KR20220007879A - 간세포 생성 방법 - Google Patents

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이고르 구레비치
사라 버튼
크리스티 문
매들린 고드랜드
캐서린 치시즈
디피카 라제쉬
마키코 오오시마
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
후지필름 홀딩스 아메리카 코포레이션
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Abstract

본 발명은 유도된 만능 줄기 세포로부터 간세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명은 간 질환의 치료를 위한 간세포를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

간세포 생성 방법
본 출원은 2019년 5월 9일자로 출원된 미국 가특허 출원 62/845,623 및 2020년 5월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 62/022,257의 우선권을 주장하며, 상기 출원 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)를 간세포로 유도 분화하는 방법에 관한 것이다.
포유류에서 간은 단백질 합성, 대사, 해독 및 배설을 포함하는 다양한 기능을 위한 중추적 역할을 수행한다. 단리된 간 세포에서 이들 기능 전부 또는 대부분의 재현이 주요 과제이다. 생존 가능하고 기능성 간세포의 가용성은 약리학적 및 독성학적 평가에 매우 유익할 것이며, 질환의 병태생리학적 분석을 위한 세포 모델을 생성하고, 생체 인공 간 지지체 및 간의 재생 치료요법을 생성한다. 동소 간 이식은 거의 모든 간 기능을 대체할 수 있고, 급성 및 만성 간부전, 및 크리글러 나자르(Crigler-Najjar) 증후군 1형, 알파-1 항트립신 결핍증, 원발성 고옥살산뇨증 등과 같은 단일유전자 간 질환 환자를 구제할 수 있다.
간 이식은 강력하고 비용이 많이 드는 절차이며, 간의 즉각적인 이용 가능성에 의존하기 때문에, 간세포 이식은 이러한 많은 장애에 대한 기관 이식에 대한 최소의 침습적 대안으로서 연구되고 있다. 그러나, 일반적으로 기관 이식을 위해 우선시 되는 공여자 간의 심각한 단축은 1차 간세포를 단리하기 위해 사용 가능한 간의 가용성을 급격히 제한한다. 이러한 문제는 1차 간세포가 배양 중에 기능이 급격히 악화되고, 냉동보존 후 이들의 생존률이 상당히 가변적이라는 사실에 의해 복잡해진다. 따라서, 사람 간세포의 대안적 재생 가능한 공급원이 크게 필요하다. 조직 줄기 세포, 예를 들어, 중간엽 및 조혈 줄기 세포, 간 전구 세포 및 만능 줄기 세포는 사람 간세포의 공급원으로서 평가되고 있다. 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 간세포로 분화시키는 방법에 대한 요구가 충족되지 않는다.
제1 구현예에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하여 간세포를 생성하는 방법을 제공한다: (a) 만능 줄기 세포(PSC)를 GSK-3 억제제의 존재하에 배양하여 예비-조건화된(pre-conditioned) PSC를 제공하는 단계; (b) 상기 예비-조건화된 PSC를 최종 내배엽(definitive endoderm)(DE) 세포로 분화시키는 단계; (c) 상기 DE 세포를 배양하여 간모세포의 형성을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 간모세포를 간세포로 분화시키는 단계. 특정 양상에서, PSC는 유도성 만능 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 양상에서, 상기 방법은: (a) iPSC를 GSK-3 억제제의 존재하에 배양하여 예비-조건화된 iPSC를 제공하는 단계; (b) 상기 예비-조건화된 iPSC를 최종 내배엽(DE) 세포로 분화시키는 단계; (c) 상기 DE 세포를 배양하여 간모세포의 형성을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 간모세포를 간세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 간세포는 사람이다.
특정 양상에서, iPSC는 1 내지 3일 동안, 예를 들어, 1, 2 또는 3일 동안 예비-조건화된다. 일부 양상에서, GSK3 억제제는 CHIR99021, BIO, SB216763, CHIR98014, TWS119, SB415286 및 티데글루십이다. 일부 양상에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이다. 특정 양상에서, CHIR99021은 1 내지 5μM, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5μM의 농도로 존재한다. 특정 양상에서, iPSC는 아스코르브산이 본질적으로 부재이거나 부재인 배지에서 예비-조건화된다.
일부 양상에서, 단계 (a) 내지 (d) 중 하나 이상은 이종-부재(xeno-free) 조건, 피더-부재(feeder-free) 조건 또는 조건화된-배지 부재 조건하에 수행된다. 특정 양상에서, 단계 (a) 내지 (d) 각각은 이종-부재 조건, 피더-부재 조건 또는 조건화된-배지 부재 조건하에 수행된다. 일부 양상에서, 이종-부재 조건은 한정된 배지를 사용함을 포함한다.
일부 양상에서, DE 세포로의 분화는 액티빈 A를 포함하는 제1 내배엽 유도 배지(EIM), BMP4, VEGF, 및 bFGF를 포함하는 제2 EIM, 및 VEGF 및 DMSO를 포함하는 제3 EIM에서 iPSC를 순차적으로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, DE 세포로의 분화는 8 내지 10일 동안, 예를 들어, 8, 9 또는 10일 동안이다. 특정 양상에서, DE 세포는 CXCR4, CD117, FOXA1, FOXA2, EOMES 및/또는 HNF4α에 대해 양성이다.
특정 양상에서, 단계 (c)는 DE 세포를 HGF, BMP4, FGF10, FGF2, VEGF, EGF, 덱사메타손, 및/또는 DMSO를 포함하는 간세포 유도 배지(hepatocyte induction media)(HIM)에서 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 단계 (c)는 DE 세포를 BMP4, HGF, 및 FGF10을 포함하는 HIM에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 단계 (c)는 DE 세포를 HGF, BMP4, FGF10, FGF2, VEGF, EGF, 덱사메타손, 및/또는 DMSO를 포함하는 HIM에서 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, HGF는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30ng/mL과 같은 20 내지 30ng/mL의 농도로 존재한다. 일부 양상에서, 유도는 5 내지 7일, 예를 들어, 5, 6 또는 7일 동안이다.
일부 양상에서, 상기 방법은 간모세포를 유도한 후 응집물을 형성하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 단계 (a) 및 (b)는 응집물이 본질적으로 부재한다.
특정 양상에서, 세포는 세포외 매트릭스 상에서 배양된다. 일부 양상에서, 세포외 매트릭스는 MATRIGEL®, 콜라겐 I, 또는 라미닌이다. 특정 양상에서, 세포외 매트릭스는 MATRIGEL®이다. 일부 양상에서, 세포외 매트릭스는 뮤린 엔겔브레쓰-홀름-스웜 종양(murine Engelbreth-Holm-Swarm tumor)으로부터 정제된 기저막 추출물(basement membrane extract)(BME)이다. 특정 양상에서, 세포외 매트릭스는 GELTREX™이다.
일부 양상에서, 간모세포는 단계 (d) 전에 분해된다. 특정 양상에서, 분화 단계는 bFGF, HGF, 온코스타틴 M, 및 DMSO를 포함하는 간세포 분화 배지(hepatocyte differentiation media)(HDM)에서 간모세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, HDM은 GSK3 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, HDM은 VEGF 및 EGF가 본질적으로 부재한다. 일부 양상에서, 단계 (d)의 분화는 8 내지 10일, 예를 들어, 8, 9 또는 10일 동안이다.
특정 양상에서, 단계 (a) 내지 (c)는 저산소 조건하에 수행된다. 일부 양상에서, 단계 (d)는 제1 분화 기간 동안 저산소 조건하에 그리고 제2 분화 기간 동안 정상산소 조건하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 제1 분화 기간 및 제2 분화 기간은 각각 3 내지 5일, 예를 들어, 3, 4, 또는 5일이다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 간세포를, 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함하는 성숙화 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 간세포는 성숙화 동안에 콜라겐 I 상에서 배양한다. 다른 양상에서, 간세포는 MATRIGEL®, 콜라겐 I, 라미닌, 뮤린 엔겔브레쓰-홀름-스웜 종양으로부터 정제된 기저막 추출물(BME) 또는 GELTREX™ 상에서 배양한다.
일부 양상에서, 성숙화 배지는 SRC 키나아제 억제제를 추가로 포함한다. 특정 양상에서, SRC 키나아제 억제제는 보수티닙, 다사티닙, A419259, 알스테르파울론, AZM475271, AZM475271, 또는 PP1이다. 특정 양상에서, 성숙화 배지는 EPO를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 성숙화 배지는 γ-세크레타제 억제제를 추가로 포함한다. 예를 들어, γ-세크레타제 억제제는 DAPT이다. 특정 양상에서, 성숙화 배지는 TGFβ 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, TGFβ 억제제는 SB431542, SB525334, SB431542-505124, Lefty, A 83-01, D 4476, GW 788388, LY 364847, R 268712, 또는 RepSox이다. 예를 들어, TGFβ 억제제는 SB431542이다. 특정 양상에서, 성숙화 배지는 PD0325901과 같은 MEK 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, MEK 억제제는 PD0325901, GSK1120212, MEK162, RDEA119 및 AZD6244이다. 특정 양상에서, 성숙화 배지는 EPO, IGF1, IGF2, 및/또는 TGFα를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 성숙화 배지는 항아폽토틱(antiapoptotic) 화합물 XMU-MP1을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 성숙화 배지는 FH1, FPH1, 및/또는 메톡사민(예를 들어, 15μM FH1, 15 FPH1, 및 1μM 메톡사민)을 추가로 포함한다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 CD133-양성 세포에 대해 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 성숙한 간세포의 적어도 70%, 80% 또는 90%는 알파 항 트립신(alpha anti trypsin)(AAT)에 대해 양성이다. 특정 양상에서, 성숙한 간세포의 적어도 40%, 50% 또는 60%는 알부민에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 성숙한 간세포의 적어도 70%, 80% 또는 90%는 알부민에 대해 양성이다.
일부 양상에서, 상기 방법은 상기 성숙한 간세포를, 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지의 존재하에 성숙한 간세포를 동시 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 상기 성숙한 간세포를, 대식세포의 존재하에 Src 키나아제 억제제와 동시 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 상기 성숙한 간세포를, 내피 세포(MSC)의 존재하에 하나 이상의 Src 키나아제 억제제와 함께 동시 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 상기 성숙한 간세포를, MSC, 대식세포 및 내피 세포의 존재하에 하나 이상의 Src 키나아제 억제제와 함께 동시 배양하여, 간 오가노이드(organoid)를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 양상에서, 방법은 성숙한 간세포를 응집물로서 냉동보존시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 간세포를 포함하는 조성물이 제공되고, 적어도 90% (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%)는 AAT에 대해 양성이고/이거나 적어도 80%는 알부민에 대해 양성이다. 일부 양상에서, 조성물은 이종-부재, 피더-부재, 조건화된-배지 부재이며 한정되어 있다.
추가의 구현예에서, 본 구현예에 의해 생성된 유효량의 간세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 간 질환은 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상이다. 특정 양상에서, 투여 단계는 간세포 이식을 포함한다.
본원에는 추가로 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 간세포를 포함하는, 예측 독성학을 위한 플랫폼이 제공된다.
본원에는 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 간세포를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 또한 본원에는 대상체에서 간 질환의 치료에 사용하기 위한 본원의 구현예의 방법에 의해 생성된 간세포를 포함하는 조성물이 제공된다. 추가의 구현예는 대상체에서 간 질환의 치료에 사용하기 위한 본원의 간세포의 조성물을 포함한다. 추가의 구현예는 질환 모델링 또는 약물 발견에 사용하기 위한 조성물을 포함한다. 일부 양상에서, 간 질환은 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic fatty steatohepatitis)(NASH)이다. 특정 양상에서, 약물 발견은 NASH, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상에 대한 표적을 동정한다.
또 다른 구현예는 질환의 치료를 위한 후보 제제(candidate agent)의 동정을 위한 메틸화-기반 분석을 수행하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원의 구현예의 조성물에 대해 오믹스(omics)-기반 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 상기 질환은 NASH, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상이다.
추가의 구현예는 고속처리 스크리닝을 수행하여 치료적 제제를 동정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원의 구현예의 방법에 따라 유래된 성숙한 간세포의 3D 응집물을 다수의 후보 제제들과 접촉시키는 단계 및 상기 성숙한 간세포의 기능을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 성숙한 간세포의 3D 응집물은 MSC, 대식세포, 내피 세포, 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지와 동시 배양된다. 다른 양상에서, 성숙한 간세포의 3D 응집물은 다른 세포 유형의 부재하에 배양된다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 구현예에 따라 유래된 성숙한 간세포를 포함하는, 간 질환의 시험관내 모델이 제공된다. 일부 양상에서, 성숙한 간세포는 MSC, 대식세포, 내피 세포, 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지와 동시 배양한다. 특정 양상에서, 성숙한 간세포는 다른 세포 유형의 부재하에 배양한다. 특정 양상에서, 간 질환은 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상, 또는 지방 간 질환이다. 특정 양상에서, 지방 간 질환은 NASH이다. 일부 양상에서, 성숙한 간세포는 지방산으로 처리 시 자발적 지질증과 같은 지질증을 진행시킨다. 특정 양상에서, 지방산은 올레산 및/또는 리놀레산이다. 일부 양상에서, 간 질환은 간 섬유증이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
하기의 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 양상들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: iPSC의 최종 내배엽으로의 분화를 위한 간세포 분화 과정의 초기 계통 사양을 도시하는 도식.
도 2: 간모세포의 유도를 위한 간세포 분화의 단계 1을 도시하는 도식.
도 3: 간세포 분화 과정의 단계 2를 도시하는 도식.
도 4: 간모세포의 성숙화를 위한 간세포 분화 과정의 단계 3을 도시하는 도식.
도 5: 간세포 분화를 위한 변형된 프로토콜의 도식. iPSC는 MATRIGEL® 코팅된 플레이트 상에 씨딩하고, 2일 동안 확장시키고, 이어서 2일 동안 CHIR99021로 예비-조건화하였다. 최종 내배엽(DE) 세포로의 전환은 0일째 (T0) 배지에 세포를 위치시키고, 이어서 배지에서 1, 2일(T1-T2)에 순차적 변화시키고, 이어서 세포를 10일의 과정 때까지 T3-T6 배지에 세포를 위치시킴으로써 착수한다. DE 유도 말기에, 세포는 DE 마커 CXCR4 및 CD117에 대해 샘플 채취한다. 세포는 세포를 6일 동안 단계 1에 위치시킴으로써 간모세포 단계로 조정한다. 단계 1의 말기에, 세포는 냉동보존될 수 있거나 추가로 간세포로 전환될 수 있다. 간세포로의 분화 단계 2는 3차원 (3D) 또는 2차원 (2D) 포맷으로 수행된다. 단계 1 세포를 수거하고 응집물을 형성하도록 방치하고 세포는 8일 동안 CHIR99021이 보충된 단계 2 배지에서 유지시킨다. 단계 2의 말기에, 세포는 알파-1 항트립신(AAT) 순도에 대해 샘플 채취하고, 냉동보존하거나 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에 직접 분주하고, 여기서, 간세포 성숙화는 단계 3 동안에 발생하여 AAT 및 알부민(ALB) 둘 다를 발현하는 세포를 유도한다. 전체 분화 과정은 세포가 정상산소 상태로 전환되는 경우, 단계 2 중반까지 저산소 조건에서 발생한다.
도 6: 표 1에 기재된 02E1 및 01D1 비알코올성 지방간염(NASH) iPSC에서 2일 동안 CHIR 예비-조건화 후 만능 및 최종 내배엽(DE) 유도로부터 이탈: (좌측) DE 유도 단계 말기에 DE 마커 CXCR4(y-축) 및 CD117(x-축) 및 만능 마커 TAR1-81에 대한 FACS 분석; (우측) 각각의 유전자에 대해 사용된 2개의 상이한 프로브를 사용한 과정 전반에 걸친 만능 유전자 POU5F1 및 NANOG에 대한 qPCR.
도 7a 내지 도 7c: CHIR99021 예비-조건화 존재 또는 부재하에 CXCR4/CD117, AAT, 또는 TRA181의 발현에 의한 간세포 분화 과정 동안에 세포의 특징 분석. 최종 내배엽의 말기에서 및 간세포 분화 과정의 단계 2의 말기에서 정상 (54A) 및 NASH 특이적 iPSC 세포주(02E1)에서 CHIR99021 예비-조건화의 2 또는 4일의 효과 평가. 정상 및 NASH iPSC 세포주에서 최종 내배엽의 말기에 CXCR4/CD117(도 7a) 및 TRA-181(도 7b) 순도의 정량. 정상 및 NASH iPSC 세포주에서 단계 2 간세포 분화의 말기에 AAT 순도의 정량(도 7c).
