TWI757274B - 初代細胞培養法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係在體外並簡便、短時間且安定地得到大量的癌細胞的初代培養物。

本發明解決上述課題之手段係一種癌細胞的初代培養物的製造方法，其包含下述步驟：(a)將源自生物體的癌組織予以細分化，從已細分化的癌組織中除去夾雜物；(b)將步驟(a)所得的組織塊供於懸浮培養；繼而(c)將步驟(b)所得的培養物供於黏附培養。

Description

初代細胞培養法
本發明係有關於初代細胞的培養方法。詳細而言，本發明係有關於癌細胞的初代培養物的製造方法、以及使用由該方法所得的癌細胞的初代培養物之醫藥品的篩選(screening)的方法等。
癌是難以根治的疾病。尤其是消化器癌為惡性度高，非常難以根治。在抗癌劑等化學療法的基礎研究中，一般而言係使用已確立的癌細胞株，但臨床上的癌係在其形態、基因呈現等有多數方面為性質不同。基於這樣的理由，在抗癌劑的篩選或癌的化學療法的基礎研究等，希望可使用源自具有與臨床上的癌的性質為類似的性質的癌組織之初代培養物。
已有報告提及將源自癌組織的細胞進行初代培養的方法(參照專利文獻1)，但該方法雖可得到具有與臨床上的癌的性質為類似的性質的初代細胞，但仍難以簡便、短時間且安定地得到大量的初代細胞。
此外，已有報告提及將癌組織的階層構造予以再現的癌幹細胞集團(cancer stem cell mass)的製作方 法，其包含在懸浮培養(suspension culture)後進行黏附培養(adhesive culture)的步驟(參照專利文獻2)，但該方法與本發明為目的不同，並且必須有移植至動物而製作細胞塊的步驟。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2010-227088號公報
[專利文獻2]國際公開公報WO2012/046797
本發明之課題是提供保持源自患者的癌細胞的性質之癌細胞集團。詳細而言，本發明之課題是提供可將源自患者的癌細胞在體外(in vitro)並簡便、短時間且安定地大量培養的初代培養法。該癌細胞集團係在體外條件下的培養系中、或是在移植有該癌細胞集團的非人類之動物模型中，可用於癌的分子機制的解明、藥劑感受性試驗等。
本發明人等為了要解決上述課題而反覆精心研究，結果發現藉由將源自癌組織的細胞進行懸浮培養，繼而進行黏附培養，可在體外並簡便、短時間且安定地得到大量的癌細胞的初代培養物，因而完成本發明。
亦即，本發明提供之項目如下：
(1)一種癌細胞的初代培養物的製造方法，其包含下述步驟：(a)將源自生物體的癌組織予以細分化，從已細分化的癌組織中除去夾雜物；(b)將步驟(a)所得的組織塊供於懸浮培養；繼而(c)將步驟(b)所得的培養物供於黏附培養。
(2)如(1)所述的癌細胞的初代培養物的製造方法，其中，夾雜物的除去是藉由包含篩分(sieving)的方法而進行，由篩分所得的細胞塊的大小係下限為20μm至100μm、上限為200μm至500μm。
(3)如(1)或(2)所述的癌細胞的初代培養物的製造方法，其中，懸浮培養係進行24至48小時。
(4)如(1)至(3)中任一項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法，其更包含下述步驟：(d)將步驟(c)所得的培養物更進一步進行繼代培養。
(5)一種癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選的方法，其係使用由(1)至(4)中任一項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法所得的癌細胞的初代培養物。
(6)一種套件(kit)，其係用於癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選，該套件包含由(1)至(4)中任一項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法所得的癌細胞的初代培養物。
依據本發明，可在體外並簡便、短時間且 安定地得到大量的癌細胞的初代培養物。本發明的癌細胞初代培養方法可適用於各種癌細胞。由本發明所得的癌細胞的初代培養物，係因具有與臨床上的癌組織為類似的性質，故可在體外再現體內的癌組織的狀態。因此，使用由本發明所得的初代培養物，可正確且有效率地進行醫藥品的篩選、藥劑感受性試驗、癌的分子機制的解明等的研究。再者，依據本發明，可得到具有與患者的癌組織為相同性質的類似的初代培養物，故也可有用於患者的個別治療。
