引張強さ（ＵＴＳ）を前記範囲の面内方向に沿って試験した場合に、第１の面内方向が最大ＵＴＳに対応し、該第１の面内方向に平行でない第２の面内方向では、最大でも最大ＵＴＳの９０％であるＵＴＳに対応するように、前記コラーゲンの線維が前記第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列する、層を提供する。

本発明の第２の態様は、コラーゲンの線維の配列を含むコラーゲンの層であって、該層が該層内に広がる平面に対して垂直な厚さ方向を有し、該厚さ方向に対して垂直であり、該層内に広がる平面内にある、或る範囲の面内方向が規定され、該層の複屈折が、偏光顕微鏡法を用いて測定した場合に少なくとも０．０１であるように、前記コラーゲンの線維が第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列する、層を提供する。

本発明の第３の態様は、第１又は第２の態様に従う少なくとも２つの層を含む積層構造を提供する。

本発明の第４の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記懸濁液をパルス電気泳動に供するために前記電場をパルス状にし、電場強度が１００Ｖ／ｍ～２０００Ｖ／ｍの範囲であり、平均パルス長が１０ｍｓ～１００ｍｓの範囲であり、デューティサイクルが２０％～７０％である、方法を提供する。

本発明の第５の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記層堆積界面が前記電場により前記懸濁液中に生成した気泡ラフト（bubble raft）を含む、方法を提供する。

本発明の第６の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記不溶性コラーゲン懸濁液を前記電気泳動堆積前に透析して、実質的に塩を除去する、方法を提供する。

本発明の第７の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記層堆積界面が剥離層の表面を含む、方法を提供する。

本発明の第８の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記層堆積界面が少なくとも非平面プロファイルを有する領域を含み、前記層が、前記非平面プロファイルを有する領域を含む前記層堆積界面の形状と適合するように形成される、方法を提供する。

本発明の第９の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記層堆積界面が対向する主要表面を有する膜又は足場によって与えられ、
該膜又は足場が、前記膜又は足場の主要表面の少なくとも一方が前記懸濁液と接触することにより前記懸濁液によって支持される、方法を提供する。

本発明の第１０の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
前記層堆積界面と前記懸濁液との間で相対運動方向に相対運動を生じさせ、それにより前記層内の前記コラーゲン線維の整列を生じさせ、該線維を前記相対運動方向に実質的に平行な第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列させることと、
を含む、方法を提供する。

本発明の第１１の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記懸濁液が生存哺乳動物細胞を含み、該細胞が堆積後に前記層内に埋め込まれる、方法を提供する。

本発明の第１２の態様は、各々がコラーゲンの線維の配列を含む少なくとも第１の線維層及び第２の線維層と、該第１の線維層及び第２の線維層に挟まれた形状適合層とを含む層状複合材料であって、前記形状適合層が、該層状複合材料を所要の形状に適合させるために、前記第１の線維層及び第２の線維層を実質的に損傷することなく剪断変形可能である、層状複合材料を提供する。

本発明の第１３の態様は、各々がコラーゲンの線維の配列を含む少なくとも第１の線維層及び第２の線維層と、該第１の線維層及び第２の線維層に挟まれた形状適合層とを含む層状複合材料を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築して、第１の線維層を形成することと、
形状適合層を前記第１の線維層上に堆積させることと、
同じ又は更なる不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記形状適合層の表面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築して、第２の線維層を形成することと、
を含む、方法を提供する。

本発明の第１４の態様は、層状複合材料を所要の形状に適合させる方法であって、
各々がコラーゲンの線維の配列を含む少なくとも第１の線維層及び第２の線維層と、該第１の線維層及び第２の線維層に挟まれた形状適合層とを含み、第１の形状を有する層状複合材料を準備することと、
前記第１の形状を、前記第１の線維層及び第２の線維層を損傷することなく、前記形状適合層の剪断変形によって該第１の形状とは異なる第２の形状へと変形させると共に、前記形状適合層を設定することと、
を含む、方法を提供する。

本発明の第１５の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記懸濁液が１つ以上の治療化合物を含み、該１つ以上の治療化合物が堆積後に前記層に含まれる、方法を提供する。

本発明の第１６の態様は、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を堆積電圧の印加によって前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、前記電場を経時的に変動させ、それにより前記堆積コラーゲンを含む層の密度を変動させる、方法を提供する。

これらの態様の好ましい／任意の特徴を下記に示す。これらは、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単独で又は本発明の任意の態様との任意の組合せで組み合わせることができる。

パルス電気泳動堆積に用いられるシステムの概略を示す図である。（ａ）使用されるＥＰＤセル、（ｂ）パルスＥＰＤに用いられる１０ｍｓの周期及び４０％のデューティサイクルでの定電圧パルスを示す。多層膜の電気泳動堆積を示す図である。（ａ）コラーゲン懸濁液をＥＰＤセルに入れ、電場を印加すると、懸濁液のコラーゲン線維がカソードに向かい、そこで膜又はゲル等の固体又は半固体構造を形成する。（ｂ）電極を取り外し、風乾させると、堆積物の厚さが大幅に減少する。（ｃ）ＥＰＤセルを乾燥フィルムが付着したままで再び組み立て、ヒアルロン酸溶液をＥＰＤセルに入れ、最初の電場とは反対の極性の電場を印加する。ＨｙＡゲルが先のコラーゲンフィルムの上に堆積する。（ｄ）電極を取り外し、風乾させると、ヒアルロン酸フィルムの厚さが大幅に減少する。（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）を繰り返し、所望の回数のサイクル後に多層フィルムが作製される。ＥＰＤにおけるカソードへの正荷電粒子の電気泳動堆積物の概略を示す図である。膜堆積に対するコラーゲン懸濁液へのエタノールの添加の影響を示す図である。グラフは、懸濁液のエタノールのパーセンテージの関数としてのコラーゲンのζ電位を示す。５分間の総Ｔ_ｏｎで種々のパルス幅についてのパルスＥＰＤによって堆積したコラーゲンの質量を示す図である（ＤＣ＝５０％、電極間隔＝７．６５ｍｍ）。パルス長＝２５ｍｓ、ＤＣ＝４０％、電極間隔＝７．６５ｍｍ、Ｖ＝５Ｖで逐次堆積によって堆積したコラーゲンの質量を示す図である：（ａ）逐次堆積の回数に対するコラーゲンの総堆積質量；（ｂ）逐次堆積の堆積工程１回当たりに堆積した質量。パルスＥＰＤによるコラーゲンの複数回の堆積の概略を示す図である。（ａ）フィルムは初めに、イオン輸送の継続に十分なコラーゲン線維間の間隔で高度に水和したヒドロゲルとして堆積する。（ｂ）ヒドロゲルを乾燥させると、緻密な非多孔質フィルムが形成される。（ｃ）電極及びフィルムをＥＰＤセルに再び付着させ、新たなコラーゲン懸濁液を添加する。フィルムが帯電すると、抵抗が増大することなく堆積の継続が可能となる。コラーゲンフィルムの微細構造を示す図である。（ａ、ｂ）パルスＥＰＤによって堆積させたコラーゲンフィルムの表面のＡＦＭ顕微鏡写真及びＳＥＭ－ＳＥＩ顕微鏡写真。（ｃ、ｄ）キャストコラーゲンフィルムの表面のＡＦＭ顕微鏡写真及びＳＥＭ－ＳＥＩ顕微鏡写真。（ｅ）キャストコラーゲンフィルムの断面のＳＥＭ顕微鏡写真。（ｆ、ｇ）パルスＥＰＤによって作製した凍結粉砕（freeze-shattered）コラーゲンフィルムの端部のＢＳＤｃｒｙｏＳＥＭ顕微鏡写真。５Ｖ及び１０ＶでのＤＣ－ＥＰＤによる堆積時間に対するヒアルロン酸の堆積質量のグラフとしてのヒアルロン酸フィルムの堆積を示す図である。パルスＥＰＤによるコラーゲン及びヒアルロン酸の逐次堆積を示す図である：（ａ）パルスＥＰＤによるコラーゲン及びヒアルロン酸の逐次堆積によって形成されたフィルムの累積乾燥質量、（ｂ）コラーゲン層及びヒアルロン酸層の逐次堆積によって形成された乾燥フィルムの構造を示すＳＥＩ－ＳＥＭ顕微鏡写真。コラーゲン－ヒアルロン酸多層フィルムの微細構造を示す図である：（ａ）１つのコラーゲン層を切り取った、コラーゲン層及びヒアルロン酸層の逐次堆積によって形成された多層フィルムのμ－ＣＴ画像、（ｂ）コラーゲン及びヒアルロン酸の独立層を示す水和多層フィルムのｃｒｙｏＳＥＭ顕微鏡写真、（ｃ）コラーゲン層とヒアルロン酸層との分離を示す水和多層フィルムのｃｒｙｏＳＥＭ顕微鏡写真、（ｄ）層状コラーゲン構造を示す多層フィルムからの水和コラーゲン層のｃｒｙｏＳＥＭ、（ｅ）水和多層フィルムにおけるコラーゲン層内の細孔形成を示すＢＳＤｃｒｙｏＳＥＭ。コラーゲンフィルムにおける気泡形成を示す概略図である。（ａ）コラーゲン線維が初めに電極上に堆積する。（ｂ）微細気泡がコラーゲンフィルムの表面上に形成し、追加のコラーゲンが気泡の周囲に堆積し続ける。（ｃ）コラーゲンが気泡上に堆積し、気泡の周囲に圧縮されたコラーゲン線維の皮膜をもたらす。（ｄ）堆積後にフィルムを電極から取り外すと、コラーゲンフィルム内に中空の細孔が残る。コラーゲン懸濁液に対する透析の影響を示す図である：（ａ、ｂ）透析を行わない（ａ）及び透析を行う（ｂ）、種々のコラーゲン１スラリーについてのパルスＥＰＤにおける電流プロファイル（電圧＝５Ｖ、パルス長＝２５ｍｓ、電極間隔＝７．６５ｍｍ、ＤＣ＝５０％）。犠牲層上への堆積の概略図である：（ａ）電極基板を酢酸セルロース中でコーティングし、（ｂ）コラーゲンをパルスＥＰＤによって基板上に堆積させ、（ｃ）コラーゲンが乾燥した後、酢酸セルロースをアセトン中で溶解し、（ｄ）コラーゲンが遊離し、損傷なしに基板から回収される。犠牲層を用いて調製したコラーゲン膜及び犠牲層を用いずに調製したコラーゲン膜のＦＴＩＲスペクトルを示す図である。コーティングしていない基板及びセルロース層でコーティングした基板上の膜堆積における電流を示す図である。代替ＥＰＤプロトコルを示す図である。（ａ）は、気泡ラフト上に堆積したコラーゲン膜をもたらす高電圧ＤＣ－ＥＰＤの概略である。膜は付着せず、即座に操作することができる。（ｂ）は、浮遊したコラーゲン膜上へのＤＣ－ＥＰＤの概略である。気泡が電極に形成されるが、堆積を妨げない。（ｃ）は、図１５（ｂ）の浮遊膜プロトコルと共に３Ｄ形状電極を用いることで、電場の形状及び強度を制御し、成形膜を形成することができることを示す。パルスＥＰＤによる成形マクロテクスチャ（macro-textured）コラーゲンフィルムの製造を示す図である。図１６Ａは、マクロテクスチャカソード上へのパルスＥＰＤ堆積の概略図を示す。図１６Ｂは、マクロテクスチャコラーゲンフィルムのＳＥＭ画像化を示す。図１６Ｃは、１つの管状電極を別の管状電極内に配置し、コラーゲン懸濁液を間に入れるパルスＥＰＤの概略側面図及び平面図を示す。図１６Ｄは、ＥＰＤによって作製されたコラーゲンチューブを示す。図１６Ｅは、３Ｄプリントした溝付きの電極及び溝付き電極上に堆積させたコラーゲン膜を示す。図１６Ｆは、溝付き電極上に作製された成形コラーゲン膜のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。感光性架橋剤が混入した多層コラーゲンヒドロゲル膜の剪断及びコマンドセット架橋を示す図である。水和多層フィルムは、所望の形状へと剪断することができる。剪断後、フィルムに青色光を当て、架橋剤を活性化する。これによりフィルムを剪断した形状で固定する。アミノ酸分析によるコラーゲン膜の架橋を示す図である。ＮＲｘは、架橋していないコラーゲンサンプルに対応し、ＭＮｘは、リボフラビンベースの架橋を行ったサンプルに対応する。細胞が混入したコラーゲンフィルムを作製する、コラーゲン及び該細胞の共懸濁液のＥＰＤの概略を示す図である。左側は、細胞堆積領域のおおよその境界を強調した、細胞を堆積させたコラーゲン膜の写真、右側は、細胞の位置を青色の点として示す蛍光顕微鏡写真である。電場に曝した顕微鏡写真の左側は、多数の細胞を含有し、電場に曝していない右側は、細胞を示さず、細胞がＥＰＤによって堆積したことが示される。堆積時にコラーゲン流を誘導し、コラーゲンを流れの方向に整列させるポンプ駆動ＥＰＤセルの概略図である。（ａ）コラーゲン線維は、通常のＥＰＤ条件下ではランダムな配向で堆積し、（ｂ）ＥＰＤ時の流れによりコラーゲン線維が堆積の際に整列する。架橋及び非架橋キャストコラーゲンフィルムのＵＴＳ試験の結果を示す図である。コラーゲンフィルムの光学複屈折を試験するプロセスを概略的に示す図である。左側に明視野顕微鏡検査、右側に偏光顕微鏡検査、上に流れを用いずに堆積させたコラーゲン、下に流れを用いて堆積させたコラーゲンを示す図である。コラーゲンフィルムを堆積時に層堆積界面とコラーゲン線維の懸濁液との間に相対運動が存在する環境で堆積させると、サンプルに起因する測定可能な複屈折が見られる。ＥＰＤによって作製された膜におけるコラーゲン線維によって形成された層状構造の概略図である。ＥＰＤによって作製された、整列した水和コラーゲン膜のＳＥＭ断面を示す図である。線維構造は、密に充填されている。膜の端部及び表面を示す、ＥＰＤによって調製したコラーゲン膜の低倍率での電子顕微鏡像である。図２５に大きな白い四角で示される、図２５の膜のより高倍率の画像である。図２６には層状構造が示される。図２５に小さな白い四角で示される、図２５のコラーゲン膜の表面のより高倍率の画像である。図２７には表面多孔性は殆ど示されない。多孔質足場上へのコラーゲン膜の電気泳動堆積の概略図である。多孔質コラーゲン足場をＥＰＤセル内に浮遊させ、コラーゲン懸濁液を片側に入れ、別の液体（例えば、水）を反対側に入れる。電場をＥＰＤセル全体に印加すると、コラーゲンが多孔質足場に向かい、そこで堆積して、多孔質コラーゲン足場の表面上に緻密なコラーゲン膜が残る。ＥＰＤによる膨張コラーゲン膜の製作の概略図である。（ａ）コラーゲン懸濁液をＥＰＤによって堆積させる。（ｂ）高度に水和したコラーゲン膜を堆積後にＥＰＤセルから取り外す。（ｃ）水和コラーゲン膜を凍結乾燥して、内部多孔性のコラーゲン膜を作製する。コラーゲン膜が付着した多孔質コラーゲン足場の製作の概略図である。（ａ）コラーゲン懸濁液をＥＰＤによって堆積させる。（ｂ）高度に水和したコラーゲン膜を堆積後にＥＰＤセルから取り外す。（ｃ）コラーゲン膜を乾燥させ、緻密なコラーゲン膜にする。（ｄ）膜をモールドに入れ、コラーゲン懸濁液を膜の上に添加する。（ｅ）懸濁液及び膜を凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥して、コラーゲン膜が付着した多孔質コラーゲン足場を作製する。多孔質コラーゲン膜が付着した多孔質コラーゲン足場のμ－ＣＴ画像である。細胞を含むコラーゲンフィルムを作製するためのコラーゲン及び細胞の共懸濁液のＥＰＤの（ａ）側面図及び（ｂ）平面図を示す概略図である。（ａ）及び（ｂ）は、カルセインＡＭ及びエチジウムホモダイマー－１で染色した細胞堆積膜の蛍光画像である。緑色は生細胞を示し、赤色の点は死細胞を示す。ＥＰＤによって作製されたコラーゲンフィルムについての堆積流速（ｃｍ／分）に対する複屈折のグラフである。コラーゲン濃度（ｗｔ％）によるコラーゲン懸濁液の粘度（ｃＰ）の変動を示すグラフである。ＥＰＤによって作製されたコラーゲンフィルムについての粘度（ｃＰ）に対する複屈折のグラフである。２つの異なるＥＰＤ電圧（５Ｖ及び１０Ｖ）についての経時的な堆積質量（ｍｇ）のグラフである。（ａ）キャストコラーゲン膜の密度及び（ｂ）ＥＰＤコラーゲン膜についての堆積電圧による密度（ｇ／ｍｍ^３）の変動を示す図である。

