KR100856446B1 - Ｃｔｌａ－４에 대한 인간 단일클론 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따라서, 인간 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4)에 대한 완전한 인간 단일클론 항체가 제공된다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이를 구성하는 아미노산 서열, 구체적으로 특히 FR1 내에 및/또는 CDR1 내지 CDR3 및/또는 FR4내에서 유래한 상보성 결정 영역(CDR)에 걸쳐있는 인접 중쇄 및 경쇄 서열이 제공된다. 본 명세서에 개시된 항체와 유사한 결합 특성을 보유한 항체 및 유사한 기능성을 보유한 항체(또는 기타 길항제)가 제공된다.

없음.

Description

ＣＴＬＡ－４에 대한 인간 단일클론 항체{HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO CTLA-4}

도 1은 본 발명에 따른 중쇄 및 카파 경쇄 면역글로불린 분자의 일련의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다: 4.1.1(도 1A), 4.8.1(도 1B), 4.14.3(도 1C), 6.1.1(도 1D), 3.1.1(도 1E), 4.10.2(도 1F), 2.1.3(도 1G), 4.13.1(도 1H), 11.2.1(도 1I), 11.6.1(도 1J), 11.7.1 (도 1K), 12.3.1.1(도 1L), 및 12.9.1.1(도 1M).

도 2는 클론 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1에서 유래한 추정 중쇄 아미노산 서열과 배선 DP-50(3-33) 아미노산 서열 사이의 서열 정렬을 제공한다. DP-50 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 음영을 넣어 도시한다.

도 3은 클론 2.1.3의 추정 중쇄 아미노산 서열과 배선 DP-65(4-31) 아미노산 서열의 서열 정렬을 제공한다. D-65 배선 서열과 클론내 서열 간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 도시한다.

도 4는 클론 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2, 및 4.13.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A27 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. A27 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 표시한다. 클론 4.8.1, 4.14.3, 및 6.1.1의 CDR1에서의 명백한 결실은 "0s"로 표시되어 있다.

도 5는 클론 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 및 11.7.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 0l2 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. 012 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 표시한다.

도 6은 클론 2.1.3의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 Al0/A26 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. Al0/A26 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 표시한다.

도 7은 클론 12.3.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A17 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. A17 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 표시한다.

도 8은 클론 12.9.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A3/A19 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. A3/A19 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 표시한다.

도 9는 항체의 중쇄 및 경쇄의 직접적인 단백질 서열 결정을 통해 형성된 N-말단 아미노산 서열을 요약한 것이다.

도 10은 본 발명의 특정 항체에 관한 일부 부가적인 특성 정보를 제공한다. 도 10A에는, 클론 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3, 및 6.1.1에 관련된 데이타가 요약되어 있다. 농도, 등전점 전기 영동(IEF), SDS-PAGE, 크기 배재 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피/질량 분광기(LCMS), 질량 분광기(MALDI), 경쇄 N-말단 서열과 관련된 정보가 제공된다. IEF와 관련된 추가의 상세한 정보는 도 10B에, SDS-PAGE와 관련된 것은 도 10C에, 4.1.1 항체의 SEC와 관련된 것은 10D에 제시되어 있다.

도 11은 항-CD80-PE mAb 및 항-CD-86-PE mAb를 사용한 라지(Raji) 세포상의 B7-1 및 B7-2의 발현을 도시한다.

도 12는 항-CTLA-4 차단 항체(BNI3, 4.1.1, 4.8.1, 및 6.1.1)가 유도하는 T 세포 아세포/라지 분석에서 IL-2 생성의 농도 의존성 증가를 도시한다.

도 13은 항-CTLA-4 차단 항체(BNI3, 4.1.1, 4.8.1 및 6.1.1)가 유도하는 T 세포 아세포/라지 분석(동일한 공여 T 세포)에서 IFN-γ 생성의 농도 의존성 증가를 도시한다.

도 14는 T 세포 아세포/라지 분석에서 항-CTLA-4 차단 항체가 유도하는 6개의 공여체 유래의 T 세포에 있어서 IL-2 생성의 평균 증가를 도시한다.

도 15는 T 세포 아세포/라지 분석에서 항-CTLA-4 차단 항체가 유도하는 6개의 공여체 유래의 T 세포에 있어서 IFN-γ생성의 평균 증가를 도시한다.

도 16은 SEA 자극 72 시간 후에 측정한 경우 항-CTLA-4 차단 mAb가 유도하는 5개의 공여체 유래의 hPBMC에서 IL-2의 생성 증가를 도시한다.

도 17은 SEA 자극 72 시간 및 96 시간 후에 측정한 경우 항-CTLA-4 차단 mAb가 유도하는 3개의 공여체 유래의 전혈 중 IL-2의 생성 증가를 도시한다.

도 18은 쥐 섬유종 종양 모델에서 항-쥐 CTLA-4 항체를 이용한 종양 성장 억제를 도시한다.

도 19는 72시간 T 아세포/라지 및 초항원(6개의 공여체 유래의 전혈 및 말초 혈액 단핵세포) 분석에서 본 발명의 항-CTLA-4 항체(4.1.1 및 11.2.1)가 유도하는 IL-2의 생성 증가를 도시한다.

도 20은 72 시간 T 아세포/라지 분석에서 본 발명의 항-CTLA-4가 항체(4.1.1 및 11.2.1)가 유도하는 IL-2 생성의 용량 의존성 증가를 도시한다.

도 21은 100 ng/㎖ 초항원으로 자극한 72 시간 초항원 전혈 분석에서 본 발명의 항-CTLA-4 항체(4.1.1 및 11.2.1)가 유도하는 IL-2 생성의 용량 의존성 증가를 도시한다.

도 22는 다음 항-CTLA-4 항체 쇄의 일련의 추가적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다: 전길이 4.1.1 중쇄(cDNA 22(a), 게놈 22(b), 및 아미노산 22(c)), 전길이 탈글리코실화된 4.1.1 중쇄(cDNA 22(d) 및 아미노산 22(e)), 4.1.1 경쇄(cDNA 22(f) 및 아미노산 22(g)), 전길이 4.8.1 중쇄(cDNA22(h) 및 아미노산 22(i)), 4.8.1 경쇄(cDNA 22(j) 및 아미노산 22(k)), 전길이 6.1.1 중쇄(cDNA 22(l) 및 아미노산 22(m)), 6.1.1 경쇄(cDNA 22(n) 및 아미노산 22(o)), 전길이 11.2.1 중쇄(cDNA 22(p) 및 아미노산 22(q)), 및 11.2.1 경쇄(cDNA 22 (r) 아미노산 22(s)).

관련 출원의 전후 참조

본 출원은 본 명세서에서 전문을 인용한 1998년 12월 23일 출원된 미국 가명세서 특허 출원 일련번호 제60/113,647호에 대한 우선권을 주장한다.

발명의 개요

본 발명에 따라서, 인간 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4)에 대한 완전한 인간 단일클론 항체가 제공된다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이를 포함하는 아미노산 서열, 구체적으로 특히 FR1 내에 및/또는 CDR1 내지 CDR3 및/또는 FR4내에서 유래한 상보성 결정 영역(CDR)에 걸쳐있는 인접 중쇄 및 경쇄 서열이 제공된다. 또한, 본 명세서에 개시된 항체와 유사한 결합 특성을 보유한 항체 및 유사한 기능성을 보유한 항체(또는 기타 길항제)가 제공된다.

배경기술

환자의 면역 반응을 조절하면, 종래 약물의 사용을 통해 좀처럼 찾아지지 않는 작용 특이성을 초래하여 여러 인간 질병을 바람직하게 치료할 수 있다. 면역계 반응을 상향 조절 및 하향 조절하는 것이 가능하다. T 세포 및 B 세포의 역할은 광 범위하게 연구되어 오고 있으며, 면역 반응의 조절과 연루되어 있는 것이 특징이다. 이들 연구로부터, 대부분의 경우 T 세포의 역할은 질병의 예방 및 치료에 특히 중요한 것으로 보인다.

T 세포는 이들 세포간의 상호작용을 제어하는 매우 복잡한 시스템을 보유한다. T 세포 간의 상호작용은 그 처리를 위해 다수의 수용체 및 가용성 인자를 이용한다. 따라서, 면역 반응에서 임의의 특정 신호의 효과는 일반적으로 다양하며, 특정 인자, 수용체 및 그 경로와 관련된 반대 수용체에 따라 달라진다. 반응을 하향 조절하는 경로는 활성화에 필요한 경로 만큼이나 중요하다. T 세포 관용력을 초래하는 흉선 교육(education)은 특정 항원에 대한 면역 반응을 방지하는 하나의 메카니즘이다. 억제성 시토킨의 분비와 같은 기타 메카니즘도 공지되어 있다.

