TWI448554B - 肝星形細胞前驅體及其分離方法 - Google Patents

肝星形細胞前驅體及其分離方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI448554B
TWI448554B TW096118759A TW96118759A TWI448554B TW I448554 B TWI448554 B TW I448554B TW 096118759 A TW096118759 A TW 096118759A TW 96118759 A TW96118759 A TW 96118759A TW I448554 B TWI448554 B TW I448554B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
vcam
rt1a
cell
liver
Prior art date
Application number
TW096118759A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200813224A (en
Inventor
Hiroshi Kubota
Lola M Reid
Original Assignee
Univ North Carolina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ North Carolina filed Critical Univ North Carolina
Publication of TW200813224A publication Critical patent/TW200813224A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI448554B publication Critical patent/TWI448554B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

肝星形細胞前驅體及其分離方法 相關申請案的交互引述
本申請案主張2006年5月26日提申之美國臨時申請案案號60/808,548的優先權，其之揭示係以其整體於本文中被併入以作為參考資料。
發明領域
本發明一般而言係關於包含一個成熟的肝之細胞的前驅體。更特別地，本發明係關於肝星形細胞的前驅體細胞，包含其之組合物及其分離方法。
 發明背景
肝星形細胞(HpStCs)首先係由庫佛(Kupffer)於第19世紀描述，以及因於一種顯微鏡下觀看時其等之“星形”閃光而被定名為"斯坦那恩(Sternellen)"。HpStCs是被發現於迪塞間隙(Space of Disse)之肝的特異性間葉細胞，以及，在很大一部份，係由含有維他命A之細胞質的脂質小滴所構成。事實上，該等脂質小滴促成與HpStCs有關的“閃光”特性。
現在已經接受HpStCs在維他命A化合物的攝取、儲存和釋放上扮演一主要角色，維他命A化合物對於視覺、生殖，和胚胎發育是特別地必須的。於哺乳動物體內，總體的身體維他命A的大約5至80%通常儲存於HpStCs內。
HpStCs也在肝內之生長因子、細胞外基質組份(ECMs)，和基質金屬蛋白酶的產生上扮演一中心角色。一些報告顯 示HpStCs分泌數種肝細胞的有絲分裂原-例如：EGF、TGF脉和HGF-以及於肝的發育和再生扮演一中心角色。同樣地，一些研究顯示ECM調控之平衡是肝纖維化或硬化的一個因子。再者，HpStCs的收縮性質暗示著其等對於周圍細胞具有一種相似的功能，周圍細胞係控制血管內的局部血流。二者合計，HpStCs之此等多變化的功能闡明其等在健康和機能障礙的肝功能上之顯著的角色。
儘管我們對於HpStCs的重要性逐漸增加的瞭解，HpStCs的來源仍然是未知的。於肝的早期發展中，前腸內的內胚層細胞促成肝憩室(hepatic diverticulum)，其依序，發展成被稱為橫隔板之周圍的中胚層以及形成肝索。縱然一些人已經假定HpStC前驅體能衍生自橫隔板內之間葉細胞，沒有HpStCs已經自其被單離，以及賦予免疫篩選能力及/或特徵化前驅體HpStCs之表面標記尚未被鑑定出。
於是，對於特異地鑑定HpStCs前驅體之標記以及對於一種單離具有該等標記之前驅體的方法存在一需要。此外，對於一種活體外繁殖HpStC前驅體細胞的方法存在一需要。
 發明概要
於本發明的一個實施例中，一種獲得富含有肝星形細胞先祖細胞的一群細胞的方法係被提供，其包含：(a)提供來自哺乳動物組織的細胞之一種單一細胞的懸浮液；以及相繼地，以任何順序，或是實質同時地，(b)自該單一細胞 的懸浮液移除表現第Ia型主要組織相容性複體抗原(MHC class Ia antigen)的該等細胞；以及(c)自該細胞懸浮液單離維他命A螢光呈陽性的該等細胞，以獲得富含有肝星形細胞先祖之一群的細胞。該哺乳動物的組織可以是肝、胰臟、腸、肺，或骨髓細胞，較佳地是肝。該方法可以進一步包含自該細胞懸浮液單離對於VCAM及/或β3-整合素(β3-integrin)呈陽性的該等細胞；自該細胞懸浮液移除表現CD45的該等細胞；及/或自該細胞懸浮液單離表現結蛋白(desmin)、絲蛋白(nestin)、波形蛋白(vimentin)、平滑肌阿伐-肌動蛋白(alpha-actin)或其等之一組合的該等細胞。
於一些實施例中，該等單離和移除步驟係於一種流動細胞計數儀內進行。表現第一型主要組織相容性複體抗原的細胞之移除可以以一種對抗表現該等抗原的細胞之物種-專一性抗體予以進行；舉例而言，於大鼠的肝細胞內使用對抗RT1A的抗體。同樣地，該等肝星形先祖細胞可以是人類肝星形細胞先祖。
於本發明的又另一個態樣中，一種獲得富含有經單離的肝星形細胞先祖的一群細胞的方法係被提供，其包含：(a)獲得肝細胞的一種細胞懸浮液；以及(b)以任何順序相繼地，，或是實質同時地，當於一種流動細胞計數儀內測量時，(i)自肝細胞的單一細胞懸浮液單離對於ICAM-1抗原呈陽性的該等細胞，(ii)移除對於第一型主要組織相容性複體抗原呈陽性的該等細胞，以及(iii)單離對於維他命A螢光呈陽性的該等細胞，以獲得富含有先祖的一群細胞。該方 法可以進一步包含自該細胞懸浮液移除表現第一型主要組織相容性複體抗原、CD45或是二者的該等細胞，及/或自該細胞懸浮液單離表現結蛋白、絲蛋白、波形蛋白(vementin)、平滑肌α -肌動蛋白或是其等之一組合的該等細胞。
於本發明的又另一個實施例中，一種表現VCAM抗原和β3-整合素抗原二者的經單離的肝星形前驅體細胞係被提供。於本發明的更進一步又一實施例中，一種星形前驅體細胞之純株化擴張(clonogenic expansion)的方法係被提供，其包含：於無血清的培養液中培養表現VCAM抗原和β3-整合素抗原二者之經單離的星形前驅體細胞。該等培養液可以進一步包含一種生長因子，例如，舉例而言：胰島素、運鐵蛋白、白血病抑制因子(LIF)或上皮生長因子(EGF)或是其等之一組合。該等經單離的星形前驅體細胞可以進一步於餵養細胞，舉例而言STO細胞，的存在之下被培養。
於此方面，在詳盡地解釋本發明的至少一個實施例之前，要了解到本發明其之應用不被限制於細節的解釋以及下列的說明中提出或是被圖解於圖示中的組份之配置。本發明能夠被實施，除了該等說明與實施的之外，以及以各種不同的方式被進行。而且，要了解到本文以及摘要中所使用的措辭和術語係為了說明的目的以及不應被視為限制。
就此，本技藝中具有技藝的那些人將明瞭本揭示所根據的概念可以容易地被使用作為用於進行本發明的幾個目的之其他的結構、方法和系統之設計的一種基礎。因而， 申請專利範圍被視為包括在不背離本發明的精神和範疇的範圍內之此等等價的建構是重要的。
圖式簡單說明
第1圖顯示13 dpc大鼠胎兒的肝和肺內之自體螢光細胞的流動細胞計數儀分析。(A)整個族群(全體)的前散射光(FSC)和側散射光(SSC)的型態。根據SSC的數值，R1和R2閘被創造出以及各別地代表高(SSChi )和低(SSClo )SSC。R1和R2內的RT1A和ICAM-1之表現型態亦被顯示。RT1A- ICAM-1+ SSChi 細胞(R2，右下方)是大鼠的胎肝內之肝母細胞(hepatoblast)(Kubota and Reid,2000)。數目指出各象限的百分比。(B)整個族群(全體)、R1，和R2的自體螢光型態係以UV雷射和488nm雷射予以分析。UV雷射特異性自體螢光信號係以一種450nm濾波器予以偵測，然而以一種488nm雷射激發的非特異性自體螢光信號係以一種530/30帶通濾波器(bandpass filter)予以測量。於R1和R2內的UV雷射-特異性自體螢光細胞被偵測(左上方)。(C)RT1A的表現和UV雷射特異性自體螢光信號被研究。UV雷射-特異性自體螢光細胞是RT1A- 。ns-autoflu+ RT1A- 細胞(許可)被鑑定以及對應於大鼠肝母細胞族群。(D)13 dpc胎肺細胞內之UV雷射特異性自體螢光信號係被分析。於肺細胞群中沒有UV特異性自體螢光細胞。全部細胞的多數是RT1A- ，以及沒有非專一性自體螢光細胞(可比得上於該胎肝內之肝母細胞族群)被偵測到。
第2圖顯示於vA+ 細胞上之VCAM-1和ICAM-1的表現。 (A)關於13dpc胎肝上之VCAM-1的表現之流動細胞計數(Flow cytometry)的柱狀圖。大概15%的細胞於該細胞表面上表現VCAM-1。封閉和開放的柱狀圖各別地代表染色的細胞和未染色的細胞。VCAM-1+ 和VCAM-1- 細胞係藉由流動細胞計數分析其等之自體螢光信號。全部的vA+ 細胞和ns-autoflu+ 細胞是VCAM-1陽性的。該等數目代表各象限的百分比。(B)13 dpc胎肝細胞關於RT1A和ICAM-1的二種顏色分析。R1細胞群(RT1A- ICAM-1+ )包含全部的vA+ 細胞和ns-autoflu+ 細胞。此等結果指出vA+ 和ns-autoflu+ 細胞是VCAM-1+ RT1A- ICAM-1+ 。
