CN114144514A - 产生肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了从诱导多能干细胞产生肝细胞的方法。本文进一步提供了使用肝细胞治疗肝病的方法。

Description

产生肝细胞的方法
本申请要求2019年5月9日提交的美国临时专利申请号62/845,623和2020年5月8日提交的美国临时专利申请号63/022,257的权益，两者均通过引用整体并入本文。
背景
1.领域
本发明一般涉及分子生物学和医学领域。更具体而言，它涉及将诱导多能干细胞定向分化为肝细胞的方法。
2.相关技术说明
在哺乳动物中，肝脏对各种各样的功能起着关键作用，包括蛋白质合成、代谢、解毒和排泄。在分离的肝细胞中再现这些功能中的所有功能或大部分功能是一项重大挑战。有活力的、有功能的肝细胞的可用性对于药理学和毒理学评价、创建用于疾病的病理生理学分析的细胞模型、产生生物人工肝支持和肝脏再生疗法非常有益。原位肝移植几乎能够替代所有肝功能，并拯救急慢性肝功能衰竭患者，以及单基因肝病，如1型克里格勒－纳贾尔综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、原发性高草酸尿症等。
因为肝移植是一项艰巨且昂贵的手术，并且依赖于肝脏的即时可用性，所以正在探索肝细胞移植作为针对这些病症中的许多病症的器官移植的微创替代方案。然而，供体肝脏(其通常被优先用于器官移植)的严重短缺极大地限制了用于分离原代肝细胞的可用肝脏的可用性。由于原代肝细胞在培养中的功能迅速恶化，并且冷冻保存后它们的生存能力极易变化，这一事实使问题更加复杂。因此，非常需要人类肝细胞的替代性可再生资源。组织干细胞(例如间充质干细胞和造血干细胞、肝祖细胞和多能干细胞)正在被评估为人类肝细胞的来源。对用于将诱导多能干细胞(iPSC)分化为肝细胞的方法存在未得到满足的需求。
概述
在第一个实施方案中，本公开内容提供了产生肝细胞的方法，包括：(a)在GSK-3抑制剂存在下培养多能干细胞(PSC)以提供预调理的PSC；(b)将预调理的PSC分化为定形内胚层(DE)细胞；(c)培养DE细胞以诱导成肝细胞的形成；以及(d)将成肝细胞分化为肝细胞。在某些方面，PSC是诱导多能干细胞(iPSC)。在一些方面，该方法包括：(a)在GSK-3抑制剂存在下培养iPSC以提供预调理的iPSC；(b)将预调理的iPSC分化为定形内胚层(DE)细胞；(c)培养DE细胞以诱导成肝细胞的形成；以及(d)将成肝细胞分化为肝细胞。在一些方面，肝细胞是人的肝细胞。
在某些方面，将iPSC预调理1-3天，例如1、2或3天。在一些方面，GSK3抑制剂是CHIR99021、BIO、SB216763、CHIR98014、TWS119、SB415286和Tideglusib。在一些方面，GSK3抑制剂是CHIR99021。在特定方面，CHIR99021的浓度为1-5μM，例如1、2、3、4或5μM。在某些方面，iPSC在基本不含或不含抗坏血酸的培养基中进行预调理。
在一些方面，步骤(a)-(d)中的一个或多个步骤在无异种蛋白条件、无饲养层条件或无条件培养基条件下进行。在特定方面，步骤(a)-(d)中的每个步骤在无异种蛋白条件、无饲养层条件或无条件培养基条件下进行。在一些方面，无异种蛋白条件包括使用成分确定的培养基。
在一些方面，分化为DE细胞包括在包含激活蛋白A的第一内胚层诱导培养基(EIM)、包含BMP4、VEGF和bFGF的第二EIM以及包含VEGF和DMSO的第三EIM中依次培养iPSC。在一些方面，分化为DE细胞持续8-10天，例如8、9或10天。在某些方面，DE细胞对CXCR4、CD117、FOXA1、FOXA2、EOMES和/或HNF4α呈阳性。
在某些方面，步骤(c)包括在包含HGF、BMP4、FGF10、FGF2、VEGF、EGF、地塞米松和/或DMSO的肝细胞诱导培养基(HIM)中培养DE细胞。在特定方面，步骤(c)包括在包含BMP4、HGF和FGF10的HIM中培养DE细胞。在一些方面，步骤(c)包括在包含HGF、BMP4、FGF10、FGF2、VEGF、EGF、地塞米松和DMSO的HIM中培养DE细胞。在特定方面，HGF的浓度为20-30ng/mL，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/mL。在一些方面，诱导持续5-7天，例如5、6或7天。
在一些方面，该方法包括在诱导成肝细胞后形成聚集体。在特定方面，步骤(a)和(b)基本上不含聚集体。
在某些方面，在细胞外基质上培养细胞。在某些方面，细胞外基质是
Figure BDA0003343940070000031
胶原蛋白I或层粘连蛋白。在具体方面，细胞外基质是
Figure BDA0003343940070000032
在某些方面，细胞外基质是从鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤纯化的基底膜提取物(BME)。在某些方面，细胞外基质是GELTREXTM。
在一些方面，在步骤(d)之前消化成肝细胞。在某些方面，分化包括在包含bFGF、HGF、抑癌蛋白M和DMSO的肝细胞分化培养基(HDM)中培养成肝细胞。在特定方面，HDM还包含GSK3抑制剂。在一些方面，HDM基本上不含VEGF和EGF。在一些方面，步骤(d)的分化持续8-10天，例如8、9或10天。
在特定方面，在低氧条件下进行步骤(a)-(c)。在一些方面，步骤(d)包括在低氧条件下培养细胞进行第一分化期和在常氧条件下培养细胞进行第二分化期。在具体方面，第一分化期和第二分化期各自为3-5天，例如3天、4天或5天。
在另外的方面，该方法还包括在包含地塞米松和抑癌蛋白M的成熟培养基中培养肝细胞。在一些方面，在成熟过程中在胶原蛋白I上培养肝细胞。在其他方面，在
Figure BDA0003343940070000033
胶原蛋白I、层粘连蛋白、从鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤纯化的基底膜提取物(BME)或GELTREXTM上培养肝细胞。
在一些方面，成熟培养基还包含SRC激酶抑制剂。在某些方面，SRC激酶抑制剂是博舒替尼、达沙替尼、A419259、阿特波龙、AZM475271、AZM475271或PP1。在特定方面，成熟培养基还包含EPO。在一些方面，成熟培养基还包含γ-分泌酶抑制剂。例如，γ-分泌酶抑制剂是DAPT。在某些方面，成熟培养基还包含TGFβ抑制剂。在一些方面，TGFβ抑制剂是SB431542、SB525334、SB431542-505124、Lefty、A 83-01、D 4476、GW 788388、LY 364847、R 268712或RepSox。例如，TGFβ抑制剂是SB431542。在特定方面，成熟培养基还包含MEK抑制剂，例如PD0325901。在一些方面，MEK抑制剂是PD0325901、GSK1120212、MEK162、RDEA119和AZD6244。在某些方面，成熟培养基还包含EPO、IGF1、IGF2和/或TGFα。在一些方面，成熟培养基还包含抗细胞凋亡化合物XMU-MP1。在某些方面，成熟培养基还包含FH1、FPH1和/或甲氧胺(例如，15μM FH1、15FPH1和1μM甲氧胺)。
在另外的方面，该方法还包括选择CD133阳性细胞。在一些方面，至少70％、80％或90％的成熟肝细胞对α抗胰蛋白酶(AAT)呈阳性。在某些方面，至少40％、50％或60％的成熟肝细胞对白蛋白呈阳性。在一些方面，至少70％、80％或90％的成熟肝细胞对白蛋白呈阳性。
在一些方面，该方法还包括在间充质干细胞(MSC)或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基存在下共培养成熟肝细胞。在一些方面，该方法进一步包括在巨噬细胞存在下将成熟肝细胞与一种或多种Src激酶抑制剂共培养。在一些方面，该方法进一步包括在内皮细胞存在下将成熟肝细胞与一种或多种Src激酶抑制剂共培养。在一些方面，该方法进一步包括在MSC、巨噬细胞和内皮细胞存在下将成熟肝细胞与一种或多种Src激酶抑制剂共培养以产生肝脏类器官。
在另一个方面，该方法还包括按照聚集体的方式冷冻保存成熟肝细胞。
在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)对AAT呈阳性和/或至少80％对白蛋白呈阳性的肝细胞。在一些方面，该组合物不含异种蛋白、不含饲养层、不含条件培养基并且是成分确定的。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有肝病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的实施方案产生的肝细胞。在一些方面，肝病是急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害。在某些方面，施用包括肝细胞移植。
本文还提供了用于预测毒理学的平台，包括通过本发明的实施方案的方法产生的肝细胞。
本文还提供了组合物，其包含通过本发明的实施方案的方法产生的肝细胞。本文还提供了包含通过本发明的实施方案的方法产生的肝细胞的组合物，其用于治疗受试者的肝病。其他实施方案还包括本发明的肝细胞的组合物，其用于治疗受试者的肝病。另外的实施方案包括组合物，其用于肝病建模或药物发现。在一些方面，肝病是非酒精性脂肪性脂肪性肝炎(NASH)。在特定方面，药物发现鉴定NASH、急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害的靶。
另一个实施方案提供了进行基于甲基化的分析以鉴定用于治疗疾病的候选剂的方法，其中该方法包括对本发明的实施方案的组合物进行基于组学的分析。在一些方面，该疾病是NASH、急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害。
另一个实施方案提供了进行高通量筛选以鉴定治疗剂的方法，包括将根据本发明的实施方案的方法衍生的成熟肝细胞的3D聚集体与多种候选剂接触并测量所述成熟肝细胞的功能。在一些方面，与MSC、巨噬细胞、内皮细胞或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基共培养成熟肝细胞的3D聚集体。在其他方面，在没有其他细胞类型的情况下培养成熟肝细胞的3D聚集体。
在又一个实施方案中，提供了包含根据本发明的实施方案衍生的成熟肝细胞的肝病体外模型。在一些方面，与MSC、巨噬细胞、内皮细胞或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基共培养成熟肝细胞。在某些方面，在没有其他细胞类型的情况下培养成熟肝细胞。在特定方面，肝病是急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害或脂肪性肝病。在具体方面，脂肪性肝病是NASH。在一些方面，成熟肝细胞在用脂肪酸处理后经历脂质沉积，例如自发性脂质沉积。在某些方面，脂肪酸是油酸和/或亚油酸。在一些方面，肝病是肝纤维化。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。应当理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的优选方案，但仅以说明的方式给出，因为来自本详细描述的在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图简要说明
下列附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述而得到更好的理解。
图1：描述了iPSC分化为定形内胚层的肝细胞分化过程的初始谱系说明的示意图。
图2：描绘了用于诱导成肝细胞的肝细胞分化的第1阶段的示意图。
图3：描绘了肝细胞分化过程的第2阶段的示意图。
图4：描绘了用于肝细胞成熟的肝细胞分化过程的第3阶段的示意图。
图5：修改的肝细胞分化方案的示意图。将iPSC接种到包被有
Figure BDA0003343940070000061
的板上并扩增2天，接着用CHIR99021预调理2天。将细胞置于第0天(T0)培养基中，然后在第1、2天(T1-T2)中依次更换培养基，然后将细胞置于T3-T6培养基中，直到处理第10天转化为定形内胚层(DE)细胞。在DE诱导结束时，以DE标志物CXCR4和CD117对细胞进行取样。通过将细胞置于第1阶段6天，将细胞引导至成肝细胞阶段。在第1阶段结束时，细胞可以被冷冻保存或进一步转化为肝细胞。向肝细胞分化的第2阶段以三维(3D)或二维(2D)格式进行。收获第1阶段细胞并使其形成聚集体，并将细胞在补充有CHIR99021的第2阶段培养基中维持8天。在第2阶段结束时，以α-1抗胰蛋白酶(AAT)纯度对细胞进行取样，然后冷冻保存或直接铺板到第3阶段肝细胞成熟的包被有胶原蛋白I的板上，从而产生表达AAT和白蛋白(ALB)的细胞。整个分化过程在低氧条件下进行，直到第2阶段中期，此时细胞过渡到常氧状态。
图6：在表1中描述的02E1和01D1非酒精性脂肪性肝炎(NASH)iPSC中，CHIR预调理两天后退出多能性和定形内胚层(DE)诱导：(左)DE标志物CXCR4(y轴)和CD117(x轴)和多能性标志物TRA1-81在DE诱导阶段结束时；(右)多能性基因POU5F1和NANOG在整个过程中的qPCR，每个基因使用两种不同的探针。
图7A-7C：在有或没有CHIR99021预调理的情况下，通过CXCR4/CD117、AAT或TRA181的表达表征肝细胞分化过程中的细胞。在定形内胚层结束和肝细胞分化过程的第2阶段结束时，评估2或4天CHIR99021预调理对正常(54A)和NASH特异性iPSC系(02E1)的影响。在正常和NASH iPSC系中定形内胚层结束时CXCR4/CD117(图7A)和TRA-181(图7B)纯度的定量。在正常和NASH iPSC系中第2阶段肝细胞分化结束时AAT纯度的定量(图7C)。