第1圖係顯示源自臨床試樣的大腸癌細胞塊的懸遊培養第0日的顯微鏡影像(左)、懸浮培養第1日的顯微鏡影像(中)、黏附培養第30日的顯微鏡影像(右)。
第2圖係顯示大腸癌的臨床試樣(左)及由本發明所得的源自大腸癌的臨床試樣的初代培養物對小鼠的移植片(移植第42日)(右)的組織切片的顯微鏡影像(HE染色)。
第3圖係顯示由本發明的方法所得的源自胃癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(上段左)、源自胰臟癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(上段右)、源自肝癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(下段左)。
第4圖係顯示由本發明的方法所得的源自肺癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(上段左)、源自腎癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(上段右)、源自乳癌的臨床試樣的初代培養物的顯微鏡影像(下段左)。
本發明係在第1態樣中，提供一種癌細胞的初代培養物的製造方法，其包含下述步驟：(a)將源自生物體的癌組織予以細分化，從已細分化的癌組織中除去夾雜物；(b)將步驟(a)所得的組織塊供於懸浮培養；繼而(c)將步驟(b)所得的培養物供於黏附培養。
針對上述方法的步驟(a)說明如下。生物體是指活的動物，較佳為哺乳動物，典型的是有癌的人類。由生物體取得癌組織可藉由任何手段‧方法來進行，例如，可藉由在外科手術時採取或摘出、或是進行活體切片檢查(biopsy)而得之。
癌的種類可為任何種類，可例示如大腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、肛門癌、胰臟癌、肝癌、膽管癌、消化器官內分泌腫瘤、胃腸道基質腫瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，即GIST)、乳癌、肺癌、間皮瘤、胸腺癌、腎癌、尿路上皮癌、睪丸癌、前立腺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、子宮肉瘤、卵巢惡性腫瘤、舌癌、齒齦癌、口腔底癌、咽頭癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、Ewing氏肉瘤、軟組織肉瘤、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndrome)、皮膚癌、神經芽細胞瘤、神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)、惡性淋巴瘤、多發性骨髄瘤等，但不限定於此等。
由生物體所得的癌組織，係可將其直接細分化，也可在細分化前維持在動物細胞培養用培養基。動 物細胞培養用培養基可例示如D-MEM、E-MEM、RPMI-1640等，但不限定於此等。在此階段中，在培養基中的維持係可實施適當時間，例如可維持數小時至48小時。
在細分化之前，可將癌組織清洗。清洗係可在生理食鹽水中或是在磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、Tris緩衝液等緩衝液中進行。
細分化可使用任何手段‧方法進行，可使用刀、剪刀、割刀等來進行。例如可使用剪刀來將癌組織細切。或者是，亦可藉由備有適當大小的注射針的注射筒將癌組織的懸浮液反覆吸入放出而進行細分化。較佳係將組織塊予以細切至無法以肉眼看見的程度(直徑約1mm以下)。
可將已細分化的癌組織進行酵素處理而除去結締組織等。就酵素而言，可將膠原蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶、分散酶(dispase)等予以單獨或組合而使用，但不限定於此等。
從已細分化的癌組織中除去夾雜物，係可使用任何手段/方法實施。夾雜物是雜菌類及癌組織以外的組織片等，但也可為此等以外者。就夾雜物的除去方法而言，也包含如上述的清洗或酵素處理，但較佳係藉由包含篩分的方法來去除夾雜物。