도 8a 내지 도 8d: CHIR99021 예비-조건화의 존재 또는 부재하에 분화의 단계 3 동안에 AAT 또는 알부민 발현에 대한 양성 세포의 퍼센트. 간세포 분화 과정의 생 단계 3의 말기에서 (도 17에 기재된 바와 같이) 정상 (54A) 및 NASH 특이적 iPSC 세포주(02E1)에서 CHIR 예비-조건화의 지속기간의 효과 평가. 정상 iPSC 세포주에서 단계 3의 말기에서 AAT(도 8a) 및 알부민 순도(도 8d)의 정량. 정상 (54A) 및 NASH 특이적 (02E1) iPSC에서 단계 3의 말기에서 AAT(도 8a, 8b) 및 알부민 순도(도 8c, 도 8d)의 정량.
도 9: 다양한 시간 동안, 및 AAT 순도에 대한 간세포 분화 프로토콜 동안에 다양한 지속 기간 동안 CHIR99021 보충의 효과. 간 분화 과정의 단계 2에서 CHIR99021 처리 후 AAT 양성 간세포 출현의 동력학. NASH (01D1 및 02E1) 특이적 iPSC에서 간세포 분화의 단계 2에서 CHIR99021 보충과 함께 AAT 순도에서의 증가. FAC 플롯은 단계 1의 말기(EoS1)에 및 간세포 분화의 단계 2 동안에 지정된 시점(2일, 4일, 6일 및 8일)에서 AAT 발현 배양물의 순도를 정량한다.
도 10: 다양한 시간 동안에 CHIR99021 보충 및 간세포 분화 프로토콜 동안에 다양한 지속기간의 아시아당단백질(asiaglycoprotein) 수용체 1(ASGPR) 순도에 대한 효과. 간 분화 과정의 단계 2에서 CHIR99021 처리 후 ASGPR 양성 간세포 출현의 동력학. 정량된 NASH 특이적 (01D1 및 02E1) iPSC에서 간세포 분화의 단계 2에서 CHIR99021 보충과 함께 ASGPR 순도에서의 증가. FAC 플롯은 단계 1의 말기(EoS1)에 및 간세포 분화의 단계 2 동안에 지정된 시점(2일, 4일, 6일 및 8일)에서 수거된 ASGPR 발현의 순도를 도시한다.
도 11a 내지 도 11e: 간세포 분화 프로토콜 동안에 CHIR99021 보충은 상이한 세포주에 걸쳐 유리하다. 분화 단계 2 동안에 CHIR99021의 첨가는 AAT 순도에 영향을 끼치지 않고 세포 증식 및 AAT-양성 세포 수율을 증가시킨다. 정상(54A) 및 2 NASH 특이적 iPSC 세포주(89F 및 01D1)는 3μM CHIR99021의 존재 또는 부재하에 분화시켰다. CHIR99021 치료의 지속기간은 단계 1(S1 D4 CHIR)의 4일째에, 단계 2(S2 D1 CHIR)의 초기, 또는 단계 2(S2 D3 CHIR)의 3일째에 개시하였다. AAT의 총 생존 세포수 및 순도를 정량하였다. 단계 1의 말기에 간모세포가 2단계 말기(E0S2)에 AAT 양성 간세포로의 전환 효율(도 11a), 단계 2의 말기(EoS2)에서 세포수(도 11b) 및 단계 2의 말기에 AAT 양성 세포의 수(수율) (도 11c), 및 이와 함께 NASH (01D1) (도 11d) 및 정상(54A) (도 11e) iPSC에서 출현 간세포 배양물의 형태적 외관의 캡쳐.
도 12: 분화 동안에 지정된 시점에서 세포로부터 추출된 RNA를 사용한 qPCR 분석에 의한 간세포 분화 과정 동안에 HNF4a의 분석. 프로모터 1(P1) 또는 프로모터 2(P2)로부터의 전사체를 검출하는 Taqman 프로브가 사용되었다. NASH 특이적 iPSC(02E1 및 01D1) 유래된 간세포로부터 HNF4A 전사 프로파일은 성인 사람 간(Invitrogen)으로부터의 총 RNA와 비교한다.
도 13: 분화 단계 3 동안에 세포 형태의 이미지. 20x 대물(objective)하에 촬영된 단계 2의 말기에서 콜라겐 I 플레이트 상으로 플레이팅한 후 7일째에 촬영된 NASH 특이적(01D1) 간세포의 대표적인 이미지. 주요 간세포 특징인 이핵 세포는 원형으로 나타낸다.
도 14: 분화 단계 3 동안에 간세포의 카복시 디클로로플루오레세인 디아세테이트(CDFDA) 취득의 이미지. 10X 대물하에 촬영된 단계 2의 말기에서 콜라겐 I 플레이트 상으로 플레이팅한 후 7일째에 염료 CDFDA로 염색된 NASH 특이적 (01D1) 간세포의 대표적인 이미지. CDFDA는 무색이지만 간세포에서 이의 절단은 녹색 형광성 대사물 카복시 디클로로플루오레세인(CDF)을 생성하고, 이는 이어서 담세관으로 수송된다. 담세관은 CDF에 의해 가시화된다.
도 15: 알부민 순도를 지적하는 유동 세포측정에 의한 단계 3 간세포의 평가. 각각의 산점도 상에 적색으로 나타낸 양성 세포의 퍼센트(순도)와 함께 분화 3단계 동안에 지정된 시점에 수거된 NASH 특이적(02E1) 간세포에서 AAT (상부) 및 알부민 (하부) 발현을 위한 FACS 분석.
도 16: 성숙화를 지시하는 알부민 발현. 상기 과정의 성숙화 단계(phase)-단계(stage) 3-동안에 NASH 특이적(02E1 및 01D1) 간세포에서 알부민 (ALB) 순도에서의 증가.
도 17: 간세포 분화 과정의 단계 3 동안에 사용된 간세포 성숙화 배지 제형.
도 18: 단계 3 간세포의 AAT 및 알부민 발현 및 형태. NASH 특이적 iPSC 세포주 01D1로부터의 간세포는 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에 해동시키고, CHIR99021의 존재하에 단계 2 분화 배지에 위치시키고, 8일 동안 SB431542 및 DAPT를 함유하는 단계 3 간세포 배지로 옮겼다. 세포는 분화의 단계 3의 말기에 수거하고, AAT 및 알부민의 존재에 대해 염색시켰다. 산점도는 AAT(좌측 상부) 및 알부민(좌측 하부)의 정량을 반영하고, 단계 3의 말기에 세포의 형태는 우측 상에 반영된다.
도 19: 분화의 단계 1에서 냉동보존 후 간세포의 회수. NASH 특이적 iPSC 01D1로부터 유래된 간세포는 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에 해동시키고, 8일 동안 단계 2 간세포 분화 배지에 위치시켰다. 세포는 단계 3 배지의 상이한 제형으로 옮겼다. 대조군 배지는 SB431542 및 DAPT (대조군) (Hep 단계 3B 배지)의 조합물, 또는 성숙화 화합물 및 간세포 기능 및 분화 증진제 FH1 및 FPH1(FH1/FPH1, 각각 15μM), α1-아드레날린작용 수용체 효능제 메톡사민(M, 1μM) 또는 FH1, FPH1, 및 메톡사민(FH1/FPH1/M)의 조합물을 함유하였다. 단계 2의 말기의 순도(ES2, 개방 막대)는 비교로서 나타낸다. 세포는 단계 3 간세포 분화의 말기에 수거하고, AAT 발현에 대해 염색시켰다.
도 20a 내지 도 20f: 분화의 단계 2에서 냉동보존 후 간세포의 회수. NASH 특이적 iPSC 세포주 01D1로부터의 간세포는 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에서 해동시키고, 10일 동안(도 20a 내지 도 20c) SB431542 및 DAPT를 함유하는 단계 3 간세포 A 배지(배지 조성에 대해 도 17 참조)에, 또는 (도 20d 내지 도 20f) 5μM Src 키나아제 억제제를 함유하는 단계 3 간세포 E 배지(배지 조성에 대해 도 17 참조)에 위치시켰다. 세포는 분화의 단계 3의 말기에 수거하고, AAT 및 알부민의 존재에 대해 염색시켰다. 산점도는 단계 3 Hep A 배지에서 AAT(도 20a) 및 알부민(도 20b)의 정량을 반영한다. 산점도는 단계 3 Hep E 배지에서 AAT(도 20e) 및 알부민(도 20f)의 정량을 반영한다. 단계 3 Hep A 배지(도 20a) 및 단계 3 Hep E 배지(도 20d)에서 단계 3의 말기에 세포의 형태.
도 21a 내지 도 21b: 불량한 간세포 분화의 경우 (예를 들어, 질환 배경으로 인해)에 간세포의 정제를 촉진시키는 AAT에 대한 대용 마커의 정제 단계가 필요할 수 있다. AAT 및 ASGPR은 세포내 단백질이고, AAT와 동시 발현된 표면 단백질이 모색된다. CD133은 부분적으로 AAT와 동시 발현하는 것으로서 동정되었고 따라서 세포 분리 전략을 위해 적합한 후보물일 수 있다(도 21a). 다수의 정상(20D, 54A, 및 1505) 및 NASH(24D, 42F, 및 45B) iPSC에 걸친 CD133 및 AAT의 동시 발현을 밝히기 위한 유동 세포측정 플롯(도 21b).
도 22: 중간엽 줄기 세포(MSC)의 부재하에, 즉 단독(좌측, MSC 부재)으로 또는 간세포 배지에 적응된 01D1 MSC(우측, +MSC)와 함께 배양된 NASH 특이적 01D1 간세포의 단계 3 말기의 형태: 상기 과정의 단계 1의 말기에 냉동보존된 간세포는 해동시키고 동시-배양물의 개시 전 표준 프로토콜 하에 단계 2를 통해 배양하고; SB431542/DAPT(표 2)는 조건 둘 다에 대해 배지에 포함시켰다.
도 23: SB431542/DAPT 또는 PP1(Src 키나아제 억제제)의 존재하에 성숙화된 간세포의 단계 3 말기의 형태: 과정의 단계 2의 말기에 냉동보존된 정상(2.038 또는 54A) 또는 NASH 특이적 iPSC(02E1)로부터의 간세포를 해동시키고, 성숙화 배지에서 10μM SB431542/2μM DAPT(SB/DAPT) 또는 5μM PP1(PP1)의 존재하에 간세포 분화의 단계 3을 통해 배양하였다. 해동 후 출현 간세포의 형태는 10X 배율로 캡쳐하였다.
도 24: SB431542/DAPT 또는 PP1 (Src 키나아제 억제제)의 존재하에 성숙화된 간세포의 단계 3 말기의 순도 정량: 정상(2.038, 54A) 및 NASH 특이적 iPSC(02E1)로부터 분화 과정의 단계 2의 말기에 냉동보존된 간세포를 해동시키고, 분화 과정의 단계 3을 통해 배양하고, AAT 및 알부민의 순도는 성숙화 배지에서 10μM SB431542/2μM DAPT (SB/DAPT) 또는 Src 키나아제 억제제 PP1 (PP1)의 존재하에 정량하였다.
도 25: 단계 3 간세포의 말기에 대한 기능성 시토크롬 P450(CYP) 3A4 활성: 명백하게 건강한 정상 iPSC(2.038) 및 2개의 NASH iPSC(01D1 및 02E1)로부터 분화된 단계 3 말기의 간세포는 매일 배지 교환과 함께 3일 동안 간세포 유지 보충 칵테일 B 및 비히클(0.1% DMSO) 또는 50μM 리팜피신(CYP3A4 유도제)을 갖는 윌리엄스 E 배지에서 항온처리하였다. 3일의 말기에, 세포를 해리시키고, 96웰 플레이트(25,000 세포/웰, 조건당 4-6웰)에 분배하고 제조업자의 추천에 따라 발광 P450-Glo CYP3A4 검정 시스템(Promega)을 사용하여 CYP3A4 활성 측정에 적용하였다.
도 26a 내지 도 26d: qPCR에 의한 분화 단계 동안에 간 유전자의 발현의 분석. 간세포 분화 배양물로부터 세포 펠렛은 지정된 단계에서 명백하게 건강한 정상 iPSC(2.038) 및 2개의 NASH iPSC(01D1 및 02E1)로부터 수거하였다. RNA는 추출하고 qPCR 분석을 위해 사용하여 단백질(AAT)을 암호화하는 유전자인 SERPINA1(도 26a), 아시아당단백질 수용체 1을 암호화하는 유전자인 ASGR1(도 26b), ALB(도 26c), 및 CYP3A4(도 26d)의 발현을 정량하기 위한 qPCR 분석을 위해 사용하였다.
도 27: 단계 3의 말기에 간세포에서 세포내 지질 축적. 명백하게 건강한 정상 iPSC(2.038) 및 2개의 NASH iPSC(01D1 및 02E1)로부터 단계 2 말기의 간세포는 콜라겐 I 코팅된 96웰 플레이트 상에 씨딩하고 5일 동안 단계 3 배지 (표 2)에 유지시키고, 배지는 격일로 교환한다. 이어서, 세포는 단계 3 배지(표 2)에 희석된 0, 100, 또는 300μM 지방산(FA, 올레산 및 리놀레산의 조합물)으로 24시간 동안 처리하고, 고정화시키고 Biodipy(녹색)로 염색시켜 액체 액적을 가시화하고 DAPI(청색)로 염색시켜 핵을 가시화하였다. 세포는 20x 대물 하에 공초점 ImageExpress 고함량 이미지화기(Molecular Devices)를 사용하여 이미지화하였다.
도 28a 내지 도 28d: 간 오가노이드의 발육: 간 오가노이드 배양물을 모방하기 위해, 간세포와 대식세포, MSC 및 내피 세포의 동시-배양이 시도되었다. 정상(2.038) 및 NASH 특이적 iPSC(02E1)로부터의 단계 2 말기의 간세포 응집물을 해리시키고, 10μM SB431542 + 2μM DAPT(SB/DAPT) 또는 5μM PP1(PP1)을 갖는 단계 3 배지에 재응집시켰다. 세포는 그들 자체로 응집시키거나, 2.038(정상)에 대해 대식세포, MSC 및 내피 세포와 함께 또는 간세포 단계 3 배지에 적응된 02E1 (NASH)로부터 유래된 대식세포 및 MSC와 함께 응집시켰다. 세포주 둘 다에 대해, 도 28a에 명시된 각각의 개별 세포 유형 및 모든 조합으로 이루어진 응집물이 시도되었다. 정상(2.038) 간세포(Hep), 대식세포(MAC), MSC, 및 내피 세포(endo)의 응집물, 및 모든 4개의 세포 유형(Hep/MAC/MSC/Endo)의 동시 배양물의 대표적인 이미지는 도 28b에 도시된다. NASH 특이적 02E1 간세포(Hep), 대식세포(MAC) 및 MSC의 응집물, 및 모든 3개의 세포(Hep/MAC/MSC) 유형의 동시 배양물의 대표적인 이미지는 도 28c에 도시된다. 모든 이미지는 4x 대물하에 IncuCyte 고함량 이미지화기(Essen BioScience)를 사용하여 취득하였다. 단계 3 말기 동시 배양 응집물의 알부민 분비의 정량은 (도 28d)에 도시한다. 정상(2.038) 및 NASH 특이적(02E1) iPSC로부터 유래된 단계 2 말기의 간세포 응집물은 해리시키고, 단계 3 배지(표 2)에서 그들 자체(간세포)에 의해 또는 동일한 세포주로부터 유래된 대식세포, MSC 및 내피 세포(동시-배양물)와 함께 재응집하였다. 수득한 응집물은 10일 동안 10μM SB431542 + 2μM DAPT(SB/DAPT) 또는 5μM PP1(PP1)가 보충된 단계 3 배지에서 유지시키고, 완전한 배지는 격일로 교환한다. 마지막 교환(8 내지 10일)으로부터의 배지를 수거하고 분비된 알부민은 제조업자의 지침에 따라 사람 알부민 ELISA를 사용하여 측정하였다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)로부터의 간세포의 생성을 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 iPSC를 간모세포를 형성하도록 유도되고, 이어서 간세포로 분화되는 내배엽 계통 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 방법은 만능으로부터 이들의 이탈을 촉진시키고 다운스트림 분화를 개선시킴으로써 최종 내배엽(DE) 세포로의 분화를 위해 세포를 예비-조건화시키기 위해 GSK3 억제제의 존재하에 iPSC를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 초기에, iPSC는 내배엽 유도 배지에서 DE 세포로 분화될 수 있다. iPSC는 MATRIGEL® 상에서와 같이 2차원 배양물에서 배양될 수 있고, 이어서, DE 세포는 간모세포 유도의 말기에 3차원 응집 배양물로 전달될 수 있다. 세포는 간모세포의 유도 및 간세포로의 분화를 포함하는 과정의 단계 2 동안에 GSK3 억제제의 존재하에 배양될 수 있다. 단계 3에서, 간세포는 세포 형태를 개선시키기 위해 TGFβ 억제제 및 γ-세크레타제 억제제의 존재하에 성숙화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포는 질환 모델링, 약물 발견 및 재생 의학을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 광범위한 간 질환에 대한 새로운 치료의 개발, 예측 독성학에 대한 플랫폼의 확립 및 섬유증, 지방증 및 바이러스 감염과 같은 질환의 시험관내 모델의 생성을 위한 모델 시스템을 포함하는 광범위한 적용을 위해 간세포를 제공한다. 추가로, 본원에 기재된 방법을 사용하여 간기능의 급성, 만성 또는 유전적 손상으로 인해 상기 치료요법을 필요로 하는 대상체에게 특정 정도의 간 기능을 복구하기 위해 간세포 이식의 임상적 적용에 사용하기 위한 간세포를 유도할 수 있다.
