CN101553564B - 肝星状细胞前体及其分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肝星状细胞的前体细胞、包含所述前体细胞的组合物以及分离所述前体细胞的方法。所述前体的表面抗原特征是Ia类MHC阴性、ICAM-1+、VCAM-1+、β3-整联蛋白+。除了这些表面标志物的表达外，细胞还表达细胞内标志物结蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白、巢蛋白、肝细胞生长因子、间质衍生因子-1α和Hlx同源异形框转录因子。

Description

肝星状细胞前体及其分离方法
相关申请的交叉引用 
本申请要求2006年5月26日提交的美国临时申请第60/808,548号的优先权，其公开内容通过引用整体结合入本文。 
技术领域
本发明一般涉及构成成体肝的细胞的前体。具体说，本发明涉及肝星状细胞的前体细胞、包含所述前体细胞的组合物以及分离所述前体细胞的方法。 
背景技术
肝星状细胞(HpStC)在19世纪首次由Kupffer描述，并因为它们在显微镜下观察时“形状”闪耀而命名为″Sternellen″。HpStC是在狄氏间隙中发现的肝特异性间质细胞，并大部分组成为含有维生素A的细胞质脂滴。事实上，脂滴促成了伴随HpStC的“闪耀”性质。 
现在认为HpStC在维生素A化合物的摄取、贮存和释放中起主要作用，这特别对视力、生殖和胚胎发育是必要的。哺乳动物中，约50至80％的全身维生素A正常贮存于HpStC中。 
HpStC在肝中细胞因子、细胞外基质组分(ECM)和基质金属蛋白酶的生成中也起重要作用。许多报道证明，HpStC分泌几种干细胞的分裂素-例如EGF、TGF和HGF-并在肝发育和再生中起重要作用。类似地，许多研究证明，ECM调节失衡是肝纤维化或肝硬化的因素。而且，HpStC的收缩性表明，它们对周细胞具有类似功能，控制血管中局部流速。总之，HpStC的这些种种功能说明它们在健康和失调的肝功能中的显著作用。 
尽管我们日益理解HpStC的重要性，但是HpStC的起源还是未 知的。在早期肝发育中，前肠的内胚层细胞产生肝突，肝突依次发育成周围称为横隔的中胚层并形成肝索。虽然一些人推测HpStC祖细胞可衍生自横隔中的间质细胞，但还没有从其分离出HpStC，实现免疫选择和/或表征前体HpStC的表面标志物还有待鉴定。 
因此，需要明确鉴定HpStC前体的标志物和使所述前体与所述标志物分离的方法。此外，需要体外繁殖HpStC前体细胞的方法。 
发明内容
发明概述 
在本发明的一个实施方案中，提供了获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括(a)提供来自哺乳动物组织的细胞的单细胞混悬液；和，以任何顺序依次或基本上同时，(b)从单细胞混悬液去除表达Ia类MHC抗原的那些细胞；和(c)从细胞混悬液分离对维生素A荧光呈阳性的那些细胞，以获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群。哺乳动物组织可以是肝、胰腺、肠、肺或骨髓细胞，优选肝。该方法可以进一步包括从细胞混悬液分离对VCAM和/或β3-整联蛋白呈阳性的那些细胞；从细胞混悬液去除那些表达CD45的细胞；和/或从细胞混悬液分离那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。 
在一些实施方案中，分离和去除步骤在流式细胞仪中进行。表达I类MHC抗原的细胞的去除可以使用抗表达那些抗原的细胞的种特异性抗体进行；例如，使用抗鼠肝细胞中RT1A的抗体。而且，肝星状祖细胞可以是人类肝星状细胞祖细胞。 
在本发明另一方面，提供了获得富集了分离的肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)获得肝细胞的细胞混悬液；和(b)以任何顺序依次或基本上同时，(i)从肝细胞的单细胞混悬液分离那些对ICAM-1抗原呈阳性的细胞(ii)去除那些对I类MHC抗原呈阳性的细胞，和(iii)分离那些在流式细胞仪中测量的对维生素A荧光呈阳性的细胞，以获得富集了祖细胞的细胞群。该方法可以进一步包括从细胞混悬液去除那些表达I类MHC抗原、CD45或 两者的细胞，和/或从细胞混悬液分离那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。 
在本发明另一个实施方案中，提供了表达VCAM抗原和β3-整联蛋白抗原的分离的肝星状前体细胞。而在本发明另一实施方案中，提供了无性扩增星状前体细胞的方法，该方法包括在无血清培养基中培养表达VCAM抗原和β3-整联蛋白抗原的分离的星状前体细胞。所述培养基科进一步包含生长因子，例如胰岛素、运铁蛋白、白血病抑制因子(LIF)或表皮生长因子(EGF)或其组合。分离的星状前体细胞可以进一步在饲养细胞例如STO细胞存在下培养。 
一方面，在详细解释本发明至少一个实施方案之前，要理解，本发明的应用不限于下述描述中提出或附图中图示的构造的细节和组成部分的布置。本发明包括除了所描述的那些以外的实施方案，并能够以不同的方式实施和实现。而且，要理解，本文采用的措辞和术语以及摘要，是为描述目的，而不应视为限制性的。 
因此，本领域技术人员将理解，本公开基于的构思可以容易被利用为用于实现本发明几个目的的其他结构、方法和系统的设计基础。因此，重要的是，在不背离本发明精神和范围的前提下，权利要求被视为包括这样的等同构造。 
附图说明
图1显示13dpc大鼠胎儿肝和肺中自荧光细胞的流式细胞检测分析。(A)整个群(全部)的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)的模式。基于SSC值，R1和R2门产生，并分别代表高(SSChi)和低(SSClo)SSC。还显示了R1和R2中RT1A和ICAM-1的表达模式。RT1A- ICAM-1+ SSChi细胞(R2，右下)是大鼠胎儿肝中的肝胚细胞(Kubota和Reid，2000)。数字指示每个象限的百分比。(B)整个群(全部)、R1和R2的自荧光模式用UV激光和488nm激光分析。UV激光特异性自荧光信号用450nm滤波器检测，而用488nm激光激发的非特异性自荧光信号用530/30带通滤波器检测。在R1和R2(左上)中检测UV激光特异性自荧光细胞。(C)研究了RT1A和UV激光特异性自荧光信号的表达。UV 激光特异性自荧光细胞是RT1A-。ns-autoflu+ RT1A-细胞(箭头)被鉴定，并对应于大鼠肝胚细胞群。(D)UV激光特异性自荧光信号在13dpc胎儿肺细胞中分析。肺细胞群中没有UV特异性自荧光细胞。所有细胞的大部分是RT1A-，没有检测到非特异性自荧光细胞(与胎儿肝中肝胚细胞相当)。 