本発明は、堆積コラーゲン層を形成する、電極の表面等の界面で不溶性コラーゲン懸濁液の電気泳動堆積によって作製されるコラーゲン生体材料に関する。

不溶性コラーゲン、すなわちポリマーコラーゲンは、殆どのコラーゲン組織の主要画分を形成する。不溶性コラーゲンは、共有結合で架橋し、小さなオリゴマー凝集体を殆ど有しない大直径原線維を組織する整列したコラーゲン線維の鎖を含む。大直径原線維は、共有結合による原繊維間架橋を有する。不溶性コラーゲンは、商業供給業者から得ることができるか（例えば、Sigma Aldrich（UK）の、例えば不溶性ウシアキレス腱コラーゲン（Ｃ９８７９））、又はポリマーを低ｐＨで透明な溶液／懸濁液へと膨潤させた後、中和によってコラーゲン線維を再凝縮／再凝集することによって天然コラーゲン組織から精製することができる（Steven F.S. (1967) Biochim. Biphys. Acta 140, 522-528、Schofield, J.D. et al (1971) Biochem. J. 124, 467-473、Steven, F.S. et al (1969) Gut 10, 484-487）。

任意の供給源に由来する不溶性コラーゲンを、本明細書に記載される生体材料を生成するために使用することができる。

不溶性コラーゲンの懸濁液は、例えば乾燥不溶性コラーゲンを再水和することによって調製することができる。乾燥不溶性コラーゲンは、エタノール、アセトン又はグリセロールを含む任意の非毒性の水混和性溶媒に再水和することができる。幾つかの実施形態では、乾燥不溶性コラーゲンを酸、好ましくは酢酸、例えば０．０５Ｍ酢酸に４℃で４８時間再水和する。

再水和したコラーゲンは、例えばホモジナイザーを用いた０℃で３０分間の処理によって均質化することができる。幾つかの実施形態では、塩、エタノール及び／又は酢酸は、不溶性コラーゲンの均質化懸濁液に導入することができる。

均質化懸濁液のζ電位は、懸濁液の安定性及び堆積速度に影響を及ぼし得る。均質化懸濁液のζ電位は、１０以上、好ましくは３０以上であるのが好ましい。

本開示では、不溶性コラーゲン懸濁液の電気泳動は、電極表面等の層堆積界面での堆積コラーゲンの層の形成を可能にする。

本明細書に記載されるように作製された堆積コラーゲンの層は、コラーゲンの線維の配列を含み得る。層は、層内に広がる平面に対して垂直な厚さ方向を有し得る。厚さ方向に対して垂直であり、層内に広がる平面内にある或る範囲の面内方向を規定することができる。

幾つかの実施形態では、コラーゲンの線維の配列は、堆積層において面内に無作為に配向されていてもよい。

他の実施形態では、コラーゲンの線維の配列は、堆積層において第１の面内方向に実質的に整列することができる。第１の面内方向は、層の最大極限引張強さ（ＵＴＳ）の方向に相当し得る。例えば、層は、最大でも最大ＵＴＳの９０％である、第１の面内方向に平行でない第２の面内方向のＵＴＳを有し得る。ＵＴＳは、標準的な技法を用いて測定することができる。例えば、コラーゲン層に、それが機能しなくなり、応力－ひずみ曲線上の最大値が測定されるまで制御された張力をかけることができる。ＵＴＳを決定する好適な方法は、
長方形又は亜鈴型の膜のサンプルを準備すること、
任意に、サンプルを液体媒体に再水和すること、
サンプルの初期厚さ及び幅を測定すること、
サンプルを機械試験機の適切なグリップに固定し、グリップ間の距離を測定すること、
引張力を印加すると共に、サンプルの伸長及び印加力を記録すること、
サンプルが破断するまで引張力を増大すること、
記録された厚さ及び幅を用いて、引張力を応力測定値に変換すること（応力＝力／面積）、
伸長をひずみ測定値に変換すること（ひずみ＝伸長／元の長さ）、
応力をｙ軸とし、ひずみをｘ軸として応力及びひずみをグラフにプロットすること、
を含み得る。ここで、極限引張応力は、応力－ひずみ曲線上のピーク値として規定される。

本明細書に記載されるように作製された堆積コラーゲンの層は、複屈折であってもよい。コラーゲンの線維は、層の複屈折が、偏光顕微鏡法を用いて測定した場合に少なくとも０．０１５であるように第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列し得る。より好ましくは、層の複屈折は、偏光顕微鏡法を用いて測定した場合に少なくとも０．０２、少なくとも０．０２５又は少なくとも０．０３であり得る。コラーゲン膜の複屈折を測定する好適なプロトコルを下記に示す（実施例１８を参照されたい）。

第２の面内方向は、第１の面内方向に対して実質的に垂直であり得る。

本明細書に記載される層は、少なくとも５μｍ又は少なくとも１０μｍの厚さを有し得る。本明細書に記載される層は、最大５０μｍ若しくは最大１００μｍ、又はそれ以上の厚さを有し得る。例えば、層は、厚さ１０μｍ～５０μｍであり得る。

層の表面積は、層堆積界面の面積によって決まり、層の使用目的の要件を満たすように調整することができる。幾つかの好ましい実施形態では、本明細書に記載される層は、平面図で見た場合に少なくとも２０ｃｍ^２、少なくとも３０ｃｍ^２、少なくとも５０ｃｍ^２、少なくとも１００ｃｍ^２、少なくとも５００ｃｍ^２又は少なくとも１０００ｃｍ^２の面積を有し得る。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるコラーゲンの少なくとも２つの層は、積層構造（多層構造）を形成することができる。積層構造内の層は、互いに実質的に平行又はより好ましくは実質的に垂直なそれぞれの第１の面内方向を有し得る。言い換えると、積層構造内の層は、積層構造内の少なくとも１つの他の層に対して所定の角度で配置されたそれぞれの第１の面内方向を有することができ、所定の角度は０°～９０°の角度である。好ましくは、所定の角度は１０°～９０°、例えば１０°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、８０°又は９０°であり、ここで角度は、積層構造内の各層のそれぞれの第１の面内方向によって規定される２本の線の間の最小の角度として測定される。好適な積層構造は、例えば下記のような複数回の電気泳動堆積によって作製することができる。

本明細書に記載されるコラーゲンの層は、管状構造を形成していてもよい。管状構造内の層は、シームレスであり得る。例えば、５００μｍ以上の断面直径を有する管状構造を作製することができる。

本明細書に記載される又は本明細書に記載の方法によって形成されるコラーゲンの層又はコラーゲン膜（単層又は多層）は、外科手術時の体液の収容に、又は血液喪失を阻止するパッチとして、又は静脈若しくは動脈代替物として使用することができる。

幾つかの実施形態では、コラーゲンの線維の配列を含む層は、パルス電気泳動堆積によって作製することができる。例えば、方法は、パルス電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することを含み得る。

パルス電場の電場強度は、１０ボルト／ｍ～５０００ボルト／ｍ、好ましくは１００ボルト／ｍ～２０００ボルト／ｍの範囲であり得る。

パルス電場の平均パルス長は、１０ｍｓ～１００ｍｓ、例えば１５ｍｓ～５０ｍｓの範囲であり得る。

パルス電場のデューティサイクルは、２０％～７０％、好ましくは３０％～６０％であり得る。

パルス電場を対向する電極間に印加することができる。電極の少なくとも一方を懸濁液と接触させることができ、電極の表面が層堆積界面を与えることができる。

電極の表面が層堆積界面を与える場合、パルスＥＰＤのための電極間の電位差は、１Ｖ～２０Ｖ、好ましくは３Ｖ～１５Ｖであり得る。

他の実施形態では、コラーゲンの線維の配列を含む層は、非パルス電気泳動堆積によって作製することができる。例えば、方法は非パルス電場、例えばＤＣ電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することを含み得る。