第3圖顯示13 dpc胎肝內之vA+ 、ns-autoflu+ ，和autoflu- RT1A- 細胞的抗原概況(antigenic profiles)。(A)關於UV-自體螢光和RT1A的表現之流動細胞計數分析。於該RT1A- 細胞群中，4個閘(R1-R4)係根據該等自體螢光信號而被創造出，(B)各被圍起的細胞群(R1-R4)之VCAM-1相對β3-整合素、PECAM-1，或Thy-1的表現之二種顏色分析。該等數目代表各象限的百分比。主要地R1細胞是VCAM-1+ β3-整合素+ ，然而R3細胞一致地表現VCAM-1，但是沒有β3-整合素、PECAM-1，或Thy-1。
第4圖顯示一種雙重潛能的(bipotent)肝母細胞群落(colony)之免疫細胞化學法。ns-autoflu+ VCAM-1+ 細胞係藉由FACS予以單離以及以一種純株細胞密度(clonal cell density)(於12井的平盤之一井內250個細胞；66個細胞/cm2 )被放置於HDM內的STO餵養細胞上。在15天的培養之後， 該等細胞被固定以及以對抗ALB(紅色)和CK19(綠色)的抗體予以染色。各群落係自一個單一分類的細胞產生的(Kubota and Reid,2000)。多於95%(95.7±0.4%；平均值±SEM,n=3)的肝群落包含ALB+ CK19- 和ALB- CK19+ 細胞，其等各別地代表肝和膽的分化。
第5圖提供由FACS分級的14 dpc胎肝細胞之RT-PCR的分析。徑1，ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素- ；徑2，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ ；徑3，autoflu- RT1A- VCAM-1+ ；徑4，autoflu- RT1A- VCAM-1- ；徑5，剩餘的VCAM-1- 細胞群；徑6，無cDNA。vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞強烈地表現SDF-1α和HGF。該等vA+ 細胞是HpStC標記(結蛋白、絲蛋白、波形蛋白、SMαA)陽性的以及對於肝母細胞標記(白蛋白和Prox1)呈陰性。
第6圖顯示LIF和EGF對於vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞的活體外增殖的效應。(A)由FACS單離的500個vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞被放置於具有指出的濃度之LIF及/或EGF的添加基膜素(laminin)之HDM的96井平盤的一井內。在5天的培養之後，細胞增殖的程度係藉由四唑鹽WST-1予以測量。LIF在低至0.1ng/ml支持vA+ 細胞的增殖。EGF稍微改善vA+ 細胞的增殖。(B)250個由FACS單離的RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ vA+ 細胞被播種於具有EGF及/或LIF的HDM內之STO餵養細胞上。使用12井的平盤。該等培養物在2週培養期間之後以Diff-QuickTM 予以染色。縱然STO細胞表現LIF，產生的量係不足以支持該等細胞在缺少 外源的LIF的補充之下的純株擴張(clonal expansion)。外源的LIF和EGF的添加戲劇性地改善該等vA+ 細胞的純株擴張。
第7圖顯示由FACS單離的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞所衍生的群落之免疫細胞化學法。細胞係被放置於以EGF和LIF補充的HDM內之STO餵養層上。在15天的活體外培養之後，培養物係以結蛋白或絲蛋白的抗體予以染色。群落形成細胞表現絲蛋白和結蛋白，而STO細胞未表現任一種。
第8圖顯示由FACS單離的經2個月的培養之vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞的免疫細胞化學法。被分類的細胞係被放置於以EGF和LIF補充的HDM內之STO餵養層上。增殖的細胞係於新鮮的STO餵養層上次選殖5次。被培養的細胞係以結蛋白或絲蛋白的抗體予以染色。增殖的細胞在培養期間維持絲蛋白和結蛋白的表現。
第9圖提供2個月培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之表現型的特徵。(A)培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之RT-PCR分析。細胞係藉由FACS予以單離以及於具有EGF和LIF的HDM內之STO餵養層上被培養。在2個月之後培養細胞係藉由FACS予以分級。增殖的大鼠細胞和小鼠STO餵養細胞在以小鼠CD98單株抗體的抗體染色之後藉由FACS予以分級。CD98被表現於小鼠STO細胞上，以及該單株抗體專一地與小鼠CD98反應，但是不與大鼠CD98反應。RNA係自vA+ -衍生的大鼠細胞和STO細胞內單 離。正常大鼠HpStC也被使用且單離RNA用於一種對照。cDNA係自該等RNA合成以及接受以對被表現於HpStCs之各種轉錄品專一的引子之PCR。(B)培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之流動細胞計數。被利用於RT-PCR之細胞係以抗VCAM-1或RT1A抗體以及小鼠CD98抗體予以染色。CD98陰性的分級被分析VCAM-1或RT1A的表現。衍生自大鼠的胎肝內之vA+ 細胞的持續增殖的細胞於檢查的培養條件下一致地表現VCAM-1和RT1A。
 較佳實施例之詳細說明
HpStCs已經被指定各種名字，包括：“脂肪細胞”、“貯脂細胞”、“伊東細胞(Ito cells)”、“竇週細胞(peri-sinusoidal cells)”，和“肝的周圍細胞”。然而，為了清楚之故，只有術語HpStC將被使用於本文中，但是應該被了解是提及具有任何和全部的上述供選擇的名字之相同族群的細胞。同樣地，於本文中的教示不被限於任何一種物種。事實上，應該了解到本文中提供的實施例僅僅是例示的以及不應被解釋為限制。本發明，以此方式，不被肝組織的哺乳動物來源所限制。HpStCs和其等之前驅體可以衍生自其之哺乳動物包括，但不限於，人類、嚙齒類動物(如，大鼠、小鼠、倉鼠)、兔、牛、馬、豬，以及綿羊。較佳地，HpStCs和其等之前驅體係衍生自人類。本發明也不被限制於肝發展之任何特定階段。因而，本發明可以實施於胎兒、新生兒的、小兒的及/或成年的肝組織，包括來自最近亡故 的個體之肝組織(如，少於大約死後30小時)。
本發明提供用於該單離和繁殖HpStC前驅體細胞(於本文中亦被提及為“HpStC前驅體”或“前驅體HpStCs”)的技術。大鼠的胎肝內之HpStC前驅體係藉由利用由細胞質的富含vA之脂質小滴產生的特異性自體螢光之流動細胞計數予以鑑定。vA+ 細胞的表面表現型看起來是一致的，以及其等是RT1A- ICAM-1+ VCAM-1+ β3-整合素+ PECAM-1- 。除了該等表面標記之外，vA+ 細胞表現HpStCs特異的中間絲，包括：結蛋白、波形蛋白、SMαA，和絲蛋白。
縱然於胎肝細胞上的ICAM-1表現是廣泛的，vA+ 細胞上的β3-整合素是相對專一的。β3-整合素需要α-整合素、αv-整合素或αII-整合素，用於表面的表現。選擇係隨著細胞類型而改變。於成年的肝中的HpStCs的事例中，αv-整合素係被使用於α鏈。因而，HpStC前驅體表現αv-整合素是可能的。有趣地，被表現於成年的HpStCs上的αvβ3-整合素和ECM配體的互動似乎影響HpStCs的命運決定，增殖或細胞凋亡(apoptosis)。該αvβ3-整合素轉導一種刺激信號以保護成年的HpStCs內的細胞凋亡反應。此外，另一個報告顯示αvβ3-整合素結合ECAM-1。因而，不被理論所限制或是束縛，於HpStC前驅體上的β3-整合素表現似乎對於接收來自周遭的ECM配體或內皮細胞，其等表現PECAM-1，之關於增殖之刺激信號是重要的，在胎肝的發展期間。
縱然FACS分析指出高的VCAM-1表現係於胎肝內之肝母細胞和HpStC前驅體上被偵測到，後者可能對於造血細 胞扮演更重要的角色，因為其等也表現SDF-1α。SDF-1α是造血幹細胞(其等表現CXCR4，SDF-1α的受體)之一種有效用的化學趨化劑。該趨化激素在造血幹細胞/先祖細胞的遷移至骨髓的期間扮演一種中心角色，以及被認為向上調控VLA-4依賴的黏附至VCAM-1。因而，可能於HpStC前驅體上之SDF-1α和VCAM-1的表現對於吸收造血幹細胞/先祖細胞進入胎肝是重要的。
有趣地，VCAM-1係被表現於肝母細胞上。除了表面表現型和mRNA的表現之外，肝母細胞之活體外CFA顯示出VCAM-1+ 細胞是肝母細胞。此發現是未預期的，因為VCAM-1被知道是作為間葉細胞的一種表面標記，例如：內皮細胞、肌原細胞(myogenic cell)，或HpStCs。該表現似乎是發展上控制的，因為成年的肝細胞由FACS分析是VCAM-1- 。
看起來HpStC前驅體對於肝的發展是重要的，因為其等於胎肝內是主要的HGF生產者。HGF對於肝的發展是一種決定性的生長因子，以及該因子也在肝的再生期間負責肝的實質細胞生長。此外，已經顯示HpStCs，但不是實質細胞、內皮細胞，和庫佛氏細胞(Kupffer cells)，於成年的肝中表現HGF。因而，我們的數據和先前的研究暗示著HpStCs是自胎兒至成年的肝內之主要的HGF生產者。因而，HpStC前驅體很可能於胎肝內之肝和造血的發展扮演一個決定性的角色，因為該等細胞是主要的HGF和SDF-1α生產者。