T 세포를 활성화시키려면 항원 수용체(T 세포 수용체(TCR))를 통한 자극 뿐 아니라 CD28과 같은 동시자극성 표면 분자를 통한 추가의 신호 전달이 있어야 한다. CD28에 대한 리간드는 B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86) 단백질인데, 이들 단백질은 T-세포 CD28 또는 CTLA-4와 상호작용하여 동시자극성 신호를 전달하는 수상 세포, 활성화된 B 세포 또는 단핵구와 같은 항원 제시 세포상에서 발현된다. 동시자극성 신호 전달의 역할은 Perrin 등[Immunol Res 14:189-99(1995)]에 의해 실험적인 알러지성 뇌척수염(EAE)에서 연구되었다. EAE는 미엘린 항원에 대해 유도된 Th1 세포가 유도하는 자가면역 질환으로서, 병리학적 면역 반응의 유도에 있어서 B7 매개성 동시자극의 역할을 연구하기 위한 생체내 모델을 제공한다. B7 수용체에 대한 가용성 융합 단백질 리간드와 CD80 또는 CD86에 대해 특이적인 단일클론 항체를 사용하 여, Perrin 등은 B7 동시자극이 EAE에서 임상적 질병 결과를 결정하는데 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다.

B7과 CD28간의 상호작용은 항원 특이적 T 세포의 성숙 및 성장을 촉발하는데 충분한 것으로 보이는 몇가지 동시자극 신호 전달 경로 중 하나이다. 동시자극의 결여와, 이에 수반되는 IL-2의 부적당한 생성으로 인하여 T 세포의 후속 증식이 억제되고 "아너지(anergy)"라고 불리우는 무반응 상태가 유도된다. 각종 바이러스 및 종양은 T 세포 활성화 및 증식을 차단하여, 감염되거나 형질전환된 세포에 대한 숙주 면역계의 불충분한 활성 또는 무반응성을 초래할 수 있다. 다수의 가능한 T 세포 장애 중에서, 아너지는 숙주가 병원성 세포 또는 종양원성 세포를 제거하지 못하는데 적어도 부분적으로는 관련되어 있을 수 있다.

항종양 면역성을 매개하는 B7 단백질의 용도는 Chen 등의 문헌[Cell 71: 1093-1102(1992)] 및 Townsend 및 Allison의 문헌[Science 259:368(1993)]에 개시되어 있다. Schwartz의 문헌[Cell 71:1065(1992)]에는 IL-2 생성 및 면역치료에 있어서 CD28, CTLA-4 및 B7의 역할이 검토되어 있다. Harding 등[Nature 356:607-609(1994)]은 CD28 매개성 신호 전달이 쥐 T 세포를 동시자극하고, T 세포 클론에서의 아너지 유도를 억제한다는 것을 입증하였다. 또한, 미국 특허 제5,434,131호, 제5,770,197호 및 제5,773,253호 및 국제 특허 출원 WO 93/00431호, WO 95/01994호, WO 95/03408호, WO 95/24217호 및 WO 95/33770호 참조.

전술한 내용으로부터, T 세포는 활성화와 효과기 작용으로의 후속되는 분화를 위해서 항원 제시 세포(APC)에서 유래한 2가지 종류의 신호를 필요로 하는 것은 확실하다. 첫번째 신호는 T 세포상의 TCR과 APC상의 MHC 분자 제시 펩티드 간의 상호작용으로 형성된 항원 특이적인 신호이다. 두 번째 신호는 B7 계열(B7-1(CD80) 또는 B7-2(CD86))의 구성원과 CD28의 상호작용으로 매개되는 항원에 독립적인 신호이다. 정확하게 CTLA-4가 면역 반응의 환경에 적합한 곳을 초기에는 파악하기 어렵다. 세포 독성 T 림프구상에서 우선적으로 발현되는 분자에 대한 조사의 일부로서 Brunet 등의 문헌[Nature 328: 267-270(1987)]에 따라 먼저 쥐 CTLA-4를 확인하고 클로닝하였다. 그 직후 Dariavach 등[Eur.J.Immunol. 18:1901-1905(1988)]이 인간 CTLA-4를 동정하고 클로닝하였다. 쥐 및 인간 CTLA-4 분자는 대략 76% 전체 서열 상동성을 보유하고, 세포질 도메인에서 완전한 서열 동일성에 근접한다(Dariavach 등 Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4는 단백질의 면역글로불린(Ig) 초과의 구성원이다. Ig 초과는 Ig 분자의 가변(V) 또는 불변(C) 도메인의 주요 구조적 특징을 보유하는 단백질군이다. Ig 초과의 구성원은 면역글로불린 그 자체, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 분자(즉, MHC 클래스 I 및 II)와 TCR 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

1991년에, Linsley 등[J. Exp. Med. 174:561-569(1991)]은 CTLA-4가 B7에 대한 제2 수용체임을 제안하였다. 유사하게, Harper 등[J. Immunol 147:1037-44(1991)]은 CTLA-4 및 CD28 분자가 서열, 메시지 발현, 유전자 구조, 및 염색체 위치에 관하여 마우스 및 인간에서 모두 밀접하게 관련되어 있음을 입증하였다. Balzano 등의 문헌[Int J Cancer Suppl 7:28-32(1992)] 참조. 또한, 이러한 역할의 증거는 기능 연구를 통해 드러난다. 예를 들어, Lenschow 등[Science 257:789-792 (1992)]은 CTLA-4-Ig가 췌장도 이식편의 장기간의 생존을 유도한다는 것을 입증하였다. Freeman 등[Science 262:907-909]은 B7 결핍 마우스에서 CTLA-4의 역할을 조사하였다. CTLA-4에 대한 리간드 조사는 Lenschow 등의 문헌[P.N.A.S. 90:11054-11058(1993)]에 개시되어 있다. Linsley 등의 문헌[Science 257:792-795(1992)]에는 가용성 형태의 CTLA-4에 의한 생체내 면역억제가 개시되어 있다. Linsley 등[J Exp Med 176:1595-604(1992)]은 CTLA-4를 결합시키고 CD28과 교차 반응하지 않는 항체를 제조하였으며, CTLA-4는 활성화된 T 림프구 상에서 CD28과 함께 동시발현되고, B7에 의한 활성화 및 T 세포 유착을 협력하여 조절한다고 결론내렸다. Kuchroo 등[Cell 80:707-18(1995)]은 B7-1 및 B7-2 동시자극 분자가 Th1/Th2 발생 경로를 차별적으로 활성화시킨다는 것을 입증하였다. Yi-qun 등[Int Immunol 8: 37-44(1996)]은 가용성 소환 항원에 대하여 최근 활성화된 메모리 T 세포를 휴지시킴으로써 B7 계열 구성원 유래의 동시자극성 신호에 대한 차별적인 조건이 있음을 확인하였다. Boer 등의 문헌[Eur J Immunol] 23:3120-5(1993) 참고.

일부 그룹은 CD28과 비교하여 CTLA-4에 대한 대안적인 또는 특징적인 수용체/리간드 상호작용을 제안하였으며, BB1 항체가 인식하는 제3의 B-7 복합체를 제안하기도 하였다. 예컨대 Hathcock 등, Science 262:905-7 (1993), Freeman 등, Science 262:907-9; Freeman 등, J Exp Med 178:2185-92(1993), Lenschow 등, Proc Natl Acad Sci USA 90:11054-8(1993), Razi-Wolf 등, Proc Natl Acad Sci USA 90:11182-6(1993), 및 Boussiotis 등 Proc Natl Acad Sci USA 90:11059-63(1993) 참조. 그러나, BB1 항체는 CD74의 세포 표면 형태와 동일한 분자를 결합시키고, 따 라서 BB1 mAb는 B7-1과 구별되는 단백질에 결합하고, 에피토프는 B7-1 단백질에 존재한다는 발견을 논의한 Freeman 등의 문헌[J Immunol 161:2708-15(1998)] 참조. 따라서, 이러한 관찰로 인해 CD80 발현 및 기능 분석에서 BB1 mAb를 사용한 연구를 재고하는 분야가 필요하다.

