CN106470697B - 抗egfr抗体以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及一种EGFR抗体，以及其单独或与各种化学治疗剂组合对活体外和活体内肿瘤抑制的治疗效果。确切地说，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括投予单独或与化学治疗剂组合的EGFR抗体。

Description

抗EGFR抗体以及其用途
相关申请的交叉参考
本申请主张2014年9月16日申请的美国临时申请62/051,126的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及抗EGFR抗体的治疗用途。确切地说，本发明涉及包括用于治疗表现EGFR的癌症的抗EGFR抗体的方法以及组合物。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)由胞外配体结合域、跨膜区段以及胞内酪氨酸激酶域组成。在结合如表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGFα)的配体之后，EGFR与ErbB家族的其它成员形成同源或异源二聚物，导致胞内域自体磷酸化以及下游信号传导途径活化，下游信号传导途径包含Ras诱导的MAP激酶途径、PI3激酶途径以及JAK/STAT途径。这可以用信号传导癌细胞增殖、细胞凋亡抑制以及侵袭活化，并且刺激肿瘤诱导的新血管生成。通常用抑制受体信号传导和肿瘤细胞增殖的EGFR特异性抗体治疗表现EGFR的人类癌症，如经过批准的抗EGFRmAb西妥昔单抗
西妥昔单抗的直接作用机制是阻断配体-受体结合并且由此抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶活化。由于这一EGFR阻断，通过在肿瘤微环境中的肿瘤细胞或基质细胞中的EGFR信号传导途径所调节的各种过程被中断(Fan Z等人,1994；Abanell J等人,2001；Prewett M等人,1996；Huang SM等人,1999；Fan Z等人,1993a；Fan Z等人,1993b)。包含抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和受体内化的其它机制也有可能起重要作用(Kawaguchi Y等人,1996；Kimura H等人,2007)。ADCC取决于细胞FcγR与单克隆抗体之间的相互作用，触发涉及自然杀手细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化的T淋巴细胞以及粒细胞的先天免疫反应。受体内化下调可用的细胞表面受体的数量，并且可以因此影响EGFR活化。
过敏反应是西妥昔单抗的常见副作用，并且可以证明对接受者是致命的。本发明提供适用于对西妥昔单抗敏感的个体的替代EGFR靶向疗法，所述疗法排除西妥昔单抗的进一步使用。确切地说，本发明提供一种抗EGFR抗体，其与西妥昔单抗具有相同的特异性和功效，但具有使得其相比于西妥昔单抗更少免疫反应并且更稳定的修饰。抗体单独或与一种或多种额外治疗剂组合用于治疗表现EGFR的癌症。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种包括表2中所阐述的氨基酸序列的抗体。在一些实施例中，所述抗体包括乙酰神经氨酸(NANA)并且缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖。
在一些实施例中，抗体与可检测标记结合。在一些实施例中，可检测标记包括放射性核素。在一些实施例中，可检测标记包括荧光标记。
在一些实施例中，抗体与一种或多种额外治疗剂结合。在一些实施例中，一种或多种额外治疗剂包括化学治疗剂。
在一些实施例中，化学治疗剂选自由以下组成的群组：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素(geldanamycin)或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素(duanorubicin)、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(carmustine,BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷(etoposide)、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康(topetecan)、长春碱、长春新碱、他莫昔芬(tamoxifen)、哌泊舒凡(piposulfan)、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康(Irinotecan)、HKP、奥他赛(Ortataxel)、吉西他滨(gemcitabine)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、长春瑞滨、卡培他滨(capecitabine)、 拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)以及埃罗替尼(erlotinib)。
在一个方面，本发明提供一种组合物，其包括含表2中所阐述的氨基酸序列的抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括选自由以下组成的群组的化学治疗剂：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、卡培他滨、 拉帕替尼、索拉非尼以及埃罗替尼。
在一个方面，本发明提供一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括编码包括表2中所阐述的氨基酸序列的抗体的核酸。在一些实施例中，所述核酸存在于从CHO细胞基因组分离的可复制载体上。在一些实施例中，核酸稳定地整合到CHO细胞基因组中。
在一个方面，本发明提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者投予包括表2中所阐述的氨基酸序列的抗体。
在一些实施例中，所述方法进一步包括投予选自由以下组成的群组的一种或多种额外治疗剂：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、卡培他滨、拉帕替尼、索拉非尼以及埃罗替尼。
在一些实施例中，抗体与一种或多种额外治疗剂结合。在一些实施例中，一种或多种额外治疗剂包括化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂选自由以下组成的群组：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、卡培他滨、拉帕替尼、索拉非尼以及埃罗替尼。
在一些实施例中，受试者的抗西妥昔单抗IgE的含量与阴性对照样品相比升高。在一些实施例中，受试者的抗半乳糖-α-1,3-半乳糖IgE的含量与阴性对照样品相比升高。
在一些实施例中，所述方法进一步包括判定受试者是否对西妥昔单抗过敏或容易对西妥昔单抗有过敏反应。在一些实施例中，判定包括测量受试者的血清样品中抗西妥昔单抗或抗半乳糖-α-1,3-半乳糖的IgE的存在，其中抗西妥昔单抗或抗半乳糖-α-1,3-半乳糖的IgE的含量与阴性对照样品相比升高指示所述受试者对西妥昔单抗过敏或容易对西妥昔单抗有过敏反应。在一些实施例中，测量包括使用酶联免疫吸附分析(ELISA)。
在一个方面，本发明提供一种制备包括表2中所阐述的氨基酸序列的抗体的方法，其包括使中国仓鼠卵巢(CHO)细胞与编码表2中所阐述的氨基酸序列的核酸接触。在一些实施例中，所述核酸稳定地整合到CHO细胞的基因组中。
附图说明
本文所包含的图式描绘本文所公开的技术的非限制性示例性实施例，并且提供其用于辅助读者理解本发明。
图1A-B是展示在肿瘤细胞系A549和FaDu中TGF诱导的EGFR磷酸化受LR004和抑制的图。
图2是展示LR004和对下咽癌FaDu细胞的ADCC作用的图。
图3A-C是展示如通过酶联免疫吸附分析(ELISA)所展示的LR004和的结合特异性的图。
图4是展示如通过ELISA所展示的LR004和与可溶性EGFR的结合的图。
图5是展示LR004或与肿瘤细胞系中的细胞表面EGFR的结合的图。
图6A-C是展示在表现EGFR的细胞系中经FITC标记的LR004结合受抑制的图。
图7是展示在MDA-MB-468癌细胞中经FITC标记的结合受LR004(LR-004)抑制的图。
图8A-D是展示LR004或对肿瘤细胞系的活体外生长的影响的图。所测试的细胞系包含A)MDA-MB-468乳腺癌细胞；B)结肠癌细胞系LoVo；C)下咽癌细胞系；以及D)A431表皮样癌细胞。通过CCK-8(A和B)或ATPLite(C和D)分析来确定LR004和对活体外生长的抑制。
图9是展示高剂量的LR004或对BALB/c裸鼠中GEO肿瘤生长的影响的图。数据表示每个组的全部小鼠的平均值；线条是标准差(N＝5只/组)。
图10是展示LR004剂量反应对活体内BALB/c裸鼠中GEO肿瘤生长的影响的图。数据表示每个组的全部小鼠的平均值；线条是标准差(N＝8只/组)。
图11是展示在向食蟹猴静脉内投药(18mg/kg)之后LR004和的浓度-时间分布的图。
图12是展示在食蟹猴中静脉内给药之后血清LR004浓度的图。
图13是展示在食蟹猴中在静脉内给药18mg/kg之后在第1天、第21天、第28天以及第35天血清LR004浓度的图。
图14A-B是展示通过RP-HPLC确定的LR004和的唾液酸修饰的图。
图15是展示通过ELISA测定的LR004和的Neu5Gc(N-羟乙酰神经氨酸(NGNA))含量的图。
图16A-B是展示通过差示扫描量热法(DSC)测定的LR004和的热稳定性的图。
具体实施方式
I.综述
本发明提供包括适用于治疗表现EGFR的癌症的EGFR特异性抗体的方法以及组合物。应了解，本文所公开的技术的某些方面、模式、实施例、变化以及特征在下文中以不同的详细程度描述以便提供实质上理解技术。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语一般具有与此技术所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。除非内容另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书所用的单数形式“一个”和“所述”包含复数指示物。举例来说，提及“一个细胞”包含两个或更多个细胞的组合等。一般来说，本文所用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学与杂交中的实验室程序是本领域中众所周知并且通常采用的那些。使用标准技术用于核酸和肽的合成。使用标准技术或其变体用于化学合成和化学分析。本文所引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入本文中并且出于所有目的，引用的程度如同每篇个别公开、专利或专利申请出于所有目的具体地并且单独地以全文引用的方式并入一般。
如本说明书中所用的某些术语的定义提供在下文中。其它术语的定义可以见于《图解免疫学词典(Illustrated Dictionary of Immunology)》,第2版(Cruse,J.M.和Lewis,R.E.编,Boca Raton,FL:CRC Press,1995)中。
如本文所用，术语“协同作用”或“增效剂”是指在两种或更多种试剂、实体、因素或物质之间产生的作用，产生大于其个别作用的总和的作用。在一些实施例中，生物活性剂，如LR004抗体和化学治疗剂之间的协同作用是通过药物相互作用的系数(即，CDI)确定(参看例如，Cao SS等人,《通过双嘧达莫和两性霉素B增强活体内抗代谢物抗肿瘤活性(Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamoleand amphotericin B)》.《癌症化疗药理学(Cancer Chemother Pharmacol)》1989；24:181-186)。在一些实施例中，CDI如下计算：CDI＝AB/A×B。根据每个组的化学发光，AB是组合组与对照组的比率；A或B是单一试剂组与对照组的比率。当CDI值小于1时，药物组合是协同的。在确定两种或更多种组分之间的协同相互作用中，在一些实施例中，最佳作用范围以及每种组分的作用的绝对剂量范围可以通过向需要治疗的患者投予不同w/w比范围和/或不同剂量的组分来测量。在一种物种中观察到协同作用可以预测在其它物种中的作用，并且这类研究的结果可以用于预测有效剂量。
如本文所用，术语“显著协同作用”或“显著协同”是指在两种或更多种试剂、实体、因素或物质之间产生的作用，产生统计学上显著大于其个别作用的总和的作用。作为实例而非作为限制，当CDI值小于0.7时药物组合是显著协同的。
如本文所用，术语“累加”是指在两种或更多种试剂、实体、因素或物质之间产生的作用，产生等于其个别作用的总和的作用。
如本文所用，术语“拮抗作用”或“拮抗”是指在两种或更多种试剂、实体、因素或物质之间产生的作用，产生小于其个别作用的总和的作用。作为实例而非作为限制，当CDI值大于1时药物组合是累加的。