考慮到HpStC前驅體之獨特的表現型和功能性特徵，包 括VCAM-1和Hlx的表現以及HGF和SDF-1α的生產，肝內之該等前驅體可能由造血幹細胞或肝的幹細胞，或是二者的一種幹細胞巢(stem cell niche)所構成。因為無血清的培養系統於活體外維持HpStC前驅體之獨特的特徵性表現型，該培養系統能被利用來發展一種活體外群落分析系統以鑑定來自成年的肝的HpStC前驅體。此外，設若一種HpStC移植系統被發展，利用HpStC前驅體之細胞療法將是可行的。成年的肝中的HpStC前驅體(precursors)或HpStC先祖(progenitors)之鑑定、活體外擴張，和移植將是一種有價值的資源以取代纖維化的肝中之活化的HpStCs。顯然地，於本研究中說明的HpStC前驅體之表現型的鑑定和一種活體外培養系統展現一種新的方向以發展肝病之新穎的治療方針。
以下的實施例係闡釋本發明的，但是本發明決不被限制於此等特定的實施例。本技藝中具有通常技藝的一個人將於此等實施例中發現不只一種手段來執行本發明。再者，縱然本實施例為了實驗方便已經以大鼠的背景呈現，本文中所說明的方法和試劑能由本技藝中具有通常技藝的一個人、自以下揭露的教示容易地轉變成年的類的應用。
材料和方法
大鼠
懷孕的費雪(Fisher)344大鼠係自Charles River Breeding Laboratory(Wilmington,MA)獲得。拴(plug)被觀察到的那個早晨被指定為第0天。雄性費雪344大鼠(200-250g) 係被用於成年的HpStCs的單離。全部的動物實驗係於學會的指導方針下實施，以及The University of North Carolina Institutional Animal Care and Use Committee認可依照The Guide for Careand and Use of Laboratory Animals of the National Academy of Sciences之全部的實驗程序。
細胞製備
依照本發明適合於活體外繁殖之肝的先祖不限於藉由任何特定方法單離或鑑定的該等細胞。一般而言，HpStC前驅體可以是得自於肝的任何割下的部分。肝的割下的部分接而可以藉由標準的程序被分離成單一分離的細胞。此等程序包括酵素的分離及/或機械的分離。酵素的分離可以於蛋白酶，例如：膠原蛋白酶，及/或核酸酶，例如：DNase的存在之下進行。於一些例子中，鏈黴蛋白酶也可以被使用。肝細胞的酵素分離的方法被說明且被實施於本技藝中。經由實施例，肝的先祖之單離和鑑定的方法已經被說明於，舉例而言，USP號碼6,069,005和USP申請案號碼09/487,318；10/135,700；以及10/387,547中，其等之揭示係以其等之全體被併入於本文中做為參考資料。更確切地，為了肝細胞的單一細胞懸浮液之消化和單離而存在的各種程序。因而，要了解到，本發明的範疇不被限制於取得整個肝或是製備其等之單一細胞懸浮液的一種特定的方法。
於本實施例中，胎肝係自13~14dpc大鼠單離以及以800U/ml膠原蛋白酶(Sigma)予以消化接著以胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)予以進一步的消化。該細胞懸浮液係以 200U/ml DNase I(Sigma)(Kubota and Reid,2000)予以處理。
細胞培養
於一個較佳實施例中，活體外的繁殖步驟涉及利用一種無血清，補充激素的，限量培養基(HDM)以支持於一層的餵養細胞上之HpStC前驅體細胞的繁殖。餵養細胞的功能是多重的，包括供應營養、供應一種附著表面，以及分泌需要用於該等前驅體HpStCs之存活、生長及/或分化的某些生長因子和細胞外基質組份至該培養基內。該等餵養細胞可以是來自於爬蟲類、鳥類、甲殼綱動物、魚、環節動物、軟體動物、線蟲類、昆蟲，或是哺乳動物，較佳地是人類。更佳地，該等餵養細胞衍生自胚胎組織，以及更佳地，胚胎肝組織。胎肝細胞係被培養於STO細胞餵養層上以及於一種如先前所說明之無血清的激素限量培養液中(Kubota and Reid,2000)。
HDM係由杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)和Ham's F12(DMEM/F12,GIBCO/BRL)的一種1：1的混合物所構成，2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)、5μg/ml的胰島素(Sigma)、10-6 M地塞米松(dexamethasone)(Sigma)、10μg/ml鐵飽和的運鐵蛋白(Sigma)、4.4 x 10-3 M菸鹼醯胺(nicotinamide)(Sigma)、5 x 10-5 M 2-巰基乙醇(Sigma)、7.6μeq/l游離脂肪酸、2 x 10-3 M麩醯胺酸(GIBCO/BRL)、1 x 10-6 M CuSO4 、3 x 10-8 M Na2 SeO3 以及抗生素(青黴素和鏈黴素)被添加至其中。游離 脂肪酸包含對於100meq/l儲備液之各別的毫莫耳比例31.0：2.8：11.6：13.4：35.6：5.6之棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸，以及次亞麻油酸(全部的Sigma)。
STO餵養細胞係以如先前說明的方式製備(Kubota and Reid，2000)。簡言之，STO細胞的一種亞純株(subclone)，STO5，係以pEF-Hlx-MC1neo予以轉染。一種被轉染的純株，STO5Hlx，係以絲裂黴素C(Sigma)予以處理以及係以每井2 x 105 細胞的濃度、於一個12井的平盤內被使用作為於餵養細胞。為了被分類的vA+ 細胞之長期培養，細胞被培養於STO餵養層上以及於以10ng/ml的人類白血病抑制因子(LIF；Boehringer Mannheim)和10ng/ml的上皮生長因子(EGF；Collaborative Biomedical Product)補充的HDM內。培養基每隔一天被更換，以及細胞每週被培養至新鮮的STO餵養層。
群落之免疫細胞化學染色
培養細胞的染色程序係於先前被說明(Kubota and Reid，2000)。簡言之，培養盤在室溫下於甲醇-丙酮(1：1)中予以固定歷時2min，被沖洗以及在4℃下以20%的山羊血清(GIBCO/BRL)予以封阻。為了雙重標示白蛋白(ALB)和細胞角質蛋白(CK)19，培養物係以抗大鼠ALB抗體(ICN Biomedicals)和抗細胞角質蛋白19(CK19)單株抗體(Amersham)接著Texas Red綴合的抗兔IgG(Vector laboratories)和FITC綴合的抗小鼠IgG(Caltag)予以培育。關於絲蛋白或是結蛋白的表現，細胞係以抗絲蛋白抗體 (Rat-401，Developmental Studies Hybridoma Bank，The University of Iowa)或抗結蛋白抗體(D33，Dako)接著Alexa488綴合的抗小鼠IgG(Molecular Probes)予以染色。
螢光激活細胞分類(FACS)
細胞係藉由一種裝備有雙重Coherent I-90雷射之FACStar Plus細胞分類器(BD Biosciences)予以分析和分類。為了偵測vA特異性自體螢光，細胞係在351nm被激發，以及螢光放射係以450DF20濾波器(Omega Optical Inc，Brattleboro，VT)的利用來偵測。螢光綴合的抗體係在488nm被激發，以及其等之螢光放射係藉由被標準的濾波器來偵測。
被使用於大鼠細胞的分析之單株抗體係為FITC綴合的抗RT1A(B5；BD Biosciences)、藻紅蛋白(PE)綴合的抗大鼠ICAM-1(1A29；BD Biosciences)、抗大鼠VCAM-1(5F10，Babco)、抗大鼠α6β1-整合素(mAB-5A，Serotec)、抗大鼠CD44(OX-49，BD Biosciences)、PE綴合的抗大鼠VCAM-1(MR109；BD Biosciences)、PE綴合的或生物素綴合的抗大鼠β3-整合素(2C9.G2；BD Biosciences)、生物素綴合的抗大鼠PECAM-1(TLD-3A12；BD Biosciences)、生物素綴合的抗大鼠Thy-1(OX-7；BD Biosciences)。為了封阻非專一性抗體結合，細胞於FACS實驗的抗體染色之前，係以20%的山羊血清(GIBCO/BRL)、1% teleostean明膠(Sigma)，和抗大鼠CD32(FcγII受體)抗體(D34-485，Rat BD Fc BlockTM ，BD Biosciences)溶液予以培 育。為了以未綴合的抗VCAM-1抗體(5F10)染色，胎肝細胞係以抗VCAM-1抗體予以培育，接著以生物素綴合的抗小鼠IgG2a 單株抗體(R19-15，BD Biosciences)予以染色。鏈黴親合素(Streptavidin)-Cy-鉻黃(BD Biosciences)係被使用以偵測生物素綴合的抗體。
關於FACS的實驗要單離自分類的vA+ 細胞衍生的長期培養的細胞，培養物中全部的細胞被收穫以及以生物素綴合的抗小鼠CD98(H202-141，BD Biosciences)接著鏈黴親合素-Cy-鉻黃予以染色以分離培養的大鼠細胞和STO餵養細胞。鼠STO餵養細胞係以對抗小鼠CD98的抗體予以明亮地染色。因而，CD98-陰性的細胞代表大鼠衍生的細胞以及能利用如先前顯示的FACS予以容易地區分(Kubota and Reid，2000)。
肝母細胞的群落形成分析(CFA)
肝母細胞的CFA程序係於先前說明的(Kubota and Reid，2000)。簡言之，分類的細胞以500或2500細胞/井(3.8cm2 )的量、三重複的方式被平放於一種12井的平盤內之STO餵養層上，以及被培養於HDM中歷時14~15天、每隔一天更換培養基。為了檢查肝母細胞之雙重潛能的分化活性，ALB和CK19的雙重免疫螢光染色被執行。該等群落係藉由Diff-Quick(Baxter)予以染色以計算每井的群落數目。
細胞增殖分析
