JP6920203B2 - 消化管上皮組織構築物を生成する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所から受けた助成金番号RO1 EY)24556の下で政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本出願は、2015年1月30日に出願された米国特許仮出願第62/110,147号の利益を主張するものであり、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を実施する為に使用される未分化細胞及び/又は消化管上皮細胞などの細胞は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫を含む任意の起源の種のものでもよい。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳類細胞であり、その例には、ヒト、サル、類人猿、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びブタの消化管上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、好ましくは一次組織に由来し、癌細胞又は腫瘍細胞ではない。結腸、小腸、胃、食道、舌、鼻咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞を含む任意のタイプの消化管上皮細胞を使用してもよい。
上で述べたように、本発明は、生細胞構築物及びその作製方法を提供する。通常、本方法は:
(a)上面及び底面を有する非細胞性支持体を提供するステップと、
(b)生きた未分化細胞(例えば、幹細胞及び/又は前駆細胞)を(典型的にはその上面上の)非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、
(c)消化管上皮細胞単層を(典型的にはその上面上の)支持体上で増殖させるステップとによって実施される。
(d)生細胞の単層を維持する培養培地を、生細胞の単層(例えば、培養培地は支持体内又は上にある。)と接触させるステップをさらに含む。任意選択で、しかし、いくつかの実施形態において好ましくは、培養培地は、短鎖脂肪酸(例えば、酪酸、酢酸、プロピオン酸、バルプロ酸など)を生理的濃度(例えば、結腸に対して0.1〜5mMの範囲内)で含む。培養培地はまた、以下でさらに議論するように、典型的な栄養素、増殖因子及びシグナル伝達因子などを含む。
ほとんどの上皮組織の現在のインビトロモデルは、依然として腫瘍由来の不死化細胞株の使用に依存している。例えば、結腸癌に由来するCaco−2細胞は、腸管上皮を模倣する為に広く使用されている。26−28これらの腫瘍細胞株は連続単層を形成することができるが、その癌表現型は正常組織の生理又はインビボで見られる微小構造をよく反映していない。この問題は、インビトロ組織モデルの主な課題の1つを示しており、これは、生体内臓器系をより代表する系を形成する為に、正常組織に由来する初代細胞を使用することである。293Dオルガノイド培養系は、初代細胞由来の細胞を連続培養するこの必要性を克服したが、球状オルガノイドの閉じた構造によって制限されたままであり、従来の組織培養系に典型的な標準的な開いた表面ではなく、ゼラチン層内で培養する必要がある(例えば、これは、Calvin Kuoの気液界面培養と比べてもよい。これらは、平坦な表面で増殖し、分極した上皮及び露出した内腔表面を有する全ての層(すなわち、上皮及び間充織)上に含まれる。違いはやはり、これらが長寿命ではなく、増殖と分化がランダムであり、ある程度制御されないということである)。この表面は、平面状又は回旋状であってもよいが、閉じた構造であるオルガノイドとは異なり、開いた構造を有することを特徴とする。開いた構造を特徴とする培養系を発明することにより、この研究は、自動化されたハイスループット培養及び解析プラットフォームにおいて利用される従来の組織培養法及び現在のロボット工学に適合する初代細胞から構成される上皮組織の培養を行うオルガノイド系の限界を克服した。開いた構造及び透過性基質は、上皮表面と平行及び直交する両方の可溶性因子の勾配下で細胞の培養を可能にする。