图2显示vA+细胞上的VCAM-1和ICAM-1表达。(A)对13dpc胎儿肝上VCAM-1表达的流式细胞术的直方图。大约15％细胞在细胞表面表达VCAM-1。闭合和开放的直方图分别代表染色的细胞和未染色的细胞。VCAM-1+和VCAM-1-细胞通过流式细胞术分析它们的自荧光信号。全部vA+细胞和ns-autoflu+细胞是VCAM-1阳性。数字代表每个象限的百分比。(B)针对RT1A和ICAM-1的13dpc胎儿肝细胞的两个颜色分析。R1细胞群(RT1A- ICAM-1+)含有全部vA+细胞和ns-autoflu+细胞。这些结果表明，vA+和ns-autoflu+细胞是VCAM-1+RT1A- ICAM-1+。 
图3显示了13dpc胎儿肝中vA+、ns-autoflu+和autoflu- RT1A-细胞的抗原特征。(A)UV自荧光和RT1A表达的流式细胞检测分析。在RT1A-细胞群中，产生基于自荧光信号的门(R1-R4)。(B)针对每个门控细胞群(R1-R4)的两个颜色分析VCAM-1与β3-整联蛋白、PECAM-1或Thy-1表达。数字表示每个象限的百分比。首选R1细胞是VCAM-1+ β3-整联蛋白+，而R3细胞一致表达VCAM-1，但没有β3-整联蛋白、PECAM-1或Thy-1。 
图4显示了双潜能肝胚细胞集落的免疫细胞化学。ns-autoflu+VCAM-1+细胞通过FACS分离并以无性系细胞密度(12孔板的每孔中250个细胞；66个细胞/cm2)置于HDM中的STO饲养细胞上。培养15天后，细胞经固定并用抗ALB(红)和CK19(绿)抗体染色。每个集落从单分选细胞产生(Kubota和Reid，2000)。超过95％(95.7±0.4％；平均值±SEM，n＝3)肝集落含有ALB+ CK19-和ALB- CK19+细胞，其分别代表肝和胆分化。 
图5提供通过FACS分离的14dpc胎儿肝细胞的RT-PCR分析。泳道1，ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白-；泳道2，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+；泳道3，autoflu- RT1A- VCAM-1+；泳道4，autoflu- RT1A- VCAM-1-；泳道5，保留VCAM-1-细胞群；泳道6，没有cDNA。vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞高表达SDF-1α和HGF。vA+细胞对HpStC标志物(结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、SMαA)呈阳性，而对肝胚细胞标志物(白蛋白和Prox1)呈阴性。 
图6显示LIF和EGF对vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞体内繁殖的影响。(A)通过FACS分离的500个vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞放入96孔板的孔中，含有添加了所示浓度的LIF和/或EGF的HDM加层粘连蛋白。5天培养后，细胞繁殖程度通过四唑盐WST-1测量。低至0.1ng/ml的LIF支持vA+细胞繁殖。EGF略微提高vA+细胞增殖。(B)通过FACS分离的250个RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+vA+细胞接种在含有EGF和/或LIF的HDM中的STO饲养细胞上。使用了22孔板。在2周培养期后，培养物用Diff-QuickTM染色。尽管STO细胞表达LIF，但是生成的量不足以支持细胞在缺乏外源LIF添加下无性扩增细胞。外源LIF和EGF的添加显著提高了vA+细胞的无性扩增。 
图7显示衍生自通过FACS分离的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的集落的免疫细胞化学。细胞置于添加有EGF和LIF的HDM中的STO饲养细胞上。体外培养15天后，培养物用结蛋白或巢蛋白抗体染色。集落生成细胞表达巢蛋白和结蛋白，而STO细胞不表达任何一个。 
图8显示培养2个月的、通过FACS分离的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的免疫细胞化学。分选细胞置于添加有EGF和LIF的HDM中的STO饲养细胞上。繁殖细胞在新鲜STO饲养细胞上传代培养5次。培养的细胞用结蛋白或巢蛋白抗体染色。繁殖细胞在培养期间保持巢蛋白和结蛋白的表达。 
图9提供培养2个月的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的表型特征。(A)培养的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的RT-PCR分析。细胞通过FACS分离，并在含有EGF和LIF的HDM中的STO饲养细胞上培养。培养2个月后，细胞通过FACS分选。繁殖的大鼠细 胞和小鼠STO饲养细胞在小鼠CD98单克隆抗体的抗体染色后通过FACS分选。CD98在小鼠STO细胞上表达，单克隆抗体与小鼠CD98但不与大鼠CD98特异性反应。从vA+-衍生的大鼠细胞和STO细胞分离RNA。还使用了正常大鼠HpStC，分离的RNA用作对照。cDNA从那些RNA合成并经受PCR，使用特异性针对HpStC中表达的各种转录子的引物。(B)培养的vA+RT1A-VCAM-1+β3-整联蛋白+细胞的流式细胞术。用于RT-PCR的细胞用抗-VCAM-1或RT1A抗体和小鼠CD98抗体染色。分析CD98阴性组分的VCAM-1或RT1A表达。衍生自大鼠胎儿肝中的vA+细胞的连续繁殖细胞在检验培养条件下一致表达VCAM-1和RT1A。 
