JP6812003B2 - 肝細胞及び肝非実質細胞、並びにそれらの調製方法 - Google Patents
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Description
[1]
肝前駆細胞を含む細胞画分から、CPM陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の調製方法。
[2]
胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞を分化誘導して肝前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[3]
多能性幹細胞を分化誘導して前記胚体内胚葉細胞又は前記肝内胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、[1]に記載の方法。
[4]
前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、[2]又は[3]に記載の方法。
[5]
[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法で調製され得、CPM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、肝前駆細胞。
[6]
凍結保存し、解凍した後における前記肝前駆細胞の増殖能が、凍結保存前における肝前駆細胞の増殖能と比較して低下しない、[5]に記載の肝前駆細胞。
[7]
全細胞に対して90%以上の肝前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝前駆細胞はCPM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
[8]
[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導する工程を含む、肝細胞の調製方法。
[9]
[8]に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する肝細胞。
[10]
[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞を胆管上皮細胞へと分化誘導する工程を含む、胆管上皮細胞の調製方法。
[11]
[10]に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する胆管上皮細胞。
[12]
肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、FLK1陽性、CD34陽性及びCD31陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の調製方法。
[13]
中胚葉細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、[12]に記載の方法。
[14]
多能性幹細胞を分化誘導して前記中胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、[13]に記載の方法。
[15]
前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、[14]に記載の方法。
[16]
[12]〜[15]のいずれか1つに記載の方法で調製され得、FLK1陽性、CD34陽性及びCD31陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、肝類洞内皮前駆細胞。
[17]
全細胞に対して90%以上の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝類洞内皮前駆細胞はFLK1陽性、CD34陽性及びCD31陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
[18]
(1)TGF−β阻害剤を用いて[16]に記載の肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導して、肝類洞内皮細胞を含む細胞画分を調製する工程、及び
(2)肝類洞内皮細胞を含む前記細胞画分からCD31陽性およびFcγR II陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程
を含む、肝類洞内皮細胞の調製方法。
[19]
[18]に記載の方法で調製され得、CD31陽性およびFcγR II陽性の表現型を有し、増殖能を有する、肝類洞内皮細胞。
[20]
肝星前駆細胞を含む細胞画分からALCAM陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の調製方法。
[21]
多能性幹細胞を分化誘導して肝星前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、肝星前駆細胞の調製方法。