藉由FACS單離的vA+ 細胞500細胞/井的量、三重複的方式被平放於帶有補充有最終濃度8μg/ml的基膜素 (Collaborative Biomedical Products)之HDM的一種96井的平盤內。EGF和LIF係以指出的濃度予以添加。在5天之後，裝載的細胞培養物被沖洗2次以移除的漂浮的細胞以及被添加具有四唑鹽WST-1(Boehringer Mannheim)之新鮮的培養基以測量可存活的附著型細胞的數目(Kubota and Reid，2000)。在4小時之後，吸光度依據製造者的程序決定。
反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
被使用於PCR之引子序列係被顯示於表1中。
由FACS分類的細胞之RT-PCR的程序係於先前被說明(Kubota等人，2002)。簡言之，細胞係利用一種FACStar Plus細胞分類器予以單離，以及總量RNAs係藉由RNeasy Kit(QIAGEN)予以萃取以及接受cDNA合成。cDNA係自總量RNA、藉由寡-dT引動和AMV反轉錄酶(Seikagaku America)、在42℃下於一種20μl的反應體積內予以合成(Kubota等人，2002)。PCR係於一個50μl的總體積內執行，其係由1μM的各引子、200μM的各dNTP、50mM KCl、1.5mM MgCl2 、10mM Tris HCl，pH 8.3，和1.25U Amplitaq聚合酶金牌(Amplitaq polymerase gold)(Perkins Elmer)與合成的cDNA組成。樣品被加熱至94℃歷時3min接著擴增在94℃歷時2min、在62℃歷時2min，以及在72℃歷時3min的26-35個週期。各標的基因之擴增週期的數目是變化的以及於表1中被指出。在最後的週期之後，一個最終的延長步驟係被進行於72℃歷時6min。接而，各PCR反應的5μl係藉由1%洋菜凝膠電泳予以分析。自被分類的細胞之總量RNA予以合成的cDNA係藉由細胞數目予以正常化。
結果
胎肝內之維他命A + 細胞的鑑定
一旦一種單一細胞的懸浮液已經被建立，HpStC前驅體的單離涉及自肝組織衍生的混合的肝細胞群暴露至流動細胞計數儀以及篩選展現由細胞質的維他命A(vA)富含的脂質小滴所產生的特異性自體螢光之細胞。維他命A當被330-360nm(ultra violet，UV)雷射的光激發時特異地生產一 種藍綠螢光。FACS分析能夠使用一種UV雷射而偵測肝內之成熟的HpStCs以及前驅體HpStCs二者的細胞質內的維他命A特異性藍綠螢光(vA+ )。
第1A圖顯示13 dpc胎肝內之自體螢光的型態。vA特異性、綠藍色的自體螢光信號係藉由以一種450nm濾波器偵測放射光，其係經由一種UV雷射(351nm)的激發，而予以測量。為了偵測一種非UV雷射特異性自體螢光信號，一種488nm雷射和530/30nm帶通濾波器係被使用。全體的胎肝細胞群以及2個次群(第1A圖的R1和R2閘)之自體螢光信號的型態係被顯示於第1B圖中。於全體的細胞群(第1B圖全體)之FACS的型態中，具有高的自體螢光特徵之2個有區別的次群係被鑑定。一種具有一種對UV光特異的自體螢光信號(第1B圖全體，左上方)，其於此被提及為vA+ ，而斜對地位於右上方的象限內之細胞指出非特異性自體螢光，因為該等自體螢光信號係以530nm濾波器和450nm濾波器偵測出，當各別地藉由488nm雷射和UV雷射予以激發時。具有非特異性自體螢光特徵之次群(被指定為ns-autoflu+ )專有地自SSC高的 閘衍生(第1A圖，R2，和第1B圖，R2)，然而vA+ 細胞(第1B圖，左上方)係於R1和R2二者內偵測到。
第1C圖顯示vA-特異性自體螢光信號的型態和第Ia型主要組織相容性複體的表現，其係藉由被予以偵測的一種FITC綴合的對抗的抗體RT1A。FACS分析指出vA+ 細胞以及ns-autoflu+ 細胞沒有RT1A的表現，因為於該染色的樣品中之該等二族群相較於對照的樣品(第1B圖，R2)未移動(第1C 圖，R2)。此外，FACS分析亦指出肝母細胞族群，細胞是RT1A- ICAM-1+ SSC高的 (第1A圖，R2，右下方)和RT1A- ns-autoflu+ 細胞(第1C圖，R2，箭頭)由此FACS分析是一種重疊的族群。
為了決定是否於胎肝內之此等自體螢光信號是特異的，來自13 dpc胎兒之胎肺細胞被單離以及藉由FACS予以分析。FACS分析顯示於該等肺細胞中沒有ns-autoflu+ 細胞或vA+ 細胞(第1D圖)，其指出於該胎肝內之特定的次群的自體螢光信號是獨特的表現型的特徵。
因肝的先祖細胞(亦即，肝母細胞)已經暗示著是13 dpc大鼠胎兒的肝之RT1A- OX18low ICAM-1+ SSC高的 細胞，vA+ 細胞內的此等標記被分析。第1A圖顯示13 dpc之胎肝細胞的FACS分析的型態，接著以對抗RT1A、大鼠第Ia型主要組織相容性複體，和ICAM-1的抗體予以染色。第1C圖顯示vA- 特異性自體螢光信號之型態和RT1A的表現，其係藉由對抗RT1A的FITC綴合的抗體予以偵測。FACS分析指出vA+ 細胞以及ns-autoflu+ 細胞沒有RT1A的表現，因為相較於對照的樣品(第1B圖，R2)、該染色的樣品中之該等二族群沒有移動(第1C圖，R2)。此外，FACS分析指出the肝母細胞族群，是RT1A- ICAM-1+ SSC高的 之細胞(第1A圖，R2，右下方)，以及RT1A- ns-autoflu+ 細胞(第1C圖，R2，箭頭)是一種同一的族群。此等結果指出FACS分析能夠偵測於大鼠的胎肝內之特徵性vA+ 細胞如13dpc一般的早期以及vA+ 細胞是RT1A-ICAM-1+ 。
維他命A + 細胞表現VCAM-1和整合素β3
如上所顯示的，vA陽性和第Ia型主要組織相容性複體陰性是鑑定和單離HpStCs充分的標記。然而，於一些情況下，根據UV光之UV免疫篩選可能不是所欲的，特別地當分子(如，DNA)的完整性是重要的。因而，本發明提供除了UV為主的免疫篩選之外可以被使用的，或是替代UV為主的免疫篩選之標記。HpStC前驅體能進一步藉由暴露經篩選的細胞群至VCAM，更明確地VCAM-1，專一的抗體而予以鑑定。VCAM-1是有意義的，因為其已經被顯示為區分成年的肝中的HpStCs與肌纖維母細胞之一種獨特表面標記。同樣地，VCAM-1的表現似乎是發展上經控制的，因為成年的肝細胞對於此標記是呈陰性的。
VCAM-1的表現於胎肝細胞內被分析以探討是否vA+ 細胞表現VCAM-1。藉由FACS分析，似乎13 dpc胎肝之大約15%的細胞是VCAM-1+ (第2A圖)。VCAM-1+ 細胞之自體螢光的型態和RT1A的表現接下來被決定。VCAM-1+ 細胞實質上包含全部的vA+ 細胞以及全部的ns-autoflu+細胞群(第2A圖)，其指出HpStCs和肝母細胞表現VCAM-1。對抗大鼠VCAM-1的2種單株抗體(5F10和MR109)之FACS分析顯示同一的VCAM-1的表現型態。此外，胎肝VCAM-1+ 細胞是RT1A- ICAM-1+ 細胞，因為第2B圖中之R1閘包括的VCAM-1+ 細胞群。此等結果暗示著胎肝VCAM-1+ RT1A- ICAM-1+ 細胞係由vA+ 細胞、肝母細胞，和一些非自體螢光細胞所構成。
額外的表面抗原被探討以區分2種自體螢光族群，vA+ 細胞和肝母細胞，二者均是VCAM-1+ RT1A- ICAM-1+ 細胞。因為β3-整合素(CD61)係被表現於內皮細胞、血管平滑肌細胞，和成年的HpStCs上，VCAM-1相對整合素β3之雙色的FACS分析係被執行。vA+ RT1A- 細胞的多數表現β3-整合素而ns-autoflu+ RT1A- 細胞是β3-整合素-，然而vA- RT1A- 細胞包含一些VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞(第3B圖)。
Autoflu- RT1A- 細胞包含一些VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞。剩餘的主要族群(第3B圖，R4)是VCAM-1- 以及似乎對應於第2B圖中之R2細胞群。該R4細胞群包含非附著型細胞，當其等被培養於塑膠培養皿上時，其暗示其等是造血細胞。該分級之一種次群(~20%)是β3-整合素+ 。PECAM-1(CD31)的表現，其被知道是一種內皮細胞標記，也被評估。然而，FACS分析指出於vA+ RT1A- 細胞和ns-autoflu+ RT1A- 細胞內之PECAM-1的表現是微不足道的(第3B圖)，然而PECAM-1+ 細胞係於autoflu- RT1A- 和非附著型細胞群中被偵測到(第3B圖，R2和R4)。Thy-1(CD90)的表現，在致瘤的侮辱(oncogenic insults)之後出現於成年的肝中的卵細胞(oval cell)的一種表面標記，被進一步評估。FACS分析顯示ns-autoflu+ RT1A- 是Thy-1- 。
相比之下，vA+ RT1A- 細胞、autoflu- RT1A- 細胞和非附著型細胞不均一地表現Thy-1。FACS分析指出ns-autoflu+ RT1A- 細胞是CD44lo 而vA+ RT1A- 細胞是CD44-( 數據未顯示)。縱然CD44(Pgp-1)似乎係有區別地被表現於vA+ RT1A- 細胞和ns-autoflu+ RT1A- 內，細胞表面上的表現視微弱的。合起來，此等數據暗示著β3-整合素抗體染色，於全部被檢查的抗體之中，促進區分vA+ RT1A- 細胞和ns-autoflu+ RT1A- 細胞，該二種族群均是胎肝內之VCAM-1+ ICAM-1+ 。
VCAM-1 + 整合素β3 - 非專一性自體螢光細胞族群僅含有肝母細胞