篩分可使用任何手段‧方法來進行，較佳係使用經滅菌過的過濾器來進行。依據癌的種類或組織類型，可選擇由篩分所得的細胞塊的大小的下限及上限。較 佳係下限是約20μm至約100μm，且上限是約200μm至約500μm。為了要得到如此大小的細胞塊，可選擇2種適當的孔隙(pore)大小的過濾器並逐次使用。現已有各種孔隙大小的過濾器販售於市面上。例如，可將通過孔隙大小200μm的過濾器但不通過孔隙大小20μm的過濾器而殘留的細胞塊在生理食鹽水或動物細胞培養用培養基中懸浮，然後進行例如離心分離，而可回收所期望的大小的細胞塊。
藉由將細胞塊的大小設為上述大小，除了可有效率地防止污染之外，也使細胞塊中的活細胞的比率提高。因此，經過下一個步驟的懸浮培養步驟以及再下一個步驟的黏附培養步驟而得到的癌細胞的初代培養的效率會提高。又，藉由將細胞塊的大小設為上述大小，可減少纖維芽細胞等的比率，在黏附培養後所得的初代培養物會成為與實際的臨床組織類似的細胞塊。
上述方法的步驟(b)，係將由上述操作所得的癌細胞塊供於懸浮培養的步驟。懸浮培養是在使癌細胞塊不黏附於培養容器的條件下的培養。懸浮培養是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所公知。關於懸浮培養用的培養容器，現已有經實施使細胞或細胞塊不容易附著於表面的處理者販售於市面上，而可使用該等。又，培養容器的形狀及大小係可因應癌細胞的種類及必要量等條件而選擇。現已有各種大小的燒瓶(flask)、瓶(bottle)、碟(dish)、管(tube)、盤(plate)等販售於市面上，而可使用該等。懸浮培養的培養基的組成、培養溫度、是否要進行靜置或攪拌 或振盪等關於懸浮培養的其他條件，也可因應癌細胞的種類等條件而由本發明所屬技術領域中具有通常知識者來適宜決定。
本發明中，可藉由進行適當時間之懸浮培養，而更有選擇性地選別可移行至黏附培養的細胞。較佳係進行約24小時至約48小時之懸浮培養。在將如此經時間而懸浮培養的癌細胞塊供於其次之黏附培養時，所得的初代培養物會成為與臨床組織類似的形態、性質，未見到基因的變異、或即使有也是極少。
上述方法的步驟(c)，係將經上述懸浮培養的癌細胞塊供於黏附培養的步驟。黏附培養是在使癌細胞塊黏附於培養容器的條件下的培養。黏附培養是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所公知。關於黏附培養用的培養容器，現已有經實施使細胞或細胞塊容易黏附於表面的處理者販售於市面上，而可使用該等。依據癌的種類或組織類型，而可將層連結蛋白511(laminin 511)、可溶性E鈣黏蛋白(soluble E cadherin)等播種於經固層化的盤中。又，培養容器的形狀及大小，也可因應癌細胞的種類及必要量等條件而選擇。現已有各種大小的燒瓶、瓶、盤、管、盤等販售於市面上，而可使用該等。黏附培養的培養基，也可因應癌細胞的種類等條件而選擇。培養基的種類、培養溫度等關於黏附培養的其他條件，也可由本發明所屬技術領域中具有通常知識來適宜決定。
可藉由進行適當時間之黏附培養使細胞增 殖，而得到大量的癌細胞的初代培養物。例如，可在市售的黏附培養用的盤中，一邊在37℃、CO2 5%下每隔1至2日更換培養基，一邊進行黏附培養使細胞增殖到盤的約5成至約8成左右。依據本發明的方法，可得到大量的與臨床組織類似的癌細胞的初代培養物。亦即，依據本發明，可在體外再現體內的癌組織的狀態。因此，使用本發明所得的初代培養物，可正確地且有效率地進行癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、醫藥品的篩選等。為了這些研究，可將本發明所得的初代培養物在體外使用，也可移植至動物而使用。
在上述所說明的本發明的初代培養物的製造方法中，也可省略(b)的進行懸浮培養的步驟。
亦可將由上述操作所得的初代培養物更進一步進行繼代培養。具體而言，可將由上述操作所得的初代培養物從培養容器剝離，依常法而進行繼代培養。藉由進行繼代培養，可得到更多的新鮮的初代培養物。繼代係以使初代培養物的性質(形態學的性質、遺傳學的性質、生理學的性質等)不會變化的次數來進行為佳。
本發明在另外的態樣中，提供癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選的方法，其特徵是使用由本發明的方法所得的初代培養物。