조사자들은, 1993년에 시작하여 1995년에 최고조에 달하는, T 세포 자극에 있어서 CTLA-4의 역할을 추가로 설명하기 시작하였다. 먼저, CTLA-4에 대항하는 단일클론 항체를 사용하여, Walunas 등[Immunity 1:405-13(1994)]은 CTLA-4가 T 세포 활성화의 반대 조절인자로서 기능할 수 있다는 증거를 제공하였다. 그 후, Waterhouse 등[Science 270:985-988 (1995)]은 CTLA-4가 결핍되어 있는 마우스가 림프절 및 비장에서 상향 조절된 활성화 마커와 T 세포 아세포를 축적하였음을 입증하였다. 아세포는 간, 심장, 폐 및 췌장 조직에 침투하고, 혈청 면역글로불린의 양을 상승시키며, T 세포 수용체를 통하여 자극하는 경우 그 T 세포는 자발적으로 강하게 성장하였다. 그러나, 이들은 Fas 수용체의 교차 및 감마선 조사가 유도하는 세포 사멸에 민감성이었다. Waterhouse 등은 CTLA-4가 T 세포 활성화의 반대 조절인자로서 작용하고, 림프구 항상성의 조절에 중요하다고 결론내렸다. 동일한 쟁점에 대한 논평에 있어서, Allison 및 Krummel[Science 270:932-933(1995)]은, CTLA-4가 T 세포 반응성을 하향 조절하는 작용을 하거나, 또는 T 세포 활성화 및 발생에 있어서 저해 신호 전달의 역할을 갖는다는 것을 분명히 나타내는 Waterhouse 등의 연구에 대해 논의하였다. Tivol 등[Immunity 3:541-7(1995)]은 CTLA-4 결핍 마우스를 형성하였으며, 그러한 마우스가 다기관 림프구 침투 및 조직 파괴와 림프성장성 질병, 특히 심각한 심근염 및 췌장염을 급속하게 발생시킨다는 것을 입증하였다. 이들은 CTLA-4가 T 세포 활성화를 하향조절하고 면역학적 항상성을 유지하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 결론을 내렸다. 또한, Krummel 및 Allison[J Exp Med 182:459-65(1995)]은 CD28 및 CTLA-4가 자극에 대한 T 세포의 반응에 있어서 저지 효과를 가진다는 것을 추가로 명백히 설명하였다. 이들은 CTLA-4에 대한 항체를 형성하고, 고도로 정제된 T 세포를 사용하여 계내 CTLA-4에 대한 항체의 결합 영향을 조사하였다. 이들은 그 보고서에서, 새로 외식한 T 세포 상의 소량의 B7-2가 존재하면 T 세포 성장을 부분적으로 저해할 수 있으며, 그 저해는 CTLA-4와 상호작용하여 매개됨을 보여주었다. TCR 및 CD28과 함께 CTLA-4의 가교는 T 세포에 의한 성장 및 IL-2 분비를 저해한다. 마지막으로, 그 결과로부터 CD28 및 CTLA-4는 항원에 대한 반응을 결정하는데 있어서 T 세포에 의해 통합되는 것으로 보이는 저지 신호를 전달한다는 것을 확인하였다. 따라서, T 세포 항원 수용체 자극의 결과는 CD28 동시자극 신호와 CTLA-4로부터 유도된 저해 신호가 조절한다는 결론을 내렸다. 또한, Krummel 등, Int Immunol 8:519-23(1996) 및 미국 특허 제5,811,097호 및 국제 특허 출원 WO 97/20574호 참조.

각종 부가 실험을 수행하여 CTLA-4의 상기 기능을 추가로 해명하였다. 예를 들어, Walunas 등[J Exp Med 183:2541-50(1996)]은, 항-CTLA-4 항체의 사용을 통하여, CTLA-4 신호 전달이 세포 생존 또는 IL-2에 대한 반응성을 조절하지는 않지만, CD28-의존성 IL-2 생성을 저해한다고 제안하였다. 또한, Perrin 등[J Immunol 157:1333-6 (1996)]은 실험적 알러지성 뇌척수염(EAE)에서 항-CTLA-4 항체가 질병 을 악화시키고 사망율을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 질병 악화는 뇌염발생 시토킨 TNF-알파, IFN-감마 및 IL-2의 생성 증가과 관련되어 있다. 따라서, CTLA-4는 EAE에서 자가면역 반응의 강도를 조절하여, 염증성 시토킨 및 임상적 질병 증후를 약화시킨다는 결론을 얻었다. Hurwitz 등, J Neuroimmunol 73:57-62(1997) 및 Cepero 등, J Exp Med 188:199-204(1998)(쥐 T 세포 모델내로 유전자를 전달한 후에 CTLA-4 발현을 특이적으로 제거하는 항-CTLA-4 헤어핀 리보좀).

또한, Blair 등[J Immunol 160:12-5 (1998)]은 휴지 인간 CD4⁺ T 세포에서 CTLA-4 단일클론 항체(mAb)의 패널의 기능적 효과를 평가하였다. 그 결과 일부 CTLA-4 mAb가 휴지 CD4+ 세포의 성장 반응과 G0에서 G1으로의 세포 주기 전이를 저해할 수 있다는 것을 입증하였다. CTLA-4의 저해 효과는, 세포 표면 CTLA-4 발현이 검출가능하지 않은 4시간내에 명백하다. 그러나, 기타 CTLA-4 mAb는 검출가능한 저해 효과가 없는데, 이는 CTLA-4 단독에 대한 mAb의 결합이 T 세포 반응의 하향 조절을 매개하는데 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, IL-2 생성은 차단되지만, 저해성 항-CTLA-4 mAb는 세포 생존 유전자 bc1-X(L)을 유도 및 발현시킨다. 이러한 관찰 결과와 일치하여, 세포는 생존하였으며, 고사는 CTLA-4 결찰 후에는 검출되지 않았다.

아너지와 관련하여, Perez 등[Immunity 6:411-7(1997)]은 T 세포 아너지의 유도는 CTLA-4를 차단하여 방지할 수 있음을 입증하고, T 세포에 의한 항원 인지 결과는 B7 분자와 T 세포상의 CD28 또는 CTLA-4의 상호작용에 의해 결정된다는 결 론을 내렸다. 또한, Van Parijs 등[J Exp Med 186:1119-28(1997)]은 생체내 T 세포 아너지에 있어서 인터루킨 12와 동시자극인자의 역할을 조사하고, 아너지 유도 과정에서 CTLA-4 진입기전(engagement)의 저해를 통하여 T 세포 성장이 차단되고, 완전한 Th1 분화가 촉진되지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나, IL-12 및 항-CTLA-4 항체의 존재하에 관용원성 항원에 노출된 T 세포는 무력해지지 않으며, 면역원성 항원에 직면한 T 세포와 동일하게 작용한다. 이들 결과는 2가지 과정이 생체내 아너지 유도에 기여한다는 것을 제안한다. 그 2가지 과정은 T 세포의 성장 능력의 차단을 초래하는 CTLA-4 진입기전과 T 세포의 Th1 효과기 세포로의 분화를 방지하는 기본형 염증성 시토킨 IL-12의 부재이다. IL-12와 항-CTLA-4 항체의 조합은 정상적인 관용원성 자극을 면역원성 자극으로 전환시키는데 충분하였다.

감염과 관련하여, McCoy 등[J E xp Med 186:183-7 (1997)]은 항-CTLA-4 항체가 니포스트론길러스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)에 대한 T 세포 면역 반응을 상당히 증가 및 가속화시켜, 성충의 수의 상당한 감소와 기생충 알 생산의 조기 종결을 초래한다는 것을 확인하였다. Murphy 등의 문헌[J. Immunol. 161:4153-4160(1998)(Leishmania donovani)] 참조.