幾つかの実施形態では、例えば印加電圧（本明細書で堆積電圧とも称する）時間を変化させることによって電場を経時的に変動させ、それにより堆積コラーゲンを含む層の密度を変動させることができる。例えば、方法は、堆積電圧を経時的に変動させ、それにより堆積コラーゲンを含む層の密度を変動させることを含み得る。堆積層の密度を制御することによって、特にｉｎｖｉｖｏ用途のために種々の分解性を有する膜を作製することが可能であり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、より高密度の層がよりゆっくりと分解することを提唱する。

幾つかの実施形態では、堆積電圧を経時的に上昇させ、それにより堆積層の厚さ全体にわたる堆積層の密度を増加させることができる。他の実施形態では、堆積電圧を経時的に低下させ、それにより堆積層の厚さ全体にわたる堆積層の密度を減少させることができる。厚さ方向の層の密度の変動を制御することによって、変動する経時的な分解速度を有する層を提供することが可能であり得る。

幾つかの実施形態では、複数のコラーゲン層を堆積させることができ、後続の層の電気泳動堆積において電場が異なっていてもよい。このようにして、多層構造内の一部又は全部の層の密度が異なる多層コラーゲン構造を作製することが可能であり得る。

層堆積界面は、電場によって懸濁液中に生成した気泡ラフトを含み得る。気泡ラフトを懸濁液と接触する電極の表面で生成し、それにより層堆積界面を電極の表面から空間的に分離することができる。この場合、気泡は、懸濁液（例えば、水）に含まれるキャリア液の電気分解によって生成する。

電場を対向する電極間に印加することができ、電極間の電位差は、例えば少なくとも２０Ｖである。電極間の電位差は、例えば最大でも２００Ｖであり得る。

好ましい実施形態では、不溶性コラーゲン懸濁液を電気泳動堆積の前に透析してもよい。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電気泳動堆積前に透析して実質的に塩を除去した不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、電場を懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することとを含み得る。

幾つかの実施形態では、方法は、不溶性コラーゲン懸濁液を透析する工程を含み得る。１回以上の透析工程を用いて、懸濁液の塩含有量を所望のレベルまで徐々に低下させることができる。透析は、例えば異なる不溶性コラーゲンの供給源間の堆積の一貫性を保つ上で有用であり得る。

例えば透析膜を用いた好適な透析方法は、当該技術分野で既知である。例えば、懸濁液をセルロース透析膜内に入れ、脱イオン水中で２４時間透析することができる。

幾つかの実施形態では、コラーゲン層を剥離層の表面上に堆積させることができる。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、剥離層の表面を含む層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することを含み得る。

剥離層は、電極からの堆積層の分離が可能となるように電極の表面にあってもよい。剥離層は、電極からの堆積層の分離が可能となるように選択的に除去される犠牲層であり得る。

犠牲層は、犠牲ポリマーを含むコーティングであり得る。好適な犠牲ポリマーは、非毒性とすることができ、好ましくは第１の溶媒、例えばアセトン等の有機溶媒に可溶性であり、酸性水溶液に不溶性である。

好適な犠牲ポリマーは、酢酸セルロースを含む。コラーゲン層の堆積後に、コーティング内の犠牲ポリマーを、第１の溶媒を用いて溶解し、堆積層を電極から放出させることができる。ＥＰＤによって堆積したフィルムを放出させるための酢酸セルロース犠牲層の使用は、当該技術分野で既知である（S. A. Hasan, et al ACS Nano, 4,. 12, pp. 7367-7372, 2010）。本明細書に記載されるように作製されたコラーゲン層は、任意の好適な分析法によって分析又は特性評価することができる。好適な方法としては、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）が挙げられる。例えば、コラーゲン層は、様々なＩＲ光にわたる各波長でのコラーゲン層の吸収を示すＦＴＩＲスペクトルを生成することによって分析することができる。波長での吸収は、層内に存在する特定の分子結合及び遷移によって決まり、ＦＴＩＲスペクトルは、コラーゲン層の組成に特徴的であり得る。２つのコラーゲン層の組成の違いは、それらのＦＴＩＲスペクトルにおける付加的なピークの有無によって示され得る。

本明細書に記載の方法は、非平面プロファイルを有する成形コラーゲン層の作製に有用であり得る。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲンの懸濁液全体に印加して、少なくとも非平面プロファイルを有する領域を含む層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせることを含んでいてもよく、上記非平面プロファイルを有する領域を含む層堆積界面の形状と適合するように層が形成される。

非平面プロファイルを有する領域は、層堆積界面の少なくとも５０％を占めることができる。

非平面プロファイルを有する領域は、１つ以上の突出又は陥凹を含み得る。例えば、界面の領域上に形成される層は、１つ以上の溝及び／又は隆起を含み得る。

非平面プロファイルを有する領域は、部分的な又は連続した曲線プロファイルを含み得る。例えば、界面の領域上に形成される層は、シームレスなチューブを含み得る。

幾つかの実施形態では、層堆積界面は、膜又は足場によって与えられる。幾つかの実施形態では、膜又は足場は、コラーゲンから形成される。例えば、層堆積界面は、コラーゲン膜又はコラーゲン足場によって与えられ得る。他の実施形態では、膜又は足場は、非コラーゲン材料から形成される。例えば、膜又は足場は、ニトリルゴム又はシリコーンゴムから形成することができる。幾つかの実施形態では、膜又は足場は、穿孔又は細孔を含有し得る（膜又は足場は多孔質であり得る）。

幾つかの実施形態では、膜又は足場は、一方の主要表面で懸濁液と接触し、膜又は足場の対向する主要表面が第２の液体、例えば水、エタノール、アセトンから選択される液体、又はこれらの液体の任意の組合せと接触する。他の実施形態では、膜又は足場が懸濁液内に保持され、膜又は足場の両方の主要表面が懸濁液と接触してもよい。

例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、対向する主要表面を有するコラーゲン膜によって与えられる層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせることを含んでいてもよく、コラーゲン膜が懸濁液内に保持され、両方の主要表面が懸濁液と接触する。

層堆積界面は、一方の電極の表面によって与えられ、任意に犠牲層が本明細書に記載される電極の表面に形成されていてもよい。電極表面は、上記のような非平面プロファイルをもたらすことができる。

代替的には、層堆積界面が電極表面又は電極表面上に形成される犠牲層によって与えられない場合、電極の形状が依然として堆積層の形状に影響を与え得る。例えば、電極に電場濃縮特徴を設けてもよい。好適な電場濃縮特徴は、電極の局所的形状のために電場が濃縮される鋭い突出を含む。電場濃縮特徴に対応する（例えば、それを覆う）層堆積界面の位置で、堆積コラーゲンのより迅速な蓄積を見ることができ、対応する堆積層の厚さの局所的増加、ひいては堆積層の形状の変動がもたらされる。

層堆積界面を与えるコラーゲン膜は、本明細書に記載の方法によって作製することができる。

幾つかの実施形態では、コラーゲン線維は、層堆積界面と懸濁液との間の相対流によって堆積層内に整列することができる。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせることと、層堆積界面と懸濁液との間で相対運動方向に相対運動を生じさせ、それにより層内のコラーゲン線維の整列を生じさせることとを含み得る。線維は、相対運動方向に実質的に平行な第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列することができる。

層堆積界面と懸濁液との間の相対運動又は相対流は、任意の簡便な方法によって発生することができる。例えば、ポンプを用いることで懸濁液が層堆積界面を横断してもよく、又は例えば電極の回転若しくはスピンによって層堆積界面が懸濁液中を移動してもよい。

層堆積界面と懸濁液との間の相対流は、１ｃｍ／分～１５ｃｍ／分、好ましくは３ｃｍ／分～１０ｃｍ／分の範囲であるのが好ましい。この範囲の相対流速を与えることで、最適なコラーゲンの堆積をもたらすことができる。

第１の層の堆積後に、相対運動方向を変化させ、線維が第１の面内方向と平行でない第２の面内方向に沿って層内に実質的に整列した後続の層を堆積させることができる。第２の面内方向は、第１の面内方向に対して１°～９０°、例えば第１の面内方向に対して１０°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、８０°又は９０°の角度で配置することができ、ここで角度は、それぞれ第１の面内方向及び第２の面内方向によって規定される２本の線の間の最小の角度として測定される。

幾つかの実施形態では、１つ以上の治療化合物（薬物）が堆積コラーゲン層に組み込まれ得る。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲン線維及び１つ以上の治療化合物を含む懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維及び１つ以上の治療化合物の電気泳動堆積を生じさせ、それにより１つ以上の治療化合物が含まれた堆積コラーゲンを含む層を構築することを含み得る。例えばテトラサイクリン、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ミノサイクリン、テイコプラニン、スルバクタム－セフォペラゾン、セフォタキシム、フシジン酸若しくはクリンダマイシン、又は他の任意の好適な治療化合物を含む広範な治療化合物がこのような電気泳動堆積に好適であり得る。

幾つかの実施形態では、複数のコラーゲン層を堆積させることができ、例えば後続の各層を堆積させる電場の印加前に懸濁液中の１つ以上の治療化合物の濃度を変化させることによって、１つ以上の治療化合物の濃度を後続の層の電気泳動堆積間で変化させることができる。このようにして、１つ以上の治療化合物の濃度が多層膜の層の一部又は全部で異なる、１つ以上の治療化合物が含まれた多層コラーゲン膜を形成することが可能であり得る。このようにして、様々な薬物放出プロファイルを有するコラーゲン膜を提供することが可能である。

幾つかの実施形態では、１つ以上の治療化合物の濃度が同じままであるか、又は後続の層の電気泳動堆積間で変動し、得られる多層構造内の一部又は全部の層の堆積において電場が異なる、複数のコラーゲン層を堆積させることができる。このようにして、多層膜の一部又は全部の層の密度が異なる１つ以上の治療化合物が含まれた多層コラーゲン膜を提供することが可能であり得る。このようにして、異なる密度を有する層の異なる分解性のために様々な薬物放出プロファイルを有するコラーゲン膜を提供することが可能である。

幾つかの実施形態では、哺乳動物細胞が堆積コラーゲン層に組み込まれ得る。例えば、コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法は、電場を不溶性コラーゲン線維及び生存哺乳動物細胞を含む懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維及び細胞の電気泳動堆積を生じさせ、それにより生存哺乳動物細胞が埋め込まれた堆積コラーゲンを含む層を構築することを含み得る。

哺乳動物細胞は、収縮構造を与える筋細胞、導電性要素を与える血管細胞及び／又は神経細胞、分泌構造を与える肝細胞、ホルモン合成細胞、脂腺細胞、膵島細胞又は副腎皮質細胞等の代謝的に活性な分泌細胞、皮膚線維芽細胞等の線維芽細胞、皮膚ケラチノサイト、メラニン細胞（及びその２つの複合層）、神経移植のためのシュワン細胞等のニューロン及びグリア細胞、血管構造のための平滑筋細胞及び内皮細胞、膀胱／尿道構造のための尿路上皮細胞及び平滑筋細胞、骨及び腱構造のための骨細胞、軟骨細胞及び腱細胞、並びに角膜（角膜縁）幹細胞、表皮幹細胞、腸管（腸）幹細胞、泌尿生殖器幹細胞、気管支幹細胞及び他の上皮幹細胞、骨髄幹細胞、成長板幹細胞等の幹細胞を含み得る。好ましい細胞としては、皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、幹細胞及び軟骨細胞を挙げることができる。

細胞は、コラーゲン生体材料又は複合材料の隙間に任意の配置で分布することができる。例えば、細胞はコラーゲン生体材料若しくは複合材料全体に均一に分布していても、又は生体材料の１つ以上の層に分布していてもよい。