開いた構造は、閉じた系では不可能な上皮の関門機能、吸収及び分泌のアッセイを可能にする。初代上皮と、覆っている細菌及びマイクロバイオームの他の成分との相互作用も今や可能である。これらの生体外組織は、とりわけマウス、ブタ及びヒトを含む様々な種から作製することができる。トランスジェニック動物、遺伝子組換えヒト幹細胞(例えば、TALEN又はCRISPR/cas)、人工多能性幹細胞、並びに特定の疾患を有する動物体及び人体に由来する幹細胞から開発されるモデル系は、これらの組織を作製する為に使用することができる材料の他の非限定的な例である。健康な源及び病気の源から、並びに異なる遺伝的背景の細胞からこれらの組織を作製できる能力は、薬剤のスクリーニング、疾患メカニズムの研究及び基礎生物学の研究にとって重要になる。生体模倣足場上又は内部で共培養された種々の他の細胞型(例えば、免疫細胞、線維芽細胞、及び特定の生体内上皮組織と共存することが明らかになった他のもの)の添加は、細胞−細胞相互作用並びに薬剤及び代謝産物の組織に対する影響を理解するのに役立つ。本発明者らは、一次組織を用いて生体模倣足場上に生成された上皮組織が、上皮組織の研究の為の現在の細胞モデルより優れていると断定する。いくつかの例が続くが、このリストは全てを含んだものではない。
1)生理学的研究(腸上皮細胞を横切る分子輸送、誘導された酵素機能、細菌との相互作用)の為のインビトロモデル
2)薬剤、生物製剤、毒素、変異誘発物質、食物化合物、病原体、ウイルス、微生物などのスクリーニング検査
3)制御された条件(酸素圧、薬剤暴露、食物化合物、代謝産物など)下での微生物叢のスクリーニング検査
4)トランスレーショナルな動物モデル又はヒト由来の幹細胞及び初代細胞を用いた疾患モデル
5)薬剤、食物化合物などの包括的な用量−反応プロファイルを含むスクリーニングの為の薬理学的及び薬物動態学的モデル
6)代謝を研究する為のインビトロモデル
7)関門機能を維持する為の上皮組織の創傷治癒の為のインビトロモデル
8)細菌−上皮相互作用を研究する為のインビトロモデル
9)損傷した上皮を修復する為の移植の為の組織工学
10)特定の遺伝的背景及び個々の患者に対して実施された調査による個別化医療
11)水及び電解質(ナトリウム、塩化物、プロトン、重炭酸塩、カリウム)の吸収、並びに未吸収の栄養素の再利用などのアッセイの性能
12)粘液の流れ、移動及び産生並びに嚢胞性線維症のようにこれに起因する疾患の影響
13)止痢剤のアッセイ
14)アヘン剤、便秘の為の治療、例えば、緩下剤
15)シン−、プレ−及びプロバイオティック剤のアッセイ。
16)放射線不透過性及びシンチグラフィーマーカーのアッセイ及びこれらの上皮に対する影響
17)免疫細胞及びその産物(抗体及びサイトカイン)の上皮に対する影響
18)可溶性及び不溶性繊維のアッセイ及びその上皮に対する影響
19)任意のタイプの損傷に応じた上皮に対する応答及び上皮の修復の理解
20)偽膜形成につながる細菌、例えば、クロストリジウム・ディフィシルの調査
21)発癌性化合物のスクリーニング
22)生物兵器化合物のスクリーニング
23)NSAID治療の副作用としてのGI出血を予防する為の研究。
24)上皮の完全性及び疾患(例えば、炎症性腸疾患、腸疾患、癌など)に対する免疫系の役割に関する研究。
25)放射性及び化学療法剤並びにオフターゲット効果を改善する薬剤のアッセイ。
26)生体外組織の拡大。
従って、上で述べたように、いくつかの実施形態において、本発明は:(a)上述の構築物を提供するステップと;(b)試験化合物又は微生物を前記構築物と接触させるステップと;次いで、(c)前記構築物の細胞上の前記微生物の毒性作用、生理作用又は発癌作用を(例えば、前記接触後の構築物を、前記化合物又は微生物を接触させていない同様の構築物と比較することによって、且つ/又は前記接触ステップ後の構築物を、前記接触ステップ前の前記構築物と比較することによって)検出するステップとを含む、試験化合物又は微生物を毒性作用、生理作用又は発癌作用についてスクリーニングする方法を提供する。
2d及び3d足場上の両方における長期の結腸上皮単層の実証