直至14 dpc為止之大鼠的胎肝細胞是均一的，其等具有取決於微環境而發展的潛力以分化成肝細胞和膽道上皮細胞二者。此等雙重潛能的先祖被稱為肝母細胞。為了檢查是否vA+ 細胞具有任何的潛力以產生肝細胞譜系，CFA(Kubota and Reid，2000)係被執行。4個細胞群係藉由FACS予以單離以及接受肝母細胞的CFA：1)ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素- 2)vA+ RT1A- VCAM-1+ 3)autoflu- RT1A- 以及4)VCAM-1- 非附著型細胞。被分類的細胞分級係被放置於HDM內之STO5餵養層上，被培養歷時15天，以及各別地以對抗肝和膽的譜系之白蛋白和CK19的抗體予以染色。接而，全部的肝的群落被計數。
CFA指出肝的群落係自第1組，ns-autoflu+ VCAM-1+ β3-整合素- 細胞產生(表2，在下方的)，其顯示其他組的被分類的細胞，包括vA+ VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞，不是肝的先祖。多於95%的自第1組-被分類的細胞衍生的肝的群落包含肝(白蛋白+ CK19- )和膽的上皮(白蛋白- CK19+ )細胞二者(第4圖)。再者，被分類的ns-autoflu+ VCAM-1+ β3-整合素- 細胞 之群落形成效率大概是31%，以及於一個先前研究建立的一種肝的先祖細胞株(rhel4321)(Kubota and Reid，2000)具有CFA之42.5±1.8%的一種群落效率。二者合計，於此實驗之CFA的結果指出ns-autoflu+ VCAM-1+ β3-整合素- 細胞群是一種幾乎純的肝母細胞族群，因為藉由已建立的細胞株之CFAs是大概更高於新鮮單離的細胞之CFAs。
表2提供來自被分類的囓齒類動物胎肝細胞之肝星形細胞的群落頻率。vA+ RT1A- VCAM-1+ 、autoflu- RT1A- 、ns-autoflu+ RT1A- 和VCAM-1- 細胞之分級的閘係各別地如被顯示於第3圖R1、R2、R3和R4中的產生。
流動細胞計數儀分類的細胞係以每井指出的細胞數目而被培養於一種12井的平盤內之STO餵養層上。肝群落數目是每井的平均。群落效率係以被接種於培養中且在15天的培養之後繼續形成群落之細胞的百分比予以表現。數值是平均值±SEM。接種被分類的細胞之總體井的數目係被圈於括號中。
新鮮單離的維他命A + VCAM-1 + 整合素β3 + 細胞之基因表現
vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞的基因表現型態接下來被分析以檢查是否其等表現各種的HpStCs標記。五個族群藉由FACS予以單離，以及RNA自該等五個族群予以單離。HpStC標記的RT-PCR係利用自RNA合成的cDNA來執行。該等五個族群是：1)ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素- ，2)vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ ，3)autoflu- RT1A- VCAM-1+ ，4)autoflu- RT1A- VCAM-1- ，和5)VCAM-1- 非附著型細胞群。成年的肝中的HpStCs表現中間絲、結蛋白和絲蛋白，其等不被表現於肝內之其他細胞類型內。
RT-PCR分析顯示vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ ，ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ ，和autoflu- VCAM-1- 細胞表現全部的4種中間絲。ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ 細胞表現白蛋白以及Prox1，其是一種特異地表現於肝母細胞內之轉錄因子。此結果係與自CFA分析獲得的數據一致，其顯示此族群係包含肝母細胞。於肝母細胞族群內沒有絲蛋白、SMαA，或是波形蛋白的表現。HpStC特異性中間絲的表現強烈地暗示vA+ 細胞是HpStC前驅體。
接著，3種各別的間葉細胞標記HGF、基質細胞衍生因子-1阿伐(SDF-1α)，和相異的Hlx同源盒轉錄因子(Hlx homeobox transcriptional factor)，Hlx的表現利用RT-PCR被探討。HGF對於正常的肝發展是必要的，特別地對於小鼠 體內之肝母細胞的增殖和分化，以及於成年的肝中HpStCs是主要的HGF生產者。SDF-1α是一種有影響力的造血先祖之趨化激素，以及胎肝內之造血幹細胞對該趨化激素反應而遷移。Hlx被表現於發展中的胎肝之間葉細胞內，以及於胎肝造血和肝的發展上扮演一種不可或缺的角色。
有趣地，於全部被檢查的細胞分級中，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞最強烈地表現HGF、SDF-1α和Hlx轉錄品(第5圖)。共同地，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞是結蛋白+ 絲蛋白+ SMαA+ 波形蛋白+ Hlx+ 以及是胎肝內之HGF和SDF-1α的主要的生產者。
RT1A - VCAM-1 + β3-整合素 + vA + 細胞之活體外純株擴張(clonal expansion)
自成年的肝單離的HpStCs僅具有有限的活體外增殖活性。胎肝內之vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞的活體外生長能力被探討，因為HpStC前驅體可能具有廣泛的增殖活性。LIF是許多不同類型的細胞之一種多效性的生長因子，包括胚胎幹細胞或是肌原細胞。當vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞，其等係藉由FACS單離，在LIF的存在下、以一種激素限量的無血清的培養液、在一種96井平盤之500個細胞/井的細胞密度下予以培養歷時5天時，該等細胞係以一種劑量依賴的方式予以擴張(第6A圖)。此外，EGF，其係為包括神經幹細胞之各種細胞類型的一種生長因子，提高由LIF所誘導的HpStC前驅體的增殖，但是不支持其自身的擴張(第6A圖)。
然而，增殖在單獨利用塑膠培養盤的情況下不持續。因而，FACS-分類的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞接下來被放置於STO5餵養層上(Kubota and Reid，2000)。縱然LIF係藉由STO細胞生產，外源的LIF和EGF的補充進一步戲劇性地支持來自分類的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之群落形成(第6B圖)。於培養物中之增殖的細胞表現結蛋白和絲蛋白，而STO5餵養層不表現二者任一(第7圖)。3個單一群落被挑選以及被放置於新鮮的STO5餵養層上。該等單一群落衍生的細胞於具有補充LIF和EGF的STO5餵養層之共培養物內繼續增殖歷時2個月，其指示其等具有廣泛的生長潛力。結蛋白和絲蛋白的表現於增殖的細胞內被維持(第8圖)。
為了進一步地比較2個月-培養的細胞與新鮮單離的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之特徵性表現型，RT-PCR被執行。於培養中維持歷時2個月之單一群落衍生的細胞(A428-3)藉由FACS與STO5餵養細胞分離，以及RNA被萃取用於RT-PCR分析。RNA係自STO5餵養細胞予以單離，其等同時地被分類用於一種對照的樣品。此外，RNA自成年的HpStCs予以單離以比較該等與A428-3和STO5細胞。
該等結果顯示A428-3表現結蛋白、絲蛋白、SMαA、波形蛋白、β3-整合素、SDF-1α、HGF，和Hlx，其指出該表現型態是新鮮的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之類似物(第5圖和第9A圖)。再者，VCAM-1的表現係藉由FACS分析予以確認(第9B圖)。RT1A的表現似乎於活體外培養被 誘發(第9B圖)。成年的HpStCs之RT-PCR結果與之前的報導相符，其中正常成年的HpStCs之表現型是結蛋白+’ 、神經膠質微纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)+ ，HGF+ ，但是SMαAlo/- 。該等結果亦顯示成年的HpStCs表現SDF-1α、β3-整合素，和Hlx。於A428-3細胞(第9A圖)或是於胎肝內之任何的分級內沒有GFAP的表現。
然而，本發明提供可以結合上述的標記使用以鑑定HpStC前驅體細胞之額外的標記，包括，舉例而言，β3-整合素+PECAM-1-VLA-6+和CD44H-。ICAM-1和β3-整合素也被表現於成熟的HpStCs上。除了該等表面標記之外，成熟的和前驅體HpStCs二者表現HpStCs特異的中間絲，包括結蛋白、波形蛋白、平滑肌阿伐-肌動蛋白(a-actin)和絲蛋白。
於本研究中，於A428-3細胞(第9A圖)或是於胎肝GFAP內之被測試之任何分級內沒有任何可偵測的GFAP的表現。縱然GFAP是被使用來鑑定中樞神經系統內之星狀細胞的一種標記，該蛋白也被表現於成年的肝中的HpStCs內。然而，我們於任何被檢查的細胞分級以及整個胎肝樣品內、藉由RT-PCR未發現GFAP mRNA。此外，即使在單離的HpStC前驅體的培養之後，GFAP的表現未被誘發，而培養物中結蛋白和絲蛋白的表現被維持。此結果暗示胎肝內之HpStC前驅體於一末期的發展階段將獲得GFAP的表現。然而，我們無法排除另一種可能性，其中GFAP+細胞係衍生自不存在於13 dpc胎肝內之不同的前驅體。血流中之循環細 胞可以是任擇的細胞來源之一種來源。然而，於成年的肝中之HpStCs的多數表現GFAP；因而，來自血液的循環細胞之較小的貢獻較不可能變成肝內之一種優勢的族群。因而，GFAP的表現之獲得似乎比較可能在HpStCs的成熟期間發生。