암과 관련하며, Kwon 등[PNAS USA 94:8099-103(1997)]은 상승적 쥐 전립선암 모델을 설정하고, 증가된 T 세포 동시자극을 통한 항전립선암 반응을 유도하도록 2가지 특징적인 조작을 시험하였다: (1) B7.1 리간드를 발현하도록 형질도입된 전립선암 세포에 의한 직접적인 동시자극의 제공 및 (ii) T 세포 하향 조절을 방지하는 T 세포 CTLA-4의 생체내 항체 매개형 차단. CTLA-4 반응의 생체내 항체 매개된 차 단은 항전립선암 면역 반응을 증가시킨다는 것이 입증되었다. 또한, Yang 등[Cancer Res 57:4036-41(1997)]은 CTLA-4 기능을 차단하면 종양 성장의 각종 단계에서 항종양 T 세포 반응의 증가를 초래할 수 있는지를 조사하였다. 시험관내 및 생체내 결과를 기초로, 종양 보유 개체에서 CTLA-4 차단이 항종양 T 세포 반응을 형성하는 능력을 향상시키지만, 그러한 증강 효과의 발현은 그 모델에서 종양 성장의 초기 단계에 한정된다는 것을 밝혀냈다. 또한, Hurwitz 등[Proc Natl Acad Sci USA 95:10067-71]은 T 세포 매개된 항종양 반응의 형성이 주요 조직적합성 복합체/항원에 의한 T 세포 수용체 진입기전과 B7에 의한 CD28 결찰에 좌우된다는 것을 조사하였다. 일부 종양, 예컨대 SM1 포유류 암종은 항-CTLA-4 면역치료로 다루기 어렵다. 따라서, 이러한 치료만으로는 효과가 없지만, CTLA-4 차단과 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 발현 SM1 세포로 구성된 백신을 조합 사용하면, 어버이 SM1 종양의 퇴행이 관찰되었다. 이러한 조합 치료는 SM1에 대한 지속적인 면역성을 초래하며, CD4(+) 및 CD8(+) T 세포에 따라 좌우되었다. 이와 같은 발견은 CTLA-4 차단이 숙주에서 유도된 항원 제시 세포의 수준에서 작용함을 제시하였다.

당뇨병과 관련하여, Luhder 등[J Exp Med 187:427-32(1998)]은 항-CTLA-4 mAb를 질병의 상이한 단계에 있는 당뇨병 TCR 돌연변이 마우스 모델에 주사하였다. 이들은 당뇨병 유발성 T 세포가 유효하게 먼저 활성화되는 시간에 CTLA-4의 진입기전이 중요한 사건이며; 진입기전이 허용되는 경우 도의 침입이 발생하나 수개월 동안 매우 무해한 상태로 남아 있음을 밝혀냈다. 그렇지 않은 경우, 인슐린염은 휠씬 더 공격적이며, 그 결과로서 당뇨병이 쉽게 발생한다.

백신 면역화와 관련하여, Horspool 등[J Immunol 160:2706-14(1998)]은 온전한 항-CTLA-4 mAb는 소환 반응에 영향을 주지 않고 pCIA/베타 gal에 대한 1차 체액 반응을 억제하지만 Fab 단편은 그러하지 않다는 것을 밝혀 내었는데, 이는 CTLA-4 활성화는 Ab 생성을 저해하지만 T 세포 프라이밍은 저해하지 않음을 제시하는 것이다. CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드인 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)의 차단은 특징적이고 중복되지 않는 기능을 드러내었다. 초기 면역화에서 CD80의 차단은 1차 및 2차 Ab 반응을 완전히 제거하는 반면, CD86의 차단은 1차 반응은 억제하지만 2차 반응은 억제하지 않는다. CD80 + CD86의 동시 차단은 단독으로 차단하는 것보다 Ab 반응을 억제하는데 효과가 적었다. B7 발현 플라스미드의 동시주입을 통한 동시 자극 강화는 CTL 반응을 증대시켰지만 Ab 반응은 증대시키지 않았으며, Th1의 Th2로의 편중의 증거도 없었다. 이러한 발견은 핵산 예방접종 후에 T 세포 동시 자극에 있어서 CD28, CTLA-4, CD80 및 CD86의 복잡하고 특징적인 역할을 제시한다.

자가이식 거부반응과 관련하여, Markees 등[J Clin Invest 101:2446-55(1998)]은 피부 자가이식 거부반응의 마우스 모델에서 허용성이 초기에 IFN-감마, CTLA-4 및 CD4(+) T 세포의 존재에 따라 달라진다는 것을 발견하였다. 프로토콜내로의 항-CTLA-4 또는 항IFN-감마 mAb의 첨가는 즉각적인 이식편 거부반응과 연관되어 있는 반면, 항IL-4 mAb는 영향이 없었다.

CD28과 관련하여 CTLA-4의 역할에 대하여, Fallarino 등[J Exp Med 188:205-10(1998)]은 항원 발현 종양으로 면역화시킨 TCR 돌연변이/리콤비나제 활성화 유전자 2-결핍/CD28 야생형 또는 CD28 결핍 마우스를 형성하였다. 양 유형의 마우스에 서 유래한 감작된 T 세포는 시토킨을 형성한 반면, B7 발현이 결핍된 자극 세포에 반응하여 성장하였다.그러나, CD28+/+ T 세포의 반응은 B7-1을 이용한 동시자극으로 증대되는 반면, CD28 -/- T 세포의 반응은 강하게 저해된다. 저해는 B7-1 또는 CTLA-4에 대한 단일클론 항체에 의해 역전되었다. 따라서, CTLA-4는 CD28의 부재하에 T 세포 활성화를 유효하게 저해할 수 있으며, 이는 TCR 매개된 신호의 길항작용이 CTLA-4의 저해 효과를 설명하기에 충분하다는 것을 의미한다. 또한, Lin 등[J Exp Med 188:199-204(1998)]은 CD28 결핍 마우스에서 심장 자가이식의 거부반응을 연구하였다. H-2(q) 심장을 동종 야생형 또는 CD28 결핍 마우스(H-2(b))로 이식하였다. 이식 거부반응은 야생형 마우스와 비교하여 CD28-결핍 마우스에서 지연된다. 야생형 수용체를 CTLA-4 면역글로불린(Ig) 또는 항-B7-1 + 항-B7-2 mAb로 처리하면 자가 이식편 생존이 상당히 연장된다. 대조적으로, CTLA-4-Ig, 항-B7-1 + 항-B7-2 mAb, 또는 차단 항-CTLA-4 mAb로 CD28 결핍 마우스를 처리하면 자가이식편 거부반응의 가속화를 유도하였다. 이식편 거부반응의 증가율은 더욱 심각한 단핵세포 침윤과 미처리 야생형 및 CTLA-4-Ig 또는 항-CTLA-4 mAb 처리된 CD28 결핍 마우스의 공여체 심장에서의 IFN-감마 및 IL-6 전사체의 수준 증가와 관련되어 있다. 따라서, CTLA-4의 반대 조절 역할은 리간드 경쟁을 통해 CD28 활성화를 방지하는 유효 능력의 범위를 초과하여 확장된다. CD28의 부재하에, CTLA-4는 자가이식편 거부반응의 조절에 있어서 저해 역할을 한다.

또한, CTLA-4의 발현의 추가의 특징을 조사하였다. 예를 들어, Alegre 등[J Immunol 157:4762-70(1996)]은 표면 CTLA-4가 급속하게 내재화된다고 제안하였는 데, 이는 세포 표면에서 일반적으로 검출되는 발현량이 적은 이유를 설명할 수 있다. CD28 및 IL-2는 모두 CTLA-4 발현의 상향 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 결론지었다. 또한, CTLA-4의 세포 표면 축적은 신속한 세포내이입에 의해 우선적으로 조절되는 것으로 보인다. 또한, Castan 등[Immunology 90:265-71(1997)]은 CTLA-4의 동일계 면역조직학적 분석을 기초로, CTLA-4 양성인 배 중심 T 세포가 면역 조절에 중요할 수 있음을 제안하였다.

따라서, 면역 반응성에 있어서 CTLA-4가 보유하는 것으로 보이는 광범위하고 중요한 역할의 관점에서, 면역치료에 효과적으로 이용할 수 있는 CTLA-4에 대한 항체를 형성하는 것이 바람직하다. 또한, 항체의 반복 투여가 필요한 만성 질병에 사용할 수 있는 CTLA-4에 대한 항체를 형성하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제1 측면에 따라서, 인간 V_H3-33 계열 유전자가 암호화하는 FR1 서열 내지 FR3 서열내에서 유래한 인접 아미노산 서열을 포함하고, 도 2에 제시된 CDR1 서열, CDR2 서열 또는 골격 서열내의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변부 아미노산 서열을 포함하는, CTLA-4에 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직한 양태에서, 아미노산 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 66, 서열 번호 68, 및 서열 번호 70으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포 함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 65, 서열 번호 67, 서열 번호 69, 및 서열 번호 71을 포함하는 서열로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변부 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

본 발명의 제2 측면에 따라서, 서열 번호 1을 포함하는 중쇄 아미노산 서열과 서열 번호 14를 포함하는 경쇄 가변부 아미노산 서열을 포함하는 항체가 제공된다.

본 발명의 제3 측면에 따라서, 서열 번호 2를 포함하는 중쇄 아미노산 서열과 서열 번호 15를 포함하는 경쇄 가변부 아미노산 서열을 포함하는 항체가 제공된다.