图8A-8D：在有或没有CHIR99021预调理的分化的第3阶段期间，AAT或白蛋白表达呈阳性的细胞百分比。在肝细胞分化过程的活第3阶段(如图17中所述)结束时评估正常(54A)和NASH特异性iPSC系(02E1)中CHIR预调理的持续时间的影响。在正常iPSC系中第3阶段结束时的AAT(图8A)和白蛋白纯度(图8D)的定量。在正常(54A)和NASH特异性(02E1)iPSC中第3阶段结束时的AAT(图8A、8B)和白蛋白纯度(图8C、8D)的定量。
图9：在肝细胞分化方案期间不同时间过程中和不同持续时间补充CHIR99021对AAT纯度的影响。在肝脏分化过程的第2阶段，CHIR99021处理后AAT阳性肝细胞出现的动力学。在NASH(01D1和02E1)特异性iPSC肝细胞分化的第2阶段补充CHIR99021可提高AAT纯度。FACS图定量了在肝细胞分化的第1阶段结束时(EoS1)和第2阶段的指定点(第2天、第4天、第6天和第8天)的AAT表达培养物的纯度。
图10：在肝细胞分化方案期间不同时间过程中和不同持续时间补充CHIR99021对去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR)纯度的影响。在肝脏分化过程的第2阶段，CHIR99021处理后ASGPR阳性肝细胞出现的动力学。在NASH特异性(01D1和02E1)iPSC定量的肝细胞分化第2阶段补充CHIR99021可提高ASGPR纯度。FACS图描绘了在肝细胞分化的在第1阶段结束时(EoS1)和第2阶段期间的指定点(第2天、第4天、第6天和第8天)收获的ASGPR表达的纯度。
图11A-11E：在肝细胞分化方案中补充CHIR99021对不同细胞系有益。在分化的第2阶段过程中添加CHIR99021可增加细胞增殖和AAT阳性细胞产量，而不会影响AAT纯度。在存在或不存在3μM CHIR99021的情况下分化正常(54A)和2个NASH特异性iPSC系(89F和01D1)。CHIR99021处理的持续时间开始于第1阶段的第4天(S1 D4 CHIR)、第2阶段开始时(S2 D1CHIR)或第2阶段的第3天(S2 D3 CHIR)。定量了AAT的总活细胞数和纯度。捕获了第1阶段结束时成肝细胞转化为第2阶段结束时AAT阳性肝细胞的效率(E0S2)(图11A)、第2阶段结束时的细胞数(EoS2)(图11B)和第2阶段结束时AAT阳性细胞的数量(产量)(图11C)以及NASH(01D1)(图11D)和正常(54A)(图11E)iPSC中出现的肝细胞培养物的形态学外观。
图12：使用在分化过程中指定时间点从细胞中提取的RNA，通过qPCR分析在肝细胞分化过程中分析HNF4a。使用检测来自启动子1(P1)或启动子2(P2)的转录物的Taqman探针。将NASH特异性iPSC(02E1和01D1)衍生肝细胞的HNF4A转录谱与成人肝脏的总RNA(Invitrogen)进行比较。
图13：分化的第3阶段过程中细胞形态的图像。在第2阶段结束时在20倍物镜下拍摄的第7天铺到胶原蛋白I板上后拍摄的NASH特异性(01D1)肝细胞的代表性图像。圈出了双核细胞(肝细胞的关键特征)。
图14：在分化的第3阶段过程中肝细胞的羧基二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA)摄取的图像。在第2阶段结束时在10倍物镜下拍摄的第2阶段结束时铺到胶原蛋白I板上7天后用染料CDFDA染色的NASH特异性(01D1)肝细胞的代表性图像。CDFDA是无色的，但它在肝细胞中的裂解产生绿色荧光代谢物羧基二氯荧光素(CDF)，然后被转运到胆小管中。通过CDF可视化胆小管。
图15：通过流式细胞术评估第3阶段肝细胞，表明白蛋白纯度。在分化的第3阶段过程中在指定点收获NASH特异性(02E1)肝细胞中AAT(上图)和白蛋白(ALB，下图)表达的FACS分析，每个散点图上的阳性细胞百分比(纯度)以红色显示。
图16：白蛋白表达指示成熟。在该过程的成熟阶段(第3阶段)过程中，NASH特异性(02E1和01D1)肝细胞中白蛋白(ALB)纯度的增加。
图17：在肝细胞分化过程的第3阶段使用的肝细胞成熟培养基配方。
图18：第3阶段肝细胞的AAT和白蛋白表达与形态学。来自NASH特异性iPSC系01D1的肝细胞被解冻到包被有胶原蛋白I的平板上，并置于在CHIR99021存在下的第2阶段分化培养基中，并转移到含有SB431542和DAPT的第3阶段肝细胞培养基中，持续8天。在分化的第3阶段结束时收获细胞，并对AAT和白蛋白的存在进行染色。散点图反映了AAT(左上)和白蛋白(左下)的定量，而第3阶段结束时的细胞形态反映在右侧。
图19：在分化的第1阶段冷冻保存后肝细胞的恢复。衍生自NASH特异性iPSC 01D1的肝细胞被解冻到包被有胶原蛋白I的平板上，并置于第2阶段肝细胞分化培养基中8天。将细胞转移到不同配方的第3阶段培养基中。对照培养基含有SB431542和DAPT(对照)的组合(Hep Stage 3B培养基)或成熟化合物与肝细胞功能和分化增强剂FH1和FPH1(FH1/FPH1，各为15μM)、α1-肾上腺素能受体激动剂甲氧胺(M，1μM)或FH1、FPH1和甲氧胺(FH1/FPH1/M)的组合。作为比较，显示了第2阶段结束时的纯度(ES2，空心柱)。在第3阶段肝细胞分化结束时收获细胞并对AAT表达进行染色。
图20A-20F：在分化的第2阶段冷冻保存后肝细胞的恢复。来自NASH特异性iPSC系01D1的肝细胞被解冻到包被有胶原蛋白I的平板上，并置于(图20A-C)含有SB431542和DAPT的第3阶段肝细胞A培养基(培养基组成参见图17)中，或(图20D-F)置于含有5μM Src激酶抑制剂的第3阶段肝细胞E培养基(培养基组成参见图17)中，持续10天。在第3阶段分化结束时收获细胞并对AAT和白蛋白的存在进行染色。散点图反映了第3阶段Hep A培养基中AAT(图20A)和白蛋白(图20B)的定量。散点图反映了第3阶段Hep E培养基中AAT(图20E)和白蛋白(图20F)的定量。第3阶段Hep A培养基(图20A)和第3阶段Hep E培养基(图20D)中第3阶段结束时的细胞形态。
图21A-21B：在肝细胞分化不良的情况下(例如，由于疾病背景)，AAT的替代标志物有助于纯化肝细胞，可能需要进行纯化步骤。由于AAT和ASGPR是细胞内蛋白，因此寻求与AAT共表达的表面蛋白。CD133被鉴定为与AAT部分共表达，因此可能是细胞分离策略的合适候选者。(图21A)流式细胞术图显示CD133和AAT在多个正常(20D、54A和1505)和NASH(24D、42F和45B)iPSC中的共表达(图21B)。
图22：在没有间充质干细胞(MSC)即单独(左，无MSC)的情况下培养或与适应肝细胞培养基的01D1 MSC(右，+MSC)一起培养的NASH特异性01D1肝细胞的第3阶段结束的形态：根据标准方案，在开始共培养之前，将在该过程的第1阶段结束时冷冻保存的肝细胞解冻并培养至第2阶段；SB431542/DAPT(表2)包含在两种条件下的培养基中。
图23：在存在SB431542/DAPT或PP1(Src激酶抑制剂)的情况下成熟的肝细胞的第3阶段结束的形态：将在该过程的第2阶段结束时冷冻保存的来自正常(2.038或54A)或NASH特异性iPSC(02E1)的肝细胞解冻并在成熟培养基中存在10μM SB431542/2μM DAPT(SB/DAPT)或5μM PP1(PP1)的情况下将其培养至肝细胞分化的第3阶段。在10倍放大倍数下捕获解冻后出现的肝细胞的形态。
图24：在存在SB431542/DAPT或PP1(Src激酶抑制剂)的情况下成熟的肝细胞的第3阶段结束的纯度定量：将在分化过程的第2阶段结束时冷冻保存的来自正常(2.038，54A)和NASH特异性iPSC(02E1)的肝细胞解冻并培养至分化过程的第3阶段，定量了在成熟培养基中存在10μM SB431542/2μM DAPT(SB/DAPT)或Src激酶抑制剂PP1(PP1)的情况下AAT和白蛋白的纯度。
图25：第3阶段结束时肝细胞的功能性细胞色素P450(CYP)3A4活性：从明显健康的正常iPSC(2.038)和两个NASH iPSC(01D1和02E1)分化而来的第3阶段结束时肝细胞，在具有肝细胞维持混合补充剂B和媒介物(0.1％DMSO)或50μM利福平(CYP3A4诱导剂)的Williams E培养基中一起培养3天，每天更换培养基。在3天结束时，将细胞解离并分到96孔板中(25,000个细胞/孔，每种条件4-6孔)并使用发光P450-Glo CYP3A4测定系统(Promega)按照制造商的建议进行CYP3A4活性测量。
图26A-26D：通过qPCR分析分化阶段过程中肝脏基因的表达。在指定阶段从明显健康的正常iPSC(2.038)和两个NASH iPSC(01D1和02E1)收集来自肝细胞分化培养物的细胞沉淀。提取RNA并用于qPCR分析以定量编码蛋白(AAT)的基因SERPINA1(图26A)、编码去唾液酸糖蛋白受体1的基因ASGR1(图26B)、ALB(图26C)和CYP3A4(图26D)。
图27：在第3阶段结束时肝细胞中的细胞内脂质积累。将来自明显健康的正常iPSC(2.038)和两个NASH iPSC(01D1和02E1)的第2阶段结束肝细胞接种到包被有胶原蛋白I的96孔板上并维持在第3阶段培养基(表2)中，持续5天，每隔一天更换培养基。然后将细胞用在第3阶段培养基(表2)中稀释的0、100或300μM脂肪酸(FA，油酸和亚油酸的组合)处理24小时，固定，用Biodipy(绿色)染色以观察脂滴并用DAPI(蓝色)染色以观察细胞核。使用共聚焦ImageExpress高容量成像仪(Molecular Devices)在20倍物镜下对细胞进行成像。
图28A-28D：肝脏类器官的发育：尝试了将肝细胞与巨噬细胞、MSC和内皮细胞共培养以模拟肝脏类器官培养。将来自正常(2.038)和NASH特异性iPSC(02E1)的第2阶段结束肝细胞聚集体解离并在具有10μM SB431542+2μM DAPT(SB/DAPT)或5μM PP1(PP1)的第3阶段培养基中重新聚集。细胞自身聚集或与巨噬细胞、MSC和内皮细胞结合(对于2.038(正常))或与巨噬细胞和衍生自02E1(NASH)的MSC结合而发生聚集，这些细胞适应肝细胞第3阶段培养基。对于这两种细胞系，尝试了图28A中概括的由每个单独的细胞类型以及每个组合组成的聚集体。正常(2.038)肝细胞(Hep)、巨噬细胞(MAC)、MSC和内皮细胞(endo)的聚集体以及所有4种细胞类型(Hep/MAC/MSC/Endo)的共培养物的代表性图像描绘于图28B中。NASH特异性02E1肝细胞(Hep)、巨噬细胞(MAC)和MSC的聚集体以及所有3种细胞类型(Hep/MAC/MSC)的共培养物的代表性图像概括于图28C中。所有图像均使用IncuCyte高容量成像仪(EssenBioScience)在4倍物镜下拍摄。共培养聚集体第3阶段结束时白蛋白分泌的定量描述于(图28D)中。将衍生自正常(2.038)和NASH特异性(02E1)iPSC的第2阶段结束肝细胞聚集体解离并在第3阶段培养基(表2)中重新聚集，它们自身聚集(肝细胞)或与衍生自相同的细胞系的巨噬细胞、MSC和内皮细胞结合(共培养)而发生聚集。所得的聚集体在补充有10μMSB431542+2μM DAPT(SB/DAPT)或5μM PP1(PP1)的第3阶段培养基中维持10天，每隔一天更换完整培养基。收集来自最后一次交换(第8-10天)的培养基，并根据制造商的说明使用人白蛋白ELISA测量分泌的白蛋白。
示例性实施方案的描述
在某些实施方案中，本公开内容提供了从诱导多能干细胞(iPSC)产生肝细胞的方法。通常，该方法包括将iPSC分化为内胚层谱系细胞，然后将其诱导形成成肝细胞，然后分化为肝细胞。
具体而言，该方法可包括在GSK3抑制剂存在下培养iPSC，以通过促进细胞退出多能性和改善下游分化来预调理细胞以分化为定形内胚层(DE)细胞。最初，iPSC能够在内胚层诱导培养基中分化为DE细胞。iPSC可在二维培养中进行培养，例如在
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上，然后可以在成肝细胞诱导结束时将DE细胞转移到三维聚集体培养中。在包括诱导成肝细胞和分化为肝细胞的过程的第2阶段过程中，可以在GSK3抑制剂存在下培养细胞。在第3阶段，肝细胞可能在存在TGFβ抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的情况下成熟以改善细胞形态。
通过本方法产生的肝细胞可用于疾病建模、药物发现和再生医学。因此，在优选的实施方案中，本公开内容的方法提供了用于广泛应用的肝细胞，所述应用包括用于开发针对一系列肝病的新治疗的模型系统、建立用于预测毒理学的平台以及创建纤维化、脂肪变性和病毒感染等疾病的体外模型。此外，本文所述的方法能够用于衍生肝细胞，用于肝细胞移植的临床应用，以恢复需要此类疗法的受试者的一定程度的肝功能，所述受试者可能发生了肝功能的急性、慢性或遗传性损伤。
I.定义
如本文在说明书中使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可以表示一个或多个。如本文在权利要求中所用，当与词“包含”结合使用时，词“一个”或“一种”可表示一个或多于一个。
权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如在本文中使用的“另一个”可意味着至少第二个或更多个。
术语“基本上”应理解为方法或组合物仅包括指定的步骤或材料，并且不实质上影响那些方法和组合物的基本和新颖特征的那些步骤或材料。
如在本文中使用的，“基本上不含”特定物质或材料的组合物或培养基含有物质或材料的≤30％、≤20％、≤15％，更优选≤10％，甚至更优选≤5％，或最优选≤1％。
如在本文中使用的术语“大致”或“大约”可用于修改任何定量比较、值、测量或其他表示的内容，这些表示的内容可以允许变化而不导致与其相关的基本功能发生变化。
术语“约”通常是指在使用测量所述值的标准分析技术确定的所述值的标准偏差内。也可以指正或负所述值的5％而使用这些术语。
如在本文中使用的，就指定组分而言，“基本上不含”用于表示没有任何指定组分被有意配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是这样一种组合物，其中用标准分析方法无法检测到任何量的指定组分。