數據亦指出HpStC前驅體相對強烈地表現相異的同源框蛋白(homeobox protein)，Hlx。縱然介於Hlx的表現和HpStC的發展之間的關係不清楚，Hlx表現的喪失可以貢獻於突變小鼠體內之缺陷。於小鼠的胎肝內之HpStC前驅體也表現HGF、SDF-1脉和Hlx。
除了HpStC前驅體之獨特的表面表現型之外，本研究中建立的培養系統能被用來鑑定成年的肝中的HpStC前驅體。直至今日，來自成年的肝的HpStCs已經被培養於以胎牛血清補充的培養基內。通常，被培養於補充血清的培養基內之HpStCs引起肌纖維母細胞，其等獲得肌纖維母細胞的特徵以及喪失原始的HpStC表現型。因而，補充血清的培養基條件是不適合鑑定HpStC前驅體的。於本研究說明的無血清的培養條件支持HpStC先祖之活體外維持。
似乎HpStC前驅體對於肝的發展扮演關鍵的角色，因為其等比任何檢查的胎肝細胞的次群表現更多的HGF轉錄品。HGF是一種肝的發展之決定性的生長因子(Schmidt等人，1995)，以及該因子也在肝的再生期間負責肝的實質細胞生長(Michalopoulos and DeFrances，1997)。此外，已經顯示HpStCs，而非實質細胞、內皮細胞，或庫佛氏細胞，是成 年的肝中的HGF之生產者(Schirmacher等人，1992)。因而，我們和先前研究的數據暗示著HpStCs是自胎兒至成年的肝內之主要的HGF生產者。
於本研究中，於13 dpc胎肝內沒有GFAP的表現。縱然GFAP是被使用來鑑定中樞神經系統內之星狀細胞的一種標記，該蛋白亦也被表現於成年的肝中的HpStCs內。然而，我們藉由RT-PCR沒有發現GFAP mRNA於任何檢查的細胞分級以及整個的胎肝樣品內。此外，即使在單離的HpStC前驅體的培養之後，GFAP的表現未被誘發，而結蛋白和絲蛋白的表現被維持於培養物中。此結果暗示著於胎肝內之HpStC前驅體將於一個後期的發展的階段獲得GFAP的表現。然而，我們無法排除另一種可能性，其中GFAP+細胞係衍生自不存在於13 dpc胎肝內之不同的前驅體。血流中之循環細胞可以是任擇的細胞來源之一種來源。然而，於成年的肝中之HpStCs的多數表現GFAP；因而，來自血液的循環細胞之較小的貢獻較不可能變成肝內之一種優勢的族群。因而，GFAP的表現之獲得似乎比較可能在HpStCs的成熟期間發生。
一種相異的同源框蛋白，Hlx，係被表現於胎肝內之橫隔板內和間葉細胞(Lints等人，1996)。Hlx剔除小鼠的一個先前研究顯示該等突變小鼠具有受損的肝發展和胎肝造血(Hentsch等人，1996)。
移植實驗指出造血缺陷係由胎肝的微環境所造成，但是不是由造血先祖本身。因而，Hlx+ 細胞是一種胎肝內之 支持肝和造血的發展之決定性的細胞群。我們的數據指出HpStC前驅體強烈地表現Hlx。因而，檢查是否Hlx剔除小鼠具有HpStC前驅體是有趣的。縱然介於Hlx的表現和HpStC的發展之間的關係尚不清楚，Hlx的表現的喪失可能對於突變小鼠體內之缺陷有貢獻。最近，我們發現小鼠的胎肝內之相似的HpStC前驅體也表現HGF、SDF-1a，和Hlx。再者，本發明人已經鑑定於人類的胎肝內之具有相似標記(如，平滑肌α -肌動蛋白)的間葉細胞，以及已經證明人類肝的幹細胞之活體外擴張是存活的。
藉由FACS純化之HpStC前驅體係於STO餵養層上以及在以脂質、胰島素、運鐵蛋白、EGF和LIF補充的無血清的培養液條件下被增殖。我們的數據指出LIF對於活體外增殖是更有幫助的。有STO餵養層的支持，HpStC前驅體持續地複製歷時多於2個月。培養的細胞表現VCAM-1、β-3-整合素、結蛋白、波形蛋白、平滑肌阿伐-肌動蛋白、絲蛋白、HGF和SDF-1a。新鮮的HpStC前驅體之此等表現型未在活體外培養的期間變化。
除了HpStC前驅體之獨特的表面表現型之外，本研究中建立的培養系統能被用來鑑定成年的肝中的HpStC前驅體。直至今日，來自成年的肝的HpStCs已經被培養於以胎牛血清補充的培養基內。通常，被培養於補充血清的培養基內之HpStCs引起肌纖維母細胞，其等獲得肌纖維母細胞的特徵以及喪失原始的HpStC表現型。因而，補充血清的培養基條件是不適合鑑定HpStC前驅體的。於本研究中說明的無 血清的培養條件支持HpStC先祖之活體外維持。設若於成年的肝中存在HpStC前驅體，其等將是取代纖維化的肝中之活化的HpStCs之一種有價值的資源。HpStC前驅體之表現型的鑑定和一種活體外培養系統將促進肝的疾病之新穎的治療方針的發展。
縱然本發明已經關於其之特定的實施例予以說明，可以瞭解到其能夠進一步的修飾，以及本申請案係意欲涵蓋本發明隨後的任何變化、用途，或是交替。一般而言，本發明的原理和包括本揭示之此等背離，如隨著本發明有關的技藝而來的已知或慣用的實施，以及如可以被應用至上文中提出的必要特徵和於以下之附隨的申請專利範圍的範疇。
第1圖顯示13 dpc大鼠胎兒的肝和肺內之自體螢光細胞的流動細胞計數儀分析。(A)整個族群(全體)的前散射光(FSC)和側散射光(SSC)的型態。根據SSC的數值，R1和R2閘被創造出以及各別地代表高(SSChi )和低(SSClo )SSC。R1和R2內的RT1A和ICAM-1之表現型態亦被顯示。RT1A- ICAM-1+ SSChi 細胞(R2，右下方)是大鼠的胎肝內之肝母細胞(hepatoblast)(Kubota and Reid，2000)。數目指出各象限的百分比。(B)整個族群(全體)、R1，和R2的自體螢光型態係以UV雷射和488nm雷射予以分析。UV雷射特異性自體螢光信號係以一種450nm濾波器予以偵測，然而以一種488nm雷射激發的非特異性自體螢光信號係以一種530/30帶通 濾波器(bandpass filter)予以測量。於R1和R2內的UV雷射-特異性自體螢光細胞被偵測(左上方)。(C)RT1A的表現和UV雷射特異性自體螢光信號被研究。UV雷射-特異性自體螢光細胞是RT1A- 。ns-autoflu+ RT1A- 細胞(許可)被鑑定以及對應於大鼠肝母細胞族群。(D)13 dpc胎肺細胞內之UV雷射特異性自體螢光信號係被分析。於肺細胞群中沒有UV特異性自體螢光細胞。全部細胞的多數是RT1A- ，以及沒有非專一性自體螢光細胞(可比得上於該胎肝內之肝母細胞族群)被偵測到。
第2圖顯示於vA+ 細胞上之VCAM-1和ICAM-1的表現。(A)關於13dpc胎肝上之VCAM-1的表現之流動細胞計數(Flow cytometry)的柱狀圖。大概15%的細胞於該細胞表面上表現VCAM-1。封閉和開放的柱狀圖各別地代表染色的細胞和未染色的細胞。VCAM-1+ 和VCAM-1- 細胞係藉由流動細胞計數儀分析其等之自體螢光信號。全部的vA+ 細胞和ns-autoflu+ 細胞是VCAM-1陽性的。該等數目代表各象限的百分比。(B)13 dpc胎肝細胞關於RT1A和ICAM-1的二種顏色分析。R1細胞群(RT1A- ICAM-1+ )包含全部的vA+ 細胞和ns-autoflu+ 細胞。此等結果指出vA+ 和ns-autoflu+ 細胞是VCAM-1+ RT1A- ICAM-1+ 。
第3圖顯示13 dpc胎肝內之vA+ 、ns-autoflu+ ，和autoflu- RT1A- 細胞的抗原概況(antigenic profiles)。(A)關於UV-自體螢光和RT1A的表現之流動細胞計數儀分析。於該RT1A- 細胞群中，4個閘(R1-R4)係根據該等自體螢光信號而被創造 出，(B)各被圍起的細胞群(R1-R4)之VCAM-1相對β3-整合素、PECAM-1，或Thy-1的表現之二種顏色分析。該等數目代表各象限的百分比。主要地R1細胞是VCAM-1+ β3-整合素+ ，然而R3細胞一致地表現VCAM-1，但是沒有β3-整合素、PECAM-1，或Thy-1。
第4圖顯示一種雙重潛能的(bipotent)肝母細胞群落(colony)之免疫細胞化學法。ns-autoflu+ VCAM-1+ 細胞係藉由FACS予以單離以及以一種純株細胞密度(clonal cell density)(於12井的平盤之一井內250個細胞；66個細胞/cm2 )被放置於HDM內的STO餵養細胞上。在15天的培養之後，該等細胞被固定以及以對抗ALB(紅色)和CK19(綠色)的抗體予以染色。各群落係自一個單一分類的細胞產生的(Kubota and Reid，2000)。多於95%(95.7±0.4%；平均值±SEM,n=3)的肝群落包含ALB+ CK19- 和ALB- CK19+ 細胞，其等各別地代表肝和膽的分化。
第5圖提供由FACS分級的14 dpc胎肝細胞之RT-PCR的分析。徑1，ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素- ；徑2，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ ；徑3，autoflu- RT1A- VCAM-1+ ；徑4，autoflu- RT1A- VCAM-1- ；徑5，剩餘的VCAM-1- 細胞群；徑6，無cDNA。vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞強烈地表現SDF-1α和HGF。該等vA+ 細胞是HpStC標記(結蛋白、絲蛋白、波形蛋白、SMαA)陽性的以及對於肝母細胞標記(白蛋白和Prox1)呈陰性。