哺乳動物細胞は、生存性を維持する温度、中性ｐＨ、イオン強度、オスモル濃度及び剪断の好適な条件下でコラーゲン懸濁液に組み込むことができる。細胞を添加し、及び／又は細胞生存性の維持に好適な条件をもたらす１つ以上の付加的な成分を添加する前にコラーゲン懸濁液を中和するのが好ましい。例えば、スクロース、グルコース、Ｍｇ^２＋及び塩化ナトリウム等の炭素源及び塩を懸濁液に添加することができる。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を懸濁液に添加してもよい。例えば、ヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸を、例えば３ｇ／Ｌ～０．０３ｇ／Ｌの濃度で懸濁液に添加してもよい。ＧＡＧを懸濁液に添加することで、凝集体の電荷の増大によりコラーゲン線維及び／又は細胞の電気泳動堆積が改善し得る。懸濁液のオスモル濃度は、２５０Ｏｓｍ／Ｌ～３５０Ｏｓｍ／Ｌ、好ましくは約３００ｍＯｓｍ／Ｌに調整することができる。細胞は、例えばピペット播種の後に穏やかに混合することによってコラーゲン懸濁液に添加することができる。懸濁液の導電性は、約３．２ｍＳ／ｃｍであり得る。

コラーゲン懸濁液中の初期細胞密度は、約１×１０^４細胞／ｍｌ～１×１０^７細胞／ｍｌ、より好ましくは約１×１０^５細胞／ｍｌ～５×１０^６細胞／ｍｌ、例えば１．５×１０^５細胞／ｍｌ～３．５×１０^６細胞／ｍｌであり得る。

細胞死又は損傷を低減及び／又は防止するために、哺乳動物細胞を含むコラーゲン層又は生体材料は、使える状態になるまで生存性を維持するが、細胞増殖を支持しない条件下で保管され得る。層又は生体材料は、例えば凍結して、又は低温、室温若しくは３７℃で保管することができる。層又は生体材料は低温、例えば０℃～１０℃で、又は抗凍結剤の存在下で凍結して（０℃未満）保管することができる。層又は生体材料は、例えば１週間までの短時間、細胞培養培地中で保管することができる。

幾つかの実施形態では、層又は生体材料は、乾燥（drying or desiccation）、例えば熱、気流又は真空による乾燥に供することができる。他の実施形態では、層又は生体材料は、例えばコラーゲン層又は生体材料からの最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％又は最大８０％（ｗ／ｗ）の液体の除去によって部分的に脱水することができる。この部分的な脱水は、前述の乾燥の結果であり得る。層又は生体材料が哺乳動物細胞を含む場合、層又は生体材料を最大でも部分的に脱水し得るのが好ましい。完全な脱水は、層又は生体材料に含まれる哺乳動物細胞を死滅させる可能性がある。

幾つかの実施形態では、層又は生体材料は、凍結乾燥（低温乾燥（cryodesiccation）又はフリーズドライとしても知られる）による乾燥に供することができる。層又は生体材料を凍結乾燥に供することで、多孔質コラーゲン膜又は足場を形成することができる。凍結乾燥前のコラーゲン層又は生体材料のフリーズドライパラメーター及び厚さを変更することによって、最終多孔質コラーゲン膜／足場の多孔性を変更することができる。

幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって作製される（例えば、本明細書に開示される方法によって作製されるコラーゲン層の乾燥によって作製される）コラーゲン膜は、コラーゲン膜が組み込まれた多孔質コラーゲン足場を作製するために使用することができる。かかる方法では、コラーゲン膜をコラーゲン懸濁液と共にモールドに入れることができる。次いで、コラーゲン膜及びコラーゲン懸濁液の入ったモールドを、凍結乾燥（フリーズドライ）して、コラーゲン膜が付着した多孔質コラーゲン足場を形成することができる。

本明細書に記載の方法は、変形及び成形することができる層状複合材料の作製に有用であり得る。層状複合材料は、例えば各々がコラーゲンの線維の配列を含む少なくとも第１の線維層及び第２の線維層を含み得る。材料は、第１の線維層及び第２の線維層に挟まれた形状適合層を更に含み得る。形状適合層は、第１の線維層及び第２の線維層を実質的に損傷することなく剪断変形可能であり、層状複合材料を所要の形状に適合することができる。

好適な層状複合材料は、
電場を不溶性コラーゲン線維の懸濁液全体に印加して、層堆積界面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築し、第１の線維層を形成することと、
形状適合層を第１の線維層上に堆積ことと、
同じ又は更なる不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
電場を懸濁液全体に印加して、形状適合層の表面で不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築し、第２の線維層を形成することと、
を含む方法によって製造することができる。

第１の形状を有する層状複合材料は、第１の線維層及び第２の線維層を損傷することなく、形状適合層の剪断変形によって第１の形状を第１の形状とは異なる第２の形状へと変形させ、形状適合層を設定することによって所要の形状に適合させることができる。

少なくとも第１の線維層において、コラーゲンの線維は、第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列し得る。

第２の線維層では、コラーゲンの線維は、第１の面内方向と平行でない第２の面内方向に沿って層内に実質的に整列し得る。第２の面内方向は、第１の面内方向に対して１°～９０°、例えば第１の面内方向に対して１０°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、８０°又は９０°の角度で配置することができ、ここで角度は、それぞれ第１の面内方向及び第２の面内方向によって規定される２本の線の間の最小の角度として測定される。

形状適合層は剪断減粘性材料、例えばヒアルロン酸、ラブリシン、キサンタンガム、カラギーナン、ＧＡＧヒドロゲル、及びメタクリル化ＨｙＡ等のＨｙＡ誘導体を含む。

形状適合層は、形状適合層を架橋するように活性化可能な架橋剤を更に含み得る。好適な架橋剤としては、リボフラビン、Ｉｒｇａｃｕｒｅ及びローズベンガルを挙げることができる。

形状適合層は、本明細書に記載される電気泳動堆積によって第１の線維層上に堆積させることができる。複合材料における１つ以上の形状適合層の存在により、作製後に材料を成形することが可能となる。このことは、臨床患者の欠陥の形状に対応させた複合材料の形状の調整に有用であり得る。

幾つかの好ましい実施形態では、層状複合材料は、少なくとも４つの線維層と、それぞれの線維層を隔てる少なくとも３つの形状適合層とを含み得る。

本明細書に記載のコラーゲン層、生体材料及び複合材料は研究、又は療法、医薬開発、細胞培養、整形外科、皮膚科学、歯科、例えば歯茎（dental ridge）増成、及び例えば皮膚再生の促進のための創傷治癒への使用に有用であり得る。

本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態を提供する。

本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。

上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。

本明細書で言及される全ての文献及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。

実験
１．材料及び方法
コラーゲン懸濁液の調製
コラーゲンを不溶性ウシアキレス腱コラーゲン（Ｃ９８７９ Sigma Aldrich，UK）から０．０５Ｍ酢酸に４℃で４８時間浸漬することによって再水和した。次いで、これを、Ｕｌｔｒａ－ＴｕｒｒａｘＶＤ１２５ホモジナイザー（VWR International Ltd，UK）を用いて乳状の外観が達成され、大きな粒子が見られなくなるまで氷上にて１００００ｒｐｍで３０分間均質化した。次いで、エタノールを更なる均質化下で添加した。懸濁液のζ電位を、ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ－ＺＳ（Malvern Instruments）によるレーザードップラー電気泳動を用いて決定した。

ヒアルロン酸溶液の調製
ヒアルロン酸（ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）に由来するヒアルロン酸ナトリウム塩、９１％、Alfa Aesar，UK）を氷下でＤＩ水に溶解し、Ｕｌｔｒａ－ＴｕｒｒａｘＶＤ１２５ホモジナイザー（VWR International Ltd，UK）を用いて１００００ｒｐｍで５分間、目に見えるヒアルロン酸が存在しない透明な混合物が達成されるまで均質化した。溶液を一晩冷蔵し、１２０００ｒｐｍでの均質化下で７０ｖｏｌ％までエタノールを滴加する間、氷上にて維持した。

ＤＣ－ＥＰＤ及びパルスＥＰＤによる電気泳動堆積
ＥＰＤを、堆積面積２．５ｃｍ×３．５ｃｍでシリコーンゴムスペーサーによって隔てられた２つの３１６Ｌ鋼電極からなる、図１ａに概略的に示すような特注セルを用いて定電圧で行った。２つの電極をＤＣ－ＥＰＤではＥＰ－６０３ＤＣ電源（Manson Engineering Industrial Ltd）、又はパルスＥＰＤではＴＧＡ１２４１任意波形発生器（TTI）に接続した。

パルス電圧ＥＰＤでは、図１ｂに示すパルス長、デューティサイクル及び電圧を独立して変動させることができる定電圧のパルスを用いる。デューティサイクルは、ＤＣ＝パルス周期／パルス長として規定され、電圧が０を超える時間の総和をＴ_ｏｎと呼ぶ。すなわち、ＤＣ＝Ｔ_ｏｎ／（Ｔ_ｏｎ＋Ｔ_ｏｆｆ）。特に指定のない限り、堆積を１．５時間の総Ｔ_ｏｎで行った。堆積フィルムをそのまま評価するか、又はヒュームフード内で一晩乾燥させ、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＣＰ１２４Ｓ天秤（０．０００１ｇ±０．０００１）を用いてフィルムの乾燥質量を測定した。

多層電気泳動堆積を行うために、コラーゲン又はヒアルロン酸をセル内に注入した後、所要のＴ_ｏｎにわたって発生器を作動させた。堆積後に電極を取り外し、ヒュームフード内で風乾した。電極をＥＰＤセルに再び付着させ、所望の懸濁液を注入し、パルス電場を印加することによって後続の層を作製した。これは図２に概略的に見ることができる。

比較用の溶媒キャストコラーゲン膜の調製
キャストフィルムを、５ｍｌのコラーゲン懸濁液をシリコーンモールド（Lakeland Ltd.）に注入した後、ヒュームフード内で一晩乾燥させることによって調製した。サンプルはモールドを逆さにすることによって取り外した。

原子間力顕微鏡法
ＡＦＭは、サンプルをシリコン基板上に置き、室温でＲＴＥＳＰシリコンＡＦＭチップ（Veeco：共振振動数２００４００Ｈｚ、ばね定数２０４０Ｎ／ｍ）を用いてライトタッピングモードでＤｉｍｅｎｓｉｏｎ３１００（Bruker Ltd）により画像化することによって行った。スキャンは、０．５ＨＺの走査速度、１列当たり５１２サンプルでランダム配置にて行った。画像解析をＧｗｙｄｄｉｏｎソフトウェアで行った（３６）。

ＳＥＭ及びｃｒｙｏＳＥＭ
ＳＥＭ用のサンプルをスタブに取り付けた後、金ターゲットを用いて２５ｍＡで４分間スパッタコーティングした。サンプルをＪＥＯＬＪＳＭ－５８００ＬＶＳＥＭ（JEOL UK Ltd）において１５ｋＶの加速電圧にて二次電子画像化モードで画像化した。

ｃｒｙｏＳＥＭ用のサンプルをスラッシュ窒素（slushy nitrogen）により－１９５℃で凍結し、真空下で粉砕した後、その場で白金ターゲートによりスパッタコーティングした。次いで、サンプルをＺｅｉｓｓＥＶＯＨＤ１５（Carl Zeiss Ltd）に移し、２５ｋＶの加速電圧にて後方散乱電子画像化（ＢＳＤ）モードで画像化した。

μ－ＣＴ
マイクロコンピュータ断層撮影（μ－ＣＴ）による３Ｄ視覚化を、Ｓｋｙｓｃａｎ１２７２システム（Bruker microCT）を用いて行った。画像は、４ｋカメラを動作電圧２５ｋＶ、画素サイズ１．２５μｍ、ステップサイズ０．２°、フレーム平均２及び回転１８０°で用いたものであった。投影をＮＲｅｃｏｎでフルコーンビームフェルドカンプ再構成アルゴリズムを用いて３Ｄデータセットに加工した後、ＣＴＶｏｘ（Bruker Ltd.）で視覚化した。

コラーゲン懸濁液の透析
コラーゲン懸濁液を上記のように生成した後、セルロース透析膜に封入し、脱イオン水中で２４時間、最初の２時間後及び４時間後に水を交換して透析した。透析の水は通常、これよりも多く、例えば４８時間で最大４、５回交換する。

比較アッセイのために、コラーゲン溶液を４つの異なる供給業者から入手したコラーゲンＩストックから生成し、上記のように透析した。Sigmaウシアキレス腱コラーゲン１－Ｃ９８７９、CS-Dermal －０１ＡＷＢ００４（ＣＳ０１０）、Devro －０１ＡＷＢ００３（ＦＳ２８００５）、CD-Tendon －ＣＳ３０１。