具体实施方式
发明详述 
HpStC已被冠以各种名称，包括“脂细胞”、“脂肪贮存细胞”、“Ito细胞”、“周窦状细胞”和“肝周细胞”。但是为了清楚，本文将仅使用术语HpStC，然而其应该被理解为指具有任何或全部前述替代名称的相同的细胞群。而且，本文的教导不限于任何一种。事实上，应该理解，本文提供的实例仅是示例性的，而不应该解释为限制性的。以这种方式，本发明不受肝组织的哺乳动物来源的限制。可以衍生HpStC及其前体的哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、仓鼠)、兔、牛、马、猪和绵羊。优选地，HpStC及其前体衍生自人。 
本发明提供了用于分离和繁殖HpStC前体细胞(本文还称为“HpStC前体”或“前体HpStC”)的技术。大鼠胎儿肝中的HpStC前体通过使用细胞质vA富集液滴产生的特异性自荧光的流式细胞术来鉴定。vA+细胞的表面表型表现为是一致的，并且它们是RT1A- ICAM-1+VCAM-1+ β3-整联蛋白+ PECAM-1-。除了这些表面标志物，vA+细胞表达特异性针对HpStC的中间丝，包括结蛋白、波形蛋白、SMαA和巢 蛋白。 
尽管胎儿肝细胞上ICAM-1表达是广泛的，但β3-整联蛋白在vA+细胞上是相对特异性的。β3-整联蛋白需要α-整联蛋白、αv-整联蛋白或αII-整联蛋白用于表面表达。选择随细胞类型而不同。在成体肝中HpStC的情况下，αv-整联蛋白用于α-链。因此，HpStC前体可能表达αv-整联蛋白。有趣的是，在成体HpStC上表达的αvβ3-整联蛋白与ECM配体的相互作用似乎影响HpStC的命运确定、繁殖或凋亡。αvβ3-整联蛋白转导刺激信号以保护成体HpStC中的凋亡反应。此外，另一报道显示，αvβ3-整联蛋白结合PECAM-1。因此，不限于或束缚于理论，HpStC前体上的β3-整联蛋白似乎对接收来自周围ECM配体或内皮细胞的刺激信号而言是重要的，所述细胞表达PECAM-1，为胎儿肝发育过程中的繁殖。 
虽然FACS分析表明在胎儿肝中肝胚细胞和HpStC前体上检测到了VCAM-1高表达，但是后者可能对造血细胞起更重要的作用，因为它们还表达SDF-1α。SDF-1α是造血干细胞的有效化学诱导物，所述细胞表达SDF-1α的受体CXCR4。趋化因子在造血干/祖细胞迁移至骨髓的过程中起重要作用，并被认为上调对VCAM-1的VLA-4依赖性粘附。因此，SDF-1α和VCAM-1在HpStC前体上的表达可能对募集造血干/祖细胞进入胎儿肝中是关键的。 
有趣的是，VCAM-1在肝胚细胞上表达。除了表面表型和mRNA表达外，肝胚细胞的体外CFA证明，VCAM-1+细胞是肝胚细胞。该发现是意想不到的，因为认为VCAM-1是间质细胞例如内皮细胞、生肌细胞或HpStC的表面标志物。表达似乎是发育上受控的，因为通过FACS分析，成体肝细胞是VCAM-1-。 
HpStC前体对于肝发育而言似乎是重要的，因为它们是胎儿肝中的主要HGF生产者。HGF是肝发育的关键生长因子，该因子还负责肝再生中肝实质细胞生长。此外，已经显示，HpStC而非实质细胞、内皮细胞和Kupffer细胞，在成体肝中表达HGF。因此，我们的数据和之前的研究表明，HpStC是从胎儿到成体的肝中主要的HGF生产者。因此，HpStC前体可能对胎儿肝的肝和造血发育起重要作用， 因为该细胞是HGF和SDF-1α的主要前体。 
考虑HpStC前体的独特表型和功能特征，包括VCAM-1和Hlx的表达以及HGF和SDF-1α的生成，前体可能由肝中造血干细胞或肝干细胞或两者的干细胞生态位组成。因为无血浆培养系统保持HpStC前体在体外的独特特征表型，培养系统可以用于开发体外集落分析系统以从成体肝鉴定HpStC前体。此外，如果HpStC移植系统被开发，使用HpStC前体的细胞疗法将是可行的。成体肝中的HpStC前体或HpStC祖细胞的鉴定、体外扩增和移植将是替换纤维生成肝中活化HpStC的有价值的来源。清楚地，本研究中描述的HpStC前体的表型鉴定和体外培养系统证明了开发新型肝疾病治疗方法的新方向。 
下述实施例是本发明的示例，但本发明决不限于这些具体实施例。本领域普通技术人员将在这些实施例中发现实现本发明的一种方式。而且，虽然本实施例为实验方便而以大鼠环境提出，但是本领域普通技术人员根据下文公开的教导可容易地将本文描述的方法和试剂转变为人类应用。 
材料和方法 
大鼠
怀孕的Fisher 344大鼠获自Charles River BreedingLaboratory(Wilmington，MA)。观察到塞子的早上指定为第0天。雄性Fisher 344大鼠(200-250g)用于分离成体HpStC。所有动物实验根据制度指导方针进行，北卡罗来纳大学动物护理和使用制度委员会根据国家科学院的实验室动物护理和使用指南批准了所有实验程序。 
细胞制备
根据本发明适合体外繁殖的肝祖细胞不限于通过任何特定方法分离或鉴定的那些。通常，HpStC前体可以从任何离体肝切片获得。然后，离体肝切片可通过标准程序离解成单离解细胞。这样的程序包括酶离解和/或机械离解。酶离解可以在蛋白酶存在下进行，所述 蛋白酶例如胶原酶和/或核酸酶，例如DNA酶。在一些情况下，也可以使用链酶蛋白酶。现有技术描述和实施酶解肝细胞的方法。仅作为例子，分离和鉴定肝祖细胞的方法已经描述于例如美国专利第6,069,005号和美国专利申请第09/487,318；10/135,700和10/387,547号，其公开内容通过引用整体结合入本文。实际上，存在用于消化和分离肝细胞的单细胞混悬液的各种程序。因此要理解，本发明范围不限于获得完整肝或制备其单细胞混悬液的特定方法。 
在本实施例中，胎儿肝从13～14dpc大鼠分离并用800U/ml胶原酶(Sigma)消化，随后用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma)进一步消化。细胞混悬液用200U/ml DNA酶I(Sigma)处理(Kubota和Reid，2000)。 
细胞培养物