本発明の実証として、2つのタイプの足場(2D及び3D足場)をコラーゲンから作製し、幹細胞を含む初代結腸陰窩組織から得た細胞の長期培養が支持されることを示した(図1)。単離された陰窩又は幹細胞を平面状の2D足場の表面で培養することによって、2D結腸上皮単層を作製した(図1A)。この条件下で、生化学的微小環境は、可溶性増殖因子(Wnt−3A、R−スポンジン、ノギン及びEGF)によって与えられたが、生物物理学的微小環境は、透過性、剛性及びECM成分に関して固有層を模倣するコラーゲン足場によって与えられた。単層は増殖性幹細胞を含んでいた。培地中の増殖因子を変化させることにより、単層を、杯細胞及び腸細胞などの特殊化した細胞に任意に選択的に分化させることができた(図1A)。
生体模倣足場上での陰窩の2D培養は、増殖性で長寿命の2D単層を産生した。1mLの中和したコラーゲン前駆体を6ウェルプレートの1つのウェルに添加することによって、コラーゲン(ラット尾部、I型、2mg/mL)から生体模倣の平面状の足場を作製し、37℃で30分間重合させた。足場は、99.8重量%の水及び0.2重量%のコラーゲンタンパク質を含んでいたので、固有層の疎性結合組織を模倣していた。細胞がDsRed蛍光タンパク質を発現するCAG−DsRedマウスモデルを用いて、蛍光顕微鏡により結腸上皮細胞の増殖をモニターした。足場上での陰窩の2D培養を、標準的な2D細胞培養と同様の方法で実施した(図2)。結腸陰窩を足場上にプレーティングし、Wnt−3A、R−スポンジン、ノギン及びEGFを含む培地で培養した。酪酸ナトリウム(0.5mM)を培地に加えた。酪酸は、食物繊維の嫌気性細菌発酵によって結腸内で局所的に産生される食物因子である。酪酸は、結腸細胞の主要なエネルギー源として働く短鎖脂肪酸であり、以前の研究は、エネルギーの為の酪酸がないと、結腸細胞がオートファジーを起こすことを示している。21エネルギー源であることに加えて、酪酸ナトリウムは、HDAC阻害剤22及びNotch活性化剤などの他の役割を果たすことが示されている。23これらの実験に使用された培養培地は、ENR−WB(E−EGF、N−ノギン、R−スポンジン、W−Wnt−3A、B−ブチレート)と呼ばれる。
2d単層は、インビボ様増殖能、形態及び機能を持つ
インビボでは、腸上皮は、哺乳類の体内で最も急速に増殖する組織の1つである。これと一貫して、コラーゲン足場上で培養した結腸上皮細胞のインビトロ2D単層は高増殖性であった。この増殖能を実証する為に、2D単層の断片を、Transwellインサート内のコラーゲン足場上にプレーティングした(図7A、上のパネル)。インサートの外周を白い点線で示す)。5日目までに、細胞は、137mm2の表面積を有するインサートの表面全体を占める連続2D単層を生成した(図7B、下のパネル)。この結果は、2D単層培養技術がインビトロで結腸上皮組織の大断片を生成することができることを実証しており、これは、3Dオルガノイド培養技術で達成することは不可能である。
足場の組成及び特性が結腸上皮の形態を決定する
本発明者らは、結腸上皮細胞が、コラーゲンゲルの表面に増殖細胞の2D単層を形成することを示した。生体模倣足場を構築する為に使用できる他のタイプのECMを探索する為に、本発明者らは、Matrigel(タンパク質濃度8.7mg/mL)及びコラーゲン(2mg/mL)を様々な体積比で混合し、得られたヒドロゲルを37℃で1時間重合させた。結腸上皮細胞を足場上にプレーティングし、ENR−WB(定義については下記参照。)下で5日間培養した。細胞は異なる形態を形成した(図8)。Matrigel組成が25%未満のとき、細胞が広がって2D単層を形成し、Matrigel組成が50%を超えるとき、細胞は3Dスフェロイドを形成した。本発明者らの結果は、細胞の封入を必要とせずに、Matrigelの上面上に3Dオルガノイドを形成することができることを初めて示す。1つの利点は、全てのオルガノイドが、その後の顕微鏡分析において同じ結像面上に位置することである。
生体模倣足場上の2D単層が多能性であり、特殊化した細胞に選択的に分化することができるという別の証拠
インビボの結腸上皮は、幹/前駆細胞だけでなく、特殊化した分化細胞(腸細胞、杯細胞、腸内分泌細胞)からも構成される。幹/前駆細胞の機能は、短寿命の特殊化した細胞の再生の為の源を提供することである。特殊化した細胞の機能は、吸収(腸細胞)、粘液分泌(杯細胞)及びホルモン産生(腸内分泌細胞)に及ぶ。従って、インビボ条件の模倣として結腸上皮のインビトロ機能研究の為の特殊化した細胞を生成することが非常に望ましい。
