RS51309B - Humana monoklonalna antitela za ctla-4 - Google Patents

Abstract

Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za antigen 4 citotoksičnog T limfocita (CTLA-4),ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa njom i lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa njom, i gde navedeno antitelo ili fragment ima sledeće osobine:a) afinitet vezivanja za CTLA-4 10-9 M ili veći;b) inhibira vezivanje CTLA-4 za B7-1 sa IC50 od 100 nM ili niže;c) inhibira vezivanje CTLA-4 za B7-2 sa IC50 od 100 nM ili niže;b) povećava proizvodnju citokina u humanoj T ćelijskoj analizi za 500 pg/ml ili više.Prijava sadrži još 18 patentnih zahteva.

Description

Pregled pronalaska

U saglasnosti sa ovim pronalaskom, obezbedjena su

potpuna humana monoklonalna antitela protiv humanog cito-toksičnog T-limfocitnog antigena 4 CTLA-4). Nukleotidne sekvence koje kodiraju i amino kiselinske sekvence koje sadrže teške i lake lance imunoglobulin molekula, naročito susedne teške i lake lance sekvenci koje se protežu preko regiona koji odredjuju komplementarnost (CDRs), naročito su obezbedjeni od unutar FR1 i/ili CDR1 do CDR3 i/ili unutar FR4. Dalje su obezbedjena antitela koja imaju slične osobine vezivanja i antitela (ili drugi antagonisti) koja imaju slične funkcionalnosti kao antitela opisana ovde.

Osnova tehnologije

Regulacija imunog odgovora kod pacijenata treba da

obezbedi željeno tretiranje mnoqih humanih bolesti što

može da dovede do specifičnosti dejstva koje se retko

nalazi u toku upotrebe konvencionalnih lekova. Moguće je i aktiviranje i dezaktiviranje regulacije odgovora imunog sistema. Uloge T ćelija i B ćelija su ekstenzivno prouča-vane i okarakterisane u vezi sa regulacijom imunog odgovora. Iz ovih studija, izgleda da je uloga T ćelija, u mnogim slučajevima naročito važna u prevenciji i tretiranju bolesti.

T ćelije poseduju veoma komplksne sisteme za kont-rolisanje njihovih interakcija. Interakcije izmedju T ćelija koriste mnogobrojne receptore i rastvorne faktore za proces. Prema tome, kakav efekat mo?e da ima bilo koji odredjen signal na imuni odgovor uglavnom varira i zavisi od odredjenih faktora, receptora i protiv receptora koji su uključeni u putanju. Putevi za dezaktiviranje regulacije odgovora su oni isto tako važni kao i oni zahtevani za aktivaciju, Obrazovanje timusom koje dovodi do T-ćelijske tolerancije je jedan meha-nizam za prevenciju imunog odgovora na odredjeni antigen. Takodje su poznati i drugi mehanizmi, kao što je sekrecija supresivnih citokina.

Aktivacija T ćelija zahteva ne samo stimulaciju preko receptora antigena CT ćelijski receptor(TCR)) fveć dodatno signaliziranje preko kostimulatorne površine molekula kao što je CD28. Ligandi za CD28 su B7-1 CCD80) i B7-2 (CD?) proteini, koji se ekspresionišu na antigen-predstavljajuće ćelija kao što su dendritične ćelije, akti-virane B-ćelije ili monociti koji interaguju sa TVćelijom • CD28 ili CTLA^4 da bi se odao kostirhulatornu signal. Uloga kostimulatornog signaliziranja je studirana u eksperimentalnom alergičnom encefalomijelitisu (EAE) od strane Perrin-a

et al. Immunol Res 14:189^99 (1995). EAE je autoimuni poremećaj, izazvan pomoću Thl ćelija usmerenih protiv

mijelin (myelin) antigena koji obezbedjuju in vivo model za studiranja uloge E7-izazvanih kostimulacija u izazivanju patološkog imunog odgovora. Upotrebljavajući rastvorni fuz ioni protein ligand za B7 receptore, kao i monoklonalna antitela specifična bilo za CD80 ili CD86 , Perrin i sarad, su demonstrirali da B7 kostimulacija igra prominentnu ulogu u odredjivanju rezultata kliničkih bolesti u EAE.

Interakcija izmedju B7 i CD28 je jedan od nekoliko ko-stimulatornih signalnih puteva,koji su izgleda dovoljni da izazovu sazrevanje i pfoliferaciju antigena specifičnog za T-ćelije. Nedostatak ko-stimulacije i prateće neadekvat-nosti IL-2 proizvodnje, sprečavaju narednu proliferaciju T ćelije i izazivaju stanje ne-reaktivnosti nazvano "anergija". Različiti virusi i tumori mogu da blokiraju T-ćelijsku aktivaciju i proliferaciju, dovodeći do nedovoljne aktivnosti ili do ne-reaktivnosti imunog sisistema domaćina na inficirane (zaražene) ili transformisane ćelije. Medju jednim Brojem mogućihT-ćelijskih poremećaja, anergije može da bude bar delimićno odgovorna za neuspeh domaćina da ukloni patogene ili tumorne ćelije.

Upotrebu B7 proteina da izazove anti-tumorni imunitet opisali su Chen et al. Cell 71:1093-1102 (.1992) i Townsend i Allison Science 259:368 (1993). Schwartz Cell 71:1065

(1992) daje pregled uloge CD28, CTLA-4, i B7 u IL-2 proizvodnji i imunoterapiji. Harding et al. Nature 356:607-609

(1994) pokazali su da CD28 izaziva signalnu ko-stimulaciju mišijih T-ćelija i sprečava indukciju anergije u T-ćelijskim klonima. Videti takodje U.S. Patente Brojeva 5,434,131, 5,770,197, i 5,773,253 i Internacionalne Patentne Prijave Brojeva WO 93/00431, WO 95/019-94, WO 95/03408, WO 95/24217, i WO 95/33770

Iz prethodnog je jasno da T-ćelije zahtevaju dva tipa signala iz ćelije koja predstavlja antigen (APC) za aktivaciju i sledeću diferencijaciju u efektorsku funkciju.

Prvo, postoji za antigen specifičan signal koji se đobi-

ja 'interakcijama izmedju TCR na T-đeliju i MHC molekule" koji predstavljaju peptide na APC. Drugo, postoji antigen nezavistan signal koji se izaziva pomoću interakcije CD28

sa članovima - B7 familije (B7-1 (CD80) ilib7-2 (.CD86), Egzaktno, tamo gde se CTLA-4 uklapa u ambijent imunih odgovora je bio u početku nejasan. Misiji CTLA-4 je bio identifikovan i kloniran od strane Brunet-a et. al. Nature 328:267-270 (1987), kao deo traganja za molekulima koji su prvenstveno ekspresionisani na citotoksičnimT-limfočitima Humani CTLA-4 je identifikovan i kloniran ubrzo posle toga od strane Dariavach-a et al. Eur. J. Immunol.18:1901-1905

(1988). Misiji i humani CTLA-4 molekuli poseduju približno 76% ukupne homologije sekvence i približavaju se komplet-noj identičnosti sekvence u njihovim citoplazmičnim područ-jima (Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 je član imunoglobulin (Ig)superfamilije proteina. Ig superfamilija je gruepa proteina koja ima zajedničke ključne strukturne osobina bilo varijabilnog CV) ili konstantnog" (C) područja Ig molekula. Članovi Ig superfamilije uključuju, ali nisu ograničeni naf' same imunoglobuline, glavnu histokompatibilnu kompleksnu (MHC)klasu molekula (tj., MHC klasu;! i II) V i TCR molekule.

U 199-i',' Linslev et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (199.1), su predložili da je CTLA-4 drugi receptor za B7, Slično, Harper et al. J. Immunol.'147:1037-44 (1991) su pokazali da su CTLA-4 i CD28 molekuli usko povezani i kod miševa<;>i"kod ljudi s obzirom na sekvencu, ekspresiju poruke, strukturu gena i hromosomalnu lokaciju. Videti takodje Balzano et al. InterJCancer Suppl 7:28^-320- 992).Dalja evidencija ove uloge porasla je funkcionalnim studijama. Na primer, Lenschov et al. Science 257:789-792 U99.2) pokazali su da CTLA-4-Ig inđukuje dugotrajno preživljavanje pankreatičnifi kalema Freeman et al, Science 262:907-909

(1993) su ispitali ulogu CTLA-4 kod B7deficijentnih miševa. Ispitivanja liganada za CTLA-4 su opisana kod Lenschow-a

et. al. P.N.A.S. 90.:110.54-110.58 U9-9-3) . Linsley et al, Science 257:792-79-5 (19-9 2) opisuju imunosupresiju in vivo pomoću rastvornog oblika CTLA-4. Linslev et al. J. Exp Med 176:159-5^6.Q4 C19-92) dobili su antitela koja vezuju CTLA-4

i koja nisu unakrsno reaktivna sa CD28 i zaključili da se CTLAt4 kOT-ekspresioniše sa CD28 na aktiviranim T limfociti-ma i kooperativno reguliše T ćelijsku ađheziju i aktivaci^

ju pomoću B7, Kucfiroo et al. Cell 80:707t18 Q995) pokazali su da B7-1 i B7-2 kostimulatorni molekuli različito aktivi-raju Thl/Th2 razvojne puteve, Yigun et al. Int Immunol 8: 37-44 (1996) su pokazali da postoje različiti zahtevi za kOT-stimulatorne signale iz članova B7 familije pomoću "restinga" prema nedavno aktiviranim memorijskim T-ćelijama u v. reaktivirajuće antigene. Videti takodje de Boer et al. Eur J. Immunol 23:3120-5 (1993).

Nekoliko grupa je predložilo alternativne ili razli-čite receptor/ligand interakcije za CTLAr-4 u poredjenju sa CD2 8 i čak je predložen treći B<^7 kompleks koji se raspoznar je pomoću BB1 antitela. Videti, na primer', Hathcock et al, Science 262:905-7 (1993), Freeman et al, Science 262:907r9

(1993), Freeman et al* J. Exp Med 178:2185^-92 (1993), LenschoV et al. Proc, Natl Acad Sci U S A 90:110-54-8 (199-3) , Razi-Wolf et al. Proc pati Acad Sci USA 90:11182-6

(1993), i Boussiotlš et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11059-63 (1993). Ali, videti Freeman et al. J. Immunol 161 :2708-15 C199-8) koji su prodiskutovali pronalazak da BB1 antitelo vezuje molekul koji je identičan sa ćelijskom ppvršinom CD7 4 i, stoga se BB1 mAb vezuje za protein različit od B7-1, i ovaj epitop je takodje prisutan na B7-1 proteinu« Prema tome ovo razmatranje zahteva polje za razmatranje studije koristeći BBl mAb u analizama CD80 ekspresije i funkcije. Početkom 1993 i kulminirajući u 1995, pronalazači su započeli da dalje opisuju ulogu CTLA-4 u T-ćelijskoj stimulaciji. Prvo, upotrebom monoklonalnih antitela protiv CTLA-4, Walunas et al. Immunity 1: 405-13 (.19-9-4) obezbedili su evidenciju da CTLA-4 mo§e da funkcioniše kao negativan regulator T-ćelijske aktivacije. Posle toga, Waterhouse et al. Science 270:985-988 (1995) demonstrirali su da miše-vi koji su deficijentni za CTLA-4 akumuliranih.T ćelijskih eksplozija sa aktivirajućom regulacijom aktivacionih markera u njihovim limfocitnim čvorovima* i sleziniEksplozivne ćelije se takodje infiltriraju u tkivcT ietre srca-, pluća i pankreasa, i količina imunoglobulin - seruma ge povećava a njihove T ćelijske proliferaci je spontano i jako kada še stimuliše preko T ćelijskog receptora, medjutim, one su bile osetljiva na ćelijsku smrt indukovanu unakrsnim vezivanjem Fas receptora i pomoću gama zračenja. Waterhouse et al. su zaključili da CTLA-4 deluje kao negativan regulator T ćelijske aktivacije i vitalan je za kontrolu limfocitne homeostazeU komentaru u istom izda-nju, Allison i Krummel Science 270:932^933 (1995) prodiskutovali su rad Waterhous-e-a et al. kao demonstrativni da CTLA-4 deluje dezaktivirajuće na regulisanje T-ćelijske odgovornosti ili ima inhibitorsku signalnu ulogu u T^ćelij-skoj aktivaciji i razvoju. Tivori et al. Immunity 3:541-7 C1995) su takodje dobili CTLA-4 deficijentne miševe i demonstrirali da takvi miševi brzo razvijaju limfoprolif e- r rativnu bolest sa multiorganskom limfocitnom infiltracijom i destrukcijo tkiva, sa naročito ozbiljnim miokarditisom i pankreatitisom. Oni su zaključili da CTLA-4 igra ključnu ulogu u dezaktivirajuđoj regulaciji T ćelijske aktivacije i održavanju imunološke homeostaze„ Takodje, Krummel i Allison J Exp Med 182:459-65 (1995) dalje razjašnjavaju

da CD28 i CTLA-4 imaju suprotne efekte na odgovor T-ćelija na stimulaciju. Oni su dobili antitelo za CTLA-4 i ispita-

li efekte njegovog vezivanja na CTLA-4 u sistemu koji koristi visoko prečišćene T ćelije. U njihovom izveštaju,

oni su pokazali da prisustvo niskih nivoa B:7t2 na sveže eksplantirane T ćelije može delimićno da inhibira T ćelij-sku proliferaciju, a ovo inhibiranje se izaziva pomoću interakcija sa CTLA-4, Unakrsno vezivanje CTLAt4 zajedno sa TCR i CD28 jako inhibira proliferaci ju i ILt-2 sekreciju pomoću T ćelija. Na kraj 13," rezultati pokazuju da CD2 8 i CTLA-4 daju suprotne signale koji izgleda da se integrišu pomoću T ćelija u odredjivanju odgovora za antigen. Prema tome, oni su zaključili da je rezultat stimulacije T-ćelij-skog antigen receptora regulisan pomoću C S2.8 kostimulator-nih signala, kao i inhibitorskti"signal a izvedenih iz CTLA-

4. Videti takodje Krummel et al. Int Immunol 8:519-23

(1996) i U.S. Patent Br. 5,811,097 i Interna<p>ionalu Patentnu Prijavu Br. WO 97/20574.

Izvršeni su različiti dodatni eksperimenti koji

dalje osvetijavaju gornju funkciju CTLA-4. Na primer,

Walunas et al. J. Exp Med 183:2541-50 (199-6)', preko upotrebe anti-CTLA-4 antitela sugeriše da CTLA^4 signaliziranje ne reguliše preživljavanje Gelija ili odgovornosti za IL-2,

ali inhibira CD28 zavisnu ILt2 proizvodnju. Takodje, Perrin et al. JT. Immunol 157:1333-6 Cl9-9.6) su pokazali da anti-CTLA-4 antitela u eksperimentalnom alergijskom encjefal<aari3elitisu (EAeI pogoršavaju Bolest i povećavaju smrtnost. Pogoršavanje bolesti je povezano sai povećanom proizvodnjom encefalito-genih- citokina. TNJF-alfa, iFN^gama i IL^2. prema tome, oni

zaključilida CTLA-4 reguliše intenzitet autoimunog odgo-

vora u EAE, slabljeći proizvodnju inflaraatornih citokina i manifestacije bolesti. Videti takodje Hurwitz et al. J Meuroimmunol 73:57-62 (1997) i Cepero et al. J. Exp Med 188:199-204 (1998) (anti-CTLA-4 "hairpindibozym" koji specijalno ukida CTLA-4 ekspresiju posle transfera gena u misiji T-đelijski model),

Pored toga, Blair et al. J. Immunol 160:12-5 (1998) ocenili su funkcionalne efekte panela CTLA-4 monoklonalnih antitela (mAbs) na mirujućim . CD4+ T delijama. Njihovi rezultati pokazuju da neke CTLA-4 mAbs mogu da inhibiraju proliferativne odgovore preostalih CD4+ delija i tranzicioni đelijski ciklus od G0 do Gl. Inhibitorski efekti CTLA-4 su bili evidentni unutar 4 sata, u vreme kada§e*ne mojsj^otkriti ekspresija ćelijske površine CTLA-4, Druge CTLA-4 mAbs, medjutim, nisu imale nikakve^inhibitorske efekte koji se mogu otkriti, pokazujući da vezivanje mAbs na same CTLA-4 nije dovoljno da izazove dezaktivaciju regulacije T ćelijskih odgovora. Zanimljivo je da je, dok je proizvodnja IL-2 bila isključena, i inhibicija anti CTLA-4 mAbs omogućava indukciju i ekspresiju ćelijskog gena preživljavanja bcl-X(L), Konzi-stentno sa ovim posmatranjem, ćelije ostaju sposobne za život ii apoptoza nije otkrivena posle CTLA-4 ligacije

U vezi sa anergijom, Perez et al, Immunii<y.>6: 411*-7 ) 199.7) su pokazali da je indukcija T-ćelijske anergije sprečena blokiranjem CTLA-4 i zaključili su da je rezultat

raspoznavanja antigena pomoću T ćelija odredjen pomoću interakcije CD28 ili CTLA-4 na T ćelijama sa B7 molekulima. Takodje, Van Parijs et ;al. J Exp Med 186 :1119-28 (.199-7) ispitali su ulogu interleukina 12 i kostimulatora na; T ćelijskoj anergiji in vivo i našli da se preko inhibiranja CTLA^-4 angažovanja tokom indukcije anergije, T ćelijska prolifera-cija blokira, x potpuna Thl diferencijacija nije potpomog-nuta. Medjutim,T ćelije izložene tolerogenom antigenu u

prisustvu i IL-12 i anti CTLA-4 antitela nisu bila anergi-zovana i ponašala su se identično' kao Tdelije, koje su susrele imunogeni antigen. Ovi rezultati sugerišu da dva procesa učestvuju u indukciji anergije in vivo: CTLA-4 angažovanja, koje dovodi do blokiranja u sposobnosti T

delija da proliferiraju, i odsustva prototipa inflamator-

nih citokina, IL-12, što sprečava diferencijaciji]T ćelija u Thl efektor delije. Kombinacija IL-12 i anti-CTLA-4 antitela je dovoljna da konvertuje normalni tolerogeni stimu-

lus u imonogeni.

U vezi sa infekcijama, McCoy et al.JExp Med 186: 183-7 (.19.97) pokazali su da anti-CTLA-4 antitela u mnogome povećavaju i ubrzavaju T celijski imuni odgovor na Nippostrongylus brasiliensis, dovodeći do jako izrazitog smanjenja kod broja odraslih crva i ranoj terminaciji proizvodnje jaja parazita. Videti takodje Murphy et al, J Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani),

U vezi sa kancerom, Kwon et al, PNAS USA 9-4 : 8 0-9-9 c

103 (1997) su odredili model sirigeneičnog mišjeg kancera prostate i ispitali su dve posebne manipulacije namenjene da izazovu antiprostata kancer odgovor preko povećane kor stimulacije T ćelija: (i) snabdevanje direktne kostimulacije pomoću ćelija kancera prostate transđukovanih da eks? presionišu B7-1 ligand i (ii) in vivo antitelo izazvanu blokadu T ćelija CTLA«?4, što sprečava T-ćelijsku dezaktivaciju regulacije. Pokazano ja da in vivo antitelo-izazvana blokaduCTLA-4 povećava antiprostata kancer imune odgovore, Takodje, Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 Cl997) su ispi^-tivali da li blokada CTLAt-4 funkcije dovodi do povećanja antitumornih T-rćelijskih. odgovora pri različitim stupnjevi-ma rasta tumora.Na bazi in vitro i in vivo rezultata oni su našli da CTLA^4 blokada kod pojedinaca koji imaju tumor povećava kapacitet da se dobiju antitumorni T^ćelijski odgovori, ali ekspresija tavog efekta ubrzavanja ograničena na

rane stupnjeve rasta tumora u njihovom modelu, Dalje, Hurv/itz et al. Proc Natl Acad Sci U.S A 95:10067-71 (1998), ispitivali su obrazovanje T đelijski \izazvanih antitumornih odgovora zavisnih od T čelijskog receptor angažovanja pomoću glavnog histokompatibilnog kompleks/antigen kao i CD28 ligacije pomoću B7, Izvesni tumori, kao što su SM1 karcinoma dojke, su bili gaseći za CTLA-4 imunoterapiju. Prema tome, kroz upotrebu kombinacije CTLA-4 blokade i vakcine koja se sastoji od granulocitne-makrofag koloni-je- stipsalacioftog faktora koji ekspresioniše SM1 ćelija, posraatrana je regresija parenteralnih SM1 tumora, i pored ne-efikasnosti bilo kojeg tretiranja samog za sebe. Ova kombinovana terapija daje dugotrajni imunitet za SM1 i zavisi i od CD4(+) i CD8(+) T ćelija. Ovi nalazi sugerišu da CTLA-4 blokada deluje na nivou koji predstavlja ćeliju izvedenu iz domaćina koja predstavlja antigeo.

U vezi sa dijabetesom, Luhder et al, J,Exp Med 187:427-32 (1998) injektirali su anti CTLA-4 mAb u TCR transgeni misiji model dijabetesa pri različitim stupnje-vima bolesti. Oni su utvrdili da angazovanje CTLA-4 u vreme kada su potencijalne dijabetogene T ćelije prvi put akti-virane je ključni dogadjaj; ako je dozvoljeno angazovanje, javlja se invazija osipa, ali se ne može inokulirati mesecima.Ako ne, insulitis je znatno agresivniji i brzo sledi dijabetes.

U ve^ i sa imunizacijom vakcinom, Horspool et al.

J Immunol 160:270-6^-14 0-9-9 8) su utvrdili da intaktni anti-CTLA-4 mAb ali ne i FAb fragmenti g^iše primarni humoralni odgovor napClA/Beta gal bez dejstva na odgovore opoziva, ukazujući da CTLAt4 aktivacija inhibira Ab proizvodnju ali ne T đelijski prajming. Blokada liganada za CD28 i CTLA^4, CD80 (J37-1) i CD86 (B7-2) otkriva posebnu i ne-preklapajuću funkciju. Blokada CD80 pri početnoj imuniza--ciji kompletno ukida primarne i sekundarne Ab odgovore,

dok blokada CD86 ukida primarne ali ne i sekundarne odgovore. Simultana blokada CD80 + CD86 je manje efikasna pri ugušivanju Ab odgovora nego bilo koja odvo-jeno svaka za sebe. Povećanje kostimulacije preko koinjek-cije B7- ekspresionišućih plazmida povećava CTL odgovore ali ne i Ab odgovore, i bez evidencije o Thl do Th2 iskošavanja. Ovi nalazi sugerišu kompleksne i posebne uloge za CD28, CTLA-4,' CD80, i CD86 u T ćelijskoj ko-stimulaciji prateće vakcinacije nukleinskom kiselinom.

U vezi sa alografsktm odbacivanjem, Markees et al,JClinInvest 10.1 :2446-55 Cl 9-9 8') su našli da u mišjem modelu kožnog alograf odbacivanja čija prihvatljivost u početku zavisi od prisustva IFN^gama, CTLAt4, i CD4 0)

T ćelije . Dodatno od anti-CTLA-4 ili anti-IFN^-gama mAb

za protokol je povezan sa brzim graft odbacivanjem, dok anti-IL-4 mAb nije imao efekta.