“治疗”(“treatment”或“treating”)包括(1)抑制正在经历或表现出疾病病理学或症状学的受试者或患者的疾病(例如，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善正在经历或表现出疾病病理或症状的受试者或患者的疾病(例如，逆转病理和/或症状)，和/或(3)使正在经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的疾病发生任何可测量的减少。
“预防性治疗”包括：(1)降低或减轻可能有患病风险和/或易患疾病但尚未经历或表现出任何或所有病理或症状的受试者或患者发生疾病的风险，和/或(2)减缓可能有患病风险和/或易患疾病但尚未经历或表现出任何或所有病理或症状的受试者或患者的疾病的病理学或症状学的发作。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者是灵长类动物。人患者的非限制性实例是成人、青少年、婴儿和胎儿。
在说明书和/或权利要求书中使用的术语“有效”是指足以实现期望的、预计的或预期的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的上下文中使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学上有效量”是指当施用于受试者或患者以治疗或预防疾病，其足以影响这种疾病的治疗或预防的量。
如本文中一般使用的，“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的收益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
“诱导多能干细胞(iPSC)”是通过表达或诱导因子组合(在本文中称为重编程因子)的表达来重编程体细胞而产生的细胞。可以使用胎儿、产后、新生儿、青少年或成人的体细胞生成iPSC。在某些实施方案中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。在一些实施方案中，通过表达至少两种重编程因子、至少三种重编程因子或四种重编程因子来重编程体细胞以将体细胞重编程为多能干细胞。
如本文所用，术语“肝细胞”旨在包括表现出成熟肝细胞以及具有如通过形态学、标志物表达以及体外和体内功能测定所确定的肝细胞的所有特征的成熟和全功能肝细胞的一些但不是全部特征的肝细胞样细胞。肝细胞可表达成熟的肝基因表达并且缺乏特定胎儿肝细胞和胚胎内胚层基因的表达。可通过肝功能的酶促测量来表征肝细胞。在特定方面，本发明的干细胞衍生的肝细胞能够具有一系列完整的成熟肝细胞功能，包括以下一项或多项：成熟肝细胞基因表达的分析——基因阵列和qPCR(例如α-1-抗胰蛋白酶、Cyp3a4)；胎儿肝细胞、内脏内胚层和非实质肝细胞基因表达量的定量评估——(例如Afp、Sox7、Ck19、Cd24a)；异生物质和内源性物质(激素和氨)的代谢；白蛋白、凝血因子、补体、转运蛋白、胆汁、脂质和脂蛋白的合成和分泌；葡萄糖(糖原)、脂溶性维生素A、B12、D、E、K、叶酸、铜和铁的储存；通过评估UGT1A1(临床)来确定葡萄糖醛酸化途径的存在和活性；通过葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和PEPCK的存在进行活性糖异生；活性尿素生成——氨解毒和尿素循环基因表达；和/或确定肝细胞是否能够通过门静脉/脾注射在体内重新填充(repopulate)肝脏
术语“细胞外基质蛋白”是指为周围细胞提供结构和生化支持的分子。细胞外基质蛋白可以是重组的，也可以指其片段或肽。实例包括胶原蛋白和硫酸肝素。
“三维(3-D)培养”是指人工创造的环境，其中允许生物细胞在所有三个维度上生长或与其周围环境相互作用。3-D培养可以生长在各种细胞培养容器中，例如生物反应器、细胞可以生长成球体的小胶囊或非贴壁培养板。在特定方面，3-D培养是无支架的。相反，“二维(2-D)”培养是指这样的细胞培养，例如贴壁表面上的单层。
如本文所用，“定形内胚层(DE)”和定形内胚层细胞(DE-细胞)是指表现出例如但不限于定形内胚层细胞典型的蛋白质或基因表达和/或形态学的细胞或包含大量类似于定形内胚层细胞的细胞的组合物。在一些方面，产生的定形内胚层细胞或细胞群表达一种或多种选自EOMES、FOXA1、FOA2、SOX17、CXCR4、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的标志物。
II.产生肝细胞
在某些实施方案中，本公开内容涉及从例如iPSC的多能干细胞产生肝细胞。产生肝细胞的分化过程包括将iPSC分化为DE细胞，然后诱导形成肝母细胞，然后分化为肝细胞。
通常在包被有一种或多种细胞粘附蛋白的培养板上培养例如iPSC的PSC，所述细胞粘附蛋白促进细胞粘附同时保持细胞活力。例如，优选的细胞粘附蛋白包括细胞外基质蛋白，例如玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和/或纤连蛋白，其可用于包被培养表面作为为多能细胞生长提供固体支持物的手段。术语“细胞外基质(ECM)”在本领域中是公认的。ECM成分可包括但不限于以下蛋白质中的一种或多种：纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤维蛋白、分区蛋白(merosin)、锚定蛋白、软骨连接蛋白、连接蛋白、骨唾液蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、依连蛋白、透明质蛋白、粗纤维调节素(undulin)、表皮整联配体蛋白和缰蛋白。其他ECM成分可能包括用于粘附的合成肽(例如，RGD或IKVAV基序)、合成水凝胶(例如，PEG、PLGA等)或天然水凝胶，例如褐藻胶。在示例性方法中，PSC在包被有
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的培养板上生长，例如直到内胚层诱导结束，或在胶原蛋白上生长，例如在第2阶段期间。在一些实施方案中，细胞粘附蛋白是人蛋白质。
将iPSC分化为肝细胞或肝细胞样细胞的一般逐步方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的方法。例如，Chen et al.描述了用激活蛋白A、Wnt3a和HGF培养细胞以进行内胚层诱导的方法；然后在knockout DMEM中培养细胞，然后用抑癌蛋白M和地塞米松成熟(Chen et al.,2012)。在另一种方法中，iPSC在激活蛋白A、BMP4和FGF2存在下分化为DE；在BMP4和FGF2中进一步培养细胞成为特定的肝内胚层；然后在HGF中培养以得到未成熟的肝细胞；然后在OSM中培养以产生成熟的肝细胞(Mallanna and Duncan,2013)。另一种方法包括用激活蛋白A培养iPSC以得到DE，然后在KO血清替代物培养基中培养细胞，然后用ROCK抑制剂培养以形成球体(Ramasamy et al.,2013)。可以用激活蛋白A、FGF和BMP培养iPSC以得到DE，用FGF2和BMP4培养以得到肝祖细胞，用HGF培养以得到未成熟的肝细胞，然后用OSM培养以得到成熟的肝细胞(Cai et al.,2013)。
在一种特定方法中，iPSC可以通过在GSK3抑制剂的存在下培养细胞以通过促进它们从多能性中退出并改善下游分化来预调理细胞以分化成定形内胚层(DE)细胞而被预调理为朝向肝细胞分化。最初，可在内胚层诱导培养基中将iPSC分化为DE细胞。iPSC可在二维培养中进行培养，例如在
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上，然后可在第1阶段结束时将成肝细胞转移到三维聚集体培养中。可在GSK3抑制剂存在下在该过程的第2阶段期间培养细胞，所述第2阶段包括诱导成肝细胞和分化为肝细胞。在第3阶段，肝细胞可在存在TGFβ抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的情况下成熟，以改善细胞形态。或者，肝细胞可在SRC激酶抑制剂和任选的EPO存在下成熟。SRC激酶抑制剂可以是博舒替尼、达沙替尼、A419259、阿特波龙、AZM475271或AZM475271。
A.分化培养基
细胞外基质蛋白可以是天然来源的并且从人或动物组织中纯化，或者，ECM蛋白可以是基因工程改造的重组蛋白或天然合成的。ECM蛋白质可以是完整的蛋白质或呈天然的或工程改造的肽片段的形式。可用于细胞培养基质的ECM蛋白的实例包括层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方案中，基质组合物不含异种蛋白。例如，在用于培养人细胞的无异种蛋白的基质中，可以使用人来源的基质成分，其中可以不包括任何非人动物成分。
在一些方面，基质组合物中的总蛋白质浓度可为约1ng/mL至约1mg/mL。在一些优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在更优选的实施方案中，基质组合物中的总蛋白质浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。
可以用支持每个特定细胞群的生长所必需的营养物来培养细胞。通常，在包括碳源、氮源和维持pH的缓冲液的生长培养基中培养细胞。培养基还可含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、丙酮酸、缓冲剂、pH指示剂和无机盐。示例性生长培养基含有基本必需培养基，例如杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)或ESSENTIAL 8TM(E8TM)培养基，补充有各种营养物，例如非必需氨基酸和维生素，以促进干细胞生长。基本必需培养基的实例包括但不限于最小必需培养基伊格尔(MEM)α培养基、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI-1640培养基、199培养基和F12培养基。此外，最小必需培养基可以补充添加剂，例如马、小牛或胎牛血清。或者，培养基可以是无血清的。在其他情况下，生长培养基可含有“knockout血清替代物”，在本文中称为优化以在培养中生长和维持例如干细胞的未分化细胞的无血清制剂。KNOCKOUTTM血清替代物公开于例如美国专利申请号2002/0076747中，其通过引用并入本文。优选地，在成分完全确定且无饲养层的培养基中培养PSC。
在一些实施方案中，培养基可含有或不含血清的任何替代物。血清的替代物可包括适当含有白蛋白的材料(如富含脂质的白蛋白、白蛋白替代物，例如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或其等价物。例如，可以通过国际公开号WO 98/30679中公开的方法制备血清的替代物。或者，为了更方便，可以使用任何市售可得材料。市售可得材料包括KNOCKOUTTM Serum Replacement(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)和GLUTAMAXTM(Gibco)。
可以适当地定义其他培养条件。例如，培养温度可为约30至40℃，例如至少或约31、32、33、34、35、36、37、38、39℃，但不特别限于此。在一种实施方案中，在37℃培养细胞。CO2浓度可为约1至10％，例如约2至5％，或其中可推导出的任何范围。氧张力可以是至少、高达或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20％，或其中可推导出的任何范围。
a.预调理培养基
PSC，例如iPSC，可以在细胞密度为约15,000-20,000个细胞/cm2的E8培养基中维持约1、2、3或4天，然后在预调理培养基(PCM)中培养细胞大约1、2或3天。示例性的PCM包含GSK3抑制剂，例如CHIR99021，约1-5μM，例如约2、3或4μM，特别是约3μM，以及介于以下之间的所有范围，例如，1-3、1-2、2-4、2-5、2-3、3-4或3-5μM。PCM还可以包含RPMI1640、无血清分化(SFD)培养基(例如，约5-15％，特别是约10％)、glutaMAX(例如，约0.5-5％，特别是约1％)、单硫代甘油(MTG)(例如，约250-750μM，特别是约450μM)和青霉素链霉素(例如，0.5％-5％，特别是约1％)。可以在低氧条件下进行预调理。
b.内胚层诱导培养基
预调理后，然后可以将iPSC在第一内胚层诱导培养基(EIM T0)中培养约1或2天。示例性的EIM T0包括RPMI、SFD培养基(例如，约5-15％，特别是约10％)、glutaMAX(例如，约0.5-5％，特别是约1％)、MTG(例如，约250-750μM，特别是约450μM)、青霉素链霉素(例如，0.5％-5％，特别是约1％)和激活蛋白A(例如，10-50ng/mL，特别是约20ng/mL)。在特定方面，EIM T0基本上不含或不含抗坏血酸。
然后将细胞在第二个EIM(EIM T1-2)中培养约1或2天，特别是约2天。示例性的EIMT1-2包含具有抗坏血酸(例如，25-100μg/mL，特别是约50μg/mL)、BMP4(例如，约1-5ng/mL，特别是约2.5ng/mL)的EIM T0培养基)、bFGF(例如，约1-10ng/mL，特别是约5ng/mL)和VEGF(例如，约10-50ng/mL，特别是约10ng/mL)。
最后，将细胞在第三个EIM(EIM T3-6)中培养约4、5、6、7、8、9或10天以产生DE细胞。EIM T3-6可包含SFD、BMP4(例如，约1-5ng/mL，特别是约2.5ng/mL)、bFGF(例如，约1-10ng/mL，特别是约5ng/mL)、VEGF(例如，约10-50ng/mL，特别是约10ng/mL)和二甲亚砜(DMSO)(例如，约0.1％-1％，特别是约0.5％)。可在低氧条件下进行向DE细胞的分化。可以通过流式细胞术或qPCR就CXCR4和CD117的阳性表达表征DE细胞。
c.成肝细胞诱导培养基(第1阶段)