[22]
前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、[21]に記載の方法。
[23]
[20]〜[22]のいずれか1つに記載の方法で調製され得、ALCAM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、肝星前駆細胞。
[24]
全細胞に対して90%以上の肝星前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝星前駆細胞はALCAM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、細胞画分。
[25]
Rock阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法。
[26]
前記肝星前駆細胞が、[23]に記載の肝星前駆細胞である、[25]に記載の方法。
[27]
[25]又は[26]に記載の方法で調製され得、増殖能を有する、肝星細胞。
[28]
[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも1つの肝非実質細胞と共培養する工程を含む、肝細胞組織モデルの調製方法。
[29]
前記肝類洞内皮細胞が、[19]に記載の肝類洞内皮細胞である、[28]に記載の方法。
[30]
前記肝星細胞が、[27]に記載の肝星細胞である、[28]又は[29]に記載の方法。
[31]
肝細胞と、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも1つの肝非実質細胞とを含み、[28]〜[30]のいずれか1つに記載の方法で調製され得る、肝細胞組織モデル。
[32]
[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞、[7]に記載の細胞画分、[9]に記載の肝細胞、[11]に記載の胆管上皮細胞、[16]に記載の肝類洞内皮前駆細胞、[17]に記載の細胞画分、[19]に記載の肝類洞内皮細胞、[23]に記載の肝星前駆細胞、[24]に記載の細胞画分、[27]に記載の肝星細胞、或いは[31]に記載の肝細胞組織モデルを含む、医薬組成物。
[33]
[9]に記載の肝細胞又は[31]に記載の肝細胞組織モデルに肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
[34]
[9]に記載の肝細胞又は[31]に記載の肝細胞組織モデルに薬剤を投与することを含む、薬剤の肝毒性の評価方法。
[35]
(1)[5]若しくは[6]に記載の肝前駆細胞、又は[7]に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
(2)病原体を感染した前記肝前駆細胞を分化誘導して病原体感染疾患モデルの肝細胞を調製すること
を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
[36]
[9]に記載の肝細胞に病原体を感染させる工程を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
[37]
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、[35]又は[36]に記載の調製方法。
[38]
[35]〜[37]に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデルの肝細胞。
[39]
(1)[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞、又は[7]に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
(2)病原体を感染した前記肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも1つの肝非実質細胞と共培養する工程
を含む、感染性疾患モデル組織の調製方法。
[40]
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、[39]に記載の調製方法。
[41]
[39]又は[40]に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデル組織。
[42]
[38]に記載の感染性疾患モデルの肝細胞又は[41]に記載の感染性疾患モデル組織に感染性肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
[43]
[5]又は[6]に記載の肝前駆細胞、[7]に記載の細胞画分、[9]に記載の肝細胞、[11]に記載の胆管上皮細胞、[16]に記載の肝類洞内皮前駆細胞、[17]に記載の細胞画分、[19]に記載の肝類洞内皮細胞、[23]に記載の肝星前駆細胞、[24]に記載の細胞画分、[27]に記載の肝星細胞、或いは[31]に記載の肝細胞組織モデルを含む、キット。