如本文所用，术语“EGFR”是指胞外蛋白配体的表皮生长因子(EGF)家族成员的细胞表面受体。受体是四种相关受体酪氨酸激酶(RTK)：EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)以及Her 4(ErbB-4)的一员。如本领域中众所周知，EGFR的突变活化可以导致配体非依赖性信号传导，促进细胞增殖和生长以及各种癌症的发展。
如本文所用，向受试者投予试剂或药物包含自我投药和通过别人投药。还应了解，如所描述的医学病状的各种治疗或预防模式打算意指“实质上”，其包括全部以及小于全部的治疗或预防，并且其中实现了一些生物学或医学相关结果。
如本文所用，术语“氨基酸”包含天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(BiochemicalNomenclature Commission)所推荐的单字母符号来提及。类似地，核苷酸可以由其通常接受的单字母代码来提及。
如本文所用，术语“抗体”意指特异性结合和识别抗原(例如，EGFR)的包括免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意指包含全抗体(包含单链全抗体)和其抗原结合片段。术语“抗体”包含双特异性抗体和多特异性抗体，只要其展现所期望的生物活性或功能即可。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指抗原结合抗体片段(包含单链抗体)，其可以包括单独或与以下多肽元素的全部或部分组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH1域、CH2域以及CH3域。本发明中还包含可变区和铰链区、CH1域、CH2域以及CH3域的任何组合。本发明技术的抗体分子包含例如(但不限于)Fab、Fab'以及F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包括VL或VH域的片段。实例包含：(i)Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括通过二硫桥键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH域组成；(v)dAb片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)，其由VH域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”可以包括全长抗体的一部分，一般其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段；由抗体片段形成的双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子以及多特异性抗体。单链抗体分子可以包括具有多个单独分子的聚合物，例如二聚物、三聚物或其它聚合物。
如本文所用，术语“生物样品”意指来源于活细胞或由活细胞接触的样品物质。术语“生物样品”打算包含从受试者中分离的组织、细胞以及生物流体，以及存在于受试者内的组织、细胞以及流体。本发明技术的生物样品包含例如(但不限于)全血、血浆、精液、唾液、泪液、尿液、粪便物质、汗液、口腔、皮肤、脑脊髓液以及头发。生物样品还可以从内脏活检或癌症获得。
如本文所用，术语“CDR移植抗体”意指“受体”抗体的至少一个CDR被具有所期望的抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替换的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指使用重组DNA技术，来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)用来自另一物种的抗体的Fc恒定区(例如，人类Fc恒定区)替换的抗体。一般参看Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利第4,816,567号；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人,《科学(Science)》240:1041-1043,1988；Liu等人,美国国家科学院院刊《(Proc Natl Acad Sci USA)》84:3439-3443,1987；Liu等人,《免疫学杂志(J Immunol)》139:3521-3526,1987；Sun等人,《美国国家科学院院刊》84:214-218,1987；Nishimura等人,《癌症研究(Cancer Res)》47:999-1005,1987；Wood等人,《自然》314:446-449,1885；以及Shaw等人,《国立癌症研究所杂志(J Natl Cancer Inst)》80:1553-1559,1988。
如本文所用，术语“比较窗口”意指选自由以下组成的群组的一定数量的相邻位置中的任一个的区段：20到600个氨基酸或核苷酸，通常约50到约200个，更通常约100到约150个，其中序列可以与相同数量的相邻位置的参考序列在最佳比对两个序列之后进行比较。
如本文所用，术语“共同FR”意指共同免疫球蛋白序列中的构架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所用，术语“共同序列”是指由相关序列家族中最频繁存在的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参看例如，Winnaker,《从基因到克隆(From Genes to Clones)》(Verlagsgesellschaft,德国魏因海姆(Weinheim,Germany)1987)。也就是说，在蛋白质家族中，共同序列的每个位置由所述家族中最频繁存在于所述位置的氨基酸占据。如果两个氨基酸同等频繁地存在，那么共同序列中可包含任一个。
如本文所用，术语“接触”在应用于细胞或组织时是指将本发明技术的EGFR抗体、抗体组合物、细胞毒性剂或部分、基因、蛋白质和/或反义序列递送到靶细胞或放置成与靶细胞直接接近的过程。这一递送可以是活体外或活体内的，并且可以涉及使用重组载体系统。
如本文所用，术语“细胞毒性部分”意指在接近细胞或由细胞吸收时抑制细胞生长或促进细胞死亡的部分。在这点上，合适的细胞毒性部分包含放射性试剂或同位素(放射性核素)；化学毒性剂，如分化诱导剂、抑制剂以及小化学毒性药物；毒素蛋白和其衍生物；以及核苷酸序列(或其反义序列)。因此，作为非限制性实例，细胞毒性部分可以是化学治疗剂、光活化毒素或放射性试剂。
如本文所用，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一多肽链(VH VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的连接子，迫使所述域与另一条链的互补域配对，并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更充分描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；以及30Hollinger等人,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)中。
如本文所用，术语组合物的“有效量”是足以实现所期望的治疗和/或预防效果的数量，例如导致预防或减少与要治疗的疾病(例如，与靶多肽相关的疾病)相关的症状的量。向受试者投予的本发明技术的组合物的量将取决于疾病类型和严重程度并且取决于个体特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重以及耐药性。其还将取决于疾病的程度、严重程度以及类型。所属领域的技术人员将能够取决于这些和其它因素确定适当剂量。本发明技术的组合物也可以与彼此或一种或多种额外治疗化合物组合投予。
如本文所用，“表现”包含(但不限于)以下中的一个或多个：使基因转录到前驱体mRNA中；剪接和以其它方式处理前驱体mRNA以产生成熟mRNA；mRNA稳定；使成熟mRNA翻译成蛋白质(包含密码子使用和tRNA可用性)；以及翻译产物的糖基化和/或其它修饰，如果需要适当表现和功能的话。
如本文所用，术语“基因”意指含有关于RNA产物的经调节的生物合成的所有信息的DNA区段，包含启动子、外显子、内含子以及控制表现的其它非翻译区。
如本文所用，术语“基因型”意指在个体的一对同源染色体上的基因座中的一个或多个多态或突变位点发现的非定相5'到3'核苷酸序列对。如本文所用，基因型包含全基因型和/或亚基因型。
如本文所用，术语“人类序列抗体”包含具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在)的抗体。本发明技术的人类序列抗体可以包含不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过活体外随机或位点特异性诱变或通过活体内体细胞突变引入突变)。这类抗体可以产生于非人类转基因动物中，例如如PCT公开第WO01/14424号和第WO 00/37504号中所描述。然而，如本文所用的术语“人类序列抗体”不打算包含来源于另一哺乳动物物种(如小鼠)的生殖系的CDR序列已经被移植到人类构架序列(例如，人源化抗体)上的抗体。
如本文所用，术语非人类(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是接受者的高变区残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的具有所期望的特异性、亲和力以及能力的非人类物种的高变区残基(供体抗体)替换的人类免疫球蛋白。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可以包括在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能，如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变域中的实质上所有，其中对应于非人类免疫球蛋白的高变环的所有或实质上所有高变环和所有或实质上所有FR区是人类免疫球蛋白序列的那些高变环和FR区，但FR区可以包含一个或多个提高结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量在H链中通常不超过6，并且在L链中不超过3。人源化抗体任选地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步细节，参看Jones等人,《自然》321:522-525(1986)；Reichmann等人,《自然》332:323-329(1988)；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。
在一个实施例中，本发明涵盖本发明技术的EGFR抗体的氨基酸修饰。举例来说，可能期望提高抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。可以通过向抗体核酸中引入适当核苷酸变化或通过肽合成来制备EGFR抗体的氨基酸序列变异体。这类修饰包含例如在EGFR结合位点的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入以及取代的任何组合以获得相关抗体，只要所得抗体具有所期望的特性(例如，生物活性)即可。修饰还包含蛋白质的糖基化模式的变化。适用于鉴别优选的诱变位置的方法被称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在《科学》,244:1081-1085(1989)中描述。随后针对所期望的活性来筛选突变抗体。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体中引起抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在VL中，在约残基24-34(L1)、50-56(L2)以及89-97(L3)周围，并且在VH中，在约31-35B(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)周围(Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,第5版马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院的公共卫生署(PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在VL中残基26-32(L1)、50-52(L2)以及91-96(L3)，并且在VH中26-32(H1)、52A-55(H2)以及96-101(H3)(Chothia和Lesk《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》196:901-917(1987))。
如本文所用，术语“一致”或“一致性”百分比在用于两个或更多个核酸或多肽序列的情况下时，是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当比较和比对比较窗口或指定区域内的最大对应关系时，在指定区域(例如，编码本文所描述的抗体的核苷酸序列或本文所描述的抗体的氨基酸序列)内约60％，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高一致性)，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法所测量，默认参数如下所描述，或通过手动比对和目视检查(参看例如，NCBI网站)。这类序列随后被称为“实质上一致”。这个术语还指或可以应用于测试序列的互补序列。所述术语还包含具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下文所描述，优选算法可以解释空位等。在一些实施例中，在长度是至少约25个氨基酸或核苷酸的区域内存在一致性；另外或或者，在一些实施例中，在长度是50-100个氨基酸或核苷酸的区域内存在一致性。