在优选实施方案中，体外繁殖步骤包括使用无血清、添加激素的确定培养基(HDM)来支持HpStC前体细胞在饲养细胞层上的繁殖。饲养细胞的功能是多方面的，包括提供营养、提供附着表面和向培养基分泌某些前体HpStC生存、生长和/或分化所需的生长因子和细胞外基质组分。饲养细胞可以来自爬行动物、鸟、介虫、鱼、环节动物、贝类、线虫、昆虫或哺乳动物，优选人。 
HDM由Dulbecco改良Eagle培养基和Ham’s F12(DMEM/F12，GIBCO/BRL)的1∶1混合物组成，其中添加了2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)、5μg/ml胰岛素(Sigma)、10-6M地塞米松(Sigma)、10μg/ml铁饱和的运铁蛋白(Sigma)、4.4x10-3M烟酰胺(Sigma)、5x10-5M 2-巯基乙醇(Sigma)、7.6μeq/l游离酸、2x10-3M谷酰胺(GIBCO/BRL)、1x10-6M CuSO4、3x10-8M Na2SeO3和抗生素(青霉素和链霉素)。游离酸包括棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸(都来自Sigma)，各自在100meq/l原液中的摩尔比为31.0∶2.8∶11.6∶13.4∶35.6∶5.6。 
STO饲养细胞如前所述制备(Kubota和Reid，2000)。简言之， STO细胞的亚克隆STO5用pEF-Hlx-MC1neo转染。经转染的克隆STO5Hlx用丝裂霉素C(Sigma)处理，并在12孔板中以2x105细胞每孔的浓度用于饲养细胞。为了分选的vA+细胞的长期培养，细胞在STO饲养细胞上和添加了10ng/ml人白血病抑制因子(LIF；Boehringer Mannheim)和10ng/ml表皮生长因子(EGF；Collaborat ive Biomedical Product)的HDM中培养。培养基每隔一天更换一次，细胞每周传代培养至新鲜STO饲养细胞。 
集落的免疫细胞化学染色
用于培养细胞的染色程序先有描述(Kubota和Reid，2000)。简言之，培养板在甲醇-丙酮(1∶1)中室温固定2分钟、冲洗并用20％山羊血清(GIBCO/BRL)在4℃封闭。为了双标记白蛋白(ALB)和细胞角蛋白(CK)19，培养物用抗大鼠ALB抗体(ICN Biomedicals)和抗细胞角蛋白19(CK19)单克隆抗体(Amersham)、随后用德克萨斯红-偶合的抗兔IgG(Vector laboratories)和FITC-偶合的抗小鼠IgG(Caltag)孵育。对于巢蛋白或结蛋白表达，细胞用抗巢蛋白抗体(大鼠-401，Developmental Studies Hybridoma Bank，The Universityof Iowa)或抗结蛋白抗体(D33，Dako)、随后Alexa488-偶合的抗小鼠IgG(Molecular Probes)染色。 
荧光激活的细胞分选(FACS)
细胞通过配有双Coherent I-90激光的FACStar Plus细胞分选仪(BD Biosciences)进行分析和分选。为了检测vA-特异性自荧光，细胞在351nm刺激，使用450DF20滤波器(Omega Optical Inc，Brattleboro，VT)检测荧光发射。荧光偶合抗体在488nm刺激，通过标准滤波器检测它们的荧光发射。 
用于分析大鼠细胞的单克隆抗体是FITC-偶合的抗-RT1A(B5；BD Biosciences)、藻红蛋白(PE)-偶合的抗大鼠ICAM-1(1A29；BDBiosciences)、抗大鼠VCAM-1(5F10，Babco)、抗大鼠α6β1-整联蛋白(mAB-5A，Serotec)、抗大鼠CD44(OX-49，BD Biosciences)、PE-偶合的抗大鼠VCAM-1(MR109；BD Biosciences)、PE-偶合的或生物素-偶合的抗大鼠β3-整联蛋白(2C9.G2；BD Biosciences)、生 物素-偶合的抗大鼠PECAM-1(TLD-3A12；BD Biosciences)、生物素-偶合的抗大鼠Thy-1(OX-7；BD Biosciences)。为了阻断非特异性抗体结合，细胞用20％山羊血清(GIBCO/BRL)、1％硬骨鱼明胶(Sigma)和抗大鼠CD32(FcγII受体)抗体(D34-485，大鼠BD Fc BlockTM，BDBiosciences)溶液孵育，然后在FACS实验中进行抗体染色。为了用未偶合抗VCAM-1抗体(5F10)染色，胎儿肝细胞用抗VCAM-1抗体孵育，随后用生物素-偶合的抗小鼠IgG2a单克隆抗体(R19-15，BDBiosciences)染色。抗生蛋白链霉素-Cy-铬(BD Biosciences)用于检测生物素-偶合的抗体。 
为FACS实验以分离衍生自分选vA+细胞的长期培养细胞，收集培养物中所有细胞并用生物素偶合的抗小鼠CD98(H202-141，BDBiosciences)、随后抗生蛋白链霉素-Cy-铬染色以分开培养的大鼠细胞和STO饲养细胞。鼠STO饲养细胞用抗小鼠CD98抗体轻微染色。因此，CD98-阴性细胞代表大鼠衍生的细胞，并可以使用之前所示FACS容易地区分(Kubota和Reid，2000)。 
肝胚细胞的集落形成分析(CFA)
肝胚细胞的CFA程序之前有描述(Kubota和Reid，2000)。简言之，分选细胞以500或2500细胞/孔(3.8cm2)置于12孔板中的STO饲养细胞上(三份重复)，并在HDM中培养14～15天，每隔一天更换一次培养基。为了检验肝胚细胞的双潜能分化活性，进行ALB和CK19的双免疫荧光染色。集落通过Diff-Quick(Baxter)染色以计数每孔的集落。 
细胞繁殖分析
通过FACS分离的vA+细胞以500细胞/孔放入含有HDM的96孔板中(三份重复)，HDM添加有终浓度为8μg/ml的层粘连蛋白(Collaborative Biomedical Products)。EGF和LIF以指示浓度添加。涂布细胞后5天，冲洗培养物两次以去除漂浮细胞，并添加含有四唑盐WST-1(Boehringer Mannheim)的新鲜培养基以测量有活力的附着细胞的数目(Kubota和Reid，2000)。4小时后，根据生产商方案测定吸光度。 
逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)
用于PCR的引物序列示于表1。 
表1 
Figure G2007800268634D00121
FACS分选细胞的RT-PCR程序之前有描述(Kubota等，2002)。简言之，细胞使用FACStar Plus细胞分选仪分离，通过RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，进行cDNA合成。cDNA通过寡聚dT开始和AMV逆转录酶(Seikagaku America)以20μl反应体积在42℃下从总RNA合成(Kubota等，2002)。PCR使用合成的cDNA以总体积50μl进行，所述50μl由1μM各个引物、200μM各dNTP、50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris HCl(pH8.3)和1.25U Amplitaq聚合酶gold(Perkins Elmer)组成。样品加热至94℃、3分钟，随后扩增26-35个循环94℃-2分钟、62℃-2分钟、72℃-3分钟。每个 靶基因的扩增数目不同并示于表1。最后一个循环后，最终延伸步骤在72℃进行6分钟。然后，5μl各个PCR反应通过1％琼脂糖凝胶电泳分析。从分选细胞的总RNA合成的cDNA被标准化为细胞数目。 
结果 
胎儿肝中维生素A+细胞的鉴定
一旦单细胞混悬液建立，HpStC前体的分离包括使衍生自肝组织的混合的肝细胞群经历流式细胞术，并选择那些表现出细胞质维生素A(vA)富集液滴产生的特异性自荧光的细胞。维生素A在用330-360nm(紫外线，UV)激光的光刺激时特异性生成绿-蓝荧光。FACS分析能够使用UV激光检测成体HpStC以及前体HpStC的细胞质中维生素A特异性绿-蓝荧光(vA+)。 
图1A显示13dpc胎儿肝细胞中自荧光模式。通过使用450nm滤波器检测UV激光(351nm)刺激的发射光而测量vA特异性蓝-绿自荧光信号。为了检测非UV激光特异性自荧光信号，使用了488nm激光和530/30nm带通滤波器。整个胎儿肝细胞群以及两个亚群(图1A的R1和R2门)的自荧光信号模式示于图1B。在整个细胞群的FACS模式中(图1B全部)，鉴定了两个具有高自荧光特征的不同亚群。一个具有特异性针对UV光的自荧光信号(图1B全部，左上)，其在这里被称为vA+，而对角位于右上象限的细胞指示非特异性自荧光，因为自荧光信号在由488nm激光和UV激光刺激时分别用530nm滤波器和450nm滤波器检测。具有非特异性自荧光特征的亚群(指定为ns-autoflu+)排他地衍生自SSC高门(图1A、R2和图1B、R2)，而vA+细胞(图1B，左上)在R1和R2中检测。 
图1C显示vA-特异性自荧光信号和Ia类MHC表达的模式，其通过FITC偶合的抗RT1A抗体检测。FACS分析表明，vA+细胞以及ns-autoflu+细胞没有RT1A表达，因为那两个群的染色样品(图1C，R2)与对照样品(图1B，R2)相比没有改变。此外，FACS分析还表明，肝胚细胞群、RT1A- ICAM-1+ SSC高的细胞(图1A R2，右下)和RT1A- ns-autoflu+细胞(图1C R2，箭头)通过该FACS分析是重叠群。 
为了检测这些自荧光信号是否特定在胎儿肝中，分离了来自13 dpc胎儿的胎儿肺细胞，并通过FACS分析。FACS分析显示，肺细胞中没有ns-autoflu+细胞也没有vA+细胞，表明胎儿肝中的特定亚群的自荧光信号是独特的表型特征。 
因为肝祖细胞(即，肝胚细胞)已经显示是大鼠胎儿13dpc肝中的RT1A- OX18低ICAM-1+SSC高细胞，在vA+细胞中分析这些标志物。图1A显示13dpc胎儿肝细胞的FACS分析模式，随后用抗RT1A、大鼠I类MHC和ICAM-1抗体染色。图1C显示vA-特异性自荧光信号和RT1A表达模式，其通过FITC-偶合的抗RT1A抗体检测。FACS分析表明，vA+细胞以及ns-autoflu+细胞没有RT1A表达，因为这两个群的染色样品与对照样品(图1B，R2)相比没有改变(图1C，R2)。此外，FACS分析表明，肝胚细胞群，RT1A-ICAM-1+SSC高的细胞(图1A，R2，右下)和RT1A- ns-autoflu+细胞(图1C，R2，箭头)是相同的群。这些结果表明，FACS分析能够检测早如13dpc的大鼠胎儿肝中的特征vA+细胞，并且vA+细胞是RT1A-ICAM-1+。 
表达VCAM-1和整联蛋白β3的维生素A+细胞
如上所证明的，vA阳性和Ia类MHC阴性是足以鉴定和分离HpStC的标志物。然而，在一些情况下，基于UV光的UV选择可能不是希望的，特别是在关心分子(例如，DNA)完整性的情况下。因此，本发明提供了可以附加或替代UV选择而使用的标志物。HpStC前体可以通过使选择的细胞群暴露于特异性针对VCAM、更特别VCAM-1的抗体而进一步鉴定。VCAM-1是重要的，因为其已显示为区分成体肝中的HpStC与肌纤维母细胞的独特表面标志物。而且，VCAM-1的表达似乎是发育上受控的，因为成体肝细胞对该标志物呈阴性。 
在胎儿肝细胞中分析VCAM-1表达以考察vA+细胞是否表达VCAM-1。通过FACS分析，13dpc胎儿肝中似乎有约15％细胞是VCAM-1+(图2A)。接下来确定自荧光和VCAM-1+细胞的RT1A表达的模式。VCAM-1+细胞含有基本上全部vA+细胞以及整个ns-autoflu+细胞群(图2A)，表明HpStC和肝胚细胞表达VCAM-1。两个单克隆抗大鼠VCAM-1抗体(5F10和MR109)的FACS分析显示了相同的VCAM-1表达模式。此外，胎儿肝VCAM-1+细胞是RT1A-ICAM-1+细胞，因为图 2B中的R1门包括VCAM-1+细胞群。这些结果表明，胎儿肝VCAM-1+RT1A-ICAM-1+细胞由vA+细胞、肝胚细胞和一些非自荧光细胞组成。 
考察了其他表面抗原以区别两个自荧光群vA+细胞和肝胚细胞，这两个群都是VCAM-1+RT1A-ICAM-1+细胞。因为β3-整联蛋白(CD61)在内皮细胞、血管平滑肌细胞和成体HpStC上表达，进行了VCAM-1与整联蛋白β3的二颜色FACS分析。大部分vA+RT1A-细胞表达了β3-整联蛋白，而ns-autoflu+RT1A-细胞是β3-整联蛋白-，而vA-RT1A-细胞含有一些VCAM-1+β3-整联蛋白+细胞(图3B)。 