ヒト小腸及び結腸上皮細胞は、2D単層として培養することができる
本発明者らは、マウスからヒト小腸及び大腸へ2D単層培養技術を拡張した。そうする為に、陰窩をまずヒト腸から単離し、3Dオルガノイドモデルにおいて培養して、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞を含む細胞を増殖した(図10)。次いで、オルガノイドをMatrigelから回収し、コラーゲンヒドロゲル足場(1mg/mL、ラット尾部コラーゲン、I型)の表面にプレーティングした。3Dオルガノイドは足場上で平坦化され、露出した内腔表面を持つ増殖性の広がる2D単層を生成した。ヒト細胞培養培地は、先進のDMEM/F12培地、Wnt−3A馴化培地、R−スポンジン−2馴化培地及びノギン馴化培地の体積比3:1:1:1の混合物から配合、調製し、EGF(50ng/mL)、N−アセチルシステイン(1.25mM)、GlutaMAX(1×)、B27(1×)、Y27632 ROCK阻害剤(10μM)、HEPES(10mM)、A83−01(500ng/mL)、プロスタグランジンE2(10nM)、ニコチンアミド(10mM)、ガストリン(10nM)、SB202190(3μM)、ペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)及びゲンタマイシン(5μg/mL)を追加した。Wnt−3Aの活性は、TCF/LEFルシフェラーゼレポーター安定HEK293細胞株(Signosis、#SL−0015)により、30ng/mLと決定され、組換えWnt−3aタンパク質(R&D Systems、#1324−WN)を用いて校正した。
初代腸上皮を用いた食物代謝産物及び天然物のハイスループットスクリーニング
膨大な数の食物及び代謝産物化合物を、腸内の増殖、分化及び他の細胞挙動に対するそれらの影響についてスクリーニングする方策はますます重要になってきている。しかし、正常な健康な結腸細胞に対するこれらの化合物の作用を忠実に再現することができる技術が欠如している為、大きな課題が存在する。スクリーニングツールとしてのインビトロの平面状の腸組織プラットフォームの可能性を実証する為に、(表1に列挙した)77種の化合物を、初代腸上皮細胞の増殖分化を変化させる能力についてスクリーニングした。これらの属性は、繰り返される化学的、物理的、免疫性及び感染性の傷害に直面している腸の関門機能及び修復の中心である。さらに、制御された増殖及び最終分化は、発癌状態を回避する為の鍵である。細胞死を伴わずに腸細胞増殖を最小限に抑え、細胞増殖を増強し、又は分化した系列に細胞を導く代謝産物又は天然物は、健康維持の為、及び療法として非常に重要である。これらの化合物は、初代腸細胞に対する多様な、又は未知の影響を有する、脂肪酸、胆汁酸、フラベノイド、植物エストロゲン、フェノール、テルペノイド、ナイトレートなどを含む幅広い化学的クラスとなった。75,000個の細胞を、ENR−W(しかし、10ng/mLのWnt−3Aを含む。)を含むコラーゲンヒドロゲル上で24時間培養し、細胞を表面に付着させ、続いて、食物/天然化合物と共に48時間インキュベートした。次いで、4つの属性:核(Hoechst 33342)、S期又は増殖性細胞(EDU)、腸細胞表現型(高アルカリホスファターゼ)及び杯細胞マーカー(Muc2)について、細胞を順次分析した(図11)。いくつかの化合物は、核及びS期細胞の数が対照細胞(ENR−Wで培養した。)の数よりも有意に少なかった(p<0.01)ので、増殖抑制性であった。これらは脂肪酸、ナイトレート、テルペノイド及びクルクミノイドの多くを含み、これらは全て分化を促進するか、又は細胞毒性を示すことが既知である。特に、キャベツ及び芽キャベツの苦味の原因であるグルコシノレート(#68、#69、#70)は、高濃度で消費されると有毒であり、これは部分的に、それらが腸細胞に直接作用することが原因である可能性がある。スタウロスポリン(#32)は、核の数を有意に増加させたが、対照のそれと比較してS期細胞を減少させ、初期増殖とその後のアポトーシスを示唆している。