Cytofix/Cytoperm Fixtation/permeabi1ization kit(BD Biosciences)を用いて細胞を固定および透過処理し、細胞質タンパク質を抗原抗体法により標識した。その後、MoF1o XDP セルソーター ((Beckman Coulter, Inc) を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
TRIzol reagent(Life Technologies)もしくはNucleoSpin RNA XS (MACHEREY-NAGAL, Duren, Germany)を用いてRNAを抽出した。残存しているゲノムDNAを、DNaseI (Life Techno1ogies)を用いて消化後、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara bio, Shiga, Japan)を用いて一本鎖cDNAを合成した。定量RT−PCRは、SYBR Premix EX TaqII(Takara bio, Shiga, Japan)を用いて行い、データはβ−アクチンを標準化コントロールとしてddCt法に従って算出した。
培養細胞を10%ホルマリン溶液(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)で10分間固定後、0.2% Triton-X100(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)で15分間浸透化処理した。5%スキムミルク溶液(BD Biosciences)でブロッキング後、一次抗体を4℃で一晩反応させた。PBSで洗浄後、蛍光標識された二次抗体を室温で2時間反応させ、Hoechst33342(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, US)で対比染色した。
実施例4(2)の肝類洞内皮前駆細胞の分離、実施例5(1)の肝類洞内皮細胞の分離、及び実施例6の肝星前駆細胞の分離を以下の通り行った。
0.05%のトリプシン/0.5mMのEDTA、若しくはAccumax(Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いて解離し、0.03%BSA−PBSで懸濁した。調製した細胞を、FcR block reagent(Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany)で20分間ブロッキングした後、各細胞に特異的な抗原を認識する一次抗体で、30分間標識した。細胞を洗浄後、必要に応じて抗FITCマイクロビーズ(Miltenyi Biotech)、抗PEマイクロビーズ(Miltenyi Biotech)で20分間標識し、autoMACS Pro セパレーター(Mi1tenyi Biotech)で目的の細胞を濃縮した。その後、MoF1o XDP セルソーター(Beckman Coulter, Inc)を用いて分離した。
(1)ヒト肝前駆細胞の調製
ヒトiPS細胞(454E2株、RIKEN Cell Bank)を、非特許文献2(Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51(1), 297-305)に記載された以下の手順により、ヒト肝前駆細胞へと分化誘導した。B27及び100ng/mlのアクチビンAを含むRPMI培地中で、ヒトiPS細胞を5%CO2、周囲酸素環境下で5日間培養した。その後、20ng/mlのBMP4及び10ng/mlのFGF2を添加したRPMI/B27培地中で4%O2/5%CO2環境下で5日間培養した。その後、20ng/mlの肝細胞増殖因子(HGF)を添加したRPMI/B27培地中で10日間以上4%O2/5%CO2環境下で培養することでヒト肝前駆細胞を含む細胞群を得た。当該細胞群から、MoFlo XDP セルソーター (Beckman Coulter)を用いて、CPM陽性細胞であるヒト肝前駆細胞と、CPM陰性の細胞とを分離した。当該分離は、autoMACS Pro セパレーター (Miltenyi Biotech)を用いても同様に行うことができた。
10% FBS(JRH Biosciences)、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、ITS、N−2サプリメント、MEM非必須アミノ酸溶液、L−グルタミン(Life Technologies)、アスコルビン酸 (1 mM)、ニコチンアミド (10 mM)、N−アセチル−システイン (0.2 mM) (Sigma-Aldrich)、デキサメタゾン(1x10-7M)、HGF (20 ng/ml)、EGF (10 ng/ml) (PeproTech)、 Y−27632(5 μM) (Wako) 及びA83−01(2.5 μM) (Tocris) を添加したDMEM−F12(Sigma-Aldrich)中で、マイトマイシンCで処理したMEFフィーダー細胞(2.0x104細胞/cm2)上にて、上記で分取されたCPM陽性細胞を培養した。