２．結果
実施例１：コラーゲン堆積に対するパルスパラメーターの影響
表面形態に対するパルスパラメーターの影響を調査するために、０．０１ｗｔ％コラーゲンスラリーについて様々なパルス幅、デューティサイクル及び電圧を用いて５分間の総Ｔ_ｏｎでパルスＥＰＣによって一連のコラーゲンフィルムを調製した。

パルス幅の影響：堆積物中に形成される気泡の数（電極での水素ガスの発生に起因すると考えられる）は、初めに５０ｍｓから１ｍｓへのパルス時間の短縮と共に減少し、その後パルス時間を１ｍｓ未満に短縮すると再び増加した。用いた低パルス幅により、パルスＥＰＤによるコラーゲンの堆積が電極でのガスの発生に強く影響を受けることが示される。パルスＥＰＤは、それぞれ別個のパルスによりガス生成部位に変化をもたらすことで堆積物中の気泡の形成を低減することが理論化されている。理論に束縛されることを望むものではないが、パルス長が十分に短くなると、その後のパルスにおいて部位が再び活性化する前にガス分子がガス生成部位から離れて拡散する時間が十分でないと理論化することによって１ｍｓ未満での気泡形成の増加を説明することができる。

堆積物形成に対するデューティサイクルの影響：デューティサイクルを５０％から２０％に減少させることで堆積物中に生じる気泡の数の減少が見られるが、デューティサイクルが２０％に達すると、フィルムの形成が中断され、一貫した堆積物は得られなかった。

堆積物形成に対する電圧の影響：生じる気泡の量及び堆積物の品質の両方に明らかな変化を見ることができる。５Ｖでは多数の気泡が堆積物中に存在し、４Ｖでは気泡が存在せず、一貫した堆積物が見られ、３Ｖでは堆積物が形成されなかった。

実施例２：コラーゲン堆積に対する有機液体の添加の影響
コラーゲン懸濁液への有機液体の添加の影響を調査するために、水と完全に混和性であり、非毒性であることからエタノールを選択した。

図４は、混合酢酸：エタノール懸濁液中のエタノールの割合に対するコラーゲンのζ電位を示す。ζ電位は、エタノールの割合を５０％エタノールまで増加させることで線形に上昇した。このエタノールの割合を超えると、ζ電位の読み取り値を決定することができなかった。

次いで、堆積フィルムに対するエタノールの影響を検証するために、コラーゲンフィルムを、エタノールの割合を変動させてパルスＥＰＤによって堆積させた（Ｖ＝５Ｖ、パルス長＝２５ｍｓ、ＤＣ＝４０％、間隔＝７．６５ｍｍ）。２５％エタノールでは、堆積フィルムは気泡形成の影響を示し、フィルムの表面に大きな穴及び白く曇った構造の形態で多量の目に見える損傷を有しており、５０％エタノールでは、堆積フィルムは発生したガスに起因する損傷を有さず、無欠陥堆積物が得られ、７５％では無欠陥フィルムが形成されたが、フィルムは大幅に緻密でなく、頑強性が低かった。有機媒体の体積分率が増大すると、水画分がそれに応じて減少し、電解され得る電極と接触する水の量が減少し、発生するガスの量が減少する。

実施例３：コラーゲン堆積に対するパルス幅の影響
パルス幅の変更が所与のＴ_ｏｎで電極上に堆積するコラーゲンの質量に影響を及ぼすかを決定するために、Ｔ_ｏｎを一定にして様々なパルス幅で堆積質量を測定した。

コラーゲンの０．１ｗｔ％懸濁液を５分間のＴ_ｏｎで堆積させた。１０ＶでのパルスＥＰＤでは、およそ０．００１ｇの質量が堆積し、電位を５Ｖに設定すると、この質量は０．０００６ｇまで減少する（図５）。より低い印加電位により浮遊粒子の速度、ひいては堆積物形成の速度が低下することから、より低い印加電位での堆積質量の減少が予想される。さらに、両方の印加電位で、パルス幅の変更は堆積するコラーゲンの質量に影響を有しなかった。これにより、パルス幅を変更した場合に質量移動速度の違いが殆ど見られないことが示唆される。

実施例４：複数のコラーゲン層の堆積
セラミック系のＥＰＤでは、材料が電極で堆積するにつれてＥＰＤセルの抵抗が増大し（３７）、堆積速度が低下し、後続の各堆積工程において堆積させることができる質量が減少することが一般に認められている。この質量堆積速度の低下が、イオンと帯電した堆積物との間の静電相互作用、並びに堆積粒子の細孔径及びデバイスクリーニング長等の様々な変数に依存する堆積物中の帯電種の保持を含む複雑な機構によって制御されることが提唱されている（２７）。

更なる層の堆積に対する堆積コラーゲンの影響を決定するために、コラーゲンを電極上に順次堆積させ、各堆積工程間に電極を乾燥させ、集結させた。図６に示すこの結果から、堆積したコラーゲンの質量が驚くべきことに先の堆積工程の影響を受けなかったことが示される。さらに、コラーゲン懸濁液を各堆積後に乾燥させることなく交換しても、各工程において堆積させることができる質量が変化しないことが見出された（データは示さない）。

コラーゲン堆積物を初めにＥＰＤにおいて作製すると、高度に水和したゲルを形成する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＥＰＤセルの抵抗の最小限の増大をもたらす導電性経路が存在することから、この初めに堆積したゲルが導電性種の通過を可能にするのに十分な多孔性を有するようである。乾燥時に堆積ゲルが崩壊し、元の堆積物の厚さにまで再水和することができない、およそ１００倍薄い、はるかに緻密なフィルムが生じる。堆積挙動、ひいては電気伝導性が影響を受けないことが見出された。緻密化したコラーゲン膜が依然としてイオン輸送を妨げないほど十分に透過性であるか、又は水和コラーゲン膜が、電場を印加した場合に、コラーゲン線維間の二重層反発力に影響を及ぼす構造変化を受け、膜の多孔性を変化させ、導電性イオンの経路を生じるか、又はコラーゲン膜が電位の印加時に急速に帯電する可能性がある。これを図７に概略的に示す。

実施例５：コラーゲン堆積物の微細構造
コラーゲンフィルムをパルスＥＰＤ及び溶液流延によって作製した。乾燥フィルムをＡＦＭ及びＳＥＭによって調べ、水和フィルムをｃｒｙｏＳＥＭで調べた。

コラーゲン膜を堆積後に電極から取り外すために、かみそりの刃を電極と膜との間に通すことによる機械的劈開を用いた。分離による損傷は見られず、フィルムは、基板から取り外した後も機械的安定性、完全性及び柔軟性を維持した。

図８ａは、パルスＥＰＤコラーゲンフィルムのＡＦＭ高さマップを示す。表面上に多数の円形及び環状構造を見ることができる。これらのより大きな円形構造の多くは、堆積プロセスにおけるミクロ気泡の発生に起因する可能性があり、崩壊した気泡の残骸が環構造となる。これは、ミクロ気泡は核となることができたが、これらの目に見えるミクロ気泡のいずれも合体してより大きなマクロ気泡となることができないため、パルスＥＰＤにおいてガス発生部位を変化させる機構と一致する。図８ｂに見られるコラーゲンフィルムの表面のＳＥＭ調査では、同様の構造が示され、フィルムの表面全体がミクロ気泡又はコラーゲン球に起因する小さな円形の塊を有する平面となる。図８ｃ及び図８ｄは、溶液流延によって形成されたコラーゲンフィルムの表面を示し、気泡の崩壊によって生じる特徴的な環構造が予想される通りには見られないが、広く同様の形態を見ることができる。キャストフィルムとパルスＥＰＤフィルムとの表面の類似性は、多数のコラーゲン球が存在する凹凸のある表面形態を示す図８ｄに確認される。

内部のミクロン及びサブミクロンの細孔の存在は、図８ｇに示す断面ｃｒｙｏＳＥＭによって見ることができる。この多孔性は、堆積中に膜の表面上で核形成され、続いて更なるコラーゲン線維で覆われ、膜の内部に空隙を残した気泡に起因する可能性がある。これにより、細孔が乾燥プロセス中に開いたままであることから、堆積物と接触した後のコラーゲン線維の運動が制限されることが示される。しかしながら、この機構により形成される細孔は、膜の微細構造に対して局所的以上の影響を与えるには小さ過ぎる。また、図８ｆ及び図８ｇは、電極からの機械的分離に起因する膜の端部での損傷の兆候を示していない。

ｃｒｙｏＳＥＭを用いて膜の全体的な微細構造も調べた。図８ｆ及び図８ｇは、膨潤膜の内部微細構造を示す。膜は、その長さ全体にわたって明らかに均一な厚さであり、図８ｇでは、緻密な層状構造内の多くの個々のコラーゲン線維で構成される膜を見ることができる。

実施例６：ＤＣ－ＥＰＤ及びパルスＥＰＤによるＨｙＡ堆積
ＨｙＡＤＣ－ＥＰＤフィルムの堆積動態を調べるために、図９に示される２つの異なる電圧について時間に対する堆積質量を測定した。定電圧でのセラミック材料の堆積については、堆積物が形成するにつれて実効抵抗が増大し、堆積速度の低下及び後続の堆積で堆積させることができる総質量の減少につながることが認められている（３７）。しかしながら、図９では、異なる電圧について各時点で堆積質量の違いを認めることができない。このことから、セラミック系とは異なり、電極上でのＨｙＡ堆積物の形成による大きな遮蔽効果は見られないと推論することができる。このことは、初期堆積物が、帯電種を妨げずに通過させることができ、電極で見られる実効抵抗の増大を防ぐ高度に多孔質のヒドロゲルからなるためであり得ると推測される。これを図７に概略的に示す。

さらに、ＨｙＡの混合水性エタノール溶液からのＨｙＡのＤＣ－ＥＰＤ堆積では、多数のガス気泡が含まれ、フィルムの構造が損傷されたフィルムが作製された。漸増堆積時間後にフィルムを１０Ｖで作製した。１分後であってもフィルム全体に多数の気泡が生じることが分かった。気泡は堆積時間と共に増加した。３０分後に作製されたフィルムは、大きな黄色／黒色の変色を有していた。この変色は、電極の正常電位を超え、金属不純物が電極から堆積物へと移動することによる可能性がある。

肉眼的に欠陥のないＨｙＡフィルムをＤＣ－ＥＰＤによって作製することが可能ではないことが見出されたため、ＨｙＡフィルムをパルスＥＰＤによって作製することにした。パルスＥＰＤと関連するパラメーターを変動させることによって、Ｖ＝１０Ｖ、パルス長＝３０ｍｓ、ＤＣ＝３０％、電極間隔＝７．６５ｍｍで肉眼的に欠陥のないＨｙＡフィルムを作製することが可能であることが見出された。

実施例７：コラーゲン－ＨｙＡ多層堆積
多層構造を作製するために、コラーゲン及びヒアルロン酸を連続して沈着し、各堆積間に風乾工程を行った。この方法の概略図を図２に示す。

コラーゲン及びヒアルロン酸の両方の堆積後にセル抵抗が増大したかを決定するために、図１０に示される各堆積工程後の質量を測定し、先のフィルム層を堆積した後に堆積挙動の変化が見られないことを見出した。

各工程において堆積した質量が変わらないことから、複数回の堆積後にＥＰＤセルの実効抵抗の増大は見られなかった。再水和した堆積物は非多孔質であり、バルク溶液から堆積物へのイオン輸送を遮断する可能性がある。フィルムの密度が増大した後の電極への電荷移動の正確な機構は未知であるが、考え得る多数の経路が存在する。堆積物は酸化還元中心間の電子移動、対イオンの拡散、電気活性種の拡散、又はこれらの組合せによって帯電し得るか、緻密な場合であっても、依然として妨げられないイオンの輸送を可能にする十分なナノ多孔性を示し得るか、又は電場が印加されると構造変化が生じ、より大きな多孔性が可能となり得る。

実施例８：コラーゲン－ＨｙＡ多層堆積物の微細構造
実施例７において生成したフィルムの微細構造を分析した。図１１ａに示す多層フィルムのμ－ＣＴ調査から、コラーゲン層がヒアルロン酸の層を挟んで明らかに分離していることが示された。堆積時のガス発生に起因する大きな空隙は見られなかった。