DE细胞然后通过诱导成肝细胞经历肝细胞分化的第1阶段。DE细胞可以在三维培养物中培养，例如聚集体，或者作为二维培养物以形成成肝细胞。成肝细胞诱导培养基(HIM或第1阶段培养基)可包含SFD、BMP4(例如，约25-75ng/mL，特别是约50ng/mL)、bFGF(例如，约5-20ng/mL，特别是约10ng/mL)、HGF(例如，约10-50ng/mL，特别是约25ng/mL)、VEGF(例如，约10-50ng/mL，特别是约10ng/mL)、二甲亚砜(DMSO)(例如，约0.1％-2％，特别是约1％)和FGF-10(例如，约40-100ng/mL，特别是约60ng/mL)。
d.肝细胞分化培养基(第2阶段)
该过程的第2阶段包括成肝细胞分化为肝细胞。成肝细胞可以被消化成基本上单一的细胞悬浮液并铺下板作为2D培养物，或者细胞悬浮液可用于生成3D聚集体。肝细胞分化的这一步骤可以2D或3D格式进行。肝细胞分化培养基(HDM或第2阶段)可包含SFD、bFGF(例如，约1-20ng/mL，特别是约10ng/mL)、HGF(例如，约50-200ng/mL，特别是约100ng/mL)、抑癌蛋白M(OSM)(例如，约10-30ng/mL，特别是约20ng/mL)、地塞米松(例如，约0.01-1μM，特别是约0.1μM)、DMSO(例如，约0.1％-2％，特别是约1％)以及GSK3抑制剂，例如CHIR99021(例如，约1-5μM，例如约2、3或4μM，特别是约3μM)。HDM可以不含VEGF和EGF。第2阶段过程可以包括在低氧下培养，然后在常氧下培养，例如低氧4天和常氧4天。
e.肝细胞成熟培养基(第3阶段)
最后，肝细胞可在该过程的第3阶段成熟，例如约7-10天。肝细胞成熟培养基(HMM或第3阶段培养基)可包含威廉氏E培养基、B27+维生素A(例如，约1％-5％，特别是约2％)、OSM(例如，约10-30ng/mL，特别是约20ng/mL)、地塞米松(例如，约0.01-1μM，特别是约0.1μM)和青霉素链霉素(例如，0.5％-5％，特别是约1％)。HMM还可包含TGFβ抑制剂和γ-分泌酶抑制剂，例如SB431542(例如，约1-20μM，特别是约10μM)和DAPT(例如，约1-5μM，特别是约2μM)。或者，HMM还可包含SRC激酶抑制剂和EPO。可以在二维培养物中进行成熟，例如在胶原蛋白I上进行。HMM可以包含TGFβ抑制剂和MEK抑制剂。或者，HMM可包含FH1、FPH1和/或甲氧胺(Shan et al.,2013)。
B.抑制剂
a.GSK3抑制剂
糖原合酶激酶3(GSK3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子添加到丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上。示例性抑制剂包括CHIR99021、BIO、SB216763、CHIR98014、TWS119、SB415286和Tideglusib。
b.TGFβ途径抑制剂
转化生长因子β(TGFβ)是一种分泌蛋白，其在大多数细胞中控制增殖、细胞分化和其他功能。它是一种细胞因子，在免疫、癌症、支气管哮喘、肺纤维化、心脏病、糖尿病和多发性硬化症中发挥作用。TGF-β存在于至少三种异形体形式，称为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β家族是称为转化生长因子β超家族的蛋白质超家族的一部分，其中包括抑制素、激活蛋白、抗苗勒管激素、骨形态发生蛋白、decapentaplegic和Vg-1。
TGFβ途径抑制剂(在本文中也称为TGFβ抑制剂)一般可包括TGFβ信号传导的任何抑制剂。例如，TGFβ抑制剂是4-[4-(1,3-苯并二
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唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)、6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉(SB525334)、2-(5-苯并[1,3]二
Figure BDA0003343940070000222
唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物(SB431542-505124)、4-(5-苯并[1,3]二
Figure BDA0003343940070000223
唑-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(1,3-苯并二
Figure BDA0003343940070000224
唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、左右决定因子(Lefty)、3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(A 83-01)、4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二
Figure BDA0003343940070000225
英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(D 4476)、4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺(GW 788388)、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基-喹啉(LY 364847)、4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇(R 268712)或2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(RepSox)。
c.MEK抑制剂
MEK抑制剂是一种抑制丝裂原活化蛋白激酶MEK1或MEK2的化学物质或药物。它们能够用于影响MAPK/ERK途径。例如，MEK抑制剂包括N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(PD0325901)、N-[3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯胺)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧吡啶[4,3-d]吡啶-1-基]苯基]乙酰胺(GSK1120212)、6-(4-溴-2-氟苯胺)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺(MEK162)、N-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯基)-6-甲氧基苯基]-1-(2,3-二羟基丙基)环丙烷-1-磺酰胺(RDEA119)和6-(4-溴-2-氯苯胺)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-甲酰胺(AZD6244)。
d.Src激酶抑制剂
Src非受体蛋白酪氨酸激酶家族在多种细胞信号转导通路中发挥重要作用，其调节细胞分裂、运动、粘附、血管生成和存活等多种过程。一种有效的、可逆的、ATP竞争性的PP1是Src蛋白酪氨酸激酶家族的选择性抑制剂。它抑制p56lck(IC50＝5nM)、p59fynT(IC50＝6nM)、Hck(IC50＝20nM)和Src(IC50＝170nM)而不会显著影响EGFR激酶(IC50＝250nM)、JAK2(IC50＝50μM)或ZAP-70(IC50≥0.6μM)的活性。PP1还通过以与Src信号传导无关的方式直接抑制I型TGF-β受体(IC50＝50nM)来阻断TGF-β介导的细胞反应。在一些方面，第3阶段成熟培养基可以补充有一种或多种Src激酶抑制剂，包括PP2、KB SRC 4、1-萘基PP1、MNS、PD 180970和博舒替尼，例如5uM。
e.γ-分泌酶抑制剂
γ分泌酶是一种多亚基蛋白酶复合物，本身是一种完整的膜蛋白，可在跨膜结构域内的残基处切割单向跨膜蛋白。这种类型的蛋白酶被称为膜内蛋白酶。γ分泌酶的最著名的底物是淀粉样前体蛋白，这是一种大的完整膜蛋白，当被γ和β分泌酶切割时，会产生一种称为淀粉样蛋白β的短氨基酸肽，其异常折叠的纤维状形式是在阿尔茨海默病患者的大脑中发现的淀粉样蛋白斑块的主要成分。
在本文中，γ分泌酶抑制剂一般指γ-分泌酶抑制剂。例如，γ-分泌酶抑制剂包括但不限于N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙酯(DAPT)、5-氯-N-[(1S)-3,3,3-三氟-1-(羟甲基)-2-(三氟甲基)丙基]-2-噻吩磺酰胺(Begacestat)、MDL-28170,3,5-双(4-硝基苯氧基)苯甲酸(Compound W)、7-氨基-4-氯-3-甲氧基-1H-2-苯并吡喃(JLK6)、(5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)-羟基-(2R)-苄基己酰基)-L-亮氨酸-L-苯丙氨酰胺(L-685,485)、(R)-2-氟-α-甲基[1,1'-联苯基]-4-乙酸((R)-氟比洛芬；Flurizan)、N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-二氢-5-甲基-6-氧-5H-二苯并[b,d]氮杂-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧乙基]-3,5-二氟苯乙酰胺(二苯并氮杂；DBZ)、N-[cis-4-[(4-氯苯基)磺酰基]-4-(2,5-二氟苯基)环己基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(MRK560)、(2S)-2-[[(2S)-6,8-二氟-1,2,3,4-四氢-2-萘基]氨基]-N-[1-[2-[(2,2-二甲基丙基)氨基]-1,1-二甲基乙基]-1H-咪唑-4-基]戊酰胺二氢溴酸盐(PF3084014氢溴酸盐)和2-[(1R)-1-[[(4-氯苯基)磺酰基](2,5-二氟苯基)氨基]乙基-5-氟苯丁酸(BMS299897)。
C.冷冻保存
通过本文公开的方法产生的成肝细胞或肝细胞可以在该过程的任何阶段，例如第1阶段、第2阶段或第3阶段进行冷冻保存，参见例如PCT公开号2012/149484A2，其通过引用并入本文。细胞可以在有或没有基材(substrate)的情况下冷冻保存。在若干实施方案中，储存温度范围从约-50℃至约-60℃、约-60℃至约-70℃、约-70℃至约-80℃、约-80℃至约-90℃、约-90℃至约-100℃及其重叠范围。在一些实施方案中，低温用于冷冻保存的细胞的储存(例如，维持)。在若干实施方案中，使用液氮(或其他类似的液体冷却剂)来储存细胞。在进一步的实施方案中，细胞储存大于约6小时。在另外的实施方案中，细胞储存约72小时。在若干实施方案中，细胞储存48小时至约一周。在其他实施方案中，细胞储存约1、2、3、4、5、6、7或8周。在进一步的实施方案中，细胞储存1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。细胞也可以储存更长时间。细胞可以单独冷冻保存或保存在基材上，例如本文公开的任何基材上。
在一些实施方案中，可以使用另外的冷冻保护剂。例如，可以将细胞冷冻保存在包含一种或多种冷冻保护剂(例如DMSO)、血清白蛋白(例如人或牛血清白蛋白)的冷冻保存溶液中。在某些实施方案中，该溶液包含约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％，或约10％DMSO。在其他实施方案中，该溶液包含约1％至约3％、约2％至约4％、约3％至约5％、约4％至约6％、约5％至约7％、约6％至约8％、约7％至约9％、或约8％至约10％二甲基亚砜(DMSO)或白蛋白。在一个具体实施方案中，该溶液包含2.5％DMSO。在另一个具体实施方案中，该溶液包含10％DMSO。
可以在冷冻保存过程中以例如约1℃/分钟的速度冷却细胞。在一些实施放哪中，冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，或约-125℃至约-140℃。在一些实施方案中，细胞以1℃/分钟冷却至4℃。冷冻保存的细胞可以在解冻使用前转移到液氮的气相中。在一些实施方案中，例如，一旦细胞达到约-80℃，它们就被转移到液氮储存区。冷冻保存也可以使用控制速率的冷冻机来完成。冷冻保存的细胞可以在例如约25℃至约40℃的温度下解冻，并且通常在约37℃的温度下解冻。
D.肝细胞纯化与表征
可以例如通过选择肝细胞标志物来纯化由本方法产生的肝细胞以获得富集的肝细胞群。可以对细胞进行分选以获得CD133的阳性表达。因此，本公开内容提供了富集的肝细胞群。示例性细胞群包含至少约50％；优选至少约60％；70％；80％；90％；95％；98％，最优选99％或100％的肝细胞。
肝细胞的特征在于肝脏标志物α-抗胰蛋白酶(AAT)和/或白蛋白。细胞也可能对肝细胞的晚期标志物呈阳性，例如HNF-1σ、细胞角蛋白(CK)18和白蛋白；缺乏早期肝细胞标志物，例如HNF-30、GATA4、CK19、σ-胎蛋白；表达细胞色素P450基因，例如CYP1A1、CYP2B1、CYP2C6、CYP2C11、CYP2C13、CYP3A2和CYP4A1；并获得极化结构。肝细胞祖细胞可以通过早期肝细胞标志物的存在来检测。肝细胞的感兴趣的其他标志物包括σ1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白受体(ASGR或ASGPR或ASGPR1)、CK7、-谷氨酰转移酶；HNF 10、HNF 3a、HNF-4σ、甲状腺素运载蛋白、CFTR、apoE、葡萄糖激酶、胰岛素生长因子(IGF)1和2、IGF-1受体、胰岛素受体、瘦素、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、L型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白和促红细胞生成素(EPO)。