(1)ヒト肝前駆細胞からヒト肝細胞への分化誘導
非特許文献2に記載された通りに、実施例1(2)で増殖させてコンフルエントに達したCPM陽性細胞を、HCM Single Quots (EGFを除く)及びオンコスタチンM (20 ng/ml) (PeproTech)を添加した肝細胞基本培地(Hepatocyte Basal Medium) (Lonza) 中で5〜10日間、インキュベートすることで、ヒト肝細胞への分化誘導を行った。
分化誘導前の肝前駆細胞と分化誘導して得られた肝細胞について、明視野顕微鏡による観察、免疫細胞化学染色によるアルブミンの染色、及びPAS染色によるグリコーゲンの蓄積を観察した結果を示す(図6)。PAS染色は、コールドシッフ試薬(Cold Schiff's Reagent)(Wako Pure Chemical Industires, Ltd.)を用いて、標準的なプロトコルにしたがって行われた。分化誘導前の肝前駆細胞と比較して分化誘導して得られた肝細胞において、アルブミンの高い産生及びグリコーゲンの高い蓄積が確認された。
上記(1)で得られたヒト肝細胞と、従来法である非特許文献2(Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51 (1), 297-305)に記載された手順でヒトiPS細胞から誘導されたヒト肝細胞(すなわち、CPM陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞)とにおけるCYP450のmRNA発現を定量RT−PCRを用いて分析した。結果を図7及び8に示す。上記(1)で得られたヒト肝細胞は、従来法で調製されたヒト肝細胞と比較して、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C18、CYP2D6、CYP1A2及びCYP2C8の高い発現を示した。また、リファンピシンを添加することで、CYP3A4の発現がさらに増大することが分かった。本発明の方法で調製されたヒト肝細胞は、その特性において、CPM陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞と区別される。
(1)ヒト肝前駆細胞からヒト胆管上皮細胞への分化誘導
Tanimizu et al., Mol Biol Cell, 2007, 18(4), 1472-1479、及びYanagida et al., PloS ONE 8, e67541に記載された三次元ゲル培養法を少し修正して、ヒト胆管上皮細胞への分化誘導を行った。実施例1(2)に従って、CPM陽性細胞を増殖させた後、細胞を回収し、増殖因子削減マトリゲル(growth factor reduced Matrigel)(Corning)とコラーゲンタイプI(Nitta Gelatin)との2:3混合物からなるゲル中で1x105細胞/50μlの密度で再懸濁した。細胞懸濁液をその後24ウェルプレート(Corning)へ添加し、固体化するまで37℃で2時間インキュベートした。その後、細胞をR−スポンジン−1(40 ng/ml)及びWNT−3a(40 ng/ml) (PeproTech)の存在下、7日間培養することで、ヒト胆管上皮細胞へと分化誘導した。ヒト胆管上皮細胞は、シストを形成した。
得られたヒト胆管上皮細胞において、肝前駆細胞マーカーであるAFPの発現量は低下した(図9)。一方、胆管上皮細胞特異的マーカーの発現が確認された(図10)。CPM陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞と、上記(1)で調製されたヒト胆管上皮細胞とにおける胆管上皮細胞マーカーのmRNA発現を定量RT−PCRを用いて分析した(図10)。上記(1)で得られたヒト胆管上皮細胞は、CPM陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞と比較して、胆管上皮細胞マーカーであるCK7、CFTR、AQP1、TGR5、SOX9及びHNF6の高い発現を示した。
ヒト肝類洞内皮前駆細胞の調製
(1)ヒトiPS細胞からヒト中胚葉細胞への分化誘導