水和条件での多層フィルムの微細構造を調べるために、フィルムをＤＩ水中で再水和した後、凍結し、破断させ、図１１に示すｃｒｙｏＳＥＭによって画像化した。図１１ｂでは、３つのコラーゲン層及び２つのヒアルロン酸層が再水和した場合に依然として明らかに異なっており、ヒアルロン酸層がコラーゲン層よりも顕著に厚く膨潤する。さらに、中心コラーゲン層は曲線の軌跡をたどり、膜が均一に再水和せず、一部の領域が他の領域よりも大幅に膨張したことが示される。図１１ｃは、コラーゲンの層を除去し、ＨｙＡの層を部分的に剥離した多層フィルムの領域を示す。露出したコラーゲンの層は比較的平坦であり、どの点でもその表面へのＨｙＡの貫入の兆候はなく、さらに、ＨｙＡ層内に明らかに埋め込まれたコラーゲン線維は存在しない。コラーゲン層及びＨｙＡ層の異なる構成を図１１ｃに明らかに見ることができ、ヒアルロン酸層は非多孔質のガラス状の層として見え、凍結したヒドロゲルが示される。

層状構造内に詰められた個々のミクロンスケールのコラーゲン線維の層から構成されるコラーゲン層を見ることができる。このコラーゲン構造は、コラーゲン層の拡大図を示す図１１ｄにより容易に見ることができる。層が互いに平行に沈着した個々のコラーゲン線維からなることが分かる。全てのコラーゲン線維が同様の配向にあるように見え、平面の外にはコラーゲン線維が殆どないことに留意すべきである。さらに、Ｐ－ＥＰＤによって作製されたコラーゲン層の構造は、線維状コラーゲンの領域によって隔てられた緻密なコラーゲンの「薄片」からなる微細構造を有する、図８ｅに示す流延によって作製されたコラーゲン膜よりも均一に緻密な微細構造を示す。

図１１ｅは、コラーゲン層内の空隙の断面のＢＳＤ顕微鏡写真を示す。細孔の端部のコラーゲンは、圧縮されて見え、気泡が存在する一方で、コラーゲンの新たな層がその上に堆積し、ガスがフィルム内に封入されたことが示される。ガス気泡のサイズは、個々のコラーゲン線維のサイズと比較して大きいが、フィルムの構造内の局所的なひずみしか引き起こさなかった。気泡形成を示す概略図を図１２に示す。気泡が先に沈着したコラーゲン線維の上部に形成され、そこで新たなコラーゲンの堆積速度よりも遅い速度で成長することが示される。これにより気泡が周囲のコラーゲン基質内に封入され、気泡の近くのコラーゲンが、堆積物に添加されたコラーゲン線維の力に起因する圧縮の兆候を示す。

本明細書で作製された多層構造は同様の厚さの５つの層で構成されるが、複数回の堆積後にＥＰＤセル抵抗の増大が見られないことから、はるかに多数の層から構成される、より厚い層を有する膜を、同じ方法論を用いて作製することが可能なはずであることが示される。加えて、多数の他の生体分子をこれらの多層フィルムに組み込むことができ、膜の機械的及び化学的特性を特定の臨床的必要性に対して調整することができる。さらに、これらの多層膜は、その場で作製されるため、下部の電極の形状及び導電性を変動させることによって非平面膜及びコーティングを容易に作製することができる。まとめると、ＥＰＤプロセスの基本的な柔軟性により、幅広い様々な生体多層膜を創出することができる。

実施例９－パルスＥＰＤに対するコラーゲン懸濁液の透析の影響
コラーゲンＩ懸濁液のパネルを生成し、脱イオン水中で透析した後、パルスＥＰＤに使用した。コラーゲン溶液は、透析後に明らかに透明となった。透析しない場合、パルスＥＰＤ時の電流は、同じタイプのコラーゲン、すなわちコラーゲンＩであるにも関わらず異なるコラーゲン溶液間で大幅に異なる（図１３ａ）。しかしながら、懸濁液を透析した後、それらは全て同じように挙動する（図１３ｂ）。透析後に示される電流がより低いことを考えると、透析した懸濁液はより高電圧で処理することができ、堆積時間が短縮されるようである。

実施例１０－犠牲層上でのコラーゲンフィルムの堆積
より回収可能なコラーゲンフィルムを提供するために、以前に記載のように酢酸セルロースの犠牲層を電極基板上に堆積させた（S. A. Hasan, et al, ACS Nano, vol. 4, no. 12, pp. 7367-7372, 2010.）。コーティングした電極上にコラーゲン層をパルスＥＰＤによって堆積させ、電極を取り外し、コラーゲンを乾燥させた。乾燥後にアセトンを添加して犠牲層を溶解し、コラーゲン層を電極基板から遊離させることで、損傷することなく回収が可能である。これを図１４Ａに概略的に示す。犠牲層の非存在下では、機械的分離なしにはコラーゲン層を電極表面から放出させることができない。

酢酸セルロースの犠牲層上で調製したコラーゲン膜及び犠牲層なしに調製したコラーゲン膜のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルを得た（図１４Ｂ）。スペクトルが同じであることが見出され、酢酸セルロース層がアセトン除去工程中に首尾よく除去されることが示された。

酢酸セルロースの犠牲層の付加は、コラーゲンの堆積に必要とされる電流に対して影響を有しないことが見出された（図１４Ｃ）。

実施例１１－高電圧ＤＣ－ＥＰＤ
代替プロトコルでは、ＤＣ－ＥＰＤによるコラーゲン堆積を高電圧（４２Ｖ）で行った。かかる高電圧では、多数の気泡が電極で形成するが、依然としてコラーゲン膜も形成する。コラーゲン懸濁液への高電圧の印加は、電極と直接接触しない気泡ラフト上でのコラーゲン膜の形成をもたらす（図１５ａ）。膜は電極に付着せず、即座に操作することができる。

実施例１２－浮遊膜ＤＣ－ＥＰＤ
これは現在、ＤＣ－ＥＰＤを用いて行われるが、Ｐ－ＥＰＤの使用が堆積膜の最終特性に有用であると考えられる。代替プロトコルでは、コラーゲン膜は２つの電極間に浮遊し、電気泳動セルを２つのサブコンパートメント又はチャンバに効果的に規定するスペーサーによって適所に保持される（図１５ｂ）。コラーゲン懸濁液を膜とアノードとの間に形成されるコンパートメントに充填し、エタノール：酢酸を膜とカソードとの間のコンパートメントに充填する。ＤＣ－ＥＰＤをそれ以外は通常通りに行った。

このようにして、２つの電極間に浮遊した膜に電場を印加することによって堆積を行うことができる。堆積は浮遊膜上に行われる。気泡が電極で形成されるが、堆積を妨げない。

図２８は、浮遊膜に堆積を行う更なるプロトコルを示す。ここでは、多孔質コラーゲン足場が２つの電極間に浮遊し、電気泳動セルを２つのサブコンパートメント又はチャンバに効果的に規定する。コラーゲン懸濁液を膜とアノードとの間に形成されるコンパートメントに充填し、別の液体を膜とカソードとの間のコンパートメントに充填する。ＤＣ－ＥＰＤをそれ以外は通常通りに行った。緻密なコラーゲン膜が多孔質コラーゲン足場上に堆積した。

３Ｄ形状電極を用いることで電場の形状及び強度を制御し、成形膜を形成することができる。これは、電極基板上へ直接ではなく浮遊膜上への堆積であっても可能である。このアプローチの概略図を図１５Ｃに提示する。

実施例１３－成形マクロテクスチャフィルムの形成
パルスＥＰＤによって作製されたコラーゲンフィルムの形状は、電極の形状によって或る程度決まる。隆起のあるマクロ構造を有する電極を生成し、先に記載のようにパルスＥＰＤ堆積を行い、対応する隆起のある表面構造を有するコラーゲンフィルムを作製した（図１６ａ）。ＳＥＭ顕微鏡検査により、電極構造がマイクロスケールであってもコラーゲンフィルムに移されることが明らかとなった（図１６ｂ）。これは、コラーゲンフィルムの乾燥及び再水和において維持された。これらの隆起は内部溝をもたらす。このような凹凸のある表面又は他の好適な凹凸のある表面を設けることで、例えば細胞のコロニー形成の誘導が可能である。

湾曲した又は他の形で非平面の膜は、従来技術で既知の従来の方法を用いて作製することが困難である。図１６Ｃに示すように管状電極を用いてパルスＥＰＤを更に行った。管状カソードをより大きなアノード内に入れ、コラーゲン懸濁液を２つの電極間に入れた。これらの電極を用いたパルスＥＰＤは、カソード上へのコラーゲンの堆積をもたらし、これを続いて取り出してシームレスなコラーゲンチューブを作製した（図１６Ｄ）。電極のサイズ、形状及び構造を変えることで、細胞の増殖及び／又は指向に応用することができる、最適化された様々なマクロ又はミクロ構造コラーゲン膜を作製することが可能である。湾曲フィルム又はチューブ等の特定のより大きな構造は、電極の形状を操作することによって作製することができ、採用した場合にコラーゲンゲルにより良好に適合し得る。したがって、様々な面積及び形態のフィルムを作製するために電極のサイズ及び形状を操作することができる。

３Ｄ形状電極を３Ｄ印刷によって作製した（図１６Ｅ）。電極表面は、一連の平行な溝及び隆起を含んでいた。この電極上での堆積により、平行な溝及び隆起を示すコラーゲン膜が作製された（図１６Ｅ及び図１６Ｆ）。

実施例１４－多層フィルムのコマンドセット架橋
堆積膜には、ＥＰＤ前に物質を電気泳動媒体に添加するか、又は膜形成後に膜を懸濁液に浸漬することによって様々な物質を混入させることができる。コラーゲン懸濁液及びＨｙＡ溶液を作製し、光活性化架橋剤を混入させた。コラーゲンについては、これはリボフラビンであり、メタクリル化末端基をＨｙＡに使用した。次いで、コラーゲン懸濁液及びＨｙＡ溶液を使用し、コラーゲン／ＨｙＡ多層フィルムを実施例７に記載のプロトコルを用いて生成した。水和多層フィルムを横方向に剪断するために剪断応力を印加した（図１７Ａ）。剪断後にフィルムに青色光を当て、架橋剤を活性化する。光硬化に好適な光源としては、歯科用青色波長光源が挙げられる。これによりフィルムを剪断した形状に固定する。このプロセスは、その場で行うことができる。代替的には、光活性化架橋剤をコラーゲン／ＨｙＡ多層フィルムの生成後に添加することができる。

リボフラビンによるコラーゲン内の架橋の程度をアミノ酸分析によって決定した。各アミノ酸の量をタンパク質加水分解物のイオン交換分析によって決定した。これによりトリプトファン及びシステイン以外のコラーゲン中の各アミノ酸の量の決定が可能となる。光活性化リボフラビン架橋を受けたコラーゲン層中の各アミノ酸のレベル（図１４Ｂ；ＭＲｘ）を、光活性化架橋を受けなかったコラーゲン層中のレベル（図１４Ｂ；ＮＲｘ）と比較した。リシンのレベルが架橋サンプル中で低下することが観察され、リシン残基の架橋が生じることが示された。

実施例１５Ａ及び１５Ｂ－細胞を含有するコラーゲンフィルムの堆積
塩及び細胞生存性を支持する他の因子を添加したコラーゲン懸濁液に、ＥＰＤによるフィルム形成の前に生細胞を混入させることができる（図１８Ａ）。電圧をパルスＥＰＤ又はＤＣ－ＥＰＤによって印加することができる。

得られるコラーゲンフィルムは、目的地で再活性化されるまでの容易な輸送を可能にするコラーゲン基質に組み込まれた細胞を休眠状態で含有する。細胞の位置及び機能は、創傷治癒及び組織再生を補うように合わせて選択することができる。

実施例１５Ａ：図１８Ａに示すようにコラーゲン膜をＥＰＤセル内に浮遊させ、細胞を含有するコラーゲン懸濁液を膜の片側に入れ、酢酸溶液を膜の反対側に入れた。電圧をセル全体に印加すると、コラーゲン及び細胞が膜に向かって移動し、そこで堆積した。膜をセルから取り外し、ＤＡＰＩ染色液を用いて染色した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、細胞ＤＮＡに結合する蛍光染色液であり、これを蛍光顕微鏡検査の際に正しい波長の光で励起することで、生存細胞の強調が可能であった。生存細胞が膜内で明らかに認められた（図１８Ｂ）。