I. 정의
본원 명세서에 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구범위(들)에 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용되는 경우 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "또 다른"이라는 말은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
용어 "본질적으로"는 방법 또는 조성물이 단지 특정 단계 또는 물질 및 상기 방법 및 조성물의 기본 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.　
본원에 사용된 바와 같이, 특정 물질 또는 재료가 "실질적으로 없는" 조성물 또는 배지는 물질 또는 재료를 ≤　30%, ≤　20%, ≤　15%, 보다 바람직하게 ≤　10%, 보다 더 바람직하게 ≤　5%, 또는 가장 바람직하게 ≤　1%로 함유한다.　
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로" 또는 "대략적으로"는 이것이 관련된 기본 기능에서의 변화를 유도하지 않고 허용 가능하게 다양할 수 있는 임의의 정량 비교, 값, 측정 또는 다른 대표적인 것을 변형시키기 위해 적용될 수 있다.
용어 "약"은 일반적으로 기술된 값을 측정하기 위한 표준 분석적 기술을 사용하여 결정된 바와 같이 기술된 값의 표준 편차 내에 있음을 의미한다.　 상기 용어는 또한 기술된 값의 + 또는 - 5%를 언급함으로써 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 특정 성분 어떠한 것도 의도적으로 조성물 내로 전혀 조제하여 넣지 않았고/않았거나 해당 특정 성분이 오염물로서만 존재하거나 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 초래된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
"치료" 또는 "치료하는"은 (1) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 억제하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상의 추가 진행을 저지하는 것), (2) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 질환을 개선하는 것 (예를 들어, 병리 및/또는 증상을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 대상체 또는 환자에서 임의의 측정가능한 감소를 달성하는 것을 포함한다.
"예방학적으로 치료하는"은 다음을 포함한다: (1) 질환의 위험에 처할 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 발병을 억제하는 것, 및/또는 (2) 질환의 위험에 있을 수 있고/있거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환의 임의 또는 모든 병리 또는 증상을 경험하지 않았거나 나타내지 않는 대상체 또는 환자에서 질환의 병리 또는 증상의 발병을 지연시키는 것.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자" 또는 "대상체"는 살아 있는 포유동물 유기체, 예를 들어, 사람, 원숭이, 소, 말, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니아 피그 또는 이들의 형질전환 종을 지칭한다. 특정 구현예에서, 환자 또는 대상체는 영장류이다. 사람 환자의 비제한적인 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.
해당 용어가 명세서 및/또는 청구항에서 사용되는 용어 "효과적인"은 원하거나 예상되거나 의도된 결과를 달성하기에 적절한 것을 의미한다. 환자 또는 대상체를 화합물로 치료하는 문맥에서 사용될 때의 "유효량", "치료적 유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 상기 화합물의 양이 질환을 치료하거나 예방하기 위해 대상체 또는 환자에게 투여될 때 상기 질환의 치료 또는 예방에 영향을 미치는데 충분한 양임을 의미한다.
본원서 일반적으로 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 적합하고, 사람 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 제형을 지칭한다.
"유도성 만능 줄기 세포(iPSC)"는 인자들 (본원에서 재프로그래밍 인자로 지칭함) 조합의 발현 또는 그 발현을 유도함으로써 체세포를 재프로그래밍하여 생성된 세포이다. iPSC는 태아, 출생후, 신생, 발육기, 또는 성체 체세포를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4(Oct 3/4로도 언급됨), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28을 포함한다. 일부 구현예에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "간세포"는 성숙한 간세포의 모든 특징은 아니지만 일부를 나타내는 간세포 유사 세포, 및 형태, 마커 발현 및 시험관내 및 생체내 기능성 검정에 의한 결정시 간세포의 모든 특징을 갖는 성숙하고 완전한 기능성의 간세포를 포함하는 것으로 의미된다. 간세포는 성숙한 간 유전자를 발현할 수 있고 특정 태아 간세포 및 배아 내배엽 유전자의 발현이 부재일 수 있다. 간세포는 간 기능의 효소적 측정에 의해 특징 분석될 수 있다. 특정 양상에서, 본원의 줄기 세포 유래된 간세포는 하기 중 하나 이상을 포함하는, 완전한 범위의 성숙한 간세포 기능을 할 수 있다: 성숙한 간세포 유전자 발현의 분석 - 유전자 어레이 및 qPCR(예를 들어, 알파-1-항트립신, Cyp3a4); 태아 간세포, 내장 내배엽 및 비-실질조직 간 세포 유전자 발현의 양의 정량적 평가 - (예를 들어, Afp, Sox7, Ck19, Cd24a); 생체이물 및 내인성 물질(호르몬 및 암모니아)의 대사; 알부민, 응고 인자, 보체, 수송 단백질, 담즙, 지질 및 지질단백질의 합성 및 분비; 글루코스(글리코겐), 지방 가용성 비타민 A, B12, D, E, K, 폴레이트, 구리 및 철의 저장; UGT1A1을 평가함에 의한 (임상적) 글루쿠로니드화 경로의 존재 및 활성; 글루코스-6-포스파타제(G6P) 및 PEPCK의 존재에 의한 활성 당생성작용(gluconeogenesis); 활성 우레아 생성작용(ureagenesis) - 암모니아 해독 및 우레아 사이클 유전자 발현; 및/또는 간세포가 간문맥/비장 감염을 통해 생체내 간에 재집단화할 수 있는지의 결정.
용어 "세포외 매트릭스 단백질"은 주변 세포에 구조적 및 생화학적 지지를 제공하는 분자를 지칭한다. 세포외 매트릭스 단백질은 재조합일 수 있고 또한 이의 단편 또는 펩타이드를 지칭한다. 예로 콜라겐 및 헤파린 설페이트를 포함한다.
"3차원(3-D) 배양"은 인공적으로 생성된 환경을 지칭하고, 여기서, 생물학적 세포는 모든 3차원에서 성장하도록 허용되거나 이들의 주변과 상호작용하도록 허용된다. 3-D 배양물은 생물반응기, 세포가 구형으로 성장하는 소형 캡슐 또는 비-접착 배양 플레이트와 같은 다양한 세포 배양 컨테이너에서 성장할 수 있다. 특정 양상에서, 3-D 배양물은 스캐폴드가 부재한다. 대조적으로, "2차원 (2-D)" 배양물은 접착 표면 상에 단층과 같은 세포 배양물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "최종 내배엽(DE)" 및 최종 내배엽 세포 (DE-세포)는 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 단백질 또는 유전자 발현을 나타내는 세포 및/또는 최종 내배엽의 세포에 전형적인 형태 또는 최종 내배엽의 세포와 유사한 유의적인 세포 수를 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 양상에서, 생성된 최종 내배엽 세포 또는 세포 집단은 EOMES, FOXA1, FOA2, SOX17, CXCR4, GSC, FGF17, VWF, CALCR, FOXQ1, CMKOR1 및 CRIP1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
II. 간세포의 생성
특정 구현예에서, 본 개시내용은 iPSC와 같은 만능 줄기 세포(iPSC)로부터의 간세포의 생성에 관한 것이다. 간세포의 생성을 위한 분화 과정은 iPSC를, 간모세포를 형성하도록 유도되고, 이어서 간세포로 분화되는 DE 세포로 분화시킴을 포함한다.
PSC, 예를 들어 iPSC는 일반적으로 하나 이상의 세포 부착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 상에 배양하여 세포 생존력을 유지하면서 세포 부착을 촉진시킨다. 예를 들어, 바람직한 세포 부착 단백질로는 만능 세포 성장을 위한 고형 지지체를 제공하는 수단으로 배양 표면을 코팅하는데 사용될 수 있는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. "세포외 매트릭스(ECM)"라는 용어는 당업계에 인지되고 있다. 이의 성분들로는 하나 이상의 하기의 단백질을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 연결 단백질, 골 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 언둘린, 에필리그린 및 칼리닌. 다른 ECM 성분들은 접착용 합성 펩타이드(예를 들어, RGD 또는 IKVAV 모티프), 합성 하이드로겔(예를 들어, PEG, PLGA, 등) 또는 천연 하이드로겔, 예를 들어, 알기네이트를 포함할 수 있다. 예시적인 방법에서, PSC는 내배엽 유도의 말기 때까지와 같은 MATRIGEL®로 코팅된 배양 플레이트 상에서 또는 예를 들어, 단계 2 동안에 콜라겐 상에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 세포 부착 단백질은 사람 단백질이다.
iPSC를 간세포 또는 간세포 유사 세포로 분화시키는 일반적인 단계적 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원의 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 첸 등(Chen et al.)은 내배엽 유도를 위한 액티빈 A, Wnt3a, 및 HGF와 함께 세포를 배양하는 방법을 기재하고; 이어서 세포는 녹아웃 DMEM에서 배양하고, 이어서 온코스타틴 M 및 덱사메타손으로 성숙화시켰다(Chen et al., 2012). 또 다른 방법에서, iPSC는 액티빈 A, BMP4, 및 FGF2의 존재하에 DE로 분화시키고; 세포는 BMP4 및 FGF2에서 특정 간 내배엽으로 추가로 배양하고; 이어서, HGF에서 배양하여 미성숙한 간세포를 유도하고; 이어서 OSM에서 배양하여 성숙한 간세포를 생성한다(Mallanna and Duncan, 2013). 추가의 방법은 iPSC를 액티빈 A와 함께 배양하여 DE를 유도함을 포함하고, 세포는 이어서 KO- 혈청 대체 배지에서 배양하고, 이어서 ROCK 억제제와 함께 배양하여 스페로이드를 형성한다(Ramasamy et al., 2013). iPSC는 액티빈 A, FGF, 및 BMP와 함께 배양하여 DE를 유도할 수 있고, FGF2 및 BMP4와 함께 배양하여 간 전구체 세포를 유도할 수 있고, HGF와 함께 배양하여 미성숙한 간세포를 유도할 수 있고, 이어서 OSM과 함께 배양하여 성숙한 간세포를 생성할 수 있다(Cai et al., 2013).
하나의 특정 방법에서, iPSC는 만능으로부터 이들의 이탈을 촉진시키고 다운스트림 분화를 개선시킴에 의해 최종 내배엽(DE) 세포로의 분화를 위해 세포를 예비-조건화시키기 위해 GSK3 억제제의 존재하에 세포를 배양함에 의해 간세포 분화를 향해 예비-조건화될 수 있다. 초기에, iPSC는 내배엽 유도 배지에서 DE 세포로 분화될 수 있다. iPSC는 MATRIGEL® 상에와 같이 2차원 배양물에서 배양될 수 있고, 이어서, 간모세포는 단계 1의 말기에 3차원 응집 배양물로 전달될 수 있다. 세포는 간모세포의 유도 및 간세포로의 분화를 포함하는 과정의 단계 2 동안에 GSK3 억제제의 존재하에 배양될 수 있다. 단계 3에서, 간세포는 세포 형태를 개선시키기 위해 TGFβ 억제제 및 γ-세크레타제 억제제의 존재하에 성숙화될 수 있다. 대안적으로, 간세포는 SRC 키나아제 억제제 및 임의로 EPO의 존재하에 성숙화될 수 있다. SRC 키나아제 억제제는 보수티닙, 다사티닙, A419259, 알스테르파울론, AZM475271, 또는 AZM475271일 수 있다.
A. 분화 배지
세포외 매트릭스 단백질은 천연 기원일 수 있고, 사람 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있거나, 대안적으로, ECM 단백질은 유전학적으로 가공된 재조합 단백질이거나 또는 천연에서 합성될 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나 또는 천연 또는 가공된 펩타이드 단편의 형태일 수 있다. 세포 배양용 매트릭스에서 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예로는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 이종-부재이다. 예를 들어, 사람 세포를 배양하기 위한 이종-부재 매트릭스에서, 사람 기원의 매트릭스 성분이 사용될 수 있으며, 이 경우 임의의 비-사람 동물 성분들은 배제될 수 있다.
일부 양상에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1ng/mL 내지 약 1mg/mL일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1㎍/mL 내지 약 300㎍/mL이다. 보다 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 5㎍/mL 내지 약 200㎍/mL이다.
세포는 각각의 특정 세포 집단의 성장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로, 세포는 탄소원, 질소원 및 pH를 유지하기 위한 완충액을 포함하는 성장 배지 중에서 배양한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토킨, 항산화제 물질, 피루브산, 완충제 pH 지시제 및 무기염을 포함할 수도 있다. 예시적인 성장 배지는 줄기 세포 성장을 향상시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어, 비필수 아미노산 및 비타민이 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예는 최소 필수 배지 이글(MEM) 알파 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 성장 배지는 본원에서 배양액 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제제로 지칭되는 "녹아웃 혈청 대체물"을 포함할 수 있다. KNOCKOUT™ 혈청 대체물은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 2002/0076747에 개시되어 있다. 바람직하게는, PSC는 완전 합성되고 피더가 없는 배지 중에서 배양된다.
일부 구현예에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대용물로는 알부민(예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물을 적절하게 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제특허 공보 WO 98/30679에 개시된 방법으로 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 KNOCKOUT™ 혈청 대체물(KSR), 화학적으로 한정된 지질 농축물(Gibco) 및 GLUTAMAX™(Gibco)을 포함한다.
다른 배양 조건들은 적절하게 한정될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 특별히 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 세포를 37℃에서 배양한다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 최대, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위일 수 있다.
a. 예비-조건화 배지
iPSC와 같은 PSC는 세포를 약 1, 2 또는 3일 동안 예비-조건화 배지 (PCM)에서 세포를 배양하기 전에 약 1, 2, 3 또는 4일 동안 약 15,000 내지 20,000 세포/㎠의 세포 밀도로 E8 배지에 유지될 수 있다. 예시적인 PCM은 GSK3 억제제, 예를 들어, CHIR99021을 약 1 내지 5μM, 예를 들어, 약 2, 3, 또는 4μM, 특히 약 3μM, 및 예를 들어, 하기 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 3, 3 내지 4, 또는 3 내지 5μM 사이의 모든 범위를 포함한다. PCM은 RPMI1640, 무혈청 분화(SFD) 배지(예를 들어, 약 5 내지 15%, 특히 약 10%), glutaMAX(예를 들어, 약 0.5 내지 5%, 특히 약 1%), 모노티오글리세롤(MTG) (예를 들어, 약 250 내지 750μM, 특히 약 450μM), 및 페니실린 스트렙토마이신(예를 들어, 0.5% 내지 5%, 특히 약 1%)을 추가로 포함할 수 있다. 예비-조건화는 저산소 조건에서 수행될 수 있다.
b. 내배엽 유도 배지
예비-조건화 후, iPSC는 이어서 약 1 또는 2일 동안 제1 내배엽 유도 배지(EIM T0)에서 배양될 수 있다. 예시적인 EIM T0은 RPMI, SFD 배지(예를 들어, 약 5 내지 15%, 특히 약 10%), glutaMAX(예를 들어, 약 0.5 내지 5%, 특히 약 1%), MTG(예를 들어, 약 250 내지 750μM, 특히 약 450μM), 페니실린 스트렙토마이신 (예를 들어, 0.5% 내지 5%, 특히 약 1%), 및 액티빈 A(예를 들어, 10 내지 50ng/mL, 특히 약 20ng/mL)를 포함한다. 특정 양상에서, EIM T0은 아스코르브산이 본질적으로 부재하거나 부재한다.