本發明在另外的態樣中，提供一種套件，其係用於癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選，並且該套件包含由本發明的方法所得的初代培養 物。本發明的套件中，除了包含上述初代培養物之外，亦可包含試驗所需要的試劑及器具、以及套件的使用說明書等。
以上是針對本發明的源自癌組織的初代細胞培養方法加以說明，但本發明的方法不限於癌組織而可適用於所有的組織的初代培養。
以下列示實施例而更詳細且具體地說明本發明，但實施例並非用於限定本發明的範圍。
[實施例1] 實施例1 源自大腸癌的初代培養物的製作
在手術時切除癌組織，以生理食鹽水清洗3次，以Antibiotic-Antimycotic(製品號碼15240062；ThermoFisher Scientific)清洗3次。將清洗過的癌組織，使用剪刀細切。使其成為肉眼看不到組織塊，並進行細切到以10mL吸量管(pipette)可吸引的大小(直徑1mm以下)。將經細切的組織片回收至50mL之FALCON試管，添加膠原蛋白酶(1mg/mL)(C6885；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)10mL，使用振盪機(Bio Shakor,BR-13FP)以37℃、200rpm反應15分鐘。
將含有經膠原蛋白酶分散的細胞集塊的溶液，以2種過濾器進行分離。將通過孔隙大小250μm的過濾器但不通過孔隙大小50μm的過濾器而殘留的細胞塊回收。將在第2個過濾器殘留的細胞集團以培養基1進行 懸浮，使用離心機(KUBOTA,KN-70)以1500rpm離心5分鐘。培養基1的組成如下所示。
DMEM/F12
Knockout serum replacement(Thermo Fisher Scientific,cat.10828028)(20%)
碳酸氫鈉(25mM)
L-抗壞血酸(0.1mg/mL)
Fibroblast growth factor 2(4至100ng/mL)
Transforming growth factor-β(20至30pM)
β-巰乙醇(0.1mM)
4-胺基丁酸(1mM)
氯化鋰(0.5至1mM)
青黴素‧鏈黴素(1%)
L-麩醯胺(1至4mM)
懸浮培養
抽吸上清液，將沉渣以培養基1進行再懸浮。將懸浮有細胞集團的培養液在盤(CORNIG,Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene)上播種。將懸浮培養開始時的細胞塊的顯微鏡照片示於第1圖的左方格。在37℃培養24至48小時後，將含有懸浮的細胞集團的培養液回收。將經進行懸浮培養1日(24小時)後的細胞塊的顯微鏡照片示於第1圖的中方格。
黏附培養
將經上述操作而回收的懸浮細胞集團予以離心，進行再懸浮，在盤(hESC-matrigel coated plate)上播種。以培養器(溫度37℃，二氧化碳濃度5%)進行培養(使用上述培養基1)，每隔1日至2日更換培養基(使用上述培養基1)。進行黏附培養30日，而得到本發明的初代細胞培養物。將經進行黏附培養30日所得的初代細胞培養物示於第1圖的右方格。可得到多量的與臨床組織類似的癌細胞的初代培養物。又，當不進行黏附培養而長期間(60日)持續懸浮培養時，只提高了懸浮細胞集團的細胞密度，但得不到本發明的初代細胞培養物。
繼代培養
在使細胞增殖到盤的5成至8成左右的階段，依據以下的方法進行繼代。抽吸培養液，以磷酸緩衝生理食鹽水清洗2次。添加Accutase(Innovative Cell Technologies,Inc.San Diego,CA,USA)，在室溫反應5至10分鐘。以DMEM/F12稀釋5倍，回收細胞。使用離心機(KUBOTA,KN-70)以1500rpm離心5分鐘。抽引上清液，將沉渣以培養基1進行再懸浮，在盤(hESC-matrigel coated plate)上播種。繼代培養所得的細胞係具有與上述黏附培養所得的細胞相同的特徵。
針對由26例的大腸癌的手術及15例的大腸 癌活體切片檢查所得的試樣，進行與上述同樣的操作而得到初代細胞培養物。此等初代細胞培養物，係與臨床的癌組織為形態類似者，免疫組織化學分析的結果也與臨床的癌組織相同。所得的初代細胞的免疫細胞學分析的結果也與臨床組織的癌細胞相同。以PCR進行基因突變解析(KRAS、NRAS、BRAF)時，初代細胞係顯示與臨床組織中的癌細胞相同的基因表現圖形。
由26例的手術所得的初代細胞培養物，全部皆可增殖且可繼代。其中，將由15例的手術所得的初代培養物移植至小鼠時(參照實施例2)，全例皆為移植成功。由活體切片檢查所得的初代細胞培養物係90%為可增殖，80%為可繼代。