U vezi sa ulogom CTLA-4 u odnosu na CD28, Falla-rino et al. JExp Med 188:20.5-10 U99-8) dobili suTCRtransgeni/rekombinasa aktivirajući gen 2r-def ici jentnog/CD • 28T-đivljeg tipa ili CD28Tdeficijentnog utiša koji je imunih ziran sa antigen ekspresionišućim tumorom. Prajmovane T-ćelije iz oba tipa miševa proizvele su citokine i prolife-rovane su u odgovoru na stimulatorske ćelije koje oskude-vaju u B7 ekspresiji. Medjutim, dok je odgovor CD28+/J- T ćelija povećan pomoću-kostimulaci je saB7«-a',' odgovor CD2 8* ?-/ — T ćelija je jako inhibiran. Ova inhibicija je preobrnuta pomoću monoklonalnog antitela protiv B7^1 ili. CTLAt4. Prema tome, CTLA-4 može potencijalno da inh.ib.tra

T ćelijsku aktivaciju u odsustvu CD28, ukazujući da je. antagonizam TCR izazvanog signala dovoljan da objasni inhibitorski efekat CTLA-4. Takodje, Lin et al, J Exp Med 188:19.9-204 Q99-8)Su proučavali odbacivanje srčanih-alografta kod CD28 deficijentnih miševa. Hv2Cq) srca su

transplantirana u alogenični divlji tip ili CD28-defici-

jentne miševe (H-2(b)).Graft odbacivanje je odloženo kod CD28 deficijentnih miševe u poredjenju sa divljim tipom miševa. Tretiranje divljeg tipa recipijenata sa CTLA-4-imunoglogulinom (Ig), ili sa anti-B7-l plus anti-B7-2

mAbs značajo je produžilo alograft preživljavanje. Na suprot ovome, tretiranje CD28 deficijentnih miševa sa CTLA-4-lg, anti-B7-l plus anti-B7-2 mAbs,' ili blokirajućim anti-CTLA-4 mAb izazvalo je ubrzavanje alograft odbacivanja. Ova povećana brzina graft odbacivanja je povezana sa ozbiljnom infiltracijonu mononuklearnih , ćelija i povećanim nivoima IFN-gama i IL-6 transkripata . u srcima donora ne-tretiranih divljeg tipa i CTLA-4-Ig- ili anti-CTLA-4 mAb-tretiranih CD28-deficijentnih miševa, "reraa tome, negativna regulatorska uloga CTLA-4 proteže . se i na njegove potencijalne sposobnosti da spreći CD28 aktivaciju pomoću ligand kompe-ticije. Čak i u odsustvu CD28, CTLA-4 igra inhibitorsku ulogu u regulaciji alograft odbacivanja.

Takodje,ispitivane su dalje karakteriz.acije ekspresije CTLA-4. Na primer, Alegre et al. J Immunol 157:4762-70

(1996) pretpostavili su da se površina C<*>DLA?--4 brzo internali-zuje, što može da objasni niske nivoe ekspresije koji se uglavnom detektuju na ćelijskoj površini. Oni su zaključiji da i CD28 i IL-^2 ingraju važne uloge u aktivira judo j regu^laciji CTLAt4 ekspresije. Pored toga,' izgleda da j#. akuHiu?'cija CTLA-4 ćelijskom površinom primarno regulisana pomoću njene brze endocitoze. Takodje, Častan et al. Immunologv 90:265-71 C19.9.7) na osnovu in situ imunohistoloških analiza ekspresije CTLA-4 predložili su da germinalne centralne T ćelije,' koje su CTLA-4 pozitivne, mogu da budu važne za imunu regulaciju.

Prema tome,' u svetlu široke i osnovne uloge za

koju izgleda da poseduje CTLA-4 u imunoj odgovornosti, poželjno je da se dobiju antitela za CTLA-4 koja se mogu koristiti efikasno u imunoterapiji. Osim toga, poželjno je da se dobiju antitela protiv CTLA~4 koja se mogu koristiti u hroničnim bolestima u kojima se zahteva ponovna primena antitela.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 obezbedjuje seriju nukleotidnih i amino kiselinskih sekvenci teškog lanca i kappa lakog lanca imunoglobulin molekula u saglasnosti sa pronalaskom: 4.1.1 (Slika 1A), 4.8.1 (Slika 1B) ; 4.14.3 (Slika 1C), 6.1.1 (Slika 1D), 3.1.1. (Slika 1E), 4.10.2 (Slika 1F), 2.13 (Slika IG), 4.13.1 (Slika IH); 11.2.1 (Slika II), 11.6.1 (Slika U), 11.7.1 (Slika 1K), 12.3.1.1 (Slika 1L) , i 12.9.1.1 (Slika IM).

Slika 2 obezbedjuje regulisanje sekvence izmedju predskazanih amino kiselinskih sekvenci teškog lanca od klona 4.1.1, 4.8.1; 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, i 12.9.1,1 i amino kisellnsku sekvencu matične loze DP-50 (3-33). Razlike izmedju sekvence matične loze DP-50 i one iz sekvence u klonima prikazane su masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao osenčene.

Slika 3 obezbedjuje regulisanje sekvenci izmedju predskazanih amino kiselinskih sekvenci teškog lanca klona 2.1.3 i amino kiselinske sekvence matične loze DP-65

(4-31). Razlike izmedju DP-65 sekvence matične loze i one

iz sekvence klona prikazane su masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene

Slika 4 obebeđuje regulisanje sekvence izmedju predskazanog kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2, 4.13.1 i amino kiselinske sekvence matične lcze A27 . Razlike izmedju sekvence matične loze A27 i one sekvence u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene. Očigledna izostavijanja u CDRl-ima klonova 4.8.1, 4.14.3 i 6.1.1 su označena sa „OS".

Slika 5 obezbedjuje regulisanje sekvence izmedju predskazanog kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, i 11.7.1 i amino kiselinske sekvence matične loze 012. Razlike izmedju sekvence matične loze 012 i one iz sekvence u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 6 obezbedjuje regulisanje sekvence izmedju predskazanoq kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 2.1.3 i amino kiselinske sekvence matične loze A10/A26. Razlike izmedju sekvence matične loze A10/A26 i one iz sekvence u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 7 obezbedjuje regulisanje sekvence izmedju predskazanog kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 12.3.1 i amino kiselinske sekvence matične loze A17. Razlike izmedju sekvence A17 matične loze i sekvence u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 8 obezbedjuje regulisanje sekvence izmedju predskazanog kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence i klona 12.9.1 i amino kiselinske sekvence matične loze A3/A19 Razlike izmedju sekvence matične loze A3/A19 i one sekvence iz klona su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuju položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 9 obezbedjuje pregled N-terminalnih amino kiselinskih sekvenci proizvedenih direktnim sekvencionisanjem proteina teških i lakih lanaca antitela.

Slika 10 obezbedjuje izvesne dodatne informacije karakterisanja o izvesnim antitelima u saglasnosti sa pronalaskom. U Slici 10A sumirani su podaci koji se odnose<na>klone 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, , 4^10. 2, 4.14.3, i 6.1.1. Obezbedjeni su podaci koji se odnose na koncentraciju, izoelektrično fokusiranje (IEF), SDS-Page, veličinu ekskluzione hromato-grafije, tečnu hromatografiju/masenu spektroskopiju (LCMS), masenu spektroskopiju (MALDI) za laki lanacN-terminalnih sekvenci. Dodatna detaljna informacija koja se odnosi na IEF je obezbedjena u Slici 10Bfobezbedjena je srodna za

za SDS-PAGE u 10C; i SEC 4.1.1 antitela u 10D,

Slika 11 prikazuje ekspresiju B7-1 i B7-2 na Raji ćelije upotrebljavajući anti-CD-80-PE i anti-CD86-PE mAbs.

Slika 12 prikazuje od koncentracije zavisno poveća-nje IL-2 proizvodnje u T ćelijskoj blast/Raji analizi izazvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajućih antitela (BNI3, 4.1.1, 4.8,1, i 6.1.1) .

Slika 13 prikazuje od koncentracije zavisno poveća-nje IFNtV proizvodnje u T ćelijskoj blast/Raji analizi izazvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajućih antitela (.BNI3, 4.1.1, 4.8,1, i 6.1.1) {isti donor T ćelija).

Slika 14 prikazuje srednju vrednost povećanja IL-2 proizvodnje ai T ćelijama (od 6 donora) izazvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajućih antitela u T ćelijskoj blast/Raji analizi.

Slika 15 prikazuje srednju vrednost povećanjaIFN- ¥proizvodnje u T ćelijama od 6 donora izažvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajućih antitela u T ćelijskoj blast/Raji analizi.

Slika 16 prikazuje povećanje IL~2 proizvodnje u hPBMC iz 5 donora izazvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajući^

mAbs mereno na 72 sata posle stimulacije sa SEA.

Slika 17 prikazuje povećanje IL-2 proizvodnje u celokupnoj krvi od 3 donora izazvano pomoću anti-CTLA-4 blokirajućih mAbs mereno na 72 sata i 96 sati posle stimulacije sa SEA.

Slika 18 prikazuje inhibiciju rasta tumora sa anti-mišijim CTLA-4 antitelom u modelu mišijeg fibrosarkoma tumora.' "~

Slika 19 prikazuje povećanje IL-2 proizvodnje izazvano pomoću anti-GTLA-4 antitela (4.1.1 i 11.2.1) prema pronalasku na 72 sata T blast/Raji i Superantigen (celokulne krvi i periferne krvi mononuklearnih ćelija iz

6 donora) analiza.

Slika 20 prikazuje od doze zavisno povećanje IL-2 proizvodnje izazvano pomoću anti-CTLA-4- antitela (4,1.1

i 11.2.1) prema pronalasku na 72 sataTblast/Raji analize.

Slika 21 prikazuje od doze zavisno povećanje IL-2 proizvodnje izazvano pomoću anti-CTLA-4 antitela (4.1,1 i 11.2.1) prema pronalaku na 72 sata Superantigen celokupne krvi analize stlmulisane sa 10Q ng/ml superantigena.

Slika 22 obezbedjuje seriju dodatnih nukleotidnih

i amino kiselinskih sekvenci sleđećih anti-CTLA-4-antitelo lanaca: potpune dužine 4.1.1 teškog lanca (cDNK 22(a), genomnog 22(b), i amino kiselinskog 22 (c)), potpune dužine aglikozilovanog 4.1.1 teškog lanca (cDNK 2 2 (d) i amino kiselinskog 2 2 (e) ) , 4.1.1 lakog lanca (cDNK 22(f) i amino kiselinskog 22 (g)), potpune dužine 4.8.1 teškog lanca (cDNK 22(h) i amino kiselinskog 22(i)), 4.8.1 lakog lanca (cDNK 22(j) i amino kiselinskog 22 (k)), potpune dužine,6,1.1 teškog lanca (cDNK 22(1) i amino kiselinskog 22 Cm), 6.1.1

lakog lanca (cDNK 22 (n) i amino kiselinskog 22(oj), potpune dužine 11,2.1 teškog lanca (cDNK 22 (p) i amino kiselinskog 22(q)) i 11.2.1 lakog lanca (cDNK 22 (r) i amino kiselinskog 22(s)).

PREDLED PRONALASKA

U saglasnosti sa prvim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je antitelo koje je sposobno da veže CTLA-4, koje sadrži težak lanac varijabilnog regiona amino kiselinske sekvence koji sadrži susedria ; amino kiselinsku sekvencu od unutar FR1 sekvence do FR3 sekvence koja je kodi-rana pomoću humanog Vrj 3-33 familije gena i koji sadrži najmanje jednu od amino kiselinskihsupstitucija u CDR1 sekvencama,' CDR2 sekvencama, ili okvirnim sekvencama prikazanim na Slici2. U prvenstvenoj realizaciji, amino kiselinska sekvenca sadrži sekvencu selektovanu iz grupe koja se sastoji od SEO ID N0:1, SEO ID NO: 2 ,' SEO ID NO: 3, SEO ID N0.-4,<1>SEO ID No: 5,' SEO ID NO: 6, SEO ID N0:£, SEO

ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEO ID NO:liy SEO ID N0:12, SEO ID NO:13, SEO ID NO:63y SEO ID NO: 64, SEO ID NO:66, SEO ID NO:68, i SEQ ID NO:70. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo dalje sadrži laki lanac varijabilnog regiona amino kiselinske sekvence koja sadrži sekvencu oda-branu iz grupe koja se sastoji od sekvence koja sadrži SEO

ED NO:14, SEQ ED NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ED NO:22, SEQ ED NO:23, SEQ ED NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ED NO:26, SEQ ID NO:65, SEQ

ID NO:67, SEQ ID NO:69, .-i.,'. SEQ ED NO:71.

U saglasnosti sa drugim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je antitelo koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO ID NO:j_ i laki lanac varijabilne amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO IE> NO:14 .

U saglasnosti sa trećim aspektom ovog pronalaska, ovezbedjeno je antitelo koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO ID NO:2 i laki lanac varijabilne amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO ID NO:15.

U saglasnosti sa četvrtim aspektom ovog pronalas-

ka, obezbedjeno je antitelo koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO ID NO:4 i laki lanac varijabilne amino kiselinske sekvence koja sadrži SEO ID No:17.

U saglasnosti sa petim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je izolovano humano monoklonalno antitelo koje je sposobno da se veže za CTLA-4,. U prvenstvenoj realizaciji, antitelo je sposobno da konkuriše za vezivanje sa CTLA-4 sa antitelom odabranim iz grupe koja se sastoji od 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,' 4.13.1, 4.14.3,

6.1.1, 11.2.1/ 11.6.1,' 11.7.1, 12.3.1.1,' i 12.9-.1.1'. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo poseduje suštinski sličnu specifičnost vezivanja za CTLA^-4 kao antitelo selektovano- iz grupe koja se sastoji od 3,1,1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1', 11.2.1,' 11,6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, i 12,9-.1.1, U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od 3.1.1,' 4.1.1,' 4.8.1, 4,10.2, 4.13.1, 4,14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, i 12,9.1.1, U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo nije unakrsno reaktivno sa CTLA-4 iz nižih vrsta sisara, prvenstveno niže vrste sisara obuhvataju miševe, pacove, i zečeve i još pogodnije miševe i pacove. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo je unakrsno reaktivno sa CTLA-4 iz primata, prvenstveno primata koji obuhvataju cinomolgouS(cynomolgOus) i rezus majmune. U jednoj'drugoj1 prvenstvenoj realizaciji, antitelo poseduje selektivnost za OTLA-4 nad CD28, B7-2, CD44,1 i hlgGl od više od oko 10.0:1, a prvenstveno

oko 50Q:l ili više. U jednoj: drugoj prvenstvenoj realizam cijr, afinitet vezivanja antitela je oko 10 — 9 M ili više

prvenstveno oko IO**10 M ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-2 sa IC50od niže nego oko 100 nM, a prvenstveno niže nego oko 0.38 nM. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-1 sa IC50niže hego oko lOOnM ili više, a prvenstveno niže nego oko 0.50 nM. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo povećava IL-2 proizvodnju u T ćelijskoj blast/Raji analizi za oko 500 pg/ml ili više, a prvenstveno za oko 3846 pg/ml ili više. CJ jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo povećavaIFN- Yproizvodnju u T ćelijama blast/Raji analize za oko 500 pg/ml ili više a prvenstveno za oko 1233 pg/ml ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji,' antitelo povećava IL-2 proizvodnju u hPBMC ili celokupne. krvi superantigen analizi za oko 500 pg/ml ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo povećava IL-2 proizvodnju u hPRMC ili celokupne krvi superantigen analizi za oko 50Q pg/ml ili prvenstveno 150.0 pg/ml ili više nego oko 30% ili prvenstveno 50% u odnosu na kontrole.

U saglasnost^ gg šestim aspektom prema ovom pronar-lasku, obezbedjeno je humanizovano antitelo koje poseduje suštinski sličnu vezujuću specifičnost za CTLAt4 kao antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,6.1.1,. 11.2 h, • llTfc.1, 11.7.1,12.3.1.1, i 12.9.1.1. U prvenstvenoj realizaciji, antitelo nije unakrsno reaktivno sa CTLAt-4 iz nižih vrsta, sisara koji obuhvataju miševe, pacove i zečeve, prvenstveno miševe i pacove. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo je unakrsno reaktivno sa CTLA^4 iz primata, prvenstveno primata koji uključuju cinomolgous Ccvnomolgous) i rezus majmune. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo poseduje selektivnost za CTLA^4 nad CD28, B7^2, CD44 i filgGl od više od oko 100:1 i prvenstveno oko 50-0:1

ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, afini-

tet vezivanja antitela je oko 10~<9>M ili više i prvenstve-

no oko 10~10 ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-2

sa IGj-q od niže nego oko 100 nM i prvenstveno niže nego oko 0.38 nM. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-1 sa IC50

od niže nego oko 100 nM i prvenstveno niže nego oko U.bUnM. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo povećava IL-2 proizvodnju u T-ćelij-skoj blast/Raji analizi za oko 500 pg/ml ili više i prvenstveno za oko 3846 pg/ml ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji,antitelo povećava IFN- proizvodnju u T ćelijskoj blast/Raji analizi za oko 500 pg/ml ili više a prvenstveno za oko 1233 pg/ml ili više. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji, antitelo indukuje Cizaziva) IL-2 proizvodnju u hPBMC ili celokupne krvi superantigen ana-

lizi za oko 500 pg/ml ili više. U jednoj drugoj prvenstve-

noj realizaciji,' antitelo povećava IL-2 proizvodnju u hPBMC ili celokulpne krvi superantigen analizi za oko 5Q0 pg/ml ili prvenstveno 1500 pg/ml ili više ili za više nego oko 30% ili prvenstveno 50% u odnosu na kontrolu.

U saglasnosti sa sedmim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je antitelo koje se vezuje za CTLA-4,koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži humane FR1, FR2i- FR3 sekvence kodirane pomoću humane VH3^33

gen familije operacrono vezane u okvir sa CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenconi; CRl, CDR2, i CDR3 sekvence: su--nezayt;!^^©davane;; iz CDRl , CDR2 i CDR3 sekvencir"prikazanih, na Slici 2, U prvenstvenoj realizaciji, antitelo prema zahtevu 32',' dalje obuhvata bilo koju od somatičnih mutacija u FR1, FR2, i FR3 sekvencama kao što je prikazano u Slici 2.

U saglasnosti sa osmim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je antitelo koje se vezuje za CTLAr-4,' koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži humane FR1, FR2, i FR3 sekvence koj<e>su kodirane pomoću humane V 3-3<3>familije genaoperaciono vezane u okvir sa CDR1, CDR2, i CDR3 sekvencom, a koje antitelo ima sledeće

-9

osobine: afinitet vezivanja za CTLA-4 od oko 10 ili više, inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-1 sa IC^q od oko 100 nM ili niže<;>' inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-2 sa IC^0odoko 100 nM ili niže; i povećava proizvodnju citokina u analizi humanih T ćelija za 500 pg/ml ili više,

U saglasnosti sa devetim aspektom ovog pronalaska, obezbedjeno je antitelo koje se vezuje za CTLA-4, koje sadrži težak lanac amino kiselinske sekvence koja sadrži FR1, FR2, i FR3 sekvence operaciono vezane u okvir sa CDR1,' CDR2, i CDR3 sekvencom nezavisno odabranom iz CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenca prikazanim u Slikama 2 i 3, a koje antitelo ima sledeće osobine: afinitet vezivanja za CTLA-4 od oko 10-~ 9 ili više) inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 i B7-1 sa IG5Qod oko 100 nf4 ili niže; inhibira vezivanje izmedju CTLA-4 iB7-2 saIC5Qod oko 10.0 nM ili niže; i povećava proizvodnju citokina u analizi humanih T ćelija za 500. pg/ml ili više,

U saglasnosti sa desetim aspektom ovog pronalaska, obezbedjen je sistem ćelijske kulture za analiziranje T ćelijske stimulacije koji sadrži kulturu humanih T će lij skih blasta ko-kultivisanih sa Raji ćelijskom linijom. U prvenstvenoj realizaciji, T ćelijski blasti se peru pre kulture sa Raji ćelijskom linijom.

U saglasnosti sa jedanaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjena je analiza za merenje'T-ćelijske stimulacije koja obuhvata: obezbedjivanje kulture humanih T-ćelijskih blasta i Raji ćelijske linije; kontaktiranje kulture sa jednim agensom; i merenje proizvodnje citokina pomoću kulture.

U saglasnosti sa dvanaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjena je funkcionalna analiza za pretraži-vanje udela za T đelijsku stimulatornu funkciju, koja obuhvata: obezbedjivanje kulture humanih T celijskih blasta i Raji ćelijske linije; kontaktiranje kulture sa tim uđelom; i odredjivanje proizvodnje citokina pomoću kulture,

U saglasnosti sa trinaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjena je T ćelijska stimulatorna analiza za CTLA-4 inhibitorsku funkciju koja obuhvata kontaktiranje kulture koja sadrži humane T-ćelijske blaste i Raji ćelijsku liniju sa jednim agensom i odredjivanje proizvodnje citokina pomoću kulture.

U saglasnosti sa četrnaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjen je postupak za pretraživanje agensa za T ćelijsku stimulatornu aktivnost, koji obuhvata: kontaktiranje agensa sa ćelijskom kulturom koja sadrži humane T ćelijske blaste i Raji ćelijsku liniju; i odredjivanje proizvodnje citokina pomoću kulture,

U svakom od desetog do četrnaestog aspekta ovog pronalaska, u prvenstvenoj realizaciji, T ćelijski blasti se peru pre kulture sa Raji ćelijskom linijom. U jednoj drugoj prvenstvenoj realizaciji citokin je IL-2 ili IFN-* . U prvenstvenoj realizaciji, proizvodnja citokina se meri

u gornjem sloju tečnosti (supernatantu) izolovanom iz kulture. U prvenstvenoj realizaciji, agens je antitelo i prvenstveno se vezuje za CTLA-4.

U saglasnosti sa petnaestim aspektom ovog prona^laska, obezbedjena je analiza za merenje T ćelijske stiiuu^lacije, koja obuhvata! obezbedjivari^e pupulacije humanih mononuklearnin ćelija perirerne krvi ili humane celokupne krvi stimulisano sa staphylococcus enterotoxin-om A; kontak-tiranjem kulture sa agensom?i merenjem proizvodnje citokina pomoću ćelijske populacije.

U saglasnosti sa šesnaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjena je funkcionalna analiza za pretraživa-nje udela za T đelijsku stimulacionu funkcij»u koja obuhvata: obezbedjiva nje populacije humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi ili humane celokupne krvi stimulisano sa staphvlococcus enterotoxin-om A; kontaktiranje kulture sa udeloma i odredjivanje proizvodnje citokina pomoću ćelijs-ke populacije.

U saglasnosti sa sedamnaestim aspektom ovog pronalaska, obezbedjena je T ćelijska stimulatorna analiza CTLA-4 inhibitorske funkcije, koja obuhvata kontaktiranje populacije humanih monoklonalnih ćelija periferne krvi ili humane celokupne krvi stimulisane sa staphylococcus enterotoxin-om A sa agensom i odredjivanje proizvodnjecitokina na pomoću ćelijske populacije,

U saglasnosti sa osamnaestim aspektom ovog pronalaska, obezbeđjen je postupak za pretraživanje agensa za T ćeli>jsku stimulatornu aktivnost, koji obuhvata: kontakt tiranje. agensa sa populacijom humanih, mnonuklearnih ćelija periferne krvi ili humane celokupne krvi stimulisano sa staphylococcus enterotoxin^om Aj i odredjivanje proizvodnje citokina pomoću Ćelijske populacije.

U svakom od petnaestog do osamnaestog aspekta prema ovom pronalasku, u prvenstvenim realizacijama, citokin je IL^-2, U jednoj drugoj-prvenstvenoj realizaciji, proizvodnja citok±na se meri u gornjem sloju tećnosti (supernatantu) izolovanom iz kulture. U prvenstvenojrealizaciji, agens je antitelo i prvenstveno se vezuje za CTLA-4,

DETALJAN OPIS PRVENSTVENIH! REALIZACIJA

U saglasnosti sa ovim pronalaskom, obezbedjena su potpuna humana monoklonalna antitela protiv humanih CTLA-4. Obezbedjene su nukleotidne sekvence koje kodiraju i amino kiselinske sekvence koje sadrže teške i lake lance imunoglobulin molekula, naročito sekvence koje odgovaraju<su>sednimteških i lakih lanaca sekvencama iz ERI i CDR1 do CDR3 i FR4. Dalje su obezbedjena antitela koja imaju slične osobine vezivanja i antitela (ili drugi antagonisti) koji imaju slične funkcionalnosti kao antitela opisana ovde. Takodje su obezbedjeni hibridomi koji ekspresio-nišu takve imunoglobulin molekule i monoklonalna antitela.

Definicije

Ukoliko nije drugojačije ovde definisano,:naučni i tehnički izrazi upotrebljeni ovde u vezi sa ovim pronalaskom treba da imaju značenja koja se uobičajeno podrazume-vaju od strane stručnjaka. Dalje, ukoliko nije drugojačije zahtevano kontekstom, izrazi u jednini treba da obuhvataju množine i izrazi u množini treba da obuhvataju jedninu. Uglavnom, nomenklature korišđene u vezi sa ovim,: i tehnike, kulture delija i tkiva, molekularne biologije i proteinske i oligo- ili polinukleotidne hernije i hibridizacija opisani ovde su one dobro poznate i obično korišđene u tehnici. Standardne tehnike se upotrebljavaju za rekombi-nantnu DNK, oligonukleotidne sinteze, i kulture tkiva i transformaciju (na pr. elektroporacija, lipofekcija), Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prer ma specifikacijama proizvodjađa ili kao što se uobičajeno vrše u tehnici ili kao što su opisane ovde. Prethodne tehv nike i postupci se obično izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i prodiskutovane kroz ovu specifikaciju, Videti

Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv. Manual

(2đ eđ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)), koji je ovde inkorporiran referencom. Nomenklature korišđene u vezi sa ovim, i laboratorijski postupci i tehnike,' analitičke hernije, sintetske organske hernije, i medicinske i farmaceutske hernije opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno upotrebljavane u tehnici. Standardne tehnike se upotrebljavaju za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutska dobijanja', formulacije, i davanje, i tretiranje pacijenata.