“经分离”或“经纯化”的多肽或其生物活性部分实质上不含细胞物质或来自多肽所衍生的细胞或组织来源的其它污染多肽，或在化学合成时实质上不含化学前驱体或其它化学物质。举例来说，经分离的EGFR抗体是实质上不含细胞物质或来自抗体所衍生的细胞或组织来源的其它污染多肽。这类污染多肽可以包含酶、激素以及其它蛋白质和非蛋白质溶质，其可能或可能不干扰抗体的生物活性。
如本文所用，短语“诱导细胞死亡”或“能够诱导细胞死亡”是指试剂使活细胞变得不能存活的能力。在一些实施例中，LR004抗体诱导活体外或活体内癌细胞中的细胞死亡。细胞死亡和细胞生存力可以通过本领域中的各种方法确定，如锥虫蓝排除分析和其它细胞生存力分析。在本发明技术中，细胞死亡是指“细胞凋亡”，也被称作“程序性细胞死亡”，其通过半胱天冬酶活化、膜联蛋白V结合到细胞表面、DNA片段化、细胞体积损失、内质网扩张、细胞片段化和/或膜囊泡形成(细胞凋亡体)所指示。细胞凋亡可以使用本领域中已知的方法测量，包含(但不限于)检测膜联蛋白V染色、DNA片段化或半胱天冬酶活化。
如本文所用，术语“完整抗体”意指具有通过二硫键互连的至少两个重链(H)多肽和两个轻链(L)多肽的抗体。每个重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个域CH1、CH2以及CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有称为构架区(FR)的更保守区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包含免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从实质上均质抗体的群体获得的抗体，即，构成所述群体的个别抗体除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具高度特异性。此外，相比于通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指示如从实质上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。举例来说，根据本发明技术使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制得，或可以通过重组DNA方法制得(参看例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)以及Marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中所描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
如本文所用，术语“医学病状”包含(但不限于)显示为一种或多种期望治疗和/或预防的身体和/或心理症状的任何病状或疾病，并且包含先前和新鉴别的疾病和其它病症。
如本文所用，术语“调节剂”包含抑制剂和活化剂。抑制剂是例如结合于、部分或完全阻断刺激、减少、防止、延迟、活化、不活化、钝化或下调靶分子的活性的试剂。活化剂是例如结合于、刺激、增加、开启、活化、促进、增强、活化、敏化或上调靶分子的活性的试剂。在一些实施例中，靶分子是EGFR受体。调节剂包含靶分子的天然存在的配体以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、促效剂、小化学分子等的遗传修饰形式。
如本文所用，术语“中和抗体”意指能够消除或显著降低靶分子的至少一种(1)生物功能的抗体分子。在一些实施例中，靶分子是EGFR受体。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”打算包含任何和所有与药物投予相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和吸收延迟化合物等。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换地用于意指包括两个或更多个通过肽键或经修饰的肽键(即，肽电子等排物)彼此接合的氨基酸的聚合物。多肽是指短链，通常被称作肽、糖肽或寡聚物，并且指较长链，一般被称作蛋白质。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。多肽包含通过如翻译后加工的自然过程或通过本领域中众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这类修饰充分描述在基本教科书和更详细的专论中，以及庞大的研究文献中。在特定实施例中，多肽含有来自EGFR受体的多肽序列。
如本文所用，术语“重组”在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体时使用时，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或更改天然核酸或蛋白质而加以修饰，或所述物质来源于如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表现细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因或表现以其它方式异常表现、低表现或完全不表现的天然基因。
如本文所用，短语“救助受体结合表位”是指引起IgG分子的活体内血清半衰期增加的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，为了增加抗体的血清半衰期，人们可以将救助受体结合表位并入抗体(尤其抗体片段)中，如例如美国专利5,739,277中所描述。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个域VL和VH的抗体融合分子。虽然Fv片段的两个域VL和VH由独立基因编码，但它们可以使用重组方法，通过一个合成连接子接合，所述连接子使其能够制备成单一蛋白质链形式，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。参看例如，Bird等人,《科学》242:423-426,1988；以及Huston等人,《美国国家科学院院刊》,85:5879-5883,1988)。这类单链抗体是通过参考术语“抗体”片段包含，并且可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学裂解制备。
如本文所用，术语“小分子”意指分子量小于约5kDa并且更优选地小于约2kDa的组合物。小分子可以是例如核酸、肽、多肽、糖肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质、脂多糖、这些物质的组合或其它有机或无机分子。
如本文所用，术语受体和配体的“特异性结合”意指受体与配体之间具有至少10-6M结合亲和力的接触。在一些实施例中，配体以至少约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10- 12M的亲和力结合。在一些实施例中，受体和配体是EGFR和EGFR抗体。在一些实施例中，EGFR抗体是LR004抗体。
如本文所用，短语“严格杂交条件”意指探针将与其标靶子序列杂交(通常在复杂的核酸混合物中)但不与其它序列杂交的条件。严格条件与序列相关，并且会随情况不同而不同。较长序列在较高温度下特异性地杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于Tijssen,《生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交(Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes)》,“《杂交原理和核酸分析策略综述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays)》”(1993)中。一般来说，选择严格条件比所定义的离子强度pH下的特定序列的热熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm是50％的与标靶互补的探针与靶序列在平衡(当靶序列过量存在时，在Tm下，在平衡下占据50％探针)下杂交的温度(在所定义的离子强度、pH以及核浓度下)。严格条件也可以通过添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号是至少两倍背景，优选地10倍背景杂交。示例性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5×SSC以及1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，在0.2×SSC中洗涤；以及0.1％SDS，在65℃下。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选地哺乳动物，如人类，但也可以为另一哺乳动物，例如家畜(例如，狗、猫等)、农畜(例如，牛、羊、猪、马等)以及实验动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠等)。
如本文所用，术语“氨基酸取代”是指肽内的氨基酸改变为不同氨基酸。如本领域中已知，氨基酸取代取决于其对肽的生物活性的作用可以是“保守”或“非保守”的。所谓的“保守取代”在下表中以标题“优选取代”展示。
如本文所用，术语“靶细胞”意指受试者(例如，人类或动物)体内可以由本发明技术的EGFR抗体靶向的任何细胞。
如本文所用，术语“治疗剂”打算意指在以有效量存在时对有需要的受试者产生所期望的治疗效果的化合物。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”或“缓解”是指治疗性治疗。受试者的表现EGFR的癌细胞的癌症在接受治疗量的EGFR抗体之后被成功地“治疗”，所述受试者展示癌症的一种或多种征象和症状可观察和/或可测量的减少或不存在，如包含(但不限于)个体中存在的癌细胞数减少；肿瘤大小、重量、体积或数量减小；肿瘤生长和/或转移得到抑制；缓解时长增加；疼痛减轻或缓解；发病率和死亡率降低；体重增加；或生活质量总体改善。“预防(Prevention/preventing)”疾病或病状是指预防剂或防治性测量，其中目标是预防或减缓(减轻)所靶向的病理病状或病症。
如本文所用，术语“可变”是指如下事实：可变域的某些片段在抗体之间的序列广泛不同。V域介导抗原结合并且定义特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变域的氨基酸跨段中并非均匀分布。相反，V区由通过各自是9-12个氨基酸长的被称作“高变区”的极端可变性较短区分离的15-30个氨基酸的被称作构架区(FR)的相对不变延伸组成。天然重链和轻链的可变域各自包括四个主要采用β折叠构型的由三个高变区连接的FR，高变区形成连接β折叠结构的环并且在一些情况下形成β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起并且与其它链的高变区保持在一起，促使抗体的抗原结合位点形成(参看Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》,第5版马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院的公共卫生署(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应功能，如参与抗体ADCC。
II.LR004抗体和抗体结合物
LR004是特异性结合于人类表皮生长因子受体(EGFR)的N端部分的重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体。EGFR是人类表皮生长因子受体(HER)或ErbB家族的一员，也被称作1型受体酪氨酸激酶或ErbB1/HER1。所述家族的其它成员包含ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)以及ErbB4(HER4)。肿瘤细胞中的EGFR信号传导引起对影响包含增殖、存活、损伤修复、粘附、迁移以及新血管生成的肿瘤生长的细胞功能的不同网络的调节。EGFR在上皮来源的多个人类癌症中以各种水平表现。通常表现EGFR的上皮肿瘤包含膀胱、乳腺、子宫颈、结肠、头颈、肾、肺、胰腺以及前列腺肿瘤。EGFR通过过度表现或突变的误调节导致组成性活性或受损受体下调并且可能使细胞恶性转化。EGFR的致癌作用包含起始DNA合成、增强细胞生长、侵袭以及转移。