Autoflu- RT1A-细胞含有一些VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞。剩余的主要群(图3B，R4)是VCAM-1-并表现为对应于图2B中的R2细胞群。R4细胞群当它们在塑料皿上培养时包含非附着细胞，表明它们是造血细胞。亚群(～20％)组分是β3-整联蛋白+。还评估了已知为内皮细胞标志物的PECAM-1(CD31)的表达。然而，FACS分析表明，vA+RT1A-细胞和ns-autoflu+ RT1A-细胞中PECAM-1表达是可忽略的(图3B)，而PECAM-1+细胞在autoflu- RT1A-和非附着细胞群中检测(图3B、R2和R4)。致癌损伤后在成体肝中出现的椭圆形细胞的表面标志物Thy-1(CD90)的表达被进一步评估。FACS分析显示，ns-autoflu+RT1A-是Thy-1-。 
相反，vA+ RT1A-细胞、autoflu- RT1A-细胞和非附着细胞异源表达Thy-1。FACS分析表明，ns-autoflu+ RT1A-细胞是CD44lo，而vA+RT1A-细胞是CD44-(数据未显示)。尽管CD44(Pgp-1)在vA+ RT1A-细胞和ns-autoflu+ RT1A-中表现为分化表达，细胞表面上的表达是弱的。总之，这些数据表明，在所有检验的抗体中，β3-整联蛋白抗体染色有助于区分vA+ RT1A-细胞和ns-autoflu+ RT1A-细胞，这两个群在胎儿肝中都是VCAM-1+ ICAM-1+。 
VCAM-1 + 整联蛋白β3 - 非特异性自荧光细胞群仅含有肝胚细胞
直至14dpc大鼠的胎儿肝细胞是同种的，具有分化成干细胞和胆上皮细胞的发育潜力，取决于微环境。这些双潜能祖细胞称为肝胚细胞。为了检验vA+细胞是否具有产生肝细胞谱系的任何潜力，进 行了CFA(Kubota和Reid，2000)。四个细胞群通过FACS分离，并接受肝胚细胞的CFA：1)ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白-2)vA+ RT1A- VCAM-1+ 3)autoflu- RT1A-和4)VCAM-1-非附着细胞。分选细胞组分置于HDM中的STO5饲养细胞上，培养15天，用抗白蛋白和CK19抗体分别对肝谱系和胆谱系进行染色。然后，计数所有肝集落。 
CFA表明，肝集落产生自组1，ns-autoflu+ VCAM-1+ β3-整联蛋白-细胞(下表2)，证明其他组的分选细胞，包括vA+ VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞，不是肝祖细胞。超过95％的、衍生自组1分选细胞的肝集落含有肝(白蛋白+ CK19-)和胆上皮(白蛋白- CK19+)细胞两者(图4)。而且，分选ns-autoflu+ VCAM-1+ β3-整联蛋白-细胞的集落形成效率为大约31％，之前研究(Kubota和Reid，2000)中建立的肝祖细胞细胞系(rhel4321)的CFA集落效率为42.5±1.8％。总结，该实验中的CFA结果表明，ns-autoflu+VCAM-1+β3-整联蛋白-细胞群是几乎纯的肝胚细胞群，因为已有细胞系的CFA大概比新分离的细胞高得多。 
表2：提供了来自分选啮齿胎儿肝细胞的肝星状集落的频率。产生了如图3的R1、R2、R3和R4分别所示的vA+RT1A-VCAM-1+、autoflu-RT1A-、ns-autoflu+ RT1A-和VCAM-1-细胞的分选门。 
Figure G2007800268634D00161
Figure G2007800268634D00162
：分选了来自R2的VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞 
§：分选了来自R1的VCAM-1+ β3-整联蛋白-细胞 
Figure G2007800268634D00163
：分选了来自R4的VCAM-1-细胞 
流式细胞术分选细胞以每孔指定细胞数目在12孔板中STO饲养细胞上培养。肝集落数目是每孔平均数。集落效率表示为培养中接种的并在15天培养后持续形成集落的细胞的百分比。值是平均值±SEM。总孔接种分选细胞数目包括在括号中。 
新分离的维生素A +  VCAM-1 +  整联蛋白β3 + 细胞的基因表达
接下来分析vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的基因表达模式以检验它们是否表达HpStC的各种标志物。通过FACS分离了五个群，从这五个群分离RNA。使用从RNA合成的cDNA进行HpStC标志物的RT-PCR。这五个群是：1)ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白-，2)vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+，3)autoflu- RT1A- VCAM-1+，4)autoflu- RT1A- VCAM-1-，和5)VCAM-1-非附着细胞群。成体肝中的HpStC表达中间丝、结蛋白和巢蛋白，其不在肝中其他细胞类型中表达。 
RT-PCR分析显示，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+、ns-autoflu+RT1A- VCAM-1+和autoflu- VCAM-1-细胞表达了所有四个中间丝。ns-autoflu+ RT1A- VCAM-1+细胞表达白蛋白以及Prox1，其是在肝胚细胞中特异性表达的转录因子。该结果与CFA分析获得的数据一致，其证明该群包含肝胚细胞。肝胚群中没有表达巢蛋白、SMαA或波形蛋白。HpStC特异性中间丝的表达强力表明vA+细胞是HpStC前体。 
随后，使用RT-PCR考察了三个单独的间质细胞标志物HGF、间质细胞衍生的因子-1α(SDF-1α)和分歧同源异形盒转录因子Hlx的表达。HGF是正常肝发育、特别是小鼠中肝胚细胞的繁殖和分化所需的，在成体肝中，HpStC是主要的HGF生产者。SDF-1α是造血祖细胞的有效趋化因子，胎儿肝中的造血干细胞相应该趋化因子而迁移。Hlx在发育胎儿肝的间质细胞中表达，并在胎儿肝造血和肝发育中起不可缺少的作用。 