이어서, 세포는 약 1 또는 2일 동안, 특히 약 2일 동안 제2 EIM(EIM T1-2)에서 배양된다. 예시적인 EIM T1-2는 아스코르브산 (예를 들어, 25 내지 100㎍/mL, 특히 약 50㎍/mL), BMP4(예를 들어, 약 1 내지 5ng/mL, 특히 약 2.5ng/mL), bFGF(예를 들어, 약 1 내지 10ng/mL, 특히 약 5ng/mL), 및 VEGF(예를 들어, 약 10 내지 50ng/mL, 특히 약 10ng/mL)를 갖는 EIM T0 배지를 포함한다.
최종적으로, 세포는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안 제3 EIM (EIM T3-6)에서 배양한다. EIM T3-6은 SFD, BMP4 (예를 들어, 약 1 내지 5ng/mL, 특히 약 2.5ng/mL), bFGF (예를 들어, 약 1 내지 10ng/mL, 특히 약 5ng/mL), VEGF (예를 들어, 약 10 내지 50ng/mL, 특히 약 10ng/mL) 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) (예를 들어, 약 0.1% 내지 1%, 특히 약 0.5%)를 포함할 수 있다. DE 세포로의 분화는 저산소 조건에서 수행될 수 있다. DE 세포는 CXCR4 및 CD117의 양성 발현에 대해, 유동 세포측정 또는 qPCR에 의해 특징 분석될 수 있다.
c. 간모세포 유도 배지 (단계 1)
이어서, DE 세포는 간모세포의 유도에 의해 간세포 분화의 단계 1을 진행한다. DE 세포는 3차원 배양물, 예를 들어, 응집물로, 또는 간모세포를 형성하기 위한 2차원 배양물로서 배양될 수 있다. 간모세포 유도 배지 (HIM 또는 단계 1 배지)는 SFD, BMP4 (예를 들어, 약 25 내지 75ng/mL, 특히 약 50ng/mL), bFGF (예를 들어, 약 5 내지 20ng/mL, 특히 약 10ng/mL), HGF (예를 들어, 약 10 내지 50ng/mL, 특히 약 25ng/mL), VEGF (예를 들어, 약 10 내지 50ng/mL, 특히 약 10ng/mL), 디메틸 설폭사이드(DMSO) (예를 들어, 약 0.1% 내지 2%, 특히 약 1%), 및 FGF-10 (예를 들어, 약 40 내지 100ng/mL, 특히 약 60ng/mL)을 포함할 수 있다.
d. 간세포 분화 배지 (단계 2)
과정의 단계 2는 간모세포의 간세포로의 분화를 포함한다. 간모세포는 본질적으로 단일 세포 현탁액으로 분해될 수 있거나 2D 배양물로서 플레이팅되거나, 세포 현탁액을 사용하여 3D 응집물을 생성할 수 있다. 간세포 분화의 상기 단계는 2D 또는 3D 포맷으로 수행될 수 있다. 간세포 분화 배지(HDM 또는 단계 2)는 SFD, bFGF(예를 들어, 약, 1 내지 20ng/mL, 특히 약 10ng/mL), HGF(예를 들어, 약 50 내지 200ng/mL, 특히 약 100ng/mL), 온코스타틴 M(OSM) (예를 들어, 약 10 내지 30ng/mL, 특히 약 20ng/mL), 덱사메타손(예를 들어, 약 0.01 내지 1μM, 특히 약 0.1μM), DMSO(예를 들어, 약 0.1% 내지 2%, 특히 약 1%), 및 GSK3 억제제, 예를 들어, CHIR99021(예를 들어, 약 1 내지 5μM, 예를 들어, 약 2, 3 또는 4μM, 특히 3μM)을 포함할 수 있다. HDM은 VEGF 및 EGF가 부재일 수 있다. 단계 2 과정은 저산소증에서의 배양에 이어서 정상산소증에서의 배양, 예를 들어, 4일 저산소증 및 4일 정상산소증과 같은 배양을 포함할 수 있다.
e. 간세포 성숙화 배지 (단계 3)
최종적으로, 간세포는 상기 과정의 단계 3 동안에, 예를 들어, 7 내지 10일 동안에 성숙화될 수 있다. 간세포 성숙화 배지(HMM 또는 단계 3 배지)는 윌리엄스 E 배지, B27+ 비타민 A(예를 들어, 약 1% 내지 5%, 특히 약 2%), OSM(예를 들어, 약 10 내지 30ng/mL, 특히 약 20ng/mL), 덱사메타손(예를 들어, 약 0.01 내지 1μM, 특히 약 0.1μM), 및 페니실린 스트렙토마이신(예를 들어, 0.5% 내지 5%, 특히 약 1%)을 포함할 수 있다. HMM은 TGFβ 억제제 및 γ-세크레타제 억제제, 예를 들어, SB431542(예를 들어, 약 1 내지 20μM, 특히 약 10μM) 및 DAPT(예를 들어, 약 1 내지 5μM, 특히 약 2μM)를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, HMM은 SRC 키나아제 억제제 및 EPO를 추가로 포함할 수 있다. 성숙화는 콜라겐 I 상에서와 같이 2차원 배양으로 수행될 수 있다. HMM은 TGFβ 억제제 및 MEK 억제제를 포함할 수 있다. 대안적으로, HMM은 FH1, FPH1, 및/또는 메톡사민을 포함할 수 있다(Shan et al., 2013).
B. 억제제
a. GSK3 억제제
글리코겐 신타제 키나아제 3(GSK3)은 포스페이트 분자의 세린 및 트레오닌 아미노산 잔기 상으로의 부가를 매개하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. 예시적인 억제제는 CHIR99021, BIO, SB216763, CHIR98014, TWS119, SB415286, 및 티데글루십을 포함한다.
b. TGFβ 경로 억제제
형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)는 대부분의 세포에서 증식, 세포성 분화 및 기타 기능을 제어하는 분비성 단백질이다. 이는 면역, 암, 기관지 천식, 폐 섬유증, 심장병, 당뇨병 및 다발성 경화증에서 역할을 하는 사이토킨의 한 유형이다. TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 불리는 적어도 3개의 이소형으로 존재한다. TGF-β 계열은 인히빈, 액티빈, 항뮬러관(anti-mullerian) 호르몬, 골형성 단백질, 데카펜타플렉(decapentaplegic) 및 Vg-1을 포함하는 형질전환 성장 인자 베타 슈퍼패밀리로 알려진 단백질 슈퍼패밀리의 일부이다.
TGFβ 경로 억제제 (또한 본원에서 TGFβ 억제제로서 지칭됨)는 일반적으로 TGFβ 신호 전달의 임의의 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, TGFβ 억제제는 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(SB431542), 6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린(SB525334), 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 히드로클로라이드 하이드레이트(SB431542-505124), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔- 5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 하이드레이트, 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드 하이드레이트, 좌우 결정 인자(Lefty), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드(A 83-01), 4-[4-(2,3-디하이드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드(D 4476), 4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드(GW 788388), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(LY 364847), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸-1-에탄올(R 268712) 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘(RepSox)이다.
c. MEK 억제제
MEK 억제제는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 효소 MEK1 또는 MEK2를 억제하는 화학물질 또는 약물이다. 이들은 MAPK/ERK 경로에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, MEK 억제제는 N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901), N-[3-[3-사이클로프로필-5-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6,8-디메틸-2,4,7-트리옥소피리도[4,3-d]피리미딘-1-일]페닐]아세트아미드(GSK1120212), 6-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복스아미드(MEK162), N-[3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도아닐리노)-6-메톡시페닐]-1-(2,3-디하이드록시프로필)사이클로프로판-1-설폰아미드(RDEA119) 및 6-(4-브로모-2-클로로아닐리노)-7-플루오로-N-(2-하이드록시에톡시)-3-메틸벤즈이미다졸-5-카복스아미드(AZD6244)를 포함한다.
d. Src 키나아제 억제제
비-수용체 단백질 티로신 키나아제의 Src 계열은 다양한 세포 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 수행하여, 세포 분열, 이동, 접착, 혈관형성 및 생존률과 같이 다양한 과정을 조절할 수 있다. 강력한 가역적 ATP와 경쟁하는 PP1은 단백질 티로신 키나아제의 Src 계열의 선택적 억제제이다. 이것은 p56lck(IC50 = 5 nM), p59fynT(IC50 = 6 nM), Hck(IC50 = 20 nM), 및 Src(IC50 = 170 nM)를 억제하고, EGFR 키나아제(IC50 = 250 nM), JAK2(IC50 = 50μM), 또는 ZAP-70(IC50 ≥ 0.6μM)의 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는다. PP1은 또한 Src 신호전달과 관련되지 않은 방식으로 I형 TGF-β-수용체(IC50 = 50 nM)를 직접적으로 억제함에 의해 TGF-β 매개된 세포성 반응을 차단한다. 일부 양상에서, 단계 3 성숙화 배지는 예를 들어, 5 uM에서 PP2, KB SRC 4, 1-나프틸 PP1, MNS, PD 180970 및 보수티닙을 포함하는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충될 수 있다.
e. 감마-세크레타제 억제제
감마 세크레타제는 막관통 도메인 내 잔기에서 단일-통과 막관통 단백질을 절단하는 통합 막 단백질 자체인 다중-서브유닛 프로테아제 복합체이다. 상기 유형의 프로테아제는 막내 프로테아제로서 공지되어 있다. 감마 세크레타제의 가장 널리 공지된 기질은 감마 및 베타 세크레타제 둘 다에 의해 절단되는 경우 비정상적으로 폴딩된 섬유 형태가 알츠하이머 질환 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 아밀로이드 베타로 불리는 짧은 아미노산 펩타이드를 생성하는 대형 통합 막 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질이다.
본원에서 감마 세크레타제 억제제는 일반적으로 γ-세크레타제 억제제를 지칭한다. 예를 들어, γ-세크레타제 억제제는 N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글라이신-1,1-디메틸에틸에틸 에스테르(DAPT), 5-클로로-N-[(1S)-3,3,3-트리플루오로-1-(하이드록시메틸)-2-(트리플루오로메틸)프로필]-2-티오펜설폰아미드(베가세스타트), MDL-28170, 3,5-비스(4-니트로페녹시)벤조산(화합물 W), 7-아미노-4-클로로-3-메톡시-1H-2-벤조피란(JLK6), (5S)-(tert-부톡시카보닐아미노)-6-페닐-(4R)-하이드록시-(2R)-벤질헥사노일)-L-류시-L-페닐알라닌아미드 (L-685,485), (R)-2-플루오로-α-메틸[1,1'-바이페닐]-4-아세트산((R)-플루르바이프로펜; 플루리잔(Flurizan)), N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-디하이드로-5-메틸-6-옥소-5H-디벤즈[b,d]아제핀-7-일]아미노]-1-메틸-2-옥소에틸]-3,5-디플루오로벤젠아세트아미드(디벤즈아제핀; DBZ), N-[시스-4-[(4-클로로페닐)설포닐]-4-(2,5-디플루오로페닐)사이클로헥실]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(MRK560), (2S)-2-[[(2S)-6,8-디플루오로-1,2,3,4-테트라하이드로-2-나프탈레닐]아미노]-N-[1-[2-[(2,2-디메틸프로필)아미노]-1,1-디메틸에틸]-1H-이미다졸-4-일]펜탄아미드 디하이드로브로마이드(PF3084014 하이드로브로마이드) 및 2-[(1R)-1-[[(4-클로로페닐)설포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산(BMS299897)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
C. 냉동보존
본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 간모세포 또는 간세포는 냉동보존될 수 있고, 예를 들어, 단계 1, 단계 2 또는 단계 3과 같이 과정의 임의의 단계에서 본원에 참조로 포함된 PCT 공보 제2012/149484 A2호를 참조한다. 세포는 기질과 함께 또는 기질 없이 냉동보존될 수 있다. 여러 구현예에서, 저장 온도는 약 -50℃ 내지 약 -60℃, 약 -60℃ 내지 약 -70℃, 약 -70℃ 내지 약 -80℃, 약 -80℃ 내지 약 -90℃, 약 -90℃ 내지 약 -100℃ 범위이고, 이들의 중복 범위도 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존된 세포의 저장(예를 들어, 유지)을 위해 보다 낮은 온도를 사용한다. 여러 구현예에서, 액체 질소 (또는 이와 유사한 다른 액체 냉각제)를 사용하여 세포를 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 6시간 초과 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 72시간 저장한다. 여러 구현예에서, 세포를 48시간 내지 약 1주 저장한다. 또 다른 구현예에서, 세포를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주, 또는 8주 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 동안 저장한다. 더 긴 시간 동안 세포를 저장할 수도 있다. 세포를 별도로 또는 본원에 개시된 임의의 기질과 같은 기질 상에서 냉동보존할 수도 있다.
일부 구현예에서, 추가의 냉동보호제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 냉동보호제, 예를 들어, DMS0, 혈청 알부민, 예를 들어, 사람 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 냉동보존 용액 중에서 냉동보존될 수 있다. 특정 구현예에서, 용액은 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 구현예에서, 용액은 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 7%, 약 6% 내지 약 8%, 약 7% 내지 약 9%, 또는 약 8% 내지 약 10%의 디메틸설폭시드(DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
세포는 예를 들어, 냉동보존을 하는 동안 약 1℃/분으로 냉각할 수 있다. 일부 구현예에서, 냉동보존 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 또는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 일부 구현예에서, 세포는 약 1℃/분으로 냉각시키기 전에 4℃로 냉각된다. 냉동보존된 세포의 사용을 위해 해동하기 전에 액체 질소의 증기상으로 해당 냉동보존된 세포를 이동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포가 일단 약 -80℃에 도달하면, 이들을 액체 질소 저장소로 이동시킨다. 냉동보존은 제어된-속도의 동결기(controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수도 있다. 냉동보존된 세포는 예를 들어, 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서, 통상 약 37℃의 온도에서 해동될 수 있다.
D. 간세포 정제 및 특징 분석
본원의 방법에 의해 생성된 간세포는 예를 들어, 간세포 마커의 선택에 의한 간세포의 농축된 집단에 대해 정제될 수 있다. 세포는 CD133의 양성 발현에 대해 분류될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 간세포의 농축된 집단을 제공한다. 세포의 예시적인 집단은 적어도 약 50%; 바람직하게 적어도 약 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 98% 및 가장 바람직하게 99% 또는 100%의 간세포를 포함한다.
간세포는 간 마커 알파-항-트립신(AAT) 및/또는 알부민에 의해 특징분석될 수 있다. 세포는 또한 간세포의 후기 단계 마커, 예를 들어, HNF-1σ, 사이토케라틴(CK)18 및 알부민에 대해 양성일 수 있거나; 조기 간세포 마커, 예를 들어, HNF-30, GATA4, CK19, σ-페토단백질이 부재일 수 있고; 시토크롬 P450 유전자, 예를 들어, CYP1A1, CYP2B1, CYP2C6, CYP2C11, CYP2C13, CYP3A2 및 CYP4A1을 발현할 수 있고; 양극화된 구조를 획득할 수 있다. 간세포 전구체 세포는 조기 간세포 마커의 존재에 의해 검출될 수 있다. 간 세포에 대해 관심 대상의 다른 마커는 σ1-항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 트랜스페린, 아시알로당단백질 수용체 (ASGR 또는 ASGPR 또는 ASGPR1), CK7, -글루타밀 트랜스퍼라제; HNF 10, HNF 3a, HNF-4σ, 트랜스티레틴, CFTR, apoE, 글루코키나아제, 인슐린 성장 인자(IGF) 1 및 2, IGF-1 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴, apoAII, apoB, apoCIII, apoCII, 알돌라제 B, 페닐알라닌 하이드록실라제, L-형 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질 및 에리트로포이에틴(EPO)을 포함한다.