実施例１５Ｂ：図３１（（ａ）は側面図であり、（ｂ）は平面図である）に示す代替的な配置では、２つのコラーゲン膜をＥＰＤセル内に浮遊させ、それにより３チャンバシステムを形成した。スペーサーを用いてコラーゲン膜を保持した。細胞、０．０３ｇ／Ｌヒアルロン酸及び様々な塩（３０ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭＢＩＳＴＲＩＳ、２０ｍＭＥＰＰＳ、１７０ｍＭスクロース、１０ｍＭグルコース）を含有する０．２５％コラーゲン懸濁液を、２つのコラーゲン膜間の中央のチャンバに入れた。外側の２つのチャンバはどちらも緩衝液で満たした。緩衝液は、電気泳動堆積時にこれらのチャンバを通って流れる。カソード側のチャンバには３００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭＢＩＳＴＲＩＳ、２０ｍＭＥＰＰＳ及び７５ｍＭスクロースを含むカソード端緩衝溶液を満たした。アノード側のチャンバには１５０ｍＭ硫酸ナトリウム、４０ｍＭＢＩＳＴＲＩＳ及び２０ｍＭＥＰＰＳを含むアノード端緩衝溶液を満たした。この方法で使用するのに好適な代替的な緩衝溶液は、Weber et al. "Applications of binary buffer systems to free flow cell electrophoresis" (2000), ELECTROPHORESIS, 21: 325-328の研究に見ることができる。

２０Ｖの電場をチャンバ全体に１０分間印加した後、電場を消し、セルを分解し、膜を取り出し、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れた。３７℃で５％ＣＯ_２中の細胞インキュベーター内で２４時間後に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）（Invitrogen、Ｌ３２２４）を用い、製造業者により提供されるプロトコルに記載されるように細胞を染色した。簡潔に述べると、ＰＢＳ中の２μＭカルセインＡＭ及び４μＭエチジウムホモダイマー－１を細胞に添加し、これを続いて３７℃で５％ＣＯ_２の細胞インキュベーター内で３０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。生存細胞が明らかに認められた（図３２（ａ）、（ｂ））。生細胞は緑色に見え、死細胞は赤色に見える。細胞は明らかに堆積ゲル内に捕捉され、端の電場に曝されていない領域の大部分が細胞を含まないことが分かる。

実施例１６－フィルム内のコラーゲン線維の整列
通常のＥＰＤ条件下では、コラーゲン線維は堆積面内でランダムな配向に堆積し、不規則なフィルム構造がもたらされる。均一に整列したコラーゲン線維を生成するために、堆積時にコラーゲン流を誘導し、コラーゲンを流れの方向に整列させるポンプを備えるＥＰＤセルを準備した。ＥＰＤを、コラーゲン懸濁液を循環させて通常通りに行った。線維が堆積する際に、整列して堆積し、均一な方向性のあるコラーゲンフィルムが作製された。このプロセスの概略を図１９に示す。

フィルム内のコラーゲン線維の整列は、機械的特性を調整するために用いることができる。例えば、各層が異なる方向に整列した多層フィルムを用いることで縫合引き抜き抵抗を全方向で増大することができる。

実施例１７－機械的特性及び架橋の影響の測定
キャストコラーゲンフィルム
架橋を有する及び有しないキャストコラーゲンフィルム（すなわち、ＥＰＤによって堆積させない）を引張試験に供し、ＵＴＳを決定した。以下のプロトコルを用いた：
膜の長方形又は亜鈴型のサンプルを準備する。
サンプルを３７℃で液体媒体に再水和する。
サンプルの初期厚さ及び幅を測定する。亜鈴型サンプルの場合、サンプルの狭い領域での厚さ及び幅を測定する。
サンプルを機械試験機の適切なグリップに固定し、グリップ間の分離を測定する。
引張力を印加すると共に、伸長及び印加力を記録する。
サンプルが破断するまで引張力を増大する。
記録された厚さ及び幅を用いて、力を応力測定値に変換する（応力＝力／面積）。
伸長をひずみ測定値に変換する（ひずみ＝伸長／元の長さ）。
応力をｙ軸とし、ひずみをｘ軸として応力及びひずみをグラフにプロットする。
極限引張応力を応力－ひずみ曲線上のピーク値として規定する。

試験後に各集団の平均及びその標準偏差を決定し、結果を下記表に示し、図２０に示した。

上記表の結果は、ＥＰＤコラーゲンフィルムではなくキャストコラーゲンフィルムに関するものである。このデータは、アミノ酸分析データを裏付ける。これにより、ＥＰＤ堆積コラーゲンフィルムも架橋した場合のより高いＵＴＳと対応すると推論することは妥当である。

ＥＰＤコラーゲンフィルム
整列及び非整列コラーゲンフィルムを印加電圧１０Ｖ、パルス長２５ｍｓ、デューティサイクル４０％で９ｃｍ／分の流速（整列フィルム）を用い、本発明によるＥＰＤによって調製した。非整列フィルムは、堆積時に流れを適用せずに形成し、それにより無作為に配向されたコラーゲン線維を層内に有するフィルムを作製した。

フィルムを、実施例１４に記載のようにリボフラビンを用いて架橋した。これらのフィルムのＵＴＳを、キャストコラーゲンフィルムについて上に記載したように決定した。

試験後に各集団の平均及びその標準偏差を決定し、結果を下記表に示した。

これにより、整列コラーゲン膜が線維の整列の方向により強いことが実証される。

多層フィルムの摩擦係数
また、本発明に従って作製した多層膜における後続の層間の摩擦係数を３層（コラーゲン／ヒアルロン酸／コラーゲン）膜及び３層コラーゲン／メタクリル化ヒアルロン酸／コラーゲン膜について調査した。摩擦係数は、２つの物品が互いに滑り合う容易さの尺度を与える。

層の滑りの摩擦係数を、Jan Girmanによって設計され、Girman, Jan, University of Cambridge. Department of Materials Science Metallurgy, degree granting institution. "Novel Treatments for Spinal Facet Arthrosis", 2016の論文に開示される特注の直線往復運動摩擦計を用い、以下のプロトコルを用いることによって算出した。４０００グリットサンドペーパーを有する直径１０ｍｍの３１６Ｌステンレス鋼ロッドをコラーゲンの多層サンプル上で往復させた（traversed）。サイクル周波数を１Ｈｚに設定した。サンプルを水中で室温にて５分間再水和した後、試験した。摩擦計に重量をかけることによって５．９６２Ｎの垂直抗力を印加し、モーターを最低６０サイクル駆動した。１０ｋｇのｓ型圧縮／引張ロードセルを用いて力を測定し、線形可変差動変圧器を用いて線形変位を測定した。

摩擦係数は、初めに時間に対して力をプロットし、定常状態の滑りが生じたサイクルを決定した後、これらのサイクルを線形変位に対する力のグラフとしてプロットすることによって決定した。線形変位の中点で前方（トレース）及び後方（リトレース）の力の読み取り値間の差を算出し、二分して、移動距離の中点での平均摩擦力を得た。

これにより、コラーゲン／ヒアルロン酸／コラーゲン層が中心層上で滑ることができることが示され、０．００８８１±０．００１７８という摩擦係数が３層コラーゲン／ヒアルロン酸／コラーゲン多層膜について決定された。

同様に、コラーゲン／メタクリル化ヒアルロン酸／コラーゲン膜を、５０％までメタクリル化したヒアルロン酸（Blafar Ltd.、コード：ＨＡ－ＭＡ３０１）を用いて本発明によるＥＰＤによって調製した。次いで、これらの膜を実施例１４のようにリボフラビンを用いて架橋し、コラーゲン／メタクリル化ヒアルロン酸／コラーゲン多層膜についての摩擦係数は、０．０２２６±０．００４２と決定された。

実施例１８－整列膜の複屈折及び整列膜のＳＥＭ画像化
ポリマー材料の光学複屈折特性は、内部の異方性構造に直接対応する。異方性（又は整列）の増大により材料の光学複屈折が増大する。

以下の実験手順を用いて膜の複屈折を決定した（プロトコル「Ａ」）：
膜の厚さを初めに測定する。
膜を偏光顕微鏡において互いに対して９０°に回転させた分析器と偏光子レンズとの間に入れる。
サンプルを通過する光の最大強度に対して４５°回転させ、サンプルの色を記録する。
記録した光及びサンプルの厚さをミッシェル・レヴィの図表と共に用い、サンプルの複屈折の値を決定する（代替的には、石英楔を用いてサンプルの複屈折の値を決定することができる）。

図２１に、上述の工程に基づきコラーゲンフィルムの光学複屈折を試験するプロセスを概略的に示す。

ＥＰＤを用い、堆積時に流れを用いて、また流れを用いずにコラーゲン膜を調製し、それによりコラーゲン線維の選択的整列方向を有しないフィルムを形成し、コラーゲン線維の選択的整列方向を有するフィルムを形成した。膜の厚さを偏光顕微鏡検査前にμ－ＣＴを用いて決定し、４０μｍであることが見出された。サンプルを上記のように偏光顕微鏡で画像化した。

その結果を、左側に明視野顕微鏡検査、右側に偏光顕微鏡検査、上に流れを用いずに堆積させたコラーゲン、下に流れを用いて堆積させたコラーゲンを示す図２２に示すが、コラーゲンフィルムを堆積時に層堆積界面とコラーゲン線維の懸濁液との間に相対運動が存在する環境で堆積させると、サンプルに起因する測定可能な複屈折が見られる。これは、サンプルをかかる相対運動なしに堆積させた場合の測定不能な複屈折と比較される。

本研究の過程で、上記のプロトコルに従って行った測定に基づくと、流れを用いて調製したサンプルは、交差偏光レンズに対して４５°回転させた場合に色を呈することが見出された。この色をミッシェル・レヴィの図表と共に用い、サンプルの厚さと共に複屈折を決定した。本発明の一実施形態の典型的な複屈折は、ミッシェル・レヴィの図表によると０．０３である。コラーゲン線維の好適な整列度を示す典型的な最小複屈折は、０．０１５である。これらの整列度は、本明細書に記載されるように流れを用いて堆積させた膜で達成可能である。比較すると、流れを用いずに堆積させた膜は通例、０．００の複屈折を有する。

サンプルの複屈折を測定する代替プロトコル（プロトコル「Ｂ」）を用いて、幾つかのサンプルの複屈折を決定した：
膜の厚さを初めに測定する。
膜を偏光顕微鏡において互いに対して９０°に回転させた分析器と偏光子レンズとの間に入れる。
サンプルを通過する光の最大強度に対して４５°回転させる。
石英補償器を顕微鏡内にサンプル層に平行に挿入する。
石英補償器を顕微鏡の接眼レンズに光が通らなくなるまで回転させ、石英補償器の角度を記録する。
この角度を用いることで、複屈折サンプルからの光の遅延を、以下の式を用いて算出する：
遅延（ｎｍ）＝－０．０４（角度）^３＋１．２５３９（角度）^２－０．５４（角度）－５．３１１４
複屈折を、遅延及びサンプル厚さを用いて以下の式で算出する：
複屈折＝遅延（ｎｍ）／厚さ（ｎｍ）

実施例１９－治療化合物を含有するコラーゲンフィルムの堆積
水中の５０％（ｖ／ｖ）エタノールにおけるテトラサイクリンの吸光度を３６０ｎｍでＵＶ－ｖｉｓを用いて２０μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で測定することによって標準曲線を作成した。これにより、２０μｇ／ｍｌ～８０μｇ／ｍｌの範囲で３６０ｎｍでの吸光度が溶解したテトラサイクリンの濃度と線形的に相関していることが決定された。

８０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを５０％の０．０５Ｍ酢酸（透析）、５０％のエタノール中の０．２５％コラーゲン懸濁液に添加した。懸濁液をＥＰＤセルに入れ、電場を印加した。膜が電極上で形成され、テトラサイクリンを含浸させた。堆積後の懸濁液体を捨て、ＵＶ－ｖｉｓを用いて３６０ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度は、８０μｇ／ｍｌから低下して６２μｇ／ｍｌの値に相当することが見出され、テトラサイクリンがＥＰＤ膜に組み込まれ、懸濁液から除去されたことが示された。さらに、膜がテトラサイクリンの色である黄色を呈し、この薬物が膜に組み込まれたことが示された。

実施例２０－様々な用途へのコラーゲン膜の適合性の調査
本発明によるＥＰＤによって作製され、リボフラビンにより架橋した水和コラーゲン膜の極限引張強さ（ＵＴＳ）も試験し、３．７３±０．１５ＭＰａと決定された。