LR004是改良形式的西妥昔单抗，具有相同作用机制，包含阻断EGFR配体结合，导致抑制下游作用，如抑制胞内信号传导、抑制细胞周期进程、诱导细胞凋亡以及抑制DNA修复、血管生成、肿瘤细胞运动、侵袭以及转移。研究展现LR004抑制TGF诱导的EGFR磷酸化、刺激ADCC，并且下文呈现活体外和活体内抗瘤作用。LR004与西妥昔单抗相比由于翻译后碳水化合物修饰的差异而不大可能诱导过敏反应，并且适用于治疗由于这些副作用而不能继续西妥昔单抗治疗的受试者。
LR004的氨基酸序列根据药物库(寄存编号：DB00002)中所公布的西妥昔单抗序列进行修饰。通过LC-MS/MS分析进行LR004与市售西妥昔单抗的序列比较。虽然LR004的Fab序列与西妥昔单抗的Fab序列一致，Fc序列有5个氨基酸差异，以粗体展示于表2中。LR004在重链的残基222到224处具有Pro-Lys-Ser重复，而西妥昔单抗不含所述重复。LR004中存在CH3天冬氨酸361和亮氨酸363的残基。相比之下，西妥昔单抗中发现CH3谷氨酸361和蛋氨酸363。这些差异表示LR004(G1m1,17)和西妥昔单抗(G1m3)的不同IgG1Fc异型。两种异型在经过批准的单克隆抗体之间是常见的。轻链的氨基酸序列以及重链的可变区与西妥昔单抗的氨基酸序列以及可变区一致。
LR004的轻链和重链的理论分子量分别是23718Da(烷基化LC)和53037Da(烷基化HC，G0F/G0F)。官能LR004由四条多肽链组成，并且通过非还原SDS-PAGE得到的表观分子量约等于200KDa。LR004的特征是可通过IEF在pI标记带7.0和8.6之间检测的多个带，代表LR004的不同电荷异构体。
LR004抗体与西妥昔单抗相比由于其制备方面而包括碳水化合物结构的两个差异。虽然西妥昔单抗在SP2/0细胞中表现，LR004在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表现。因此，LR004的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)，相反，西妥昔单抗的唾液酸是N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。NANA被视为比NGNA更类似人类。另外，虽然西妥昔单抗含有高含量的有效寡糖免疫原半乳糖-α-1,3-半乳糖(Galα1,3Gal)，LR004不含可检测量的这类碳水化合物结构。在CHO细胞中的表现给出LR004聚糖谱，其免疫反应性比西妥昔单抗显著更少。在这两个修饰的情况下，LR004是比西妥昔单抗更安全的产品但具有相同的作用机制和功效。如下文所展示，LR004还展现在重复给药治疗方案中血清半衰期比西妥昔单抗更长，并且热稳定性增加。
表2中给出LR004的氨基酸序列。轻链含有214个氨基酸并且重链含有452个氨基酸。轻链的序列与西妥昔单抗的序列一致。在表2中，二硫键的位置展示为连接直线，并且占据重链上N-聚糖位点的两个是带下划线的，一个在处于具有一系列糖(包含唾液酸、N-乙酰神经氨酸(NANA))的Asn88处的可变(Fv)区的构架3内，并且另一个在Asn302处的CH2域内。重链上存在一种N端焦谷氨酸。表3中概述LR004抗体的生理化学和生物特性。
如在本文所包含的实例中所描述，LR004特异性结合于人类EGFR并且抑制表现EGFR的肿瘤细胞的生长和信号传导。活体外研究展现LR004对下咽癌(FaDu)细胞中的EGFR磷酸化以及ADCC的影响。所描述的药效学评估包含基于ELISA和SPR的结合亲和力研究、ELISA结合特异性研究以及结合于活体外完整肿瘤细胞的LR004的流式细胞评估。还在活体外人类癌细胞系和活体内小鼠异种移植研究中在人类结肠癌GEO细胞衍生的肿瘤的情况下展示抗肿瘤活性。额外活体内功效研究将进一步展现LR004相比于西妥昔单抗的功效。
LR004适用于治疗表现EGFR的癌症，单独或与一种或多种额外治疗剂组合投予。确切地说，LR004适用于治疗对西妥昔单抗过敏而不能继续用西妥昔单抗治疗的患者。
表3：LR004的物理化学和生物特性
在一个方面，本发明提供用于治疗表现EGFR的癌症的抗体，以及包括所述抗体的组合物。在一些实施例中，抗体是LR004。在一些实施例中，抗体是与其它试剂结合的LR004。在一些实施例中，其它试剂包括可检测标记或治疗剂。在一些实施例中，可检测标记包含(但不限于)荧光标记或放射性标记。在一些实施例中，治疗剂包括化学治疗剂，如癌症治疗剂。
一般来说，治疗性部分可以通过任何合适技术与LR004抗体结合，适当考虑受试者对药物动力学稳定性和总体毒性降低的需求。治疗性、细胞毒性或标记/成像试剂(即，“部分”)可以与抗体直接或间接偶合(例如，通过连接基团)。部分与LR004抗体之间的直接反应在各自具有能够与彼此反应的官能团时是可能的。举例来说，亲核性基团(如氨基或硫氢基)可以能够与含羰基的基团(如酸酐或酰卤基)或含有良好离去基团(例如卤基)的烷基反应。或者，可以使用合适的化学连接基团。连接基团可以起到使LR004抗体与部分隔开以便避免干扰结合能力的间隔基的作用。连接基团也可以用于增加部分或LR004抗体上的取代基的化学反应性，并且因此增加偶合效率。化学反应性的增加还可以促进使用部分或部分上的官能团，否则将是不可能的。
合适的键联化学物质包含马来酰亚胺基连接子和烷基卤连接子(其与抗体部分上的硫氢基反应)以及琥珀酰亚胺基连接子(其与抗体部分上的伯胺反应)。在免疫球蛋白上存在几个伯胺和硫氢基，并且额外基团可以被设计到重组免疫球蛋白分子中。本领域的技术人员将显而易见，可以采用多种双官能或多官能试剂(同官能性和异官能性(如伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯化工有限公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)的目录中所描述的那些试剂))作为连接基团。偶合可以例如通过氨基、羧基、硫氢基或氧化碳水化合物残基受到影响(参看例如，美国专利第4,671 958号)。
作为替代偶合方法，可以使部分与LR004抗体通过氧化碳水化合物基团在糖基化位点偶合，如美国专利第5,057 313号和第5,156 840号中所描述。LR004抗体与部分的又一替代偶合方法是通过使用非共价结合对，如抗生蛋白链菌素/生物素或抗生物素蛋白/生物素。在这些实施例中，所述对的一个成员与LR004抗体共价偶合并且所述结合对的另一个成员与部分共价偶合。
当细胞毒性或治疗性部分在不含本发明技术的免疫结合物的LR004抗体部分时更有效时，可以期望使用在内化到细胞中期间或之后可裂解或在胞外环境中随时间推移逐渐可裂解的连接基团。已经描述多个不同的可裂解连接基团。细胞毒性部分从这些连接基团的胞内释放的实例包含例如(但不限于)通过二硫键还原(例如，美国专利第4,489,710号)、通过光不稳定性键的照射(例如，美国专利第4,625,014号)、通过所衍生的氨基酸侧链水解(例如，美国专利第4,638,045号)、通过血清补体介导的水解(例如，美国专利第4,671,958号)以及酸催化水解(例如，美国专利第4,569,789号)来裂解。
在一个实施例中LR004抗体与超过一种治疗性、细胞毒性和/或成像部分偶合。通过聚衍生LR004抗体，可以同时实施几种细胞毒性策略，可以使LR004抗体适用作用于几种可视化技术的造影剂，或可以被标记用于通过可视化技术追踪的治疗性抗体。在一个实施例中，细胞毒性部分的多个分子与一种LR004抗体偶合。在一个实施例中，LR004抗体与选自由以下组成的群组的至少两个部分的混合物偶合：细胞毒性部分；治疗性部分；以及标记/成像部分。也就是说，超过一种类型的部分可以与一种LR004抗体偶合。举例来说，治疗性部分，如聚核苷酸或反义序列可以与LR004抗体以及化学毒性或放射毒性部分结合，增加化学毒性或放射毒性疗法的有效性以及降低需要获得所期望的治疗效果的所需剂量。不管特定实施例如何，具有超过一个部分的免疫结合物可以通过多种方式制备。举例来说，超过一个部分可以与LR004抗体直接偶合，或可以使用提供多个连接位点的连接子(例如，树枝状聚合物)。或者，可以使用能够容纳超过一个细胞毒性部分的载体。
如上文所解释，LR004抗体可以通过多种方式携带部分，包含直接或通过连接基团的共价粘结，以及非共价结合。在一个实施例中，抗体与封装载体组合。这尤其适用于化学毒性治疗实施例，因为其可以使治疗组合物随时间推移逐渐释放LR004抗体化学毒性部分同时在靶细胞附近聚集所述部分。
在一个实施例中，LR004抗体与放射性核素细胞毒性部分偶合。适用作细胞毒性部分的优选放射性核素是适于药理学投予的放射性核素。这类放射性核素包含123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb以及212Bi。碘和砹同位素是适用于本发明技术的治疗组合物的更优选的放射性核素，如已经累积关于其用途的大量文献。131I是特别优选的，因为其它β辐射发射核素具有几毫米的有效范围。123I、125I、131I或211At可以使用几种已知结合剂中的任一种与LR004抗体结合用于所述组合物和方法中，所述结合剂包含非水溶性碘化试剂(iodogen)、3-[211At]砹代苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯、3-[131I]碘苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIB)以及5-[131I]碘-3-吡啶甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SIPC)。可以在所述碘试剂中使用任何碘同位素。其它放射性核素可以通过核医学领域中的技术人员已知的合适螯合剂与LR004抗体结合。
在一个实施例中，LR004抗体与化学毒性部分偶合。化学毒性剂包含(但不限于)小分子药物，如氨甲喋呤和嘧啶以及嘌呤类似物。化学毒素分化诱导剂包含佛波醇酯和丁酸。化学毒性部分可以与LR004抗体直接结合。在一个实施例中，LR004抗体通过化学连接子与细胞毒性部分偶合。在另一实施例中，使部分封装在载体中，又使载体与LR004抗体偶合。
在一个实施例中，LR004抗体与蛋白质毒素部分偶合。适用作细胞毒性部分的优选毒素蛋白包含例如(但不限于)放线菌(Actinomycete)或链霉菌(Streptomyce)抗生素、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、小红莓、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)以及嘌呤霉素以及其类似物或同源物。适用作细胞毒性部分的优选毒素蛋白进一步包含蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)、志贺氏菌毒素(Shigella toxin)、美洲商陆抗病毒蛋白以及医药生物化学领域中已知的其它毒素蛋白。由于这些毒素剂可能引发受试者的不期望的免疫反应，尤其在血管内注射时，优选的是其被封装在用于偶合到LR004抗体的载体中。
在一个实施例中，LR004抗体与酶活性毒素偶合。酶活性毒素可以是细菌或植物来源，或这类毒素的酶活性片段(“A链”)。适用于本发明技术的酶活性毒素和其片段是白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素(modeccin)A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素以及伊诺霉素(enomycin)。使用各种双官能蛋白质偶合剂进行LR004抗体与细胞毒性部分的结合。这类试剂的实例是SPDP；IT；亚氨酸酯的双官能衍生物，如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯；活性酯，如辛二酸二琥珀酰亚胺酯；醛，如戊二醛；双叠氮化合物，如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺；双-重氮衍生物，如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺；二异氰酸酯，如2,6-甲苯二异氰酸酯；以及双活性氟化合物，如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。毒素的溶解部分可以与LR004抗体的Fab片段接合。
在一个实施例中，LR004抗体与治疗性部分偶合。治疗性部分包含例如(但不限于)抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷基化剂(例如，氮芥、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)以及洛莫司汀(lomustine,CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C以及顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前称道诺霉素)和小红莓)、抗生素(例如，更生霉素(以前称放线菌素)、博莱霉素、光神霉素以及安曲霉素(AMC))、小红莓(阿霉素)、顺铂、硫酸博莱霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺羟基脲或蓖麻毒素A以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