간세포 분화는 전사 인자 HNF-4α를 요구하는 것으로 보고되었다(Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000). HNF-4α 발현과 무관한 마커는 α1-항트립신, α-페토단백질, apoE, 글루코키나아제, 인슐린 성장 인자 1 및 2, IGF-1 수용체, 인슐린 수용체 및 렙틴을 포함한다. HNF-4α 발현에 의존하는 마커는 알부민, apoAI, apoAII, apoB, apoCIII, apoCII, 알돌라제 B, 페닐알라닌 하이드록실라제, L-형 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질 및 에리트로포이에틴(EPO)을 포함한다.
상기 마커의 발현 수준의 평가는 다른 세포와 비교하여 결정될 수 있다. 성숙한 간세포의 마커에 대한 양성 대조군은 관심 대상의 종의 성인 간세포, 및 확립된 간세포 세포주, 예를 들어, 미국 특허 5,290,684에 보고된 간모세포종으로부터 유래된 HepG2 세포주를 포함한다. 음성 대조군은 성인 섬유아세포 세포주 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포와 같은 별도의 계통의 세포를 포함한다.
본 개시내용에 열거된 조직-특이적 단백질 및 올리고사카라이드 결정인자는 임의의 적합한 면역학적 기술―예를 들어, 세포 표면 마커에 대한 유동 면역세포화학, 세포내 또는 세포-표면 마커에 대한 면역조직화학(예를 들어, 고정화된 세포 또는 조직 섹션의), 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석, 및 배지 내로 분비된 세포 추출물 또는 생성물에 대한 효소-연결된 면역검정을 사용하여 검출될 수 있다. 세포에 의한 항원의 발현은 유의적으로 검출 가능한 양의 항체가 임의로 세포의 고정화 후, 및 임의로 표지화를 증폭시키기 위해 표지된 2차 항체 또는 다른 접합체(예를 들어, 비오틴-아비딘 접합체)를 사용하는 표준 면역세포화학 또는 유동 세포측정 검정에서 항원에 결합하는 경우 "항체-검출 가능한" 것으로 일컬어진다.
조직-특이적 마커의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 도트-블롯 하이브리드화 분석, 또는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용하는 역전사효소 개시된 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해 미국 특허 제5,843,780호를 참조한다. 본 개시내용에 열거된 특정 마커들에 대한 서열 데이터는 GenBank와 같은 대중의 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. mRNA 수준에서 발현은 전형적인 조절된 실험에서 표준 과정에 따른 세포 샘플 상의 검정 수행능이 명백하게 식별 가능한 하이브리드화 또는 증폭 생성물을 유도하는 경우 본 개시내용에 기재된 검정 중 하나에 따라 "검출 가능한" 것으로 일컬어진다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출된 바와 같은 조직-특이적 마커의 발현은 상기 수준이 미분화된 iPS 세포, 섬유아세포 또는 다른 관련되지 않은 세포 유형과 같은 대조군 세포의 것에 비해 적어도 2배, 바람직하게 10배 또는 50배 초과인 경우 양성인 것으로 고려된다.
세포는 또한 이들이 간세포 계통의 세포의 특징인 효소적 활성을 나타내는지에 따라 특징 분석될 수 있다. 예를 들어, 글루코스-6-포스파타제 활성에 대한 검정은 문헌(Bublitz (Mol Cell Biochem. 108:141, 1991); Yasmineh et al. (Clin. Biochem. 25:109, 1992); and Ockerman (Clin. Chim. Acta 17:201, 1968))에 의해 기재된다. 간 세포에서 알칼린 포스파타제(ALP) 및 5-뉴클레오티다제(5'-Nase)에 대한 검정은 문헌(Shiojiri (J. Embryol. Exp. Morph.62:139, 1981))에 의해 기재된다. 연구 및 건강 관리 부문에 서비스를 제공하는 많은 실험실에서 상업적 서비스로 간 효소에 대한 검정을 제공한다.
시토크롬 p450은 모노-옥시게나제 시스템의 주요 촉매 성분이다. 이것은 생체이물(투여되는 약물) 및 많은 내인성 화합물의 산화적 대사를 담당하는 혈단백질 계열을 구성한다. 상이한 시토크롬은 특징적이고 중복의 기질 특이성을 제공한다. 바이오형질전환 능력의 대부분은 1A2, 2A6, 2B6, 3A4, 2C9-11, 2D6, 및 2E1로 지정된 시토크롬에 기인할 수 있다(Gomes-Lechon et al., pp 129-153 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997).
다수의 검정은 시토크롬 p450 효소 활성을 촉진하기 위해 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 p450 활성에 의해 형광성 생성물로 전환될 수 있고 이어서 형광성 활성화된 세포 계수에 의해 분석되는 비-형광성 기질과 접촉될 수 있다(미국 특허 제5,869,243호). 구체적으로, 세포를 세척하고, 이어서 암실에서 37℃에서 15분 동안 10μM/L 5,6-메톡시카보닐플루오레세인의 용액 (Molecular Probes, Eugene OR)으로 항온처리한다. 이어서, 세포를 세척하고, 배양 플레이트로부터 트립신 처리하고, ~520 내지 560 nm에서 형광 방출에 대해 분석한다. 본 개시내용 중에 임의의 효소에 대한 활성 증거는 시험 세포에서 활성 수준이 섬유아세포와 같은 대조군 세포의 것에 비해 2배 초과, 바람직하게는 10 또는 100배 초과인 경우 결정된다.
시토크롬 p450의 발현은 또한 예를 들어, 웨스턴 블롯에서 특이적 항체를 사용하여 단백질 수준에서 또는 노던 블롯 또는 RT-PCR에서 특이적 프로브 및 프라이머를 사용하여 mRNA 수준에서 측정될 수 있다. 문헌(Borlakoglu et al., Int. J. Biochem. 25:1659, 1993)을 참조한다. p450 시스템의 특정 활성이 또한 측정될 수 있다: 7-에톡시쿠마린 O-데-에틸라제 활성, 알록시레소루핀 O-데-알킬라제 활성, 쿠마린 7-하이드록실라제 활성, p-니트로페놀 하이드록실라제 활성, 테스토스테론 하이드록실화, UDP-글루쿠로닐트랜스퍼라제 활성, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 활성 등(문헌(Gomes-Lechon et al., pp 411-431 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997)에서 검토됨). 이어서, 활성 수준은 1차 간세포에서의 수준과 비교할 수 있다.
소분자 약물의 접합, 대사 또는 해독에 관여하는 효소들에 대한 검정도 가능하다. 예를 들어, 세포는 요로 또는 담도를 통한 배설을 위해 빌리루빈, 담즙산 및 소분자 약물을 접합시키는 능력에 의해 특징분석될 수 있다. 세포는 적합한 기질과 접촉시키고, 적합한 기간 동안 항온처리하고, 이어서 배지를 분석하여 (GCMS 또는 다른 적합한 기술에 의해) 접합 생성물이 형성되었는지의 여부를 결정한다. 약물 대사 효소 활성은 탈에틸화, 탈알킬화, 하이드록실화, 탈메틸화, 산화, 글루쿠로접합, 설포접합, 글루타티온 접합, 및 N-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 포함한다(A. Guillouzo, pp 411-431 in "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997). 검정은 피나세틴 탈에틸화, 프로카인아미드 N-아세틸화, 파라세타몰 설포접합, 및 파라세타몰 글루쿠로니드화를 포함한다(Chesne et al., pp 343-350 in "Liver Cells and Drugs", A. Guillouzo ed. John Libbey Eurotext, London, 1988).
간세포 계통의 세포는 또한 글리코겐을 저장하는 이들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 적합한 검정은 주기적 산 쉬프(PAS) 염색을 사용하고, 이는 모노- 및 디사카라이드와 반응하지 않지만 글리코겐 및 덱스트란과 같은 장쇄의 중합체를 염색시킨다. PAS 반응은 가용성 및 막 결합된 탄수화물 화합물뿐만 아니라 복합체 탄화수물의 정량적 제거를 제공한다. 키르케비 등(Kirkeby et al.) (Biochem. Biophys. Meth. 24:225, 1992)은 탄수화물 화합물 및 세제의 정량적 PAS 검정을 기재한다. 반데르 라세 등(van der Laarse et al.) (Biotech Histochem. 67:303, 1992)은 PAS 반응을 사용한 글리코겐을 위한 마이크로밀도측정 조직화학적 검정을 기재한다. 글리코겐 저장의 증거는 세포가 섬유아세포와 같은 대조군 세포의 것에 대해 적어도 2배, 및 바람직하게 10배 초과인 수준에서 PAS-양성인 경우 결정된다. 세포는 또한 표준 방법에 따른 핵형분류에 의해 특징 분석될 수 있다.
III. 사용 방법
본 개시내용은 이에 의해 간세포 계통의 대다수의 세포가 생성될 수 있는 방법을 제공한다. 이들 세포 집단은 다수의 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 이에 한정되지 않지만, 몇 가지 거론하자면, 세포의 생체내 이식 또는 주입; 항-바이러스, 세포 독성 화합물, 발암물질, 돌연변이원 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 시험관내 스크리닝; 간 질환 또는 감염의 기전에 대한 해명; 약물 및/또는 성장 인자가 작용하는 기전에 대한 연구; 환자 내 암의 진단 및 모니터링; 유전자 치료요법; 및 생물학적 활성 생성물의 제조를 포함한다.
간세포는 또한 대사 프로파일링을 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포 또는 이의 분획, 예를 들어, 마이크로솜 분획은 잠재적으로 상이한 농도에서 시험 제제와 접촉시키고, 상이한 시간 동안, 상기 배지를 수거하고 분석하여 시험 제제의 대사된 형태를 검출한다. 임의로, 부푸랄롤과 같은 대조군 분자가 또한 사용된다. 대사 프로파일링을 사용하여, 예를 들어, 대상체가 특정 약물을 대사하는지 및 그렇다면 약물이 어떻게 대사되는지를 결정할 수 있다. 상기 검정을 위해, 사용된 간세포는 대상체로부터 유래하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시내용은 아마도 간 기능의 급성, 만성 또는 유전적 손상으로 인한 상기 치료요법을 필요로 하는 대상체에 대한 어느 정도의 간 기능을 회복시키기 위한 간세포의 용도를 또한 제공한다.
본 개시내용은 캡슐화되거나 바이오인공 간 장치의 일부인 간세포를 포함한다. 캡슐화의 다양한 형태는 문헌("Cell Encapsulation Technology and Therapeutics", Kuhtreiber et al. eds., Birkhauser, Boston Mass., 1999)에 기재되어 있다. 본원의 세포는 시험관내 또는 생체내 사용을 위한 상기 방법에 따라 캡슐화될 수 있다.
임상적 사용을 위한 바이오인공 기관은 장기 치료요법의 일부로서 손상된 간 기능을 갖는 개체를 지지하기 위해 또는 전격성 간 부전증과 간 재구성 또는 간 이식체 간의 시간을 브릿징하기 위해 디자인된다. 현탁액형 바이오인공 간은 플레이트 다이알라이저(dialyser)에 현탁되거나, 적합한 기질에서 마이크로캡슐화되거나 세포외 매트릭스로 코팅된 마이크로캐리어 비드에 부착된 세포를 포함한다. 대안적으로, 간세포는 팩킹된 베드, 멀티플레이트 편평한 베드에서 고형 지지체 상에, 마이크로채널 스크리닝, 또는 주변 중공 섬유 모세관 상에 위치할 수 있다. 장치는 대상체의 혈액이 이를 통해 통과되는 입구 및 출구, 및 때로는 영양물을 세포에 공급하기 위한 포트의 분리된 세트를 갖는다.
본 간세포를 또한 사용하여, 예를 들어, 세포의 분화 또는 대사에 영향을 미치는 후보 화합물 또는 환경 조건들을 스크리닝할 수 있다. 간세포는 추가로 세포 특이적 항체 제제 및 세포 특이적 cDNA 라이브러리를 수득하기 위해, 예를 들어, 유전자 발현 또는 약제학적 제제 중에 활성 성분으로서의 패턴을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 간세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 세포는 예를 들어, 조직 재구성 또는 재생을 위해 대상체의 간에 투여될 수 있다. 세포는 이들이 의도된 조직 부위에 접목되도록 하고 기능적 결핍 영역을 재구성하거나 재생하도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 투여 전, 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라, 대상체로부터 세포로 또는 그 반대로 (이식편 대 숙주 질환) 면역 반응을 억제하도록 변형될 수 있다.
간세포는 C형 간염 감염으로부터 초래되는 것과 같은 완전한 또는 부분 간 부전증을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. 간세포는 간 손상을 복구하는 능력에 대해 동물 모델에서 평가될 수 있다. 하나의 상기 예는 D-갈락토사민의 복막내 주사에 의해 유발되는 손상이다. 치료의 효능은 간 세포 마커에 대한 면역세포화학 염색, 세관 구조가 성장하는 조직에서 형성되는지, 및 간 특이적 단백질의 합성을 복구하기 위한 치료 능력의 현미경 결정에 의해 결정될 수 있다.
A. 약제학적 조성물
또한 본원에는 간세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 제공된다.
따라서, 본 발명에 따른 대상체에게 투여하기 위한 세포 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 화합물의 가공을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하는 임의의 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적당한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 간세포는 직접적인 투여, 또는 일시적 간 기능을 제공하는 바이오보조 장치의 일부에 의해 치료요법에 사용될 수 있고, 대상체의 간 조직은 전격성 간 부전증 후 자체를 재생한다. 의학적 제형 중에 일반적인 원리에 대해, 독자는 세포 치료요법을 언급한다: 문헌(G. Morstyn ii W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; and Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000)에 의한 줄기 세포 이식, 유전자 치료요법, 및 세포 면역치료요법. 조성물은 조직 재생 또는 치료적으로 중요한 대사 기능의 복구에서 세포의 사용을 위한 서면 지침서와 함께 팩키징될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분(예를 들어, 세포)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 사이의 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 -활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP, 및 rHuPH20을 포함하는 사용 방법은 미국 특허 공개 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 조합된다.
B. 시험 화합물 스크리닝
본 개시내용의 세포를 사용하여 본원에 제공된 세포의 특징에 영향을 주는 인자(예를 들어, 용매, 소분자 약물, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드) 또는 환경 조건(예를들어, 배양 조건 또는 조작)에 대하여 스크리닝할 수 있다.
본 개시내용의 특정 스크리닝 적용은 약물 연구에서 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 독자는 일반적으로 문헌(표준 텍스트북 In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997, 및 미국 특허 제5,030,015호)을 참조한다. 본 개시내용의 특정 양상에서, 제제-처리된 간세포는 단기 배양에서 간세포 세포주 또는 1차 간세포에 대해 이전에 수행된 바와 같이, 표준 약물 스크리닝 및 독성 검정을 위한 시험 세포의 역할을 수행한다. 후보 약제학적 화합물에 대한 활성 평가는, 일반적으로 본 개시내용의 특정 양상에 제공된 세포를 후보 화합물과 조합하는 단계, 상기 화합물에 기인할 수 있는 세포의 형태, 마커 표현형 또는 대사 활성의 임의의 변화를 (처리되지 않은 세포 또는 비활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 결정하는 단계, 및 이후 상기 화합물의 효과를 관찰된 변화와 연관시키는 단계를 수반한다. 상기 스크리닝은, 상기 화합물이 간 세포에 대하여 약리학적 효과를 갖도록 디자인되었기 때문에, 또는 그밖에 효과를 갖도록 디자인된 화합물이 의도치 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행할 수 있다. 2개 이상의 약물은 가능한 약물-약물간 상호작용 효과를 검출하기 위해, 조합(세포와 동시에 또는 순차적으로 조합)하여 시험될 수 있다.