据报道，肝细胞分化需要转录因子HNF-4a(Li et al.,Genes Dev.14:464,2000)。独立于HNF-4α表达的标志物包括α1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白、apoE、葡萄糖激酶、胰岛素生长因子1和2、IGF-1受体、胰岛素受体和瘦素。依赖于HNF-4α表达的标志物包括白蛋白、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛缩酶B、苯丙氨酸羟化酶、L型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白和促红细胞生成素(EPO)。
与其他细胞相比，可以确定对这些标志物的表达水平的评估。成熟肝细胞标志物的阳性对照包括感兴趣物种的成体肝细胞和已建立的肝细胞系，例如美国专利号5,290,684中报道的源自肝母细胞瘤的HepG2系。阴性对照包括单独谱系的细胞，例如成体成纤维细胞系或视网膜色素上皮(RPE)细胞。
本公开内容中列出的组织特异性蛋白质和寡糖决定簇可以使用任何合适的免疫学技术进行检测——例如细胞表面标志物的流式免疫细胞化学、细胞内或细胞表面标志物的免疫组织化学(例如，固定细胞或组织切片的)、细胞提取物的蛋白质印迹分析和酶联免疫分析，用于细胞提取物或分泌到培养基中的产物。如果在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中，任选地在细胞固定后，并且任选地使用标记的二抗或其他偶联物(例如生物素-抗生物素蛋白偶联物)以放大标记，显著可检测量的抗体将与抗原结合，那么细胞表达的抗原被称为“抗体可检测”。
也可以在标准扩增方法中使用序列特异性引物通过Northern印迹分析、斑点杂交分析或通过逆转录酶引发的聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平检测组织特异性标志物的表达。详情请参阅美国专利号5,843,780。本公开内容中列出的特定标志物的序列数据可以从公共数据库如GenBank获得。如果在典型的对照实验中根据标准程序对细胞样品进行测定导致清晰可辨的杂交或扩增产物，则认为根据本公开内容中描述的测定之一在mRNA水平的表达“可检测”。如果在蛋白质或mRNA水平上检测到的组织特异性标志物的表达水平是对照细胞(例如未分化的iPS细胞、成纤维细胞或其他不相关的细胞类型)的至少2倍，优选超过10或50倍，则认为其表达为阳性。
还可以根据细胞是否表现出作为肝细胞谱系细胞特征的酶活性来表征细胞。例如，Bublitz(Mol Cell Biochem.108:141,1991)；Yasmineh et al.(Clin.Biochem.25:109,1992)；和Ockerman(Clin.Chim.Acta17:201,1968)描述了葡萄糖-6-磷酸酶活性的测定。Shiojiri(J.Embryol.Exp.Morph.62:139,1981)描述了肝细胞中碱性磷酸酶(ALP)和5-核苷酸酶(5'-Nase)的测定。作为一项商业服务，许多服务于研究和医疗保健部门的实验室提供肝酶检测。
细胞色素p450是单加氧酶系统的关键催化组分。它构成了一个血红素蛋白家族，负责异生物质(施用的药物)和许多内源性化合物的氧化代谢。不同的细胞色素呈现出特征性和重叠的底物特异性。大多数生物转化能力可归因于指定为1A2、2A6、2B6、3A4、2C9-11、2D6和2E1的细胞色素(Gomes-Lechon et al.,pp 129-153于“In vitro Methods inPharmaceutical Research,”Academic Press,1997)。
本领域已知多种测定法用于测量细胞色素p450酶活性。例如，可以将细胞与非荧光底物接触，该底物可通过p450活性转化为荧光产物，然后通过荧光激活细胞计数进行分析(美国专利号5,869,243)。具体而言，洗涤细胞，然后用10μM/L 5,6-甲氧基羰基荧光素(Molecular Probes，Eugene OR)的溶液在37℃下在黑暗中温育15分钟。然后洗涤细胞，从培养板中用胰蛋白酶消化，并分析约520-560nm的荧光发射。如果测试细胞中的活性水平是对照细胞(例如成纤维细胞)的2倍以上，优选10倍或100倍以上，则确定本公开内容中任何酶的活性证据。
细胞色素p450的表达也可以在蛋白质水平上测量，例如，在蛋白质印迹中使用特异性抗体，或在mRNA水平上，在Northern印迹或RT-PCR中使用特异性探针和引物测量。参见Borlakoglu et al.,Int.J.Biochem.25:1659,1993。还可以测量p450系统的特定活性：7-乙氧基香豆素O-脱乙基酶活性、烯丙试卤灵(aloxyresorufin)O-脱烷基酶活性、香豆素7-羟化酶活性、对硝基苯酚羟化酶活性、睾酮羟基化、UDP-葡萄糖醛酸转移酶活性、谷胱甘肽S-转移酶活性等(综述于Gomes-Lechon et al.,pp 411-431于“In vitro Methods inPharmaceutical Research,”Academic Press,1997)。然后可以将活性水平与原代肝细胞中的水平进行比较。
参与小分子药物结合、代谢或解毒的酶的测定也是可获得的。例如，可通过能够结合胆红素、胆汁酸和小分子药物，通过尿道或胆道排泄的能力表征细胞。将细胞与合适的基材接触，培养合适的时间，然后分析培养基(通过GCMS或其他合适的技术)以确定是否已经形成结合产物。药物代谢酶活性包括脱乙基化、脱烷基化、羟基化、脱甲基化、氧化、葡萄糖醛酸结合、磺基结合、谷胱甘肽结合和N-乙酰转移酶活性(A.Guillouzo,pp 411-431于“Invitro Methods in Pharmaceutical Research,”Academic Press,1997)。测定包括对乙酰氨基酚(peenacetin)脱乙基化、普鲁卡因酰胺N-乙酰化、对乙酰氨基酚磺基结合和对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸化(Chesne et al.,pp 343-350于“Liver Cells and Drugs”,A.Guillouzo ed.John Libbey Eurotext,London,1988)。
肝细胞谱系的细胞也可以评估它们储存糖原的能力。合适的测定使用高碘酸希夫(PAS)染色剂，它不与单糖和二糖反应，但染色长链聚合物，如糖原和葡聚糖。PAS反应提供复杂碳水化合物以及可溶性和膜结合碳水化合物化合物的定量估计。Kirkeby et al.(Biochem.Biophys.Meth.24:225,1992)描述了碳水化合物化合物和去污剂的定量PAS测定。van der Laarse et al.(Biotech Histochem.67:303,1992)描述了使用PAS反应对糖原进行的微光密度组织化学测定。如果细胞的PAS阳性水平是对照细胞(例如成纤维细胞)的至少2倍，优选超过10倍，则确定糖原储存的证据。还可以根据标准方法通过核型分析来表征细胞。
III.使用方法
本公开内容提供了一种可以产生大量肝细胞谱系细胞的方法。这些细胞群能够用于许多重要的研究、开发和商业目的。这些包括但不限于在体内细胞的移植或植入；在体外筛选抗病毒药物、细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂、生长/调节因子、药物化合物等；阐明肝病和感染的机制；研究药物和/或生长因子的作用机制；诊断和监测患者的癌症；基因治疗；以及生产生物活性产品等等，不一而足。
肝细胞也可用于代谢谱分析。在一个实施方案中，细胞或其部分，例如微粒体部分，与测试剂接触，可能以不同的浓度和持续不同的时间，收集和分析培养基以检测测试剂的代谢形式。任选地，还使用对照分子，例如丁呋洛尔。代谢谱分析可用于，例如，确定受试者是否代谢特定药物，并且如果是，则如何代谢该药物。对于此类测定，优选使用的肝细胞来源于受试者。
本公开内容还提供了使用肝细胞来为可能是由于肝功能的急性、慢性或遗传性损害而需要这种治疗的受试者恢复一定程度的肝功能。
本公开内容包括被封装的肝细胞，或生物人工肝装置的一部分。在“CellEncapsulation Technology and Therapeutics”,Kuhtreiber et al.eds.,Birkhauser,Boston Mass.,1999中描述了各种形式的封装。本发明的细胞可以根据用于体外或体内的这些方法进行封装。
用于临床用途的生物人工器官被设计成支持肝功能受损的个体——作为长期治疗的一部分，或者在暴发性肝衰竭和肝重建或肝移植之间架起时间。悬浮型生物人工肝脏包括悬浮在平板透析器中的细胞，或微囊化在合适的基质中，或附着在包被有细胞外基质的微载体珠上。或者，可以将肝细胞置于填充床、多板平板床、微通道筛网上或中空纤维毛细管周围的固体支持物上。该装置有入口和出口，受试者的血液通过该入口和出口，有时还有一组单独的端口用于为细胞提供营养。
本发明的肝细胞还可用于筛选例如影响细胞分化或代谢的候选化合物或环境条件。肝细胞还可用于获得细胞特异性抗体制剂和细胞特异性cDNA文库，例如，以研究基因表达模式，或作为药物制剂中的活性成分。在另一个实施方案中，将肝细胞施用于有需要的受试者。可以将细胞施用于受试者的肝脏，例如用于组织重建或再生。可以以允许它们移植到预期组织部位并重建或再生功能缺陷区域的方式施用细胞。根据本领域已知的方法，在施用之前，可以修饰细胞以抑制受试者对细胞的免疫反应或反之亦然(移植物抗宿主病)。
可以将肝细胞施用于患有完全或部分肝功能衰竭的受试者，例如由丙型肝炎感染引起的。可以在动物模型中评估肝细胞修复肝损伤的能力。一个这样的实例是由腹腔注射D-半乳糖胺引起的损伤。可以通过肝细胞标志物的免疫细胞化学染色、显微镜下确定是否在生长组织中形成小管结构以及治疗恢复肝脏特异性蛋白质合成的能力来确定治疗效果。
A.药物组合物
本文还提供了包含肝细胞和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。
根据本发明用于施用于受试者的细胞组合物因此可以使用一种或多种生理学可接受的载体以任何常规方式配制，所述载体包括促进将化合物加工成可药用制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。肝细胞可通过直接施用用于治疗，或作为提供临时肝功能的生物辅助装置的一部分，同时受试者的肝组织在暴发性肝功能衰竭后自行再生。对于药物制剂的一般原则，读者可以参考Cell Therapy:Stem CellTransplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy,由G.Morstyn iiW.Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；和Hematopoietic Stem CellTherapy,E.D.Ball,J.Lister&P.Law,Churchill Livingstone,2000。可以将组合物与用于细胞在组织再生或恢复治疗上重要的代谢功能的书面说明一起包装。
可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如细胞)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition,2012)混合来制备如本文所述的药物组合物和制剂，形式为冻干制剂或水溶液。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003343940070000311
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
B.测试化合物筛选
本公开内容的细胞可用于筛选影响本文提供的细胞特性的因素(例如溶剂、小分子药物、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。
本公开内容的特定筛选应用涉及药物研究中的药物化合物的测试。读者一般可参考In vitro Methods in Pharmaceutical Research,Academic Press,1997)。在本公开内容的某些方面，经试剂处理的肝细胞在标准药物筛选和毒性测定中扮演测试细胞的角色，正如之前在短期培养中对肝细胞系或原代肝细胞所进行的那样。候选药物化合物活性的评估通常涉及将本公开内容的某些方面中提供的细胞与候选化合物组合，确定可归因于该化合物的细胞形态学、标志物表型或代谢活性的任何变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞进行比较)，然后将化合物的作用与观察到的变化相关联。进行筛选可能是因为该化合物被设计为对肝细胞具有药理作用，或者因为被设计为在别处产生作用的化合物可能具有非预期的肝脏副作用。可以组合测试两种或多种药物(通过同时或顺序与细胞组合)，以检测可能的药物相互作用的影响。
在一些应用中，最初筛选化合物的潜在肝毒性(Castell et al.,1997)。首先可以通过对细胞活力、存活、形态和酶泄漏到培养基中的影响来确定细胞毒性。进行更详细的分析以确定化合物是否影响细胞功能(如糖异生、尿素生成和血浆蛋白合成)而不引起毒性。乳酸脱氢酶(LDH)是一个很好的标志物，因为肝同工酶(V型)在培养条件下是稳定的，可以在培养12-24小时后在培养上清液中进行可重现的测量。也可以使用酶的泄漏，例如线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶。Gomez-Lechon et al.(1996)描述了一种用于测量糖原的微量测定法，可用于测量药物化合物对肝细胞糖异生的影响。