いくつかの化合物は、細胞数を大きくは減少させなかったが、増殖を抑制し、癌のリスクを減少させることができる可能性のある特徴。これらは、没食子酸(#28)、エラグ酸(#29)及びプニカラギン(#31)などのアッセイしたフェノールのほとんど、並びにバルプロ酸(#6)及びβ−カロテン(#58)などの化合物も含んでいたが、それらは全て、文献において細胞分化を誘導すると認識されている。イチョウ葉に見られるイソラムネチン(#21)は、S期の細胞数を増加させたが、これは、毒素に直面している腸の損傷を緩和するこの天然物の能力の1つの源である可能性がある。驚いたことに、調味料、香料及び化粧品に使用されるユーカリプトール(#42)も細胞増殖を最小限に抑え、腸細胞系列に向けて細胞を押し、アルカリホスファターゼ発現を増加させた(p=0.01)。細胞数を減少させずに腸細胞系列に向けて細胞を導いた他の化合物は、ザクロに見られる抗酸化物質であるプニカラギン(#31;p=0.02)及び香料産業において使用される核内受容体リガンドであるフィトール(#51;p=0.002)であった。腸細胞形成を促進する分子は、腸の関門及び/又は吸収機能を強化することによってそれらの有益な効果のいくつかを発揮する可能性があり、従って、さらに調査する価値がある可能性がある。単一化合物であるマタイレシノール(#77)は、Muc2又はムチン発現を有意に増加させた(p<0.01)。マタイレシノールは、Caco−2細胞においてCOX−2由来のプロスタグランジンE2を増加させ、プロスタグランジンE2は、結腸内で杯細胞形成を誘導して粘液分泌を増加させることが特徴とされている。初代結腸上皮のスクリーニングは、マタイレジノールを粘液産生の増加と直接結びつけ、これはプロスタグランジンE経路を介している可能性がある。
1.N.バーカー,M.ファン・デ・ウェテリンク及びH.クレバーズ(N.Barker, M. van de Wetering and H.Clevers)著,ジーンズ アンド デベロップメント(Genes & Development),22巻,2008年,p.1856−1864。
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26.H.J.キム,D.ハー,G.ハミルトン及びD.E.イングバー(H.J.Kim, D.Huh, G.Hamilton and D.E.Ingber)著,ラボ チップ(Lab Chip),12巻,2012年,p.2165−2174。
27.Q.ラマダン,H.Jafarpoorchekab,C.B.ホワン,P.シラッチ,S.カラーラ,G.コクル,J.ガーユ,J.ラムスデン,C.ルファート,G.ヴェルジェール及びM.A.M.ジイス(Q.Ramadan, H.Jafarpoorchekab, C.B.Huang, P.Silacci, S.Carrara, G.Koklu, J.Ghaye, J.Ramsden, C.Ruffert, G.Vergeres and M.A.M.Gijs)著,ラボ チップ(Lab Chip),13巻,2013年,p.196−203。
28.J.H.スング,J.J.ユー,D.ルオ,M.L.シュラー及びJ.C.マーチ(J.H.Sung, J.J.Yu, D.Luo, M.L.Shuler and J.C.March)著,ラボ チップ(Lab Chip),11巻,2011年,p.389−392。
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Claims (34)
- (a)上面及び底面を有する非細胞性支持体を提供するステップであって、前記非細胞性支持体は、因子および栄養素の輸送を可能にするために多孔質および透過性であり、前記非細胞性支持体が約550KPa未満の弾性率を有し、前記非細胞性支持体が天然又は合成高分子から形成されたヒドロゲルを含む、ステップと、
(b)生きた未分化消化管上皮細胞を前記非細胞性支持体と接触させるステップと、次いで、
(c)生きた消化管上皮細胞の自己再生単層を前記上面上で増殖させるステップであって、前記生きた消化管上皮細胞が少なくとも一部の未分化細胞を含み、前記自己再生単層中における、未分化細胞を含む、生きた消化管上皮細胞の数が、少なくとも24時間維持され又は増加している、ステップと、