일부 적용에서, 화합물은 초기에 잠재적 간독성에 대해 스크리닝한다(Castell et al., 1997). 세포독성은 세포 생존력, 생존, 형태 또는 배양액 배지로의 효소의 누출에 대한 효과에 의해 우선적으로 먼저 결정될 수 있다. 보다 상세한 분석을 수행하여 화합물이 독성을 유발하지 않으면서 세포 기능(예를 들어, 동화작용, 요소생성 및 형질 단백질 합성)에 영향을 주는지의 여부를 결정한다. 락테이트 데하이드로게나제(LDH)는 간 동위효소(V형)가 배양 조건에서 안정하여 12 내지 24h 항온처리 후 배양 상등액 중에 재현 가능한 측정을 가능하게 하기 때문에 양호한 마커이다. 미토콘드리아 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나제와 같은 효소의 누출이 또한 사용될 수 있다. 문헌(Gomez-Lechon et al. (1996))은 간세포 동화작용에 대한 약제학적 화합물의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있는 글리코겐을 측정하기 위한 마이크로검정을 기재한다.
간독성을 평가하기 위한 다른 현재 방법은 알부민, 콜레스테롤 및 지질단백질의 합성 및 분비의 결정; 접합된 담즙산 및 빌리루빈의 수송; 우레아 생성작용; 시토크롬 P450 수준 및 활성; 글루타티온 수준; α-글루타티온 s-트랜스퍼라제의 방출; ATP, ADP, 및 AMP 대사; 세포내 K+ 및 Ca2+ 농도; 핵 매트릭스 단백질 또는 올리고뉴클레오좀의 방출; 및 아폽토시스의 유도(세포 라운딩, 염색질 응축 및 핵 단편화에 의해 지적된)를 포함한다. DNA 합성은 [3H]-티미딘 또는 BrdU 혼입으로서 측정될 수 있다. DNA 합성 또는 구조에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 복구를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 특히 세포 사이클에서 스케줄되지 않은 시점에서 또는 세포 복제를 위해 요구되는 수준을 초과하는 [3H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치 않는 효과는 또한 중기 확산에 의해 결정되는, 자매 염색분체 교환의 비정상적인 비율을 포함할 수 있다. 독자는 추가의 상세한 설명을 위해 문헌(Vickers (1997))을 참조한다.
C. 간 치료요법 및 이식
본 개시내용은 아마도 간 기능의 급성, 만성 또는 유전적 손상으로 인한 상기 치료요법을 필요로 하는 대상체에 대한 어느 정도의 간 기능을 회복시키기 위해 본원에 제공된 간세포의 용도를 또한 제공한다.
치료적 적용을 위해 본원에 제공된 세포의 적합성을 결정하기 위해, 세포를 먼저 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 하나의 수준에서, 세포는 생존하고 생체내 이들의 표현형을 유지하는 능력에 대해 평가한다. 본원에 제공된 세포는 추가의 관찰을 위해 순응할 수 있는 부위에서, 예를 들어, 콩팥 캡슐하에, 비장으로, 또는 간소엽으로 면역결핍 동물(예를 들어, SCID 마우스 또는 화학적으로 또는 조사에 의해 면역결핍이 부여된 동물)에게 투여된다. 조직은 며칠 내지 수주 이상까지의 기간 후 수거되고 만능줄기 세포와 같은 출발 세포 유형이 여전히 존재하는지를 평가한다. 이것은 검출 가능한 표지(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 β-갈락토시다제)를 갖는 투여된 세포를 제공하거나; 투여된 세포에 특이적인 항상성 마커를 측정함에 의해 수행될 수 있다. 본원에 제공된 세포가 설치류 모델에서 시험되는 경우, 투여된 세포의 존재 및 표현형은 사람-특이적 항체를 사용한 면역조직화학 또는 ELISA에 의해 또는 사람 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 증폭을 유발하는 프라이머 및 하이브리드화 조건을 사용한 RT-PCR 분석에 의해 평가될 수 있다. mRNA 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 평가하기 위해 적합한 마커는 본원의 다른 곳에 제공된다. 동물 모델에서 간세포의 운명을 결정하기 위한 일반 기재 사항은 문헌(Grompe et al. (1999); Peeters et al. (1997); and Ohashi et al. (2000))에 제공된다.
또 다른 수준으로, 본원에 제공된 세포는 완전한 간 기능이 부재인 동물에서 간 기능을 회복하는 능력에 대해 평가한다. 브라운 등(Braun et al.) (2000)은 HSV-tk 유전자에 대해 형질전환된 마우스에서 독소-유도된 간 질환에 대한 모델을 기재한다. 림 등(Rhim et al.) (1995) 및 리베르 등(Lieber et al.) (1995)은 우로키나아제의 발현에 의한 간 질환에 대한 모델을 기재한다. 미그논 등(Mignon et al.) (1998)은 세포 표면 마커 Fas에 대해 항체에 의해 유도된 간 질환을 기재한다. 오버터프 등(Overturf et al.) (1998)은 Fah 유전자의 표적화된 붕괴에 의해 마우스 내 유전적 티로신혈증 I형에 대한 모델을 개발하였다. 동물은 2-(2-니트로-4-플루오로-메틸-벤지올)-1,3-사이클로헥산디온(NTBC)의 공급을 제공함에 의해 결핍으로부터 구제될 수 있지만, 이들은 NTBC가 철회되는 경우 간 질환을 발병한다. 급성 간 질환은 90% 간절제에 의해 모델링될 수 있다(Kobayashi et al., 2000). 급성 간 질환은 또한 동물을 갈락토사민, CCI4 또는 티오아세트아미드와 같은 간독소로 처리함에 의해 모델링될 수 있다.
간경변과 같은 만성 간 질환은 섬유증을 유도할 만큼 충분히 긴 간독소의 준치사 용량으로 동물을 처리함으로써 모델링될 수 있다(Rudolph et al., 2000). 간 기능을 재구성하기 위해 본원에 제공된 세포의 능력의 평가는 세포를 상기 동물에 투여하고 이어서 병태의 진행에 대해 동물을 모니터링하면서 1 내지 8주 기간 이상에 걸쳐 생존력을 결정함을 포함한다. 간 기능에 대한 효과는 간 조직에서 발현되는 마커, 시토크롬 P450 활성 및 혈액 지표, 예를 들어, 알칼린 포스파타제 활성, 빌리루빈 접합, 및 프로트롬빈 시간 및 숙주의 생존력을 평가함에 의해 결정될 수 있다. 이들 임의의 기준에 따른 생존력, 질환 진행 또는 간 기능의 유지에서 임의의 개선은 치료요법의 효과에 관한 것이고 추가의 최적화를 유도할 수 있다.
동물 모델에서 대사 효소의 이들의 프로파일 또는 효능에 따라 요구될 수 있는 기능적 특징을 입증하는 본 개시내용의 특정 양상에 제공된 세포는 또한 손상된 간 기능을 갖는 사람 대상체로의 직접적인 투여를 위해 적합할 수 있다. 지혈 목적을 위해, 세포는 전형적으로 복강내 순환계에 적당히 근접한 임의의 부위에서 투여될 수 있다. 일부 대사 및 해독 기능을 위해, 세포는 담도에 근접하는 것이 유리하다. 따라서, 세포는 간(예를 들어, 만성 간 질환의 치료에서) 또는 비장 (예를 들어, 전격성 간 부전증의 치료에서) 근처에 투여된다. 하나의 방법에서, 세포는 내재 카테터를 통한 주입에 의해 간 동맥을 통해 또는 간문맥을 통해 간 순환으로 투여된다. 간문맥에서 카테터는 조작되어 세포가 원칙적으로 비장, 또는 간 또는 이들의 조합으로 유동될 수 있도록 한다. 또 다른 방법에서, 세포는 전형적으로 볼러스를 제자리에 유지하는 부형제 또는 매트릭스에 볼러스를 표적 기관 근처에 공동 내 위치함으로써 투여된다. 또 다른 방법에서, 세포를 간 또는 비장의 엽에 직접 주사한다.
본 개시내용의 특정 양상에서 제공된 세포는 회복되거나 보충된 간 기능을 가질 필요가 있는 임의의 대상체의 치료요법을 위해 사용될 수 있다. 이러한 치료요법에 적합할 수 있는 사람 병태는 모든 원인으로 인한 전격성 간 부전증, 바이러스성 간염, 약물 유도 간 손상, 간경변, 유전성 간부전증(예를 들어, 윌슨병, 길버트 증후군 또는 α1-항트립신 결핍증), 간담도 암종, 자가면역 간 질환(예를 들어, 자가면역 만성 간염 또는 1차 담즙성 간경변) 및 손상된 간 기능을 유도하는 임의의 다른 병태를 포함한다. 사람 치료요법을 위해, 용량은 일반적으로 약 109 내지 1012개 세포, 및 전형적으로 약 5×109 내지 5×1010개 세포이고, 이는 대상체의 체중, 환부 특성 및 중증도 및 투여된 세포의 복제 능력에 따라 조정된다. 치료 방식 및 적당한 용량의 결정을 위한 궁극적인 책임은 담당 의사에게 달려 있다.
D. 간 보조 장치에서의 용도
본 개시내용의 특정 양상은 캡슐화되거나 바이오인공 간 장치의 일부인 본원에 제공된 세포를 포함한다. 캡슐화의 다양한 형태는 문헌(Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, 1999)에 기재되어 있다. 본 개시내용의 특정 양상에 제공된 간세포는 시험관내 또는 생체내 사용하기 위한 상기 방법에 따라 캡슐화될 수 있다.
임상적 사용을 위한 바이오인공 기관은 장기 치료요법의 일부로서 손상된 간 기능을 갖는 개체를 지지하기 위해 또는 전격성 간 부전증과 간 재구성 또는 간 이식체 간의 시간을 브릿징하기 위해 디자인된다. 바이오인공 간 장치는 문헌(Macdonald et al. (1999))에 의해 검토되었고, 미국 특허 5,290,684, 5,624,840, 제5,837,234, 5,853,717, 및 5,935,849에 예시되어 있다. 현탁액형 바이오인공 간은 플레이트 투석기에 현탁되거나, 적합한 기질에서 마이크로캡슐화되거나 세포외 매트릭스로 코팅된 마이크로캐리어 비드에 부착된 세포를 포함한다. 대안적으로, 간세포는 팩킹된 베드, 멀티플레이트 편평한 베드에서 고형 지지체 상에, 마이크로채널 스크리닝, 또는 주변 중공 섬유 모세관 상에 위치할 수 있다. 상기 장치는 대상체의 혈액이 이를 통해 통과되는 입구 및 출구, 및 때로는 영양물을 세포에 공급하기 위한 포트의 분리된 세트를 갖는다.
세포는 초기에 기재된 방법에 따라 제조되고, 이어서 MATRIGEL® 또는 콜라겐의 매트릭스와 같은 적합한 기질 상에 장치로 플레이팅한다. 장치의 효능은 원심성 흐름으로부터 제거된 대사물과 원심성 흐름에서 새롭게 합성된 단백질 측면에서 원심성 채널의 혈액 조성과 원심성 채널의 혈액 조성을 비교하여 평가할 수 있다.
이러한 종류의 장치를 사용하여 혈액과 같은 유체를 해독시킬 수 있고, 여기서, 상기 유체는 세포가 유체 내 독소를 제거하거나 변형시키도록 하는 조건하에 본 개시내용의 특정 양상에 제공된 간세포와 접촉하게 된다. 해독은 일반적으로 간에 의해 가공되는 적어도 하나의 리간드, 대사물 또는 기타 화합물(천연 또는 합성)을 제거하거나 변경함을 포함한다. 상기 화합물은 빌리루빈, 담즙산, 우레아, 헴, 지질단백질, 탄수화물, 트랜스페린, 헤모펙신, 아시알로당단백질, 호르몬 유사 인슐린 및 글루카곤, 및 다양한 소분자 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 장치를 또한 사용하여 알부민, 급성기 반응물 및 부하되지 않은 캐리어 단백질과 같은 합성된 단백질과 함께 원심성 유체를 풍부하게 할 수 있다. 장치는 다양한 상기 기능이 수행됨으로써 요구되는 바와 같이 많은 간 기능을 회복하도록 최적화될 수 있다. 치료적 케어와 관련하여, 상기 장치는 간부전증에서 환자로부터 혈류를 가공하고 이어서 혈액은 환자로 복귀시킨다.
E. 상업적, 치료적 및 연구 목적을 위한 분배
일부 구현예에서, 제조, 분배 또는 사용 동안에 임의의 시점에 존재하는 세포를 포함하는 시약 시스템이 제공된다. 키트는 흔히 동일한 게놈을 공유하는, 미분화 만능 줄기 세포 또는 다른 분화 세포 유형과 조합하여 본 개시내용에 기재된 세포의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 각각의 세포 유형은 동일한 실체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 실체들의 제어 하에, 동시에 또는 다른 시점에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 컨테이너로 팩키징될 수 있다. 약제학적 조성물은 기계적 독성학과 같은 요구되는 목적을 위한 서면 지침서와 함께 적합한 컨테이너에 임의로 팩키징될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 세포의 생성을 위한 하나 이상의 배지 및 성분들을 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 시약 시스템은 수성 배지 중에 또는 동결건조된 형태로 적절히 포장될 수 있다. 키트 용기의 수단으로는 일반적으로 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 성분이 배치될 수 있는 다른 용기 수단, 바람직하게는 적절히 분취될 수 있는 다른 용기 수단 중 하나 이상을 포함한다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 성분들이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기들을 포함할 것이다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수도 있다. 키트의 성분들은 건조 분말(들)로 제공될 수도 있다. 시약 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 분말은 적절한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또 다른 용기 수단에 제공될 수도 있을 것으로 예상된다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 밀폐된 공간에 키트 성분(들)을 함유하기 위한 수단을 포함한다. 상기 컨테이너는 요구되는 바이알이 보유된 사출 성형 또는 취입 성형 플라스틱 컨테이너를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 인쇄형 또는 전자 포맷, 예를 들어 디지털 포맷의 사용설명서를 포함할 수도 있다.
IV. 실시예
하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러 가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 간세포 분화 과정의 개발 및 특징 분석
간세포 분화의 과정에서 여러 단계를 시험하고 세포 마커 및 세포 형태에 의해 평가된 바와 같이 성숙한 간세포의 생성을 위해 최적화시켰다.
간세포의 생성을 위한 분화 과정은 iPSC를, 간모세포를 형성하도록 유도되고 이어서 간세포로 분화되는 DE 세포로 분화시킴을 포함한다.
iPS 세포는 대략적으로 4 내지 5일 마다 스플릿팅하기 위해 0.5 mM EDTA를 사용하는 저산소 조건(5% O2)하에 E8 배지에서 MATRIGEL® 상에 유지시켰다. iPSC 배양물은 간세포 분화가 개시되기 전에 약 10회 계대 동안 저산소증에 적응시켰다. 개시 iPS 세포 배양물은 MATRIGEL® 코팅된 6-웰 플레이트 또는 T150 플라스크 상에 15 내지 20 k/㎠로 씨딩하였다. 씨딩 2일 후에, 배지는 예비-조건화 배지(PCM)로 갈아주고 매일 2 내지 3일 동안 공급하였다. 내배엽 유도는 세포를 액티빈을 함유하는 배지(DE 0일째 배지, 또한 T0 배지로 언급됨)에 위치시킴에 의해 수행하였다. 1 내지 2일째에, 배지는 다음 2일 동안 저농도의 BMP4, VEGF 및 FGF2와 함께 액티빈을 함유하는 DE 1 내지 2일째 배지(또한 T1-T2 배지로 언급됨)로 갈아주었다. 3 내지 9일로부터, 배지는 DE 3 내지 9일째 (또한 T3 내지 T6 배지로 언급됨)에 액티빈, BMP4 및 VEGF가 보충된 기저 배지 SFD로 갈아주었다. 10일째에, 배양물의 샘플링은 상기 퍼센트의 최종 내배엽 세포를 염색시키기 위해 수행하였다. 세포는 37℃에서 5 내지 7분 동안 가온 TrypLE를 사용하여 개별화하고 켄칭하였다. 표면 염색을 수행하여 유동 세포측정에 의해 Tra181, CXCR4, CD117의 수준을 정량하였다. 배양물은 6일 동안 최종 내배엽에서 간모세포로의 전환을 촉진하기 위해 덱사메타손, DMSO, 간세포 성장 인자 및 FGF와 함께 중내배엽 유도 인자 BMP4, VEGF, FGF를 함유하는 간세포 유도 단계 1 배지로 옮겼다. 세포에는 16일 동안 48시간 마다 새로운 간세포 유도 베지를 공급하였다. 17일째에, 전체 배양물은 TrypLE를 사용하여 수거하였다. 수거된 세포는 이어서 냉동보존하였다. 냉동보존은 회전 후 상등액 배지를 흡인함에 의해 수행하였고, 세포 펠렛은 5 내지 1000만개 세포/mL로 뱀뱅커(Bambanker) 용액 중에서 재현탁시키고, 컨트롤 레이트 동결기(Control Rate Freezer)에 의해 일정하게 냉각시키고 이어서 액체 질소 저장하였다.