目前评价肝毒性的其他方法包括测定白蛋白、胆固醇和脂蛋白的合成和分泌；运输结合胆汁酸和胆红素；尿素生成；细胞色素P450水平和活性；谷胱甘肽水平；α-谷胱甘肽S-转移酶的释放；ATP、ADP和AMP代谢；细胞内K+和Ca2+浓度；核基质蛋白或寡核小体的释放；和诱导细胞凋亡(由细胞变圆、染色质凝聚和核碎片化所指示的)。DNA合成可以通过[3H]-胸苷或BrdU掺入来测量。药物对DNA合成或结构的影响可以通过测量DNA合成或修复来确定。[3H]-胸苷或BrdU掺入，尤其是在细胞周期中的计划外时间，或高于细胞复制所需的水平，与药物作用一致。不良影响还可能包括由中期扩散确定的姐妹染色单体交换的异常率。读者可参考Vickers(1997)以作进一步阐述。
C.肝脏治疗和移植
本公开内容还提供了本文提供的肝细胞在可能是由于肝功能的急性、慢性或遗传性损伤而需要这种治疗的受试者中恢复一定程度的肝功能的用途。
为了确定本文提供的细胞对于治疗应用的适用性，可以首先在合适的动物模型中测试细胞。在一个层面上，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。将本文提供的细胞在适合进一步观察的部位施用于免疫缺陷动物(例如SCID小鼠，或通过化学或辐射导致免疫缺陷的动物)，例如在肾囊下、进入脾脏或进入肝小叶。在几天到几周或更长时间后收获组织，并评估起始细胞类型例如多能干细胞是否仍然存在。这可以通过为施用的细胞提供可检测的标记(例如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)或通过测量对所施用细胞特异的组成标志物来实现。当在啮齿动物模型中测试本文提供的细胞时，可以通过免疫组织化学或使用人特异性抗体的ELISA，或通过使用引物和杂交条件从而导致扩增具有特异性用于人类多核苷酸序列的RT-PCR分析来评估所施用细胞的存在和表型。在本公开内容的别处提供了用于在mRNA或蛋白质水平评估基因表达的合适标志物。Grompe et al.(1999)；Peeters etal.(1997)；和Ohashi et al.(2000)提供了确定动物模型中肝细胞命运的一般描述。
在另一个层面上，评估本文提供的细胞在缺乏完全肝功能的动物中恢复肝功能的能力。Braun et al.(2000)概述了在HSV-tk基因转基因小鼠中毒素诱导的肝病模型。Rhimet al.(1995)和Lieber et al.(1995)概述了通过尿激酶的表达的肝病模型。Mignon etal.(1998)概述了由细胞表面标志物Fas的抗体诱导的肝病。Overturf et al.(1998)通过靶向破坏Fah基因开发了一种小鼠遗传性酪氨酸血症I型模型。这些动物可以通过提供2-(2-硝基-4-氟-甲基-苯)-1,3-环己二酮(NTBC)从缺乏症中解救出来，但当停止使用NTBC时，它们会患上肝病。可以通过90％的肝切除术来模拟急性肝病(Kobayashi et al.,2000)。也可以通过用肝毒素(例如半乳糖胺、四氯化碳或硫代乙酰胺)处理动物来模拟急性肝病。
慢性肝病(例如肝硬化)可以通过用亚致死剂量的肝毒素治疗动物足够长以诱导纤维化来建模(Rudolph et al.,2000)。评估本文提供的细胞重建肝功能的能力包括将细胞施用于此类动物，然后确定存活1至8周或更长时间，同时监测动物的病情进展。可以通过评估肝组织中表达的标志物、细胞色素P450活性和血液指标(例如碱性磷酸酶活性、胆红素结合和凝血酶原时间)和宿主存活率来确定对肝功能的影响。根据这些标准中的任何一个的生存、疾病进展或肝功能维持的任何改善都与治疗的有效性有关，并且可以导致进一步优化。
在本公开内容的某些方面中提供的根据其代谢酶谱或动物模型中的功效表现出期望的功能特征的细胞也可适合直接施用于肝功能受损的人受试者。出于止血的目的，可以在任何能够充分进入循环的部位(通常在腹腔内)施用细胞。对于某些代谢和解毒功能，细胞进入胆道是有利的。因此，在肝脏附近(例如，在慢性肝病的治疗中)或脾脏(例如，在暴发性肝衰竭的治疗中)施用细胞。在一种方法中，细胞通过肝动脉或门静脉通过留置导管输注进入肝循环。可以操作门静脉中的导管，使细胞主要流入脾脏或肝脏，或两者的组合。在另一种方法中，通过将丸剂(bolus)放置在靶器官附近的腔中来施用细胞，通常在将丸剂保持在适当位置的赋形剂或基质中。在另一种方法中，将细胞直接注射到肝脏或脾脏的叶中。
本公开内容的某些方面中提供的细胞可用于治疗任何需要恢复或补充肝功能的受试者。适用于此类治疗的人疾病包括任何原因导致的暴发性肝功能衰竭、病毒性肝炎、药物诱导的肝损伤、肝硬化、遗传性肝功能不全(例如威尔逊病、吉尔伯特综合征或α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、肝胆癌、自身免疫性肝病(例如自身免疫性慢性肝炎或原发性胆汁性肝硬化)，以及任何其他导致肝功能受损的病况。对于人体治疗，剂量通常在约109至1012个细胞之间，通常在约5×109至5×1010个细胞之间，根据受试者的体重、病痛的性质和严重程度以及所施用的细胞复制能力进行调整。确定治疗模式和适当剂量的最终责任在于管理临床医生。
D.在肝脏辅助装置中使用
本公开内容的某些方面包括本文提供的细胞，其被封装或是生物人工肝装置的一部分。在Cell Encapsulation Technology and Therapeutics,1999中描述了各种形式的封装。在本公开内容的某些方面中提供的肝细胞可以根据用于体外或体内的这些方法进行封装。
用于临床用途的生物人工器官被设计成支持肝功能受损的个体——作为长期治疗的一部分，或者在暴发性肝衰竭和肝重建或肝移植之间架起时间。Macdonald et al.(1999)综述了生物人工肝装置并在美国专利号5,290,684、5,624,840、5,837,234、5,853,717和5,935,849中举例说明。悬浮型生物人工肝包括悬浮在平板透析器中的细胞，微囊化在合适的基质中，或附着在包被有细胞外基质的微载体珠上。或者，可以将肝细胞置于填充床、多板平板床、微通道筛网上或中空纤维毛细管周围的固体支持物上。该装置有入口和出口，受试者的血液通过该入口和出口，有时还有一组单独的端口用于为细胞提供营养。
根据早先描述的方法制备细胞，然后将细胞铺板到合适的基材上的装置中，例如
Figure BDA0003343940070000351
或胶原蛋白的基质。可以通过比较传入通道中的血液组成与传出通道中的血液组成来评估该装置的功效——用从传入流中去除的代谢物和传出流中新合成的蛋白质来表示。
这种类型的装置可用于解毒诸如血液的流体，其中该流体在允许细胞去除或修饰流体中的毒素的条件下与本公开内容的某些方面中提供的肝细胞接触。解毒包括去除或改变至少一种配体、代谢物或其他通常由肝脏加工的化合物(天然或合成)。此类化合物包括但不限于胆红素、胆汁酸、尿素、血红素、脂蛋白、碳水化合物、转铁蛋白、血红素结合蛋白、去唾液酸糖蛋白、激素如胰岛素和胰高血糖素，以及各种小分子药物。该装置还可用于用合成蛋白质(例如白蛋白、急性期反应物和未加载的载体蛋白)来丰富传出液。该装置可以进行优化，以便执行各种这些功能，从而根据需要恢复尽可能多的肝功能。在治疗护理的情况下，该装置处理从肝细胞衰竭患者流出的血液，然后将血液返回给该患者。
E.用于商业、治疗和研究目的的分销
在一些实施方案中，提供了一种试剂系统，其包括在制造、分销或使用期间的任何时间存在的细胞。试剂盒可以包含本公开内容中描述的细胞与未分化的多能干细胞或其他分化的细胞类型的组合，通常共有相同的基因组。每种细胞类型可以在同一实体或共享业务关系的不同实体的控制下，在同一设施中或在不同地点、在相同或不同时间被包装在一起，或在分开的容器中。药物组合物可以任选地包装在合适的容器中，并带有用于所需目的例如机制毒理学的书面说明。
在一些实施方案中，提供了可包括例如一种或多种用于产生细胞的培养基和组分的试剂盒。在合适的情况下，试剂系统可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、培养瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，可将组分放入其中并优选地适当等分处理。当试剂盒中有不止一种组分时，该试剂盒通常还包含第二、第三或其他附加容器，附加组分可以分开地放置在其中。然而，小瓶中可以包含各种组分的组合。可以作为干燥粉末提供试剂盒的组分。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。考虑了溶剂也可以提供在另一个容器装置中。本公开内容的试剂盒还将通常包括用于在密闭空间中容纳用于商业销售的试剂盒组分的装置。这种容器可以包括注射或吹塑塑料容器，所需的小瓶保持在其中。试剂盒还可包括使用说明，例如印刷或电子格式，例如数字格式。
IV.实施例
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了由本发明人所发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得同样或相似的结果。
实施例1——肝细胞分化过程的开发与表征
对肝细胞分化过程中的几个步骤进行了测试和优化，以产生通过细胞标志物和细胞形态学评估为成熟的肝细胞。
用于产生肝细胞的分化过程包括将iPSC分化为DE细胞，然后将其诱导形成成肝细胞，然后分化为肝细胞。
iPS细胞在低氧条件(5％O2)下维持在E8培养基中的
Figure BDA0003343940070000371
上，大约每4-5天使用0.5mM EDTA进行分瓶。在肝细胞分化开始之前，将iPSC培养物传代约10代以适应低氧。起始iPS细胞培养物以15-20k/cm2接种在包被了
Figure BDA0003343940070000372
的6孔板或T150培养瓶上。接种后两天，将培养基更换为预调理培养基(PCM)并每天供给两到三天。通过将细胞置于含有激活蛋白的培养基(DE第0天培养基，也称为T0培养基)中来进行内胚层诱导。在第1-2天，培养基更换为DE第1-2天培养基(也称为T1-T2培养基)，在接下来的两天中含有激活蛋白以及低浓度的BMP4、VEGF和FGF2。从第3-9天起，将培养基更换为DE第3-9天(也称为T3-T6培养基)，其中含有基础培养基SFD，并补充有激活蛋白、BMP4和VEGF。在第10天，对培养物取样以染色定形内胚层细胞的百分比。使用温热的TrypLE在37℃下将细胞个体化5-7分钟并淬灭。进行表面染色以通过流式细胞术定量Tra181、CXCR4、CD117的水平。将培养物转变至肝细胞诱导第1阶段培养基中，该培养基含有中内胚层诱导因子BMP4、VEGF、FGF以及地塞米松、DMSO、肝细胞生长因子和FGF，以在6天的时间段内促进定形内胚层向成肝细胞的转化。每48小时给细胞供给新鲜的肝细胞诱导培养基至第16天。在第17天，使用TrypLE收获整个培养物。然后将收获的细胞冷冻保存。通过在旋转后吸出上清培养基进行冷冻保存，细胞沉淀以500-1000万个细胞/mL重悬浮在Bambanker溶液中，并在程序冷冻仪(ControlRate Freezer)中持续冷冻，然后进行液氮储存。
或者，将细胞个体化细胞悬液置于培养基中以形成聚集体。将细胞置于第2阶段肝细胞分化培养基+Blebbistatin中。以0.25×106个细胞/mL的密度开始聚集体形成。将细胞置于静态条件下的T75 ULA培养瓶或低氧条件下的旋转培养瓶中。在第18天，将培养基更换为第2阶段+CHIR99021培养基并每隔一天供给直至第24天。在第20天，将培养物从缺氧条件转变为常氧条件。在第23天，对培养物取样进行染色分析。使用温热的TrypLE在37℃下消化聚集体5-7分钟并淬灭。单细胞在室温下用Live/Dead Red处理15分钟，然后在室温下用4％PFA溶液固定15分钟。经流式细胞术进行细胞内染色以定量AAT、ASGPR、白蛋白和匹配同种型的水平。在第25天，在分化过程的第2阶段结束时收获培养物并冷冻保存。这提供了AAT阳性肝细胞的冷冻保存。AAT的细胞内表达与CD133的表面表达相关。此特征允许在肝细胞分化的第2阶段结束时对CD133阳性细胞进行磁性分选的选项，以冷冻保存纯AAT阳性肝细胞群。通过在Bambanker溶液中以500-2000万个细胞/mL重悬消化后的细胞沉淀并在程序冷冻仪中持续冷冻，然后进行液氮储存，来进行第2阶段结束时肝细胞的冷冻保存。添加蛋白酶抑制剂和ECM(如
Figure BDA0003343940070000381
)可包括在第2阶段肝细胞的冷冻保存中。
第1阶段结束时冷冻保存的细胞可以在包被了胶原蛋白I的板上解冻。在16-18天的培养过程中，第1阶段细胞成熟到第2阶段，然后成熟到第3阶段，以产生成熟的肝细胞。第2阶段结束的细胞被放置包被了胶原蛋白I的板上进行第3阶段成熟，并且在铺板后8-10天可以可视化成熟的AAT/白蛋白阳性表达成熟肝细胞，具有经典的鹅卵石多边形形态。
进行了若干实验以衍生出这种优化的肝细胞分化过程。首先，评估了GSK3抑制剂CHIR99021对本本发明的肝细胞分化方法不同阶段的影响。CHIR预调理是在没有生长因子和基础非iPSC培养基中进行的。
观察到这种预调理在促进细胞退出多能性方面特别有价值，正如TRA1-81染色和多能性基因POU5F1(转录因子OCT4的编码基因)和NANOG表达的急剧下降所证明的。这种下降伴随着DE标志物CXCR4和CD117的流式细胞术染色显示的良好水平的DE诱导(图6)。
下一步是确定iPSC的CHIR预调理的最佳时机，并检查预调理对分化第2阶段和第3阶段中DE、成肝细胞和肝细胞出现的影响。观察到在DE诱导前添加CHIR99021可促进肝细胞增殖和分化效率。发现在第1阶段引入CHIR99021没有阳性作用，而在第2阶段引入CHIR99021显示出对细胞增殖的有益影响并且对细胞形态没有负面影响。
研究了在肝细胞分化过程中补充CHIR99021以提高分化过程的产量和效率。事实证明，补充CHIR可有效促进肝细胞向肝细胞转变过程中的细胞扩增。此外，细胞数量的增加并不妨碍细胞的肝表型，其特征在于AAT阳性细胞的出现。用CHIR预调理的细胞显示出从DE到肝脏谱系的平稳转变，并且在第2阶段结束时(EoS2)表现出高纯度的肝脏标志物α1抗胰蛋白酶(AAT)(图9)和去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR1)(图10)。
表1.用于测试方案修改的NASH患者和非疾病对照系组。CHIR预调理在DE诱导过程中下调多能性标志物，例如TRA181、POU5F1、NANOG。
Figure BDA0003343940070000401