を含む、生細胞構築物を作製する方法。 - 前記単層内の前記生細胞が:
前記未分化細胞と組み合わせた分化細胞
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記生きた消化管上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫の細胞からなる群から選択される請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生きた消化管上皮細胞がヒト消化管上皮細胞である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生きた消化管上皮細胞が癌細胞又は腫瘍細胞ではない請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生きた消化管上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞からなる群から選択される請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- (d)前記生きた消化管上皮細胞の前記自己再生単層を維持する培養培地を、前記生きた消化管上皮細胞の前記自己再生単層と接触させるステップをさらに含む請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地が、短鎖脂肪酸を含む請求項7に記載の方法。
- (i)前記培養培地が、10ミリモル以下の単糖類並びに二糖類を含み;及び
(ii)前記培養培地が、少なくとも2ミリモルの前記短鎖脂肪酸を含む
請求項8に記載の方法。 - 前記支持体が多孔質支持体を含む請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物及びこれらの組み合わせを含み;且つ/又は前記支持体が、天然又は合成高分子から生成されるヒドロゲルを含む請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体底面が、多孔質担体、無機グリッド、ヒドロゲル又はこれらの組み合わせ上にある請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記上面が、その中に形成された複数のウェルを有し;前記ウェルのそれぞれが、上部開口、側壁及び床を有し;前記自己再生消化管上皮細胞単層が、前記ウェル側壁及び床の上に延び、前記ウェル上部開口が開いたままであり、前記ウェル内が細胞で覆われた開いた内腔を形成する請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- (a)上面及び底面を有する非細胞性支持体であって、因子および栄養素の輸送を可能にするために多孔質および透過性である前記非細胞性支持体であり、前記非細胞性支持体が約550KPa未満の弾性率を有し、前記非細胞性支持体が天然又は合成高分子から形成されたヒドロゲルを含む、前記非細胞性支持体と、
(b)前記上面に形成された前記生きた消化管上皮細胞の自己再生単層であって、前記自己再生単層中における、未分化細胞を含む、生きた消化管上皮細胞の数が、少なくとも24時間維持され又は増加している、前記自己再生単層と;
を含む生細胞構築物。 - 前記単層内の前記生きた消化管上皮細胞が:
(i)未分化細胞;及び
(ii)前記未分化細胞と組み合わせた分化細胞
を含む請求項14に記載の構築物。 - 前記生きた消化管上皮細胞が、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び昆虫の細胞からなる群から選択される請求項14又は15に記載の構築物。
- 前記生きた消化管上皮細胞がヒト消化管上皮細胞である請求項14から16のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記生きた消化管上皮細胞が悪性細胞ではない請求項14から17のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記生きた消化管上皮細胞が、結腸、小腸、胃、食道、舌、上咽頭、中咽頭、下咽頭及び膵臓の上皮細胞からなる群から選択される請求項14から18のいずれか一項に記載の構築物。