Kao što su iskorišđeni u saglasnosti sa ovim otkri-đem, sledeđi izrazi, ukoliko nije drugojačije navedeno, treba da se razumeju da imaju sledeća značenja: Izraz "izolovani polinukleotid" kao što je upotreba ljen ovde treba da znači polinukleotid genomne cDNK, ili sintetskog porekla ili neke kombinacije otuda, pri čemu na osnovu njegovog porekla "izolovani polinukleotid" (1) nije asociran sa celim ili delom polinukleotida u kome se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) je-.operaciono vezan: sa polinukleotidom ža koji ni je." vezan u prirodi,

ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo veće sekvence.

Izraz "izolovani protein" kao što je navedeno ovde označava protein iz cDNK rekombinantne RNK, ili sintetskog porekla ili neke kombinacije otuda, koji. prema njegovom poreklu, ili izvoru dobijanja, "izolovani protein Cl) nije asociran sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) slobo-dan je od drugih proteina iz istog izvora,' na pr. slohor-.

dan je od mišijih proteina, C3)ekspresionisan je ćelijom iz druge vrste, ili (.4) ne nalazi se u prirodi.

Izraz "polipeptid" kao što je upotrebljen ovde

kao generički izraz odnosi se na nativni protein, fragmente, ili analoge polipeptidne sekvence. Prema tome, nativni protein, fragmenti, i analozi su vrste polipeptidnog roda. Prvenstveni polipeptidi u saglasnosti sa pronalaskom obuhvataju humane teške lance imunoglobulin molekula i humane kappa lake lance imuno<g>lobulin molekula predstav-ljene u Slici 1, kaoi molekuleantitela obrazovane pomoću kombinacija koje obuhvataju težak lanac imunoglobulin molekula sa lakim lancem imunoglobulin molekula, kao što je kappa laki lanac imunoglobulin molekula, i obrnuto, kao i njihove fragmente i analoge.

Izraz "koji se javlja u prirodi" kao što je upotrebljen ovde kao što je primenjen na neki predmet, odnosi se na činjenicu da se predmet može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili polipeptidna sekvenca koja je prisutna u jednom organizmu (/uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane ljudi u laboratoriji ili drugojačije, javlja se u prirodi.

Izraz "operativno vezan" kao što je upotrebljen ovde, odnosi se na položaje komponenata tako opisanih da im omogućava da funkcionišu na njihov namenjen način. Kontrolna sekvenca "operaciono vezana" za kodirajuću sekvencu je ligirana na takav način da je ekspresija kodirajuće sekvence ostvarena pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama.

Izraz "kontrolna sekvenca" kao što je upotrebljen ovde, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su potrebne da ostvare ekspresiju i p-bradu kodirajućih sekvenci za koje su ligirane. Priroda takvih kontrolnih, sekvenci se razlikuje od organizma domaćina; u prokariotima, takve kontrolne sekvence uglavnom uključjuju promotor, ribosomalni vezujući položaj, i transkripcionu terminacionu sekvencu; u eurokatiotima,' uglavmo, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i transkripcionu terminacionu sekvencu. Izraz "kontrolne sekvence je namenjen da obuhvati pri minimumu, sve komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i obradu, i može takodje da uključuje dodatne komponente čije je prisustvo pogodno, na primer, vodeće (leader) sekvence i fuzione partner sekvence.

Izraz "polinukleotid" kao što je naveden ovde, znači polimerni oblik nflkleotida od najmanje 10 baza u dužini, ili ribomikleotiđa ili dezoksinukleotida ili mođifikovanog oblika bilo kojeg tipa nukleotida. Izraz obuhvata oblike DNK sa jednostrukom ili dvostrukom niti.

Izraz "oligonukleotid" kao što je naveden ovde, obuhvata nukleotide koji se javljaju u prirodi i modifikova-ne nukleotide vezana, zajedno sa oligonuleotidnim vezama koje se javljaju u prirodi i koje se na javljaju u prirodi.Oligonukleotidi su polinukleotidni f'subset'V pod niz koji obično Ima dužinu od 200 baza ili manje.Prvenstveno oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužini a najpogodnije 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do -40 baza u dužini. Oligonukleotidi su obično sa jednom niti, na pr. za probe; mada oligonukleotidi mogu imati dvostruke niti, na pr. za upotrebu u konst-rukciji mutanta gena. Oligonukleotidi iz ovog panonalaska mogu da budu ili sens (u smislu) ili antisens Cantismislu) olugonukleotidi.

Izraz "nukleotidi koji se nalaze u prirodi" kao što je naveden ovde, obuhvata dezoksiribonukleotide i ribo-^nukleotide. Izraz "mođifikovani nukleotidi" naveden ovde uključuje nukleotide sa mođifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Izraz "oligonukleotidne veze" naveden ovde uključuje oligonukleotidne veze kao što su fosfortioat^ fosforđitioat, fosforselenoat, fosforđisele-noat, fosforanilotioat, fosforaniladat, fosforamiđat, i slično. Videti na pr, , LaPlanche et al, Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)fStec et al. J. Am. Chem, Soc. 106:6077

(1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988);

Zon et al, Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et

al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach str. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Universitv Press, Oxford England (1991));' Stec et al. U.S. Patent No, 5,151,510; Uhlmann and Pevman Chemical Reyiews 90:543

(1990), čija su otkrića ovde inkorporirana referencom. Jedan oligonukleotid može da obuhvati oznaku za detekciju, ukoliko je to poželjno.

Izraz "selektivno hibridizira" naveden ovde, ozna-čava vezivanje koje se može detektovati i koje je specifič-no. Polinukleotid!, oligonukleotidi i njihovi fragmenti u saglasnošću sa pronalaskom selektivno se hibriđizuju na niti nukleinske kiseline pod uslovima hibridizacije i pranja koji smanjuju na minimum primetne količine vezivanja koje se može detektovati na ne-specifične nukleinske kiseline, Uslovi visoke stringentnosti ro°gu se upotrebiti da bi se postigli uslovi selektivne hibridizacije kao što je poznato u tehnici i prodiskutovano ovde. Uglavnom, homologije sekr-vence nukleinske kiseline izmedju p^olinukleotiđa, oligonuk^leotida, i fragmenata prema pronalasku i sekvence nuklein^ske kiseline od interesa biće najmanje 80-%, i tipični je sa prvenstvenim povećavanjem homologija najmanje 85%, 90%, 95%, 9-9%', i 100%, Dve amino kiselinske sekvence su homologne ako postoji delimićna ili kompletna identičnost izmedju njihovih sekvenci. Na primer, 85% homologije označava da je 85% amino kiselina identično kada su dve sekvence poredjan£~ za maksimalno uskladjivanje. Medjuprostori (u bilo kojoj od dve sekvence su uskladjeni) i nalaze se u maksimalnomuskladjivanju ;dužina medjuprostora je prvenstveno od 5 ili manje, a još pogodnije od 2 ili manje. Alternativno i prvenstveno,' dve proteinske sekvence iili polipeptiđne sekvence izvedene iz njih od'najmanje 30 amino kiselina u dužini) su homologne, kao što je ovaj termin ovde upotrebljen, ako one imaju poredjani - broj od više nego 5 (u standardnim jedinicama devijacije) upotreblja-vajući program ALIGN sa mutacionim podacima matriksa i medjuprostora od 6 ili više. Videti Davhoff, M.O u Atlas of Protein Sequence and Structure, pp 10-1^10 CVolume 5, National Biomedical Research Foundation (19.72)) and Supple-ment 2 za ovaj Volumen str. 1-10, Dve sekvence ili njihovi delovi su bolje homologne ako su njihove amino kiseline veđe ili jednake do 50% identične kada su optimalno pore-djane upotrebijavajuđi ALIGN program. Izraz "odgovara sa" je upotrebljen ovde da označi da je polinukleotidna sekvenca homologa Ctj.',' identična, ne striktno evoluciono srodna) sa svim ili delom referentne polinukleotidne sekvence, ili da je polipeptidna sekvenca identična sa referentnom polir* peptidnom sekvencom, U suprotnosti,' izraz "komplementaran sa" je upotrebljen ovde da označi da je komplementarna sekvenca homologa sa svim ili delom referentne polinukleotidne sekvence,

Radi ilustracije, nukleotidna sekvenca "TATAC" odgovara referentnoj sekvenci "TATAC" i komplementarna je sa referentnom sekvencom "GTATA".

Sledeđi izrazi su upotrebljeni da se opiše poveza-nost izmedju dva ili više polinukleotida ili amino kiselinskih sekvenci: "referentne sekvence", "uporedjujuđi prozor", "identičnost sekvence", "procenat identičnosti sekvence", i "suštinska identičnost". ''Referentna sekvenca" je defini-sana sekvenca upotrebljena kao baza (osnova) za upoređji-vanje sekvence; referentna sekvenca može da bude feubset) podniz veće sekvence, na primer, kao segment potpune dužine cDNK

ili sekvence gena dat<e>. u nabrajanju (listingu) sekvence ili može da obuhvata kompletnu cDNK ili sekvencu gena. Uglavnom, referentna sekvenca je najmanje 18 nukleotida

ili 6 amino kiselina dužine, često najmanje 24 nukleotida ili 8 amino kiselina dužine, a često najmanje 48 nukleotida ili 16 amino kiselina dužine. Pošto dva polinukleotida ili amino kiselinske sekvence mogu svaki (.1) da obuhvataju sekvencu Ctj., jedan deo kompletnog polinukleotida ili amino kiselinske sekvence) koja je slična izmedju dva molekula, i (2) može dalje da obuhvataju sekvencu koja je divergentna izmedju dva polinukleotida ili amino kiselinske sekvence, uporedjivenje sekvenci izmedju dva (ili više) molekula se tipično izvodi uporedjivanjem sekvenci iz dva molekula preko "prozora za uporedjivanje" da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvence. "Prozor za uporedjivanje" kao što je upotrebljeno ovde, odnosi se na korcopfcufini segment od najmanje 18 sus<eđn£h,. nukleotidnih položaja ili 6 amino kiselina gde polipetidna sekvenca ili amino kiselinska sekvenca mogu da budu uporedjene sa referentnom sekvencom od najmanje 18 susednih nukleotidnih ili 6 amino kiselinskih sekvenci i gde deo -..polinukleotidne sekvence u prozoru za uporedjivanje može da obuhvata adicije, izostavijanja, supstitucije, i slično Ctj., međju-prostore) od 20 procenata ili manje u poredjenju sa referentnom sekvencom (koja ne obuhvata adicije ili izostav-ljan ja) za optimalno uredjivanje dve sekvence. Optimalno uredjivanje sekvenci za uredjivanje prozora za uporedjivanje može da se izvodi iz lokalnog algoritma homologije

Smith-a i Waterman-a Adv. Appl, Math. 2_: 482 (1981),

pomoću algoritma regulacije homologije Neeđleman-a i Wunsch-a J. Mol. Biol, 48:443 (1970), pomoću postupka pretraživa-nja za sličnost Pearson-a i Lipman-a Proc. Natl, Acad.

Sci. (U.S.A}) 85:2444 (1988), pomoću kompjuterizovane primene ovih algoritana (GAP,BESTFIT,FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Softare Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), Genevorks, ili Mac Vector software packages), ili pomoću inspekcije, i naj-boljeg regulisanja (tj. rezultujući u najvećem procentu homologije preko prozora za uporedjivanje) selektovanog dobijanjem pomoću različitih postupaka.

Izraz "identičnost sekvence" znači da su dve polinukleotidne ili amino kiselinske sekvence identične (tj na bazi nukleotid- za - nukleotid ili ostatak - za -ostatak) preko prozora za uporedjivanje. Izraz "procenat identičnosti sekvence" se izračunava uporedjivanjem dve optimalno regulisane sekvence preko prozora za uporedjivanje, odredjujući broj ili položaje na kojima se javljaju identične'osnove nukleinske kiseline (na pr., A, T, C, G, U, ili I) ili ostatak u obe sekvence da bi se dobio broj uskladienih položaja, deleći broj uskladjenih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru za uporedjivanje Ctj, veličina prozora),

i množenjem rezultata sa 100 pri čemu se dobija procenat identičnosti sekvence. Izraz "suštinska identičnost" kao što je upotrebljen ovde označava karakteristiku polinukleotidne ili amino kiselinske sekvence, gde polinukleotid ili amino kiselina obuhvataju sekvencu koja.ima najmanje 85 procenata identičnosti sekvence, prvenstveno najmanje 90. do 95 procenata identičnosti sekvence, uobičajenije najmanje 99 procenata identičnosti sekvence u poredjenju se referentnom sekven^com preko prozora za uporedjivanje od najmanje 18 nukleotidnih (6 amino kiselinskih) položaja, često preko prozora od najmanje 24-48 nukleotidnih (8-16 amino kiselinskih.)

položaja, gde se procenat identičnosti sekvence izračunava uporedjivanjem referentne sekvence sa sekvencom koja može da obuhvata izostavijanja ili adicije sa ukupno 20 procenata ili manje od referentne sekvence preko prozora za uporedjivenje. Referentna sekvenca može da bude podniz (subset) veće sekvence.

Kao što je upotrebljeno ovde dvadeset konvencionalnih amino kiselina i njihovih skraćenica se koriste kao što je konvencionalno.u 'upotrebi. Videti Immunologv "A Svnthesis (2<nd>Eđition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)) koji je ovde inkorporiran referencom. Stereoizomeri (.na pr., D-amino kiseline) dvadeset konvencionalnih amino kiselina, amino kiseline koje se na javljaju u prirodi kao što su >{-, V-disupstituisane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, mlečna kiselina i druge ne-konvencionalne amino kiseline mogu isto tako da budu pogodne komponento"za polipeptide prema ovom pronalasku. Primeri ne-konvencionalnih amino kiselina obuhvataju:4rhidroksiprolin, -karboksiglutamat,

? -N,N,N-trimetillizin, . -N-acetillizin, 0-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksi-lizin, f -Nr-metilarginin, i druge slične amino kiseline i imino kiseline Cna pr, 4-hidroksiprolin) ,Upolipeptidnom obeležavanju upotrebijavanom ovde, levi smer je amino terminalni smer a desni smer* je karboksir-terminalni smer, u saglasnosti sa standardnom upotrebom i konvencijom.

Slično, ukoliko nije specificirano drugojačije,

levi kraj polinukleotidne sekvence jednostruke niti je 5 ■ kraj; a levi smer dvostruke nukleotidne sekvence se navodi kao 5<17>smer, Smer 5" na3"adiciju nascentnih RNf? trans-krlpta se navodi kao transkripcioni smer; sekventni regioni

na DNK niti koja ima istu sekvencu kao RNK i koji su 5'

ka 5' kraju RNK transkripta se navode kao "uzvodne sekvence"; "sekventni regioni" naDNKniti imaju istu sekvencu kao RNK

i oni su 3' ka3"kraju RNK transkriptai navode se kao "nizvodne sekvence".

Kao što je primenjeno na polipeptide, izraz "suštin-ska identičnost" označava da su dve peptidne sekvence, kada su optimalno regulisane, kao što je kod programa GAP ili BESTFIT.upotrebijavajuđi nedostajuće težine medjuprostora, dele najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, prvenstveno najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, pogodnije najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, i najpogodnije najmanje 9-9 procenata identičnosti sekvence. Prvenstveno, položaji ostatka koji nisu identični, razlikuju se po konzervativnoj amino kiselinskoj supstituciji, Kozervativne amino kiselinske supstitucije odnose sa na zamenljivost ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa amino kiselina koja ima alifatične bočne lance je glicin,' alanin, valin',' leucin, i izoleucin; grupa amino kiselina koje imaju alifatične^ifiđroksilne bočne lance je serin i treonin; grupa amino kiselina koje imaju bočne lance koji sadrže amid je asparagin i glutamin/ grupa amino kiselina koje imaju aromatične bočne lance je fenilalanin, tirozin, i triptofan;' grupa amino kiselina koje imaju bazne bočne lance je lizin, arginin, i histiđin; i grupa amino kiselina koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor je cistein i metionin. Prvenstvene konzervativne amino kiselinske supstitucione grupe su: valin-rleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin*-arginin, alanin^valin, glutaminskar-asparaginska, i asparaginr-glutamin.

Kao što je ovde prođiskutovano, manje varijacije u amino kiselinskim sekvenvama antitela ili imunoglobulin molekulima se smatraju obuhvaćenim ovim pronalaskom, pod uslovom da varijacija u amino kiselinskoj sekvenci zadržava najmanje 75%, pogodnije najmanje 80%, 90%, 95%, i najpogodnije 99%.Naročito su razmatrane konzervativne amino kiselinske zamene. Konzervativne zamene su one koje se dogadjaju unutar familije amino kiselina koje su srodne pcfijihovim bočnim lancima. Genetički kodirane amino kiseline se uglavnom dele u familije: (1) kisele =f aspartat, glutamatf :> (2) bazne = lizin, arginin, histiđin; (3) ne-polarne = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4)

bez naboja polarne = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin,' tirozin. Pogodnije familije su: serin i treonin je alifatična-hidroksi familija: asparagin i glutamin su alifatična familija koja sadrži amiđ; alanin, valin, leucin i izoleucin su alifatična familija; i fenilalanin, triptofan, i tirozin su aromatična familija. Na primer razumljivo je očekivati da izolovana zaraena leucina sa izoleuci-nom ili valinom, aspartata sa glutaminom, treonina sa seri-nom, ili slična zamena amino kiseline sa strukturno srodnom amino kiselinom neće imati znatan efekat na vezivanje ili osobine dobijenog molekula, naročito ako zamena ne uključuje amino kiselinu unutar položaja okvira. Da li promena amino kiseline rezultuje u funkcionalni:\derivat peptida, može lako da se odredi analiziranjem specifične aktivnosti deri-vata, polipeptida. Analize su ovde detaljno opisane. Fragmenti ili analozi antitela ili imunoglobulin molekula mogu lako biti izvršene od strane stručnjaka u ovoj oblasti, Prvenstveni amino i karboksi krajevi fragmenata ili analoga javljaju se blizu granica funkcionalnih područja.

Strukturna i funkcionalna područja mogu da se identifikuju uporedjivanjem podataka nukleotida i/ili amino kiselinske sekvence sa objavljenim i.li podesnim ha.zama podataka za sekvencu. Prvenstveno se upotrebljavaju kompjuterizovani postupci za uporedjivanje radi '.identifikacije motiva sekvence ili predskazanih proteinskih konformacionih područja koja se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikovanje sekvenci proteina koji spadaju u poznate tro-dimenzionalne strukture su poznati,Bowie et al. Science 253:164 (1991). Prema tome naredni primeri demonstriraju da stručnjaci iz ove oblasti mogu da raspoznaju motive sekvence i strukturne konformacije koje se mogu upotrebiti da bi se definisala strukturna i funkcionalna područja u saglasnosti sa pronalaskom.

Prvenstvene amino kiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju osetljivost na pr«teolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitete vezivanja za obrazovanje proteinskog kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i (4) menjaju ili modifikuju druge Jizikohrr.iijSke ili funkcionalne osobine takvih analoga. Analozi mogu da obuhvataju različite muteine sekvence drugojačije nego što ge sekvenča peptida koji se javljaju u prirodi. Na primer, jednostruke ili višestruke amino kiselinske supstitucije

(prvenstveno konzervativne amino kiselinske supstitucije)

mogu da se učine u sekvenci polipeptida koji se javlja u prirodi (prvenstveno u delu polipeptida izvan područja koja obrazuju intramolekularne kontakte. Konzervativna amino kiselinska supstitucija ne treba da bitno menja strukturne karakteristike roditeljske sekvence (na pr., zamena amino kiseline ne treba da ima tendenciju da razbije heliksa koji se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili da razbije druge tipove sekundarne strukture koje karakterišu roditeljsku sekvencu). Primeri u tehnici prepoznatljivih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura su opisani

u Proteins, Structures and Molekular Principles (Creighton, Ed., W, H. Freeman and Companv, New York (1984));

Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eđs., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al.Nature 354:105 (1991), od kojih je svaki inkorporiran ovde referencom.

Izraz "polipeptidni fragment" kao što je upotrebijeno ovde odnosi se na polipeptid koji ima amino terminalnu i/ili karboksi terminalnu deleciju (izbacivanje), ali gde je preostala amino kiselinska sekvenca identična sa odgovaraju-ćim položajima u sekvenci koja se javlja u prirodi izvede-noj, na primer, iz cDNK sekvence potpune dužine. Fragmenti su tipično najmanje 5, 6, 8 ili 10 amino kiseline dužine, prvenstveno najmanje 14 amino kiseline dugi, pogodnije najmanje 20 amino kiseline dugi, obično najmanje 50. amino kiseline dugi,' i još pogodnije najmanje 70 amino kiseline dugi. Izraz "analog kao što je upotrebijeno ovde odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 amino kiselina koji ima suštinsku identičnost sa delom izvedene amino kiselinske sekvence i koja ima najmanje jednu od slededih osobina: (1) specifično vezivanje za CTLA-4, pod pogodnim uslovima vezivanja,' (2) sposobnost da blokira CTLA-4 vezivanje sa njegovim receptorima, ili (3) sposobnost da inhibira CTLA-4 ekspresiju đelijskog rasta in vitro ili in vivo. Tipično, polipeptidni analozi obuhvataju konzervativnu amino kiselinsku supstituciju (.ili adicije ili izostavijanja) s obzorom na sekvence koje se

i

javljaju u prirodi, Analozi su tipično najmanje 20. amino kiselina dugački, prvenstveno najmanje 50. amino kiselina dugački ili duži,' i mogu često da budu toliko dugački kao što je polipeptid potpune dužine koji se javlja u prirodi,

Analozi peptida se obično upotrebljavaju u farma-ceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa osobinama analognim onima šablonskih (matričnih) peptida. Ovi tipovi ne-peptidnih jedinjenja se nazivaju "peptidni mimetici" ili "peptiđomimetici " Fauchere, J. Adv, Drug Res. 15:29

(1986); Veber andFrei>Unfer -TINSp 392 (1985); i Evans

et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), koji su inkorporirani ovde referencom. Takva jedinjenja su često razvijene pomoću kompjuterizovanog molekularnog modeliranja. Peptidni mimetici su strukturno slični sa terapeutski korisnim peptidima i mogu se upotrebiti da se proizvede ekvivalentan terapeutski ili profilaktički efekat. Ucrlavnom,<p>eptido-mimetici su strukturno slični paradigmatskim polipeptidima (tj. polipeptid koji ima biohemijske osobine ili farmakološku aktivnost) kao humano antitelo, ali ima jednu ili više peptidnih veza opciono zamenjenih pomoću veze odabrane iz grupe koja se sastoji od: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-. -CH=CH- Ccis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2~ r i -CB^SOt pomoću postupaka dobro poznatih u tehnici. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina opšte sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (na pr., D-lizin umesto L-lizina) može da se upotrebi za dobijanje stabilnijih peptida. Dodatno,ograničeni peptidi koji obuhvataju opštu sekvencu ili varijaciju s-uš*tte©k±/identične ©pfete* sekvence mogu da se dobiju pomoću postupaka poznatih u tehnici (Rizo and Gierasch Ann. Rev,Biochem. 61:387 (19.92), in-korporiranih ovde referencom); na primer, dodavanjem internih cistein ostataka sposobnih da obrazuju intramoleTkularne disulfidne mostove koji ciklizuju peptid,

"Antitelo" ili "antitelo peptidCi) " odnosi se na intaktno antitelo, ili^na njegov vezujući-fragment koji se nadmeće sa intaktnim antitelomza specifično vezivanje. Vezujući fragmenti se dobijaju pomoću tehnika rekombinantne DNK,' ili pomoću enzimatskog ili hemijskog^ cepanja

intaktnih antitela. Vezujući fragmenti obuhvataju Fab", Fah", F(ab")2fF^ , i antitela sa jednim lancem. Antitelo drugojačije nego rjispecifično" ili "bifunkcionalno antitelo podrazumeva se da ima svaki od njegovih vezujućih položaja identičan. Antitelo bitno inhibira adheziju receptora na kontrareceptor kada višak antitela smanjuje količinu receptora vezanog na kontrareceptor za oko najmanje 20%, 40%,

60% ili 80%, i obično više nego oko 85$ (kao što je izmereno , u in vitro kom<p>etitlvnoj analizi vezivanja.