为了确定聚集体形成的最佳点，评估了分化结果的影响。发现通过在第1阶段结束时聚集体形成的中间过程聚集体时机产生具有最高AAT纯度的细胞群。
接下来，评估了生长因子浓度的影响。分化期间使用的HGF浓度的降低以及去除EGF和修改VEGF时机对分化结果没有不利影响。
最后，发现在第3阶段成熟培养基中添加TGFβ和NOTCH抑制剂可促进白蛋白表达并显示肝细胞形态。
HNF4A水平的定量：在肝细胞分化期间检查核受体HNF4A的基因表达。该受体是许多肝脏过程的关键调节剂，其表达对于肝脏发育是必需的。编码HNF4A的基因受称为P1和P2的两个不同启动子的转录控制。P1转录物是更成熟肝细胞的特征，而P2转录物是胎儿肝细胞的特征。在该方案产生的肝细胞中，P1转录在第1阶段结束时(EoS1)占主导地位。值得注意的是，HNF4A转录谱——mRNA水平和P1/P2转录率——与成人肝脏中的相似(图12)。
活的结束阶段肝细胞的形态学和功能分析：当在第2阶段结束时接种到包被了胶原蛋白的板上时，该方案产生的肝细胞表现出适当的肝细胞形态，其特征在于具有突出的细胞核和相位明亮的边界的鹅卵石形状。还观察到肝细胞的另一个重要形态特征：双核细胞(图13)。此外，用染料CDFDA染色细胞(图14)表明它们形成了肝细胞的另一个关键特征：功能性胆小管。
第3阶段结束的肝细胞活培养物的分析：最后，分化的肝细胞达到高水平的白蛋白纯度(>65％)，同时保持它们的AAT纯度。在第3阶段分化的第7天和第14天定量AAT和白蛋白的百分比
表2.用于肝细胞分化方案所有步骤的培养基配方。
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CD133(也称为prominin-1或AC133)是pentaspan膜蛋白prominin家族中第一个鉴定的成员。CD133在造血祖细胞以及鼠或人组织(包括脑、肾、前列腺、胰腺、皮肤和肝细胞癌)中的上皮和非上皮祖细胞中表达。由于AAT是用于纯化肝细胞的细胞内标志物，因此进行了研究以筛选有助于富集和随后纯化肝细胞培养物的替代细胞表面标志物。CD133表面标志物在几种不同细胞系中肝细胞分化第2阶段结束时与AAT+细胞共染色(图21A、B)。所有AAT+细胞均为CD133+，因此CD133可用于纯化AAT表达较差的细胞系并清除大部分污染细胞。
因此，发现iPSC可以通过在GSK3抑制剂存在下培养细胞来预调理细胞以通过促进它们退出多能性和改善下游分化而分化为定型内胚层(DE)细胞，从而朝向肝细胞分化。最初，iPSC可以在内胚层诱导培养基中分化为DE细胞。iPSC可以在二维培养中进行培养，例如在
Figure BDA0003343940070000432
上，然后可以在第1阶段结束时将DE细胞转移到三维聚合体培养中。可以在包括诱导成肝细胞和分化为肝细胞的该过程的第2阶段过程中在GSK3抑制剂存在下培养细胞。在第3阶段，肝细胞可在TGFβ抑制剂和γ-分泌酶抑制剂的存在下成熟，以改善细胞形态。
肝细胞/MSC共培养研究：进行了一项初步实验以检查肝细胞和MSC共培养的效果。从NASH系01D1生成了MSC库(表1)。MSC成功适应肝细胞培养基，然后以各种密度接种到来自01D1系的肝细胞上。该实验是用在第3阶段培养基+/-SB431542/DAPT中培养的细胞进行的。我们发现，在不存在SB431542/DAPT的情况下，与对照相比，所有培养物——单独的肝细胞或肝细胞/MSC共培养物——都在形态上恶化，并且AAT和ALB的纯度降低。与此一致，通过ELISA测量的上清液中的ALB分泌也下降。然而，观察到在SB431542/DAPT的存在下，肝细胞/MSC共培养物不仅保持了适当的形态(图6)，而且还保持了它们的高AAT纯度，并且ALB纯度和分泌有适度但明显的增加。这表明与MSC共培养可能促进肝细胞成熟。研究该系可以扩展到使用系匹配的补充有SB431542/DAPT的MSC条件培养基来成熟肝细胞。
解冻分化第2阶段冷冻保存的肝细胞和解冻后成熟为第3阶段肝细胞：在第3阶段培养基中解冻在第2阶段结束时冷冻保存的肝细胞。在rock抑制剂存在的情况下，将细胞接种在包被了胶原蛋白I的平板上，无需旋转。在铺板后24小时结束时轻轻更换培养基。成熟培养基含有SB/DAPT或Src激酶抑制剂，让细胞再分化8-10天，其中每48小时更换一次培养基。分析结束阶段细胞的肝细胞形态以及通过流式细胞术定量的AAT和白蛋白表达的存在。
初步数据显示，PP1代替SB431542/DAPT的替代促进了肝细胞的成熟。图23描绘了解冻后培养物的形态，而图24描绘了解冻后培养物的纯度。
肝脏类器官的产生：产生被设计成模拟肝脏类器官培养物的由肝细胞和其他肝脏相关细胞类型(特别是巨噬细胞、MSC和内皮细胞)组成的聚集体，并维持5-10天。在补充有1μM H1152的肝细胞第3阶段培养基(表2)中产生聚集体，非肝细胞细胞在开始共培养之前适应第3阶段培养基。对于共培养的开始，从冷冻保存中恢复第1阶段结束细胞肝细胞，并在补充有1μM的rho激酶(rock)抑制剂H1152的第2阶段培养基(表2)中以500,000个细胞/mL形成聚集体。24小时后，将培养基更换为含有3μM CHIR99021的第2阶段培养基。将细胞在第2阶段培养基中总共维持8天，前4天在低氧条件下，后4天在常氧条件下。将冷冻保存的巨噬细胞以约100,000个细胞/cm2铺板于无血清成分确定(SFD)培养基中的低附着板中，并通过添加第3阶段培养基(2mL/孔，每隔一天6wp)到培养物缓慢适应肝细胞第3阶段培养基(不含SB431542/DAPT或PP1)。类似地，将冷冻保存的MSC在标准组织培养板上以50,000个细胞/cm2在MSC培养基(含有各自50ng/mL PDGF-BB和bFGF的SFD)中解冻。通过在解冻后第1天开始增加第3阶段培养基与MSC培养基的比例(第1天75％MSC/25％第3阶段，第2天50％MSC/50％第3阶段，第3天25％MSC/75％第3阶段，第4-7天100％第3阶段)使细胞适应肝细胞第3阶段培养基(不含SB431542/DAPT或PP1)，持续7天。将冷冻保存的内皮细胞解冻并铺板在包被有纤连蛋白(2μg/cm2)的组织培养板上以约25,000个细胞/cm2在内皮细胞培养基(含有各自50ng/mL VEGF和bFGF的SFD)中。通过增加第3阶段培养基与含有各自50ng/mL VEGF和50ng/mL FGF的无血清成分确定(SFD)内皮细胞培养基的比例，使细胞适应肝细胞第3阶段肝细胞培养基7天。通过在解冻后第1天开始增加第3阶段肝细胞培养基与内皮细胞培养基的比例(第1天75％内皮细胞培养基/25％第3阶段，第2天50％内皮细胞培养基/50％第3阶段，第3天25％内皮细胞培养基/75％第3阶段，第4-7天100％第3阶段)，使细胞适应肝细胞第3阶段肝细胞培养基(不含SB431542/DAPT或PP1)。在肝细胞聚集体形成后的第8天，在37℃下用0.5％胰蛋白酶-EDTA解离肝细胞聚集体7分钟。同时，巨噬细胞、MSC和内皮细胞用TrypLE Select解离(37℃下5-7分钟)，然后洗涤、离心细胞悬液并测定活细胞浓度。所有细胞类型都悬浮在肝细胞第3阶段培养基(不含SB431542/DAPT或PP1)中，浓度为1,000,000个细胞/mL。然后将细胞以1:0.5:2:0.2肝细胞:巨噬细胞:MSC:内皮细胞的比例铺板在超低附着(ULA)圆底96孔板中。在所有聚集体条件下(图28A)，每孔的细胞总数保持恒定。然后将细胞以200g沉淀3分钟，并用等体积的含有2μM H1152、0.6mg/mL
Figure BDA0003343940070000451
和SB431542/DAPT(分别为20μM/4μM)或PP1(10μM)的第3阶段培养基覆盖至使化合物的最终浓度为1μM H1152、0.3mg/mL
Figure BDA0003343940070000452
和10μM SB431542/2μM DAPT或5μM PP1。然后将细胞再次以200g沉淀3分钟并置于常氧培养箱中。每隔一天更换一次培养基，在不干扰聚集体的情况下去除50％的培养基并用等量的含有SB431542/DAPT或PP1的第3阶段培养基替换。
脂肪沉积测定：在第3阶段结束时对iPSC衍生的肝细胞：2.038、54A(均为正常)、01D1和02E1(均为NASH)系进行细胞内脂质沉积诱导测定。在肝细胞分化的第2阶段结束时，使用0.5％胰蛋白酶-EDTA在37℃下解离聚集体7分钟，并用补充有10％FBS的IMDM培养基淬灭。然后将细胞以200g沉淀3分钟，并以200,000个细胞/cm2接种到包被了胶原蛋白I的平板上，并在脂质沉积诱导前在第3阶段培养基(表2)中保持4-5天，每隔一天更换培养基。或者，在第1阶段结束时用TrypLE Select在37℃下解离细胞5-7分钟，并用补充有10％FBS的IMDM培养基淬灭。然后将细胞以200g沉淀3分钟，并以100,000个细胞/cm2接种到包被了胶原蛋白I的平板上，并置于低氧条件下。细胞在第2阶段+CHIR99021培养基(表2)中保持8天，每隔一天更换培养基。在第2阶段分化的第4天，将细胞置于常氧条件下。8天后，将细胞切换到2D铺板条件下的第3阶段培养基。对于脂质沉积诱导，细胞用50-600μM脂肪酸、亚油酸或油酸-亚油酸混合物在第3阶段培养基中稀释，在37℃、常氧条件下处理24小时。细胞用DPBS洗涤两次，并在室温下用4％PFA固定20分钟。用DPBS洗涤3次后，将细胞用含有1μg/mL Bodipy493/503、肌动蛋白-555和DAPI的含有0.1％Triton-X的DPBS溶液染色中室温避光染色20分钟，然后用DPBS洗涤3次。脂滴、细胞基质和细胞核被染色并分别被高容量共聚焦显微镜上的FITC(脂质)、德克萨斯红(肌动蛋白-555)和DAPI(细胞核)过滤器捕获。以20倍放大率捕获图像，随后使用MetaXpress软件进行定量分析。每个细胞的脂质沉积通过每个细胞的脂质沉积＝FITC的积分强度之和/细胞核总数来计算。
从冷冻保存的第1阶段结束成肝细胞或定形内胚层(DE)细胞生成结束阶段肝细胞：在低氧条件下，在rock抑制剂H1152(1μM)的存在下，将冷冻保存的成肝细胞(第1阶段结束的细胞)在第2阶段肝细胞培养基中解冻以形成500,000个细胞/mL的聚集体。24小时后，培养基更换为第2阶段+CHIR99021(表2，第2阶段培养基+3μM CHIR99021)。聚集体在第2阶段+3μM CHIR99021培养基中保持8天，每隔一天更换培养基。在第4天，在第2阶段培养基存在的情况下，将聚集体置于常氧条件下。在第8天，将聚集体切换到第3阶段肝细胞培养基并培养5-10天以使其成熟，然后收集聚集体以进行各种结束阶段测定。或者，也可以在第2阶段结束时使用0.5％胰蛋白酶-EDTA(在37℃下约7分钟)解离聚集体，并在存在rock抑制剂(H1152，1μM)的情况下铺在第3阶段培养基(表2)中的包被了胶原蛋白I的板上。24小时后，细胞可以在第3阶段肝细胞培养基(表2)中以2D格式再培养7-10天，每隔一天更换一次培养基。结束阶段2D细胞可用于肝细胞的各种结束点分析。
从冷冻保存的定形内胚层(DE)细胞生成第3阶段结束肝细胞：在低氧条件下，在rock抑制剂(H1152，1μM)存在的情况下，将冷冻保存的DE细胞解冻，在T3-T6培养基(表2)中以100,000个细胞/cm2接种在包被了
Figure BDA0003343940070000471
的板上。24小时后，将培养基更换为不含rock抑制剂的T3-T6，并在该培养基中再维持1-2天，然后更换为第1阶段肝细胞培养基(表2)。在低氧条件下将细胞维持在第1阶段肝细胞培养基中6天，每隔一天更换培养基。6天后，细胞在37℃下用TrypLE解离5-7分钟，淬灭、洗涤并置入超低附着(ULA)静态容器或旋转瓶中以产生3D聚集体，持续8天，每隔一天更换培养基。在第4天，在第2阶段培养基存在的情况下，将聚集体置于常氧条件下。在第8天，将聚集体切换到第3阶段肝细胞培养基并培养5-10天以使其成熟，然后收集聚集体以进行各种结束阶段测定。通过流式细胞术定量结束阶段α-1抗胰蛋白酶(AAT)和白蛋白表达，典型结果如表3所示。
表3.在DE诱导结束或第1阶段结束时冷冻保存的细胞中典型的AAT和白蛋白(ALB)纯度，解冻并分化到第3阶段结束。
系 冷冻保存点 AAT ALB
2.038(健康) DE结束 97 38
01D1(NASH) DE结束 89 45
02E1(NASH) DE结束 97 80
2.038(健康) 第1阶段结束 99 87
01D1(NASH) 第1阶段结束 95 80
初步数据显示，PP1代替SB431542/DAPT的替代促进了肝细胞的成熟。图23描绘了解冻后培养物的形态，而图24描绘了解冻后培养物的纯度。在MSC、巨噬细胞和内皮细胞存在的情况下，PP1还能促进肝细胞的成熟。
使用活结束阶段肝细胞的脂质沉积数据揭示了在NASH特异性肝细胞中自发脂质沉积的表现(图27)。该结果展示了使用iPSC衍生的肝细胞对脂肪肝表型进行建模的可测量表型。此功能能够辅以其他体外NASH特异性检测用于药物开发和筛选应用。
衍生自正常和NASH特异性iPSC的结束阶段肝细胞的共培养能够与间充质干细胞、同基因巨噬细胞、同基因内皮细胞配对以开发3D肝脏类器官(图28A-C)。
肝细胞与辅助细胞类型的3D共培养能够用于增强肝细胞的成熟和功能(图28D)、纤维化疾病建模、基于组学的分析和高通量筛选应用以及用于NASH的药物开发。
* * *
根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下做出和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对所述方法和所述方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体而言，很明显，某些化学和生理学相关的药剂可以替代本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替代和修改都被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
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Claims (82)

1.产生肝细胞的方法，其包括：