- (c)生きた消化管上皮細胞の前記単層を維持する、生きた消化管上皮細胞の前記単層と接触している培養培地をさらに含む請求項14から19のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記培養培地が、短鎖脂肪酸を含む請求項20に記載の構築物。
- (i)前記培養培地が、10ミリモル以下の単糖類並びに二糖類を含み;及び
(ii)前記培養培地が、少なくとも2ミリモルの前記短鎖脂肪酸を含む
請求項21に記載の構築物。 - 前記支持体が、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エンゲルブレス−ホルム−スウォームマウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物及びこれらの組み合わせを含み;且つ/又は前記支持体が、天然又は合成高分子から生成されるヒドロゲルを含む請求項14から22のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記支持体が多孔質である請求項14から23のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記支持体底面が、多孔質担体、無機グリッド、ヒドロゲル又はこれらの組み合わせ上にある請求項14から24のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記上面が、その中に形成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが、上部開口、側壁及び床を有し;
前記生きた消化管上皮細胞単層が、前記ウェル側壁及び床の上に延び、前記ウェル上部開口が覆われないままであり、前記ウェル内に開いた細胞内腔を形成する請求項14から25のいずれか一項に記載の構築物。 - 前記ウェルが、深さ100、200又は300ミクロンから、深さ800又は1000ミクロン以上までであり、且つ/又は前記ウェルが、幅10又は50ミクロンから、幅100又は200ミクロン以上までであり;且つ/又は少なくとも10、50又は100個の前記ウェルが前記上面に形成される請求項26に記載の構築物。
- 前記単層内の前記生きた消化管上皮細胞が、分化細胞及び未分化細胞の両方を組み合わせで含み;
前記分化細胞及び前記未分化細胞が、ある勾配で前記単層内に位置し;
前記勾配が前記ウェル側壁に合わせて又は沿って向けられている、
請求項26又は27に記載の構築物。 - (a)請求項14から28のいずれか一項に記載の構築物を提供するステップと;
(b)第1の培養培地を前記上面と接触させるステップと;及び
(c)第2の培養培地を前記底面と接触させるステップと
を含み、一方の前記培養培地が、増殖幹細胞及び前駆細胞の前記分化を誘導し、且つ他方の前記培養培地が、未分化細胞の増殖を誘導する、生細胞構築物を維持する方法。 - (a)請求項14から28のいずれか一項に記載の構築物、又は請求項29に記載の方法に従って維持される構築物を提供するステップと、
(b)試験化合物又は微生物を前記構築物と接触させるステップと;次いで、
(c)前記構築物の細胞上の前記微生物の毒性作用、生理作用又は発癌作用を検出するステップと
を含む、試験化合物又は微生物を毒性作用、生理作用又は発癌作用についてスクリーニングする方法。 - 前記試験化合物又は微生物が、芳香族有機化合物、脂肪族有機化合物並びに混合芳香族及び脂肪族有機化合物からなる群から選択される請求項30に記載の方法。
- 前記試験化合物又は微生物が、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母及びカビからなる群から選択される請求項30に記載の方法。
- 前記生きた消化管上皮細胞の自己再生単層が、前記生きた消化管上皮細胞の成長を維持するのに十分な増殖能力を維持する、請求項1に記載の方法。
- 前記生きた消化管上皮細胞の自己再生単層が、前記生きた消化管上皮細胞の成長を維持するのに十分な増殖能力を維持する、請求項14に記載の生細胞構築物。
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