用于这类治疗性部分与LR004抗体结合的技术是众所周知的，参看例如，Arnon等人,“《在癌症治疗中免疫靶向药物的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)》”,《单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)》,Reisfeld等人(编),第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“《药物递送用抗体(Antibodies For DrugDelivery)》”,《药物递送控制(Controlled Drug Delivery)》(第2版),Robinson等人(编),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“《在癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review)》”,《单克隆抗体'84：生物和临床应用(Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications)》,Pinchera等人(编),第475-506(1985)页；“《在癌症治疗中放射性标记抗体的治疗用途的分析、结果以及未来前瞻性(Analysis,Results,And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)》”,《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection AndTherapy)》,Baldwin等人(编),第303-16页(学术出版社(Academic Press)1985)；以及Thorpe等人,“《抗体-毒素结合物的制备和细胞毒性(The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates)》”,《免疫学评论(Immunol.Rev.)》,62:119-58(1982)。
在一个实施例中LR004抗体与标记部分(即，可检测基团)偶合。与LR004抗体结合的特定标记或可检测的基团不是本发明技术的重要方面，只要其不显著干扰抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任何物质。这类可检测标记在免疫分析和成像领域中已经充分发展，一般来说，大部分适用于所述方法的任何标记都可以应用于本发明技术。因此，标记是通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组合物。有用标记包含磁珠(例如，DynabeadsTM)；荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明等)；放射性标记(例如，3H、14C、35S、125I、121I、112In、99mTc)；其它成像剂，如微泡(用于超声成像)，18F、11C、15O(用于正电子发射断层摄影术)，99mTC、111In(用于单光子发射断层摄影术)；酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及常用于ELISA中的其它酶)；以及量热标记，如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠粒。描述这类标记的使用的专利包含美国专利第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；以及第4,366,241号，每个专利以全文引用的方式并且出于所有目的并入本文中。此外参看《荧光探针与研究化合物手册(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)》(第6版,俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene OR.))。
根据本领域中众所周知的方法，标记可以与所期望的分析组分直接或间接偶合。如上文所指示，可以使用各种标记，标记的选择取决于所需灵敏度、与化合物结合的容易性、稳定性要求、可用仪器以及处理规定。
非放射性标记通常通过间接手段连接。一般来说，配体分子(例如，生物素)被共价结合到分子。配体随后结合到抗配体(例如，抗生蛋白链菌素)分子，所述分子本身可检测或共价结合到信号系统，如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用多种配体和抗配体。当配体具有天然抗配体，例如生物素、甲状腺素以及皮质醇时，其可以结合经标记的天然存在的抗配体一起使用。或者，任何半抗原或抗原性化合物可以与LR004抗体组合使用。
所述分子还可以直接结合到信号产生化合物，例如通过与酶或荧光团结合。作为标记的相关酶将主要是水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶，或氧化还原酶，尤其是过氧化物酶。适用作标记部分的荧光化合物包含(但不限于)例如荧光素和其衍生物、罗丹明和其衍生物、丹酰、伞形酮等。适用作标记部分的化学发光化合物包含(但不限于)例如荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺(luminol)。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参看美国专利第4,391,904号。
检测标记的手段是本领域的技术人员众所周知的。因此，举例来说，当标记是放射性标记时，检测手段包含闪烁计数器或如自动射线照相术中的照相胶片。当标记是荧光标记时，其可以通过用适当波长的光激发荧光染料并且检测所得荧光来检测。荧光可以用肉眼、借助于照相胶片、通过使用电子检测器，如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增器等进行检测。类似地，酶标记可以通过提供酶的适当底物并且检测所得反应产物来检测。最后，单一比色标记可以通过观察与标记相关的颜色简单地检测。因此，在各种浸染棒法中，结合金通常呈现粉红色，而各种结合珠粒呈现珠粒的颜色。
III.制备LR004
LR004是特异性结合于人类EGFR的N端部分的重组人类/小鼠嵌合单克隆抗体。表2中给出LR004重链和轻链的序列。如上文所论述，所述序列根据药物库(寄存编号：DB00002)中所公布的西妥昔单抗序列进行修饰，并入五个氨基酸变化。
LR004抗体可以使用本领域中已知的方法在CHO细胞中制得。在这些细胞中制备所述抗体导致碳水化合物结构与在SP2/0细胞中制得的西妥昔单抗相比有两个差异。确切地说，LR004的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(NANA)，相反，西妥昔单抗的唾液酸是N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)。NANA被视为比NGNA更类似人类。另外，虽然西妥昔单抗含有高含量的有效寡糖免疫原半乳糖-α-1,3-半乳糖，LR004不含可检测量的这类碳水化合物结构。LR004的聚糖分布的免疫反应性比西妥昔单抗少得多，使其较安全用于投予人类受试者。此外，由于这些序列和翻译后差异，LR004展现在重复剂量治疗方案中血清半衰期比西妥昔单抗更长，并且热稳定性增加。
重组LR004抗体可以使用本领域中已知的方法在CHO细胞中表现。在一些实施例中，抗体是使用被引入宿主CHO细胞中的哺乳动物表现载体来表现。在一些实施例中，抗体由稳定地整合到宿主CHO细胞基因组中的重组序列表现。
编码LR004抗体的重组聚核苷酸构筑体通常将包含可操作地连接到抗体的编码序列的表现控制序列。因此，本发明技术的另一方面包含含有编码LR004抗体的一个或多个核酸序列的载体。制备不同种群的载体的方法已经由Lerner等人的美国专利第6,291,160号、第6,680,192号描述。
编码本发明技术的LR004抗体的核酸可以使用哺乳动物表现载体在CHO细胞中表现。哺乳动物表现载体的实例包含(但不限于)pCDM8(Seed,.《自然》329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》6:187-195,1987)。举例来说，常用启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒以及猿猴病毒40。适合于真核细胞的表现系统适用于表现LR004抗体。参看例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL)》第2版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,1989的第16章和第17章。
在另一方面，本发明提供一种CHO细胞，已经向其中引入包括LR004编码序列的哺乳动物表现载体。在一些实施例中，LR004编码序列存在于从CHO细胞的基因组分离的可复制载体上。在一些实施例中，LR004编码序列稳定地整合到CHO细胞的基因组中。
在表现后，LR004抗体可以使用本领域中已知的方法分离和纯化。抗体的生物活性可以使用本领域中已知并且本文中描述的方法确定。举例来说，抗体的生物活性可以通过评估抗体对EGFR的结合特异性、抗体在活体外或活体内抑制EGFR磷酸化的能力以及评估抗体对活体外或动物模型中肿瘤细胞增殖的影响在活体外确定。
IV.治疗方法
在一个方面，本发明提供治疗表现EGFR的癌症的方法，其包括向有需要的受试者投予LR004抗体，单独或与一种或多种额外治疗剂组合。在一些实施例中，一种或多种治疗剂包括蛋白质或肽，如酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、绿脓杆菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-α；或生物反应调节剂，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
在一些实施例中，治疗剂包括化学治疗剂，包含(但不限于)长春花生物碱、微管形成破坏剂(如秋水仙碱和其衍生物)、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂(如酪氨酸激酶抑制剂)、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物(如核苷类似物)、烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇(如全反式视黄酸或其衍生物)、格尔德霉素或其衍生物(如17-AAG)以及本领域中公认的其它标准化学治疗剂。
在一些实施例中，化学治疗剂包含以下一种或多种：阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物(例如，紫杉醇、太平洋紫杉醇和其衍生物、多西紫杉醇(taxotere)和其衍生物等)、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、卡培他滨、 拉帕替尼、索拉非尼、埃罗替尼、其衍生物、本领域中已知的化学治疗剂等。在一些实施例中，化学治疗剂是包括含硫代秋水仙碱衍生物和载体蛋白(如白蛋白)的纳米颗粒的组合物。
在一些实施例中，化学治疗剂是抗肿瘤剂，包含(但不限于)卡铂、(长春瑞滨)、蒽环霉素拉帕替尼(GW57016)、吉西他滨卡培他滨顺铂、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、表阿霉素、环磷酰胺、 等。
本文提及的化学治疗剂适用于化学治疗剂或其衍生物，并且因此本发明技术包含这些实施例(试剂；试剂或衍生物)中的任一个。化学治疗剂或其它化学部分的“衍生物”或“类似物”包含(但不限于)结构上类似于所述化学治疗剂或部分或一般化学类别与所述化学治疗剂或部分相同的化合物。在一些实施例中，化学治疗剂或部分的衍生物或类似物保留所述化学治疗剂或部分的类似化学和/或物理特性(包含例如功能性)。
在一个方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括判定受试者是否对西妥昔单抗过敏或容易对西妥昔单抗具有过敏反应。在一些实施例中，所述方法包括判定抗西妥昔单抗IgE是否存在于受试者血清中。在一些实施例中，所述方法包括判定抗半乳糖-α-1,3-半乳糖(Galα1,3Gal)IgE是否存在于受试者血清中。在一些实施例中，抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE是通过ELISA测量。在一些实施例中，抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE是使用放射变应原吸附试验测量。在一些实施例中，抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE是使用测量。
通过ELISA检测抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE可以使用本领域中已知的协议进行，如Plum等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》286(50):43103-43111(2011)；Mariotte等人,mAbs 3(4):396-401(2011)；以及Chung等人,《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》358(11):1109-1117(2008)中所公开的那些方案。举例来说，Galα1,3Gal或西妥昔单抗本身可以用作包衣试剂，为IgE结合提供固定决定子。结合于固定决定子的抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE可以使用IgE特异性二级抗体和适于发展和/或定量标记的手段来检测。