대안적으로, 세포 개별화된 세포 현탁액은 응집물 형성을 위해 배지에 위치시켰다. 세포는 단계 2 간세포 분화 배지 + 블레비스타틴(Blebbistatin)에 위치시켰다. 응집물 형성은 0.25 x 106개 세포/mL의 밀도로 개시하였다. 세포는 정체 조건하에 T75 ULA 플라스크 또는 저산소 조건하에 스피너 플라스크에 위치시켰다. 18일째에, 배지는 단계 2 + CHIR99021 배지로 갈아주고 24일째까지 격일로 공급하였다. 20일째에, 배양물은 저산소로부터 정상산소 조건으로 전환시켰다. 23일째에, 배양물의 샘플링은 염색 분석을 위해 수행하였다. 응집물은 37℃에서 5 내지 7분 동안 가온 TrypLE를 사용하여 분해시키고 켄칭하였다. 단일 세포는 실온에서 15분 동안 4% PFA 용액으로 고정화시키기 전에 실온에서 15분 동안 생/사 레드(live/dead Red)로 처리하였다. AAT, ASGPR, 알부민 및 일치된 이소타입의 수준을 정량하기 위한 세포내 염색은 유동 세포측정을 통해 수행하였다. 25일째에, 배양물을 수거하고 분화 과정의 단계 2의 말기에 냉동보존하였다. 이것은 AAT 양성 간세포의 냉동보존을 제공한다. AAT의 세포내 발현은 CD133의 표면 발현에 연관시킨다. 상기 특성은 AAT 양성 간세포의 순수 집단을 냉동보존하기 위해 간세포 분화의 단계 2의 말기에 CD133 양성 세포의 자기 분류를 위한 선택사항을 가능하게 한다. 단계 2 간세포의 말기의 냉동보존은 5 내지 2000만개 세포/mL로 뱀뱅커(Bambanker) 용액 중에서 분해 후 세포 펠렛을 재현탁시킴으로써 수행하였고, 컨트롤 레이트 동결기(Control Rate Freezer)에 의해 일정하게 냉각시키고, 이어서 액체 질소 저장하였다. 프로테아제 억제제 및 ECM 유사 MATRIGEL®의 첨가는 단계 2 간세포의 냉동보존에 포함될 수 있다.
단계 1 말기의 냉동보존된 세포는 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에서 해동될 수 있다. 단계 1 세포는 단계 2로 성숙화시키고, 이어서 배양의 16 내지 18일 동안 단계 3으로 성숙화시켜 성숙한 간세포를 생성하였다. 단계 2 말기 세포는 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상의 단계 3 성숙화에 위치시키고, 전형적 자갈 다각형 형태를 갖는 성숙한 AAT/알부민 양성 발현 간세포의 존재는 플레이팅 후 8 내지 10일에 가시화할 수 있다.
여러 실험을 수행하여 상기 최적화된 간세포 분화 과정을 유도하기 위해 수행하였다. 먼저, GSK3 억제제인 CHIR99021의 효과는 본원의 간세포 분화 방법의 상이한 단계 상에서 평가하였다. CHIR 예비-조건화는 성장 인자의 부재하에 및 기본 비 iPSC 배지에서 수행하였다.
상기 예비-조건화는 특히, TRA1-81 염색 및 만능 유전자 POU5F1(전사 인자 OCT4를 암호화하는 유전자) 및 NANOG의 발현에서 급격한 감소에 의해 입증된 바와 같이 만능으로부터 세포의 이탈을 촉진시키는데 가치가 있을 수 있는 것으로 관찰되었다. 상기 감소는 DE 마커 CXCR4 및 CD117에 대한 유동 세포측정 염색에 의해 나타난 DE 유도의 양호한 수준을 수반하였다(도 6).
다음 단계는 iPSC의 CHIR 예비-조건화의 최적의 타이밍을 결정하고, 분화의 단계 2 및 단계 3에서 DE, 간모세포 및 간세포의 출현에 대한 예비-조건화의 영향을 조사하는 것이었다. DE 유도 전 CHIR99021 첨가는 간세포 증식 및 분화 효율을 촉진시키는 것으로 관찰되었다. 단계 1 동안에 CHIR99021의 도입은 어떠한 양성 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌고, 단계 2 동안에 이의 도입은 세포 증식에 대해 이로운 효과를 보여주었고 세포 형태에 대한 어떠한 음성 영향을 보여주지 않았다.
간 세포 분화를 통한 중간 지점에서 CHIR99021의 보충이 분화 과정의 수율 및 효율을 증가시키는지를 연구하였다. CHIR의 보충은 간모세포의 간세포로의 전환 동안에 세포의 확장을 촉진시키는데 효과적임을 입증하였다. 더욱이, 세포 수에서 확장은 AAT-양성 세포의 출현을 특징으로 하는 바와 같이 세포의 간 표현형을 방해하지 않았다. CHIR로 예비-조건화를 거친 세포는 DE에서 간 계통으로의 부드러운 전환을 밝혔고, 단계 2의 말기(EOS2)까지 고순도의 간 마커 알파 1 항트립신(AAT) (도 9) 및 아시아당단백질 수용체(ASGPR1)(도 10)를 나타냈다.
Figure pct00001
응집물 형성에 대한 최적점을 결정하기 위해, 분화 결과의 효과를 평가하였다. 단계 1 말기에 응집물 형성에 의해 중간-과정 응집물 타이밍이 최고 AAT 순도로 세포 집단을 생성함을 밝혔다.
이어서, 성장 인자 농도의 효과를 평가하였다. EFG의 제거 및 VEGF 타이밍의 변형과 함께 분화 동안에 사용되는 HGF 농도에서의 감소는 분화 결과에 대해 어떠한 부작용을 갖지 않는다.
최종적으로, 단계 3 성숙화 배지로 TGFβ 및 NOTCH 억제제의 첨가는 알부민 발현을 촉진시키고 간세포 형태를 밝히는 것으로 밝혀졌다.
HNF4A 수준의 정량: 핵 수용체 HNF4A의 유전자 발현은 간세포 분화 동안에 조사하였다. 상기 수용체는 다수의 간 과정의 주요 조절인자이고 이의 발현은 간 발육을 위해 필요하다. HNF4A를 암호화하는 유전자는 P1 및 P2로 호칭되는 2개의 별개의 프로모터의 전사 제어하에 있다. P1 전사체는 보다 성숙한 간세포를 특징으로 하고, P2 전사체는 태아 간세포를 특징으로 한다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 간세포에서, P1 전사체는 단계 1 말기(EoS1)까지 우세하다. 현저하게, HNF4A 전사 프로파일 - mRNA 수준 및 P1/P2 전사체 비율은 - 성인 사람 간에서의 것과 유사하였다(도 12).
생존 말기 단계의 간세포의 형태학적 및 기능적 분석: 단계 2 말기에 콜라겐 코팅된 플레이트 상에 씨딩되는 경우, 이러한 프로토콜에 의해 생성되는 간세포는 현저한 핵 및 상 밝은 경계선을 갖는 자갈 형태를 특징으로 하는 적당한 간세포 형태를 나타냈다. 간세포의 또 다른 중요한 형태학적 특징인 이중핵 세포가 또한 관찰되었다(도 13). 추가로, 세포의 염료 CDFDA로의 염색(도 14)은 이들이 간세포의 또 다른 주요 특징인 기능성 모세담관을 형성함을 보여주었다.
단계 3 말기 간세포 생존 배양물의 분석: 최종적으로, 분화된 간세포는 이들의 AAT 순도를 유지하면서 고수준의 알부민 순도(>65%)에 도달하였다. AAT 및 알부민의 퍼센트는 단계 3 분화의 7일 및 14일째에 정량하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
CD133(프로미닌-1 또는 AC133으로도 공지된)은 펜타스판 막 단백질의 프로미닌 계열의 최초 동정된 구성원이다. CD133은 뇌, 콩팥, 전립선, 췌장, 피부 및 간세포 암종을 포함하는 뮤린 또는 사람 조직에서 상피 및 비-상피 전구체 세포뿐만 아니라 조혈 전구체 세포에서 발현된다. AAT는 간세포의 정제를 위한 세포내 마커이기 때문에, 연구는 간세포 배양물을 농축시키고, 이어서 정제하는데 도움이 되는 대용 세포 표면 마커를 스크리닝하기 위해 수행하였다. CD133 표면 마커는 여러 상이한 세포주에서 간세포 분화의 단계 2의 말기에 AAT+ 세포와 동시 염색시킨다(도 21a, 도 21b). 모든 AAT+ 세포는 CD133+이고, 따라서, CD133은 불량한 AAT 발현을 갖는 세포주를 정제하고 대부분의 오염 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 상기 iPSC는 만능으로부터 이들의 이탈을 촉진시키고 다운스트림 분화를 개선시킴에 의해 최종 내배엽(DE) 세포로의 분화를 위해, 세포를 예비-조건화시키기 위한 GSK3 억제제의 존재하에 세포를 배양함으로써 간세포 분화를 향해 예비-조건화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 초기에, iPSC는 내배엽 유도 배지에서 DE 세포로 분화될 수 있다. iPSC는 MATRIGEL® 상에와 같이 2차원 배양물에서 배양될 수 있고, 이어서 DE 세포는 단계 1의 말기에 3차원 응집 배양물로 전달될 수 있다. 세포는 간모세포의 유도 및 간세포로의 분화를 포함하는 과정의 단계 2 동안에 GSK3 억제제의 존재하에 배양될 수 있다. 단계 3에서, 간세포는 세포 형태를 개선시키기 위해 TGFβ 억제제 및 γ-세크레타제 억제제의 존재하에 성숙화될 수 있다.
간세포/MSC 동시-배양 연구: 파일럿 실험은 간세포 및 MSC의 동시 배양의 효과를 조사하기 위해 수행하였다. MSC 뱅크는 MASH 세포주 01D1로부터 생성시켰다(표 1). MSC는 성공적으로 간세포 배지에 적응하였고 이어서 다양한 밀도로 01D1 세포주로부터의 간 세포 상으로 플레이팅하였다. 실험은 단계 3 배지 +/- SB431542/DAPT에서 배양된 세포와 함께 수행하였다. 본원 발명자들은 SB431542/DAPT의 부재하에, 모든 배양물 - 간세포 단독 또는 간세포/MSC 동시 배양물-은 대조군과 비교하여 형태적으로 악화되었고, AAT 및 ALB의 감소된 순도를 가짐을 밝혔다. 이와 일치하여, ELISA에 의해 측정된 상등액 중에 ALB 분비는 또한 감소하였다. 그러나, SB431542/DAPT의 존재하에, 간세포/MSC 동시 배양물은 적당한 형태를 유지할 뿐만 아니라(도 6), 이들의 높은 AAT 순도를 유지하였고, ALB 순도 및 분비에서 완만하지만 현저한 증가를 갖는다는 것이 관찰되었다. 이것은 MSC와의 동시 배양물이 간세포 성숙화를 촉진시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 연구 세포주는 간세포를 성숙화하기 위해 SB431542/DAPT가 보충된 세포주-일치된 MSC 조건화된-배지를 사용하는 것으로 연장될 수 있다,
분화의 단계 2에서 냉동보존된 간세포의 해동 및 해동 후 단계 3 간세포로의 성숙화: 단계 2의 말기에 냉동보존된 간세포는 단계 3 배지에서 해동시켰다. 세포는 rock 억제제의 존재하에 회전시키지 않고 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 배지는 플레이팅 후 24시간의 말기에 약간 변화시켰다. 성숙화 배지는 SB/DAPT 또는 Src 키나아제 억제제를 함유하였고, 세포는 추가 8 내지 10일까지 분화하도록 방치하였고 배지는 48시간 마다 갈아준다. 말기 단계 세포는 간세포 형태에 대해서, 및 유동 세포측정에 의해 정량된 AAT 및 알부민 발현의 존재에 대해 분석하였다.
예비 데이터는 SB431542/DAPT 대신 PP1의 치환이 간세포의 성숙화를 촉진시킴을 밝혔다. 도 23은 형태를 도시하고, 도 24는 해동 후 배양물의 순도를 도시한다.
간 오가노이드의 생성: 간세포 및 다른 간 관련 세포 유형, 특히 대식세포, MSC 및 내피 세포로 이루어지고, 간 오가노이드 배양물을 모방하도록 디자인된 응집물을 확립하고 5 내지 10일 동안 유지하였다. 응집물은 1μM의 H1152가 보충된 간세포 단계 3 배지(표 2)에서 확립하였고, 비-간세포는 공동 배양의 개시 전 단계 3 배지로의 적응을 진행한다. 동시 배양 개시를 위해, 단계 1 말기 세포인 간세포를 냉동보존으로부터 회수하였고, 1μM의 rho 키나아제(rock) 억제제 H1152가 보충된 단계 2 배지(표 2)에서 500,000개 세포/mL로 응집시켰다. 24시간 후, 배지는 3μM CHIR99021을 갖는 단계 2 배지로 갈아주었다. 세포는 총 8일 동안 단계 2 배지에 유지되었는데, 처음 4일은 저산소 조건하에 있고, 이어서 4일은 정상산소 조건하에 있다. 냉동보존된 대식세포는 낮은 접착 플레이트에서 무혈청 한정된 (SFD) 배지 중 ~100,000개 세포/㎠로 플레이팅하고 단계 3 배지(2 mL/6wp 격일의 웰)의 배양물로의 첨가에 의해 간세포 단계 3 배지(SB431542/DAPT, 또는 PP1 부재)에 서서히 적응시켰다. 유사하게, 냉동보존된 MSC는 MSC 배지(각각 50ng/mL의 PDGF-BB 및 bFGF를 갖는 SFD)에서 50,000 세포/㎠로 표준 조직 배양 플레이트 상에 해동시켰다. 세포는 해동 후 1일째 개시하여 단계 3 배지 대 MSC 배지의 비율을 증가시킴에 의해 (1일째 75% MSC/25% 단계 3, 2일째 50% MSC/50% 단계 3, 3일째 25% MSC/75% 단계 3, 4 내지 7일째 100% 단계 3) 7일 동안 간세포 단계 3 배지(SB431542/DAPT 또는 PP1 부재)에 적응시켰다. 냉동보존된 내피 세포를 해동시키고, 내피 세포 배지(각각 50ng/mL의 VEGF 및 bFGF를 갖는 SFD)에서 ~25,000개 세포/㎠로 피브로텍틴(2㎍/㎠)으로 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포는 단계 3 배지 대 50ng/mL VEGF 및 50ng/mL FGF를 함유하는 무혈청 한정된 (SFD) 내피 세포 배지의 비율을 증가시킴에 의해 7일 동안 간세포 단계 3 간세포 배지에 적응시켰다. 세포는 해동 후 1일째에 개시하여 단계 3 간세포 배지 대 내피 배지의 비율을 증가시킴에 의해 (1일째 75% 내피 세포 배지/25% 단계 3, 2일째 50% 내피 세포 배지/50% 단계 3, 3일째 25% 내피 세포 배지/75% 단계 3, 4 내지 7일째 100% 단계 3) 7일 동안 간세포 단계 3 배지(SB431542/DAPT 또는 PP1 부재)에 적응시켰다. 간세포 응집물 형성 후 8일째에, 간세포 응집물은 37℃에서 7분 동안 0.5% 트립신-EDTA를 사용하여 해리시켰다. 동시에, 대식세포, MSC, 및 내피 세포는 TrypLE Select(37℃에서 5 내지 7분)로 해리시키고 이어서 세포 현탁액을 세척하고, 회전시키고 생존 세포 농도를 결정하였다. 모든 세포 유형은 간세포 단계 3 배지 (SB431542/DAPT 또는 PP1 부재)에서 1,000,000 세포/mL로 현탁시켰다. 이어서, 세포는 초저(ultra-low) 접착 (ULA) 환저 96웰 플레이트에 1:0.5:2:0.2 간세포: 대식세포: MSC: 내피 세포의 비율로 플레이팅하였다. 모든 응집 조건(도 28a)에서, 웰 당 세포의 총수는 일정하게 유지되었다. 그런 다음, 세포를 3분 동안 200g에서 펠렛화하고 2μM H1152, 0.6mg/mL MATRIGEL® 및 SB431542/DAPT(각각 20μM/4μM) 또는 PP1(10μM)을 포함하는 동일한 부피의 3단계 배지로 오버레이하여 화합물의 최종 농도가 1μM H1152, 0.3mg/mL MATRIGEL® 및 10μM SB431542/2μM DAPT 또는 5μM PP1이 되게 하였다. 이어서, 세포는 3분 동안 200g에서 다시 펠렛화하고 정상산소 항온처리기에 위치시켰다. 배지는 응집물을 붕괴시키지 않고 배지의 50%를 제거하고 SB431542/DAPT 또는 PP1을 함유하는 동일량의 단계 3 배지로 대체함에 의해 격일로 갈아주었다.