第6圖顯示LIF和EGF對於vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合 素+ 細胞的活體外增殖的效應。(A)由FACS單離的500個vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞被放置於具有指出的濃度之LIF及/或EGF的添加基膜素(laminin)之HDM的96井平盤的一井內。在5天的培養之後，細胞增殖的程度係藉由四唑鹽WST-1予以測量。LIF在低至0.1ng/ml支持vA+ 細胞的增殖。EGF稍微改善vA+ 細胞的增殖。(B)250個由FACS單離的RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ vA+ 細胞被播種於具有EGF及/或LIF的HDM內之STO餵養細胞上。使用12井的平盤。該等培養物在2週培養期間之後以Diff-QuickTM 予以染色。縱然STO細胞表現LIF，產生的量係不足以支持該等細胞在缺少外源的LIF的補充之下的純株擴張(clonal expansion)。外源的LIF和EGF的添加戲劇性地改善該等vA+ 細胞的純株擴張。
第7圖顯示由FACS單離的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞所衍生的群落之免疫細胞化學法。細胞係被放置於以EGF和LIF補充的HDM內之STO餵養層上。在15天的活體外培養之後，培養物係以結蛋白或絲蛋白的抗體予以染色。群落形成細胞表現絲蛋白和結蛋白，而STO細胞未表現任一種。
第8圖顯示由FACS單離的經2個月的培養之vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞的免疫細胞化學法。被分類的細胞係被放置於以EGF和LIF補充的HDM內之STO餵養層上。增殖的細胞係於新鮮的STO餵養層上次選殖5次。被培養的細胞係以結蛋白或絲蛋白的抗體予以染色。增殖的細胞 在培養期間維持絲蛋白和結蛋白的表現。
第9圖提供2個月培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之表現型的特徵。(A)培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之RT-PCR分析。細胞係藉由FACS予以單離以及於具有EGF和LIF的HDM內之STO餵養層上被培養。在2個月之後培養細胞係藉由FACS予以分級。增殖的大鼠細胞和小鼠STO餵養細胞在以小鼠CD98單株抗體的抗體染色之後藉由FACS予以分級。CD98被表現於小鼠STO細胞上，以及該單株抗體專一地與小鼠CD98反應，但是不與大鼠CD98反應。RNA係自vA+ -衍生的大鼠細胞和STO細胞內單離。正常大鼠HpStC也被使用且單離RNA用於一種對照。cDNA係自該等RNA合成以及接受以對被表現於HpStCs之各種轉錄品專一的引子之PCR。(B)培養的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整合素+ 細胞之流動細胞計數。被利用於RT-PCR之細胞係以抗VCAM-1或RT1A抗體以及小鼠CD98抗體予以染色。CD98陰性的分級被分析VCAM-1或RT1A的表現。衍生自大鼠的胎肝內之vA+ 細胞的持續增殖的細胞於檢查的培養條件下一致地表現VCAM-1和RT1A。

Claims (18)

  1. 一種獲得富含有肝星形細胞先祖的一群細胞之方法，其包含：(a)提供來自哺乳動物的組織之肝細胞的一種單一細胞的懸浮液；以及(b)任何順序相繼地，或是實質上同時地，(i)自該單一細胞的懸浮液移除表現第Ia型主要組織相容性複體抗原(MHC class Ia antigen)與神經膠質微纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)之該等細胞；以及(c)自該細胞懸浮液單離對於維他命A螢光呈陽性的該等細胞，以獲得富含有肝星形細胞先祖之一群細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(b)包含(iii)單離對於VCAM呈陽性的該等細胞。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(b)包含(iii)表現CD45的該等細胞之移除。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法其中該步驟(b)包含(iii)單離對於VCAM抗原和β3-整合素二者均呈陽性的該等細胞。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(b)包含(iii)自該細胞懸浮液單離表現結蛋白(desmin)、絲蛋白(nestin)、波形蛋白(vimentin)、平滑肌阿伐-肌動蛋白(alpha-actin)或是其等之一組合的該等細胞。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該單離和移除步驟係利用流動細胞計數技術(Flow cytometry)予以進行。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等肝星形細胞先祖是人類肝星形細胞先祖。
  8. 一種獲得富含有的肝星形細胞先祖之一群細胞的方法，其包含：(a)獲得肝細胞的一種細胞懸浮液；以及(b)以任何順序相繼地，或是實質上同時地，(i)自肝細胞的該細胞懸浮液單離對於ICAM抗原呈陽性的該等細胞，(ii)移除對於第一型主要組織相容性複體抗原與神經膠質微纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein)(GFAP)呈陽性的該等細胞，以及(iii)單離當於一種流動細胞計數儀內測量時對於維他命A螢光呈陽性的該等細胞，以獲得富含有肝星形細胞先祖的一群細胞。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該步驟(b)包含(iv))自該細胞懸浮液單離表現結蛋白、絲蛋白、波形蛋白(vimentin)、平滑肌α -肌動蛋白或是其等之一組合的該等細胞。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該單離和移除步驟係於一種流動細胞計數儀內予以進行。
  11. 如申請專利範圍第8項之方法，其中表現第一型主要組織相容性複體抗原之該等細胞的移除係以一種抗體予以進行。
  12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該等肝星形細胞先祖是人類肝星形細胞先祖。
  13. 一種經單離的肝星形前驅體細胞，其表現VCAM抗原和β3-整合素抗原二者且不表現MHC第1a型抗原與GFAP。
  14. 一種肝星形前驅體細胞之純株化擴張(clonogenic expansion)的方法，其包含：於無血清的培養液中培養經單離的肝星形前驅體細胞，該肝星形前驅體細胞表現VCAM抗原和β3-整合素抗原二者且不表現MHC第1a型抗原與GFAP。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該等培養液進一步包含一種生長因子。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該生長因子是胰島素、運鐵蛋白、LIF或EGF或是其等之一組合。
  17. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該等經單離的肝星形前驅體細胞於餵養細胞的存在之下被進一步的培養。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該等餵養細胞是STO細胞。
TW096118759A 2006-05-26 2007-05-25 肝星形細胞前驅體及其分離方法 TWI448554B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80854806P 2006-05-26 2006-05-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200813224A TW200813224A (en) 2008-03-16
TWI448554B true TWI448554B (zh) 2014-08-11

Family

ID=38779344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096118759A TWI448554B (zh) 2006-05-26 2007-05-25 肝星形細胞前驅體及其分離方法

Country Status (12)

Country Link
US (4) US7824911B2 (zh)
EP (2) EP2428561B8 (zh)
JP (1) JP5254221B2 (zh)
CN (1) CN101553564B (zh)
CA (2) CA2872716C (zh)
DK (2) DK2428561T3 (zh)
ES (2) ES2701729T3 (zh)
HU (2) HUE040629T2 (zh)
PL (2) PL2029725T3 (zh)
PT (2) PT2428561T (zh)
TW (1) TWI448554B (zh)
WO (1) WO2007140243A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101553564B (zh) 2006-05-26 2012-12-05 北卡罗来纳大学教堂山分校 肝星状细胞前体及其分离方法
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US9164093B2 (en) * 2011-03-31 2015-10-20 Iheart Japan Corporation Cardiomyocyte marker