Izraz "epitop" obuhvata bilo koji determinantni polipeptic sposoban da se specifično veže za imunoglobulin ili Tćelij-ski receptor. Epitop determinanti obično se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su amino kiselinsU bočni nizovi ili bočni nizovi šećera i obično imaju specifične tro dimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja. Kaže se da bilo koje antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta**disoci jaci je 5 l.;uM, prvenstveno't 10.0. nM, a najpogodnije ^ 10 nM.

Izraz "agens" je upotrebljen ovde da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makro-molekul, ili ekstrakt dobijen iz bioloških materijala.

Kao -všto je upotrebljeno ovde "obeleždvač" ili_,,"obeležen" odnosi se na inkorporaciju markera koji se može detektovati, na pr., inkorporiranjem radioaktivno obeležena amino kise-

\ ■<->

lina ili pričvršćivanje polipeptida^ sa biokalajnim delovima koji se može detektovati sa markiranim avidinom (na pr. streptavadinom koji sadrži fluorescentni marker ili enzi-matsku aktivnost koja se može detektovati pomoću optičkih

ili kolorimetrijski.fr postupaka-). U izvesnim situacijama, obeleživač ili marker može takodje da bude terapeutski. U tehnici su poznat različiti postupci za obeležavanje polipeptida i glikoproteina i mogu da se upotrebe.Primeri obeleživađa za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni 3 14 na,sledeđe radioizotope ili radionuklide (na pr,, H, C, 1<5>N,<35>s,<90>Y,<99>Tc,<i:L1>In,125I, 131I) , fluorescentne obeleži leživađe (na pr. , FITC, rodamin, fosfor lantanid) ,' enzimatske obeleživaće Cna pr,, peroksidaza rena, 0> r-galaktozi-daza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminoscentne, biotin grupe, prethodno odredjeni polipeptid epitopi koji se raspoznaju pomoću sekundarnih reportera (na pr., leucin "zipper pair" sekvence, vezjući položaji za sekundarna antitela područja vezivanja metala, epitop.'etikete). u nekim realizacijama obeleživaći su vezani pomoću prostornih kraka ^spacer arms) različite dužine da bi se smanjila potencijalna prostorna smetnja.

Izraz "farmaceutski agens ili lek" kao što je upotrebljen ovde odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kom-poziciju sposobnu da izazove'željeni terapeutski efekat kada se prikladno primeni kod pacijenta. Drugi hemijski termini ovde upotrebljen! su u saglasnosti sa konvencior naInom upotrebom u tehnici, kao što je dato primerom u The McGravr-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker,<1>S-,

Ed, , McGraw-Hili, San Prancisco C.1985) ) koji je ovde inkorporiran referencom),

Izraz 'antineoplastični agens" je upotrebljen ovde

da se odnosi na agense koji imaju funkcionalne osobine da inhibiraju razvoj ili napredak neoplazma kod ljudi', naroči-r to maligne CkancerozneJ lezije, kao što su karcinom, sarkom,

limfom ili leukemija. Inhibiranje metastaza je često osobina antineoplastičnih agenasa.

Kao što je upotrebijeno ovde, "suštinski čist"

znači da je predmetna vrsta predominantno prisutna vrsta (tj., na molarnoj bazi ona je mnogo obilnija nego bilo

koja druga individualna vrsta u kompoziciji), i prvenstveno suštinski prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj predmetna vrsta sadrži najmanje oko 50 procenata Cna molarnoj bazi) od svih makromolekularnih vrsta koje su prisutne. Uglavnom, suštinski čista kompozicija će sadrža--vati više nego oko 80 procenata od svih makromolekular-

nih vrsta koje su prisutne u kompoziciji, još pogodnije više nego oko 85%, 90%, 95%, i 99%. Najpogodnije, predmet-ma vrsta je prečišćena do suštinske homogenosti (kontami-nantne vrste ne mogu da se otkriju u kompoziciji pomoću-; konvencionalnih postupaka za detekciju) pri čemu se kompozicija sastoji suštinski od jedne jedine makromolekular-ne vrste.

Izraz pacijent uključuje humane i veterinarske pojedince.

Struktura an titela.

Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela obuhvata, tetramer, Svaki tetramer se sastoji od dva iden-r tična para polipeptiđnih lanaca, svaki par pri tome ima jedan "laki" Coko 25 kDaJ i jedan "teški"^lanac Coko 50V70 kDa) . Amino terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni regi.on od oko 1QQ do 110. ili više amino kiselina primarno odgovornih, za raspoznavanje antigena. Karboksi terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgo^voran za efektor funkciju. Humani laki lanci su klasifikovani kao kappa i lambđa laki lanci. Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotipe antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i odnosno IgE. Unutar lakih i teških lanaca, promenljivi • kons-

tantni regioni su spojeni pomoću "J" regiona od oko 12 ili više amino kiselina, sa teškim lancima koji takodje uklju-čuju "D" region od'oko 10 amino kiselina«Videti opće-nito, Fundamental Immunologv Ch. 7 (Paul, E., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (inkorporiran referencom u celosti za sve svrhe). Promenljivi regioni svakog para lakog/teš-kog lanca obrazuju vezujući položaj antitela.

Prema tome, intaktno IgG antitelo ima dva vezujuća položaja. Osim u bifunkcionalnim ili bispecifičnim ahti-telima, dva vezujuća položaja su ista.

Svi lanci pokazuju istu opštu strukturu relativno konzervisanog okvira regiona (FR) spojenih pomoću tri hiper promenljivih regiona, takodje nazvano regioni koji odredjuju komplementarnostili CDR^. CDRs iz dva lanca ođ svakog para su regulisani pomoću okvirnih regiona, omogućavajući vezivanje za specifičan epitop. Od N-kraja (terminala) do C-kraja (terminala) ovi i laki i teški lanci obuhvataju područja FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Odredjivanje amino kiselina za svako područje je u saglasnosti sa definicijama Kabat^a Sequences of Proteins of Immunological Interest (.National Institutes of Health, Bethesda, Md.

(19.87 i 1991) ) , ili Chothia & Lesk J, Mol. Biol. 196 :901-917 Cl987) • Chothia et al.Nature 342:878-883 (1989).

Eišpeclfično:ili bifunkcionalno antitelo je veštački i

hibrid antitela koji ima dva različita^ para težak/laki lanac i dva različita vezujuća položaja. Bispecifična antitela mogu da se dobiju različitim postupcima uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab" fragmenata, Videti na pr.

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79:315-321

(1990), Kostelny et al. J. Immunol. 14.8:1547-1553 (1992).

Pored toga, bispecifična antitela mogu da se obrazuju kao "diatela" ("diabodies") (Holliger et al.""Diabođies ': small ? bivalent arđJbispecific antibody fragmenti PNAS USA 90:

6444-6448 (1993)) ili "Janusins (Traunecker et al,

"Bispecific single Chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infec ted cells"EMBO J 10: 3655-3659- (1991) i Traunecker et al, "Janusin:new molecular design for bispecific reagents" Int J,.Cancer Suppl 7:51-52 (.1992). Proizvodnja bispecifičnih antitela

može da bude proces koji zahteva relativno intenzivan rad u poredjenju sa proizvodnjom konvencionalnih antitela i prinosi i stepen čistoće su uglavnom niži za bispecifična antitela. Bispecifična antitela ne postoje u obliku fragmenata koji imaju jedan vezujući položaj (na pr., Fab, Fab'

<i>?v?-

Humana antitela i humanizacija antitela

Humana antitelaeliminišu izvesne probleme vezane

sa antitelima koja poseduju varijabilne i/ili konstantne regione miševa ili pacova. Prisustvo takvih iz miševa ili pacova izvedenih proteina dovodi do brzog"klirensa" antitela ili može da dovede do stvaranja imunog odgovora protiv antitela od strane pacijenta, U cilju da se izbegne korišće-nje antitela izvedenih iz miševa ili pacova, zahteva

se da se mSgu razviti humanizovana antitela ili dobiti potpu-

na humana antitela uvodjenjem humane antitelo funkcije u glodara tako da će glodar proizvesti antitela koja imaju potpune humane sekvence.

Humana antitela

Sposobnost da se kloniraju i rekonstruišu megabaza-veličine humana mesta u YACs i da se uvedu u mišiju liniju klica obezbedjuje snažan prilaz objašnjavanju fundamental-nih komponenata veoma velikih ili grubo mapiranih mesta kao i dobijanje korisnih modela humane bolesti. Osim toga, primena takve tehnologije za zamenu mesta (loci) sa humanim ekvivalentima može da obezbedi jedinstvene uvide u ekspresiju i regulaciju humanih genskih proizvoda tokom razvoja njihove komunikacije sa drugim sistemima i njihovog učest-r vovanja u izazivanju i razvoju bolesti.

Važan praktičan pristup takvoj strategiji je "humanizacija" mišijeg humoralnog imunog sistema. Uvodjenje humanog imunoglobulina (Ig) mesta.u miševe u kojima su endogeni Ig geni inaktivirani nudi mogućnost da se studira mehanizan koji je'fundamentalan za programiranu ekspresiju i sakupljanje antitela kao i njihovu ulogu u razvoju B-đelija. Osim toga, takva strategija može da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpunih humanih monoklonalnih antitela CMabs) važne prekretnice ka ispunjavanju obećanja terapije antitelima u humanim bolestima. Očekuje se da potpuna humana antitela smanje na minimum imunogene i aler^-gijske odgovoresuštinske za mišje ili iz miševa izvedene Mabs i prema tome da povećaju efikasnost i bezbednost od pri-menjeniri antitela. Može da ste -očekuje da< upptreb^"'p©t|»unih humanih antitela obezbedi bitne pogodnosti u tretiranju humanih'hroničnih i bolesti kojie se ponovo vraćaju, kao što su inflamacija, autoimunost, i kancer, koje zahtevaju ponovnu primenu antitela,

Jedan prilaz prema evem cilju je inžinjering vrsta miševa def ici jentnih u proizvodnji antitela miševa sa. veliki fragmenti humanih Ig mesta sa predvidjanjem da će takvi miševi proizvesti velike repertoare humanih antitela u odsustvu antitala miševa. Veliki humani Ig fragmenti će zadržati velike varijabilne razlike gena kao i pogodnu regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišća-vanjem mašinerije miševa za diversifikaciju i selekciju i nedostatak imunološke tolerancije za humane proteine, reprodukovan repertoar humanog antitela u ovim vrstama miševa treba da da antitela visokog afiniteta protiv bilo kojeg antigena od interesa, uključujući humane antigene. Upotrebljavajući tehnologiju hibridoma, antigen specifični humani Mabs se željenom specifičnošću mogu lako da se proizvedu i selektuju.

Opšta strategija je prikazana u saglasnostt sa našim dobijanjem prvih XenoMous™ vrsta kao što je objavljeno u 1994. Videti. Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994). XenoMous™ vrste su dobijene inženjeringom sa veštačkim hromozomima kvasca (YACs) koji sadrže 245 kb i 190 kb-veličine konfiguracije matične loze fragmenata mesta humanih teških lanaca i odnosno mesta kappa lakih lanaca koji sadrže jezgra varijabilnih i konstantnih regiona sekvenci. Id. Humani Ig koji sadrži YACs obezbedjuje kompatibilnost sa sistemom miševa za oba, i preuređivanje i ekspresiju antitela i bili su sposobni da zamene interaktivne Ig gene miševa. Ovo je prikazano pomoću njihove sposobnosti da izazovu B-ćelijski razvoj, da proizvedu odraslim-sličan humani repertoar potpunih humanih antitela i da daju antigenu specifične Mabs. Ovi rezultati takodje sugerišu da uvodjenje većih porcija humanih Ig mesta koja sadrže veće brojeve V gena, dodatnih regulatorskih elemenata, i humanih Ig konstantnih regiona mogu da rekapituliraju suštinski potpuni repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor za infekciju i imunizaciju. Rad Green-a et al. je u novije vreme proširen na uvodjenje više od približno 80% repertoara humanih antitela preko uvodjenja mega-baza veličine matične loze konfiguracije YAC fragmenata humanih teškog lanca mesta i kappa lakih lanaca mesta, da bi se proizveli XenoMous™ miševi. Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), i U.S. Patentna Prijava serijski No. 08/759,620 podneta 3 decembta 1996, čije otkriće je ovde inkorporirano referencom.

Ovakav prilaz je dalje prodiskutovan i opisan u U.S.

Patentnoj Prijavi Serijski No. 07/466.008, podnetoj 12 januara 1990, 07/610,515 podnetoj 8 novembra, 1990, 07/919,297, podnetoj 24 jula 1992, 07/922,649', podnetoj 30, jula, 1992, 08/031,801, podnetoj 15 marta 1993, 08/112,848, podnetoj 27 avgusta 1993, 08/234,145, podnetoj 28 aprila, 1994, 08/376,279, podnetoj 20 januara, 1995 08/430,938, 27 april, 1995 08/464,584 podnetoj 5 juna 1995, 08/464,582, podnetoj 5 juna 1995, 08/463,191, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,837 podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,853, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486/857, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,859, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,513, podnetoj 5 juna, 1995, 08/724,752, podnetoj 2 oktobra, 1996, i 08/759,620, podnetoj 3 decembra, 1996. Videti takodje Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp.Med. 188:483-495 (1998). Videti takodje Europeah patent No., EP 0 463 151 BI, odobrenje objavljeno 12 juna, 1996, internacionalna Patentna Prijava NO. WO 94/ 02602, publikovana 3 februara ,1994, Internacionalna Patentna Prijava NO. WO 96/34096, publikovana 31 oktobra,1996, i WO 98/24893, publkovana 11 juna, 1998. Otkriće svakog od gore navedenih patenata, prijava i referenci su ovde inkorporirana referencom u njihovoj celosti.

U alternativnom prilazu, drugi, uključujući GenPharm International Ine,, su koristili "minilokus" prilaz. U minilokus prilazu, egzogeni Ig lokus se podražava preko inkluzije delova (individualni geni) iz Ig lokusa. Prema tome, jedan ili više VHgena, jedan ili više DRgena jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i drugi konstantni region (prvenstveno gama konstantni region) se formiraju u konstrukciju za umetanje u životinju. Ovaj prilaz je opisan u UVS. Patentu No. 5,545,807 Surani-a et al. i U.S. Patentima No. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, i 5,814,318 svaki Lonberg-a i Kay-a, U.S. Patent No. 5.591,669 Krimpenfort-a i Berns-a, U.S. patent No. 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 Berns-a et. al., i U.S. Patent No. 5,643,763 Choi-a i Dunn-a, i GenPharm International U.S. PStentne Prijave Ser. No. 07/574,748, pođnetbj 29 avgusta, 1990, 07/575,9-62, podnetoj 31 avgusta, 1990 , 07/810 ,279, podnetoj 17 decembra, 1991, 07/853,408, podnetoj 18 marta 1992, 07/904,068, podnetoj 23 juna, 1992, 07/990, 860, podnetoj 16 decembra 1992, 08/053,131, podnetoj 26 aprila,^ 1993, 08/096,762, podnetoj 22 jula, 1993, 08/155,301, podnetoj 18 novembra 1993, 08/161,739, podnetoj 3 decembra, i99 3, 08/165,699, podnetoj 10 decembra, 1993, 0.8/209,741, podnetoj 9 marta, 1994i>>-,čijasu otkrića inkorporirana ovde referencom. Videti takodje Evropski Patent No. 0 546 073 BI, Internacionalne Patentne PrijaveNo. WO 9 2/0 3918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670 , W0>93/12227, W0; 94/00569 WO 94/25585,WO 96/14436,WO 97/13852, i WO 98/24884, čija su otkrića inkorporirana ovde referencom u njihovoj celosti. Videti dalje Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al,, 1993, Lonberg et al.,

(1994), Taylor et al., (1994), i Tuaillon et al., (.1995),

Fishwild et al., (1996), čija su otkrića inkorporirana referencom ovde u celosti.

Pronalazači Surani et al., navedeni gore i

prenet na Medical Research Counsel ("MRC"), proizveli su transgenog miša koji poseduje antlg lokus preko upotrebe minilokus prilaza. Pronalazači GenPharm International rada, navedeni gore, Lonberg i Kay, prateći navodjenje ovih pronalazača, predložili su inaktivaciju endogenih mišijih lokusa kuplovanihsa suštinskom duplikacijom Surani-a et,al. radom.

Prednost minilokus prilaza je brzina sa kojom se konstrukti, uključujući delove Ig lokusa mogu dobiti i uvesti u životinje. Proporcionalno, medjutim, značajan nedostatak minilokus prilaza je taj što se teorijski, nedovoljna raznolikost unosi preko inkluzije malog, broja V, D, i J gena. Ustvari, izgleda da publikovani rad podrža-

va ovaj prilaz. B-ćelijski razvoj i proizvodnju antitela životinja dobijenih upotrebom minolokus prilaza izgleda zakržljalo. Stoga, je istraživanje koje okružuje ovaj pronalazak konzis-tentno usmereno prema unošenju velikih delova Ig lokusa u cilju da se postigne veća raznolikost i u pokušaju da se rekonstituiše imuno saopštenje životinja.

Odgovori humanih anti^nišijih antitela (HAMA) naveli

su industriju da pripremi himerična ili drugojačije humani-zirana antitela. Dok himerična antitela imaju humani konstantni region i mišiji varijabilni region, očekuje se da će biti uočeni odgovori humanog anti-himeričnog antitela (HACA), naročito u hroničnim ili multi-doznim upotrebama antitela. Prema tome, poželjno je da se obezbede potpuna humana antitela protiv CTLA-4 u cilju da se ponište zabri-nutosti i/ili efekti HAMA ili HACA odgovora.

Humanizacija i izložene tehnologije (DisplavTechnologies)

Kao što je prodiskutovano gore u vezi sa dobijanjem humanog antitela, postoje prednosti da se proizvedu anti-

tela sa smanjenom imunogenošđu." . Do jednog stepena ovo može da se postigne u vezi sa tehnikama humanizacije i izlo-

ženim tehnikama upotrebljavajući pogodne biblioteke.

Razumljivo je da se misija antitela ili antitela iz drugih

vrsta mogu humanizirati ili primatizovati

upotrebljavajući tehnike dobre poznate u tehnici. Videti na pr. , Winter and Harris Immunol Tođav l4:43r-46 (.19.93) i Wright et al., Crit. Reviews in Immunol, 12125-168 (1992). Antitelo od interesa se može dobiti inžinjeringom pomoću rekombinantnihUDNK tehnika supstituisanjem CH1, CH2, CH3,

područja šarnira i/ili okvirnih područja sa odgo-

varajućim humanim sekvencama (videti W0 9 2/0 2190 i U.S.

Patenti 5,530,101, 5,585,089, 5.693,761, 5.693,792,

5,714,350, i 5,777,085). Takodje, upotreba Ig cDNK za konstrukciju himernih imunoglobulin genaje poznata u tehnici (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) i J, Immunol.

139:3521 (1987)). mRNK je izolovana iz hibridoma ili drugih ćelija koje proizvode antitelo i upotrebljava se za proizvodnju ODNK. cDNK od interesa može da se pojača pomo-

ću reakcije polimeraza lanca upotrebljavajući specifične prajmere (U.S. Pat. No. 4,683,195 i 4,683,202). Alternativ-

no, biblioteka se obrazuje i pretražuje da bi se izolova-

la sekvenca od interesa. DNK sekvenca koja kodira varijabilr-

ni region antitela se zatim fuzioniše na humane konstantnog regiona sekvence. Sekvence humanih konstantnih regiona gena'mogu da se nadju u Kabat et al. (1991) Seguences od Proteins of Immunological Interest, N.I.H publication no 91-3242,

Geni humanog C regiona su lako raspoloživi iz poznatih klona.

Izbor izotipa će biti rukovodjen željenim efektor funkcijama, kao što su komplementna fiksacija, ili aktivnost u antitelo-zavisnoj celularnoj citotoksičnosti. Prvenstveni izotipi su IgGl, IqG2, IgG3 i IgG4, Naročito pogodni izotipi za antitela iz pronalaska su IgG2 i IgG4, Bilo koji od humanih lakih lanaca konstantnih re<g>iona,' kappa ili iLambda, mogu da se upotrebe. Himerično, humanizirano antitelo se tada ekspresioniše pomoću konvencionalnih postupaka .

Fragmenti antitela, kao što su Fv, FCab'<r>)2i Fab mogu da se dobiju cepanjem intaktnog proteina, na pr., po-moću proteaze ili hemijskim cepanjem. Alternativno, projaktovan je skraćeni (zarubljeni) (truncated) gen. Na primer, Rimerični gen koji kodira jedan deo PCah"^ fragmenta uključuje DNK sekvence koje kodiraju CH1 područje i šarnirni Chinge) region H lanca, prateće sa translacionim stop kodonom,' pri čemu se dobi ja zarubljeni molekul,

U jednom pristupu, konsensus sekvence koje kodiraju teške i lake lance \!T?€tgi.ona mogu da se upotrebe za projektovanje oligonukleotida za upotrebu kao primera za unošenje korisnih restrikcionih položaja u J region za naredno vezivanje V reg-ionih segmenata za humane C "ire^tDne .-segmenatK.'^'C region cDNK može da se mođifikuje pomoću na mesto usmerene mutageneze da se postavi restrikciono mesto na analogni položaj u,humanu sekvencu.

Ekspresioni vektori uključuju plazmide',' retroviruse, kosmide, YACs, EBV izvedenih episome, i slično. Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu CH ili CL imunoglobulin sekvencu, sa pogodnim restrikcioniro položajima dobijenim inžinjeringom tako da bilo koja VH ili VL sekvenca može da se lako umetne ili ekspresioniše. U takvim vektorima, "splajsing se obično događja izmedju splajs donor mesta u umetnuti J region i splajs akceptor mesto koje prethodi humanog C regiona i takodje na splajs regione koji se javljaju unutar humanog GH ekzona. Poliadenilacija i transkripciona termi-nacija se javlja na nativnim hromosomalnim mestima nizvodno od kodirajuđih regiona. Rezultujuće' himerično antitelo može da se spoji na bilo koji jak promotor, uključujući retrovi-ralni LTRs, na pr, SV-40 rani promotor, (Okavama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), Rous sarkoma virus LTR (.Gorman

et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), i "moionay" mišje leukemi-je virus LTR (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985));

nativni lg promotori, itd.

Dalje, humana antitela ili antitela iz drugih vrsta mogu da se dobiju preko izloženog-tipa (displej-tipa) tehnologija, uključujući, bez ograničenja, fag-displej, retro-virusni displej, ribosomalni displej , i druge tehnike, upo-trebljavajući tehnike dobro poznate u tehnici, i rezultujući molekuli mogu da se podvrgnu dodatnom sazrevanju, kao što je srodno (affinity): sazrevanje, pošto su takve tehnike dobro poznate u tehnici. Wright i Harris, suppra,, Hanes i Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomalni displej), Parmley

i Smith Gene 73:305-318 (1988) (fag displej), Scott TIBS 17: 241-245 (1992),Cwirla et al.PNASUSA87:6378-6382 C1990), Russel et al.Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993). Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992) Chiswell

i MaCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), i U.S. Patent No. 5,733,743. Ako su displej tehnologije korišćene za proizvodnju antitela koja nisu humana, takva antitela se mogu humani-zovati kao što je opisano gore.

Upotrebljavajući ove tehnike, antitela mogu da se dobiju u CTLA-4 ćelijama koje ekspr-esionišu, samom CTLAt-4, oblicima CTLA-4, epitopima ili njihovim peptidima, i eksp-resionim bibliotekama uz to (videti na pr. U.S, Patent No, 5,703,057) koja može potom da se pretraži kao što je opisano gore za aktivnosti opisane gore.