본 발명의 제4 측면에 따라서, 서열 번호 4를 포함하는 중쇄 아미노산 서열과 서열 번호 17을 포함하는 경쇄 가변부 아미노산 서열을 포함하는 항체가 제공된다.

본 발명의 제5 측면에 따라서, CTLA-4에 결합할 수 있는 분리된 인간 단일클론 항체가 제공된다. 바람직한 양태에서, 항체는 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1로 구성된 군에서 선택된 항체와 CTLA-4와 결합하기 위해 경쟁할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, l2.3.1.1, 및 12.9.1.1로 구성된 군에서 선택된 항체로서 CTLA-4 에 대해 실질적으로 유사한 결합 특이성을 보유한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 하등 포유류 종에서 유래한 CTLA-4와 교차 반응하지 않는데, 하등 포유류 종은 바람직하게는 마우스, 래트 및 토끼를 포함하고, 더욱 바람직하게는 마우스 및 래트이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 영장류 유래의 CTLA-4와 교차 반응성이 있는데, 영장류는 바람직하게는 게잡이 원숭이 및 붉은 털 원숭이를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 CD28, B7-2, CD44, 및 hIgG1보다 CTLA-4에 대한 선택성이 약 100:1 이상, 바람직하게는 약 500:1 이상이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체의 결합 친화도는 약 10^-9 M 또는 그 이상이며, 바람직하게는 약 10^-10 M 이상이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 100 nM 이하, 바람직하게는 약 0.38 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-2 간의 결합을 저해한다. 또 다른 바람직한 양태에서 항체는 약 100 nM 이상보다 더 낮은, 바람직하게는 약 0.50 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-1간의 결합을 저해한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 약 3846 pg/㎖ 이상으로 T 세포 아세포/라지 분석에서 IL-2 생성을 증가시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 약 1233 pg/㎖ 이상으로 T 세포 아세포/라지 분석에서 IFN-γ의 생성을 증가시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 hPBMC 또는 전혈 초항원 분석에서 약 500 pg/㎖ 이상으로 IL-2의 생성을 증가시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 hPBMC 또는 전혈 초항원 분석에서 약 500 pg/㎖, 또는 바람직하게는 1500 pg/㎖ 이상, 또는 대조군에 비하여 약 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상으로 IL-2의 생성을 증가시킨다.

본 발명의 제6 측면에 따라서, 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1., 4.10.2, 4.13.1, 4.13.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1로 구성된 군에서 선택된 항체로서 CTLA-4에 대해 실질적으로 유사한 결합 특이성을 보유한 인간화된 항체가 제공된다. 바람직한 양태에서, 항체는 하등 포유류 종 유래의 CTLA-4에 대해 교차 반응성이 없다. 바람직하게는 하등 포유류 종은 마우스, 래트 및 토끼를 포함하며, 더욱 바람직하게는 마우스 및 래트이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 영장류 유래의 CTLA-4과 교차 반응하는데, 바람직하게는 영장류는 게잡이 원숭이 및 붉은 털 원숭이를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 CD28, B7-2, CD44, 및 hIgG1보다 CTLA-4에 대한 선택성이 약 100:1 이상, 바람직하게는 약 500:1 이상이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체의 결합 친화도는 약 10^-9 M 또는 그 이상이며, 바람직하게는 약 10^-10 M 이상이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 100 nM 이하, 바람직하게는 약 0.38 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-2 간의 결합을 저해한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 100 nM 이상보다 낮은, 바람직하게는 약 0.50 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-1간의 결합을 저해한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 약 3846 pg/㎖ 이상으로 T 세포 아세포/라지 분석에서 IL-2 생성을 증가시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 약 1233 pg/㎖ 이상으로 T 세포 아세포/라지 분석에서 IFN-γ의 생성을 증가시킨다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 hPBMC 또는 전혈 초항원 분석에서 약 500 pg/㎖ 이상으로 IL-2의 생성을 유도한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 hPBMC 또는 전혈 초항원 분석에서 약 500 pg/㎖, 또는 바람직하게는 1500 pg/㎖ 이상, 또는 대조군에 비하여 약 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상으로 IL-2의 생성을 증가시킨다.

본 발명의 제7 측면에 따라서, CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열과 프레임내에서 작동가능하게 결합된 인간 V_H 3-33 유전자 계열이 암호화하는 인간 FR1, FR2 및 FR3 서열을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 보유하는, CTLA-4에 결합하는 항체가 제공된다. 여기서 CDRl, CDR2, 및 CDR3 서열은 도 2에 예시된 CDRl, CDR2, 및 CDR3 서열로부터 각각 선택된다. 바람직한 양태에서, 청구범위 제32항의 항체는 도 2에 예시된 바와 같이 FR1, FR2, 및 FR3 서열에 대한 임의의 체세포 돌연변이를 추가로 포함한다.

본 발명의 제8 측면에 따라서, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 프레임내에서 작동가능하게 결합된 인간 V_H3-33 유전자 계열이 암호화하는 인간 FR1, FR2 및 FR3 서열을 포함하는 중쇄 아미노산을 포함하는, CTLA-4에 결합하는 항체가 제공되는데, 이 항체는 약 10^-9 이상의 CTLA-4에 대한 결합 친화도를 보유하고, 약 100 nM 이하 의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-1 간의 결합을 저해하고, 약 100 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-2 간의 결합을 저해하며, 인간 T 세포의 분석에서 500 pg/㎖ 이상으로 시토킨 생성을 증가시킨다.

본 발명의 제9 측면에 따라서, 도 2 및 도 3에 예시된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열에서 각각 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 프레임내에서 작동가능하게 결합된 FR1, FR2 및 FR3을 포함하는 중쇄 아미노산을 포함하는, CTLA-4에 결합하는 항체가 제공되는데, 이 항체는 약 10^-9 이상의 CTLA-4에 대한 결합 친화도를 보유하고, 약 100 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-1 사이의 결합을 저해하며, 약 100 nM 이하의 IC₅₀으로 CTLA-4와 B7-2 사이의 결합을 저해하고, 인간 T 세포의 분석에서 500 pg/㎖ 이상으로 시토킨 생성을 증가시킨다.

본 발명의 제10 측면에 따라서, 라지 세포주와 동시 배양한 인간 T 세포 아세포의 배양물을 포함하는, T 세포 자극 분석용 세포 배양계가 제공된다. 바람직한 양태에서, T 세포 아세포는 라지 세포주와 함께 배양하기 전에 세척한다.

본 발명의 제11 측면에 따라서, 라지 세포주와 인간 T 세포 아세포의 배양물을 제공하는 단계, 그 배양물을 제제와 접촉시키는 단계; 및 배양물에 의한 시토킨 생성을 측정하는 단계를 포함하여 T 세포 자극을 측정하는 분석법이 제공된다.

본 발명의 제12 측면에 따라서, 인간 T 세포 아세포와 라지 세포주의 배양물을 제공하는 단계; 그 배양물과 성분(moiety)을 접촉하는 단계; 및 배양물에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하여 T 세포 자극 기능에 대해 성분을 스크리 닝하는 기능 분석법이 제공된다.

본 발명의 제13 측면에 따라서, 인간 T 세포 아세포 및 라지 세포주를 포함하는 배양물을 제제와 접촉하는 단계 및 배양물에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하여 CTLA-4 저해 기능에 대한 T 세포 자극 분석법이 제공된다.

본 발명의 제14 측면에 따라서, 인간 T 세포 아세포 및 라지 세포주를 포함하는 세포 배양물과 제제를 접촉시키는 단계; 및 배양물에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하여 T 세포 자극 활성에 대해 제제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제10 내지 제14 측면 각각의 바람직한 양태에서, T 세포 아세포를 라지 세포주와 함께 배양하기 전에 세척한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 시토킨은 IL-2 또는 IFN-γ이다. 바람직한 양태에서, 시토킨 생성은 배양물로부터 분리된 상청액에서 측정한다. 바람직한 양태에서, 제제는 항체이며 바람직하게는 CTLA-4에 결합한다.

본 발명의 제15 측면에 따라서, 스타필로코커스 엔테로톡신 A로 자극된 인간 말초 혈액 단핵세포 또는 인간 전혈의 군을 제공하는 단계, 그 배양물을 제제와 접촉시키는 단계; 및 세포군에 의한 시토킨 생성을 측정하는 단계를 포함하여 T 세포 자극을 측정하는 분석법이 제공된다.

본 발명의 제16 측면에 따라서, 스타필로코커스 엔테로톡신 A로 자극한 인간 말초혈액 단핵세포 또는 인간 전혈의 군을 제공하는 단계; 배양물을 성분과 접촉시키는 단계; 및 세포군에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하여 T 세포 자 극 기능에 대해 성분을 스크리닝하는 기능적 분석법이 제공된다.