患者样品可以与使用适当血清和/或生物化学试剂制备的阳性和阴性对照进行比较。举例来说，阴性对照可以使用已知缺乏西妥昔单抗过敏的受试者的血清制备，阳性对照使用已知具有西妥昔单抗过敏的受试者的血清制备。西妥昔单抗过敏的定义和分级可以基于国家癌症研究所(National Cancer Institute)《常见毒性标准(Common ToxicityCriteria)》3.11,16版中列出的症状，其给出1级反应的特征是发热低于38℃(100.4°F)的暂时面红或皮疹；2级反应的特征是有或没有超过38℃发热的皮疹或面红、荨麻疹以及呼吸困难；3级的特征是皮疹、呼吸困难以及低血压；以及4级的特征是过敏反应。
如本领域中已知，具有血清抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3GalIgE的受试者比不具有所述IgE的受试者对西妥昔单抗的严重过敏发病率更高。因此，受试者的抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3GalIgE的含量可以充当如下指示：受试者是否已经具有或容易具有严重的西妥昔单抗过敏，以及受试者是否是用于用西妥昔单抗治疗的候选人。与抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE的含量不高于阴性对照的受试者相比，抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE的含量高于阴性对照指示受试者的西妥昔单抗过敏风险升高。
在一些实施例中，西妥昔单抗过敏风险增加的受试者的血清抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE含量比西妥昔单抗过敏风险未增加的受试者高至少约1到至少约99百分比。在一些实施例中，受试者的抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE含量比西妥昔单抗过敏风险未增加的受试者高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99百分比。
在一些实施例中，西妥昔单抗过敏风险增加的受试者的血清抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE含量高出至少约1到至少约100倍。在一些实施例中，受试者的抗西妥昔单抗IgE或抗Galα1,3Gal IgE含量比西妥昔单抗过敏风险未增加的受试者高至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99倍。
LR004抗体可以并入适于向有需要的受试者投予用于治疗表现EGFR的癌症的药物组合物中。药物组合物一般包括抗体以及呈适于特定投予途径的形式的药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂部分地通过所投予的特定组合物以及通过用于投予组合物的特定方法来确定。因此，存在用于投予抗体组合物的药物组合物的多种合适的调配物(参看例如，《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,马克出版公司(MackPublishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA)第18版,1990)。药物组合物一般调配为无菌、实质上等渗并且完全符合美国食品和药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)的所有良好生产规范(GMP)规定。
术语“药学上可接受的”、“生理学上可耐受的”以及其语法变化形式在其指组合物、载剂、稀释剂以及试剂时可互换使用，并且表示所述物质能够向受试者投予或投予到受试者而不会产生将禁止组合物的投予的程度上的不期望的生理作用。举例来说，“药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备一般安全无毒并且所期望的药物组合物的赋形剂，并且包含对于兽用以及对于人类药物使用可接受的赋形剂。这类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下是气态的。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并且具有所期望的药理学特性的盐和酯。这类盐包含可以在存在于抗体中的酸性质子能够与无机或有机碱反应时形成的盐。合适的无机盐包含与例如钠和钾、镁、钙以及铝的碱金属形成的盐。合适的有机盐包含与如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等有机碱形成的盐。这类盐还包含与无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、顺丁烯二酸以及链烷磺酸和芳烃磺酸，如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包含由存在于抗体中的羧基、磺酰基氧基以及膦氧基形成的酯，例如C1-6烷基酯。
这类载剂或稀释剂的优选实例包含(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、右旋糖溶液以及5％人类血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒剂，如不挥发性油。这类介质和化合物用于药学活性物质的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规介质或化合物与所述抗体不相容，否则涵盖其在组合物中的使用。还可以将补充活性化合物并入组合物中。
本发明技术的药物组合物被调配成与投予途径相容，并且预期投予途径如非经肠、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌肉内途径或呼吸道投予。
在一些实施例中，调配物局部直接投予到患病组织。在一些实施例中，调配物是全身性地投予。在一些实施例中，调配物以大丸剂形式投予。在一些实施例中，投予调配物用于时间释放递送。
用于非经肠、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。可以将非经肠制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于可注射使用的药物组合物包含用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液(在可溶于水时)或分散液和无菌粉末。对于静脉内投予，合适的载剂包含生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(新泽西州派西派尼的巴斯夫(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是达到存在容易可注射性的程度的流体。其必须在制造和存储条件下稳定并且必须被保存以免微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可以例如通过使用如卵磷脂的包衣，通过维持所需粒度(在分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌化合物实现，所述化合物例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选的是在组合物中包含等渗化合物，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)达成。
无菌可注射溶液可以通过将所述抗体以所需量与以上所列举的成分中的一者或组合并入适当溶剂中，视需要随后过滤灭菌来制备。一般来说，分散液通过将所述抗体并入含有碱性分散介质和来自以上所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所期望的成分的粉末。本发明技术的试剂可以积存注射或植入式制剂形式投予，其能够以允许活性成分的持续或脉冲释放的方式调配。
口服组合物一般包含惰性稀释剂或可食用载剂。其可以被密封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。出于口服治疗投予的目的，LR004抗体或抗体结合物可以与赋形剂合并，并且以片剂、锭剂或胶囊形式使用。口服组合物还可以使用适用作漱口水的流体载剂制备，其中在流体载剂中的化合物经口施用并且漱口并吐掉或吞咽。可以包含药学上相容的结合化合物和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解化合物，如海藻酸、淀粉羟基乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或斯特罗特斯(Sterotes)；滑动剂，如胶态二氧化硅；甜味化合物，如蔗糖或糖精；或调味化合物，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入投予，所述抗体以气雾剂喷雾形式从含有合适的推进剂(例如气体，如二氧化碳)或喷雾器的加压容器或分配器递送。
还可以通过经粘膜或经皮手段全身性投予。对于经粘膜或经皮投予，在调配物中使用适于渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域中已知的，并且对于经粘膜投予，包含例如清洁剂、胆盐以及梭链孢酸衍生物。经粘膜投予可以通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。如本领域中一般已知，对于经皮投予，将所述抗体调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏。
抗体还能够以用于经直肠递送的栓剂(例如具有常规栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式制备为药物组合物。
在一个实施例中，抗体是用将保护抗体免于从身体快速消除的载剂，如控制释放调配物，包含植入物和微封装递送系统来制备。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这类调配物的方法将是本领域的技术人员显而易见的。所述物质还可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。还可以使用脂质体悬浮液(包含用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)作为药学上可接受的载剂。这些物质可以根据本领域的技术人员已知的方法制备，例如如美国专利第4,522,811号中所描述。
就投予简便性和剂量均匀性来说，尤其有利的是以单位剂型调配口服或非经肠组合物。如本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合，经计算以产生所期望的治疗效果的预定数量的抗体。本发明技术的单位剂型的规格由以下指示并且直接取决于以下：抗体的独特特征和要实现的特定治疗效果；以及在混配用于治疗受试者的抗体的领域中固有的局限性。
本发明技术的核酸分子可以插入载体中并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部投予(参看例如，美国专利第5,328,470号)或立体定向注射(参看例如，Chen等人,1994.美国国家科学院院刊91:3054-3057)向受试者递送。基因治疗载体的药物制剂可以包含基因治疗载体的可接受的稀释剂，或可以包括嵌入基因递送工具的缓释基质。或者，当完整基因递送载体可以由重组细胞(例如，反转录病毒载体)完整制得时，药物制剂可以包含产生基因递送系统的一种或多种细胞。药物组合物可以连同投药说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
在一个方面，本发明提供一种活体内肿瘤成像的方法，其包括向受试者投予一定量的与适于通过X射线照相术、NMR或ESR检测的可检测标记结合的LR004抗体。对于X射线照相术，合适标记包含发射可检测辐射的放射性同位素，如钡或铯。NMR和ESR的合适标记包含具有可检测旋转特征的标记，如氘，其可以使用本领域中已知的方法与所述抗体合并或结合。
将已经用适当的可检测成像部分，如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射物质或可通过核磁共振检测的物质标记的LR004抗体引入(例如，非经肠、皮下或腹膜内)受试者体内。应在本领域中理解，受试者的大小和所用的成像系统将决定需要产生诊断图像的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，所注射的放射能的数量通常将在约5到20毫居里99mTc范围内。经标记的LR004抗体随后将优先在含有特定靶多肽的细胞位置累积。举例来说，活体内肿瘤成像描述于S.W.Burchiel等人,《肿瘤成像：癌症放射性化学检测(Tumor Imaging:The Radiochemical Detection of Cancer)》13(1982)中。