[實施例2] 實施例2 初代培養物對小鼠的移植
將經由與實施例1同樣的操作所得的大腸癌的初代細胞培養物(1×105細胞)移植到NOD-SCID小鼠的皮下。在小鼠中，移植片的大小增加，顯示本發明所得的初代培養物具有腫瘤形成能力。在42日後對移植片加以解析。移植片係顯示與臨床試樣類似的形態(第2圖)，免疫組織化學分析的結果也與臨床的癌組織相同。所得的初代細胞的免疫細胞學分析的結果也與臨床組織的癌細胞相同。以PCR解析時，初代細胞係顯示與臨床組織中的癌細胞相同的基因表現圖形。
[實施例3] 實施例3 由各種癌組織製作初代細胞培養物
使用藉由手術時採取或活體切片檢查而得之由胃癌、胰臟癌、肝癌、肺癌、腎癌、乳癌的組織所採取的試樣，經由與實施例1同樣的操作而得到初代培養物。將源自胃癌的初代培養物示於第3圖的左上方格，將源自胰臟癌的初代培養物示於第3圖的右上方格，將源自肝癌的初代培養物示於第3圖的左下方格。將源自肺癌的初代培養物示於第4圖的左上方格，將源自腎癌的初代培養物示於第4圖的右上方格，將源自乳癌的初代培養物示於第4圖的左下方格。此顯示可使用本發明的方法由各種癌組織得到初代細胞。
[產業上的利用可能性]
本發明所得的癌細胞的初代培養物，係具有與臨床上的癌相同的性質，所以，本發明係可利用於醫藥品的領域、癌的研究的領域等。

Claims (4)

  1. 一種癌細胞的初代培養物的製造方法，其包含下述步驟：(a)將源自生物體的癌組織予以細分化，從已細分化的癌組織中除去夾雜物，其中，夾雜物的除去是藉由篩分而進行，由篩分所得的細胞塊的大小係下限為20μm至100μm，上限為200μm至500μm；(b)將步驟(a)所得的組織塊供於37℃之懸浮培養24至48小時；繼而(c)將步驟(b)所得的培養物供於黏附培養。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法，其更包含下述步驟：(d)將步驟(c)所得的培養物更進一步進行繼代培養。
  3. 一種癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選的方法，其係使用由申請專利範圍第1項或第2項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法所得的癌細胞的初代培養物。
  4. 一種用於癌分子機制的解明、藥劑感受性試驗、或醫藥品的篩選的套件，該套件包含由申請專利範圍第1項或第2項所述的癌細胞的初代培養物的製造方法所得的癌細胞的初代培養物。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011115106A (ja) * 2009-12-04 2011-06-16 Rei Medical Co Ltd 癌細胞凝集塊およびその調製法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5652809B2 (ja) * 2009-03-02 2015-01-14 株式会社ルネッサンス・エナジー・インベストメント 癌組織由来細胞塊およびその調製法
WO2012046797A1 (ja) 2010-10-06 2012-04-12 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞集団及びその作製方法
JP2015062400A (ja) * 2013-08-30 2015-04-09 独立行政法人放射線医学総合研究所 癌組織由来細胞凝集塊を調製するための方法及び癌組織由来細胞凝集塊を用いる抗癌剤スクリーニング方法、抗癌剤の定量分析又は癌組織の放射線感受性試験
JP2017205021A (ja) * 2014-09-26 2017-11-24 Jsr株式会社 初代癌細胞のスフェロイド作製方法、スフェロイド、スクリーニング方法、及び、診断方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011115106A (ja) * 2009-12-04 2011-06-16 Rei Medical Co Ltd 癌細胞凝集塊およびその調製法

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