ヒトiPS細胞(454E2株、RIKEN Cell Bank)を、マイトマイシンC処理したマウス胎仔線維芽細胞 (MEF:Mouse Embryo Fibroblast、)をフィーダーとして培養した。なお、MEFは、胎仔マウス(ICRマウス、日本エスエルシー株式会社)から調製した。分化誘導開始前に、ヒトiPS細胞をゼラチンコートディッシュに再播種し、30分間インキュベートすることでMEFを取り除いた。ヒトiPS細胞から中胚葉へ分化誘導するため、Ultra-Low Attachment plate (Corning) 上で胚葉体形成培養を行った。胚葉体形成培養を、Stempro-34 SFM (Life Technologies) を基本培地として、誘導開始0日から1日に10μMのY27632(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)、2ng/mlのBMP4(Life Technologies)を加え、誘導開始1日〜4日に5ng/mlのアクチビンA(Pepro Tech, New Jersey, US)、5ng/mlのbFGF(Life Technologies社)、30ng/mlのBMP4(Life Technologies社)を加え、誘導開始4日から6日に10ng/mlのVEGF(Pepro Tech)、5.4μMのSB431542(Tocris, Bristol, UK)、0.5μMのドルソモルフィン(Tocris)を加えることで行った。6日間培養して中胚葉細胞へと分化誘導した。
(1)で得られた胚葉体をあらかじめゼラチンコートしたプレートに移し、EGM−2(Lonza, Basel, Switzerland)に50ng/m1のVEGFを添加した内皮細胞培地で7日間培養した。CD31陽性、FLK1陽性及びCD34陽性のヒト肝類洞内皮前駆細胞を、MoFlo XDP cell sorter (Beckman Coulter, Inc)で分離した。すべての分化誘導を5%CO2、4%O2環境下で行った。
ヒトiPS細胞、上記(1)で誘導されたヒト中胚葉細胞、上記(2)で誘導されたヒト肝類洞内皮前駆細胞(細胞分離前)における、マーカー分子の遺伝子発現量を定量RT−PCRにより分析した。結果を図11に示す。未分化マーカーであるOCT4は、iPS細胞において高く発現し、分化の進行とともに減少した。中胚葉マーカーであるMESP1は、中胚葉細胞の分化ステージで最も高い発現を示した。CD31やVE−カドヘリン(VE−Cad)といった血管内皮細胞マーカー分子は、肝類洞内皮前駆細胞のステージで高発現した。さらに、STAB2やLYVE1といった肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子も肝類洞内皮前駆細胞のステージで高発現した(図11)。以上の結果から、誘導された細胞中には肝類洞内皮前駆細胞の特徴を有する細胞が含まれることが示唆された。
ヒト中胚葉から分化誘導されたヒト肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞群(pre-sorted)、pre-sorted群から分離されたFLK1+CD31+CD34+細胞(CD34+)、FLK1+CD31+CD34-細胞(CD34-)における、ヒト肝類洞内皮前駆細胞のマーカー分子(STAB2及びLYVE1)の発現量を定量RT−PCRにより分析した。結果を図13に示す。CD34+細胞群は、CD34-細胞群と比較して、STAB2やLYVE1といった肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子を高発現していた。当該結果から、FLK1+CD31+CD34+の表現型の組み合わせが、ヒト肝類洞内皮前駆細胞を分取するためのマーカーとして利用できることが明らかとなった。
上記実施例4(2)で分取したFLK1+CD31+CD34+細胞を、フィブロネクチンコートしたプレートに15,000 細胞/cm2で播種し、内皮細胞培地で培養した。FLK1+CD31+CD34+細胞は、内皮細胞様の形態を維持し(図14)、高い増殖能を有しており(図15上)、数回の継代培養も可能であった(図15下)。なお細胞数は、0.05%トリプシン/0.5mM EDTAを用いて細胞を解離し、血球計算盤を用いて算出した。また、定量RT−PCR解析により、この細胞は5継代後も肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子の発現を維持した(図16)。さらに、長期凍結保存が可能であり、30日間の凍結保存後もCD31を均一に発現した(図17)。
(1)ヒト肝類洞内皮細胞の調製
上記実施例4(2)で分取されたヒト肝類洞内皮前駆細胞を、20,000細胞/cm2の密度でフィブロネクチンコートしたプレートに再播種し、EGM−2(Lonza, Basel, Switzerland)に50ng/m1のVEGF、TGF−β阻害剤である1.5μMのA83−01(Tocris)を添加したヒト肝類洞内皮細胞誘導培地で14日間培養することで、ヒト肝類洞内皮細胞を含む細胞画分を得た。すべての分化誘導を5%CO2、4%O2環境下で行った。高効率に成熟した肝類洞内皮細胞を誘導するため、当該細胞画分からその後、MoFlo XDP セルソーター(Beckman Coulter, Inc)を用いて、CD31陽性、FcRγII陽性細胞を分離した。
上記実施例4(2)で分取されたヒト肝類洞内皮前駆細胞と上記実施例5(1)で調製されたヒト肝類洞内皮細胞(分取前)における、肝類洞内皮細胞マーカーの発現量を定量RT−PCRにより分析した。結果を図18に示す。TGF−β阻害剤の添加により、肝類洞内皮細胞マーカーであるSTAB2、FcRγIIB及びF8の発現が細胞中で促進された。
実施例5(1)で分取されたCD31陽性FcRγII陽性の肝類洞内皮細胞は、内皮細胞様形態を呈した(図20)。また、CD31陽性FcRγII陽性細胞は、CD31陽性FcRγII陰性細胞やHUVECと比較して、STAB2、FcRγIIB、血液凝固第VIII因子(ファクターVIII)を高発現していた(図21)。
CD31陽性FcRγII陽性の肝類洞内皮細胞を含む培養培地に 5μg/mlのDiI−Ac−LDL(AlfaAesar, Massachusetts, US)もしくは 25μg/mlのフルオレセインアミン標識されたヒアルロン酸ナトリウム(FAHA−L1)(PG Research, Tokyo, Japan)を添加し、30℃で4時間インキュベートした。4時間後、PBSで洗浄し、Hoechst33342で対比染色した。結果を図22及び23に示す。肝類洞内皮細胞におけるアセチル化LDLの取り込み能はHUVECと比べて同等程度であったのに対し、STAB2を介して行われるヒアルロン酸の取り込みは、肝類洞内皮細胞のみで確認された。
免疫細胞化学染色およびフローサイトメトリー解析(図24及び25)により、ファクターVIIIのタンパク質レベルでの発現が認められた。
ヒト肝星前駆細胞の調製
実施例4(1)に記載された手順と同様にして、ヒトiPS細胞からヒト中胚葉細胞を分化誘導した。当該中胚葉細胞集団に含まれるヒト肝星前駆細胞を、ALCAM陽性を指標として、MoFlo XDP セルソーター(Beckman Coulter, Inc)でALCAM陽性細胞(ヒト肝星前駆細胞)とALCAM陰性細胞に分離した。ヒトiPS細胞由来中胚葉細胞の分離前、ALCAM陽性細胞及びALCAM陰性細胞における、肝星前駆細胞マーカー分子の発現量を定量RT−PCRにより分析した。結果を図27に示す。ALCAM陽性細胞はALCAM陰性細胞と比較して、HGF、CYGB、NGFR、デスミン(DES)といった肝星前駆細胞特異的マーカー分子を高発現していた。
(1)ヒト肝星細胞の調製
セルマトリックス TypeI−C(Nitta Gelatin, Osaka, Japan)をコートしたプレートに、実施例6で調製されたヒト肝星前駆細胞を15,000細胞/cm2の密度で播種し、MSCGM(Lonza)に、Rock阻害剤である10μMのY27632を添加した肝星細胞誘導培地で5日間培養することで分化誘導し、ヒト肝星細胞を得た。分化誘導は5%CO2、20%O2の環境下で行った。
上記実施例7(1)で調製されたヒトiPS細胞由来肝星細胞における肝星細胞マーカー分子の発現量を定量RT−PCRにより分析した。結果を図28に示す。ヒトiPS細胞由来肝星細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)と比較して肝星細胞に特異的に発現するHGF、NGFR、CYGB、LRATを高発現した。
肝星細胞は、細胞内にピタミンAを取り込み、貯蔵することが知られている。そこで、ビタミンAを培地中に添加し、取り込み能を解析した。ヒトiPS細胞由来肝星細胞の培養系にビタミン A (レチノイド(Sigma-Aldrich Corporation,St. Louis,US))を10μMで添加した。0.05%トリプシン/0.5mM EDTAを用いて細胞を解離し、CantoII (BD Biosciences)用い、フローサイトメトリーによって細胞内のビタミンAの自家蛍光を検出した。hMSCをコントロールとして用いた。ヒトiPS細胞由来肝星細胞のみにおいて自家蛍光が検出され、細胞内にピタミンAを取り込んでいることが確認された(図29)。
ヒト肝細胞組織モデルの調製(ヒト肝非実質細胞とヒト肝前駆細胞との共培養)
実施例5で調製したヒト肝類洞内皮細胞、及び実施例7で調製したヒト肝星細胞を、セルマトリックスTypeI−C(Nitta Ge1atin, Osaka, Japan)でコートしたプレートにコンフルエントになるように播種し、フィーダーを作製した。翌日フィーダー細胞をマイトマイシンC処理した。フィーダー細胞のコントロールとして、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC,Lonza社から入手)とヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC,Lonza社から入手)を用いた。これらのフィーダー細胞に実施例1で調製した肝前駆細胞を播種し、10日間共培養した。
ヒト肝細胞組織モデルの調製(マウス肝非実質細胞とヒト肝前駆細胞との共培養)
(1)マウス胎仔肝の消化・溶血処理
胎齢14.5日のマウス胎仔(C57BL/6マウス、日本エスエルシー株式会社)から、小型バサミとピンセットを用いて外科的に肝臓を摘出した。摘出した肝組織を小型バサミにより細切した。肝組織を10〜20 mlのLPM(Thermo Fisher Scientific) に移し、37℃の温浴にて5分間静置した。その後、Liver Digest Medium(Thermo Fisher Scientific)に液交換し、37℃の温浴にて5分間攪拌した。その後、ディスポーザブルピペットを用いてピペッティングにより機械的に肝組織を消化した。1800 rpm、3分間の遠心分離を行い上清除去後、10% FBSを添加したDMEMで懸濁した。70 μmセルストレイナーに細胞懸濁液を通し、1800 rpm、3分間の遠心分離を行い上清除去後、得られた細胞を5 mlの塩化アンモニウム溶液に懸濁し、4℃、6分間反応させ、溶血処理を行った。10% FBSを添加したDMEMを添加し、70 μmセルストレイナーに通し、1800 rpm、3分間遠心分離を行い上清除去後、細胞を回収した。
溶血処理を行った細胞を1% BSA/PBSで懸濁し、マウスFcR(抗体(1:100希釈)を添加し4℃、15分間ブロッキングを行った。次に一次抗体(1:100希釈)を 30分間反応させた。一次抗体はビオチン標識あるいはFITC標識されたStab2抗体、ビオチン標識されたMsln抗体、APC標識されたp75NTR抗体を用いた。一次抗体を1% BSA/PBSで除去後、同様に二次抗体(1:100希釈)を20分間反応させた。二次抗体はSA-APC抗体あるいはSA-PE抗体を用いた。二次抗体を1% BSA/PBS で除去後、MACS Running Buffer(Miltenyi Biotec K.K.)で20倍に希釈された磁気ビーズ(Miltenyi Biotec K.K.)を10分間反応させた。その後auto MACS (Miltenyi Biotec K.K.)を用いて磁気細胞分離を行った。単細胞分離を行う場合はさらにMoflo(Beckman Coulter)を用いて分離を行った。
分離したマウス胎仔肝非実質細胞は、コラーゲンTypeIC(Nitta Gelatin)及びコラーゲンTypeIA(Nitta Gelatin)上のプレートに2% B27(Life Technology)、50 ng/ml rhVEGF(Peprotech)、10 μg/ml Y27632(Wako)、 0.5 μM A83-01(Tocris) を添加したEGM+MSC(1:1、LONZA)にて 37℃、5% CO2 、湿度 95% 条件下にて培養を行った。
コラーゲンTypeIC(Nitta Gelatin)及びコラーゲンTypeIA(Nitta Gelatin)上のプレートに播種した。培地は50 ng/ml rhVEGF(Peprotech)、10 μg/ml Y27632(Wako)、0.5μM A83-01(Tocris)が添加されたEGM(LONZA)を用いた。37℃、5% CO2 、湿度95% 条件下にて培養を行った。
コラーゲンTypeIC(Nitta Gelatin)及びコラーゲンTypeIA(Nitta Gelatin)上のプレートに播種した。培地は2% B27(Life Technology)、50 ng/ml rhVEGF(Peprotech)、10 μg/ml Y27632(Wako)、 0.5 μM A83-01(Tocris) を添加したEGM+MSC(1:1、LONZA)を用いた。37℃、5% CO2 、湿度95% 条件下にて培養を行った。
コラーゲンTypeIV(Nitta Gelatin)及びコラーゲンTypeIA(Nitta Gelatin)上のプレートに播種した。培地は10% FBS、50 nmol/L mercaptoethanol、10 ng/ml oncostatin M (0SM)(Peprotech)、10 ng/ml bFGF(Peprotech)が添加されたαMEMを用いた。37℃、5% CO2、湿度95% 条件下にて培養を行った。培地交換は1日おきに行った。
コラーゲン1ゲル(Nitta Gelatin)を48-wellプレート1 wellあたり200 μl添加し30分間、インキュベーター内でゲル化させた。当該ゲルに上記実施例9(3)のマウス由来非実質細胞を播種し、培養後、これをフィーダー細胞として、実施例1で調製された肝前駆細胞と共に、肝前駆細胞が維持・増殖可能な維持培地及び肝前駆細胞を成熟肝細胞へ誘導する分化培地中で共培養した。なお、維持培地として、実施例1(2)において肝前駆細胞の培養に用いたDMEM−F12培地を使用した。分化培地として、20 ng/ml rhOSM(Peprotech)、1% ITS premix(Life Technology)、0.5 μM デキサメタゾン、0.5 μM A83-01(Tocris)を添加した HCM SingleQuots Kit(LONZA、rhEGFのみ非添加)を用いた。また、肝前駆細胞を上記維持培地及び分化培地中で単独培養した。