지질증 검정: iPSC-유래된 간세포: 단계 3의 말기에 2.038, 54A(둘 다 정상), 01D1 및 02E1(둘 다 NASH) 세포주는 세포내 지질증 유도 검정에 적용하였다. 간세포 분화의 단계 2의 말기에서, 응집물은 37℃에서 7분 동안 0.5% 트립신-EDTA를 사용하여 해리시키고, 10% FBS가 보충된 IMDM 배지로 켄칭하였다. 이어서, 세포는 3분 동안 200g에서 펠렛화하고, 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상으로 200,000개 세포/㎠로 씨딩하고 지질증 유도 전에 4 내지 5일 동안 단계 3 배지(표 2)에 유지시키고, 배지는 격일로 갈아준다. 대안적으로, 세포는 37℃에서 5 내지 7분 동안 TrypLE Select로 단계 1의 말기에 해리시키고, 10% FBS가 보충된 IMDM 배지로 켄칭하였다. 이어서, 세포는 3분 동안 200g에서 펠렛화하고, 콜라겐 I 코팅된 플레이트 상으로 100,000개 세포/㎠로 씨딩하고 저산소 조건하에 위치시켰다. 세포는 8일 동안 단계 2 + CHIR99021 배지 (표 2)에 유지시키고, 배지는 격일로 갈아준다. 단계 2 분화의 4일째에, 세포는 정상산소 조건하에 위치시켰다. 8일 후, 세포는 2D 플레이팅된 조건에서 단계 3 배지로 전환시켰다. 지질증 유도를 위해, 세포는 정상산소 조건하에 37℃에서 24시간 동안 단계 3 배지에 희석된 50 내지 600μM 지방산, 리놀레산 또는 올레산-리놀레산 혼합물로 처리하였다. 세포는 DPBS로 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 4% PFA로 고정화시켰다. DPBS로 3회 세척 후, 세포는 암실의 실온에서 20분 동안 0.1% Triton-X를 갖는 DPBS 중에서 1㎍/mL Bodipy 493/503, 액틴-555 및 DAPI를 함유하는 용액으로 염색시키고, 이어서 DPBS로 3회 세척하였다. 지질 액적, 세포 매트릭스 및 핵을 염색시키고, FITC(지질), 텍사스 레드(액틴-555) 및 DAPI(핵) 필터에 의해 각각 고함량 공초점 현미경 상에 캡쳐하였다. 이미지는 20X 배율로 캡쳐하고, 이어서 MetaXpress 소프트웨어를 사용한 정량 분석에 적용하였다. 세포당 지질증은 세포 당 지질증=FITC/핵의 총수의 통합 강도의 합에 의해 계산하였다.
냉동보존된 단계 1 말기의 간모세포 또는 최종 내피 (DE) 세포로부터 말기 단계 간세포의 생성: 냉동보존된 간모세포(단계 1 말기의 세포)는 해동시켜 저산소 조건하에 rock 억제제 H1152(1μM)의 존재하에 단계 2 간세포 배지에서 500,000개 세포/mL로 응집물을 형성하였다. 24시간 후, 배지는 단계 2 + CHIR99021(표 2, 단계 2 배지 + 3μM CHIR99021)로 변화시켰다. 응집물은 8일 동안 단계 2 + 3μM CHIR99021 배지에 유지시키고, 배지는 격일로 갈아준다. 4일째에, 응집물은 단계 2 배지의 존재하에 정상산소 조건에 위치시켰다. 8일째에, 응집물은 단계 3 간세포 배지로 전환시키고, 5 내지 10일 동안 배양하여 성숙화시키고, 응집물은 수거하여 다양한 단계 말기의 검정을 수행하였다. 대안적으로, 응집물은 또한 0.5% 트립신-EDTA(37℃에서 ~7분)를 사용하여 단계 2의 말기에서 해리시킬 수 있고, rock 억제제 (H1152, 1μM)의 존재하에 단계 3 배지(표 2)에서 콜라겐 I 코팅된 플레이트상 으로 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포는 추가로 7 내지 10일 동안 단계 3 간세포 배지(표 2)에서 2D 포맷으로 배양할 수 있고 배지는 격일로 갈아주었다. 말기 단계 2D 세포는 간세포에 대해 다양한 종점 검정을 위해 사용될 수 있다.
냉동보존된 최종 내배엽(DE) 세포로부터 단계 3 말기 간세포의 생성: 냉동보존된 DE 세포는 해동시키고, 저산소 조건하에 rock 억제제 (H1152, 1μM)의 존재하에 T3-T6 배지(표 2)에서 100,000개 세포/㎠로 MATRIGEL® 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지는 rock 억제제의 부재하에 T3-T6로 변화시키고, 단계 1 간세포 배지(표 2)로 변화시키기 전에 추가로 1 내지 2일 동안 상기 배지에 유지시켰다. 세포는 저산소 조건하에 6일 동안 단계 1 간세포 배지에 유지시키고, 배지는 격일로 교환한다. 6일 후, 세포는 37℃에서 5 내지 7분 동안 TrypLE로 해리시키고, 켄칭시키고, 세척하고, 초저 접착(ULA) 정체 용기 또는 스피너 플라스크에 위치시켜 8일 동안 3D 응집물을 생성시키고, 배지는 격일로 교환한다. 4일째에, 응집물은 단계 2 배지의 존재하에 정상산소 조건에 위치시켰다. 8일째에, 응집물은 단계 3 간세포 배지로 전환시키고, 5 내지 10일 동안 배양하여 성숙화시키고, 응집물은 수거하여 다양한 단계 말기의 검정을 수행하였다. 말기 단계 알파-1 항트립신(AAT) 및 알부민 발현은 유동 세포측정에 의해 정량하고, 전형적인 결과는 표 3에 나타낸다.
Figure pct00004
예비 데이터는 SB431542/DAPT 대신 PP1의 치환이 간세포의 성숙화를 촉진시킴을 밝혔다. 도 23은 형태를 도시하고, 도 24는 해동 후 배양물의 순도를 도시한다. PP1은 또한 MSC, 대식세포 및 내피 세포의 존재하에 간세포의 성숙화를 증진시킨다.
생존 말기 단계 간세포를 사용한 지질증 데이터는 NASH 특이적 간세포에서 자발적 지질증의 증상을 밝혔다(도 27). 상기 결과는 iPSC 유래 간세포를 사용하여 지방간 표현형을 모델링하기 위한 측정 가능한 표현형을 보여준다. 상기 특성은 약물 개발 및 스크리닝 적용을 위해 다른 시험관내 NASH 특이적 검정으로 보완될 수 있다.
정상 및 NASH 특이적 iPSC로부터 유래된 말기 단계 간세포의 동시 배양은 중간엽 줄기 세포, 동종 대식세포, 동종 내피 세포와 쌍을 이루어 3D 간 오가노이드를 생성시킬 수 있다(도 28a 내지 도 28c).
보조 세포 유형과 함께 간세포의 3D 동시 배양은 간세포의 성숙화 및 기능(도 28d), 섬유증에 대한 질환 모델링, 오믹스-기반 분석 및 고속 처리량 스크리닝 적용을 증진시키기 위해 및 NASH에 대한 약물 개발을 위해 사용될 수 있다.
* * *
본원에 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 명세서의 내용을 고려하여 과도한 실험 없이 제조하여 수행할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기 참고문헌은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참조로서 상세하게 포함된다.
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Claims (82)

  1. 간세포를 생성하는 방법으로서,
    (a) 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)(iPSC)를 GSK3 억제제의 존재하에 배양하여 예비-조건화된(pre-conditioned) iPSC를 제공하는 단계;
    (b) 상기 예비-조건화된 iPSC를 최종 내배엽(definitive endoderm)(DE) 세포로 분화시키는 단계;
    (c) 상기 DE 세포를 배양하여 간모세포의 형성을 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 간모세포를 간세포로 분화시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 iPSC가 1 내지 3일 동안 예비-조건화되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021, BIO, SB216763, CHIR98014, TWS119, SB415286 또는 티데글루십인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 GSK3 억제제가 CHIR99021인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CHIR99021이 약 1 내지 5μM의 농도로 존재하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC가 아스코르브산이 본질적으로 부재하는 배지에서 예비-조건화되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d) 중 하나 이상이 이종-부재(xeno-free) 조건, 피더-부재(feeder-free) 조건 및/또는 조건화된-배지 부재 조건하에 수행되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d) 각각이 이종-부재 조건, 피더-부재 조건 및/또는 조건화된-배지 부재 조건하에 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d) 각각이 한정된 배지 하에 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, DE 세포로의 분화가, 액티빈 A를 포함하는 제1 내배엽 유도 배지(EIM), BMP4, VEGF, 및 bFGF를 포함하는 제2 EIM, 및 VEGF 및 DMSO를 포함하는 제3 EIM 중에 상기 iPSC를 순차적으로 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, DE 세포로의 분화가 8 내지 10일 동안인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DE 세포가 CXCR4, CD117, FOXA1, FOXA2, EOMES 및/또는 HNF4α에 대해 양성인, 방법.
  13. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 DE 세포를, HGF, BMP4, FGF10, FGF2, VEGF, EGF, 덱사메타손, 및/또는 DMSO를 포함하는 간세포 유도 배지(HIM)에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 DE 세포를, BMP4, HGF, 및 FGF10을 포함하는 HIM에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 DE 세포를, HGF, BMP4, FGF10, FGF2, VEGF, EGF, 덱사메타손, 및 DMSO를 포함하는 HIM에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HGF가 20 내지 30ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 5 내지 7일 동안인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 간모세포를 유도시킨 후 응집물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가, 응집물이 본질적으로 부재하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세포외 매트릭스 상에서 배양되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 뮤린 엔겔브레쓰-홀름-스웜 종양 (murine Engelbreth-Holm-Swarm tumor)으로부터 정제된 기저막 추출물(BME)인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 MATRIGEL®, GELTREX™, 콜라겐 또는 라미닌인, 방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 MATRIGEL®인, 방법.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 콜라겐인, 방법.
  25. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 GELTREX인, 방법.
  26. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스가 라미닌인, 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간모세포가 단계 (d) 전에 분해되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분화 단계가 bFGF, HGF, 온코스타틴 M, 및 DMSO를 포함하는 간세포 분화 배지(HDM)에서 간모세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 HDM이 GSK3 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 HDM이 VEGF 및 EGF가 본질적으로 부재하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)의 분화가 8 내지 10일 동안인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)가 저산소 조건하에 수행되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 제1 분화 기간 동안 저산소 조건하에 그리고 제2 분화 기간 동안 정상산소 조건하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제1 분화 기간 및 제2 분화 기간이 각각 3 내지 5일인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손 및 온코스타틴 M을 포함하는 성숙화 배지에서 상기 간세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 간세포가 성숙화 동안에 콜라겐 상에 배양되는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 SRC 키나아제 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 SRC 키나아제 억제제가 보수티닙, 다사티닙, A419259, 알스테르파울론, AZM475271, AZM475271, 또는 PP1인, 방법.
  39. 제35항 내지 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 EPO를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 γ-세크레타제 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 γ-세크레타제 억제제가 DAPT인, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 TGFβ 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 TGFβ 억제제가 SB431542, SB525334, SB431542-505124, Lefty, A 83-01, D 4476, GW 788388, LY 364847, R 268712 또는 RepSox인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 TGFβ 억제제가 SB431542인, 방법.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 MEK 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901, GSK1120212, MEK162, RDEA119, 및 AZD6244인, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 MEK 억제제가 PD0325901인, 방법.
  48. 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 EPO, IGF1, IGF2 및/또는 TGFα를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 항아폽토시스 화합물 XMU-MP1을 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙화 배지가 FH1, FPH1, 및/또는　α1-아드레날린작용 수용체 효능제 메톡사민을 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CD133-양성 세포에 대해 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙한 간세포의 적어도 70%, 80% 또는 90%가 알파 항트립신(AAT)에 대해 양성인, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙한 간세포의 적어도 40%, 50% 또는 60%가 알부민에 대해 양성인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙한 간세포의 적어도 70%, 80% 또는 90%가 알부민에 대해 양성인, 방법.
  55. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기 세포(MSC), 대식세포, 내피 세포, 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지의 존재하에 상기 성숙한 간세포를 동시 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 3D 응집물로서 성숙한 간세포를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간세포가 사람인, 방법.
  58. AAT에 대해 적어도 90% 양성이고/이거나 알부민에 대해 적어도 80% 양성인 간세포를 포함하는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 조성물이 이종-부재, 피더-부재, 조건화된-배지 부재이며 한정되어 있는, 조성물.
  60. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 유효량의 간세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 간 질환이 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상인, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 투여가 간세포 이식을 포함하는, 방법.
  63. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 간세포를 포함하는 예측 독성학을 위한 플랫폼.
  64. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 간세포를 포함하는 조성물.
  65. 대상체에서 간 질환의 치료를 위한, 제64항에 따른 조성물의 용도.
  66. 간 질환 모델링을 위한, 제64항에 따른 조성물의 용도.
  67. 제66항에 있어서, 상기 간 질환이 비-알코올성 지방간염(NASH)인, 용도.
  68. 약물 전달을 위한, 제64항에 따른 조성물의 용도.
  69. 제68항에 있어서, 상기 약물 발견이 NASH, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상에 대한 표적을 동정하는, 용도.
  70. 질환의 치료를 위한 후보 제제의 동정을 위한 메틸화-기반 분석을 수행하는 방법으로서, 상기 방법이 제64항에 따른 조성물에 대해 오믹스(omics)-기반 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 질환이 NASH, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상인, 방법.
  72. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 유래된 성숙한 간세포의 3D 응집물을 다수의 후보 제제들과 접촉시키는 단계 및 상기 성숙한 간세포의 기능을 측정하는 단계를 포함하는, 치료적 제제를 동정하기 위해 고속 처리량 스크리닝을 수행하기 위한 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 성숙한 간세포의 3D 응집물이 MSC, 대식세포, 내피 세포, 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지와 동시 배양되는, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 성숙한 간세포의 3D 응집물이 다른 세포 유형의 부재하에 배양되는, 방법.
  75. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따라 유래된 성숙한 간세포를 포함하는, 간 질환의 시험관내 모델.
  76. 제75항에 있어서, 상기 성숙한 간세포가 MSC, 대식세포, 내피 세포, 또는 하나 이상의 Src 키나아제 억제제가 보충된 MSC 조건화된-배지와 동시 배양되는, 모델.
  77. 제75항에 있어서, 상기 성숙한 간세포가 다른 세포 유형의 부재하에 배양되는, 모델.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 질환이 급성 간 질환, 만성 간 질환, 또는 간 기능의 유전적 손상, 또는 지방 간 질환인, 모델.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 간 질환이 NASH인, 모델.
  80. 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙한 간세포가 지방산으로 처리시 지질증을 진행시키는, 모델.
  81. 제80항에 있어서, 상기 지방산이 올레산 및/또는 리놀레산인, 모델.
  82. 제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 질환이 간 섬유증인, 모델.
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