本发明技术的LR004抗体适用于治疗表现EGFR的癌症，并且确切地说，适用于治疗不能够采取用西妥昔单抗治疗的受试者的表现EGFR的癌症。本发明技术的组合物和方法适用于治疗对于EGFR抑制有用的所有癌症，包含(但不限于)膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、胰腺癌以及前列腺癌。
当在活体内用于治疗时，LR004抗体以有效量(即，具有所期望的治疗效果的量)向受试者投予。剂量和给药方案将取决于存在于个体内的表现EGFR的疾病的程度，以及所讨论的特定疾病的特征。在一些实施例中，抗体在数天、数周、数月或数年的时程内重复投予直到获得所期望的治疗程度。
在一些实施例中，LR004抗体与一种或多种额外治疗剂结合投予。在一些实施例中，抗体和额外治疗剂对于表现EGFR的癌症的治疗显示协同效应。也就是说，抗体与治疗剂的组合导致比相对于例如促进肿瘤消退或抑制肿瘤生长的累加效应更大的效应。在一些实施例中，协同效应允许抗体和一种或多种额外试剂的投予剂量比在单独使用任一者时将有效的低。
通常，本发明技术的组合物的足以实现治疗性或预防性作用的有效量在每天每千克体重约0.000001mg到每天每千克体重约10,000mg的范围内。在一些实施例中，剂量范围是每天每千克体重约0.0001mg到每天每千克体重约100mg。在一些实施例中，组合物以每天约0.0001mg/kg到100mg/kg或约0.01mg/kg到5mg/kg的剂量范围投予。举例来说，剂量可以是每天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在每天1mg/kg到10mg/kg范围内。在一些实施例中，抗体的单剂量在每千克体重0.1微克到10,000微克范围内。在一些实施例中，载剂中的抗体浓度在每递送毫升0.2微克到2000微克范围内。说明性治疗方案需要每两周投予一次或每个月一次或每3到6个月一次。单剂量之间的时间间隔可以按周、月或年算。时间间隔也可以是不规则的，如通过测量受试者血液的抗体含量所指示。
在一些方法中，调整剂量以实现1-1000μg/ml并且在一些方法中25-300μg/ml的血浆抗体浓度。或者，调配物可以持续释放调配物形式投予，在此情况下，需要较不频繁投药。剂量和频率取决于抗体在受试者中的半衰期而变化。
在一些实施例中，有效量的LR004抗体将提供治疗益处而不对受试者造成实质性毒性。抗体的毒性可以通过细胞培养物或实验动物的标准制药程序，例如通过测定LD50(对50％群体的致死剂量)或LD100(对100％群体的致死剂量)来确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据可以用于制定在人类中使用无毒的剂量范围。本文所描述的抗体的剂量优选地处于包含在有极小毒性或无毒性的情况下的有效剂量的循环浓度的范围内。剂量可以取决于所用剂型和所用投予途径而在这个范围内变化。个别医师可以鉴于受试者的病状来选择准确的调配物、投予途径以及剂量。参看例如，Fingl等人,在《治疗学的药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)》中,第1章(1975)。
此外，在本发明技术的范围内的是包括用于治疗表现EGFR的癌症的LR004抗体的试剂盒。所述试剂盒可以含有适于特定投予途径的抗体的调配物以及任选地投予被封装在合适容器中的调配物的手段。所述试剂盒可以进一步包括用于使用试剂盒投予LR004抗体的说明书。
在一些实施例中，所述试剂盒包括LR004抗体以及一种或多种额外治疗剂或可检测标记的调配物。
实例
为了更充分说明本发明技术的优选实施例，呈现以下实例。这些实例决不应该解释为限制如由所附权利要求书所界定的本发明技术的范围。
实例1.抑制EGFR磷酸化
使用人类肺癌细胞系A549和下咽癌细胞系FaDu进行磷酸化分析和后续ELISA分析。在不同浓度的LR004或存在下在冰上用750ng/mL TGF刺激细胞1小时。在刺激之后，细胞用PBS洗涤并且用细胞溶解缓冲剂溶解以用于后续ELISA分析。通过用HRP结合的pTyr-4G10mAb探测来确定EGF受体EGFR\HER2\HER3的磷酸化，并且使用ELISA检测。
这些活体外分析的结果展现在两种肿瘤细胞系A549和FaDu中在所测试的所有浓度下LR004和都能够以类似程度抑制EGFR磷酸化(图1)。
实例2.LR004依赖性细胞介导的细胞毒性
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是针对肿瘤的治疗性单克隆抗体的重要作用机制。本研究的目的是判定LR004和是否可以介导针对活体外肿瘤细胞的ADCC。
从健康供体获得外周血单核细胞(PBMC)并且用作效应细胞。使用下咽癌细胞系FaDu作为靶细胞。将FaDu细胞以5×103个细胞/孔接种在96孔格式中。向个别孔中一式三份地添加不同浓度(0.01-10,000ng/mL)的LR004，并且以30:1的效应细胞:靶细胞比添加效应细胞并且在37℃下培育4小时，并且使用CytoTox 96非放射性细胞毒性分析检查ADCC。
结果展示于图2中。LR004诱导针对下咽癌FaDu细胞的显著ADCC活性。在效应:靶比是30:1并且LR004浓度是100ng/mL时，ADCC达到最高的抗肿瘤细胞毒性百分比。在LR004参考对照样品(LR004-201307001)和本体溶液(LR004-034-201304002)中在所检查的所有浓度(0.01-10,000ng/mL)下健康供体PBMC的ADCC活性百分比类似地响应于LR004和此外，在针对肿瘤细胞FaDu的LR004介导的ADCC中存在剂量依赖性，证实LR004和的类似抗肿瘤作用机制。
用LR004进行的主要药理学研究包含在无细胞系统中在可溶性人类EGFR和表现EGFR的细胞下的结合研究；使用EGFR阳性癌细胞系的活体外抗肿瘤活性研究；以及在EGFR阳性人类肿瘤异种移植模型中的活体内抗肿瘤活性。
实例3.LR004结合特异性和亲和力
A.如通过ELISA所测量的与固定受体的结合
通过ELISA在活体外评估LR004的结合特异性。将经纯化的EGFR、HER2以及HER3涂布在微量培养板上并且随后阻断。将LR004参考物质(LR004-RS-201307001)、三批LR004本体溶液(LR004-034-201304002、LR004-034-201304004、LR004-034-201305005)以及和不相关抗体对照hIgG1单独地稀释到2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL以及0.128ng/mL，并且添加到含有固定抗原的孔中。培养板在37℃下培育30分钟并且洗涤。用HRP标记的二级抗体和TMB底物检测LR004或与固定抗原的结合。
如图3中所展示，LR004和仅结合EGFR抗原而非HER2或HER3抗原，表明预期的EGFR标靶的特异性高。LR004展现几乎与相同的对于EGFR的结合亲和力。
B.如通过BIAcore所测量的与可溶性EGFR的结合
通过表面等离子共振(SPR)和ELISA确定LR004与sEGFR的结合亲和力，并且与的结合亲和力进行比较。在SPR分析中，使LR004或固定到CM5BIAcore传感器芯片，去除非交联蛋白质并且阻断未反应位点。使浓度是8nM、16nM、32nM、64nM以及128nM的经纯化的重组人类sEGFR蛋白连续流经传感器表面。运行之间的芯片表面用10mM甘氨酸-盐酸(pH 2.5)再生。
在ELISA中，再次使sEGFR固定到微量培养板的孔。稀释LR004或并且添加到用sEGFR涂布的孔中。在37℃下培育1小时之后，洗涤培养板。用HRP标记的抗人类Fc单克隆抗体和TMB底物检测LR004或与固定sEGFR的结合。在450nm波长下测定每个孔的光密度(OD)。使用这种方法，LR004和的Kd值分别是3.23nM和3.5nM(图4和表4)。
使用表面等离子共振(SPR/BIAcore)，发现sEGFR以2.80nM Kd值结合于固定LR004，类似于对于的结合所观察(Kd＝3.88nM)(参看下表4)。
表4LR004和与人类EGFR的结合亲和力
C.如通过流式细胞术测量的结合细胞表面EGFR
在具有不同EGFR表现水平的九个肿瘤细胞系中通过流式细胞术评估LR004与细胞表面EGF受体的结合。使用市售作为用于这些实验的比较剂。将细胞浓度调整到2×106个细胞/毫升，并且使用1×105个细胞进行结合分析。添加两种不同浓度(200ng/mL和1000ng/mL)的LR004或到细胞中，并且在4℃下共同培育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并且与RPE结合山羊抗人类IgG一起在4℃下培育。洗涤细胞并且再悬浮于250mL PBS中用于流式细胞分析。记录荧光强度的几何平均值(G-平均值)并且用于数据分析。
如图5中所展示，在具有不同的EGFR表现水平的九个不同肿瘤细胞系中检测LR004与EGF受体的结合，所述细胞系包含胃癌细胞系MKN28、表皮样癌细胞系A431、下咽癌细胞系FaDu、结肠直肠腺癌细胞系COLO205、胰腺腺癌细胞系AsPC-1、肝细胞癌细胞系HepG2和7402、乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7。在MDA-MB-468乳腺癌细胞和A431表皮样癌细胞系中观察到最显著的结合。在所检查的所有肿瘤细胞系中LR004与EGFR的结合活性类似于表明两种抗体可以在EGFR结合位点共享类似结构域。
随后使用高EGFR表现细胞系MDA-MB-468、FaDu以及A431作为用于LR004结合研究的靶细胞。在第一个实验中，LR004是FITC标记的，并且使用未标记作为竞争配体。在第二系列实验中，是类似地FITC标记的并且使用LR004作为竞争配体。在每种情况下，将细胞浓度调整到2×106个细胞/毫升并且在1×105个细胞中进行结合分析。使相同体积的FITC结合LR004与不同浓度的或人类IgG1mAb(80μg/mL、16μg/mL、3.2μg/mL、0.64μg/mL、0.128μg/mL以及0μg/mL)混合，并且添加到高EGFR表现靶细胞中。在冰上培育1小时之后，用含有0.2％BSA的冷PBS洗涤细胞。洗涤细胞并且再悬浮于250μL PBS中用于流式细胞分析。
如图6中所展示，展示与LR004竞争结合于表现EGFR的细胞系。LR004与靶细胞表面EGF受体的结合由以剂量依赖性方式消除。高剂量治疗(20μg/mL)几乎完全阻断FITC结合LR004结合。相比之下，对照mAb(人类IgG1)可以不阻断LR004与EGF受体的结合，表明LR004可以识别EGF受体与的类似配体结合表位。对于LR004结合受抑制所计算的IC50值展示于表5中。
表5在三个癌细胞系中对FITC标记LR004的抑制
使用不同方法，选择MDA-MB-468作为用于LR004对标记结合的抑制的靶细胞系。在1×105个肿瘤细胞中进行结合分析。使FITC结合与不同浓度的LR004或人类IgG1mAb(80μg/mL、16μg/mL、3.2μg/mL、0.64μg/mL、0.128μg/mL以及0μg/mL)混合，并且添加到MDA-MB-468细胞中。在冰上培育1小时之后，用含有0.2％BSA的冷PBS洗涤细胞。使细胞再悬浮并且通过流式细胞分析来分析。
如图7中所展示，展示LR004与竞争结合MDA-MB-468。与靶细胞表面EGF受体的结合由LR004以剂量依赖性方式消除。高剂量治疗(20μg/mL)几乎完全阻断FITC结合LR004到达受体。相比之下，对照mAb(人类IgG1)可以不阻断LR004与EGF受体结合。本研究中的结果类似于在用标记LR004的前述实验中所观察到的结果，表明LR004和识别EGF受体的相同配体结合表位。
实例4.LR004活体外抗肿瘤活性
此外，在活体外直接检查LR004的抗肿瘤活性。在本研究中测试四个人类癌细胞系，包含乳腺癌细胞MDA-MB-468、结肠癌细胞LoVo、下咽癌细胞FaDu以及表皮样癌细胞A431。
在第一个研究中使用MDA-MB-468和LoVo。使每个细胞系(5,000个细胞)培育过夜。丢弃肿瘤细胞系的培养上清液，并且添加不同浓度的LR004或在37℃下培育48小时之后，添加20μL CCK-8混合底物到每个孔中并且在37℃下培育3小时。使用微量培养板读取器测定OD450nm。
在另一实验中，使FaDu和A431(5,000个细胞)与不同浓度的LR004或一式三份地在96孔平底培养板中一起培育。在37℃下培育96小时之后，添加底物到每个孔中并且在黑暗中培育10分钟。使用化学发光方法测定RLU(相对化学发光单位)。如下计算抑制比(IR)：IR(％)＝[未治疗细胞的RLU值-经治疗细胞的RLU值]/(未治疗细胞的RLU值)
结果展示于图8中。在四个所选细胞系中MDA-MB-468是对抗体最敏感的细胞系，并且A431和FaDu的反应较弱。两种抗体都能够以类似程度抑制每个细胞的增殖，表明LR004具有类似于的活体外抗肿瘤活性。
实例5.LR004活体内抗肿瘤活性
使用BALB/c裸鼠用于在LR004和的情况下的人类肿瘤异种移植研究。使用一小组五只小鼠建立荷瘤小鼠。虽然人类结肠癌细胞系GEO和人类肺癌细胞系A549都用于异种移植模型发展，此处仅呈现在GEO细胞系情况下的结果。将肿瘤细胞皮下注射到裸鼠的右后侧。当肿瘤已经达到400-600mm3体积时，选择具有良好肿瘤和健康状况的荷瘤小鼠。移出肿瘤并且切成大小是2-3mm3的小块，并且皮下接种到裸鼠的右后侧。当肿瘤体积生长到100-300mm3时，以10只小鼠/组将小鼠随机分配到LR004或的对照、低、中以及高剂量组。每周两次静脉内给药小鼠。每周两次用测径规测量肿瘤尺寸，并且测量在安乐死之后的肿瘤重量并且计算每个组的肿瘤重量抑制率。结果被认为在抑制率≤60％时是阴性的，在抑制率>60％时是阳性的。