薄肉円筒と仮定すると、
σ_θ＝Ｐｒ／ｔ
ここで、
Ｐは内圧であり、
ｔは壁の厚さであり、
ｒは円筒の平均半径であり、
σ_θはフープ応力である。

直径４．５ｍｍ（動脈管腔と同等である）、ｔ＝１００μｍの円筒と仮定し、σθ＝σ_ＵＴＳと設定すると、ＥＰＤ膜が耐えることができる理論最大圧力は、これらの値に基づくとＰ＝１６６ｋＰａであることが見出される。この理論破裂圧力は、動脈系の圧力１３ｋＰａを大幅に上回る。

さらに、水を収容するＥＰＤコラーゲン膜の能力を、水で満たしたビーカーを膜で覆い、ビーカーを逆さにすることによって試験した。ビーカーを７日間静置し、毎日調べて、水が漏出し得るかを決定した。チャンバを毎日調べ、漏出を確かめた。７日後に、流体はＥＰＤ膜を通って漏出しなかった。

これらの結果から、本発明に従って作製されたＥＰＤコラーゲン膜が外科手術時の体液の収容、血液喪失を阻止するパッチとしての使用、又は静脈若しくは動脈代替物としての使用等の用途に好適であることが示される。

実施例２０－コラーゲン膜の複屈折に対する堆積パラメーターの影響の調査
１０Ｖパルス電流ＥＰＤで作製されたサンプルの複屈折を様々な異なる流速で測定した（上で論考したプロトコル「Ｂ」を用いる）。複屈折に対する流速（ｃｍ／分）のグラフである図３４から分かるように、サンプルの複屈折が流速の増大と共に増大することが見出された。

コラーゲン懸濁液の粘度がサンプルの複屈折にどのように影響を及ぼすかも調査した。コラーゲン懸濁液の粘度は、コラーゲン濃度（ｗｔ％）の関数として粘度（ｃＰ）を示すグラフである図３５に示されるように、コラーゲンの濃度を変化させることによって操作することができる。このグラフ上の「Sigma」及び「Devro」の線は、元のコラーゲンの供給源を指し、SigmaはSigma Aldrichから供給され（コード：Ｃ９８７９）、DevroはDevro Plcから供給されたコラーゲンである。

粘度測定値は、以下のプロトコルを用いて得た：
コラーゲン懸濁液を、上記のように酢酸及びエタノールを用いるが、コラーゲンの濃度を変動させて調製した。
懸濁液の粘度測定を、レオメーターを用いて行った：
０．５ｍｌのコラーゲン懸濁液をレオメーターの基部にピペットで入れ、レオメーターを密閉してから稼働させた。
各測定にＣＰＡ－４０Ｚディスク／スピンドルを用い、温度を２３．１℃、速度を５ｒｐｍ、剪断速度を３７．５／ｓ、コンディショニング時間を３０秒間とした。

コラーゲン膜を異なる粘度のコラーゲン懸濁液から作製したが、他の全てのパラメーターを同じままにした：１０Ｖパルス電流及び５ｃｍ／分の流速。暫定的結果から、図３６に示されるように、懸濁液の粘度を増大することで作製されるコラーゲン膜の複屈折が増大することが示唆される。これらの測定に基づくと、整列を生成するのに好ましいコラーゲン懸濁液の粘度の範囲は、５０ｃＰ～４００ｃＰ、好ましくは１００ｃＰ～３００ｃＰとして選択することができる。

実施例２１－コラーゲン膜の密度の制御の調査
ＥＰＤによって作製されたコラーゲン膜の密度は、堆積速度を変化させることによって制御することができる。５Ｖ及び１０Ｖの堆積電圧についてのＥＰＤにおけるコラーゲンの堆積質量を示す図３７に示されるように、コラーゲンが堆積する速度は、堆積電圧の上昇と共に増大する。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、コラーゲンが増大した速度、増大した力で堆積する場合、堆積時により緊密に充填され、密度が増大することを提唱する。

コラーゲン膜を、様々な堆積電圧を用いて作製し、該膜の密度を以下の方法によって測定した：
コラーゲンを通常のパルス電流パラメーター下で、電圧を変動させて堆積させた。
コラーゲン膜を乾燥させ、秤量した。
膜の長さ及び幅をノギスで測定し、厚さをマイクロメーターで測定した。これらを用いて各膜の体積を決定した。
次いで、体積及び質量を用いて各膜の密度を算出した：
密度＝質量／体積

結果を図３８に示す。堆積膜の密度が６Ｖの堆積電圧で約１．６ｅ－０４から１０Ｖの堆積電圧での約４．５ｅ－０４まで増大したことが分かる。また、これらの密度はキャストフィルムよりも高かった。結果から、ＥＰＤを用いて作製されたコラーゲン膜の密度を変更し得ることが示され、これはキャスト膜では可能ではない。

図２３は、ＥＰＤによって作製された膜内のコラーゲン線維によって形成される層状構造の概略図を示す。図２４は、ＥＰＤによって作製された水和コラーゲン膜のＳＥＭ断面を示す。線維構造は密に充填される。整列の程度及び／又は方向が異なる２つ以上のコラーゲンフィルムから形成される膜では、異なる層間の整列の違いは、液体窒素中での凍結後に膜を破断させることによって見ることができる。次いで、ＳＥＭを用いて破断面を調べた。好適なプロトコルは、以下の工程を含む：
膜サンプルをサンプルが凍結するまで液体窒素に浸漬する。
次いで、ナイフ又は他の器具を用いて膜を破断させる。
破断面を上にして膜をＳＥＭスタブに取り付ける。
膜をスパッタコーティングにより金、炭素又は他の導電性材料でコーティングする。
ＳＥＭを用いて膜の端部を画像化すると、各層内の線維の異なる配向を観察することができる。

ここで、本発明の実施形態と、電気化学的圧縮を用いて溶液中のコラーゲンモノマーを堆積させ、電極間の等電点でフィルムを形成する従来技術のアプローチとの形態学的相違を検討することに興味が持たれる。続いて、原線維形成を誘導する工程を行う。かかるアプローチを用いて形成される膜は、本明細書に記載の開示を用いて形成される膜よりも高い多孔性を有する傾向がある。参照文献３９は、かかるコラーゲンフィルムの電子顕微鏡像を非水和フォーマットで示している。同条件での比較を可能にするために、本発明の一実施形態によるＥＰＤによって調製したコラーゲン膜を、非水和（すなわち、乾燥）形態で図２５～図２７に示す。図２５は、膜の端部及び表面を示す、ＥＰＤによって調製したコラーゲン膜を低倍率で示す。図２６は、図２５に大きな白い四角で示される、図２５の膜のより高倍率の画像を示す。フィルムの層状構造を図２６に見ることができる。図２７は、図２５に小さな白い四角で示される、図２５のコラーゲン膜の表面のより高倍率の画像を示す。図２７から分かるように、フィルムは表面多孔性を殆ど有しない。

電圧、パルス幅及びデューティサイクル等の堆積パラメーターを慎重に選ぶことで、肉眼的に欠陥のないコラーゲンのフィルムを水性懸濁液からパルスＥＰＤによって作製することができることが示された。堆積速度がより高電圧でより速いことが見出され、単一の電極への複数の懸濁液の堆積により、質量が線形に増加することが見出された。微細構造の調査から、溶液流延及びパルスＥＰＤによって形成されたコラーゲン膜間の表面形態の僅かな相違が示され、水和コラーゲン膜の内部構造は、少数のナノスケールの空隙を有して密に充填されることが見出された。パルスＥＰＤによって作製された膜は、乾燥後に目に見える損傷なく容易に電極から機械的に分離することができた。

ＤＣ－ＥＰＤ及びパルスＥＰＤの両方でＨｙＡを堆積させる能力を実証した。堆積速度は、より高電圧でより速く、パルスＥＰＤによってのみ肉眼的に欠陥のないヒアルロン酸のフィルムの作製が可能であった。パルスＥＰＤによるコラーゲン層及びヒアルロン酸層の連続堆積は、コラーゲン及びヒアルロン酸の明確に規定された独立層からなる多層フィルムをもたらすことが見出された。達成し得る堆積速度及び厚さは、先のコラーゲン層及びＨｙＡ層の堆積に影響を受けないことが見出された。水和多層フィルムの調査から、ＨｙＡ層が緻密なヒドロゲルを含み、コラーゲン層がコラーゲン線維の層状構造を含むことが示された。ミクロ空隙がコラーゲン層及びヒアルロン酸層の両方において見られ、マイクロスケールの気泡が堆積中に形成されたが、損傷を与える巨視的な気泡には凝集しなかった。厚さ、化学的性質及び複雑性が調整されたフィルムの作製に用いることができ、臨床要件に高度に適合した材料を作製するために一般化することができる、生体分子から複雑な多層膜を作製する方法を実証した。

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Claims

コラーゲンの線維の配列を含む層を製造する方法であって、
不溶性コラーゲン線維の懸濁液を準備することと、
層堆積界面を準備することと、
電場を前記懸濁液全体に印加して、前記層堆積界面で前記不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積を生じさせ、それにより堆積コラーゲンを含む層を構築することと、
を含み、
前記層堆積界面が（ｉ）、又は（ｉｉ）のいずれかによって与えられることを特徴とする方法。
（ｉ）対向する主要表面を有する膜であって、前記膜の主要表面の両方が前記懸濁液と接触することにより前記懸濁液中に保持される、膜
（ｉｉ）前記電場により前記懸濁液中に生成した気泡ラフトであり、前記気泡ラフトは前記懸濁液と接触する電極の表面で生成され、それにより前記層堆積界面が前記電極の表面から空間的に分離される、気泡ラフト
請求項１に記載の方法であって、
前記懸濁液をパルス電気泳動に供するために前記電場をパルス状にし、電場強度が１００Ｖ／ｍ～２０００Ｖ／ｍの範囲であり、平均パルス長が１０ｍｓ～１００ｍｓの範囲であり、デューティサイクルが２０％～７０％であり、
任意に前記デューティサイクルが３０％～６０％である、方法。
前記電場がＤＣ電場である、請求項１又は２に記載の方法。
前記電場を対向する電極間に印加し、該電極間の電位差が少なくとも２０Ｖである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記不溶性コラーゲン懸濁液を前記電気泳動堆積前に透析して、実質的に塩を除去する、方法。
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに、前記層堆積界面と前記懸濁液との間で相対運動方向に相対運動を生じさせ、それにより前記層内の前記コラーゲン線維の整列を生じさせ、該線維を前記相対運動方向に実質的に平行な第１の面内方向に沿って層内に実質的に整列させることを含む、方法。
第１の層の堆積後に、線維が前記第１の面内方向と平行でない第２の面内方向に沿って層内に実質的に整列した後続の層を堆積させるために前記相対運動方向を変化させる、請求項６に記載の方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記懸濁液が生存哺乳動物細胞を含み、該細胞が不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積の間に前記層内に埋め込まれる、方法。
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記懸濁液が１つ以上の治療化合物を含み、該１つ以上の治療化合物が不溶性コラーゲン線維の電気泳動堆積の間に前記層に含まれる、方法。
各層が堆積コラーゲンを含む複数の層を堆積させることを含み、（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれか、又は両方が適用される、請求項９に記載の方法。
（ｉ）前記１つ以上の治療化合物の濃度を後続の層の電気泳動堆積間で変化させる
（ｉｉ）該層の一部又は全部の密度が異なるように、前記電場が前記層の一部又は全部の堆積において異なる
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記電場を経時的に変動させ、それにより前記堆積コラーゲンを含む層の密度を変動させ、
任意に、堆積電圧を経時的に変化させることによって前記電場を変動させる、方法。
前記コラーゲンの線維の配列を含む層を凍結乾燥することを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記コラーゲンの線維の配列を含む層を乾燥させ、コラーゲン膜を形成する工程と、前記コラーゲン膜をモールド内に配置する工程と、前記モールドに不溶性コラーゲン線維の懸濁液を少なくとも部分的に充填する工程と、前記不溶性コラーゲン線維の懸濁液及び前記コラーゲン膜の入ったモールドを凍結乾燥し、それにより該コラーゲン膜が組み込まれた多孔質コラーゲン足場を形成する工程とを更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記層堆積界面が剥離層の表面を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。