US9533013B2 (en) 2013-03-13 2017-01-03 University Of North Carolina At Chapel Hill Method of treating pancreatic and liver conditions by endoscopic-mediated (or laparoscopic-mediated) transplantation of stem cells into/onto bile duct walls of particular regions of the biliary tree
CN103743907B (zh) * 2013-07-24 2015-04-15 北京大学人民医院 测定造血干细胞移植后患者骨髓微循环环境评测的试剂盒、系统及方法
CN103555656A (zh) * 2013-10-24 2014-02-05 上海中医药大学附属龙华医院 同时分离肝星状细胞及成纤维母细胞的方法
EP3708652A3 (en) * 2015-03-18 2020-12-16 The University of Tokyo Liver sinusoidal endothelial progenitor cells, and methods for preparation thereof
CN106947731A (zh) * 2017-02-21 2017-07-14 广州柏赛柯生物技术有限公司 一种肝星状细胞分离制备方法
WO2023086958A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Ambys Medicines, Inc. Methods of producing and using human hepatocytes and related compositions

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182188A1 (en) * 1999-01-19 2002-12-05 Reid Lola M. Human liver progenitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6069005A (en) 1991-08-07 2000-05-30 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshwa University Hapatoblasts and method of isolating same
US7456017B2 (en) * 1999-10-01 2008-11-25 University Of North Carolina At Chapel Hill Processes for clonal growth of hepatic progenitor cells
US7413897B2 (en) * 2002-03-15 2008-08-19 University Of North Carolina At Chapel Hill Primitive and proximal hepatic stem cells
CN101553564B (zh) * 2006-05-26 2012-12-05 北卡罗来纳大学教堂山分校 肝星状细胞前体及其分离方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182188A1 (en) * 1999-01-19 2002-12-05 Reid Lola M. Human liver progenitors

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Trounson, "The production and directed differerntiation of human embryonic stem cells.", Endocrine Reviews, Epub 24 Jan. 2006, Vol. 27, No.2, page208-219 *
H. Kubota & L. M. Reid, "Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineages, are lacking clasddical major histocompatibility complex class I antigen.", PNAS, 24 Oct. 2000, Vol.97, No.22, page 12132-12137 *
T. Knittel, et al., "Rat liver myofibroblasts and hepatic stellate cells: Different cell populations of fibroblast lineage with fibrogenic potential.", Gastroenterology, Nov. 1999, Vol.117, No.5, page1205-1221 *
X. Zhou, et al., "Engagement of alphavbeta3 integrin regulates proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells.", Journal of Biological Chemistry, 4 June 2004, Vol.279, No.23, page 23996-24006 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101553564B (zh) 2012-12-05
US20080009057A1 (en) 2008-01-10
WO2007140243A3 (en) 2008-11-13
US20150093762A1 (en) 2015-04-02
EP2029725B1 (en) 2018-01-03
EP2029725A2 (en) 2009-03-04
PT2029725T (pt) 2018-04-12
DK2029725T3 (en) 2018-03-26
EP2428561B1 (en) 2018-09-26
ES2664375T3 (es) 2018-04-19
US9416349B2 (en) 2016-08-16
TW200813224A (en) 2008-03-16
CN101553564A (zh) 2009-10-07
PL2029725T3 (pl) 2019-01-31
US7824911B2 (en) 2010-11-02
CA2872716C (en) 2017-12-05
EP2428561A1 (en) 2012-03-14
HUE036729T2 (hu) 2018-07-30
US10093895B2 (en) 2018-10-09
US20120028353A1 (en) 2012-02-02
EP2428561B8 (en) 2019-03-20
PL2428561T3 (pl) 2019-05-31
US20170152472A1 (en) 2017-06-01
EP2029725A4 (en) 2009-09-09
JP5254221B2 (ja) 2013-08-07
ES2701729T3 (es) 2019-02-25
WO2007140243A2 (en) 2007-12-06
JP2009538152A (ja) 2009-11-05
PT2428561T (pt) 2019-01-10
CA2688309A1 (en) 2007-12-06
DK2428561T3 (en) 2019-01-21
CA2688309C (en) 2015-02-17
CA2872716A1 (en) 2007-12-06
HUE040629T2 (hu) 2019-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11339373B2 (en) Method for producing adult liver progenitor cells
TWI448554B (zh) 肝星形細胞前驅體及其分離方法
Kubota et al. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis
US11180734B2 (en) Single cell-derived organoids
KR101119878B1 (ko) 프리미티브 간 줄기세포 및 프록시멀 간 줄기세포
CN101974480A (zh) 肝移植细胞、测定及其应用
Chou et al. Fetal hepatic progenitors support long-term expansion of hematopoietic stem cells
CN1461341A (zh) 肝祖先细胞克隆生长的方法
Kamiya et al. Identification and differentiation of hepatic stem cells during liver development
Shinohara et al. Unstable side population phenotype of mouse spermatogonial stem cells in vitro
CN114317398A (zh) Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用
Lukacs Identification of a link between prostate stem cell self-renewal and carcinogenesis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees