KR20170068409A - 항-egfr 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 EGFR 항체 단독으로 또는 다양한 화학치료제와 병용하여 시험관내 및 생체내 종양 저해에 대한 그것의 치료 효과에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 EGFR 항체를 단독으로 또는 화학치료제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이다.

Description

항-EGFR 항체 및 그의 용도{ANTI-EGFR ANTIBODY AND USES OF SAME}
관련 출원에 대한 교차참조
본원은 2014 년 9 월 16 일에 출원된 미국 가출원 62/051,126(이것은 본원에 그 전체가 참고로 편입됨)을 우선권으로 청구한다.
발명의 분야
본 개시내용은 일반적으로 항-EGFR 항체의 치료 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 EGFR-발현 암의 치료를 위한 항-EGFR 항체를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 세포외 리간드-결합 도메인, 막통과 세그먼트 및 세포내 티로신 키나제 도메인으로 이루어진다. 리간드, 예컨대 표피 성장 인자(EGF) 및 전환 성장 인자 α(TGFα)의 결합 시, EGFR은 ErbB 패밀리의 다른 구성원과 동종 또는 이종이량체를 형성하여 세포내 도메인의 자가인산화 및 Ras-유도된 MAP 키나제 경로, PI3-키나제 경로 및 JAK/STAT 경로를 포함하는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 일으킨다. 이것은 암 세포 증식, 세포자멸사 저해, 및 침습 활성화의 신호를 전달하고 종양-유도된 신생혈관형성을 자극할 수 있다. EGFR을 발현하는 인간 암은 종종 수용체 신호전달 및 종양 세포 증식을 저해하는 EGFR-특이적 항체, 예컨대 승인된 항-EGFR mAb, 세툭시맙(Erbitux?)으로 치료된다.
세툭시맙의 직접적인 작용 기전은 리간드-수용체 결합의 차단 및 그에 따른 EGFR 티로신 키나제의 리간드-매개된 활성화의 저해이다. 상기 EGFR 차단의 결과, 종양 세포 또는 종양 미세환경 내의 기질 세포에서 EGFR-신호전달 경로에 의해 조절되는 다양한 공정이 파괴된다(Fan Z 등, 1994; Abanell J 등, 2001; Prewett M 등, 1996; Huang SM 등, 1999; Fan Z 등, 1993a; Fan Z 등, 1993b). 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 및 수용체 내재화를 포함하는 다른 기전도 중요할 역할을 담당할 수 있다(Kawaguchi Y 등, 1996; Kimura H 등, 2007). ADCC는 세포성 FcγR 및 단클론성 항체 간 상호작용에 의존적이며, 이는 천연 살해 세포, 단핵구, 대식구, 활성화된 T-림프구 및 과립구가 관여되는 선천성 면역 반응을 유발한다. 수용체 내재화는 이용가능한 세포 표면 수용체의 수를 하향 조절하고, 이에 따라 EGFR 활성화에 영향을 미칠 수 있다.
과민증 반응은 세툭시맙의 빈번한 부작용으로, 수령체에 대해 치명적인 것으로 입증될 수 있다. 본 개시내용은 그것의 추가 사용을 배제하는 세툭시맙에 대한 민감성을 갖는 개인에 대해 유용한 대안적인 EGFR-표적화된 요법을 제공한다. 특히, 개시내용은 세툭시맙과 동일한 특이성 및 효능을 갖지만 이를 세툭시맙보다 덜 면역반응성이고 더 안정하게 만드는 변형을 갖는 항-EGFR 항체를 제공한다. 상기 항체는 EGFR-발현 암의 치료를 위해 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 유용하다.
요약
일 측면에서, 본 개시내용은 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항체는 N-아세틸뉴라민산(NANA)을 포함하며, 갈락토스-α-1,3-갈락토스가 없다.
일부 구현예에서, 항체는 검출가능한 마커에 접합된다. 일부 구현예에서, 검출가능한 마커는 방사선핵종을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출가능한 마커는 형광성 표지를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 추가 치료제에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 화학치료제를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학치료제는 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택된 화학치료제를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 CHO 세포 게놈과 별도의 복제가능한 벡터 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산은 CHO 세포 게놈 내로 안정하게 통합된다.
일 측면에서, 본 개시내용은 이들을 필요로 하는 대상체에서의 암 치료 방법으로서, 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 하나 이상의 추가 치료제에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 화학치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학치료제는 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 대상체는 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-세툭시맙 IgE를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE를 갖는다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체가 세툭시맙에 대해 과민성인지 또는 세툭시맙에 대해 과민증 반응을 갖기 쉬운지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 결정 단계는 대상체로부터의 혈청 샘플 중 항-세툭시맙 또는 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE의 존재를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-세툭시맙 또는 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE는 대상체가 세툭시맙에 대해 과민성이거나 세툭시맙에 대해 과민증 반응을 갖기 쉽다는 것을 시사한다. 일부 구현예에서, 측정은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)의 이용을 포함한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 항체의 생산 방법으로서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 표 2에 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 CHO 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
도면의 간단한 설명
본원에 포함된 도면은 본원에 개시된 기술의 비제한적인 예시적 구현예를 도시하며, 독서자의 개시내용 이해를 돕기 위해 제공된다.
도 1a-b는 종양 세포주 A549 및 FaDu에서 LR004 및 Erbitux?에 의한 EGFR의 TGF-유도된 인산화의 저해를 나타내는 그래프이다.
도 2는 하인두 암종 FaDu 세포 상의 LR004 및 Erbitux?의 ADCC 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3a-c는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)으로 나타나는, LR004 및 Erbitux?의 결합 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 ELISA로 나타나는, 가용성 EGFR에 대한 LR004 및 Erbitux?의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 5는 종양 세포주에서 세포-표면 EGFR에 대한 LR004 또는 Erbitux?의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 6a-c는 Erbitux?에 의한 EGFR-발현 세포주에서 FITC-표지된 LR004 결합의 저해를 나타내는 그래프이다.
도 7은 MDA-MB-468 암 세포에서 LR004(LR-004)에 의한 FITC-표지된 Erbitux? 결합의 저해를 나타내는 그래프이다.
도 8a-d는 종양 세포주의 시험관내 성장에 대한 LR004 또는 Erbitux?의 효과를 나타내는 그래프이다. 시험된 세포주에는 A) MDA-MB-468 유방 암종 세포, B) 결장암 세포주 LoVo, C) 하인두 암종 세포주 FaDu 및 D) A431 표피모양 암종 세포가 포함되었다. LR004 및 Erbitux?에 의한 시험관내 성장 저해는 CCK-8(a 및 b) 또는 ATPLite(c 및 d) 검정에 의해 결정되었다.
도 9는 BALB/c 누드 마우스에서 GEO 종양 성장에 대한 고-용량 LR004 또는 Erbitux?의 효과를 나타내는 그래프이다. 데이타는 각 그룹에 대한 총 마우스 상 평균을 나타낸다; 막대, SD.(N=5/그룹).
도 10은 생체내 BALB/c 누드 마우스에서 GEO 종양 성장에 대한 LR004 용량-반응 효과를 나타내는 그래프이다. 데이타는 각 그룹에 대한 총 마우스 상 평균을 나타낸다; 막대, SD.(N=8/그룹).
도 11은 사이노몰구스 원숭이에 대한 IV 투여(18 mg/kg) 후 LR004 및 Erbitux?에 대한 농도-시간 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 12는 사이노몰구스 원숭이에서 IV 투여 후 혈청 LR004 농도를 나타내는 그래프이다.
도 13은 1, 21, 28 및 35 일에 18 mg/kg을 이용한 IV 투여 후 사이노몰구스 원숭이에서 LR004의 혈청 농도를 나타내는 그래프이다.
도 14a-b는 RP-HPLC에 의해 결정된 LR004 및 Erbitux? 시알산 변형을 나타내는 그래프이다.
도 15는 ELISA에 의해 결정된 LR004 및 Erbitux? Neu5Gc(N-글라이콜릴뉴라민산(NGNA)) 수준을 나타내는 그래프이다.
도 16a-b는 시차주사열량계(DSC)에 의해 결정된 LR004 및 Erbitux?의 열안정성을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 상세한 설명
I. 개론
본 개시내용은 EGFR-발현 암을 치료하기 위해 유용한 EGFR-특이적 항체를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 기술의 어떤 측면, 방식, 구현예, 변화 및 특징이 실질적인 기술 이해를 제공하기 위해 다양한 상세 수준으로 아래에 기재됨이 인정되어야 한다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 기술에 속하는 당해분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 용어에는 명확히 다르게 지시되지 않으면 복수의 지시대상이 포함된다. 예를 들면, 세포에 대한 언급에는 2 개 이상의 세포 조합 등이 포함된다. 일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 아래 기재된 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 분석 화학 및 핵산 화학 그리고 하이브리화의 실험실 절차는 당해분야에 널리 공지되고 통상적으로 이용되는 것들이다. 핵산 및 펩타이드 합성을 위한 표준 기술이 이용된다. 표준 기술, 또는 이들의 변형이 화학 합성 및 화학 분석을 위해 이용된다. 본원에서 인용된 모든 참조문헌은 각각의 개별 공보, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 그 전체가 다목적으로 참고로 편입된 것과 동일한 정도로 본원에 그것의 전체가 다목적으로 참고로 편입된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 어떤 용어들의 정의는 아래에 제공된다. 다른 용어들의 정의는 [Illustrated Dictionary of Immunology, 2nd Edition(Cruse, J.M. and Lewis, R.E., Eds., Boca Raton, FL: CRC Press, 1995)]에서 확인될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상승작용" 또는 "상승제"는 이들의 개별 효과의 합보다 큰 효과를 생성하는 2 개 또는 그 초과 제제, 독립체, 인자, 또는 물질 간에 일어나는 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 제제, 예컨대 LR004 항체 및 화학치료제 간 상승작용은 약물 상호작용 계수(즉, CDI)를 통해 결정된다(예를 들면, Cao SS 등, Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamole and amphotericin B. Cancer Chemother Pharmacol 1989; 24: 181-186 참고). 일부 구현예에서, CDI는 하기와 같이 계산된다: CDI = AB/A ×B. 각 그룹의 화학발광에 따라, AB는 대조군 그룹에 대한 조합 그룹의 비이고; A 또는 B는 대조군 그룹에 대한 단일 제제 그룹의 비이다. 약물 조합은 CDI 값이 1 미만인 경우 상승작용성이다. 2 개 또는 그 초과 성분 간 상승작용성 상호작용의 결정에서, 일부 구현예에서, 효과를 위한 최적 범위, 및 효과를 위한 각 성분의 절대 용량 범위가 치료를 필요로 하는 환자에게 상이한 w/w 비 범위 및/또는 상이한 용량에 걸친 성분 투여에 의해 측정될 수 있다. 하나의 종에서의 상승작용의 관측은 다른 종에서의 효과를 예측할 수 있고, 그와 같은 연구 결과가 효과적인 용량을 예측하기 위해 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유의미한 상승작용" 또는 "유의미하게 상승작용성"은 이들의 개별 효과의 합보다 통계적으로 유의미하게 더 큰 효과를 생성하는 2 개 또는 그 초과 제제, 독립체, 인자, 또는 물질 간에 일어나는 효과를 나타낸다. 비제한적인 예로써, 약물 조합은 CDI 값이 0.7 미만인 경우 유의미하게 상승작용성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "첨가제"는 이들의 개별 효과의 합과 같은 효과를 생성하는 2 개 또는 그 초과 제제, 독립체, 인자, 또는 물질 간에 일어나는 효과를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "길항작용" 또는 "길항성"은 이들의 개별 효과의 합보다 작은 효과를 생성하는 2 개 또는 그 초과 제제, 독립체, 인자, 또는 물질 간에 일어나는 효과를 나타낸다. 비제한적인 예로써, 약물 조합은 CDI 값이 1 초과인 경우 첨가제이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "EGFR"은 세포외 단백질 리간드의 표피 성장 인자(EGF) 패밀리의 구성원에 대한 세포 표면 수용체를 나타낸다. 수용체는 4 개의 관련된 수용체 티로신 키나제(RTK): EGFR(ErbB-1), HER2/c-neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), 및 Her4(ErbB-4)의 구성원이다. 당해분야에 널리 공지된 바와 같이, EGFR의 돌연변이 활성화는 리간드-독립적 신호전달, 세포 증식 및 성장의 촉진, 및 다양한 암의 발생으로 이어질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 제제 또는 약물의 투여에는 자가-투여 및 타인에 의한 투여가 포함된다. 또한 기재된 바와 같은 의학적 상태의 치료 또는 예방의 다양한 방식이 "실질적인" 것으로 의도됨이 인정되어야 하며, 여기에는 전체 뿐만 아니라 부분 치료 또는 예방이 포함되고, 일부 생물학적으로 또는 의료적으로 관련된 결과가 달성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"에는 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체가 포함된다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 것들뿐만 아니라 이후 변형되는 아미노산들, 예를 들면 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 α-탄소를 갖는 화합물, 예를 들면 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 나타낸다. 그와 같은 유사체는 변형된 R기(예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모사체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다. 아미노산은 이들의 통상적으로 공지된 3 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권고된 1-문자 기호에 의해 본원에서 언급될 수 있다. 뉴클레오타이드도 마찬가지로, 이들의 통상적으로 허용되는 단일-문자 코드로 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 항원, 예를 들면 EGFR에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이들의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 항체의 이용은 단일쇄 전체 항체, 및 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 전체의 항체를 포함하려는 것이다. 용어 "항체"에는 이들이 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체-관련된 폴리펩타이드"는 단일쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편을 의미하며, 이는 가변 영역(들)을 단독으로, 또는 하기 폴리펩타이드 요소의 전부 또는 일부와의 조합으로 포함할 수 있다: 항체 분자의 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한 본 개시내용에는 가변 영역(들) 및 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합이 포함된다. 본 기술의 항체-분자에는, 예를 들면 비제한적으로 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 디설파이드-연결된 Fv(sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이 포함된다. 예에는 하기가 포함된다: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1 가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2 가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward 등, Nature 341: 544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR). 그와 같이 "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이들의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 단일쇄 항체 분자는 수많은 개별 분자, 예를 들면 이량체, 삼량체 또는 다른 폴리머와의 폴리머를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 살아 있는 세포에 의해 유도되거나 접촉된 샘플 물질을 의미한다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생체액뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하려는 것이다. 본 기술의 생물학적 샘플에는, 예를 들면 비제한적으로 전혈, 혈청, 정액, 타액, 누액, 소변, 대변 물질, 땀, 구강, 피부, 뇌척수액, 및 모발이 포함된다. 생물학적 샘플은 내부 기관의 생검으로부터 또는 암으로부터 수득될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR-그래프트된 항체"는 "수신체" 항체의 적어도 하나의 CDR이 바람직한 항원 특이성을 보유하는 "공여체" 항체로부터의 CDR "그래프트"에 의해 대체되는 항체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라성 항체"는 하나의 종으로부터의 단클론성 항체의 Fc 불변 영역(예를 들면, 마우스 Fc 불변 영역)이 재조합 DNA 기법을 이용하여 또 하나의 종의 항체로부터의 Fc 불변 영역(예를 들면, 인간 Fc 불변 영역)으로 대체되는 항체를 의미한다. 일반적으로 [Robinson 등, PCT/US86/02269; Akira 등, 유럽 특허 출원 184,187; Taniguchi, 유럽 특허 출원 171,496; Morrison 등, 유럽 특허 출원 173,494; Neuberger 등, WO　86/01533; Cabilly 등, U.S. 특허 번호 4,816,567; Cabilly 등, 유럽 특허 출원 125,023; Better 등, Science 240: 1041-1043, 1988; Liu 등, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-3443, 1987; Liu 등, J Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun 등, Proc Natl Acad Sci USA 84: 214-218, 1987; Nishimura 등, Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood 등, Nature 314: 446-449, 1885; 및 Shaw 등, J Natl Cancer Inst 80: 1553-1559, 1988]을 참고하라.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비교 윈도우"는 두 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 동일한 인접 위치 수의 참조 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600 개 아미노산 또는 뉴클레오타이드, 보통은 약 50 내지 약 200 개, 더욱 보통은 약 100 내지 약 150 개로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 하나의 인접 위치 수의 세그먼트를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공통 FR"은 공통 면역글로불린 서열에서의 프레임워크(FR) 항체 영역을 의미한다. 항체의 FR 영역은 항원과 접촉하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공통 서열"은 관련된 서열 패밀리에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로 형성된 서열을 나타낸다(예를 들면, Winnaker, From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987 참고). 즉, 단백질 패밀리에서, 공통 서열 내의 각각의 위치는 패밀리에서 그 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산에 의해 점거된다. 2 개의 아미노산이 동등하게 빈번하게 발생하는 경우, 둘 중 어느 것도 공통 서열에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "접촉된"은 세포 또는 조직에 대해 적용되는 경우, 본 기술의 EGFR 항체, 항체 조성물, 세포독성 제제 또는 모이어티, 유전자, 단백질 및/또는 안티센스 서열이 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접 근접하여 배치되는 공정을 나타낸다. 상기 전달은 시험관내 또는 생체내일 수 있고, 재조합 벡터 시스템의 사용이 관여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성 모이어티"는 세포에 근접하거나 이에 의해 흡수되는 경우 세포 성장을 저해하거나 세포사를 촉진하는 모이어티를 의미한다. 이와 관련하여 적합한 세포독성 모이어티에는 방사선활성제 또는 동위원소(방사선핵종), 화학독성 제제, 예컨대 분화 유도제, 저해제 및 소형 화학독성 약물, 독소 단백질 및 이들의 유도체뿐만 아니라 뉴클레오타이드 서열(또는 이들의 안티센스 서열)이 포함된다. 따라서, 세포독성 모이어티는 비-제한적인 예로서, 화학치료제, 광활성화된 독소 또는 방사선활성제일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상 2 개의 도메인 간에 페어 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어를 형성하게 되고 2 개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들면 [EP　404,097; WO　93/11161; 및 30 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448(1993)]에 보다 자세히 기재된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 조성물의 "효과적인 양"은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기 충분한 양, 예를 들면 치료받고 있는 질환, 예를 들면 표적 폴리펩타이드와 관련된 질환에 관련된 증상의 예방 또는 감소를 일으키는 양이다. 대상체에 투여되는 본 기술의 조성물의 양은 질환의 유형 및 중증도 그리고 개체의 특성, 예컨대 일반 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 의존할 것이다. 이는 또한 질환의 정도, 중증도 및 유형에 의존할 것이다. 숙련가는 이들 및 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 기술의 조성물은 또한 서로와의, 또는 하나 이상의 추가의 치료 화합물과의 조합으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "발현"에는 비제한적으로 하기 중 하나 이상이 포함된다: 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 전구체 mRNA의 성숙 mRNA를 생성하기 위한 스플라이싱 및 다른 가공; mRNA 안정성; 성숙한 mRNA의 단백질로의 번역(코돈 사용 및 tRNA 이용가능성 포함); 및 적절한 발현 및 기능을 위해 필요한 경우, 번역 생성물의 당화 및/또는 다른 변형.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 발현을 제어하는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 다른 미번역된 영역을 포함하는 RNA 생성물의 조절된 생합성을 위한 모든 정보를 함유하는 DNA 세그먼트를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전형"은 개체에서 한 쌍의 상동성 염색체 상의 좌위에 하나 이상의 다형성 또는 돌연변이체 부위에서 확인되는 뉴클레오타이드 페어의 비-단계적 5'에서 3'으로의 서열을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전형에는 전체-유전형 및/또는 하위-유전형이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 서열 항체"에는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유도된 가변 및 불변 영역(존재하면)을 갖는 항체가 포함된다. 본 기술의 인간 서열 항체에는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)가 포함될 수 있다. 그와 같은 항체는 비-인간 트랜스제닉 동물에서, 예를 들면 PCT 공개 번호 WO　01/14424 및 WO　00/37504에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 그러나 용어 "인간 서열 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이, 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상으로 그래프팅된 항체(예를 들면, 인간화된 항체)를 포함시키려는 것이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 비-인간(예를 들면, 쥣과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화된 항체는 수신체의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수신체 항체 또는 공여체 항체에서 확인되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 추가로 정련하기 위해 제조된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 그리고 전형적으로 2 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하며, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것들이지만, FR 영역에는 결합 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환이 포함될 수 있다. FR에서 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6 개 이하, 그리고 L 사슬에서 3 개 이하이다. 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것들을 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해서는 [Jones 등, Nature 321:522-525(1986); Reichmann 등, Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)]를 참고하라.
일 구현예에서, 본 개시내용은 본 기술의 EGFR 항체의 아미노산 변형을 고려한다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. EGFR 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산 내로 적절한 뉴클레오타이드 변화의 도입에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 변형에는, 예를 들면 EGFR 결합 부위의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 내로의 삽입 및/또는 그의 치환이 포함된다. 수득된 항체가 원하는 특성, 예를 들면 생물학적 활성을 보유하는 한, 관심 항체를 수득하기 위해 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 제조될 수 있다. 변형에는 또한 단백질의 당화 패턴의 변화가 포함된다. 돌연변이유발을 위해 바람직한 위치의 확인을 위해 유용한 방법은 [Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085(1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이어서 돌연변이된 항체가 원하는 활성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들면 VL에서 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 가량의 잔기, 및 VH에서 31-35B(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 가량의 잔기(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기(예를 들면 VL에서 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 VH에서 26-32(H1), 52A-55(H2) 및 96-101(H3)(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 2 개 또는 그 초과 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 사용될 때, 아래에 기재된 디폴트 파라미터를 이용해서 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여, 또는 수동 정렬 및 시각 검사(예를 들면, NCBI 웹사이트 참고)에 의해 측정되는 동일하거나 명시된 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는(즉, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 명시된 영역(예를 들면, 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열)에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성) 2 개 또는 그 초과 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 이어서 그와 같은 서열은 "실질적으로 동일한" 것으로 불린다. 상기 용어는 또한 시험 서열의 상보쇄를 나타내거나 이에 적용될 수 있다. 용어에는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 것들이 포함된다. 아래에서 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 고려할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 약 25 개 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다; 추가적으로 또는 대안적으로 일부 구현예에서, 50-100 개 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다.
"단리된" 또는 "정제된" 폴리펩타이드 또는 이들의 생물학적-활성 부분에는 폴리펩타이드가 유도되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염 폴리펩타이드가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 예를 들면, 단리된 EGFR 항체는 항체가 유도되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염 폴리펩타이드가 실질적으로 없는 것이다. 그와 같은 오염 폴리펩타이드에는 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 및 비단백질성 용질이 포함될 수 있고, 이는 항체의 생물학적 활성을 방해할 수도 방해하지 않을 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "세포사를 유도하는" 또는 "세포사를 유도할 수 있는"은 생존 세포가 생존 불가능하게 유도하는 제제의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, LR004 항체는 시험관내 또는 생체내 암 세포에서 세포사를 유도한다. 세포사 및 세포 생존력은 당해분야에서 다양한 방법, 예컨대 트립판 블루 배제 검정 및 다른 세포 생존력 검정에 의해 결정될 수 있다. 본 기술에서, 세포사는 "프로그래밍된 세포사"로도 공지된 "세포자멸사"를 나타내며, 이는 카스파제 활성화, 세포 표면에 대한 아넥신 V의 결합, DNA 단편화, 세포 용적의 손실, 세포질 세망의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포(세포자멸체)의 형성에 의해 시사된다. 세포자멸사는 비제한적으로 아넥신 V 염색, DNA 단편화, 또는 카스파제 활성화의 검출을 포함하는 당해분야에서 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "온전한 항체"는 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2 개의 중쇄(H) 폴리펩타이드 및 2 개의 경쇄(L) 폴리펩타이드를 갖는 항체를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존된 영역 사이에 배치되는 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변성 영역으로 추가 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카복실-말단으로 배열되는 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q) 및 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 효과기 세포)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "단클론성 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 실질적으로 동종성 항체 집단으로부터 수득된 항체를 나타낸다, 즉 집단을 이루는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 매우 특이적으로, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 더욱이, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 종래의(다클론성) 항체 제조물과는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종성 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 시사하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 기술에 따라 사용될 단클론성 항체는 [Kohler 등, Nature 256:495(1975)]에 의해 최초 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567 참고)에 의해 제조될 수도 있다. "단클론성 항체"는 또한, 예를 들면 [Clackson 등, Nature 352:624-628(1991) 및 Marks 등, J. Mol . Biol . 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "의학적 상태"에는 비제한적으로 그에 대한 치료 및/또는 예방이 바람직한 하나 이상의 신체적 및/또는 심리적 증상으로 발현되는 임의의 상태 또는 질환이 포함되며, 이전에 및 새로 확인된 질환 및 다른 장애가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절물질"에는 저해제 및 활성제가 포함된다. 저해제는, 예를 들면 표적 분자에 결합하거나, 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 활성화를 감소시키거나, 예방하거나, 지연하거나, 불활성화하거나, 탈감작하거나, 활성을 하향조절하는 제제이다. 활성제는, 예를 들면 표적 분자에 결합하거나, 자극하거나, 증가시키거나, 개방하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 활성화를 강화하거나, 감작하거나, 활성을 상향조절하는 제제이다. 일부 구현예에서, 표적 분자는 EGFR 수용체이다. 조절물질에는 표적 분자에 대한 천연 발생 리간드의 유전적으로 변형된 버전뿐만 아니라 천연 발생 및 합성 리간드, 길항제, 작용제, 소형 화학 분자 등이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 표적 분자의 적어도 하나의(1) 생물학적 기능을 제거하거나 유의미하게 감소시킬 수 있는 항체 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 표적 분자는 EGFR 수용체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용가능한 캐리어"는 약제학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하려는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2 개 또는 그 초과 아미노산을 포함하는 폴리머, 즉 펩타이드 등배체를 의미하려는 것이다. 폴리펩타이드는 통상적으로 펩타이드, 글리코펩타이드 또는 올리고머로 불리는 짧은 사슬, 및 일반적으로 단백질로 불리는 더 긴 사슬을 모두 나타낸다. 폴리펩타이드는 20 개의 유전자-인코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드에는 자연적 공정, 예컨대 번역 후 가공에 의해, 또는 당해분야에 널리 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열이 포함된다. 그와 같은 변형은 기본 교과서 및 보다 상세한 논문뿐만 아니라 수 많은 연구 문헌에 잘 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 EGFR 수용체로부터의 폴리펩타이드 서열을 함유한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은, 예를 들면 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 원상태 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었음을 또는 물질이 이렇게 변형된 세포로부터 유도됨을 시사한다. 따라서, 예를 들면 재조합 세포는 세포의 원상태(비-재조합) 형태 내에서 확인되지 않는 유전자를 발현하거나 다르게는 비정상적으로 발현되거나, 하향 발현되거나, 전혀 발현되지 않는 원상태 유전자를 발현한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "회수 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여되는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 회수 수용체 결합 에피토프를, 예를 들면 U.S. 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 항체(특히 항체 단편) 내로 도입할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일쇄 항체" 또는 "단일쇄 Fv(scFv)"는 Fv 단편, VL 및 VH의 2 개 도메인의 항체 융합 분자를 나타낸다. Fv 단편의 2 개 도메인, VL 및 VH는 별도 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용해서, 이들을 VL 및 VH 영역이 페어를 형성하여 1 가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨, 예를 들면 Bird 등, Science 242: 423-426, 1988; 및 Huston 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 85: 5879-5883, 1988 참고)를 형성하는 단일 단백질쇄로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 그와 같은 단일쇄 항체가 용어 "항체" 단편에 대한 언급에 포함되며, 재조합 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "소분자"는 약 5 kDa 미만, 더 바람직하게는 약 2 kDa 미만의 분자량을 갖는 조성물을 의미한다. 소분자는, 예를 들면 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 펩타이드모사체, 탄수화물, 지질, 지질다당류, 이들, 또는 다른 유기 또는 무기 분자의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 수용체 및 리간드의 "특이적 결합"은 적어도 10-6 M의 결합 친화도를 갖는 수용체 및 리간드 간 접촉을 의미한다. 일부 구현예에서, 리간드는 적어도 약 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체 및 리간드는 EGFR 및 EGFR 항체이다. 일부 구현예에서, EGFR 항체는 LR004 항체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "엄격한 하이브리드화 조건"은 프로브가 전형적으로 핵산의 복합 혼합물에서 그것의 표적 하위서열에 하이브리드화할 것이지만 다른 서열에는 하이브리드화하지 않을 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 하이브리드화할 것이다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 지침은 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)]에서 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5-10℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 대해 하이브리드화하는 온도(정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에)이다(표적 서열은 과량으로 존재하므로, Tm에서 프로브의 50%가 평형에서 점유된다). 엄격한 조건은 또한 탈안정제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화에 있어서, 양성 신호는 배경의 적어도 2 배, 바람직하게는 배경 하이브리드화의 10 배이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이팅, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이팅, 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 중 65℃에서 세정.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간을 나타내지만, 또 다른 포유동물, 예를 들면, 가축(예를 들면, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들면, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들면, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니아 피그 등)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 치환"은 펩타이드 내 하나의 아미노산의 상이한 아미노산으로의 변경을 나타낸다. 당해분야에서 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 펩타이드의 생물학적 활성에 대한 이들의 효과에 따라 "보존적"일 수도 "비-보존적"일 수도 있다. 소위 "보존적 치환"을 아래의 표에서 "바람직한 치환"의 제목 하에 나타낸다.
Figure pct00001
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 세포"는 본 기술의 EGFR 항체에 의해 표적화될 수 있는 대상체(예를 들면, 인간 또는 동물)에서의 임의의 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 효과적인 양으로 존재하는 경우, 이를 필요로 하는 대상체 상에 원하는 치료 효과를 생성하는 화합물을 의미하려는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 치료적 처리를 나타낸다. 대상체는 EGFR을 발현하는 암 세포가 치료량의 EGFR 항체를 수여받은 후, 대상체가 비제한적으로 개체에 존재하는 암 세포의 수 감소; 종양 크기, 중량, 용적 또는 수의 감소, 종양 성장 및/또는 전이의 저해, 차도의 길이 증가, 통증의 감소 또는 완화, 이환율 및 사망률 감소를 포함하는 암의 하나 이상의 징후 및 증상의 관측가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재; 체중 증가 또는 삶의 질의 일반적 향상을 나타내는 경우 암에 대해 성공적으로 "치료된다". 질환 또는 상태의 "예방" 또는 "예방하는"은 예방적 또는 방지적 방안을 나타내며, 여기서 목적은 표적화된 병리적 상태 또는 장애를 예방하거나 지연시키는(줄이는) 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가변"은 가변 도메인의 어떤 세그먼트가 항체 간에 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 나타낸다. V 도메인은 항원 결합을 매개하며, 그것의 특정한 항원에 대한 특정한 항체의 특이성을 정의한다. 그러나 가변성은 가변 도메인의 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분배되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12 개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리는 초가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 개 아미노산의 프레임워크 영역(FRs)으로 불리는 상대적으로 불변 신장부로 구성된다. 원상태 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 크게는 β-시트 입체배치를 채택하고, 3 개의 초가변 영역에 의해 연결되는 4 개의 FR을 포함하며, 이는 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 사슬에서의 초가변 영역은 FR에 의해 가까이 근접하여 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 참고). 불변 도메인은 항체의 항원에 대한 결합에 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체 ADCC의 참여를 나타낸다.
II. LR004 항체 및 항체 콘주게이트
LR004는 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 N-말단부에 특이적으로 결합하는 재조합, 인간/마우스 키메라성 단클론성 항체이다. EGFR은 1형 수용체 티로신 키나제 또는 ErbB1/HER1로도 공지된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 또는 ErbB 패밀리의 구성원이다. 패밀리의 다른 구성원에는 ErbB2(HER2/neu), ErbB3(HER3) 및 ErbB4(HER4)가 포함된다. 종양 세포에서의 EGFR 신호전달은 증식, 생존, 손상 치유, 부착, 이동, 및 신생혈관형성을 포함하는 신생물 성장에 영향을 미치는 다양한 네트워크의 세포 기능 조절에 관여한다. EGFR은 상피 기원의 수많은 인간 암에서 다양한 수준으로 발현된다. 통상적으로 EGFR을 발현하는 상피성 종양에는 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 두경부, 신장, 폐, 췌장, 및 전립선이 포함된다. 과-발현 또는 돌연변이를 통한 EGFR의 조절오류는 항상적 활성 또는 수용체 하향-조절 손상으로 이어지며, 세포의 악성 전환을 유도할 수 있다. EGFR의 종양발생 효과에는 DNA 합성의 개시, 증대된 세포 성장, 침습, 및 전이가 포함된다.
LR004는 다운스트림 효과의 저해, 예컨대 세포내 신호전달의 저해, 세포 주기 진행의 저해, 세포자멸사의 유도, 및 DNA 치유의 저해, 혈관신생, 종양 세포 운동성, 침습, 및 전이로 이어지는 EGFR 리간드 결합의 차단을 포함하는 동일한 작용 기전을 갖는 향상된 버전의 세툭시맙이다. EGFR의 TGF-유도된 인산화, ADCC의 자극 및 시험관내 및 생체내 항종양발생 효과의 LR004 저해를 실증하는 연구를 아래에 나타낸다. LR004는 번역 후 탄수화물 변형에서의 차이로 인해 세툭시맙보다 과민증 반응을 유도할 가능성이 적고, 이들 부작용으로 인해 세툭시맙 치료를 지속할 수 없는 대상체의 치료를 위해 유용하다.
LR004의 아미노산 서열은 Drug Bank(수납 번호: DB00002)에 공개된 세툭시맙 서열로부터 변형되었다. LR004의 서열 및 상업적으로 이용가능한 세툭시맙의 비교는 LC-MS/MS 분석에 의해 수행되었다. LR004의 Fab 서열이 세툭시맙의 서열과 동일한 경우, Fc 서열은 표 2에 진한 글씨체로 나타낸 5 개 아미노산이 상이하다. LR004는 중쇄의 잔기 222 내지 224에서 Pro-Lys-Ser 반복체를 가지는 반면에, 세툭시맙은 반복체를 함유하지 않는다. CH3 아스파르테이트361 및 류신363 잔기가 LR004에 존재한다. 그에 반해서, CH3 글루타메이트361 및 메티오닌363은 세툭시맙에서 확인된다. 이들 차이는 LR004(Glm1, 17) 및 세툭시맙(Glm3)의 상이한 IgG1 Fc 동종이형을 나타낸다. 두 동종이형은 모두 승인된 단클론성 항체 간에 공통된다. 경쇄의 아미노산 서열 및 중쇄의 가변 영역은 세툭시맙에서와 동일하다.
LR004의 경쇄 및 중쇄의 이론적 분자량은 각각 23718 Da(알킬화된 LC) 및 53037 Da(알킬화된 HC, G0F/G0F)이다. 기능적 LR004는 4 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 비환원 SDS-PAGE에 의한 겉보기 분자량은 ≒200 KDa이다. LR004의 특성은 pI 마커 밴드 7.0 및 8.6 사이에서 IEF에 의해 검출가능한 다수의 밴드로, LR004의 상이한 전하의 이소형을 나타낸다.
LR004 항체는 그것의 생산 측면으로 인해 세툭시맙에 비해 탄수화물 구조에서 2 개의 차이를 포함한다. 세툭시맙은 SP2/0 세포에서 발현되지만, LR004는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된다. 그 결과, LR004의 시알산은 세툭시맙 상의 N-글라이콜릴뉴라민산(NGNA)과 배치되는 N-아세틸뉴라민산(NANA)이다. NANA는 NGNA보다 더 인간-유사한 것으로 간주된다. 또한, 세툭시맙은 강력한 올리고당 면역원인 높은-수준의 갈락토스-α-1,3-갈락토스(Galα1,3Gal)를 함유하지만, LR004는 검출가능한 양의 이러한 탄수화물 구조를 함유하지 않는다. CHO 세포에서의 발현은 세툭시맙에서보다 면역반응성이 현저히 더 적은 글리칸 프로파일을 LR004에 제공한다. 이러한 2 개 변형을 가지며, LR004는 세툭시맙보다 더 안전한 생성물이지만 동일한 작용 기전 및 효능을 갖는다. 이하에서 보여진 바와 같이, LR004는 또한 반복-투여량 치료 레지멘에서 세툭시맙에 비해 더 긴 혈청 반감기 및 증가된 열안정성을 실증한다.
LR004의 아미노산 서열이 표 2에 주어진다. 경쇄는 214 개 아미노산을 함유하며 중쇄는 452 개 아미노산을 함유한다. 경쇄의 서열은 세툭시맙에서와 동일하다. 표 2에서, 디설파이드 결합의 위치는 연결된 직선으로 나타내며, 중쇄 상의 2 개의 점유된 N-글리칸 부위는 밑줄쳐서 나타내며, 하나는 시알산, N-아세틸뉴라민산(NANA)을 포함하는 범위의 당을 갖는 Asn88에서의 가변(Fv) 영역의 프레임워크 3 내에 있고, 다른 것은 Asn302에서 CH2 도메인 내에 있다. 중쇄 상에는 하나의 N-말단 파이로글루타메이트가 존재한다. LR004 항체의 이화학적 및 생물학적 특징이 표 3에 요약된다.
본원에 포함된 실시예에 기재된 바와 같이, LR004는 인간 EGFR에 특이적으로 결합하며, EGFR-발현 종양 세포의 성장 및 신호전달을 저해한다. 시험관내 연구는 하인두 암종(FaDu) 세포에서 EGFR 인산화 및 ADCC에 대한 LR004의 효과를 실증한다. 기재된 약력학적 평가에는 ELISA 및 SPR-기반 결합 친화도 연구, ELISA 결합 특이성 연구뿐만 아니라 시험관내 온전한 종양 세포에 대한 LR004 결합의 유세포-측정 평가가 포함된다. 항종양 활성은 또한 인간 암 세포주에서 시험관내 그리고 인간 결장암 GEO 세포-유도된 종양을 이용한 마우스 이종이식편 연구에서 생체내 나타난다. 추가적인 생체내 효능 연구는 세툭시맙 대비 LR004의 효능을 추가로 실증할 것이다.
LR004는 단독으로, 또는 하나 이상의 추가 치료제와의 조합으로 투여되어, EGFR-발현 암의 치료를 위해 유용하다. 특히, LR004는 세툭시맙을 이용한 지속 요법을 배제하는 세툭시맙에 대한 과민증을 갖는 환자의 치료를 위해 유용하다.
Figure pct00002
표 3: LR004의 이화학적 및 생물학적 특징
Figure pct00003
일 측면에서, 본 개시내용은 EGFR-발현 암의 치료를 위한 항체, 및 그를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 항체는 LR004이다. 일부 구현예에서, 항체는 추가 제제에 접합된 LR004이다. 일부 구현예에서, 추가 제제는 검출가능한 마커 또는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출가능한 마커에는 비제한적으로 형광성 마커 또는 방사성 마커가 포함된다. 일부 구현예에서, 치료제는 화학치료제, 예컨대 암 치료제를 포함한다.
일반적으로, 치료 모이어티는 약동학적 안정성에 대한 필요성을 적절히 고려하여 임의의 적합한 기술에 의해 LR004 항체에 접합되고 대상체에 대한 전반적인 독성을 감소시킬 수 있다. 치료제, 세포독성제, 또는 표지화제/영상화제(즉, "모이어티")는 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들면, 링커기를 통해) 항체에 커플링될 수 있다. 모이어티 및 LR004 항체 간 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 작용기를 보유하는 경우 가능하다. 예를 들면, 친핵기, 예컨대 아미노기 또는 설프하이드릴기는 카보닐-함유기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드와, 또는 우수한 이탈기(예를 들면, 할라이드)를 함유하는 알킬기와 반응할 수 있다. 대안적으로, 적합한 화학적 링커기가 사용될 수 있다. 링커기는 결합 능력으로의 방해를 배제하기 위해 모이어티로부터 LR004 항체와 거리를 만드는 스페이서로서 기능할 수 있다. 링커기는 또한 모이어티 상의 치환체 또는 LR004 항체의 화학적 반응성을 증가시키고, 이에 따라 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 화학적 반응성의 증가는 또한 모이어티, 또는 모이어티 상의 작용기의 사용을 촉진할 수 있고, 이는 다르게는 가능하지 않을 것이다.
적합한 연결부 화학에는 말레이미딜 링커 및 알킬 할라이드 링커(항체 모이어티 상의 설프하이드릴과 반응함) 및 석신이미딜 링커(항체 모이어티 상의 일차 아민과 반응함)가 포함된다. 몇몇 일차 아민 및 설프하이드릴기가 면역글로불린 상에 존재하며, 추가 기가 재조합 면역글로불린 분자 내로 설계될 수 있다. 동종- 및 이종-작용성 모두의 다양한 이작용성 또는 다작용성 시약(예컨대 Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.의 카탈로그에 기재된 것들)이 링커기로서 사용될 수 있음이 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 커플링은, 예를 들면 아미노기, 카복실기, 설프하이드릴기 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 영향받을 수 있다(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,671,958 참고).
대안적인 커플링 방법으로서, 모이어티는 U.S. 특허 번호 5,057,313 및 5,156,840에 기재된 바와 같이 당화 부위에서 산화된 탄수화물기를 통해 LR004 항체에 커플링될 수 있다. 모이어티에 대한 LR004 항체의 또 하나의 대안적인 커플링 방법은 비-공유 결합 페어, 예컨대 스트렙타비딘/바이오틴, 또는 아비딘/바이오틴의 사용에 의한 것이다. 이들 구현예에서, 페어의 하나의 구성원은 LR004 항체에 공유 결합되고 결합 페어의 다른 구성원은 모이어티에 공유 결합된다.
세포독성 또는 치료 모이어티가 본 기술의 면역접합체의 LR004 항체부가 없는 경우에 더 강력한 경우, 세포 내로의 내재화 동안 또는 내재화 시에 절단가능하거나, 또는 세포외 환경에서 경시적으로 서서히 절단가능한 링커기를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 수많은 상이한 절단가능한 링커기가 기재되었다. 이들 링커기로부터 세포독성 모이어티의 세포내 방출의 예에는, 예를 들면 비제한적으로, 디설파이드 결합의 환원(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,489,710), 광불안정한 결합의 조사(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,625,014), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,638,045), 혈청 보체-매개된 가수분해(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,671,958), 및 산-촉매된 가수분해(예를 들면, U.S. 특허 번호 4,569,789)에 의한 절단이 포함된다.
일 구현예에서, LR004 항체는 1 초과의 치료적, 세포독성 및/또는 영상화 모이어티에 커플링된다. LR004 항체의 다중-유도체화에 의해, 몇몇 세포독성 전략이 동시에 시행될 수 있고, LR004 항체는 몇몇 가시화 기술에 대한 조영제로서 유용하게 제조될 수도 있고, 또는 치료 항체가 가시화 기술에 의한 추적을 위해 표지될 수도 있다. 일 구현예에서, 세포독성 모이어티의 다중 분자가 하나의 LR004 항체에 커플링된다. 일 구현예에서, LR004 항체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 2 개의 모이어티의 혼합물에 커플링된다: 세포독성 모이어티; 치료 모이어티; 및 표지화/영상화 모이어티. 즉, 1 초과 유형의 모이어티가 하나의 LR004 항체에 커플링될 수 있다. 예를 들면, 치료 모이어티, 예컨대 폴리뉴클레오타이드 또는 안티센스 서열은 화학독성 또는 방사선독성 모이어티와 함께 LR004 항체에 접합되어 화학- 또는 방사선독성 요법의 유효성을 증가시킬뿐만 아니라 원하는 치료 효과를 수득하기 위해 필요한 필요 투여량을 저하시킬 수 있다. 특정한 구현예와 무관하게, 1 초과의 모이어티를 갖는 면역접합체는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 1 초과의 모이어티가 LR004 항체에 직접적으로 커플링될 수도 있고, 또는 부착을 위한 다중 부위를 제공하는 링커(예를 들면, 덴드리머)가 사용될 수도 있다. 대안적으로, 1 초과의 세포독성 모이어티를 보유하는 능력을 갖는 캐리어가 사용될 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, LR004 항체는 직접적으로 또는 링커기를 통한 공유 결합 및 비-공유 회합을 포함하는 다양한 방식으로 모이어티(들)를 보유할 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 캡슐화 캐리어와 조합된다. 이것은 치료 조성물이 표적 세포 부근에서 이를 농축하면서 LR004 항체의 화학독성 모이어티를 경시적으로 서서히 방출하도록 할 수 있으므로, 세포독성 치료 구현예에서 특히 유용하다.
일 구현예에서, LR004 항체는 방사선핵종인 세포독성 모이어티와 커플링된다. 세포독성 모이어티로서 사용하기 위해 바람직한 방사선핵종은 약리적 투여를 위해 적합한 방사선핵종이다. 그와 같은 방사선핵종에는 123I, 125I, 131I, 90Y, 211At, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Pb, 및 212Bi가 포함된다. 요오드 및 아스타틴 동위원소는 다수의 문헌이 이들의 사용에 관해 축적되어 있으므로, 본 기술의 치료 조성물에 사용하기 위해 더 바람직한 방사선핵종이다. 수 밀리미터의 유효 범위를 갖는 다른 β-방사선 방출 핵종과 마찬가지로 131I가 특히 바람직하다. 123I, 125I, 131I, 또는 211At는 요오드 발생제, N-석신이미딜 3-[211At]아스테이토벤조에이트, N-석신이미딜 3-[131I]요오도벤조에이트(SIB), 및 N-석신이미딜 5-[131I]요오도b-3-피리딘카복실레이트(SIPC)를 포함하는 임의의 몇몇 공지된 접합 시약을 이용하는 조성물 및 방법에서 사용하기 위해 LR004 항체에 접합될 수 있다. 임의의 요오드 동위원소가 인용된 요오도-시약에서 사용될 수 있다. 다른 방사선핵종은 핵 의약 분야의 숙련가에 공지된 적합한 킬레이트화 제제에 의해 LR004 항체에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, LR004 항체는 화학독성 모이어티와 커플링된다. 화학독성 제제에는 비제한적으로 소분자 약물, 예컨대 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 유사체가 포함된다. 화학독소 분화 유도제에는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 화학독성 모이어티는 LR004 항체에 직접적으로 접합될 수 있다. 일 구현예에서, LR004 항체는 화학적 링커를 통해 세포독성 모이어티에 커플링된다. 또 하나의 구현예에서, 모이어티는 캐리어에 캡슐화되며, 이는 다시 LR004 항체에 커플링된다.
일 구현예에서, LR004 항체는 단백질 독소 모이어티와 커플링된다. 세포독성 모이어티로서 사용하기 위해 바람직한 독소 단백질에는, 예를 들면 비제한적으로 액티노마이세테스 또는 스트렙토마이세스 항생제, 듀오카르마이신, 탁솔, 사이코칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디드네, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 그리고 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 세포독성 모이어티로서 사용하기 위해 바람직한 독소 단백질에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라 독소, 미국자리공 항바이러스 단백질, 및 의약 생화학 분야에 공지된 다른 독소 단백질이 추가로 포함된다. 이들 독소 제제는 대상체에서 바람직하지 않은 면역 반응을, 특히 혈관내로 주사된 경우 유발할 수 있으므로, 이들이 LR004 항체에 대한 커플링을 위해 캐리어에 캡슐화되는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, LR004 항체는 효소 활성 독소와 커플링된다. 효소 활성 독소는 박테리아 또는 식물 기원이거나, 또는 그와 같은 독소의 효소 활성 단편("A 쇄")일 수 있다. 본 기술에서 유용한 효소 활성 독소 및 이들의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사 유래), 리신 A 쇄, 애브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신이다. LR004 항체와 세포독성 모이어티의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제를 사용해서 제조된다. 그와 같은 시약의 예는 SPDP, IT, 이미도에스테르의 이작용성 유도체, 예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl, 활성 에스테르, 예컨대 디석신이미딜 수베레이트, 알데하이드, 예컨대 글루타르알데하이드, 비스-아지도 화합물, 예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민, 비스-디아조늄 유도체, 예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민, 디이소시아네이트, 예컨대 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트, 및 비스-활성 불소 화합물, 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠이다. 독소의 용해 부분은 LR004 항체의 Fab 단편에 연결될 수 있다.
일 구현예에서, LR004 항체는 치료 모이어티와 커플링된다. 치료 모이어티에는, 예를 들면 비제한적으로 항-대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파마이드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들면, 다우노루비신(예전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(예전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴, 블레오마이신 설페이트, 카르무스틴, 클로르암부실, 사이클로포스파마이드 하이드록시우레아 또는 리신 A, 및 항-유사분열 제제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함된다.
그와 같은 치료 모이어티의 LR004 항체에 대한 접합 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 [Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등(eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 등, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson 등(eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등(eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등(eds.), pp. 303-16(Academic Press 1985), 및 Thorpe 등, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev ., 62: 119-58(1982)]을 참고하라.
일 구현예에서, LR004 항체는 표지 모이어티, 즉 검출가능한 기와 커플링된다. LR004 항체에 접합된 특정한 표지 또는 검출가능한 기는 이것이 항체의 특이적 결합을 유의미하게 방해하지 않는 한, 본 기술의 결정적 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 그와 같은 검출가능한 표지는 면역검정 및 영상화 분야에서 잘 개발되어 있고, 일반적으로 그와 같은 방법에서 유용한 대부분의 임의의 표지가 본 기술에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 유용한 표지에는 자성 비드(예를 들면, Dynabeads™), 형광 염료(예를 들면, 플루오레신 이소티오시아네이트, 텍사스 레드, 로다민 등), 방사선표지(예를 들면, 3H,14C, 35S, 125I, 121I, 112In, 99mTc), 다른 영상화 제제, 예컨대 마이크로버블(초음파 영상화용), 18F, 11C, 15O(양전자 방출 단층촬영용), 99mTC, 111In(단일 광자 방출 단층촬영용), 효소(예를 들면, 홀스 래디쉬 페록시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 통상적으로 사용되는 다른 것들), 및 열량측정 표지, 예컨대 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱(예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드가 포함된다. 그와 같은 표지의 사용이 기재된 특허에는 U.S. 특허 번호 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241이 포함되며, 각각은 그 전체가 본원에 참고로 다목적으로 편입된다. 또한 하기를 참고하라: [Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)].
표지는 당해분야에서 잘 알려진 방법에 따라 검정의 원하는 성분으로 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기에서 명시된 바와 같이, 다양한 표지가 사용될 수 있고, 표지 선택은 필요한 민감성, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 요건, 이용가능한 기기장치, 및 폐기 조항에 의존한다.
비-방사성 표지는 종종 간접적 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예를 들면, 바이오틴)는 분자에 공유 결합된다. 이어서 리간드는 본질적으로 검출가능하거나 신호 시스템, 예컨대 검출가능한 효소, 형광성 화합물, 또는 화학발광 화합물에 공유 결합된 항-리간드(예를 들면, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 여러 리간드 및 항-리간드가 사용될 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드, 예를 들면 바이오틴, 티록신, 및 코르티졸을 갖는 경우, 이는 표지된, 천연 발생 항-리간드와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물이 LR004 항체와의 조합으로 사용될 수 있다.
분자는 또한 신호 생성 화합물에 직접적으로, 예를 들면 효소 또는 형광단과의 접합에 의해 접합될 수 있다. 표지로서의 관심 효소는 주로 가수분해효소, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다아제, 또는 산화환원효소, 특히 페록시다제일 것이다. 표지화 모이어티로서 유용한 형광성 화합물에는 비제한적으로, 예를 들면 플루오레신 및 이들의 유도체, 로다민 및 이들의 유도체, 단실, 엄벨리페론 등이 포함된다. 표지화 모이어티로서 유용한 화학발광 화합물에는 비제한적으로, 예를 들면 루시페린, 및 2,3-디하이드로프탈라진디온, 예를 들면 루미놀이 포함된다. 사용될 수 있는 다양한 표지화 또는 신호-생성 시스템의 검토를 위해서는 U.S. 특허 번호 4,391,904를 참고하라.
표지 검출 수단은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들면 표지가 방사성 표지인 경우, 검출 수단에는 섬광 계수기 또는 방사선사진촬영에서의 사진촬영 필름이 포함된다. 표지가 형광성 표지인 경우, 이는 적절한 파장의 빛으로 형광단을 여기시키고 수득한 형광을 검출함으로써 검출될 수 있다. 형광은 사진촬영 필름에 의해, 전자 검출기, 예컨대 전하 커플링된 디바이스(CCDs) 또는 광증폭기 등의 이용에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소적 표지는 효소에 대해 적절한 기질을 제공하고 수득한 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 마지막으로 단순한 비색 표지가 표지와 관련된 색상을 관측함으로써 단순히 검출될 수 있다. 따라서, 다양한 막대 검정에서, 접합된 금이 종종 분홍색으로 나타나는 반면, 다양한 접합된 비드가 비드 색상으로 나타난다.
III. LR004의 제조
LR004는 인간 EGFR의 N-말단부에 특이적으로 결합하는 재조합, 인간/마우스 키메라성 단클론성 항체이다. LR004 중쇄 및 경쇄의 서열이 표 2에 주어진다. 상기에서 논의된 바와 같이, 서열은 5 개의 아미노산 변화를 도입하여 Drug Bank(수납 번호: DB00002)에서 공개된 세툭시맙 서열에서 변형되었다.
LR004 항체는 당해분야에서 공지된 방법을 이용해서 CHO 세포에서 생산될 수 있다. 이들 세포에서의 항체 생산은 SP2/0 세포에서 생산되는 세툭시맙에 비해 탄수화물 구조에 2 개의 차이를 일으킨다. 특히, LR004의 시알산은 세툭시맙 상의 N-글라이콜릴뉴라민산(NGNA)과 배치되는 N-아세틸뉴라민산(NANA)이다. NANA는 NGNA에 비해 더 인간-유사한 것으로 간주된다. 또한, 세툭시맙은 강력한 올리고당 면역원인 높은-수준의 갈락토스-α-1,3-갈락토스를 함유하지만, LR004는 검출가능한 양의 이러한 탄수화물 구조를 함유하지 않는다. LR004의 글리칸 프로파일은 세툭시맙보다 면역반응성이 훨씬 더 적어서 이를 인간 대상체에 대한 투여를 위해 더 안전하게 만든다. 또한 이들 서열 및 번역 후 차이로 인해, LR004는 또한 반복-투여량 처리 레지멘에서 세툭시맙에 비해 더 긴 혈청 반감기 및 증가된 열안정성을 실증한다.
재조합 LR004 항체는 당해분야에서 공지된 방법을 이용해서 CHO 세포에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 CHO 세포 내로 도입된 포유동물 발현 벡터를 사용해서 발현된다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 CHO 세포 게놈 내로 안정하게 통합된 재조합 서열로부터 발현된다.
LR004 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물에는 전형적으로 항체의 코딩 서열에 작동가능하게-연결된 발현 조절 서열이 포함될 것이다. 이와 같이, 본 기술의 또 하나의 측면에는 LR004 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 벡터가 포함된다. 다양한 벡터 집단의 생산 방법은 [Lerner 등, U.S. 특허 번호 6,291,160; 6,680,192]에 기재되었다.
본 기술의 LR004 항체를 인코딩하는 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용해서 CHO 세포에서 발현될 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예에는 비제한적으로 pCDM8(Seed,. Nature 329: 840, 1987) 및 pMT2PC(Kaufman 등, EMBO J. 6: 187-195, 1987)가 포함된다. 예를 들면, 통상적으로 사용된 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 및 시미안 바이러스 40으로부터 유도된다. LR004 항체의 발현을 위해 유용한 진핵 세포에 대해 적합한 발현 시스템에 대해서는, 예를 들면 [Chapters 16 and 17 of Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]를 참고하라.
또 하나의 측면에서, 본 개시내용은 LR004 코딩 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터가 도입된 CHO 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, LR004 코딩 서열은 CHO 세포의 게놈과 별도의 복제가능한 벡터 상에 존재한다. 일부 구현예에서, LR004 코딩 서열은 CHO 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다.
일단 발현되면, LR004 항체는 당해분야에서 공지된 방법을 이용해서 단리되고 정제될 수 있다. 항체의 생물학적 활성은 당해분야에서 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 결정될 수 있다. 예를 들면, 항체의 생물학적 활성은 항체의 EGFR에 대한 결합 특이성, 항체가 시험관내 또는 생체내 EGFR 인산화를 저해하는 능력을 평가하고, 시험관내 종양 세포 증식 상 또는 동물 모델 내에서 항체의 효과를 평가하여 시험관내 결정될 수 있다.
IV. 치료 방법
일 측면에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에 대해 LR004 항체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는 EGFR-발현 암의 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 치료제는 단백질 또는 펩타이드, 예컨대 효소 활성 독소, 또는 이들의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-알파; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식구 집락 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 집락 자극 인자("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료제는 비제한적으로 빈카 알카로이드, 미세소관 형성을 파괴하는 제제(예컨대 콜히친 및 이들의 유도체), 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제(예컨대 티로신 키나제 저해제), 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질(예컨대 뉴클레오사이드 유사체), 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드(예컨대 모든-트랜스 레티노산 또는 이들의 유도체); 젤다나마이신 또는 이들의 유도체(예컨대 17-AAG), 및 당해분야에서 널리 인식되는 다른 표준 화학치료제를 포함하는 화학치료제를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학치료제에는 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체(예를 들면, 탁솔, 파클리탁셀 및 이들의 유도체, 탁소테르 및 이들의 유도체 등), 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 에를로티닙, Erbitux?, 이들의 유도체, 당해분야에 공지된 화학치료제 등 중 하나 이상이 포함된다. 일부 구현예에서, 화학치료제는 티오콜히친 유도체 및 캐리어 단백질(예컨대 알부민)을 포함하는 나노입자를 포함하는 조성물이다.
일부 구현예에서, 화학치료제는 비제한적으로 카보플라틴, Navelbine?(비노렐빈), 안트라사이클린(Doxil?), 라파티닙(GW57016), Herceptin?, 젬시타빈(Gemzar?), 카페시타빈(Xeloda?), Alimta?, 시스플라틴, 5-플루오로우라실(5-Fu), 에피루비신, 사이클로포스파마이드, Avastin?, Velcade? 등을 포함하는 항신생물 제제이다.
본원에서 화학치료제에 대한 언급은 화학치료제 또는 이들의 유도체에 적용되며, 이에 따라 본 기술에는 이들 구현예 중 어느 하나(제제; 제제 또는 유도체(들))가 포함된다. 화학치료제 또는 다른 화학적 모이어티의 "유도체" 또는 "유사체"에는 비제한적으로 화학치료제 또는 모이어티와 구조적으로 유사하거나 화학치료제 또는 모이어티와 동일한 일반 화학 클래스에 속하는 화합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 화학치료제 또는 모이어티의 유도체 또는 유사체는 화학치료제 또는 모이어티의 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성(예를 들면, 작용성 포함)을 보유한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 대상체가 세툭시맙에 대해 과민성이거나 세툭시맙에 대해 과민증 반응을 갖기 쉬운지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 항-세툭시맙 IgE가 대상체의 혈청 중에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스(Galα1,3Gal) IgE가 대상체의 혈청 중에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE는 ELISA에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE는 방사성알레르고흡착 시험을 이용해서 측정된다. 일부 구현예에서, 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE는 ImmunoCAP?을 이용해서 측정된다.
ELISA에 의한 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE의 검출은 당해분야에 공지된 프로토콜, 예컨대 [Plum 등, J. Biol . Chem. 286(50):43103-43111(2011); Mariotte 등, mAbs 3(4):396-401(2011); 및 Chung 등, N. Engl . J. Med. 358(11):1109-1117(2008)]에 개시된 것들을 이용해서 수행될 수 있다. 예를 들면, Galα1,3Gal 또는 세툭시맙 자체는 IgE 결합을 위한 고정된 결정인자를 제공하기 위해 코팅 시약으로 사용될 수 있다. 고정된 결정인자에 결합된 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE는 IgE-특이적 2 차 항체 및 표지를 현상하고/하거나 정량하기 위해 적절한 수단을 이용해서 검출될 수 있다.
환자 샘플은 적절한 혈청 및/또는 생화학적 시약을 사용해서 제조된 양성 및 음성 대조군과 비교될 수 있다. 예를 들면, 음성 대조군은 세툭시맙 과민증이 없는 것으로 공지된 대상체로부터의 혈청을 사용해서 제조될 수 있고, 양성 대조군은 세툭시맙 과민증을 갖는 것으로 공지된 대상체로부터의 혈청을 사용해서 제조된다. 세툭시맙 과민증의 정의 및 등급평가는 국립 암 협회 공통 독성 기준, 버전 3.11,16에 열거된 증상에 기반할 수 있고, 이는 등급 1의 반응 특성을 38℃(100.4°F) 미만의 열을 갖는 일시적 홍조 또는 발진으로; 등급 2의 반응 특성을 38℃ 초과 열을 갖거나 갖지 않는 발진 또는 홍조, 두드러기 및 호흡곤란으로; 등급 3의 특성을 발진, 호흡곤란, 및 저혈압으로; 그리고 등급 4의 특성을 아나필락시스로 제공한다.
당해분야에서 공지된 바와 같이, 혈청 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE를 갖는 대상체는 IgE를 갖지 않는 대상체보다 세툭시맙에 대한 중증 과민증의 더 높은 발생률을 갖는다. 따라서, 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE의 대상체 수준은 대상체가 세툭시맙에 대해 중증 과민증을 가졌는지 또는 가지기 쉬운지 여부 그리고 대상체가 세툭시맙을 이용한 치료에 대한 후보인지 여부에 대한 인디케이터로 작용할 수 있다. 음성 대조군보다 높은 수준의 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE는 대상체가 음성 대조군보다 높은 수준의 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE를 갖지 않는 대상체에 비해 세툭시맙 과민증의 상승된 위험을 가짐을 시사한다.
일부 구현예에서, 세툭시맙 과민증의 증가된 위험을 갖는 대상체는 세툭시맙 과민증의 증가된 위험을 갖지 않는 대상체에 비해 적어도 약 1 내지 적어도 약 99 퍼센트 더 높은 혈청 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 세툭시맙 과민증의 증가된 위험을 갖지 않는 대상체에 비해 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99 퍼센트 더 높은 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE 수준을 갖는다.
일부 구현예에서, 세툭시맙 과민증의 증가된 위험을 갖는 대상체는 적어도 약 1 내지 적어도 약 100-배 더 높은 혈청 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 세툭시맙 과민증의 증가된 위험을 갖지 않는 대상체에 비해 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99-배 더 높은 항-세툭시맙 IgE 또는 항-Galα1,3Gal IgE 수준을 갖는다.
LR004 항체는 EGFR-발현 암의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여를 위해 적합한 약제학적 조성물 내로 편입될 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 특정한 투여 경로를 위해 적합한 형태로 약제학적으로-허용가능한 캐리어와 함께 항체를 포함한다. 약제학적으로-허용가능한 캐리어는 부분적으로는 투여되는 특정한 조성물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정한 방법에 의해 결정된다. 따라서, 항체 조성물을 투여하기 위해 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990 참고). 약제학적 조성물은 일반적으로 U.S. 식품의약품안전청의 모든 우수 제조 실시(GMP) 규제를 전체 수용하며 멸균되고 실질적으로 등장성으로 제형화된다.
용어 "약제학적으로-허용가능한", "생리적으로-관용가능한" 및 이들의 문법적 변화는 이들이 조성물, 캐리어, 희석제 및 시약을 나타낼 때, 상호교환적으로 사용되며 물질이 조성물의 투여를 금지할 정도까지 바람직하지 않은 생리적 효과를 일으키지 않고 대상체로 또는 대상체 상에 투여할 수 있음을 나타낸다. 예를 들면, "약제학적으로-허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 바람직한 약제학적 조성물의 제조에서 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도를 위해서뿐만 아니라 인간 약제학적 용도를 위해 허용가능한 부형제가 포함된다. 그와 같은 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우 기체일 수 있다. "약제학적으로-허용가능한 염 및 에스테르"는 약제학적으로-허용가능하며 원하는 약리학적 특징을 갖는 염 및 에스테르를 의미한다. 그와 같은 염에는 항체에 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우 형성될 수 있는 염이 포함된다. 적합한 무기 염에는 알칼리 금속, 예를 들면 나트륨 및 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 및 알루미늄으로 형성된 것들이 포함된다. 적합한 유기 염에는 유기 염기, 예컨대 아민 염기, 예를 들면 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등으로 형성된 것들이 포함된다. 그와 같은 염에는 또한 무기 산(예를 들면, 염화수소산 및 브롬화수소산) 및 유기 산(예를 들면, 아세트산, 시트르산, 말레산, 및 알칸- 및 아렌-설폰산, 예컨대 메탄설폰산 및 벤젠설폰산)으로 형성된 산 부가 염이 포함된다. 약제학적으로-허용가능한 에스테르에는 항체에 존재하는 카복시, 설포닐옥시, 및 포스포녹시기로부터 형성된 에스테르, 예를 들면 C1-6 알킬 에스테르가 포함된다.
그와 같은 캐리어 또는 희석제의 바람직한 예에는 비제한적으로 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이 포함된다. 리포좀 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정유도 사용될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 그와 같은 매질 및 화합물은 당해분야에 잘 공지되어 있다. 임의의 종래 매질 또는 화합물이 항체와 양립불가능한 경우를 제외하고, 조성물에서 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물 내로 편입될 수 있다.
본 기술의 약제학적 조성물은 의도되는 투여 경로, 예컨대 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 진피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내; 근육내 경로, 또는 호흡기 투여와 양립가능하게 제형화된다.
일부 구현예에서, 제형은 국소로, 직접적으로 이환 조직 내로 투여된다. 일부 구현예에서, 제형은 전신으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제형은 볼러스로 투여된다. 일부 구현예에서, 제형은 경시 방출 전달을 위해 투여된다.
비경구, 진피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 서스펜션에는 하기 성분이 포함될 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균 화합물, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화 화합물, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 조정용 화합물, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염화수소산 또는 나트륨 하이드록사이드로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사가능 용도를 위해 적합한 약제학적 조성물에는 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위해 적합한 캐리어에는 생리적 염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충된 염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 멸균성이어야 하며, 주사 용이성이 존재하는 정도까지 유체여야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대비하여 보존되어야 한다. 캐리어는, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유체성은, 예를 들면 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 예방은 다양한 항균 및 항진균 화합물, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 사례에서, 등장성 화합물, 예를 들면 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기적인 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 일으킬 수 있다.
멸균 주사가능 용액은 요구되는 바와 같이 필요한 양의 항체를 적절한 용매 중에 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 도입한 다음 멸균 여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 항체를 기본 분산매 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입하여 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 이들의 이전에 멸균된-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 냉동건조이다. 본 기술의 제제는 활성 성분의 지속적 또는 간헐적 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 제조물의 형태로 투여될 수 있다.
경구 조성물에는 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 캐리어가 포함된다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여 목적을 위해, LR004 항체 또는 항체 콘주게이트는 부형제와 함께 도입되고 정제, 트로키, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강청결제로서 사용하기 위해 유체 캐리어를 사용하여 제조될 수 있고, 여기서 유체 캐리어 중 화합물은 경구로 적용되고 가글되고 뱉어지거나 삼켜진다. 약제학적으로 양립가능한 결합 화합물, 및/또는 아쥬반트 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등은 임의의 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 트라가칸쓰 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해 화합물, 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활제, 예컨대 콜로이드성 실리콘 디옥사이드; 감미 화합물, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미 화합물, 예컨대 박하, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제.
흡입에 의한 투여를 위해, 항체는 적합한 추진제, 예를 들면 가스, 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과될 배리어에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 그와 같은 침투제는 당해분야에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들면 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙산염, 및 후시딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 항체는 당해분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
항체는 또한 좌약 형태의 약제학적 조성물로(예를 들면, 종래의 좌약 기재, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세라이드 포함) 또는 직장 전달용 정체 관장제로서 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 신체로부터 신속한 제거에 대비하여 항체를 보호할 캐리어와 함께, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형으로 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그와 같은 제형의 제조 방법은 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 상업적으로 수득될 수 있다. 리포좀 서스펜션(바이러스 항원에 대한 단클론성 항체로 감염된 세포에 표적화된 리포좀 포함)이 또한 약제학적으로-허용가능한 캐리어로서 사용될 수 있다. 이들은 당해분야의 숙련가에게 공지된, 예를 들면 U.S. 특허 번호 4,522,811에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여량 단위 형태는 치료받을 대상체에 대해 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타낸다; 각각의 단위는 필요한 약제학적 캐리어와 연합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 항체를 함유한다. 본 기술의 투여량 단위 형태에 대한 사양은 항체의 고유한 특성 및 달성될 특정한 치료 효과, 그리고 대상체 치료를 위한 항체 화합 분야의 내재적 제한에 의해 지정되고 이에 직접 의존한다.
본 기술의 핵산 분자는 벡터 내로 삽입되고 유전자 요법 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 벡터는, 예를 들면 정맥내 주사, 국소 투여(예를 들면, U.S. 특허 번호 5,328,470 참고) 또는 뇌정위적 주사(예를 들면, Chen 등, 1994. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 3054-3057 참고)에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약제학적 제조물에는 허용가능한 희석제 중의 유전자 요법 벡터가 포함될 수도 있고, 또는 유전자 전달 비히클이 임베딩되는 서방성 매트릭스를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 전체 유전자 전달 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터가 재조합 세포로부터 온전히 생산되는 경우, 약제학적 제조물에는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포가 포함될 수 있다. 약제학적 조성물은 투여용 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
일 측면에서, 본 개시내용은 생체내 종양 영상화 방법으로서, 대상체에 X-선 촬영, NMR 또는 ESR에 의한 검출을 위해 적합한 검출가능한 표지에 접합된 하나의 양의 LR004 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. X-선 촬영에 있어서, 적합한 표지에는 방사선동위원소, 예컨대 검출가능한 방사선을 방출하는 바륨 또는 세슘이 포함된다. NMR 및 ESR을 위해 적합한 마커에는 검출가능한 특징적 회전을 갖는 것들, 예컨대 당해분야에서 공지된 방법을 이용해서 항체에 도입되거나 접합될 수 있는 중수소가 포함된다.
적절한 검출가능한 영상화 모이어티, 예컨대 방사선동위원소(예를 들면, 131I, 112In, 99mTc), 방사선-불투과성 물질, 또는 핵 자기 공명에 의해 검출가능한 물질이 표지된 LR004 항체가 대상체에 도입된다(예를 들면, 비경구로, 피하로, 또는 복강내로). 대상체의 체격 및 이용된 영상화 시스템이 진단 이미지를 생성하기 위해 필요한 영상화 모이어티의 양을 결정할 것임이 당해분야에서 이해될 것이다. 방사선동위원소 모이어티의 경우, 인간 대상체에 있어서, 주사된 방사성의 양은 보통 99mTc 약 5 내지 20 밀리퀴리 범위일 것이다. 이어서 표지된 LR004 항체는 특정한 표적 폴리펩타이드를 함유하는 세포 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 예를 들면, 생체내 종양 영상화는 [S. W. Burchiel 등, Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer 13(1982)]에 기재된다.
본 기술의 LR004 항체는 EGFR-발현 암의 치료를 위해, 특히 세툭시맙을 이용한 치료를 추구할 수 없는 대상체에서 EGFR-발현 암의 치료를 위해 유용하다. 본 기술의 조성물 및 방법은 비제한적으로 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 결장직장, 두경부, 신장, 폐, 췌장, 및 전립선암을 포함하여 EGFR 저해가 유용한 모든 암의 치료를 위해 유용하다.
요법을 위해 생체내 사용될 때, LR004 항체는 대상체에 대해 효과적인 양(즉, 원하는 치료 효과를 갖는 양)으로 투여된다. 용량 및 투여량 레지멘은 개체에 존재하는 EGFR-발현 질환의 정도, 및 특정한 문제 질환의 특성에 의존할 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 원하는 치료 정도가 수득될 때까지, 수 일, 수 주, 수 개월 또는 수 년의 과정에 걸쳐 반복적으로 투여된다.
일부 구현예에서, LR004 항체는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 항체 및 추가 치료제는 EGFR-발현 암의 치료를 위해 상승작용성 효과를 나타낸다. 즉, 항체 및 치료제의 조합은, 예를 들면 종양 퇴행의 촉진 또는 종양 성장의 억제에 대해 부가 효과보다 큰 효과를 일으킨다. 일부 구현예에서, 상승작용성 효과는 어느 하나가 단독 사용되는 경우 효과적일 것보다 낮은 용량의 항체 및 하나 이상의 추가 제제의 투여를 허용한다.
전형적으로, 치료 또는 예방 효과를 달성하기 위해 충분한 본 기술의 조성물의 효과적인 양은 약 0.000001 mg/체중 킬로그램/1 일 내지 약 10,000 mg/체중 킬로그램/1 일 범위이다. 일부 구현예에서, 투여량 범위는 약 0.0001 mg/체중 킬로그램/1 일 내지 약 100 mg/체중 킬로그램/1 일이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 5 mg/kg/1 일의 투여량 범위로 투여된다. 예를 들면 투여량은 1 mg/체중 kg/1 일 또는 10 mg/체중 kg/1 일이거나, 1-10 mg/kg/1 일의 범위 내일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 단회 투여량은 0.1-10,000 마이크로그램/체중 kg 범위이다. 일부 구현예에서, 캐리어 중 항체 농도는 0.2 내지 2000 마이크로그램/전달된 밀리리터 범위이다. 예시적인 치료 레지멘은 2 주 1 회, 또는 1 개월 1 회 또는 3 내지 6 개월 1 회 투여를 포괄한다. 단회 투여량 간 간격은 주, 개월 또는 년일 수 있다. 간격은 또한 대상체에서 항체의 혈액 수준 측정에 의해 시사되는 바와 같이 불규칙할 수 있다.
일부 방법에서, 투여량은 1-1000　㎍/ml의 혈장 항체 농도, 일부 방법에서는 25-300　㎍/ml를 달성하도록 조정된다. 대안적으로, 제형은 지속 방출 제형으로 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 필요하다. 투여량 및 빈도는 대상체에서 항체의 반감기에 따라 변한다.
일부 구현예에서, LR004 항체의 효과적인 양은 대상체에게 실질적 독성을 유도하기 않고 치료 이점을 제공할 것이다. 항체의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해, 예를 들면 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 또는 LD100(집단의 100%에 치명적인 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간 용량 비가 치료 지수이다. 이들 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 수득된 데이타는 인간에서 사용하기 위해 독성이 아닌 투여량 범위의 제형에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 효과적인 용량을 포함하는 순환 농도 범위 내에 놓인다. 투여량은 사용되는 투여량 형태 그리고 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 대상체의 상태 측면에서 주치의에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, [Fingl 등, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1(1975)]를 참고하라.
EGFR-발현 암의 치료에서 사용하기 위한 LR004 항체를 포함하는 키트도 본 기술의 범위 내이다. 키트는 특정한 투여 경로를 위해 적합한 항체의 제형 및 임의로 적합한 용기에 패키지화된 제형의 투여를 위한 수단을 함유할 수 있다. 키트는 LR004 항체를 투여하기 위한 키트 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 추가 치료제 또는 검출가능한 표지와 함께 LR004 항체의 제형을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 기술의 바람직한 구현예를 보다 자세히 예시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 결코 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 기술의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. EGFR 인산화의 저해
인산화 검정 및 후속 ELISA 분석을 인간 폐 암종 세포주 A549 및 하인두 암종 세포주 FaDu를 이용하여 수행하였다. 세포를 얼음 상에서 1 시간 동안 상이한 농도의 LR004 또는 Erbitux?의 존재 하에 750 ng/mL TGF로 자극하였다. 자극 후, 세포를 PBS로 세정하고 후속 ELISA 분석을 위해 세포 용해 버퍼로 용해시켰다. EGF 수용체 EGFR＼HER2＼HER3의 인산화를 HRP-접합된 pTyr-4G10 mAb를 이용해서 프로브처리해서 결정하고 ELISA를 이용하여 검출하였다.
이들 시험관내 분석 결과는 LR004 및 Erbitux?가 모두 종양 세포주 A549 및 FaDu 둘 다에서 시험된 모든 농도에서 유사한 정도로 EGFR의 인산화를 저해할 수 있었음을 실증하였다(도 1).
실시예 2. LR004-의존적 세포- 매개된 세포독성
항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 종양에 대한 치료적 단클론성 항체의 중요한 작용 기전이다. 상기 연구의 목표는 LR004 및 Erbitux?가 시험관내 종양 세포에 대해 ADCC를 매개할 수 있는지 여부를 결정하는 것이었다.
말초 혈액 단핵구(PBMCs)를 건강한 공여체로부터 수득하고 효과기 세포로 사용하였다. 하인두 암종 세포주, FaDu를 표적 세포로 사용하였다. FaDu 세포를 5x103 세포/웰로 96-웰 포맷으로 플레이팅하였다. 다양한 농도(0.01-10,000 ng/mL)의 LR004를 개별 웰 3 개씩에 첨가하고, 효과기 세포를 효과기:표적 세포 비 30:1로 첨가하고, 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하고, CytoTox 96 비-방사성 세포독성 검정을 이용하여 ADCC를 조사하였다.
결과를 도 2에 나타낸다. LR004는 하인두 암종 FaDu 세포에 대해 유의미한 ADCC 활성을 유도하였다. 효과기:표적 비 30:1 및 LR004 농도 100 ng/mL에서, ADCC는 최고 백분율의 항종양 세포독성에 도달하였다. 건강한 공여체 PBMC에 의한 ADCC 활성 백분율은 LR004 참조 대조군 샘플(LR004-201307001) 및 벌크 용액(LR004-034-201304002) 모두에서 조사된 모든 농도(0.01 - 10,000 ng/mL)에서 LR004 및 Erbitux? 둘 다에 대해 유사하게 반응하였다. 더욱이, 종양 세포 FaDu에 대해 LR004 매개된 ADCC에 용량-의존성이 존재하여, LR004 및 Erbitux?의 유사한 항종양 작용 기전을 확인시켰다.
LR004로 수행된 일차 약리학 연구에는 가용성 인간 EGFR 및 EGFR-발현 세포를 이용한 무세포 시스템에서의 결합 연구, EGFR-양성 암 세포주를 이용한 시험관내 항종양 활성 연구, 및 EGFR-양성 인간 종양 이종이식편 모델에서의 생체내 항종양 활성이 포함되었다.
실시예 3. LR004 결합 특이성 및 친화성
A. ELISA에 의해 측정된 고정된 수용체에 대한 결합
LR004의 결합 특이성을 ELISA에 의해 시험관내 평가하였다. 정제된 EGFR, HER2, 및 HER3을 마이크로플레이트 상에 코팅한 다음 차단하였다. LR004 참조 물질(LR004-RS-201307001), 3 개 로트의 LR004 벌크 용액(LR004-034-201304002, LR004-034-201304004, LR004-034-201305005)뿐만 아니라 Erbitux?, 및 관련없는 항체 대조군 hIgG1을 2000, 400, 80, 16, 3.2, 0.64 및 0.128 ng/mL로 개별 희석하고 고정된 항원을 함유하는 웰로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고 세정하였다. LR004 또는 Erbitux?와 고정된 항원의 결합을 HRP 표지된 2차 항체 및 TMB 기질을 이용하여 검출하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, LR004 및 Erbitux?는 둘 다 HER2 또는 HER3 항원이 아닌 EGFR 항원에만 결합하여, 의도된 EGFR 표적에 대한 높은 특이성을 제시하였다. LR004는 EGFR에 대해 Erbitux?에 대해서와 거의 동일한 결합 친화도를 나타내었다.
B. BIAcore에 의해 측정되는 가용성 EGFR에 대한 결합
LR004의 sEGFR에 대한 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 ELISA에 의해 결정하고 Erbitux?에서와 비교하였다. SPR 검정에서, LR004 또는 Erbitux?를 CM5 BIAcore 센서 칩에 고정하고, 가교결합되지 않은 단백질을 제거하고, 반응하지 않은 부위를 차단하였다. 8, 16, 32, 64, 및 128 nM 농도의 정제된 재조합 인간 sEGFR 단백질을 계속해서 센서 표면에 걸쳐 흘렸다. 수행 간에는 칩 표면을 10 mM 글리신-HCl(pH 2.5)로 재생시켰다.
ELISA에서, sEGFR를 마이크로플레이트의 웰로 다시 고정하였다. LR004 또는 Erbitux?를 희석하고, sEGFR로 코팅된 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세정하였다. 고정된 sEGFR에 대한 LR004 또는 Erbitux?의 결합을 HRP 표지된 항-인간 Fc 단클론성 항체 및 TMB 기질을 이용하여 검출하였다. 각 웰의 광학 밀도(OD)를 파장 450 nm에서 결정하였다. 상기 방법론을 이용하여, LR004 및 Erbitux?에 대한 Kd 값은 각각 3.23 및 3.5 nM였다(도 4 및 표 4).
표면 플라즈몬 공명(SPR/BIAcore)을 이용하여, sEGFR이 고정된 LR004에 Kd 값 2.80 nM로, Erbitux?의 결합에 대해 관측된 것(Kd = 3.88 nM)과 유사하게 결합한 것으로 확인되었다(아래의 표 4 참고).
표 4 LR004 및 Erbitux ? 의 인간 EGFR에 대한 결합 친화도
Figure pct00004
C. 유세포측정에 의해 측정된 세포 표면 EGFR 결합
LR004의 세포 표면 EGF 수용체에 대한 결합을 상이한 EGFR 발현 수준을 갖는 9 개의 종양 세포주에서 유세포측정에 의해 평가하였다. 상업적으로 이용가능한 Erbitux?를 이들 실험에 대한 대조군으로 사용하였다. 세포 농도를 2 x 106 세포/mL로 조정하고 1 x 105 세포를 사용하여 결합 검정을 수행하였다. 2 개의 상이한 농도(200 ng/mL 및 1000 ng/mL)의 LR004 또는 Erbitux?를 세포에 첨가하고, 4℃에서 1 시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 세포를 포스페이트-완충 염수(PBS)로 세정하고 4℃에서 RPE-접합된 염소 항-인간 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세정하고 유세포측정 분석을 위해 250 mL PBS 중에 재현탁시켰다. 형광 세기의 기하 평균(G-평균)을 기록하고 데이타 분석을 위해 사용하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, LR004의 EGF 수용체에 대한 결합을 위암 세포주 MKN28, 표피모양 암종 세포주 A431, 하인두 암종 세포주 FaDu, 결장직장 선암종 세포주 COLO205, 췌장 선암종 세포주 AsPC-1, 간세포 암종 세포주 HepG2 및 7402, 유방 암종 세포주 MDA-MB-468 및 MCF-7을 포함하는 가변 수준의 EGFR 발현을 갖는 9 개의 상이한 종양 세포주에서 검출하였다. 가장 주목할 만한 결합은 MDA-MB-468 유방 암종 세포 및 A431 표피모양 암종 세포주에서 관측되었다. LR004의 EGFR에 대한 결합 활성은 조사된 모든 종양 세포주에서 Erbitux?에서와 유사하여, 두 항체가 EGFR 결합 부위에서 유사한 구조 도메인을 공유할 수 있음을 제시하였다.
고-EGFR 발현 세포주 MDA-MB-468, FaDu 및 A431을 LR004 결합 연구를 위한 표적 세포로 후속 사용하였다. 최초 실험에서, LR004를 FITC 표지하고, 표지되지 않은 Erbitux?를 경쟁 리간드로 사용하였다. 실험의 두 번째 시리즈에서, Erbitux?를 유사하게 FITC-표지하고 LR004를 경쟁 리간드로 사용하였다. 각 경우에, 세포 농도를 2 x 106 세포/mL로 조정하고 1 x 105 세포에서 결합 검정을 수행하였다. 동일한 용적의 FITC-접합된 LR004를 상이한 농도의 Erbitux? 또는 인간 IgG1 mAb(80, 16, 3.2, 0.64, 0.128, 및 0 ㎍/mL)와 혼합하고 고-EGFR 발현 표적 세포에 첨가하였다. 1 시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션 후, 세포를 0.2% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 세정하였다. 세포를 세정하고, 유세포측정 분석을 위해 250 ㎕의 PBS 중에 재현탁시켰다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Erbitux?는 EGFR-발현 세포주로의 결합에 대해 LR004와 경쟁하는 것으로 나타났다. 표적 세포 표면 EGF 수용체에 대한 LR004의 결합은 용량-의존적 방식으로 Erbitux?에 의해 폐지되었다. 고용량 처리(20 ㎍/mL)는 FITC-접합된 LR004 결합을 거의 완전히 차단하였다. 그에 반해서, 대조군 mAb(인간 IgG1)는 LR004와 EGF 수용체의 결합을 차단할 수 없어서 LR004가 Erbitux?와 EGF 수용체의 유사한 리간드-결합 에피토프를 인식할 수 있음을 제시하였다. Erbitux?에 의한 LR004 결합의 저해에 대해 계산된 IC50 값을 표 5에 나타내었다.
표 5 3 개의 암 세포주에서 Erbitux ? 에 의한 FITC -표지된 LR004의 저해
Figure pct00005
상이한 접근법을 이용해서, MDA-MB-468을 LR004에 의한 표지된 Erbitux? 결합의 저해를 위한 표적 세포주로 선택하였다. 결합 검정을 1 x 105 종양 세포에서 수행하였다. FITC-접합된 Erbitux?를 상이한 농도의 LR004 또는 인간 IgG1 mAb(80, 16, 3.2, 0.64, 0.128, 및 0 ㎍/mL)와 혼합하고 MDA-MB-468 세포에 첨가하였다. 1 시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션 후, 세포를 0.2% BSA를 함유하는 차가운 PBS로 세정하였다. 세포를 재현탁시키고 유세포측정 분석에 의해 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, LR004는 MDA-MB-468의 결합에 대해 Erbitux?와 경쟁하는 것으로 나타났다. 표적 세포 표면 EGF 수용체에 대한 Erbitux?의 결합은 용량-의존적 방식으로 LR004에 의해 폐지되었다. 고용량 처리(20 ㎍/mL)는 수용체에 대한 FITC-접합된 LR004 결합을 거의 완전히 차단하였다. 그에 반해서, 대조군 mAb(인간 IgG1)는 LR004와 EGF 수용체의 결합을 차단할 수 없었다. 상기 연구에서의 결과는 표지된 LR004를 이용한 이전 실험에서 관측된 것들과 필적하여, LR004 및 Erbitux?가 EGF 수용체의 동일한 리간드-결합 에피토프를 인식함을 제시하였다.
실시예 4. LR004 시험관내 항종양 활성
LR004의 항종양 활성을 시험관내에서 직접 조사하였다. 유방암 세포 MDA-MB-468, 결장암 세포 LoVo, 하인두 암종 세포 FaDu, 및 표피모양 암종 세포 A431을 포함하는 4 개의 인간 암 세포주를 상기 연구에서 시험하였다.
MDA-MB-468 및 LoVo를 첫 번째 연구에서 사용하였다. 각각의 세포주(5,000 세포)를 밤새 인큐베이션하였다. 종양 세포주로부터의 배양 상청액을 폐기하고, 상이한 농도의 LR004 또는 Erbitux?를 첨가하였다. 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션 후, 20 ㎕의 CCK-8 혼합된 기질을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. OD450 nm를 마이크로플레이트 판독기를 이용해서 결정하였다.
또 다른 실험에서, FaDu 및 A431(5,000 세포)을 3 개씩 96-웰 편평 바닥 플레이트에서 상이한 농도의 LR004 또는 Erbitux?와 인큐베이션하였다. 37℃에서 96 시간 동안 인큐베이션 후, 기질을 각 웰에 첨가하고 암소에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. RLU(상대 화학발광 단위)를 화학발광 방법을 이용해서 결정하였다. 저해 비(IR)를 하기와 같이 계산하였다: IR(%) = [미처리 세포의 RLU 값 - 처리 세포의 RLU 값]/(미처리 세포의 RLU 값)
결과는 도 8에 나타낸다. MDA-MB-468이 4 개의 선택된 세포주 중에서 항체에 가장 민감한 세포주였으며, A431 및 FaDu의 반응은 더 약했다. 두 항체 모두 유사한 정도로 각 세포의 증식을 저해할 수 있어서, LR004가 Erbitux?와 유사한 시험관내 항종양 활성을 가짐을 제시하였다.
실시예 5. LR004 생체내 항종양 활성
BALB/c 누드 마우스를 LR004 및 Erbitux?를 이용한 인간 종양 이종이식편 연구를 위해 사용하였다. 5 마리 마우스의 작은 그룹을 종양-보유 마우스의 구축을 위해 사용하였다. 인간 결장암 세포주 GEO, 및 인간 폐암 세포주 A549를 모두 이종이식편 모델 개발을 위해 사용하였지만, GEO 세포주를 이용한 결과만을 여기에 나타낸다. 종양 세포를 누드 마우스의 오른쪽 후측 넙다리 내로 s.c. 주사하였다. 종양이 400-600 mm3 용적에 도달하면, 우수한 종양 및 건강 상태를 갖는 종양-보유 마우스를 선택하였다. 종양을 제거하고 2-3 mm3 크기의 작은 조각으로 절단하여 마우스의 오른쪽 후측 넙다리 내로 s.c. 접종하였다. 종양 용적이 100-300 mm3로 자라면, 마우스를 10 마우스/그룹씩 LR004 또는 Erbitux?의 대조군, 저, 중 및 고용량 그룹으로 무작위 배치하였다. 마우스에 주 2 회 i.v. 투여하였다. 종양 치수를 주 2회 캘리퍼로 측정하고, 안락사 후 종양 중량을 측정하고 각 그룹에 대한 종양 중량 저해율을 계산하였다. 저해율이 ≤ 60%이면 결과를 음성으로, > 60%이면 양성으로 간주하였다.
도 10은 구축된 GEO 인간 결장 암종 이종이식편에 대한 고용량(100-200 mg/kg LR004) 및 100 mg/kg Erbitux?의 생체내 항종양 효과를 나타낸다. 마우스에 3 주 동안 주 2 회 투여하였다.
다음 실험에서, 용량-반응을 LR004로 수행하였고, 고용량의 Erbitux?를 다시 대조군으로 사용하였다. 상기 실험에서, 마우스는 4 주 동안 주 2 회 100 mg/kg/용량의 Erbitux? 또는 25, 50 또는 100 mg/kg/용량의 LR004의 주사를 수여받았다. 각 그룹은 8 마리 마우스로 구성되었다.
결과를 도 10에 나타낸다. LR004 및 Erbitux?는 둘 다 두 연구에서 모두 종양 용적을 유의미하게 감소시켰다. 제2 실험을 다시 반복하여 모든 용량의 LR004 및 Erbitux?에 의해 매우 유사한 결과 및 완전한 종양 억제를 얻었다. 두 항체 간 또는 이들 실험에서 사용된 상이한 LR004 용량 간에는 유의차가 없었다.
실시예 6. LR004 약력학
이들 초기 완료된 시험관내 및 생체내 약리학 연구에 부가하여, SW948 결장직장 선암종, A431 표피모양 암종 및 MDA-MB-468 유방 암종 종양 세포주를 포함하는 몇몇 다른 상이한 EGRF-발현 종양 유형에 대한 LR004의 효능이 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이 평가된다.
표 6 생체내 마우스 이종이식편 모델에서 평가된 EGFR -발현 종양 유형
Figure pct00006
GEO, SW948 및 A4331 종양 세포주를 이용한 연구를 BALB/c 누드 마우스에서 수행한다(MDA-MB-468 종양은 NOD SCID 마우스에서 평가한다). 처음에 고형 종양을 작은 그룹의 BALB/c 누드 마우스에서 생체내 성장시킨다. 종양이 400-600 mm3로 자라면, 종양을 절제하고 2-3 mm3의 작은 조각으로 절단하여, 작은 그룹의 마우스 내로 s.c. 접종한다. 종양이 100-300 mm3로 자라면, 마우스를 무작위화하고, 마우스에 비히클, Erbitux?(용량 TBD) 또는 저, 중 또는 고용량의 LR004를 4 주 동안 주 2 회 i.v. 투여한다. 마우스를 종양 세포 이식 후 최대 4 주 동안 관측하고, 종양 용적을 측정하고 계산한다. 최종 안락사 후 종양 중량을 측정하고, 저해율 또는 효과를 대조군 대비 각각의 치료군에 대해 계산한다. 결과는 저해율이 ≤ 60%이면 음성으로, > 60%이면 양성으로 간주한다. 이들 세포주를 이용한 주요 연구에 대한 전체 설계를 아래에 나타낸다.
표 7 LR004를 이용한 생체내 약력학 종양 이종이식편 연구
Figure pct00007
이들 4 개 종양 유형을 이용한 50 마우스의 각각의 연구를 각각의 종양 유형에 대해 N=2로 한 번 더 반복한다. 10 마리 수컷 그룹을 이용한 각각의 주요 연구 전에, 5 마리 수컷 마우스 그룹, 저 및 고용량의 LR004 및 공지된 유효 용량의 Erbitux?를 이용하여 LR004 및 Erbitux?로 모두 더 작은 파일롯 연구를 수행한다. 이들 최종 효능 연구 결과를 LR004의 후속 반복-용량 안전성 연구를 위한 용량 범위 결정을 위해 사용한다.
실시예 7: 약리학
A. 사이노몰구스 원숭이에서 LR004의 약동학
파일롯 약동학(PK) 연구를 표 8에 나타낸 바와 같이 작은 그룹의 수컷 사이노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 2 마리의 수컷 원숭이에 18 mg/kg LR004를 1 hr IV 주입으로 투여하였다. 제2 그룹의 2 마리 원숭이에는 아래의 표 8에 기재된 바와 같이 18 mg/kg Erbitux?를 유사하게 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 24 일(577 hr)까지 표시된 시점에 수집하고, 혈청 샘플을 제조하고, 상기에서 기재된 바와 같이 검증된 ELISA에 의해 LR004 또는 Erbitux? 농도에 대해 분석하였다.
표 8 원숭이에서 LR004 및 Erbitux ? 의 파일롯 약동학 연구
Figure pct00008
수컷 사이노몰구스 원숭이에서 18 mg/mL의 단회 용량 IV 주입 후 LR004 및 Erbitux?의 동력학은 거의 동일하였다. Cmax 값은 Erbitux? 및 LR004에 대해 각각 403-423 범위였으며, 1 hr의 Tmax는 1 hr 주입 말기에 상응한다. AUC 수준에 의해 평가되는 노출은 사실상 동일하였다(30-32 mg·hr/L). 반감기 값 또한 상당히 유사하였고, Erbitux? 및 LR004에 대해 각각 133-137 hr였다. 도 11 및 표 9에 나타낸 바와 같이, LR004는 시판되는 Erbitux? 생성물에 대해 이미 구축된 것과 일치하는 동력학을 나타내었다.
표 9 1 hr IV 주입 후 LR004 및 Erbitux ? 의 약동학 파라미터
Figure pct00009
B. 단회 및 반복 IV 투여를 이용한 원숭이에서의 LR004의 약동학
성별 당 6 마리의 사이노몰구스 원숭이 그룹에 표 10에 나타낸 바와 같이 단회 18 mg/kg 용량의 Erbitux? 또는 반복 IV 용량의 Erbitux?를 1, 21, 28 및 35 일에, 또는 단회 용량의 LR004 6, 18 또는 54 mg/kg 또는 반복 IV 용량의 18 mg/kg LR004를 1, 21 및 35 일에 처리하였다. 혈액 샘플을 수집하고 혈청 샘플을 투여 전 및 6 mg/kg으로 투여된 원숭이에 대해 0.33, 0.67 1, 2, 3, 5, 9, 13, 25, 49, 97, 145, 193, 241 시간(10 일)에 18 mg/kg의 투여 후 최대 18 일 동안, 54 mg/kg 투여 후 최대 28 일 동안 각각의 동물로부터 제조하였다. 18 mg/kg으로 LR004 또는 Erbitux?가 반복 투여된 원숭이에 대해, 혈액 샘플을 표 10에 나타낸 바와 같이 35 일에 최종 투여 후 최대 22 일(529 시간) 동안 수집하였다. 혈청 샘플을 검증된 ELISA 방법을 이용해서 LR004 또는 Erbitux? 농도에 대해 분석하였다.
표 10 사이노몰구스 원숭이에서 LR004 및 Erbitux ? 의 단회 및 반복 IV 투여 PK/TK 연구 설계
Figure pct00010
6, 18 또는 54 mg/kg으로 수컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이에 대한 LR004의 단회 용량 IV 투여 후, 상기 항체에 대해 용량-의존적 혈청 노출 및 1차 혈청 동력학을 관측하였다(도 12). 최대 혈청 농도(Cmax)는 각각 6 및 54 mg/kg 용량 수준에 대해 148 ㎍/mL 내지 992 ㎍/mL 범위였다. 관측된 Tmax는 모든 3 용량 수준에서 대략 1 시간이었고 LR004의 반감기는 상기 실험에서 용량과 함께 증가하여 6 mg/kg에서의 51 hr부터 18 mg/kg에서의 98 hr, 54 mg/kg에서의 116 hr의 범위인 것으로 결정되었다(표 11). 그러나 AUC 값에 의해 결정되는 전반적인 노출은 비교적 용량과 비례하였으며, 청소능은 비교적 일관되었고 0.7-0.8 mL/hr·kg 범위였다. 18 mg/kg 용량 수준에 대해 관측된 이들 파라미터는 사이노몰구스 원숭이에서의 상기 동일한 용량 수준에서 Erbitux?에 대해 결정된 것들과 일치하였다.
표 11 사이노몰구스 원숭이에서 LR004의 단회 IV 용량 투여에 대한 약동학 파라미 터
Figure pct00011
18 mg/kg에서 LR004 및 Erbitux? 둘 다의 반복 투여(1, 21, 28 및 35 일의 4 회 투여)로, 두 항체는 모두 일치하는 동력학을 나타내었고, 21, 28 및 35 일에 복용 직후 약간 더 높은 피크 혈청 수준(LR004의 경우)에도 불구하고 경시적으로 유의미한 축적을 나타내지 않았다.
이들 혈청 수준은 18 mg/kg Erbitux?를 이용한 IV 투여 후 관측된 것과 크게 상이하지 않았다. 최초 용량 후 두 화합물의 동력학 비교는 Erbitux?에 비해 LR004에 있어서 단지 약간 더 큰 분포 용적(VD) 및 약간 더 낮은 Cmax 및 AUC(0-∞)를 나타내었다. 그러나 4 번째 용량에 의해, LR004는 4 번째 용량 후 Erbitux?에 비해 훨씬 높은 VD 및 더 긴 반감기를 나타내었지만, Cmax 및 AUC 값은 두 생성물 간에 필적하였다. 상기 연구에서 LR004 또는 Erbitux?의 최초 및 최종(4 번째) 용량에 대한 약동학 파라미터를 아래의 표 12에 나타낸다.
표 12 사이노몰구스 원숭이에서 18 mg /kg에서의 최초 및 최종( 4 번째 ) IV 용량에 있어서 LR004 및 Erbitux ? 에 대한 PK 파라미터
Figure pct00012
실시예 8: LR004 탄수화물 구조
A. 역상 고성능 액체 크로마토그래피
LR004 및 Erbitux?의 산성 가수분해를 11.5%(v/v) 아세트산을 사용해서 수행하고 60 분 동안 80℃에서 인큐베이션하였다. 시알산 표준을 0.619 mg/mL NANA 및 0.651 mg/mL NGNA를 함유하는 모액으로부터 Milli Q H2O 중에 제조하였다. DMB(4,5-메틸렌디옥시-1,2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 표지화 반응을 각각의 샘플에 대해 3 개씩 수행하였다. 10 또는 40 ㎕(0.3-0.6 ㎍, 단백질 농도에 따라)의 산-가수분해된 단백질을 200　㎕ DMB 표지화 용액(7 mM DMB, 1.4 M 아세트산, 0.75 M 베타-머캅토에탄올, 및 18 mM 나트륨 디티오나이트)과 조합하여 표지화 반응을 55℃에서 3 시간 동안 수행하였다. 50 ㎕를 1 mL의 Milli Q H2O 내로 분취하고 볼텍싱하여 반응을 켄칭하였다. 단백질 농도에 따라, 25-100 ㎕(3-9 ng)를 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석을 위해 주사하였다.
0.5 ㎛ 프리-칼럼 필터를 갖는 Xbridge HPLC 칼럼, 3.0 mm x 100 mm, 3.5 ㎛를 이용해서 RP-HPLC를 수행하였다. 형광 검출기는 373 nm에서의 여기 및 448 nm에서의 방출로 구성되었다. 칼럼 온도는 30℃였고, 자동시료주입기는 4℃로 설정하였다. 이동상 A는 7% 메탄올/93% MilliQ H2O(v/v)였고 B는 7% 메탄올/50% 아세토니트릴/43% MilliQ H2O였고, 유속은 0.4 mL/분이었고, 구배는 표 13에 나타낸 바와 같다.
표 13 LR004 시알산 분석을 위한 RP- HPLC 구배
Figure pct00013
결과를 도 14에 나타낸다. 도 14a는 각각 6 분 미만 및 6 분 초과로 이동하는 NGNA 및 NANA 표준 피크를 나타낸다. 도 14b는 NANA에 상응하는 6 분 초과에서의 LR004-유도된 시알산의 이동을 나타낸다. 반대로, Erbitux?-유도된 시알산은 NGNA에 상응하는 6 분 미만에서 이동한다.
B. Neu5Gc(N-글라이콜릴뉴라민산(NGNA))의 ELISA 검출
Erbitux? 및 LR004를 100 ㎍/mL로 희석하고 2.5, 5.5, 및 10 ㎍/웰로 미세적정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 PBST로 3 회 세정하고 200 ㎕의 0.5% PBST로 실온에서 1 시간 동안 차단하였다. 웰을 실온에서 2 시간 동안 1:1000 닭 항-Neu5Gc IgY 또는 IgY 이소형 대조군과 인큐베이션하고, PBST로 5 회 세정하고, 실온에서 1 시간 동안 1:1000 당나귀 항-닭 IgY-Fc-HRP와 인큐베이션하였다. 세정 후, 웰을 TMB 기질로 발색시키고 10% H2SO4를 첨가하여 종료시켰다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
표 14 ELISA에 의해 결정된 LR004 및 Erbitux ? Neu5Gc 수준(OD450 nm)
Figure pct00014
결과를 표 14 및 도 15에 나타낸다. Erbitux? 샘플은 음성 대조군에 비해 1.87-1.97 배의 Neu5Gc 수준을 나타내었다. 이에 반해, LR004는 음성 대조군에 필적하는 Neu5Gc 수준을 나타내었다.
실시예 9: LR004의 열안정성
LR004의 열안정성을 시차주사열량측정(DSC)에 의해 결정하였다. LR004 및 Erbitux?를 제형 버퍼(100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 0.01% 폴리소르베이트 80, 10 mM 시트르산, pH 5.5) 중에 5 mg/ml의 농도로 제조하였다. DSC를 표준 프로토콜을 이용해서 SII Seiko-DSC 상에서 수행하였다. 모든 샘플을 분석 전에 5 분 동안 탈기하였다. 참조 세포에 제형 버퍼를 충전하였다. 샘플을 60℃/hr의 속도로 4℃부터 100℃까지 가열하였다.
결과를 도 16에 나타낸다. 도 16a는 LR004가 88.84℃의 용융점을 가짐을 나타낸다. 도 16b는 Erbitux?가 85.28℃의 용융점을 가짐을 나타낸다. 따라서, LR004는 Erbitux?보다 높은 정도의 열안정성을 갖는다.
균등부
본 발명은 본 발명의 개별 측면의 단일 예시로서 의도되는 본원에 기재된 특정한 구현예에 관하여 제한되지 않는다. 당해분야의 숙련가에게 분명할 것과 같이, 본 발명의 많은 변형 및 변화가 그것의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다. 본원에서 열거된 것들에 부가하여 본 발명의 범위 내의 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 상기 설명으로부터 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 그와 같은 변형 및 변화는 첨부된 청구범위 내에 속하도록 의도된다. 본 발명은 그와 같은 청구범위가 청구하는 균등부의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구범위에 관해서만 제한되어야 한다. 본 발명이 당연히 변할 수 있는 특정한 방법, 시약, 화합물 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적이지 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다.
<110> TSAO, ERIC <120> ANTI-EGFR ANTIBODY AND USES OF SAME <130> 108973-0117 <140> PCT/US2015/050131 <141> 2015-09-15 <150> 62/051,126 <151> 2014-09-16 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> May or may not be present <400> 3 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15

Claims (25)

  1. 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 N-아세틸뉴라민산(NANA)을 포함하고 갈락토스-α-1,3-갈락토스가 없는, 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 마커에 접합되는, 항체.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 방사선핵종을 포함하는, 항체.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 검출가능한 마커가 형광성 표지를 포함하는, 항체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체가 하나 이상의 추가 치료제에 접합되는, 항체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가 화학치료제를 포함하는, 항체.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 화학치료제가 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  9. 청구항 1의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 화학치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  11. 청구항 1의 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산이 CHO 세포 게놈으로부터 별도의 복제가능한 벡터 상에 존재하는, CHO 세포.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산이 CHO 세포 게놈 내로 안정하게 통합되는, CHO 세포.
  14. 이를 필요로 하는 대상체에서의 암 치료 방법으로서, 청구항 1의 항체를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 항체가 하나 이상의 추가 치료제에 접합되는, 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 치료제가 화학치료제를 포함하는, 방법.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 화학치료제가 빈카 알카로이드, 미세소관 파괴제, 항-혈관신생제, 치료 항체, EGFR 표적화 제제, 티로신 키나제 표적화 제제, 전이 금속 착물, 프로테아솜 저해제, 항대사물질 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포이소머라제 저해제, 매크롤라이드, 레티노이드, 젤다나마이신 또는 이들의 유도체, 아드리아마이신, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 악티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 플루오로우라실, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 에토포시드, 인터페론, 캄프토테신 및 이들의 유도체, 펜에스테린, 탁산 및 이들의 유도체, 토페테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 피포설판, nab-5404, nab-5800, nab-5801, 이리노테칸, HKP, 오르타탁셀, 젬시타빈, 옥살리플라틴, Herceptin?, 비노렐빈, Doxil?, 카페시타빈, Alimta?, Avastin?, Velcade?, Tarceva?, Neulasta?, 라파티닙, 소라페닙, 및 에를로티닙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 청구항 14에 있어서, 상기 대상체가 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-세툭시맙 IgE를 가지는, 방법.
  20. 청구항 14에 있어서, 상기 대상체가 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE를 가지는, 방법.
  21. 청구항 14에 있어서, 대상체가 세툭시맙에 대해 과민성인지 또는 세툭시맙에 대해 과민증 반응을 갖기 쉬운지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 결정 단계가 대상체로부터의 혈청 샘플 중 항-세툭시맙 또는 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE의 존재를 측정하는 것을 포함하며, 음성 대조군 샘플에 비해 상승된 수준의 항-세툭시맙 또는 항-갈락토스-α-1,3-갈락토스 IgE는 대상체가 세툭시맙에 대해 과민성이거나 세툭시맙에 대해 과민증 반응을 갖기 쉽다는 것을 시사하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 측정 단계가 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)의 이용을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1의 항체의 생산 방법으로서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 표 2에 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 핵산이 CHO 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 방법.
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