96-well-EZsphere(IWAKI)に5×104 cells/wellの密度で培養した。上記実施例9(4)〜(6)の肝類洞内皮細胞(3×104 cells/well)、肝星細胞(3×104 cells/well)又は肝中皮細胞(3×103 cells/well)を、上記実施例1のヒトiPS細胞由来肝前駆細胞と同時に播種した。上記の分化培地を使用し、培養二日目に半量培地交換した。37℃、5% CO2、湿度95%条件下にて培養を行った。三次元培養した場合において、スフェロイド形成が認められた。マーカーの発現解析結果を図35に示す。HNF4AとCEBPAの発現量は、肝星細胞と共培養を行った際に特に上昇することが示された。また、アルブミン発現量における平面培養と三次元培養との違いを示す結果を図36に示す。平面培養4日目、三次元培養2日目、三次元培養4日目において比較すると、三次元培養の条件下において、効率的に成熟化が促進されたことが示された。
ヒトB型肝炎疾患モデルの肝細胞の調製
実施例1(1)で調製されたヒト肝前駆細胞及び実施例2(2)で調製されたヒト肝細胞にHBVを感染させた。HBV感染後16日目で培養上清および細胞を回収した。
病原体の感染に必要な物質の産生の分析
実施例2(1)で調製されたヒト肝細胞(以下で「CPM+-Hep」とも呼ぶ)と、実施例1(1)でiPS細胞から肝前駆細胞へと分化誘導後、CPM陽性を指標として肝前駆細胞を分取する工程を経ずに、実施例2(1)と同様の手順で分化誘導をして調製された肝細胞(以下で「iPSCs-Hep」とも呼ぶ)とにおいて、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス及びマラリア原虫が細胞に感染するために必要とされる物質が産生されているか否かを定量RT−PCRを用いて分析した。結果を図40に示す。
マウス胎仔肝細胞の分析(マウス肝前駆細胞)
胎齢 12.5 日マウス胎仔(C57BL/6マウス)の肝臓を回収した。当該肝臓を細断し、 Liver Digestion Medium (Life Technologies, California, US)で 15分間消化した。消化した胎仔マウス肝臓細胞を、 40μmセルストレイナー (BD bioscience, New Jersey, US)に通し、単一細胞懸濁液を得た。この細胞をFcブロック試薬でブロッキングし、PE標識抗CPM抗体及びFITC標識抗DLK1抗体とインキュベートした。PE及びFITC標識抗アイソタイプコントロールをネガティブコントロールとして用いた。CPM陽性(CPM+)及びCPM陰性(CPM−)細胞をMoFlo XDP セルソーター(Beckman Coulter, Inc, California, US)で単離した。
マウス胎仔肝細胞の分析(マウス肝類洞内皮前駆細胞)
胎齢12.5日マウス胎仔(C57BL/6マウス)の肝臓を回収した。当該肝臓を細断し、Liver Digestion Medium (Life Technologies, California, US)で 10分間消化した。消化した胎仔マウス肝臓細胞を溶血後、 70μmセルストレイナー (BD bioscience, New Jersey, US)に通した。この細胞をFcRブロック試薬で20分間ブロッキングした後、FITC標識抗CD31抗体 (BD Biosciences)、PE標識抗F1k1抗体 (eBioscience, SanDiego, USA)、ビオチン標識抗CD34抗体(eBioscience)、BV395標識抗CD45抗体(BD bioscience)で30分間標識した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジンAPC (BD Biosciences) と抗FITCマイクロビーズ仰(Miltenyi Biotech)で 20分間標識した。CD31+細胞をautoMACS Pro セパレーター(Miltenyi Biotech)で濃縮後、MoFlo XDP セルソーター(Beckman Coulter, Inc, California, US)を用いてCD45-CD31+F1k1+CD34+/-細胞を単離した。
Claims (3)
- Rock阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法。
- 前記肝星前駆細胞が、ALCAM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する肝星前駆細胞であって、肝星前駆細胞を含む細胞画分からALCAM陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む方法によって調製され得る肝星前駆細胞である、請求項1に記載の方法。
- 肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法であって、前記肝星前駆細胞が、ALCAM陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する肝星前駆細胞であって、肝星前駆細胞を含む細胞画分からALCAM陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む方法によって調製され得る肝星前駆細胞である方法。
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