(a)在GSK3抑制剂存在下培养诱导多能干细胞(iPSC)以提供预调理的iPSC；
(b)将所述预调理的iPSC分化为定形内胚层(DE)细胞；
(c)培养所述DE细胞以诱导成肝细胞的形成；和
(d)将所述成肝细胞分化为肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述iPSC预调理1-3天。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021、BIO、SB216763、CHIR98014、TWS119、SB415286和Tideglusib。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述CHIR99021的浓度为1-5μM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述iPSC在基本上不含抗坏血酸的培养基中进行预调理。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的一个或多个步骤在无异种蛋白条件、无饲养层条件和/或无条件培养基条件下进行。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的每个步骤在无异种蛋白条件、无饲养层条件和/或无条件培养基条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的每个步骤在成分确定的条件下进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中分化为DE细胞包括在包含激活蛋白A的第一内胚层诱导培养基(EIM)、包含BMP4、VEGF和bFGF的第二EIM和包含VEGF和DMSO的第三EIM中依次培养所述iPSC。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中分化为DE细胞持续8-10天。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述DE细胞对CXCR4、CD117、FOXA1、FOXA2、EOMES和/或HNF4α呈阳性。
13.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在包含HGF、BMP4、FGF10、FGF2、VEGF、EGF、地塞米松和/或DMSO的肝细胞诱导培养基(HIM)中培养DE细胞。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在包含BMP4、HGF和FGF10的HIM中培养DE细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括在包含HGF、BMP4、FGF10、FGF2、VEGF、EGF、地塞米松和DMSO的HIM中培养DE细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HGF的浓度为20-30ng/mL。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中步骤(c)持续5-7天。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括在诱导成肝细胞后形成聚集体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(a)和(b)基本上不含聚集体。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在细胞外基质上培养细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞外基质是从鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤纯化的基底膜提取物(BME)。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞外基质是
Figure FDA0003343940060000031
GELTREXTM、胶原蛋白或层粘连蛋白。
23.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞外基质是
Figure FDA0003343940060000032
24.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞外基质是胶原蛋白。
25.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞外基质是GELTREX。
26.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述细胞外基质是层粘连蛋白。
27.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之前消化所述成肝细胞。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中分化包括在包含bFGF、HGF、抑癌蛋白M和DMSO的肝细胞分化培养基(HDM)中培养所述成肝细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述HDM还包含GSK3抑制剂。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述HDM基本上不含VEGF和EGF。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(d)的分化持续8-10天。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在低氧条件下进行步骤(a)-(c)。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括在低氧条件下培养细胞进行第一分化期和在常氧条件下培养细胞进行第二分化期。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一分化期和第二分化期各自为3-5天。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其还包括在包含地塞米松和抑癌蛋白M的成熟培养基中培养所述肝细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中在成熟过程中在胶原蛋白上培养所述肝细胞。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述成熟培养基还包含SRC激酶抑制剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述SRC激酶抑制剂是博舒替尼、达沙替尼、A419259、阿特波龙、AZM475271、AZM475271或PP1。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含EPO。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含γ-分泌酶抑制剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂是DAPT。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述成熟培养基还包含TGFβ抑制剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542、SB525334、SB431542-505124、Lefty、A 83-01、D 4476、GW 788388、LY 364847、R 268712和RepSox。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂是SB431542。
45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含MEK抑制剂。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述MEK抑制剂是PD0325901、GSK1120212、MEK162、RDEA119和AZD6244。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述MEK抑制剂是PD0325901。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含EPO、IGF1、IGF2和/或TGFα。
49.根据权利要求35-48中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含抗细胞凋亡化合物XMU-MP1。
50.根据权利要求35-49中任一项所述的方法，其中所述成熟培养基还包含FH1、FPH1和/或α1-肾上腺素受体激动剂甲氧胺。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其还包括选择CD133阳性细胞。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中至少70％、80％或90％的成熟肝细胞对α抗胰蛋白酶(AAT)呈阳性。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中至少40％、50％或60％的成熟肝细胞对白蛋白呈阳性。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中至少70％、80％或90％的成熟肝细胞对白蛋白呈阳性。
55.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其还包括在间充质干细胞(MSC)、巨噬细胞、内皮细胞或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基存在下共培养所述成熟肝细胞。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其还包括按照3D聚集体的方式冷冻保存所述成熟肝细胞。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述肝细胞是人的肝细胞。
58.组合物，其包含至少90％对AAT呈阳性和/或至少80％对白蛋白呈阳性的肝细胞。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述组合物不含异种蛋白、不含饲养层、不含条件培养基并且是成分确定的。
60.治疗患有肝病的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的通过根据权利要求1-57中任一项所述的方法产生的肝细胞。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述肝病是急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中施用包括肝细胞移植。
63.用于预测毒理学的平台，其包含通过根据权利要求1-57中任一项所述的方法产生的肝细胞。
64.组合物，其包含通过根据权利要求1-57中任一项所述的方法产生的肝细胞。
65.根据权利要求64所述的组合物用于治疗受试者的肝病的用途。
66.根据权利要求64所述的组合物用于肝病建模的用途。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述肝病是非酒精性脂肪性脂肪性肝炎(NASH)。
68.根据权利要求64所述的组合物用于药物发现的用途。
69.根据权利要求68所述的用途，其中所述药物发现鉴定NASH、急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害的靶。
70.进行基于甲基化的分析以鉴定用于治疗疾病的候选剂的方法，其中所述方法包括对根据权利要求64所述的组合物进行基于组学的分析。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述疾病是NASH、急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害。
72.进行高通量筛选以鉴定治疗剂的方法，其包括将根据权利要求1-57中任一项所述的方法衍生的成熟肝细胞的3D聚集体与多种候选剂接触并测量所述成熟肝细胞的功能。
73.根据权利要求72所述的方法，其中与MSC、巨噬细胞、内皮细胞或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基共培养所述成熟肝细胞的3D聚集体。
74.根据权利要求72所述的方法，其中在不存在其他细胞类型的情况下培养所述成熟肝细胞的3D聚集体。
75.肝病体外模型，其包含根据权利要求1-57中任一项衍生的成熟肝细胞。
76.根据权利要求75所述的模型，其中与MSC、巨噬细胞、内皮细胞或补充有一种或多种Src激酶抑制剂的MSC条件培养基共培养所述成熟肝细胞。
77.根据权利要求75所述的模型，其中在不存在其他细胞类型的情况下培养所述成熟肝细胞。
78.根据权利要求75-77中任一项所述的模型，其中所述肝病是急性肝病、慢性肝病或遗传性肝功能损害或脂肪性肝病。
79.根据权利要求75-78中任一项所述的模型，其中所述脂肪性肝病是NASH。
80.根据权利要求75-79中任一项所述的模型，其中所述成熟肝细胞在用脂肪酸处理后经历脂质沉积。
81.根据权利要求80所述的模型，其中所述脂肪酸是油酸和/或亚油酸。
82.根据权利要求75-81中任一项所述的模型，其中所述肝病是肝纤维化。
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