Dodatni kri terijumi za antitelo terapeutike

Kao što se može razumeti, uglavnom nije poželjno

da se ubiju CTLA-4 delije koje ekspresionišu, Radije se uglavnom odlučuje na jednostavno inhibiranje CTLA-4 vezivanje sa njegovim ligandima za olakšavanje T-đelijske dezaktivirajuće regulacije. Jedan od glavnih mehanizama preko kojeg antitela ubijaju delije je kroz fiksaciju komplementa j-učestvovanje u CDC. Konstantni region antitela igra važnu ulogu i vezi sa sposobnošću ahtitela da fiksiraj-u kcjplemenat"' i ?a učestvuju u CDC. Prema tome, uglavnom se selektuje izotip antitela koji ili obezbedjuje sposobnost fiksacije komplementa;ili nej, u slučaju ovog pronalaska, uglavnom, kao što je pomenuto dore, obični<ye>pogođno da se koristi antitelo koje ubija ćelije. Postoji jedan broj izotipova antitela koji su sposobni da upotpune fiksaciju i CDC,

uključujući, bez ograničavanja', sledeće: mišije TgM', misije Ig62a,<i>mišije IgS2b, mišije IgG3, humane IgM, humane IgGl, i humane IgG3, Oni izotipovi koji ne uključuju,' bez ograniča-vanja, humane IgG2 i humane IgG4.

Razumljivo je, da antitela koja se dobijaju ne

mora inicijalno da poseduju naročito željeni izotip, ali radije, antitelo kao što je dobij eno može da poseduje bilo koji izotip i antitelo može da bude izotip preokrenut posle toga upotrebijavajući' konvencionalne tehnike koje su dobro poznate u tehnici. Takve tehnike uključuju upotrebu direkt^nih rekombinantnih tehnika (videti., U.S. Patent No. 4,816,39-7), ćelija-ćelija fuziona tehnike (videti na pr., U.S. Patentnu Prijavu No. 08/730,639, podnetu 11 oktobra, 1996), izmedju ostalih,

U tfelija-ćelija fuzionoj tehnici,<1>mijelom ili drur* ga ćelijska linija se dobijaja koja poseduje te<g>ak lanac sa bilo kojim željenim izotipom i drugi mijelomi ili druge ćelijske linije se proizvode koji poseduju laki lanac. Takve delije mogu, posle toga, da se fuzionišu i ćelijska linija koja ekspresioniše intaktno antitelo može da se izoluje.

Kao primer, najveći broj CTLA-4 antitela prodiskutovanih ovde su humana anti-CTLA-4 IgG2 antitela. Pošto takva antitela poseduju željeno vezivanje za CTLA-4 molekul,

bilo koje od takvih antitela može lako da preokrene izotip da se dobije humani IgG4 izotop, na primer', dok još uvek poseduje isti varijabilni region (koji definiše specifič-

nost antitela i neke od njegovih afiniteta).

Prema tome,' pošto se kandidati antitela dobij a ju

koji odgovaraju željenim "strukturnim" atributima, kao što je prodiskutovano gore, oni mogu uglavnom da budu obezbe-

djeni sa najmanje izvesnim dodatnim "funkcionalnim" atribu-

tima koji su poželjni preko preokretanja izotipa.

Projektovanje i dobijanje drugih terapeutika

U saglasnosti sa ovim pronalaskom i na osnovu

aktivnosti antitela koja su proizvedena i okarakterisana ovde s obzirom na CTLA-4, olakšan je dizajn drugih terapeut-

skih modaliteta uključujući druga antitela, druge anta-

goniste, ili hemijske udele drugojačije nego što su anti-

tela. Takvi modaliteti uključuju, bez ograničenja, antitela koja imaju slične vezujuće aktivnosti ili funkcionalnosti,kaonapredni antitelo terapeuti .', kao što su bispecifična ćtrttitela, imunotoksini, i radioaktivno obeleženi terapeutici, dobijanjejpeptidnih terapeutika, genske terapije, naročito intratela (intrabodies.) , antisens terapeutici i mali molekuli. Osim toga',' kao što je prodiskutovano gore, efektor funkci-

je antitela- prema pronalasku mogu; da se izmene pomoću preokretanja izotipa u IgGl, IgG2, lgG3, IgG4 ,' IgD, IgA,

IgE, ili IgM za različite terapeutske upotrebe.

U vezi sa dobijanjem unapredjenih antitelo terapeutika, gde je fiksacija komplemenata željeni atribut, može da bude moguće da se izbegne zavisnost od komplementa za ubijanje ćelije upotrebom bispecifika, imunotoksin, ili radioaktivno obeleženih, na primer.

U vezi sa bispecifičnim antitelima, bispecifična antitela mogu da se dobiju koja sadrže (.i) dva antitela,

jedno sa specifičnošću za CTLA-4 i drugo za drugi molekul koji je zajedno konjugovan, (ii)jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za CTLA-4 i drugi lanac specifičan za drugi molekul, ili Ciii) antitelo sa jednim lancem koji je specifičan za CTLA-4 i drugi molekul. Takva bispecifična antitela mogu da se dobiju upotrebom tehnika koje su dobro poznate na primer, u vezi sa (i) i (ii) videti na pr.,

Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) i Vfright i

Harris, supra i u vezi sa (iii) videti na prf , Traunecher

et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51^52 U99-2) .

Dodatno,"KappabodieV (III et al "Design and cons-truction of a hvbrid immunoglobulin domain vrith properties of both Reavy and light chain variable regions" /"Kappa-tela"CJII et al. "Dizajn i konstrukcija hibrida imunoglo-

bulin područja sa osobinama i teških i lakih lanaca varija-^ bilnih. regiona" / Protein Eng 10 :949-57 (19-9-7) ), "Minibodies"

(Martin et al."The affinity-selection of a minibođy poly-peptide inhibitor of human interleukinT-6" /"Minitela" " S. "Selekcija afiniteta monotelo polipeptidnog inhibitora huma-

nog interleukina-6" /EMBOJ 13:5303-9 (1994)), "Diabodies"

(Hollinger et al. "'Diabodies": small bivalent and bispeci-

fic antibody fragments"/" Dijatela" "mali bivelantni i bi-specifični fragmenti antitela"/PNASUSA 90:6444-6448 (1993)), ili "Janusins" (Traunecker et. al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocates ori HIV infected cells" / "Janusini" "Bispecifični molekuli sa jednim

lancem (Janusini) ciljani citotoksični limfociti za HIV inficiranim delijama"/ EMBO j 10: 3655-3659 (1991)) i Traunecker et al. "Janusin: new molecular designe for bispecific reagents" /"Janusin: novi molekularni dizajn za bi<s>.pecificne reagense"/ Int J Cancer Suppl 7:51-52 Q992)) mogu takodje da se dobiju.

U vezi sa imunotoksinima/antitela mogu da se modifikuju tako da deluju kao imunotoksini upotrebljavajući tehnike koje su dobro poznate u tehnici. Videti na pr,, Vitetta Immunol 1oday 14:252 (.1993). Videti takodje U.S. Patent No. 5,194,594. U vezi sa dobijanjem radioaktivno obeleženih antitela, takva modifikovana antitela mogu takodje lako da se dobiju korišđenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Videti na pr., Junghans et al, , u Cancer Chemotherapy and Biotherapy 6 55-6 86 (2nd edition, Chatner and Longo, eds Lippincott Raven (1996)). Videti takodje U.S. Patente No. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,9-90. (RE35,'50.(1), 5.648,471, i 5.697 ,902. Svaki od imunotoksina i radioaktivno obeleženih molekula đe verovatno ubiti ćelije koje ekspresionišu CTLA-4, a naročito one ćelije u kojima su antitela prema pronalasku efikasna.

U vezi sa dobijanjem terapeutskih peptida preko korišćenja strukturnih informacija vezanih za CTLA-4 i antitela uz to, kao što su antitela prema pronalasku Gcao što je prodiskutovano,niže u vezi sa malim molekulima) ili pretraživanjem peptidnih biblioteka, terapeutski' peptidi mogu da se dobiju koji su usmereni protiv CTLA-4. Dizajn i pretraživanje peptidnih terapeutika je prodiskutovano u vezi sa Houghten et al.', Biotechnigues 13:412^421 (1992) ,! Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al, Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzir-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Imunotoksini i radio aktivno obeleženi molekuli mogu takodje da se proizvedu na sličan način, u vezi sa peptidnim delovima kao što je

prodiskutovano gore u vezi sa antitelima.

Važna informacija koja se odnosi na vezivanje antitela za antigen može da se dobije preko fag displej ekperi-mentisanja. Takvi eksperimenti se uglavnom ostvaruju ispiranjem fag biblioteke koja ekspresionišenasumične pe^tide za vezivanje sa antitelima prema pronalasku da bi se odredilo da li se mogli izolovati peptidi koji vezuju.

Ako je uspešno, izvesna epitop informacija se može sakupiti

iz peptida koji vezuju.

Uglavnom, fag biblioteke koje ekspresionišu nasumič-ne peptide mogu biti nabavljene od New England Biolabs (7-mer i 12-mer biblioteke, Ph.D 7-peptida 7-mer bibliotečka oprema i odnosno Ph.Đ.-12' peptida 12r-mer bibliotečka oprema) bazirano na bakteriofag M13 sistemu. 7-rmer biblio - teka predstavlja odstupanja od približno 2.0. x 10<9>nezavisnih klona, koji predstavljaju najveći broj, ako ne sve od 20<7>=1.28 x IO<9>mogućih 7-mer sekvenci, 12-mer biblioteka sadrži približno 1.9 x 10 q nezavisnih klona i predstavlja samo veoma mali uzorak potencijalnog prostora sekvencdod 20 12 = 4.1 x 10<15>12 mer sekvenci. Svaka od 7^

mer i 12-mer biblioteka su isprane^<i>pretražene u saglasnosti sa preporukama proizvodjaća u kojima su ploče obložene

" sa antitelom da bi se uhvatila pocrođna antitela (koziii anti-humanj. ToGfr.za IgG antitelo na primer) ) "praćeno sa pranjem. Vezani fag se eluira sa 0.2 glicina HC1, pH 2.2.Posle 3 kruga selekcije/amplifikacije (pojačavanja) pri konstantnoj stringentnost (0.5%Tween) upotrebomDNK sek^vencionisanjem, može da se karakterišu kloni iz biblioteke koji su reaktivni sa jednim ili više antitela. Reaktivnost peptida može da se odredi pomoću ELISA, Za dodatnu diskusi-

ju epitop-analizi peptida videti takodje Scott, J.K, i Smith, G.P. Science 249:386-390(1990) - fCwirla et al,

PNAS USA 87:6378^6382 (1990);Felici et al, J, Mol, Biol, 222:301-310 (1991 (, i Kuwabara et al. Nature Biotechnology 15:74-78 (1997).

Dizajn gena i/ili antisens terapeutika preko konvencionalnih tehnika je takodje olakšana ovim pronalaskom. Takvi modaliteti mogu da se iskoriste za moduliranje funkcije CTLA-4. u saglasnosti š tim antitela iz ovog pronalaska olakšavaju dizajn i upotrebu funkcionalnih analiza poveza-nih s tim. Dizajn^strategija za antisens (antismer) terapeutike su prodiskutovani detaljno u Internacionalnoj Patentnoj Prijavi No. W0 94/29444. Dizajn i strategije za gen terapiju su dobro poznati. Medjutim,naročito, upotreba gen terapeutskih tehnika koje obuhvataju intratela Cintra-bodies) mogu se pokazati kao naročito pogodne, Videti na pr., Chen et al. Human Gene Therapy 5:595r60..1 (1994) i Marasco Gene Therapy 4:11-15 (199-7), Opšti dizajn i razmat-ranja srodna sa gen terapeuticima su takodje prodiskutovani u Internacionalnoj Patentnoj Prijavi No. WO 97/38137. Genetički materijali koji kodiraju antitelo prema pronalasku (kao što su 4.1.1, 4.8.1, ili 6.1.1, ili drugi) mogu da budu uključeni u pogodan ekspresioni sistem Cbilo virusni, oslabljeni virusni, ne-virusni, ogoljeni, ili drugojačiji) i primenjuju se na domaćina za in vivi dobijanje antitela u domaćinu.

Terapeutici malih molekula mogu takodje da se pred-vide u saglasnost sa ovim pronalaskom.Lekovi mogu da se dizajniraju da se modulira aktivnost CTLAr4 na osnovu ovog pr&nalska. Saznanja stečena iz strukture CTLAt4 molekula i njegovih interakcija sa drugim molekulima u saglasnosti sa ovim pronalaskom, kao što su antitela iz ovog pronalasr-ka, CD28,'B7, B7t1,E7t2, i drugi može da se iskoristi da se racionalno dizajniraju dodatni terapeutski modaliteti.

U ovom pogledu, tehnike racionalnoa dizajna leka kao što

su kristalografija X-zracima, molekularno moduliranje pomoću kompjutera(ili asistirano) (CAMM) kvantitativni ili kvalitativni odnos aktivnosti strukture (OSAR), i slične tehnologije mogu da se iskoriste da se usredsrede napori za otkriće leka. Racionalni dizajn dopušta predvidjanje struktura proteina ili sintetskih struktura koje mogu da interaguju sa molekulom ili njegovim spe'ćifičnim oblicima koji se mogu upotrebiti za modifikovanje ili moduliranje aktivnosti CTLA-4. Takve strukture mogu da se sintetizuju hemijski ili da se ekspresionišu u biološke sisteme Ovaj prilaz je razmatran u Capsev et al. Geneticallv Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988). Ustvari, racionalni dizajn molekula (bilo peptida, peptidomimetik©malih molekula, ili slično) bazirano na poznatim, ili opisanim .strukturnim aktivnostima odnosima sa drugim molekulima (kao što su antitela u saglasnosti sa pronalaskom) su postali opšta rutina. Videti na pr., Fry et al. "Specific, irreversible inactivation of epidermal growth factor receptor and erbB2 by a new class of tyrosine kinase inhibitor" Proc Natl Acad Sci USA 9 5 : 12022-7-(.1998) ; Hoffman et al. "A model od Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of rhodanese homology domain" MolBiol 282:195-208 (1998) ; Ginalski et al. "M.odelling od active forms of protein kinases: p38-a case study" Acta Biochem Pol 44:557-6-4 (1997);. Jouko et al. "Identification od csk tyrosine phosphori-lation sites and a tvrosine residue importantfor kinase domain structure" Biochem J 322:927-35 (1997)p Singh et al. "Structure-based design ofa potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalvtic domain of erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases" J Med Chem 40: 1130-5 (1997);Mandel et al. "ABGEN: a knov^leiđge-based

automated approach for antibođv structure modeling" Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini et al. "Rational design, analvsis, and potentional utility of GM-CSF anta-gonists" Proc Assoc Am Physicians 108:420-31 (19-96);

Furet et al " Modelling stuđY of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411" J Comput Aided Mol Des 9:465-72 U9-9-5).

Dalje, kombinatorne biblioteke mogu da se dizajniraju i sintetizuju i upotrebljavaju u programima pretraživanja, kao što su radovi na pretraživanju sa velikim prometom.

Terapeutska primena i formulacije

Razumljivo je da će primena terapeutskih entiteta u saglasnosti;- sa pronalaskom biti primena sa pogodnim nosačima, ekscipijentima, i drugim agensima koji se inkor-poriraju u formulacije da bi se obezbedio poboljšani trans-fer odavanje, tolerancija, i slično. Mnoštvo pogodnih formulacija može da se nadje u zbirci formula poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Reminton<*r>s Pharmaceutical Sciences Cl5 ■f-o izd,, Mak Publishing Company, Easton, PA

(1975)), naročito poglavlje 87 Blaug-a, Seymour-a, u njemu. Ove"formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide (katjonske ili anjons-ke) koji sadrže prenosioce (kao šti je Lipofectm TM), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje u vodi i voda u ulju . emulzije, karbovakš emulzije (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polu-čvrsti gelovi, i polu-čvrste smeše koje sadrže karbovakš (tvrdi polietilen). Bilo koja od prethodnih smeša može da bude pogodna u tretmanima i terapijama u saglasnosti sa ovim pronalaskom, pod uslovom da aktivna komponenta u formulaciji nije inaktivirana formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i podnošljiva sa načinom primene. Videti takodje Powell et al. "Compendium of excipients for paren-teral formulations" PDA ,J Pharm Sci Technol. 52 : 23 8 - 311

(1998) i citati u njemu za dodatne informacije povezane

sa ekscipijentima i nosačima dobro poznatim farmaceutskim hemičarima.

Dobijanje antitela

Antitela u saglasnosti sa pronalaskom prvenstveno

se dobijaju korišđenjem transgenog miša koji ima bitni uđe<p>(porciju) humanog antitela koji proizvodi genome umetnute ali koji su učinjeni deficijentnim u proizvodnji endogen nih, mišijih',' antitela. Takvi miševi su tada,' sposobni za proizvodnju Humanih imunoglobulin molekula i antitela i deficijentni su u proizvodnji mišijih imunoglobulin mole^ kula i antitela. Tehnologije korišđene za postizanje istog prodiskutovane su u patentima, prijavama, i referencama<i>izložene su ovde u Osnovi pronalaska, Medjutim , naroči-to, prvenstvena realizacija transgene proizvodnje miševa i antitela otuda prodiskutovani su u U.S. Pateintnoj Prijavi Seri jski No. 08/759,620,' podnetoj 3 decembra, 1996 , čiji je opis inkorporiran ovde referencom, Videti takodje Mendez et al. Nature Genetics 15:146^156. (1997) čiji je opis inkorr* poriran ovde referencom.

Upotrebom takve tehnologije', mi smo proizveli

potpuna humana monoklonalna antitela različitih, antigena,

TM , ...

Suštinski, mi smo imunizirali XenoMouse Unije misa sa antigenom od interesa, dobijanje limf atične,. ćelije (kao što su B-ćelije) iz miševa koj . ekspresionišu antitela, fuzionišu takve dobijene ćelije sa mijeloid-tip ćelijskom linijom, da bi se dobile besmrtne hibridoma ćelijske linije, i takve hibridoma ćelijske linije se pretražuju i selektuju da bi se identifikovale hibridoma ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. Mi smo koristili ove tehnike u saglasnosti sa ovim pronalaskom za dobijanje antitela specifičnih za CTLA-4. U ovome mi smo opisali proizvodnju višestrukih hibridom ćelijskih linija koje proizvode antitela speci-fična za CTLA-4. Dalje', mi smo obezbedili karakterizaciju antitela proizvedenih pomoću takvih ćelijskih linija, uključujući nukleotidne i amino kiselinske sekvence analize teških i lakih lanaca takvih antitela.

Antitela izvedena iz hibridom ćelijskih linija prodiskutovana ovde su označena 3.1,1, 4,1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11,7.1,12.3.1.1, i 12.9.1.1.Svako od antitela proizvedeno pomoću prethodno navedenih ćelijskih linija su ili potpuna humana IgG2 ili igG4 teški lanci sa humanim kappa lakim lancima. Uglavnom, antitela u saglasnosti sa pronalaskom poseduju veoma visoke afinitete, tipično posedujući Kđ "s od oko 10— ' 9 sve do oko 10—~ 11M, kada se meri pomoću bilo čvrste faze ili faze rastvora.

Kao što je razumljivo, antitela u saglasnosti sa ovim pronalaskom mogu da se ekspresionišu u ćelijskim lini^-jama drugoj ačij im nego hibridom;. će^lijskim linijama, Sekvence koje kodiraju cDNKs ili genomne klone za odredjena antitela mogu da se upotrebe za transformaciju pogodnih .'sisara ili ne-sišara. Transformacija može da bude pomoću bilo kojeg poznatog postupka za uvodjenje polinukleotida u deliju domaćina, uključujući', na primer,

pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje delije domaćina sa virusom (ili vektorom)

ili pomoću postupaka transfekcije poznatih u tehnici, kao što je dato primerom u U.S. Patentima No. 4, 3 99 , 216 , .4 .9 4 ,912,040 , 4 ,740 ,461 i 4',959 ,455 ( koji su patenti ovim inkorporirani ovde referencom) Upotrebljen trensformaci-

oni postupak zavisi od domaćina koji treba da se transfor-miše. Postupci za uvodjenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u tehnici i uključuju,

ali nisu ograničeni na dekstranom posredovanu transfekciju, kalcijum fosfat taloženje,' polibrenottrposredovanu transfekciju, protoplast fuziju, elektroporaciju, bombardovanje česticama, enkapsuliranje polinukleotida? u lipozome, peptidne konjugate, dendrimere, i direktnim mikroinjekti-ranjem DNK u jezgro.

Ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u tehnici i uključuju mnoge obesmrčene ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali ne ograničavajući na ćelije ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovary) (CHO), NSOQ, HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka Cbaby hamster kidney )( BEK),ćelije bubrega majmuna (monkey kidnev) v (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (na pr., Hep G2),

i jedan broj drugih ćelijskih linija. Ćelije ne-sisara uključujući ali ne ograničavajući na bakterijske, kvasca, insekata, i biljaka mogu takodje da se upotrebe za ekspresuju rekombinantnih antitela. Na mesto usmerena mutageneza anti-r telo CH2 područja da bi se eliminisala glikosilacija može da bude prvenstvena u cilju da se spreče promene Bilo u imunogenosti, farmakokinetici, i/ili efektor funkcijama koje rezultuju od ne-humane glikcsilacije. Ekspresioni postupci su odabrani odredjivanjem koji sistem daje najve-

će ekspresione nivoe i proizvodi antitela sa konstitutiv-

nim CTLA-4 vezujućim osobinama.

Dalje, ekspresija antitela prema pronalasku (ili njihovih drugih udelaJ iz produkcionih ćelijskih linija može da se poveća upotrebom jednog broja poznatih tehnika. Na primer, glutamin sinteteza i DHFR gen ekspresioni sistem su uobičajeni pristup za povećanje ekspresije pod izvesnim uslovima. đelijski kloni koji visoko ekspresio-nišu mogu da se identifikuju upotrebljavajući konvencionalne tehnike, kao što su ograničeno razblaženo kloniranje i mikrokapljičasta (Microdrop) tehnologija. GS sistem je prodiskutovan u celosti ili delom u vezi sa Evropskim Patentima 0 216 846, 0 256 055, i 0 323 997 iEvropska

Patentna ^rijava no 89303964.4.

Antitela prema pronalasku mogu takodje da se proizvedu tra.isgeno dobijanjem i szisara ili biljke koja je transgena za sekvence' oimunoglobulina teških i lakih lanaca od interesa i proizvodnju antitela u obliku koji se može otuda regenerisati. U vezi sa transgenom proizvodnjom u sisarima, antitela se mogu proizvesti i regenerisati iz, mleka koza, krava,' ili drugih sisara. Videti, na pr., U.S.

Patente No. 5,827,690,' 5', 756 ,'687', 5,75(1,172, i 5,741,957.

Antitela u saglasnosti sa ovim pronalaskom su anali?" zirana strukturno i funkcionalno. U vezi sa strukturama antitela, amino kiselinske sekvence teških i kappa lakih lanaca su predskazane na osnovu cDNK sekvenci dobijenih pomoću RT-PCR hibridoma. Videti Primere 3 i 4 i Slike 1-8. N-Terminalno sekvencionisanje antitela takodje je izvr-šeno u konfirmaciji rezultata prodiskutovanih u Primerima 3 i 4. Videti Primer 5 i Sliku 9. Kinetičke analize antitela su izvedene da bi se odredili afiniteti. Videti Primer 2. Antitela u saglasnosti sa pronalaskom Ci naročito 4,1,1, 4.8.1, i 6.1.1 antitela prema pronalasku) imaju velike afinitete C4. 1.1:1.63X10<10>1/M?4.8,1:3,54 X IO<10>' 1/M^i 6.1.1:7.2 x 10 l/M) . Dalje, antitela su analizi/rana pomoću izoelektričnog fokusiranja (IEF), redukujuće gei elektroforeze (SDS-PAGE), hromatografijom ekskluzije po veličini, tečnom hromatografijom/masenom spektroskopijom,

i masenom spektroskopijom i proizvodnjom antitela pomoću hibridoma . Videti Primer 6 i Sliku 10.

U vezi sa funkcionalnim analizama antitela u saglasnosti sa ovim pronalaskom, pokazano je da su takva antitela snažni inhibitori CTLA-4 i njegovog vezivanja za njegove ligande B7 familije molekula. Na primer, pokazano je da antitela prema ovom pronalasku blokiraju CTLA-4 vezivanje na bilo B7-1 ili B7-2, Videti Primer 7, U stvari mnoga od antitela u saglasnosti sa pronalaskom poseduju nanomolarne i subnanomolarne IC^gS obzirom na inhibiranje CTLA-4 vezivanje za B7-1 i B7-2. Dalje, antitela prema pronalasku poseduju odličnu selektivnost za CTLA-4 u poredjenju sa CD28, CD44, B7-2, ili hlgGl. Videti Primer 8. Selektivnost je odnos koji odražava stepen preferencijalnog vezivanja molekula sa prvim agensom u poredjenju sa molekulima koji se vezuju sa drugim, i opciono sa drugim molekulima. U ovome, selektivnost se odnosi na stepen preferencijalnog vezivanja antitela prema pronalasku na CTLA-4 u poredjenju sa vezivanjem antitela na druge molekule kao što su CD28, CD44, B7-2, ili hlgGl. Vrednosti selektivnosti antitela prema pronalasku veće od 50.0.:1

su uobičajene. Antitela prema pronalasku su takodje demona strirana da izazivaju povećanu ekspresiju izves'nih citokina Ckao što su IL-2 i IFNt V ) kultivisanjem T ćelija u T-ćelijskom blast modelu. Videti Primere 9 i 10 i Slike 12-17. Dalje, očekuje se da će antitela prema pronalasku inhibirati rast tumora u pogodnim in vivo modelima tumora, Čiji je dizajno modela prodiskutovan u Primeru 11 i 12.