有趣的是，在所有被检验的细胞中，vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞表达HGF、SDF-1α和Hlx转录子最强烈(图5)。总结，vA+RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞是结蛋白+巢蛋白+ SMαA+ 波形蛋白+Hlx+，并且是胎儿肝中HGF和SDF-1α的主要生产者。 
RT1A -  VCAM-1 +  β3-整联蛋白 +  vA + 细胞的体外无性扩增
从成体肝分离的HpStC在体外仅具有有限的繁殖活性。考察了胎儿肝中vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞的体外生长能力，因为HpStC前体可能具有广泛的繁殖活性。LIF是许多不同类型的细胞的多效生长因子，所述细胞包括胚胎干细胞或肌性细胞。当通过FACS分离的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞用激素确定的无血清培养基以500细胞/孔的密度在LIF存在下于96孔板培养5天时，细胞以剂量依赖方式扩增(图6A)。此外，各种细胞类型(包括神经干细胞)的生长因子EGF增强了LIF诱导的HpStC前体的繁殖，但是没有支持其自身的扩增(图6A)。 
但是，繁殖没有在单独使用塑料培养板的条件下持续。因此，FACS-分选的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞接下来置于STO5饲养细胞上(Kubota和Reid，2000)。尽管LIF由STO细胞生成，但外源LIF和EGF补充进一步支持了从分选的vA+ RT1A- VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞显著地形成集落(图6B)。培养中的繁殖细胞表达了结蛋白和巢蛋白，而STO5饲养细胞没有表达任一个(图7)。三个单集落被挑选并置于新鲜STO5饲养细胞上。单集落衍生的细胞在与添加了LIF和EGF的STO5饲养细胞共培养中继续繁殖2个月，表明它们具有广泛的生长潜力。结蛋白和巢蛋白的表达保持在繁殖细胞中(图8)。 
为了进一步比较2个月培养的细胞与新分离的vA+ RT1A- VCAM-1+β3-整联蛋白+细胞的特征表型，进行了RT-PCR。培养中维持2个月的单集落衍生的细胞(A428-3)通过FACS从STO5饲养细胞分离，提取RNA用于RT-PCR分析。从同时分选的STO5饲养细胞分离的RNA用作对照样品。此外，从成体HpStC分离RNA以与来自A428-3和STO5细胞的RNA比较。 
结果证明，A428-3表达了结蛋白、巢蛋白、SMαA、波形蛋白、β3-整联蛋白、SDF-1α、HGF和Hlx，表明表达模式类似于新鲜vA+ RT1A-VCAM-1+ β3-整联蛋白+细胞(图5和图9A)。而且，VCAM-1表达通过FACS分析确认(图9B)。RT1A表达似乎在体内培养中诱导(图9B)。 成体HpStC的RT-PCR结果与之前报道相符，其中正常成体HpStC的表型是结蛋白+、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)+、HGF+、但SMαAlo/-。结果还显示，成体HpStC表达SDF-1α、β3-整联蛋白和Hlx。A428-3细胞中不表达GFAP(图9A)，胎儿肝中不表达任何测试组分。 
但是，本发明提供了可以与前述标志物一起使用以鉴定HpStC前体细胞的其他标志物，包括例如β3-整联蛋白+PECAM-1-VLA-6+和CD44H-。ICAM-1和β3-整联蛋白还表达在成熟HpStC上。除了那些表面标志物外，成熟和前体HpStC表达特异性针对HpStC的中间丝，包括结蛋白、波形蛋白、平滑肌a-肌动蛋白和巢蛋白。 
在该研究中，A428-3细胞中没有可检测的GFAP表达(图9A)，胎儿肝GFAP中没有任何测试组分。尽管GFAP是用于鉴定中枢神经系统中星状细胞的标志物，但是该蛋白质还表达于成体肝的HpStC中。但是，我们没有通过RT-PCR在所检验的任何细胞组分以及整个胎儿肝样品中发现GFAP mRNA。此外，甚至在培养分离的HpStC前体后，没有诱导GFAP表达，而培养物中保持了结蛋白和巢蛋白表达。该结果表明，胎儿肝的HpStC前体将在后来的发育阶段获得GFAP表达。但是，我们不能排除另一种可能，其中GFAP+细胞衍生自不存在于13dpc胎儿肝中的不同前体。血流中的循环细胞可以是替代细胞起源的来源。但是，成体肝中的大部分HpStC表达GFAP；因此，血液循环细胞的较小贡献不可能成为肝中的优势群。因此，更可能的是，GFAP表达的获得发生在HpStC成熟过程中。 
数据还表明，HpStC前体相对强地表达分歧同源异形盒蛋白Hlx。尽管Hlx表达与HpStC发育之间的关系不清楚，但是Hlx表达的损失可能促进变异小鼠的缺陷。小鼠胎儿肝的HpStC前体还表达HGF、SDF-1和Hlx。 
除了HpStC前体的独特表面表型外，该研究中建立的培养系统可以用于鉴定成体肝的HpStC前体。直到现在，成体肝的HpStC已经在添加有胎儿牛血清的培养基中培养。正常而言，添加血清的培养基中培养的HpStC产生成肌纤维细胞，其获得了成纤维特征但失去了原始的HpStC表型。因此，添加血清的培养基条件不适合鉴定 HpStC前体。该研究中描述的无血清培养条件支持HpStC祖细胞的体外保持。 
HpStC前体似乎在肝发育中起关键作用，因为它们表达比所检验的胎儿肝细胞组分中任何亚群更多的HGF转录子。HGF是肝发育的关键生长因子(Schmidt等，1995)，并且该因子还负责肝再生过程中肝实质细胞生长(Michalopoulos和DeFrances，1997)。此外，已经显示，HpStC而非实质细胞、内皮细胞或Kupffer细胞，是成体肝中HGF的生产者(Schirmacher等，1992)。因此，我们的数据和之前研究的数据表明，HpStC是从胎儿到成体肝中主要的HGF生产者。 