图10展示高剂量(100-200mg/kg LR004)和100mg/kg对所建立的GEO人类结肠癌异种移植的活体内抗肿瘤作用。每周两次给药小鼠持续三周。
在接下来的实验中，在LR004下进行剂量反应并且再次使用高剂量作为对照。在这个实验中，小鼠接受每周两次100mg/kg/剂量或25、50或100mg/kg/剂量LR004的注射持续四周。每个组由8只小鼠组成。
结果展示于图10中。LR004和都在两个研究中显著减小肿瘤体积。再次重复第二个实验，在所有剂量的LR004和的情况下有非常类似的结果和完全肿瘤抑制。在这些实验中使用的两种抗体之间或不同剂量的LR004之间没有显著差异。
实例6.LR004药效学
除了这些最初完成的活体外和活体内药理学研究之外，将如表6和表7中所展示来评估LR004对抗几种其它不同的表现EGRF的肿瘤类型的功效，所述肿瘤类型包含SW948结肠直肠腺癌、A431表皮样癌以及MDA-MB-468乳腺癌肿瘤细胞系。
表6在活体内小鼠异种移植模型中评估的表现EGFR的肿瘤类型
·GEO结肠癌 ·SW948结肠直肠腺癌
·A431表皮样癌 ·MDA-MB-468乳腺癌
将在BALB/c裸鼠中进行在GEO、SW948以及A4331肿瘤细胞系的情况下的研究，并且(将在NOD SCID小鼠中评估MDA-MB-468肿瘤)。实体肿瘤最初将在小组BALB/c裸鼠中在活体内生长。当肿瘤生长到400-600mm3时，将切下肿瘤并且切成2-3mm3的小块并且皮下接种到小组小鼠中。当肿瘤生长到100-300mm3时，将使小鼠随机分组，并且小鼠将被每周两次静脉内给药媒剂、(剂量TBD)或低、中或高剂量的LR004持续4周。小鼠在肿瘤细胞移植之后将被观察长达4周，并且将测量和计算肿瘤体积。将在最终牺牲之后测量肿瘤重量，并且将计算每个治疗组相对于对照的抑制率或效果。结果将被认为在抑制率≤60％时是阴性的，并且将被认为在抑制率>60％时是阳性的。以下呈现在这些细胞系的情况下主要研究的总体设计。
表7在LR004的情况下活体内药效学肿瘤异种移植研究
对于每种肿瘤类型N＝2，这四种肿瘤类型的50只小鼠的每个研究将重复一次。在10只雄性的群组的每个主要研究之前，将使用5只雄性小鼠的群组用LR004和以及低和高剂量的LR004以及已知有效剂量的进行较小初步研究。这些明确的功效研究的结果将用于测定LR004的后续重复剂量安全性研究的剂量范围。
实例7：药理学
A.LR004在食蟹猴中的药物动力学
如表8中所展示在小组雄性食蟹猴中进行初步药物动力学(PK)研究。两只雄性猴以1小时静脉内输液形式给药18mg/kg LR004。第二组两只猴类似地给药18mg/kg 如下表8中所描述。在给药后的指定时间点到24天(577小时)收集血液样品，并且制备血清样品并通过如上文所描述的经验证的ELISA分析LR004或浓度。
表8LR004和在猴中的初步药物动力学研究
在雄性食蟹猴中单次给药静脉内输液18mg/mL之后，LR004和的动力学几乎相同。和LR004的Cmax值分别介于403到423，1小时Tmax对应于1小时输液结束。如通过AUC水平所评估的曝光几乎相同(30-32mg·hr/L)。半衰期值也非常类似，并且和LR004的半衰期值分别是133-137小时。如图11和表9中所展示，LR004展现动力学与市售产品已经建立的动力学一致。
表9在1小时静脉内输液之后LR004和的药物动力学参数
B.在单次和重复静脉内给药的情况下LR004在猴中的药物动力学
将每个性别六只食蟹猴的群组用单次18mg/kg给药或重复静脉内给药在第1天、第21天、第28天以及第35天治疗，或用单次给药6mg/kg、18mg/kg或54mg/kgLR004或重复静脉内给药18mg/kgLR004在第1天、第21天以及第35天治疗，如表10中所展示。在给药之前并且对于给药6mg/kg的猴子在0.33、0.671、2、3、5、9、13、25、49、97、145、193、241小时(10天)、在给药18mg/kg之后长达18天、给药54mg/kg长达28天，从每只动物收集血液样品并且制备血清样品。对于重复给药18mg/kg LR004或的猴子，在第35天最终给药之后长达22天(529小时)收集血液样品，如表10中所呈现。使用经验证的ELISA方法分析血清样品的LR004或浓度。
表10LR004和在食蟹猴中的单次和重复静脉内给药PK/TK研究的设计
在向雄性和雌性食蟹猴单次给药静脉内投予6mg/kg、18mg/kg或54mg/kg的LR004之后，观察这种抗体的剂量依赖性血清曝光和一级血清动力学(图12)。6mg/kg和54mg/kg剂量水平的最大血清浓度(Cmax)分别介于148μg/mL到992μg/mL。所观察到的Tmax在所有三个剂量水平下是大约1小时，并且在本实验中测定的LR004的半衰期随着剂量而增加并且介于在6mg/kg下的51小时到在18mg/kg下的98小时到在54mg/kg下的116小时(表11)。然而，如通过AUC值所确定的总曝光是相对与剂量成比例的，并且清除率相对一致并介于0.7到0.8mL/hr·kg。在食蟹猴中，这些所观察到的18mg/kg剂量水平的参数与在这个相同剂量水平下所测定的的参数一致。
表11向食蟹猴单次静脉内给药投予LR004的药物动力学参数
在重复给药18mg/kg(在第1天、第21天、第28天以及第35天4剂)LR004和的情况下，两种抗体都展现一致的动力学并且不展现随时间推移显著累积，但在第21天、第28天以及第35天给药后不久峰值血清含量(对于LR004)稍高(图13)。
这些血清含量并不明显地不同于在静脉内给药18mg/kg之后所观察到的血清含量。在第一次给药之后两种化合物的动力学的比较展示LR004的分布体积(VD)相对于仅稍大，并且Cmax和AUC(0-∞)稍低。然而，截至第4次给药，两种产品之间的Cmax和AUC值类似，但在第4次给药之后LR004展示与相比VD更高并且半衰期更长。下表12中呈现在本研究中LR004或的第一次和最后一次(第4次)给药的药物动力学参数。
表12在食蟹猴中第一次和最后一次(第4次)静脉内给药18mg/kg LR004和的PK参数
实例8：LR004碳水化合物结构
A.反相高效液相色谱法
使用11.5％(v/v)乙酸进行LR004和的酸水解，并且在80℃下培育60分钟。在Milli Q H2O中由含有0.619mg/mL NANA和0.651mg/mL NGNA的储备溶液制备唾液酸标准品。对每种样品一式三份地进行DMB(4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐)标记反应。标记反应是通过组合10μL或40μL(0.3-0.6μg，取决于蛋白质浓度)酸水解蛋白质与200μL DMB标记溶液(7mM DMB、1.4M乙酸、0.75Mβ-巯基乙醇以及18mM连二亚硫酸钠)在55℃下进行3h。通过将50μL等分成1mL Milli Q H2O并且涡旋来淬火反应物。取决于蛋白质浓度，注射25-100μL(3-9ng)用于反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析。
使用具有0.5μm柱前过滤器的3.0mm×100mm，3.5μm Xbridge HPLC柱进行RP-HPLC。荧光检测器被配置成用于在373nm下激发和在448nm下发射。柱温是30℃，并且自动进样器被设置为4℃。流动相A是7％甲醇/93％MilliQ H2O(v/v)并且B是7％甲醇/50％乙腈/43％MilliQ H2O，并且流速是0.4mL/min，其中梯度展示于表13中。
表13LR004唾液酸分析的RP-HPLC梯度
时间(分钟) ％B
0 9
3 9
6 12
12 15
20 40
23 100
24 100
25 9
30 9
结果展示于图14中。图14A展示NGNA和NANA标准峰分别在小于6分钟和大于6分钟时的迁移。图14B展示LR004衍生的唾液酸对应于NANA在大于6分钟时的迁移。相比之下，衍生的唾液酸对应于NGNA在小于6分钟时迁移。
B.Neu5Gc(N-羟乙酰神经氨酸(NGNA))的ELISA检测
将和LR004稀释到100μg/mL，并且以2.5微克/孔、5.5微克/孔以及10微克/孔添加到微量滴定板中。使培养板在4℃下涂布过夜。用PBST洗涤孔三次，并且用200μl0.5％PBST在室温下阻断1小时。使孔与1:1000鸡抗Neu5Gc IgY或IgY同型对照一起在室温下培育2小时，用PBST洗涤五次，并且与1:1000驴抗鸡IgY-Fc-HRP一起在室温下培育1小时。在洗涤之后，孔用TMB底物显影并且通过添加10％H2SO4终止。在450nm下测量吸光度。
表14通过ELISA测定的LR004和Neu5Gc含量(OD450nm)
结果展示于表14和图15中。样品展示Neu5Gc含量是阴性对照的1.87-1.97倍。相比之下，LR004展示Neu5Gc含量类似于阴性对照。
实例9：LR004的热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)测定LR004的热稳定性。在浓度是5mg/ml的调配缓冲剂(100mM NaCl、100mM甘氨酸、0.01％聚山梨醇酯80、10mM柠檬酸，pH 5.5)中制备LR004和在SII Seiko-DSC上使用标准协议进行DSC。使所有样品在分析之前脱气5分钟。用调配缓冲剂填充参考单元。以60℃/小时速率将样品从4℃加热到100℃。
结果展示于图16中。图16A展示LR004具有88.84℃熔点。图16B展示具有85.28℃熔点。因此，LR004的热稳定性程度比更高。
等效物
本发明不限于在本申请中所描述的特定实施例，所述实施例仅打算说明本发明的个别方面。如本领域的技术人员将显而易见，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行许多修改和改变。除了本文所列举的方法和设备之外，本领域的技术人员根据前述描述还将显而易见在本发明范围内的功能上等效的方法和设备。这类修改和改变打算属于所附权利要求书的范围内。本发明仅受限于所附权利要求书各权项以及所述权利要求书所授权的等效物的整个范围。应理解，本发明不限于特定方法、试剂、化合物组合物或生物系统，当然这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不打算作为限制。

Claims (15)

1.一种抗体，其包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
所述抗体包括N-乙酰神经氨酸并且缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖；
所述抗体序列的重链的Asn88和Asn302位点存在N-乙酰神经氨酸。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与可检测标记结合。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述可检测标记包括放射性核素。
4.根据权利要求2所述的抗体，其中所述可检测标记包括荧光标记。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种额外治疗剂结合。
6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述一种或多种额外治疗剂包括化学治疗剂。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述化学治疗剂选自由以下组成的群组：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、Herceptin®、长春瑞滨、Doxil®、卡培他滨、Alimta®、Avastin®、Velcade®、Tarceva®、Neulasta®、拉帕替尼、索拉非尼以及埃罗替尼。
8.一种组合物，其包括根据权利要求1所述的抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其进一步包括选自由以下组成的群组的化学治疗剂：长春花生物碱、微管破坏剂、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇、格尔德霉素或其衍生物、阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、小红莓、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、Herceptin®、长春瑞滨、Doxil®、卡培他滨、Alimta®、Avastin®、Velcade®、Tarceva®、Neulasta®、拉帕替尼、索拉非尼以及埃罗替尼。
10.一种中国仓鼠卵巢CHO细胞，其包括编码根据权利要求1所述的抗体的核酸。
11.根据权利要求10所述的中国仓鼠卵巢CHO细胞，其中所述核酸存在于从中国仓鼠卵巢CHO细胞基因组分离的可复制载体上。
12.根据权利要求10所述的中国仓鼠卵巢CHO细胞，其中所述核酸稳定地整合到所述中国仓鼠卵巢CHO细胞基因组中。
13.权利要求1所述的抗体在制备治疗癌症的药物中的用途。
14.一种制备根据权利要求1所述的抗体的方法，其包括使中国仓鼠卵巢CHO细胞与编码SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核酸接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸稳定地整合到所述CHO细胞的基因组中。
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