Rezultati demonstrirani u saglasnosti sa ovim pronalaskom pokazuju da antitela prema ovom pronalasku poseduju izvesne kvalitete koji mogu da učine ova antitela efikasnijim od sadašnjih terapeutskih antitela protiv CTLA-4.

Naročito, 4.1.1, 4.8.1, i 6.1.1. antitela prema pronalasku poseduju veoma poželjne osobine. Njihove strukturne karakteristike, funkcije, ili aktivnosti obezbedjuju kriterijum koji olakšava dizajn ili selekciju dodatnih antitela ili drugih molekula kao što je prodiskutovano gore. Takavi kriterijumi uključuju jedan ili više od sledeđih: Sposobnost da se nadmeđu za vezivanje za CTLA-4 sa jednim ili više antitela prema pronalasku';'

Sličnu specifičnost vezivanja za CTLA-4 kao jedno ili više antitela prema pronalasku;

Afinitet vezivanja za CTLA-4 od oko 10 M ili veći, a prvenstveno od oko IO"1 M ili veći;

Ne reaguje unakrsno sa CTLA-4 nižih sisare, uključu-jući, prvenstveno miševe, pacove, ili zečeve, a prvenstveno CTLA-4 miševa ili pacova. ,,

Reaguje unakrsno sa CTLA-4 primata, uključujući, prvenstveno CTLAr4 cynomologus-a i rezus-a;

Selektivnost za CTLA-4 nad CD28, B7T2,' CD44, ili hlgGl od najmanje oko 10.0:1 ili više a prvenstveno od oko 30.0, 400, ili 50.0:1 ili više;

IC5q u blokiranju CTLA^4 vezivanja za B7^2 od oko 100 nM ili niže, a prvenstveno 5, 4 ,' 3 ,' 2 , 1,' a. 5,' ili 0 ,38 nM ili niže;

IC^q u blokiranju CTLA-4 vezivanja za B7-1 od oko 100 nM ili niže,' a prvenstveno 5, 4', 3, 2, 1, 0.5 ili0.50 nM ili nigej i

Povećanje proizvodnje citokina u jednoj ili više

in vitro analiza, na primer;

Povećanje proizvodnje IL-2 u T-ćelijskoj blast/ Raji analizi od oko 500 pg/ml ili više, a prvenstveno 750, 1000, 1500, 2000, 3000, ili 3846 pg/ml ili više;

Povećanje proizvodnje IFN-^u T ćelijskoj blast/ Raji analizi od oko 500 pg/ml ili više, a prvenstveno 750, 10.0-0-,' ili 1233 pg/ml ili više'?

ili

Povećanje proizvodnje IL-^2 u hPBMC ili analizi superantigena celokupne krvi od oko 500 pg/ml ili više, a prvenstveno 750, 1000, 1200.', ili 1511 pg/ml ili više. Izra-ženo na drugi način, poželjno je da se proizvodnja IL-2 poveća za oko 30, 35, 40, 45, 50 procenata ili više u odnosu na kontrolu u analizi.

Očekuje se da antitela Cili molekuli dizajnirani ili sintetizovani otuda) koji imaju jednu ili više od ovih osobina poseduju sličnu efikasnost za antitela opisana u ovom pronalasku.

Željene funkcionalne osobine prodisutovane gore mogu često da rezultuju iz vezivanja za,i inhibicije CTLA-4 pomoću molekula (tj . , antitela, fragmenta antitela ,' peptida,<1>ili malih molekula) na sličan način kao i anti^telo prema pronalaku Ctj. vezivanjem na iste ili slične epitope CTLAt4 molekula). Molekul može da se primenjuje bilo direktno Ctj., direktna primena na pacijenta takvih molekula)',' Ili, altenativno', molekul može da se "primenjuje" indirektno Ctj., peptid ili slično koji proizvodi imuni odgovor kod pacijenta (slično vakcirii) gde imuni odgovor uključuje đobijanje antitela koja se vezuju za isti ili sličan epitop ili antitelo ili fragment koji se proizvodi in situ posle primene genetičkog materijala koji kodira takava antitela ili njihove fragmente koji se vezuje za

isti ili sličan epitop). Prema tome, razumljivo je da če epitop na CTLA-4 za koji se vezuju antitela prema pronalasku biti korisan u vezi sa proizvodnjom i/ili dizajnom terapeutika u saglasnosti sa pronalaskom. U dizajnu leka, negativna informacija je isto tako često korisna kao i (tj činjeni-ca da se antitelo koje se vezuje za CTLA-4 ne izgleda da se vezuje za epitop koji deluje kao inhibitor CTLA-4 j<g>korisnol Prema tome, epitop za koji se vezuju antitela prema pronalasku što ne dovodi do željene funkcionalnosti može takodje da bude veoma korisno, Prema tome, se razmatraju u saglasnosti sa ovim pronalaskom molekuli (a naročito antitela) koji se vezuju za iste ili slične epitope kao antitela prema pronalasku.

Pored činjenice da se antitela prema pronalasku i epitopi za koje se ona vezuju razmatraju u saglasnosti sa pronalaskom, mi smo izvršili neka preliminarna ispitivan nja kartografisanja (mapiranja) izvesnih antitela u saglasnosti sa pronalaskom a naročito 4.1.1 i 11,2.1 antitela prema pronalasku.

Kao prvi korak, mi smo izvršili BIAcore kompetici-one studije da bi se dobila gruba mapa vezivanja kao što je izmedju izvesnih antitela prema pronalaku u poredjenju sa njihovom sposobnošću da se nadmeću za vezivanjesa CTLA-4. Na kraju,' CTLA4 se vezuje za BIAcore čip Cparče) i prvo antitelo, pod uslovima zasićenja, se vezuje uz to i meri se konkurenata ••. -narednih sekundarnih antitela u vezivanju za CTLA4 Ova tehnika omogućava đobijanje grube mape u koju familiju antitela može da se klasifikuju.

Ovim procesom, mi smo odredili da izvesna antitela

u saglasnosti sa pronalaskom mogu da budu kategori-sana kao da spadaju u sledeće kategorije epitopa:

Kao sleđeći korak, mi smo nastojali da odredimo

da li antitela prema pronalasku raspoznaju linearni epitop na CTLA4 pod ređukujuđim i nerredukujuđim uslovima na Western blots. Mi smo uočili da ni jedno od 4.1,l','3.1,1, 11.7.1,li,6.l', ili 11.2,1 antitela prema pronalas-igleda da raspoznaje redukovani oblik CTLA4 na Westarn blot. Prema tome, izgleda verovatno da epitop za koji je svako od ovih antitela vezano nije linearni epitop već' jeverovatni-je konformacioni epitop čija je struktura mogla biti ukinutaPoc* redukujuđim uslovima.

Stoga, smo mi razmatrali da odredimo da li možemo da saznamo o ostacima unutar CTLA4 molekula koji su značajni za vezivanje antitela prema pronalasku. Jedan način koji smo iskoristili je bio da izvršimo kinetička odredjivanja "off-rates" (off brzina^ kao izmedju humanih CTLA4 i dva visoko konzervirana ' primatna CTLA4 molekula (cvnomologous i marmoset CTLA4). BIAcore studije su poka-zale da se 4.1.1 antitelo prema pronalasku vezuje za humane, cvnomologous i marmoset GTIA4 istom brzinom. Medjutim s obzirom na "off-rates" ("off brzine) (.afinitet) , 4.1.1 antitelo je imalo najveđi afinitet (najnižu<"6ff-rate")

za humane, veću "off-rate" sa cvnomologous, i mnogo veću "off rate" za marmoset. 11.2.1 Antitelo prema pronalasku,

s druge strane, vezuje se za humane, cvnomologous i marmo-se*- CTIA4- °'co istom brzinom i ima istu relativnu "off-rate" za svaku od ove tri.:oVa informacija dalje ukazuje da 4.1.1 i 11.2.1 antitela prema pronalasku se vezuju za različite epitope na CTLA4.

Za dalju studiju epitopa za koj<i>se kategorije B i C antitela prema pronalasku vezuju, mi smo izvršili izvesne studije na mesto usmerene mutageneze. , Marmot CTLA4 poseduje dve važne promene na ostacima 105 i 106 u odnosu na humani CTLA4. Takve razlike su leucin u.■ metionin promenu na ostatku 105 i glicin u , serin promenu na ostatku 106. Prema tome, mi sm<o>mutirali cDNK koja kodira humani CTLA4 da kodira mutirani CTLA4 koji ima L105M i G106s promene. Homologi zamenjujući mutant CTLA4 nije uticao na vezivanje B7-2-IgGl fuzionog proteina. Dalje, vezivanje sa 11.2.1 antitelom prema pronalasku nije se^dogadjalo.

Medjutim, takvi molekuli su bili značajno inhibirani u njihovoj sposobnosti da se vežu sa 4,1.1 antitelom prema pronalasku tslično sa marmosetom). Potom, mi smo mutirali cDNK koja kodira marmoset CTLA4 da bi stvorili mutant marmoset CTLA4 koji ima S106G promenu. Takva promena je rezultirala u restauraciji stabilnog vezivanja izmedju 4.1,1 antitela i marmoset CTLA4 mutanta. Pored toga, mi smo mutirali cDNfv koja kodira marmoset CTLA4 da bi stvorili mutant marmoset CTLA4 koji ima M105L promenu. Takva promena delimiđno restaurira vezivanje izmedju 4,1.1 antitela i mutanta CTLA4.

Svaka od kategorija B do D antitela prema pronalasku poseduje slične funkcionalne osobine iizgleda da imaju potencijal da deluju kao snažni anti-CTLA4 terapeutski . agensi. Dalje, svaki od molekula osigurava unakrsnu kompe-ticiju (konkurenciju) u njihovom vezivanju ža'CTLRT. Medjutim, kao što se vidi iz gonje diskusije, svaki od molekula u različitim kategorijama izgleda da se vezuje za odvoje-

ne konformacione epitope na CTLA4,

Iz prethodnog, bide razumljivo da informacija o epitopima prodiskutovana gore pokazuje da đe antitela (.ili drugi molekuli, kao što je prodiskutovano gore) koji su unakrsno konkurentni sa antitelima prema pronalasku verovatno imati terapauteku snagu u saglasnosti sa ovim pronalaskom. Dalje, očekuje se da đe antitela (ili drugi molekuli kao što je prodiskutovano gore) koji su unakrsno konkurentni sa antitelima prema pronalasku (tj, unakrsno,konkurentni sa kategorijom B, C i/ili d antite-13-- i koji (i) nisu redukovani u njihovom vezivanju za marmoset CTLA-4 (slično sa 11.2.1 antitelom) ili (ii) su redukovani u njihovom vezivanjusa marmoset CTLA4. (slično sa 4.1,1 antitelom) imati verovatno izvesan dodatni terapeutski potencijal u saglasnosti sa ovim pronalakom.Antitela (ili drugi molekuli, kao što je prodiskutovano gore) koji konkurišu sa kategorijama A i E mogu takodje da inaiu izvesan terapeutski potencijal,

PRIMERI

Sledeđi primeri, uključujuđi eksperimente koji

su izvedeni i dobijene rezultate su obezbedjeni samo u ilustrativne svrhe i ne treba da se smatraju ograničavaju^đim za ovaj pronalazak.

Pobijanje hibridoma koji proizvode an ti- CTLA- 4 antitela

Antitela prema pronalasku se dobijaju, selektuju, i analiziraju u saglasnosti sa ovim Primerom.

Pobijanje antigena: Tri posebna imunogena se dobijaju za imunizaciju KenoMouse1''1 miševa: (i) CTLA-4-IgG fuzioni protein, (ii) CTLA-4 peptid, i (iii) 300.19 mišije limfoma ćelije transfektovane sa mutantom od CTLA-4

(Y201V) koji je konstitutivno ekspresionisan na ćelijskoj površini.

(i) CTLA- 4- Ig G fuzioni protein

Konstrukcija ekspresi onog vektor ca: cDNK koja kodira zrelo ekstraćelijsko područje CTLA-4 je PCR amplificirana iz humane timus cPNK biblioteke (Clontech) upotrebljavajući prajmere dizajnirane za publikovane sekvence (Eur. J. Immunol 18:1901-1905 (1988)). Fragment je usmereno subkloniran u pSR5, Sindbis virus ekspresioni plazmid (InVitrogen), izmedju humanog onco statin M signalnog peptida i humanog IgG gama 1 (IgGl) CH1/CH2/CH3 područja. Fuzioni protein ne sadrži šaržirno područje ali sadrži cistein 120 u ekstraćelijskom području CTLA-4 da bi se obrazovao kovalentni dimer. Dobijeni vektor je nazvan CTLA-4-IgGl/pSR5. Kompletna CTLA-4-IgGl cDNK u vektoru se sekvencionisanjem potvrdjuje u obe niti. Amino kiselinska sekvenca CTLA4-Ig proteina je prikazana niže. Zrelo ekstraćelijsko područje za CD44 je PCR amplificirano iz humane limfocitne biblioteke (Clontech) i subklonirano u pSinRep5 da bi se dobio kontrolni protein sa identičnim IgGl krajem (repom).

0M-CTLA4-IgGl Fuzioni protein:

Podvučeno: signalni peptid

Masna slova: CTLA4 ekstraćelijsko područje

cDNKs za zrelo ekstraćelijsko područje CD28 su

PCR amplificirana iz humane limfocitne biblioteke (Clontech) i zatim subklonirani pCDM8 (J. Immunol. 151: 5261-71 (1993)) da bi se dobio humani IgGl fuzioni protein koji sadrži i trombin rascep i šarnlrne regione. Marmoset, Cvnomologous,

i Rhesus CTLA4 su klonirani iz mRNK izolovane iz PHA stimu-lisanih PBMCs upotrebljavajući standardne tehnike degeneri-sanog PCR. Sekvencionisanje je pokazalo da su režus i cinolo-logous amino kiselinske sekvence bile identične sa tri razlike od zrelog humanog CTLA4 ekstraćelijskog područja (S13N, I17T i L105M). Marmoset je pokazao deset amino kiselinskih razlika od zrelog humanog CTLA4 ekstraćelijskog područja (V21A, V33I, A41T, A51G, 5.41, S71F-, 075K, T 88M, L10-5M i G106S)A='Na mesto usmerena mutageneza je upotrebljena da bi se dobila jedna jedina tačka mutacija svih amino kiselina

različita u marmoset CTLA4 da bi se kartografisale (mapirale) amino kiseline važne za interaciju antitela sa humanim CTLA4-IgG. Mutacije humanih i marmoset CTLA4-IgG za epitope kartografisane dobijene su pomoću posredničke na mesto usmerene mutageneze (Promega) . IgG fuzioni proteini s"u đobi-jeni tranzientnom transfekcijom CoS7 ćelija i prečišćavanjem upotrebljavajući standardne Protein A tehnike. Mutantni CTLA4-lgG proteini su procenjeni na vezivanje za antitela pomoću imunoblotinga i upotrebom BIAcore analiza.

Ekspresija/ prečišćavanj e rekombinantog proteina: Rekombinantni sinđbis virus se dobij a elektroporacijom (Gibco) ćelija bubrega mladunca hrčka sa SP6 in vitro transkribovanom CTLA4-IgGl/pgR5 mRNK i DH 26S poma-gačem j^RNK kao što je opisano pomoću InVitrogen. Četrdeset i osam sati kasnije rekombinantni virus je sakupljen i tit-risan za optimalnu ekspresiju proteina u ćelijama ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovarv cells) (CHO-K1), CH0-K1 ćelije se kultivišu u suspenziji u DMEM/F12 (Gibco) koja sadžrži 10.% toplotom inaktiviranog fetalnog govedjeg seruma CGibco) ne^bitnih amino kiselinaCGibco) r4mM glutaminaCGibco) fpenicilina/streptomicina(Gibco) f10 mM Hepes^a pH 7.5 CGiEco). Da bi se proizy~leCTLA-4^IgG, CKO-Kl ćelije se ponovo suspenduju pri 1 x 10 ćelija/ml u DMEM/F12 i inkubiraju sa sindbis virusom jedan sat na sobnoj temperaturi. Ćelije se tada razbla<g>uju do 1 x ia<6>/ml uDMEM/F12 koji sadrži 1% fetalnog govedjeg seruma sa smanjenim gove-djim IgG upotrebljavajući protein A sefarozu (Pharmacia), ne-bitne amino kiseline, 4mM glutamina 12.5mM Hepes-a pH 7.5, i peniciltna/streptomic^h-a. četrdeset osam sati posle infekcije delije se peletiziraju i kondicionirani medi juni se sakuplja i dopunjava sa potpunim i proteaza inhi-bitorskim tabletama (Boehringer Mannheim), podešava se pH

na 7,5 i filtrira 0.2 u (Nalgene). F^LC (Pharmacia) se upotrebljavaju da po afinitetu prečisti fuzioni protein upotrebljavajući 5 ml protein A HiTrap kolonu (Pharmacia)

pri lOml/min brzini protoka. Kolona se pere sa 30 zapremi-

na sloja PBS i eluira se sa 0.IM glicina/HCl pH 2.8 pri lml/min. Frakcije (.1 ml) se odmah neutrališu do pH 7,5

sa Tris pH 9. Frakcije koje sadrže CTLA4^IgGl se identifikuju pomoću SDS-PAGEizatim se koncentrišu upotrebi java*-

jući centriplus 50. (Amicon) pre nanošenja na sefaroza 20-0. kolonu (Pharmacia) pri 1 ml/min upotrebljavajući PBS kao rastvarač. Frakcije koje sadrže CTLA-r4-rlg.Gl se objeđinju^

ju i sterilno filtriraju 0.2 u (Millipore), dobijaju ali-kvoti i zamrzavaju na -80°C, CD44-IgGl se ekspresionišu i prečišćavaju upotrebljavajući iste postupke CD28-IgG se prečišćavaodkondicioniranog medijuma od transientnih tr^nfektovanih Cos7 ćelija.

Karakterizacija CTLA-4-IgGl:

Prečišćena CTLA-4-IgGl migrira kao samo jedna traka na SDS-PAGE upotrebljavajući koloidalno "coomassie" bojenje (Novex (.. Pod ne-redukujućim uslovima CTLA-4-^lgGl je bio dimer O-OOkDa) 'f' koji je redukovan do 50kDa monomer kada je tretiran sa 50 mM DTT. Amino kiselinsko sekvencionisanje prečišćenog CTLA-4-IgGl u rastvoru potvrdilo je N^terminus CTLA-4(MHVAOPAVVLAS) ti onaj onkostatin M signalni ; peptid

<■ je isečen iz zrelog fuzionog proteina,

CTLA-4-IgGl je- vezan za imobilisani B.71-IgG na način koji zavisi od koncentracije, a vezivanje je blokirano pomoću hrčak-anti-humanog anti-CTLA-4 antitela (BNT3: PharMingen). Sterilni CTLA-4-IgG je bio bez endotoksina i kvantitatiran pomoću OD280 upotrebljavajući 1.4 kao ekstinkcioni coefi-cijent. Prinos prečišćenog CTLA-4-IgG dostizao je izmedju 0.5-3 mgs/litar CHO-K1 ćelija.

(ii) CTLA- 4 Peptid:

Sledeći CTLA-4- peptid je dobijen kao što je opisano niže: nh2:mhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtylrqadsqvt evcaat<y>mm<g>nelt<p>lddsict<g>tss<g>nqvnltiq<g>lramdt<g>l<y>ick"-velm<ypppyy>l<g>ign<g>tqi<y>vid<p>e<p>c-conh2

Skraćenice/ Materijali:

NMP, N-metilpirolidinon; TFE', 2 ,<2>2-trif luor-etanol; DCM,' đihlormetan; FMOC, fluorenil metoksi-karbonil. Svi regensi su snabdeveni od strane firmePerkinElmer, sa sledećim izuzecima: f-p^Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG smd'ia Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Scr(lBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH .. i" FMOC-Tyr(tBu)-OH

su upotrebljen! za one amino kiseline koje zahtevaju zaštitne grupe za boćne lance.

Sinteza peptida:

Sinteza peptida se izvodi na Perkin-Eimer 431A, retropodešenim sa podacima o rezultatima beleženim preko UV absorbcije na 30lnm (('Perkin-Elmer Model 759A detektor) Peptidna sekvenca je sakupljena na FMOC-PAL-PEG smoli upotrebljavajući kondicionalne cikluse dvostrukog kuplovanja. Prinudna dvostruka kuplovanja su izvršena na ciklusima 10 ,11 ,'l8 ,19 , 20 i 28 do 33. Smola se pere sa 50% smešom od DCM i TFE pri upotpunjavanju svakog ciklusa aci-lovanja, praćeno kaptažom nereagovanih amino grupa sa anhidridom sirćetne kiseline u NMP. Smola se uklanja iz reaktora posle upotpunjavanja ciklusa 49 i ostatak se ostavlja do upotpunjavanja. Peptidno cepanje iz smole izvodi se upotrebljavajući Reagens K (King et al. International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) za 6 sati na 415 mg smole daje 186 mg sirovog CTLA-4 peptida.

Karakterizacija peptida:

25 mg alikvota sirovog CTLA-4 peptida je rastvore-no u 5 ml 6M gvanidin HCl/lOOmM J^PO^ na pH 6.4 i eluirano preko Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 kolone (16 mm x 600 mm, 120 ml zapremina sloja) sa 2M gvanidin.HC1/100 mM K2PC>3 na pH 6.4 pri 2 ml/min za 180 minuta sakupij'enih 5 ml frakcija. Frakcije su analizirane pomoću nanošenja 1.7 ul frakcije naNuPAGE Laemeli g§la ispiranjem sa MES puferom za ispiranje i učinjene vidljivim preko Daichii protokola bojenjem sa srebrom. One frakcije koje pokazuju molekulske te<g>ine od 12 KDafšto je procenjeno preko standarda molekulskih težina su objedinjene i lagerovane na 4°c. Sjedinjene frakcije su analizirane pomoću UV i gel elektroforezom. Sekvencionisanje amino kiselina je izvrše-no pomoću absorbovanja uzorka od 100 mikrolitara u PtoSorb patroni (absorbovano na PVDF membrani) i pranjem da bi se uklonile puferske soli. Sekvencionisanje je izvršeno na Applied Biosvstems 420. Uočena je očekivana N-terminalna sekvenca (MHVAOPAVVLA). Imunobloting1 je pokazalo da se peptid raspoznaje pomoću BNI3 anti-humanog CTLA-4 (PharMingen), Da bi se odstranile soli, alikvot koji je sadržavao 648 ug materijala stavlja se u 3500 Da MWCO

cev za dijalizu i dijalizira se sa 0.1% TFA/h^O na 4°C

9 dana uz mešanje. Celokupni sadržaj iz posude za dijali-ziranje se liofilizira do praška.

(iii) 300. 19 ćelije transfektovane sa

CT L- A- 4 CY2Q. 1V)

Potpune dužine CTLA^4 cDNK se PCR amlificira iz humane timus cDNK bibloiteke (Strategene) i subklonira se u pIRESneo CClontech). Mutacija CTLA-4 koja rezultira u konstitutivnoj ćelijskoj površinskoj ekspresiji unosi se upotrebljavajući MatchMaker Mutagenesis Svstem CPromega). Mutacija tirozina, Y201 u valin inhibira vezivanje adaptin proteina AP50 koji je odgovoran za brzu internalizaciju CTLA-4 (Chuang et al. J. Immunol, 1_5_9:144t151 U9-97) . 300.19 mišije limfocitne ćelije slobodne od mikoplazme se kultivišu u RpMI-1640 koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma, ne*"suštinske amino kiseline, penicilin/streptomicin, 2mM glutamin, 12.5 mM Hepes-a pH7,5i 25uHbeta<-merkaptO'r etanola. Ćelije su elektropc irane (3x10- /0-,4 ml RPMI bez seruma) u patroni od 1 ml sa 20 ug CTLAt4-)f20-lv/dpiresneo ostavljene 10 minuta i zatim je dodato 8 ml prethodno zagrejanog kompletnog RPMI medijuma. Na 48 sati ćelije su razblažene do 0.5 x l06/ml u kompletnom RPMI medijumu koji sadrži 1 mg/ml G418 (Gibco). Rezistentne ćelije su ekspandirane i pokazano je da ekspresionišu CTLA-4 na ćelijskoj površini upotrebljavajući BNI3 antitelo konjugo-vano sa fikoeritrinom (PharMingen). Visok nivo ćelija koje ekspresionišu je izolovan pomoću sterilnog sortiranja.