该研究中，13dpc胎儿肝中无GFAP表达。尽管GFAP是用于鉴定中枢神经系统星状细胞的标志物，但是蛋白质也在成体肝的HpStC中表达。但是，我们没有通过RT-PCR在所检验的任何细胞组分以及整个胎儿肝样品中发现GFAP mRNA。此外，甚至在培养分离的HpStC前体后，没有诱导GFAP表达，而培养物中保持了结蛋白和巢蛋白表达。该结果表明，胎儿肝的HpStC前体将在后来的发育阶段获得GFAP表达。但是，我们不能排除另一种可能，其中GFAP+细胞衍生自不存在于13dpc胎儿肝中的不同前体。血流中的循环细胞可以是替代细胞起源的来源。但是，成体肝中的大部分HpStC表达GFAP；因此，血液循环细胞的较小贡献不可能成为肝中的优势群。因此，更可能的是，GFAP表达的获得发生在HpStC成熟过程中。 
分歧同源异形盒蛋白Hlx表达于胎儿肝的横隔和间质细胞中(Lints等，1996)。Hlx敲除小鼠的之前研究证明，突变小鼠具有受损的肝发育和胎儿肝造血(Hentsch等，1996)。 
移植实验表明，造血缺陷是由胎儿肝微环境引起的，而不是由造血祖细胞本身引起的。因此，Hlx+细胞是胎儿肝中支持肝和造血发育的关键细胞群。我们的数据表明，HpStC前体高表达了Hlx。因此，感兴趣的是检查Hlx敲除小鼠是否具有HpStC前体。尽管Hlx表达与HpStC发育之间的关系不清楚，但是Hlx表达的损失可能促进变异小鼠的缺陷。最近我们发现，小鼠胎儿肝中类似的HpStC前体还表达HGF、SDF-1a和Hlx。而且，本发明人已经在人类胎儿肝中鉴 定了具有类似标志物(例如，平滑肌α-肌动蛋白)并且已经证明对人肝干细胞的体外扩增至关重要的间质细胞。 
通过FACS纯化的HpStC前体在STO饲养细胞和添加了脂质、胰岛素、运铁蛋白、EGF和LIF的无血清培养基条件下繁殖。我们的数据表明，LIF对于体内繁殖更有益。在STO饲养细胞支持下，HpStC前体持续复制超过2个月。培养的细胞表达了VCAM-1、β-β3-整联蛋白、结蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白、巢蛋白、HGF和SDF-1a。这些新鲜HpStC前体表型没有在体外培养过程中改变。 
除了HpStC前体的独特表面表型外，该研究中建立的培养系统可用于鉴定成体肝中的HpStC前体。直到现在，成体肝的HpStC已经在添加有胎儿牛血清的培养基中培养。正常而言，添加血清的培养基中培养的HpStC产生成肌纤维细胞，其获得了成纤维特征但失去了原始的HpStC表型。因此，添加血清的培养基条件不适合鉴定HpStC前体。该研究中描述的无血清培养条件支持HpStC祖细胞的体外保持。如果成体肝中存在HpStC前体，则它们将是替换纤维生成肝中活化HpStC的有价值的资源。HpStC前体的表型鉴定和体外培养系统将有利于新型肝疾病治疗方法的开发。 
虽然已经结合其具体实施方案描述了本发明，但要理解其能够进一步改变，本申请是要涵盖下述发明的任何变性、用途或改变。大体上，本发明原理包括如下从本公开的偏离：落入本发明所述领域已知或常规实践，可以适用于上文所提出的必要特征，落入所附权利要求范围内。 

Claims (16)

1.一种获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括：
(a)提供来自哺乳动物组织肝细胞的单细胞混悬液；并以任何顺序依次或基本上同时，
(b)从所述单细胞混悬液去除那些表达Ia类MHC抗原的细胞；并
(c)从细胞混悬液分离以得到那些对维生素A荧光呈阳性的细胞，
以获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群；
其中，所述肝星状细胞祖细胞没有GFAP表达。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：以任何顺序依次或基本上同时(d)分离以得到那些对VCAM呈阳性的细胞。
3.权利要求1的方法，其进一步包括：以任何顺序依次或基本上同时(d)去除那些表达CD45的细胞。
4.权利要求1的方法，其进一步包括：以任何顺序依次或基本上同时(d)分离以得到那些对VCAM抗原和β3-整联蛋白呈阳性的细胞。
5.权利要求1的方法，其进一步包括：以任何顺序依次或基本上同时，(d)从所述细胞混悬液分离以得到那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述分离和去除步骤使用流式细胞仪进行。
7.权利要求1的方法，其中所述肝星状祖细胞是人肝星状细胞祖细胞。
8.一种获得富集了分离的肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括：
(a)获得肝细胞的细胞混悬液；和
(b)以任何顺序依次或基本上同时，(i)从肝细胞的单细胞混悬液分离以得到那些对ICAM-1抗原呈阳性的细胞(ii)去除那些对I类MHC抗原呈阳性的细胞，和(iii)分离得到那些在流式细胞仪中测量的对维生素A荧光呈阳性的细胞，以获得富集了祖细胞的细胞群；其中，所述肝星状细胞祖细胞没有GFAP表达。
9.权利要求8的方法，其进一步包括：以任何顺序依次或基本上同时，(c)从细胞混悬液分离以得到那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。
10.权利要求8的方法，其中所述分离和去除步骤使用流式细胞仪进行。
11.权利要求8的方法，其中那些表达I类MHC抗原的细胞的去除使用抗体进行。
12.权利要求8的方法，其中所述肝星状祖细胞是人肝星状细胞祖细胞。
13.一种分离的肝星状祖细胞，其是维生素A阳性、VCAM阳性、β3-整联蛋白阳性和Ia类MHC阴性。
14.一种无性扩增肝星状祖细胞的方法，该方法包括在无血清包括EGF和LIF的培养基中培养表达维生素A阳性、VCAM阳性、β3-整联蛋白阳性和Ia类MHC阴性的分离的肝星状祖细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述分离的星状前体细胞进一步在饲养细胞存在下培养。
16.权利要求15的方法，其中所述饲养细胞是STO细胞。
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