본 발명의 제17 측면에 따라서, 스타필로코커스 엔테로톡신 A로 자극한 인간 말초 혈액 단핵세포 또는 인간 전혈의 군을 제제와 접촉시키는 단계, 및 세포군에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하는, CTLA-4 저해 기능에 대한 T 세포 자극 분석법이 제공된다.

본 발명의 제18 측면에 따라서, 스타필로코커스 엔테로톡신 A로 자극한 인간 말초 혈액 단핵세포 또는 전혈의 군을 제제와 접촉시키는 단계, 및 세포군에 의한 시토킨 생성을 평가하는 단계를 포함하여 T 세포 자극 활성에 대해 제제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.

본 발명의 제15 내지 제18 측면 각각의 바람직한 양태에서, 시토킨은 IL-2이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 시토킨 생성은 배양물로부터 분리된 상청액에서 측정한다. 바람직한 양태에서, 제제는 항체이고, 바람직하게는 CTLA-4에 결합한다.

바람직한 양태들의 상세한 설명

본 발명에 따라서, 인간 CTLA-4에 대한 완전한 인간 단일클론 항체가 제공된다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 이를 구성하는 아미노산 서열, 특히 FR1 및 CDR1 내지 CDR3 및 FR4에서 유래한 인접 중쇄 및 경쇄 서열에 해당하는 서열이 제공된다. 본 명세서에 개시된 항체와 유사한 결합 특성을 보유한 항체 및 유사한 기능성을 보유한 항체(또는 기타 길항제)도 추가로 제공된다. 이러한 면역글로불린 분자 및 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도 마도 제공된다.

정의

특별한 언급이 없으면, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 공통적으로 이해하는 의미를 갖는다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는다면, 한 용어도 여러 의미를 포함하고, 복수 단어도 하나의 의미를 나타낸다. 일반적으로, 본원에 개시된 세포 및 조직 배양물, 분자 생물학, 및 단백질과 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드화와 관련되어 사용된 명명법, 및 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 사용되는 것이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직 배양과 형질전환(예, 일렉트로포레이션, 리포펙션)에 대한 표준 기법을 사용한다. 효소 반응 및 정제 기법은, 제조업자의 규격에 따르거나, 당업계에서 통상적으로 교시하거나 또는 본 명세서에 개시된 바와 같이 수행한다. 전술한 기법 및 절차는 일반적으로 본 발명에 공지된 종래의 방법에 따라서, 그리고 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 보다 구체적인 문헌에 개시된 바와 같이 수행한다. 예컨대 본원에서 참고로 인용한 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 뉴욕(1989) 참조. 본 명세서에 개시된 분석 화학, 합성 유기 화학과 약물 화학 및 약화학과 관련하여 사용된 명명법과 이의 실험 절차 및 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업계에서 일반적으로 사용된다. 표준 기법은 화학적 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형화 및 전달과 환자 치료에 사용된다.

본 발명의 내용에 따라 사용된 바와 같이, 다음 용어들은 특별한 언급이 없 는 한 하기 설명하는 바와 같은 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA 또는 이의 합성 기원이나 일부 조합의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 기원에 따라서 "분리된 폴리뉴클레오티드"는 (1) "분리된 폴리뉴클레오티드"가 천연 상태에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부와 회합되어 있지 않거나, (2) 천연 상태에서 결합되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 결합되어 있거나, 또는 (3) 더 거대한 서열의 일부로서 자연 상태에서 발생하지 않는다.

"분리된 단백질"은 cDNA, 재조합 RNA 또는 이의 합성 기원이나 일부 조합을 의미하며, 기원 또는 유도체화 공급원에 따라서 "분리된 단백질"은 (1) 천연 상태에서 발견되는 단백질과 회합되어 있지 않거나, (2) 동일한 공급원 유래의 기타 단백질, 예컨대 쥐 단백질이 없거나, (3) 상이한 종 유래의 세포가 발현하거나, 또는 (4) 천연 상태에서 발생하지 않는다.

일반명으로서 본 명세서에서 사용된 "폴리펩티드"는 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 의미한다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드속의 종류들이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 도 1에 제시된 인간 중쇄 면역글로불린 분자 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린 분자와, 경쇄 면역글로불린 분자, 예컨대 카파 경쇄 면역글로불린 분자와 중쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합, 그 역의 조합으로 형성된 항체 분자, 이의 단편 및 유사체를 포함한다.

어떤 대상에 대해 적용한 본 명세서에서 사용된 "자연 발생적"은 그 대상을 자연에서 발견할 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 천연 상태의 공급원으로부터 분리할 수 있고 실험실내에서 사람이 의도적으로 또는 달리 변형시키지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다.

본 명세서에서 사용된 "작동가능하게 결합된" 이란 용어는 성분들이 의도하는 방식으로 기능하도록 하는 관계로 평가되는 성분의 위치를 의미한다. 암호 서열에 "작동가능하게 결합된" 대조군 서열은, 암호 서열이 대조군 서열에 적합한 조건하에서 발현되도록 결찰시킨다.

본 명세서에서 사용한 "대조군 서열"은, 이들 서열이 결찰되는 암호 서열의 발현 및 프로세싱을 실시하는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 대조군 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 달라진다. 원핵 세포에서는 이러한 대조군 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고, 진핵 세포에서는 이들 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "대조군 서열"은 최소한 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하며, 예컨대 리더 서열 및 융합쌍 서열과 같이 존재하면 유리한 부가의 성분도 포함할 수 있다.

본 명세서에서 언급한 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 10 염기 이상인 뉴클레오티드, 즉 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 각 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태의 중합체 형태를 의미한다.

본 명세서에서 언급한 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적 올리고뉴클레오 티드, 자연발생적 뉴클레오티드와 함께 결합된 변형 뉴클레오티드, 및 비자연 발생적 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200 염기 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 아군이다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 10 내지 60 염기, 가장 바람직하게는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 염기이다. 일반적으로, 예컨대 프로브의 경우 올리고뉴클레오티드는 1본쇄이지만, 예컨대 유전자 변이체 작제에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 2본쇄이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서에서 말하는 "자연 발생적 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드이다. 본 명세서에서 말하는 "변형된 뉴클레오티드"는 변형된 또는 치환된 당의 기 등을 보유한 뉴클레오티드이다. 본 명세서에서 언급한 "올리고뉴클레오티드 결합"은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로센레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 예컨대, 본 명세서에서 참고로 인용한 LaPlanche 등, Nucl. Acids Res. 14:908l (1986); Stec 등, J. Am. Chem.Soc. 106:6077(1984); Stein 등 Nuc1. Acids Res. 16:3209(l988); Zon 등 Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon 등, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec 등, 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann 및 Peyman Chemical Reviews 90:543(1990) 참조. 올 리고뉴클레오티드는 필요에 따라 검출용 라벨을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 언급한 "선택적으로 하이브리드화하는"은 검출가능하게 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 감지할 수 있는 양을 최소화하는 하이브리드화 및 세척 조건하에 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드화한다. 고 엄중 조건을 이용하여 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 개시된 선택적 하이브리드화 조건을 달성할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 단편과 해당 핵산 서열 간의 핵산 서열 상동성은 80% 이상이고, 더욱 통상적으로는 상동성이 바람직하게는 최소한 85%, 90%, 95%, 99% 및 100%로 증가한다. 2개의 아미노산 서열 간에 부분적 또는 완전한 동일성이 있다면 그 2개의 아미노산 서열은 상동성이 있다. 예를 들어, 85% 상동성이란 2개의 서열이 최대로 정합되도록 정렬한 경우 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 갭(정합된 2개의 서열 중 하나에 있음)은 정합을 최대화시킨다. 5 이하의 길이의 갭이 바람직하며, 2 이하의 갭이 더욱 바람직하다. 대안적으로 그리고 바람직하게, 이 용어는 본 명세서에서 사용한 바와 같이 돌연변이 데이타 행렬과 6 이상의 갭 벌점을 보유하는 프로그램 ALIGN을 사용하여 (표준 편차 단위에서) 5 이상의 정렬 점수를 갖는 경우, 2개의 단백질 서열(또는 이로부터 유도된 길이가 30 아미노산 이상인 폴리펩티드 서열)은 상동성이다. Dayhoff, M.O.의 문헌[Atlas of Protein Sequence and Structure, p101-110(Vol 5, National Biomedical Research Foundation(1972)) 및 이 책의 부록 2 p1-10] 참조. 2개의 서열 또는 이의 일부는, ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 정렬했을 때 아미노산이 50% 이상 동일한 경우 더욱 바람직한 상동성이다. "∼에 해당하는"은 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대해 상동성(즉, 동일하지만 엄격하게 진화적으로는 관련이 없음)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 대조적으로, "∼에 상보적인"은 상보 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부에 대해 상동성임을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 예시용으로, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 해당하며, 기준 서열 "GTATA"에 상보적이다.