Imunizacija i đobijanje hibridoma:

XenoMouse miševi (8 do 10 nedelja starosti su imu-hizirani (i) subkutano na osnovi repova sa 1 x 10 300.19 ćelijama koje su transfektovane da ekspresionišu CTLA-4

kao što je opisano gore, ponovo suspenđovane u fosfatno puferovanom slanom rastvoru (PBS) sa kompletnim Freund-

ovim adjuvansom, ili (ii) subkutano na osnovi repa sa

(a) 10 ug CTLA-4 fuzionog proteina ili (b) 10 ug CTLA-4 peptida, emulgovani sa kompletnim Freund-ovim adjunansom.

U svakog slučaju, doza je ponovljena tri ili četiri puta

u nekompletnom Freund-ovom adjuvansu. Četiri dana pre fuzije miševi su dobili finalnu injekciju imunogena ili ćelija u PBS. Lim^fociti iz slezine i/ili limfnih čvorova iz imuniziranih miševa su fuzionisani sa/mišijim ne-izlučujuđim mieloma P3 ćelijskim linijama/ i podvrgnuti su HAT selekciji ka,Q što je prethodno opisano (Galfre, G i- Mllsteln,<1>C. r ' "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures, "MethodsEnzymol. 73:3^46 (1981)). Dobi.jen.' je veliki pane- (listaj hibridoma koji svi izlučuju CTLAr-4 specifičnehumane I"?G2K ili l9fG4K(kao što je detektovano niže) antitela.

ELISA analiza

ELISA za odredjivanje antigen specifičnih antitela u mišijem serumu i u supernatantu (gornjem sloju tečnosti) hibridoma vrši se kao što je opisano (Coligan et al., Urtit 2.1, "Enzyme-linkeđ immunosorbent assavs," u Current proto-cols in immunology (1994)) upotrebljavajući CTLA-4-lg fuzioni protein da zarobi antitela. Za životinje koje su imunizirane sa CTLA-4-Ig fušionim proteinom, mi smo dodatno izvršili pretraživanje za ne-specifičnom reaktivnosti protiv Ig dela humanog fuzionog proteina. Ovo se posti-že upotrebljavajući ELISA ploče obložene sa humanim IgGl kao negativnom kontrolom za specifičnost.

U prvenstvenoj ELISA analizi, upotrebijene su sle-deće tehnike: ELISA ploče su obložene sa 100 ^1/udubljenju od antigena na puferu za oblaganje ploča (0.1 M karbonatnog pufera, pH 9.6 i NaHC03(MT 84) 8.4 g/L). Ploče su zatim inkubirane na4°Cpreko noći. Posle inkubacije, pufer koji oblaže se uklanja i ploče blokiraju sa 200\-]l/uđubljenje blokirajućeg pufera (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.0.1% time-rosala u lx PBS) i inkubiraju se na sobnoj temperaturi 1 sat. Alternativno, ploče se lageruju u hladnjaku sa blokira jućim puferom i žaptivačima za ploče. Blokirajući pufer se uklanja i dodaje se 50ul/udubljene hibridom supernata, nta , serum ili drugih hibridom supernatanta (pozitivna kontrola) i HAT medijumaili blokirajućeg pufen-i (negativna kontrola). Ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 2 sata Posle inkubacije, ploče se peru sa .puferom za pranje U x PBS). Dodaje se detekciono antitelo^ Ctj. mišiji anti-humani IgG2-HRP (SB, #90 70-05) za IgG2 antitela ili mišiji anti-humani IgG4-HRP (SB #9 200-05) za Ig<S4 antitela) pri 100. ul/udubljenje (misiji anti-humani IgG2-HRP;q)1:2000 ili više mišjeg anti-humano3 IgG4-HRPX1' 10.0.0) svaki raz-bla<g>en u blokirajućem puferu). Ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat i zatim se peru sa puferom za pranje. Posle toga, dodaje se 100 ul/udubljenje sveže pripremljenog rastvora za razvijanje (10 ml Substrat pufera, 5 mg OPD (o-fenilendiamin, Sigma Cat. No. P-7288)

i 10 ul 30% H2°2(Sigma) u udubljenje. Ploče se ostave da se razvijaju 10-20 minuta, sve dok udubljenja negativne kontrole ne !počnu jedva da pokazuju bolu, Posle toga, dodaje se 100 ul/udubljenje stop rastvora (.2 M H2S<0>4) i ploče se čitaju na ELISA čitaču ploča na talasnoj dužini 490 nm.

Odredjivanje konstanti afiniteta potpunog humanog Mabs pomoću BIAcore: Merenje afiniteta prečišćenih humanih, monoklonalnih antitela, Fab fragmenata ili supernatanata hibridoma pomoću plasmon rezonance vrši se upotrebljavajući BIAcore 2000 instrument, upotrebljavajući opšte postupke iznete

od strane proizvodjača.

Kinetička analiza antitela je izvedena upotreblja-vajući antigene imobilizirane na sensor površini pri niskoj gustini. Tri površine BIAcore senzorskog čipa su imobilizir-rane sa CTLA-r4-ig fuzionira proteinom pri gustini koja se kreće od približno 390-900 upotrebljavajući CTLA-4r-Ig fuzioni protein pri 20 ili 50. ug/ml u 10 mM natrijum aceta-r ta na pH 5.0 upotrebljavajući amin kuplujuću opremu dostav-ljenu od strane proizvodjača (BIAcore, Ine), Četvrta povr-šina BIAcore senzorskog čipa je imobilizirana sa IgGl (900 RU) i koristi se kao negativna kontrolna površina za ne-speci-fično vezivanje. Kinetička analiza se izvodi pri brzini protoka od 25 ili 50 mikrolitara na minut i brzine diso-cijacije (kd ili kQff^i asocijacije (ka ili kQn) se odredjuju upotrebljavajući softvera koji obezbedjuje proizvod jač (BIA procena 3.0) što obezbedjuje globalna pogodna izračunavanja.

PRIMER 2

Merenje af ini teta >anti-CTLA-4-antitela

U sledecoj Tabeli obezbedjena su merenja afiniteta za neka antitela selektovana na ovaj način:

Kao što se može uočiti antitela dobijena u saglasnosti sa pronalaskom imaju visoke afinitete i konstante vezivanja.

PRIMER 3

Strukture anti- CTLA- 4- antitela dobijeni h u saglasnosti sa

pronalaskom

U sledeđoj diskusiji, obezbedjena je strukturna informacija vezana za antitela dobijena u saglasnosti sa pronalaskom.

U cilju da se analiziraju strukture antitela dobijenih u saglasnosti sa pronalaskom, mi smo klonirali gene koji kodiraju fragmente- teških i lakih lanaca iz odredjenih hibridoma. Kloniranje gena i sekvencionisanje se vrši na sledeđi način: Poli(A) + mRNK se izoluje iz približno 2 X 10 5 delija hibridoma izvedenih iz imuniziranih XenoMouse miševa upot-rebljavajući Fast-Track opremu (Invitrogen). Proizvodnja nasumično prajmovanih cDNK je praćena pomoću PCR. Humana Vp ili humana V"K familija specifičnih varijabilnih regiona prajmera (Marfe et al., "Oligonucleotide primers for poly-merase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family specific oligonucleo-

tide probes" Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) ili univerzalnog humanog VRprajmera,. M<3-30

(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) se upotrebljava u vezi sa prajme-rima specifičnim za humani C 2 konstantni regionCMG-40-đ?5 "-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3 "/ ili CKkonstantnim regionom (hKP2fkao što je prethodno opisano u Green et al., 1994). Sekvence humanih Mabs-izvedenih teških i kappa lanaca transkripata, a iz hibridoma su dobijeni direktnim sekvencioni-r sanjem PCR proizvoda proizvedenih iz poliCAj^RNK upotreblja-vajući prajmere opisane gore. PCR proizvodi su takodje

klonirani u pCRII upotrebljavajući TA klonirajuću opremu (invitrogen) i obe niti su sekvencionisane upotrebljavajući Prism boja terminator sekvencionu opremu (Prism Dye-terminator seguencing kits) i ABI 377 sekvencionišuću mašinu.

Sve sekvence su analizirane pomoću regulisanja na "V BASE sequence đirectorv" (TOmlinson et al., MRC Centre for

Protein Engineering, Cambriđge, UK) upotrebljavajući

MacVector i Geneworks software programe.

Dalje, svako od antitela 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1, i

6.1.1 su izloženi potpunoj dužini DNK sekvenca. Za ovo sekvencionisanje, ^oliCA)"1" mRNK je izolovana iz približno

4 x IO6 ćelija hibridoma.upotrebljavajući mRNK Direktnu

opremu (Dynal). mRNK je reverzno transkribovana upotreblja-vajući oligo-dT(l8) i korisnu RT/PCR opremu (Advantage RT/PCR kit) (Clonetech. Baza podataka varijabilnih regiona

(V Baza je upotrebljena za odredjivanje amplifikacije prajmera počinjući n<a>ATG start mestu teškog lanca DP50 gena (5"-TATCTAAGCTTCTAGACrCGACCGCCACCATCGAGTTTGGGCTGAGC

TG-3<1>) i do stop kodona IgG2 konstantnog regiona C5

TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-

?')-Optimalna Kozak sekvenca CACOGCCACC) se dodaje 5u ATG start mesto. Isti postupak sa koristi za dizaniranje prajmera za ATG start mesto kappa lanca A27 gena C5 V

TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATCiGAAACCCCAGCGCAG

' ' i stop kodona kappa konstantnog regiona(3 f

TTCTTTG ATCAGAATTCTC ACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3').

(112 cDNK. se. klonira upotrebi java j ući prajmer za ATG startno mesto (5"

TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGC

T-3) i kappa konstantnog regiona stop kodon prajmera gore. Težak lanac cDNKs je takodje kloniran kao genomna konstrukcija pomoću na mesto usmerene mutageneze da bi se dodalo Nhel mesto na kraju varijabilnog J područja i subkloniranjem Nhel-fragmenta koji sadrži genomne IŠG2 CHl/Hinge/CH2CH3 regione. Tačka mutacije da bi se dobilo Nhel mesto. ne menja aminoKiselinsku sekvencu iz linije klica.Parovi prajme-mera su upotrebljeni da amplificiraju cDNKs upotreblja-vajući "Advantage High Fidelity PCR opremu" (Clonetech) . Sekvenca iz PCR se dobija direktnim sekvencionisanjem upotrebljavajući boja-terminator sekvencione opreme i ABI sekvencionu mašinu. PCR proizvod se klonira u pEE glutamin sintetaza ekspresione vektore sisara (Lonza) i tri klona su sekvencionisana da bi se potvrdile somatske mutacije. Za svaki klon proverena je sekvenca na obe niti u najmanje tri reakcije. Aglikozilovano 4.1.1 antitelo se proizvodi pomoću na mesto usmerene mutageneze N29 40 u CH2 područja. Rekombinantna antitela se proizvode pomoću tr<S>nzientne (prolazne) transfekcije Cos7 ćelija u IgG iscrpljenom FCS

i prečišćavanjem upotrebljavajući standardne Protein A sefaroza tehnike. Stabilni transfektanti se dobijaju elektroporacijom mišijih NSO ćelija i selekcijom u medijumubez glutamina. Rekombinant;:... 4.1.1 sa ili bez glikozilacije pokazuje identičnu specifičnost i afinitet za CTLA4 u in vitro ELISA i BIAcore analizama.

Analiza iskorišćavanja gena

Sledeća Tabela izlaže evidenciju iskorišćavanja gena pomoću selektovanih hibridom.'klona antitela u saglasnosti sa pronalakom, ^

Kao što je uočeno, antitela u saglasnosti sa ovim pronalakom proizvode se sa snažnomtendencijom za koriš-tenje DP-50 teškog lanca varijabilnog regiona. DP-50 gen se takodje navodi i kao V"H 3-33 familija gena. Samo jedno antitelo koje je selektovano na bazi CTLA-4 vezivanja i preliminarno in vitro funkcionalnim analizama pokazalo je korišđenje gena teškog lanca drugojačijeg nego DP-50.

Taj klon, 2.1,3 koristi DP-65 teškog lanca varijabilni region i on je IgG4 izotip. DP-65 gen se takodje navodi i kao V"H 4-31 familija gena. S druge strane, klon, 4.9.1

koji poseduje DP-47 teškog lanca varijabilni region vezuje se za CTLA-4, ali ne inhibira vezivanje na B7-1 ili B7-2.

Kod XenoMouse miševa postoji više od 30 posebnih funkcionalnih teških lanaca varijabiInih gena sa kojim proizvode antitela.Tendencija je stoga indikativna za prvenstveni motiv vezivanja antitelo-antigen interakcije s obzirom na kombi-novane osobine vezivanja za antigen i funkcionalnu aktivnost.

Mutacione analize

Kao što je razumljivo, analiza korišđenja gena obezbedjuje samo ograničen pregled strukture antitela. Kako B-đelije XenoMouse životinja stohastično daju -t-ranskriote V-D-J teških ili V-J kapa lakih lanacapostoji jedan broj sekundarnih procesa koji se javljaju, uključujući, bez ograničenja,somatsku hipermutaciju, n-adicije i CDR3 eks-tenzije. Videti, na primer, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i U.S, patentnu Prijavu serijski No. o8/759,620, podnetu 3 decembra, 1996. Prema tome, za dalje ispitivanje-«antitela, strukture predskazanih amino kiselinskih sekvenci antitela su dobijene iz cDNKs đobijene iz klona. Pored toga,N-terminalne amino kiselinske sekvence su dobijene sekvencionisanjem proteina.

Slika 1 obezbedjuje nukleotid i preds^azane amino kiselinske sekvence teških i kappa lakih lanaca klona 4.1.1 CSlika 1A)f4.8.1 (Slika lB)r~4.14.3 (Slika 1C), 6,1.1 (Slika ID) , 3,1.1 (Slika 1E) , 4.10.2 (Slika 1F) 2.1.3 ?; SlikaIG) ' f4.13.1 CSlika IH), 11,2.1 (Slika II), 11.6,1 (Slika U), 11.7.1 (Slika 1K) , 12.3.1.1 (Slika 1L) f i 12,9.1,1 CSlika Im) U Slikama 1A, lBri ID, produžene sekvence antitela 4.1.1, 4.8,1, i 6,1.1 su dobijenje pomoću

potpune dužine kloniranja cDNKs kao što je opisano gore.

U takvim Slikama, signalne peptidne->sekvence (ili baze

koje kodiraju iste) su prikazane masnim slovima a sekvence koje se koriste za 5' PCR reakciju su podvučene.

Slika 2 obezbedjuje poravnjavanje sekvenci izmedju predskazanih teškog lanca amino kiselinskih sekvenci iz klona 4.1,1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10,2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12,3.1.1, i 12.9.1.1 i linije klica DP50 (3-33) amino kiselinske sekvence. Razlike izmedju sekvenca DP50

linije klica i one sekvence iz klona prikazane su masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3

sekvenci antitela kao osenčene.

Slika 3 obezbedjuje poravnjavanje sekvenci izmedju predskazane teškog lanca amino kiselinske sekvence klona 2.1.3 i amino kiselinske sekvence linije klica DP-65 (4-31). Razlike izmedju sekvence DP-65 linije kiča i onih iz sekvence u klonu su prikazane masnim slovima, Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 4 obezbedjuje potavnjavanje sekvenci izmedju predskazanih kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 i 4,13.1 1AA27

amino kiselinske sekvenceA27 linije klica.Razlike izmedin sekvenve A27 linije klica i one sekvence u klonu su šrikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podučene. Očigledna izostavije-

nja u CDRls klona 4.8.1, 4.14.3, i 6.1.1 su označena sa "Os".

Slika 5 obezbedjuje poravnjavanje sekvenci igmSdju . predskazanih kappa lakog lanca amino kiselinske sekvence klona 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, i 11.7.1 i amino kiselinske sekvenca 0-12 linije klica. Razlike izmedju sekvence 012

linije klica i one od sekvenci u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 6 obezbedjuje poravnjavanje sekvenci izmedju predskazanehamino kiselinske sekvence kappa lakog lanc<g>klona 2.1.3 i amino kiselinske sekvence A10/A26 linije klica. Razlike izmedju A10/A26 sekvenca linije klica i one sekvence u klonu su prikazane masnim slovima. Slika takodje prikezuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 7 obezbedjuje poravnjavanje sekvenci izmedju predskazane amino kiselinske sekvence kappa lakog lanca klona 12.3.1 i amino kiselinske sekvence A17 linije klica. Razlike izmedju A17 sekvence linije klica i one sekvence u klonu su prikazane masnim slovima, Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 8 obezbedjuje poravnavanje sekvenci izmedju predskazane amino kiselinske sekvence kappa lakog lanca klona 12.9.1 i amino kiselinske sekvence A3/A19 linije klica. Razlike izmedju A3/A19 sekvence linije klica i one sekvence

i klonu su prikazane masnim slovima,. Slika takodje prikazuje položaje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvenci antitela kao podvučene.

Slika 22 obezbedjuje seriju dodatnih nukleotida i amino kiselinskih sekvenci sledeđi anti-CTLA-4 antitelo:lance: 4.1,1

potpune dužine 4.1,1 težak lanac (cDNK 22(a),

genomni22 (b) fi amino kiselina 22(c));

potpune dužine aglikozilovani 4.1.1 težak

lanac CcDNA 22 Cd) i amino kisleina 22 te))}

4.1.1 laki lanac (cDNK 22(f) i amino kiselina 22 Cg))}

4.8.1

potpune dužine 4.8,1 težak lanac (cDNK 22(h)

i amino kiselina 22 (i);

4.8.1 laki lanac (cDNK 22 (j) i amino kiselina (22 (k)) ;

6.1.1

potpune dužine 6.1.1 težak lanac (.cDNK 22(1) i amino kiselina 22 (m));

6.1.1 laki lanac (cDNK 22 (n) i amino kiselina 2 2 (o) ) ;

11.2.1 : potpune dužine težak lanac (cDNK 22(p) i amino

kiselina 22 (q); i

11.2.1 laki lanac (cDNK 22Cr) i amino kiselina 22 (s) ) .

Sekvence signalnog peptida su prikazane masnim i velikim tekstom. Otvoreni okviri čitanja u potpunoj dužini 4.1.1 genomne DNK sekvence (Slika 22 (b) su podvučeni.<1>mutacijekoje su unete da bi se dobio aglikozilovani 4.1.1 težak lanac i"reaultujuđa promena (N2940) su prikazani u dvostruko podvučenom i masnom tekstu (cDNK (Slika 22(b)

i amino kiselina (Slika 22 (c)) .

PRIMER 4

Analiza teškog i lakog lanca amino kiselinskih supstitucija

Slika 2 obezbedjuje poravnjavanje sekvence izmedju predskazanih teškog lanca amino kiselinskih sekvenci i<z>klona 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4,13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3,1.1 i 12.9.1.1 i germlin DP-50 (3-33 amino kiselinske sekvence, javlja se interesantan šablon. Pored činjenice o tendenciji za težak lanac DP-50 u većini klona, postoji relativno ograničena hipermutacija u antitelima u odnosu.na matične loze DP50 gena. Na primer kloni 3.1.1 i 11.2.1 nemaju mutacije. Osim toga, mutacije u drugim klonima su uglavnom konzervativne promene, koje uključuju supstitucije amino kiselina sa sličnim osobinama za amino kiseline u matičnoj lozi. Mutacije unutar mnogih CDR1 i CDR2 sekvenci su naročito konzervativne po prirodi. Tri od teških lanaca predstavljenih na Slici 2, 4.10.2, 4.13.1, i 4.14.3 su jasno izvedeni iz jednog rekombinantnog dogadjaja (tj. izvedeni iz identičnog centra matične loze i skoro su identični u sekvenci. Ako se ova tri smatraju kao jedna sekvenca, tada, medju 10 različitih antitela koja sadrže DP-50 težak lanac, u CDRL i CDR2 postoje 3 položaja u kojima je nepolarni ostatak zamenjen sa jednim drugim nepolarnim ostatkom, 12 u kome je polarni nenabijeni ostatak zamenjen sa jednim drugim polarnim nenabijenim ostatkom, i 1 u kome je polarni nabijeni ostatak zamenjen jednim drugim polarnim nabijenim ostatkom. Dalje, postoje dva položaja u kojima su dva ostatka koja su veoma slična strukturno, glicin i alanin su supstituisani jedan za drugog. Jedine mutacije koje nisu striktno konzervativne uključuju 3 supstitucije polarnog nabijenog ostatka za polarni nenabijeni ostatak i jednu supstituciju nepolarnog ostatka za polarni ostatak.

Laki lanci ovih antitela su izvedeni iz 5 različitih Vk gena. A27 gen je najteže predstavljen i izvor je 6 različitih lakih lanaca. Uporedjivanje ovih 6 sekvenci otkriva dve karakteristike vredne pažnje. Prvo, u tri od njih, 4.8.1, 4.14.3, i 6.1.1, nalaze se izbacivanja jednog ili dva ostatka u CDR1, redak dogadjaj. Drugo, postoji snažna tendencija protiv serin matične loze na položaju šest u CDR3 u tome što je serin bio zamenjen u svakoj sekvenci. Ovo sugeriše da je serin na ovom položaju inkompatibilan sa CTLA-4 vezivanjem.

Razumljivo je, da mnoge od gore identifikovanih amino kiselinskih supstitucija egzistira u uskoj povezanos-ti za ili unutar CDR. Takve supstitucije izgleda da imaju neki efekat na vezivanje antitela na CTLA-4 molekul. Dalje, takve supstitucije mogu da imaju značajan efekat na afinitet antitela.

PRIMER 5

Analiza N-terminalne amino kiselinske sekvence antitela u

s aglasnosti sa pro nalaskom.

U cilju da se dalje verifikuje sastav i struktura antitela u saglasnosti sa pronalaskom koja su identifiko-vana gore, mi smo sekvencionisali izvesne od antitela upo-trebljavajući Perkin Elmer sekvenator. Oba i teški i kappa laki lanci antitela su izolovani i prečišćeni upotrebom preparativne elektroforeze i elektrobloting tehnika i posle toga direktno sekvencionisani kao što je opisano u Primeru 6. Najveći deo teških i teškikog lanca sekvence su blokirane na njihovom amino terminusu. Zato, takva antitela su prvo tretirana sa piroglutam.at aminopeptidazom i posle toga sekvencionisana.

Rezultati iz ovog eksperimenta su prikazani na

Slici a. Slika 9 takodje obezbedjuje molekulsku težinu teš-kih i lakih lanaca kao što je odredjena pomoću masene spektroeskopije CMALDI),

^RIMEJR 6_

Dodatna karakterizacija antitela u saglasnosti

sa pronalaskom

Slika 10 obezbedjuje izvesno dodatno karakterizo-vanje informacije o izvesnim antitelima u saglasnosti sa pronalaskom.Na Slici su sumirani podaci koji se odnose na klone 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14,3, i 6.1.1. Sleđeđi podaci obezbedjuju: koncentraciju, izoelektrično fokusiranje (IEF), SDS-PAGE, po veličini ekskluzionu hromatograf i ju,' FACS, masenu spektroskopiju (MALDI), i laki lanac N-terminalnihsekvenci.

Uopšte, podaci su đobiieni na sledeđi način:

Materijali i postupci

Koncentracija proteina je odredjena na 280. nm iz

UV skan C200.-350 mm) gde je1.58 jedinica absorpcije na

28 0 nm ođcrovara 1 mg/^ml,

'; SDS-PAGE se izvodi upotrebljavajući Novex NuPAGE sistem za elektroforezu sa 10% NuPAGE gel i MES mifpra.v.: u+-,3^^Uzorci su dobijeni pomođu razblaživanja 3:1 sa 4 x NuPAGE puferom za uzorkovanje (->-/-) beta inerkaptoetanola, zagrejanog>i oko 5 ug proteina se nanosi na gel. Gel se tada boji sa Brilliant Blu R (brilijantnim plavim R) rast-vorom (Sigma k-at.*= B-65 29 i molekulska veličina se proce-njuje uporedjivanjem obojenih traka prema "Perfect Protein Markers" (Novagenkat.£69149-3) ^

Za N-terminalno sekvencionisanje, uzorci se tretiraju kao gore na NuPAGE gelovima, prebacuju na Pro Blot imobilizacionU membranu (Applied Biosystems) i za,tim boje sa Coomassie Plavim R-250 (Komasi plavim R-250). Obojene trake proteina se isecaju i podvrgavaju analizi sekvence pomoću automatizovane"Edgman degradacije na Applied Biosvstems 494 Procise HT Sequencer.(Sekvenatoru).

Izoelektrično fokusiranje (IEF) se izvodi upotreb-ljavajući IEF 3-9 pHast gelova (k'£t = 17-0543-01). Uzorci Se razblažuju u 10% glicerina do oko 0.8 mg/ml i 1 ul se nanosi na gel i zatim se boje sa srebrom.pl odredjivanja su učinjena uporedjivanjem obojenih traka sa širokom oblašću (pH3-lO) IEF standarda (Pharmacia kath17-0471-01)

Po veličini ekskluziona hromatograf i j a (.SEC) se izvodi u fosfatno puferovanom slanom rastvoru (PBS) na Pharmacia SMART sistemu upotrebljavajući Superdex 7 5 PC 3.2/30 kolonu.Procene molekulske veličine su učinjene pomoću uporedjivarija maksimalnog retencionog vremena sa retencionim vremenima iz gela.

Za FACS studije, humane periferne T ćelije su dobijene i stimulisane u toku 48 sati, T ćelije se peru jednom, ponovo suspenduju u FACS puferu na 1 x 10 6 ć-elija/ 100 ul ibo<jeza CD3 površinsku ekspresiju sa 10 ;ul anti-CD3-FITC (Immunote-ch, Marseille, Francuska) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se peru dva puta,

zatim fiksiraju, učine permeabilnim (jFix i Perm, čaltag)

i boje za intraćelijsku CTLA-4 ekspresiju sa 10 ,ul anti-CD152-PE CPharmingeh'<*>Izvodi se protočna citometrija upotrebljavajući Becton Dickinson FACSorttKvadranti su utvrdjeni pomoću analize relevantnih izotfp kontrolnih antitela CCaltag).

Kao što je prodiskutovano gore, pokazano je da anti-CTLA-4 antitela poseduju izvesne snažne imuno modulaci-one aktivnosti. Sledeđi eksperimenti su izvršeni u cilju da se odredi da li antitela u saglasnosti sa ovim pronalaskom poseduju takve aktivnosti. Uglavnom, eksperimenti su tako postavljeni da se analizira sposobnost antitela da inhibiraju interakciju izmedju CTLA-4 i B7 molekula, da budu selektivni kao što je to izmedju CTLA-4 i B7 molekula i

CD28, i da unaprede T ćelijsku' citokin proizvodnju, uklju-čujući, ali ne ograničavajući na IL-2 i/ili IPN- ~ Y ekspresiju. Dalje, ispitivanje unakrsne reaktivnosti antitela prema pronalasku sa izvesriim humanim tkivima i CTLA-4 molekulima u drugim vrstama (na pr.,'miševi i primati) su izvršeni.

PRIMER 7

Konkurentna ELISA: Inhibiranje CTLAr4/B7-l ili B7-2 interakcija pomoću antitela u saglasnosti sa pronalaskom

Jedna in vitro analiza je izvedena da bi se odredilo da li šu antitela u saglasnosti sa ovim pronalaskom sposobna

da inhibiraju vezivanje CTLA-4 sa bilo B7rl iliB7^2.Kao što je razumljivo, antitela prema pronalaku koja su sposobna da inhibiraju vezivanje CTLA-4 sa B7 molekulima može se očekiva-da budu kandidati za imunu regulaciju preko CTLAt-4 puta.

U analizi korišćeni su siedeći materijali i postupci.

Materijali i postupci

3 nM B7-l-Ig(Gl) ili B7.2-lg(Gl) (.Repligen, Inc. Needham, MA) u Dulbecco-ovom PBS je obložen na MajciSorp plQ^^S''od-9.6. udubljenjaCNunk jDenmark, =439454) i inkubirano je na 4°C preko noći. Na dan2fB7-Ig se uklanja i ploče se blokiraju sa 1% BSA plus 0,0 5%Tween-a 20 u D-PBS d^a sata, Plođe^se zatim peru 3X sa puferom za pranje (0.05% Tw9enr-20 u Dr-PBS) , Antitelo pri pogodnim test koncentracijama i CTLA-4lg (G4)

(0.3 nM finalne koncentracije). (Replingen, Inc. Neeđham, MA) se prethodno pomešaju za 15 minuta i zatim se dodaju

u sa B7lg obloženu ploču (60 ul ukupne zapremine) i inkubira na sobnoj temperaturi u toku 1.5 sati. Ploče se peru 3 X i dodaje se 50. ul 1 : 1000 razblaženja HRP obeleženog mišijeg anti-humanog IgG4 antitela (Zymed, San Francisco, CA, =05-3820 ) i inkubira se na sobnoj temperaturi u toku 1 sata. Ploče se peru 3 X i dodaje se 50 ul TMB Microwell substrata peroksidaze (Kirkegaarđ&Perry, Gaithersburg, MD,^50-76-04) i inkubira se na sobnoj temperaturi u toku 20 minuta, i zatim se dodaje 50 ul IN H2S04u ploču. Ploče se očitavaju pri 450 nm upotrebljavajući Molecular Devices čitać ploča (Sunnvvale, CA), Svi uzorci su testirani u duplikatu. Maksimalni signal je definisan kao CTLA-4-Ig vezivanje u odsustvu test antitela. Ne-specifično vezivanje je definisano kao absorbcija u odsustvu CTLA-4r-lg i test antitela.

Rezultati analize dati su u Tabeli IIIA i IIIB.

0 Tabeli IITA rezultati su prikazani za»različita antitela u saglasnosti sa prona]askcm U Tabeli IIIB, rezultati su prikazani uporedjujući 4.1.1 antitelo prema pronalasku sa 11.2.1 antitelom prema pronalasku iz odvojenog eksperimenta .

PRIMER_ 8

Odnosi selektivnosti antitela prema pronalasku s obzirom na CTLA-4 prema bilo CD28 ili B7-2

Jedna druga in vitro analiza je izvedena da bi se odredila selektivnost antitela prema pronalsku s obzirom na CTLA-4 prema bilo CD28 ili B7-2. Sledeđi materijali i postupci su upotrebijeni u vezi sa eksperimentima:

CTLA-4 Selektivnost ELISA: Materijali i postupci

FluroNUNC ploča sa 96 udubljenja (Nurc Kat. No. 475515) je obložena na ploči sa četiri antigena: CTLA-4/lg. CD44/Ig, CD28/lg, i B7.2/ig (antigeni dobi jeni u kuci). Antigeni su obloženi na ploči preko noći na + 4 oC prx

1 ug/ml 100 ul/udubljenje u 0,1 M natrijum bikarbonatnom puferu, pH 9.6. Ploča je zatim oprana sa PBST (PBS + o.l% Tween-20) tri puta upotrebljavajući NUNC perač za ploče. Ploča je blokirana sa PBST + 0,5% BSA pri 150 ul/ udubijenje-Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi u toku 1 sata, a zatim oprana sa PBST tri puta, Z atim su anti-CTLA-4 antitela prema pronalaku razblažena u sredstvu za blokiranje pri 1 ug/ml i dodata u ploču. Ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi u toku 1 sata i oprana sa PBST tri puta. Udubljenja koja sadrže antitela prema pronalaku su tada tretirana sa 100 ul/udubljenje anti-humanim IgG2-HRP (Southern Biotech Kat. No. 9070-05) pri 1:4000 razblaženju u bloku. Takodje, jedan red je tretiran sa anti-humanim IgG (Jackson Kat.No. 209-035-088) da se normalizuje za oblaganje ploča. Ovo antitelo se razblažuje do 1:5000 u bloku i dodaje

na 100 ul/udubljenju. Takodje, se jedan red tretira sa anti-humanim CTLA-4-HRP (Pharmingen Kt. No.' 345815 Custom HRP conjugated) kao pozitivna kontrola. Ovo antitelo se

upotrebljava pri 0.05 ug/ml razblaženo u bloku. Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi u toku 1 sata, zatim se

pere saPEST tri puta. LBA hemiluminiscentni substrat (Pierce) se dodaje pri 100 ul/ugubljene i ploča se

inkubira na mudcalici . ' ploča (plateshaker) u toku 5

minuta. Ploča se zatim očitava upotrebljavajući "lumi-imager" u toku 2 minuta ekspozicije

I'^EN CTLA-4-Ig analiza selektivnog vezivanja:

Materijali i postupci:

M-450 Dinabeads (Dyna granule) (Dynal A.S,Oslo,Norway<3>140.0<2>su oprane 3 X sa Na fosfatnim puferom, pH 7.4 i ponovo suspendovane u Na fosfatnom puferu. 1.0 ug CTLA-4-lg(Gl), 1.0 ug CD28-Ig(Gl) ili 1.0 do 3.0 ug B7-2-Ig(Gl) (Replingen,

Inc. Needham, MA) se dodaju u 100 ul granula i inkubira

se preko noći na rotatoru na 4°C. Na dan 2 granule se peru 3 X u 1% BSA plus 0.05% Tween-20 u Dulbecco-ovom PBS i blokira se u toku 30. minuta. Granule se razblažuju 1l10 sa puferom za blokiranje i 25 ul obloženih granula se dodaje u 12 x 75 mm polipropilenske cevi Svi uzorci su testirani u duplikatu. 50 ul test antitela (1 ug/ml finalne koncentracije) M blokirajući pufer se dodaje u cevi i inkubira se 30 minuta na Origen 1.5 Analyzer carousel (.IGEN International, Ine, Gaithersburg , MD) na sobnoj temperaturi, mešanjem pri 100 opm. _.~7 U cevi se dodaje 25 ul ruteni-lovanog mišijeg anti-humanog IgGl, IgG2 ili lgG4 (Zvmeđ,

Inc. San Francisco, CA 40.5-3300, 05-3500 i 05-3800) (final-na koncentracija od 3 ug/ml u 100 ul ukupne zapremine).

Ceviseinkubira,ju 20 minuta na sobnoj temperaturi sa

mešanjem pri 100 opm, 200 ul Origen pufera za analizu (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD #40 2-050-0-3-) po cevi. se dodaje i kratko meša i zatim se broje u Origen Analyzer i ECL ( elektrohemiluminiscenthe jdinice se -određjuju za svaku cev.. Normalizacioni faktori

se odredjuju da bi se korigovale razlike u vezivanju fuzi-onih proteina za Dvnagranule (Dvnabeađs), i ECL jedinice se koriguju za ne-specifično vezivanje pre izraanavabja odnosa selektivnosti.

Rezultati iz analiza su obezbedjeni u Tabelama IVA i IVB.

PRIMER 9.

Signalni model humanih T-ćelija

U cilju da se dalje definiše aktivnost antitela u saglasnosti sa pronalaskom da deluju kao imuni regulatori, mi smo razvili izvesne T-ćelijske analize u cilju kvantifi-kovanja povećanja<m>'ćelijske IL-2 proizvodnje posle blokade CTIJv-4signala sa antitelom. Sledeći materijali i postupci su korišćeni u vezi sa eksperimentima:

Materijali i po stupci

Sveže izolovane humane T ćelije se dobijaju upotrebom Histopaqe CSigma, St Louis, MO =A-70543) i T-kwik £L (Lympho-Kwik, One Lambda,Canoga Park, CA =LK-50tT), i stimu-lišu sa PHA Cl ug/ml.) CPurified Phytohemagglutinin, Murex Diagnostics Ltd. Dartforđ,England,*HA 16) u medijumu CRPMI 1640 koji sadrži L-glutamin, MEM ne-bitne amino kiseline, penicilin, streptomicin, 25 nM Hepes i i 0% FBSj pri koncentraciji od 1 x IO-<6>ćelija/ml i inkubiraju na 37°C u toku 2 dana. Ćelije se peru i razblažuju u medijumu do 2x10 ćelija/ml. Raji ćelije (Burkitt lvmph-'oma, Human Atcc No.:

CCL 86 Class II AmericanType Culture Collection Rockville,

MD) se tretiraju sa mitomicinom C (Sigma St. Louis, MO,

M-4287) (25 ug/ml) u toku jednog sata na 37°C. Raji ćelije

se peru 4 X u ' PBS i ponovo suspenduju na 2 x 10 6 ć~elija/ml. Humani T ćelijski blastovi (5xl05/ml) , Raji ćelije (.5x10<5>/ml)

i anti-CTLA-4 antitela ili izotipski podesno kontrolno antitelo pri različitim koncentracijama se dodaju u mikrotitar-

ske ploče sa 96 dubljenja i ploče se inkubiraju na 37°C u toku 72 sata. Ukupna zapremina po udubljenju je bila 200 ul. Sedamdeset i dva sata posle stimulacije, ploče se rotiraju

i spiraju i gornji sloj tečnosti (supernatan) se uklanja i zamrzava za kasnije odredjivanje IL-2 (Ouantikine IL-2

ELISA oprema, R&D Svstems,' Minneapolis, MN, =D2050) i IFN-(Ouantikine IFN-g ELISA oprema R&D Systems). Povećanje

citokina je đefinisano kao razlika izmedju citokin nivoa u kulturama koje sadrže anti-CTLA-4-blokirajućih mAb prema izotip-podešenom kontrolnom antitelu. Za protočne citomet-ričke eksperimente, Raji ćelije su oprane 1 X sa FACS pu-

ferom (.PBS koji sadrži 2% toplotom inaktiviranog FCS,

0.025% natrijum azida). Pelete ćelija su ponovo suspendo-

vaneu FACS puferu pri 1 x IO<6>ćelija/100 ul i inkubi-

rane sa 10 ul anti-CD80-PE (Becton Dickinson, San Jose,

CA) ili anti-CD86-PE (Pharmingen, San Diego, Ca) u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi, delije su oprane dva puta i ponovo suspendovane u 1 ml FACS pufera. Protočna citometri-

ja se izvodi upotrebljavajući Becton Dickinson FACSort. Histogram markeri su utvrdjeni analizama relevantnih izo-

tip kontrolnih antitela (Ca-l|ag, Burlingame, CA) ,

U opštem , mi smo razvili analizu koja može da se upotrebi za brzo odredjivanje T-ćelijske IL-2 regulacije, na gore Kao što je razumljivo, stimulacija T-ćelija je B7 i CD28 zavisna. Dalje, oprani T blasti ne daju IL-2 kojif^se Stogu ■ detektovati i Raji delije ne daju IL-2 koji se mogu detektovati čak i kada su stimulisani sa LPS ili PWM. Medjutim,

u kombinaciji, T-blasti kokultivisani sa Raji delijama mogu da modelišu B7 , CTLA-4 i CD28 signalizirajuđe dogadjaje i efekti antitela na to mogu da se procene.

Slika 11 prikazuje ekspresiju B7-1 i B7-2 na Raji ćelije upotrebljavajući anti-CD80-PE i anti-CD86-PE mAbs upotrebljavajući protočnu citometriju (FACs) ("flow cyto-metry) kao što je opisano u Primeru 6.

Slika 12 prikazuje.-od koncentracije zavisno IL-2 povećanje proizvodnje u T ćelijskoj blast/Raji analizi indukovanoj pomo ću CTLA-4 blokirajućih antitela (BNI3 (Pharmingen) i 4.1.1, 4.8.1, i 6.1.1 antitela prema pronalasku).

Slika 13 prikazuje od koncentracije zavisno poveća-nje IFN- ." proizvodnje u T ćelijskoj blast/Raji analizi indukovano pomoću CTLA-4 blokirajućih antitela (BNI3 (PharMingen) i 4.1.1, 4.8.1, i 6.1.1 antitela prema pronalasku)

(iste donor T ćelije).

Slika 14 prikazujesrednje povećanje IL-2 proizvodnje u T ćelijama iz 6 donora indukovano pomoću CTLA-4 blo-kirajućih antitela u T ćelijskoj blast/Raji analizi. Inte-resantno je da se razmotri da se mAbs, CT4.9.1, vezuju na CTLA-4, ali da ne blokiraju B7 vezivanje. Prema tome, jednostavno vezivanje za CTLA-4 nije dovoljno samo po sebi da obezbedi funkcionalno antitelo prema pronalasku.

Slika 15 prikazuje srednje povećanje IFNt\" proiz?-vodnje u T ćelijama iz 6 donora indukovano pomoću CTLA-'4 blo-kirajućih antitela u T ćelijskoj blast/Raji analizi.

Slika 19 prikazuje uporedjivanje izmedju 4.1.1 i 11.2.1 antitela prema pronalasku u koncentraciji od 30 ug/ ml u 72 sata T ćelijskoj blast/Raji analizi kao što je opisano u ovom Primeru 9 i superantigen analizi opisanoj u Primeru 10,

Slika 20 prikazuje od koncentracije zavisno povećanje IL-2 proizvodnje u T ćelijskoj blast/Raji analizi indukovano pomoću 4,1.1 i 11.2.1 CTLA-4 antitela prema pronalasku.

Sledeća Tabela IVC obezbedjuje informaciju koja

se odnosi na srednje povećanje i o<p>se<g>povećanja citokin odgovora u Raji i SEA analizama prema pronalaku. Svaki od eksperimenata uključen u rezultate se bazira na antiteloDri dozi od 30 ua/ml i mereno na 72 sata. Brojni . upotrebljeni donori korišćeni u eksperimentima kao i odgovori su prikazani

PRIMER 10

Signalni model humane T-ćelije

Mi smo razvili drugu ćelijsku analizu u cilju da

se kv>antifikuje povećanje T ćelijske LL-2 reguliše na gore posle blokade CTLA-4 signala sa antitelom. Sledeći materijali i postupci su upotrebljen! u vezi sa eksperimentima:

Materijali i postupci

Humane PBMC ; su dobijene upotrebljavajući Accuspin. Mikrotitar ploče su prethodno obložene sa anti-CD3 antitelom (leu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) i inkubirane i toku 2 sata na 37°C. hPBMC se dodaje u udubljenja pri 200,000 ćelija na udubijenje.Staphviococcus enterotoxin A (SEA) (Sigma) se dodaje u udubljenja pri 100 ng/ml. Antitela se dodaju u udubljenja, obično pri 30 ug/ml. delije se tada stimulišu u toku 48, 72 ili 96 sati. Ploče se centrifugiraju na željenom vremenu i supernatanti se uklanjaju iz udubljenja. Posle toga, supernatanti se provera-vaju za IL-2 proizvodnju upotrebljavajući ELISA (R&D sisteme),

Rezultati iz ovih eksperimenata su prikazani na Slikama 16, 17, i 21, Na Slici 16, indukcija IL-2 proizvodnje\j hPBMC iz 5 donora je merena 72 sata posle stimulacije. ,U Slici 17, prikazani su rezultati iz merenja celokupne krvi,, analizirajući razliku u indukciji IL-2 proizvodnje u krvi iz 3 donora mereno na 72 i 96 sati posle stimulacije.

U Slici 21, povećanje IL-2 proizvodnje u celokupnoj krvi iz 2 donora kao što je izmereno na 72 sata posle stimulacije.

PRIMER 11

Model tumora kod životinje

Mi smo uspostavili model tumora kod živo-tinje za in vivo analize anti-mišijih CTLA^4 antitela u inhibiranju rasta tumora. U modelu, mišiji fibrosarkoma tumor se gaji i životinje se tretiraju sa anti-mišijim-CTLA-4 antitelima. Materijali i postupci za uspostavlja-

nje modela su obezbedjeni niže:

Materijali i postupci

Ženke A/J miševa (6-8 nedelja stare) se injektiraju subkutano na ledjnoj strani vrata sa 0.2 ml SalN delija tumora (1 x 10 ) (Baskar 1995). Anti-mišiji CTLA-4 ili izotip podešeno antitelo (PharMinqen, San Diego, CA, 200 ug/ životinju) se injektiraju intraperitionealno na dane 0, 4, 7, i 14 posle injekcije ćelija tumora. Merenja tumora su preduzeta tokom 3-4 nedelja eksperimenata upotrebljavajući Starrett SPC plus elektronski nierač ■ (Athol, MA) i veliči-na tumora je izražena kao oblast površine prekrivena rastom tumora (mm^).

Slika 18 prikazuje inhibiciju rasta tumora sa anti-mišijim CTLA-4 antitelom u modelu tumora mišijeg fibrosarkoma .Kao što je prikazano na Slici 18, životinje treti-rane sa anti-CTLA-4 imale au smanjenje rasta tumora u poredjenju sa životinjama tretiranim sa izotipom kontrolnog antitela. Prema tome, anti-mišiji CTLA-4mAbs su sposobni da inhibiraju rast fibrosarkoma u modelu tumora kod miševa.

Očekuje se da će antitela koja su unakrsno reaktivna sa mišijim CTLA-4 ispoljiti sličnost u modelu. Medjutim, od antitela prema pronalaku koja su ispitana na unakrsnu reaktivnost, ni jedno nije unakrsno reaktivno sa mišijim CTLA-4.

PRIMER 12

Model tumora kod životinja

<U>cilju da se dalje ispita^aktivnost antitela u saglasnosti sa pronalaskom, ksenograft (xenograft) SCID mišiji model je projektovan da se testira iskorenjivanje uspostavljenih tumora i njihovih izvedenih metastaza, U modelu, SCID miševi su snabdeveni sa kalemljenim (qraft)

(transplantiranim) humanim T ćelijama i implantirani su sa od pacijenta izvedenim ne-malim ćelijama<p>luća ćelijom (NSCL) ili kolorektaln<x* karcinoma ćelijai(CC) . Implantacija se vrši u gonadalne masne šape SCID miševa. Tumori se ostave da rastu, i zatim se uklanjaju. Miševi razvijaju tumor sličan humanom i metastaze jetre. Jedan takav model je opisan u Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282-288 (1996).

Očekuje se da će antitela prema pronalasku inhibira^ ti rast tumora obrazovanih kod takvih miševa.

Claims (19)

1. Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za antigen 4 citotoksičnog T limfocita (CTLA-4), ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa njom i lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa njom, i gde navedeno antitelo ili fragment ima sledeće osobine: a) afinitet vezivanja za CTLA-4 IO"<9>M ili veći; b) inhibira vezivanje CTLA-4 za B7-1 sa IC50od 100 nM ili niže; c) inhibira vezivanje CTLA-4 za B7-2 sa IC50od 100 nM ili niže; b) povećava proizvodnju citokina u humanoj T ćelijskoj analizi za 500 pg/ml ili više.

2. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1, gde aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 antitela 11.2.1 kao što je prikazano na Slici 2.

3. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1 ili 2, gde aminokiselinska sekvenca lakog lanca sadrži aminokiselinske sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 antitela 11.2.1 kao što je prikazano na Slici 5.

4. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela 11.2.1 kao što je prikazano na Slici 2.

5. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 22.

6. Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, gde težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela 11.2.1 kao što je prikazano na Slici 2 i lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela 11.2.1 kao što je prikazano na Slici 5.

7. Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, gde težak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 70 i lak lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 71.

8. Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde težak lanac navedenog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 5 i lak lanac navedenog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 18.

9. Humano monoklonsko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, ili njegov fragment za vezivanje antigena, gde težak lanac navedenog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 10 i lak lanac navedenog antitela sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 23.

10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Ćelijska linija koja proizvodi antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

12. Ćelijska linija prema zahtevu 11 koja je ćelijska linija sisara

13. Ćelijska linija prema zahtevu 12 koja je ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO)ili NSO ćelijska linija.

14. Nukleinska kiselina koja kodira lak i/ili težak lanac antitela ili fragmenta za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

15. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač, za upotrebu u tretiranju kancera.

16. Postupak za pravljenje humanog antitela na CTLA-4 ili fragmenta za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koji obuhvata eksprimiranje navedenog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena u ćelijskoj liniji domaćina i sakupljanje navedenog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena.

17. Postupak prema zahtevu 16, gde je navedena ćelijska linija domaćina ćelijska linija sisara.

18. Postupak prema zahtevu 17, gde je navedena ćelijska linija sisara ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO)ili NSO ćelijska linija.

19. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za upotrebu u tretiranju kancera