다음 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 서열 관계를 설명하는데 사용된다: "기준 서열", "비교창", "서열 동일성", "서열 동일성율(%)" 및 "실질적인 동일성". "기준 서열"은 서열 비교의 기준으로서 사용되는 정의된 서열이며; 기준 서열은, 예컨대 서열 목록에 제시된 전길이 cDNA 또는 유전자 서열의 분절로서 거대 서열의 부분 세트이거나, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 적어도 18 뉴클레오티드 또는 6 아미노산 길이이고, 빈번하게는 적어도 24 뉴클레오티드 또는 8 아미노산 길이이며, 종종 적어도 48 뉴클레오티드 또는 16 아미노산 길이이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 2개의 분자 사이에 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부)을 포함하고, (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간에 차이가 있는 서열을 추가로 포함할 수 있기 때문에, 2개( 또는 그 이상) 분자 사이의 서열 비교는 통상적으로 "비교창"에 걸쳐 2 분자의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부적인 영역을 확인하고 비교함으로써 수행한다. 본 명세서에서 사용한 "비교창"은 18개 이상의 인접 뉴클레오티드 위치 또는 6개 이상의 아미노산의 개념 분절을 의미하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 적어도 18개 인접 뉴클레오티드 또는 6개 아미노산의 기준 서열과 비교할 수 있고, 비교창내 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적 정렬에 대하여 (삽입 또는 결실을 포함하지 않는) 기준 서열과 비교하여 20% 이하의 삽입체, 결실체, 치환체 등을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 Smith & Waterman의 국부적 상동성 알고리즘[Adv.Appl.Math. 2:482(1981)], Needleman & Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘[J.Mol.Biol. 48:443(1970)], Pearson & Lipman의 유사성 방법에 대한 조사[Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:2444(1988)], 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행[미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 닥터 575 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0 중 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Geneworks 또는 MacVector 소프트웨어 패키지] 또는 육안 검사로 수행할 수 있다. 각종 방법으로 형성된 최적 정렬(즉, 비교창을 통해 최대 비율의 상동성을 초래하는 정렬)을 선택한다.

"서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교창을 통해 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 잔기 대 잔기 기준)는 것을 의미한다. "서열 동일성율(%)"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하여 계산하는데, 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 산출하고, 정합된 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총수(즉, 비교창 크기)로 나눈 다음, 100을 곱하여 서열 동일성율(%)을 산출한다. 본 명세서에서 사용한 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특성을 나타내며, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 18개 이상의 뉴클레오티드(6개 이상의 아미노산) 위치, 빈번하게는 24∼48개 이상의 뉴클레오티드(8∼16개 이상의 아미노산) 위치의 비교창에 걸쳐 기준 서열과 비교하였을 때 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90∼95% 이상의 서열 동일성, 더욱 일반적으로는 99% 이상의 서열 동일성을 보유한 서열을 포함하며, 이 때 서열 동일성율(%)은 비교창에 걸쳐 기준 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 삽입을 포함할 수 있는 서열을 기준 서열과 비교하여 계산한다. 기준 서열은 거대 서열의 부분 세트일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 이의 약어는 종래 사용에 따른다. 참고 문헌으로서 본원에서 인용한 Immunology-A Synthesis(제2판, E.S. Golub and D.R.Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)) 참조. 20개의 통상적인 아미노산의 입체 이성체(예, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산 및 기타 비통상적인 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드용 성분으로서 적합할 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산 및 이 미노산(예, 4-히드록시프롤린)이 있다. 본 명세서에서 사용된 폴리펩티드 표시법에서, 표준 사용 및 관례에 따라서 왼쪽 방향은 아미노산 말단 방향이고, 오른쪽 방향은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게, 특별한 언급이 없으며, 1본쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고, 2본쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로서 언급된다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 첨가 방향은 전사 방향이라고 하고; RNA와 동일한 서열을 보유하고 RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 DNA 가닥의 서열 영역은 "업스트림 서열"이라고 하며; RNA와 동일한 서열을 보유하고 RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 DNA 가닥의 서열 영역은 "다운스트림 서열"이라고 한다.

폴리펩티드에 응용되는 바와 같이, "실질적인 동일성"은, 예컨대 디폴트 갭 가중치를 사용한 프로그램 GAP 또는 BSETFIT에 의해 최적으로 정렬한 경우 2개의 펩티드 서열이 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 동일하지 않은 잔기 위치에서는 보존성 아미노산 치환체가 다른 것이 바람직하다. 보존성 아미노산 치환체는 유사한 측쇄를 보유한 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들어, 지방 측쇄를 보유한 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며; 지방족 히드록실 측쇄를 보유한 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드 함유 측쇄를 보유한 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 보유한 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 보유한 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티 딘이고; 황 함유 측쇄를 보유한 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존성 아미노산 치환군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다.

전술한 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에 있어서 약간의 변화는 본 발명에 포함되는 것으로 이해되는데, 단 아미노산 서열에서의 변화가 75% 이상, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99% 유지되어야 한다. 특히, 보존성 아미노산 치환체를 생각할 수 있다. 보존성 치환체는 측쇄가 관련되어 있는 아미노산 계열내에서 치환된 것들이다. 유전자적으로, 암호화된 아미노산은 일반적으로 다음 계열로 분류된다: (1) 산성=아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성=알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성= 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 더욱 바람직한 계열은 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족 히드록시 계열; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드 함유 계열; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 계열; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 계열. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 분리된 치환, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 분리된 치환, 트레오닌의 세린으로의 분리된 치환, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 치환은, 특히 그러한 치환이 골격틀 부위내 아미노산을 포함하지 않는 경우, 생성 분자의 결합 또는 특성에 대한 지대한 영향이 없을 것으로 기대하는 것은 당연하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 초래하는지 여부는 폴리펩티드 유도체 의 특이적 활성을 분석하여 쉽게 측정할 수 있다. 분석법은 본 명세서에 상세하게 설명되어있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자들이 쉽게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조 도메인 및 기능 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공개 또는 독점 서열 데이타 베이스에 비교하여 확인할 수 있다. 컴퓨터화된 비교 방법을 사용하여 공지된 구조 및/또는 기능의 기타 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 추정된 단백질 형태 도메인을 확인할 수 있다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 알려져 있다. Bowie 등의 문헌[Science 253:164(1991)] 참조. 따라서, 당업자들은 본 발명에 따라서 구조 도메인 및 기능 도메인을 한정하는데 사용할 수 있는 서열 모티프 및 구조 형태를 인지할 수 있음을 전술한 예로부터 입증할 수 있다.

바람직한 아미노산 치환체는 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고 (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 착물을 형성하는 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하며 (4) 이러한 유사체의 기타 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 변형시키는 것들이다. 유사체는 자연 발생적 펩티드 서열 이외의 서열의 각종 뮤테인(muteins)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수 아미노산 치환체(바람직하게는 보존성 아미노산 치환체)는 자연 발생적 서열(바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 일부분)에서 만들 수 있다. 보존성 아미노산 치환체는 모서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예컨대, 치환 아미노산은 모서열에서 발생하는 헬릭스를 파괴 하는 경향이 없거나, 또는 모 서열의 특성을 제공하는 2차 구조의 기타 유형을 파열시키는 경향이 없어야 한다). 당업계에 인식된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 본원에서 참고로 인용한 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)); 및 Thornton 등, Nature 354:105 (1991)]에 개시되어 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 결실 및/또는 카르복시 말단 결실을 보유하지만, 여기서 잔여 아미노산 서열은, 예컨대 전길이 cDNA 서열로부터 추론되는 자연 발생적 서열내 해당 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 통상적으로 5개 이상, 6개 이상, 8개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 길이이고, 바람직하게는 14개 이상의 아미노산 길이이며, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 길이이고, 일반적으로는 50개 이상의 아미노산 길이이고, 더욱 더 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유사체"는 추론 아미노산 서열의 일부에 대해 실질적인 동일성이 있는 25개 이상의 아미노산 분절로 구성되고, (1) 적절한 결합 조건하에 CTLA-4에 대한 특이적 결합, (2) 수용체와 CTLA-4의 결합을 차단하는 능력, 또는 (3) 시험관내 또는 생체내에서 CTLA-4 발현 세포 성장을 억제하는 능력 중 하나 이상의 특성을 보유한 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연 발생적 서열에 대하여 보존성 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상적으로 20 개 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 길이이며, 종종 전길이 자연 발생적 폴리펩티드와 같은 길이일 수도 있다.

펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 보유한 비펩티드 약물로서 약학 산업에 널리 사용된다. 이들 유형의 비펩티드 화합물은 "펩티드 모조체" 또는 "펩티도모조체(peptidomimetics)"라고 한다. 본 명세서에서 참고로 인용한 Fauchere, J.Adv.Drug Res. 15:29(1986); Veber and Freidinger TINS p392(1985); 및 Evans 등 J.Med. Chem. 30:1229(1987). 이러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티도모조체를 사용하여 등가의 치료 효과 또는 예방 효과를 산출할 수 있다. 일반적으로, 펩티도모조체는 전형적인 폴리펩티드(생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 보유한 폴리펩티드), 예컨대 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지된 방법으로 경우에 따라 -CH₂NH-, CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 -CH₂SO-으로 구성된 군에서 선택된 결합으로 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 보유한다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 고의로 치환하면(예, L-리신 대신 D-리신) 더욱 안정한 펩티드를 형성할 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변형체를 포함하는 속박형 펩티드는 당업계에 공지된 방법(본 명세서에서 참고로 인용한 Rizo 및 Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387(1992)), 예컨대 펩티드를 환형화시키는 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하여 형성할 수 있다.

"항체" 또는 "항체 펩티드(들)"는 온전한 항체, 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 경쟁하는 이의 결합 단편을 의미한다. 결합 단편은 재조합 DNA 기법으로, 또는 온전한 항체의 효소적 절단 또는 화학적 절단으로 생성된다. 결합 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 단일쇄 항체가 있다. "이특이적" 또는 "이작용성" 항체 이외의 항체는 각각 결합 부위가 동일한 것으로 생각된다. 과량의 항체가 반대수용체에 결합하는 수용체의 양을 최소한 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 더욱 일반적으로는 약 85% 이상 감소시키는 경우(시험관내 경쟁 결합 분석으로 측정함), 항체는 반대 수용체에 대한 수용체의 부착을 실질적으로 저해한다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정원을 포함한다. 에피토프 결정원은 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹으로 구성되고, 일반적으로 특정 3차원 구조 특성과 특정 하전 특성을 보유한다. 항체는, 해리 상수가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 nM, 가장 바람직하게는 ≤10 nM인 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.

용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 재료로부터 만든 추출물을 일컫는데 사용한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, "표지" 또는 "표지된"은, 예컨대 방사능 표지된 아미노산의 혼입, 또는 표시된 아비딘(예컨대, 광학법 또는 발색법으로 검출할 수 있는 효소적 활성 또는 형광 마커를 함유하는 스트렙타비딘)으로 검출할 수 있는 비오티닐 부분의 폴리펩티드로의 부착으로 검출가능한 마커를 도입하는 것을 의미한다. 특정 상황에서, 표지 및 마커는 치료에 도움이 될 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 각종 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 사용할 수 있다. 폴리펩티드용 표지의 비제한적인 예로는 방사성 동위 원소 또는 방사성 핵종(예, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 표지(예, FITC, 로다민, 라탄족 인광체), 효소적 표지(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제), 화학발광체, 비오티닐기, 2차 리포터가 인식하는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그) 등이 있다. 일부 양태에서, 각종 길이의 스페이서 암으로 표지를 부착하여 가능한 입체 장애를 줄인다.

본 명세서에서 사용한 용어 "약학제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여된 경우 목적하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다. 기타 화학 용어는, 본 명세서에서 참고로 인용한 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker, S., Ed., McGraw-Hill, 샌프란시스코(1985)]에 예시된 바와 같이, 당업계의 통상적인 관례에 따라 사용한다.

용어 "신생물 억제제"는 인간에서의 신생물, 특히 악성(암) 병변, 예컨대 암종, 육종, 림프종 또는 백혈병의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 보유한 제제를 의미한다. 전이를 저해하는 것은 종종 신생물 억제제의 특성이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 대상 종이 존재하 는 우세종(즉, 몰을 기준으로 조성물 중 임의의 기타 개별적인 종보다 더욱 풍부하게 존재하는 종류)이며, 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대 분자 종의 약 50%(몰 단위) 이상을 구성하는 조성물이라는 것을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대 분자 종의 약 80% 이상을 구성하고, 더욱 바람직하게는 약 85%, 90%, 95% 및 99% 이상을 구성한다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 필수적인 동질성(오염종은 종래의 검출 방법으로 조성물내에서 검출할 수 없음)을 갖도록 정제하는데, 여기서 조성물은 주로 단일 거대 분자로 구성된다.

용어 환자란 인간 및 수의 검체를 의미한다.

항체 구조

기본 항체 구조 단위는 사량체인 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드쇄의 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)과 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 포함한다. 각 쇄의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100∼110 이상의 아미노산의 가변부를 포함한다. 각 쇄의 카르복시 말단부는 주로 효과기 작용을 담당하는 불변부를 한정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로 분류되고, 항체 이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 한정된다. 경쇄 및 중쇄내, 가변부 및 불변부는 약 12 또는 그 이상의 아미노산의 "J" 영역으로 결합되어 있고, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2판, Raven Press, N.Y.(1989))(모든 목적을 위 해 그 전문을 참고로 인용함) 참조. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변부는 항체 결합 부위를 형성한다.

따라서, 온전한 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 보유한다. 이작용성 또는 이특이적 항체를 제외하고는, 두개의 결합 부위는 동일하다.

쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고 불리우는 3개의 초가변부에 의해 결합된 비교적 보존된 골격틀 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 쇄로부터 유래한 CDR은 골격틀 영역에 의해 정렬되어 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 된다. N-말단에서 C-말단 방향으로, 경쇄 및 중쇄는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 아미노산을 각 도메인으로 할당하는 것은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (l987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothia 등, Nature 342:878-883(1989)]의 정의에 따른다.

이특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 부위를 보유한 인공 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 비롯한 각종 방법으로 생성할 수 있다. 예컨대 Songsivilai & Lachmann의 문헌[Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990)], Kostelny 등의 문헌[J.Immunol. 148:1547-1553(1992)] 참조. 또한, 이특이적 항체는 "2항체(diabodies)"(Holliger 등, "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) 또는 "야뉴신(Janusins)" (Traunecker 등, "Bispecific single chain molecules(Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J l0:3655-3659 (1991) and Traunecker 등. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992))로서 형성할 수 있다. 이특이적 항체의 생성은 종래의 항체의 생성과 비교하여 비교적 노동 집약적인 과정일 수 있으며, 수율 및 순도는 이특이적 항체의 경우 일반적으로 더 낮다. 이특이적 항체는 단일 결합 부위를 보유한 단편의 형태(예, Fab, Fab' 및 Fv)로 존재하지 않는다.

인간 항체 및 항체의 인간화

인간 항체는 쥐 또는 래트 가변부 및/또는 불변부를 보유하는 항체와 관련된 일부 문제를 해소할 수 있다. 이러한 쥐 또는 래트 유래의 단백질의 존재는 항체를 급속히 제거할 수 있거나, 환자의 항체에 대한 면역반응의 형성을 초래할 수 있다. 쥐 또는 래트 유래의 항체의 이용을 피하기 위해서, 인간화된 항체를 발생시키거나, 또는 설치류내로 인간 항체 기능을 도입하여 완전한 인간 항체를 형성하여 설치류가 완전한 인간 서열을 보유한 항체를 생성하도록 할 수 있다고 가정하였다.

인간 항체

YAC에서 메가베이스 크기의 인간 좌를 클로닝하고 재작제하여 마우스 배선내로 도입하는 능력은, 매우 거대하거나 조잡하게 지도작성된 좌의 기능 성분을 해명하고 인간 질병의 유용한 모델을 형성하는 강력한 방법을 제공한다. 또한, 마우스 좌를 인간 등가체로 치환하는 이러한 기법을 이용하여 발생 과정에서 인간 유전자 생성물의 발현 및 조절, 기타 시스템과의 정보전달과, 질병 유도 및 진행과의 관련 성에 대한 고유의 식견을 제공한다.

이러한 방법의 중요한 실제 용도는 마우스 체액성 면역계의 "인간화"이다. 인간 면역글로불린(Ig) 좌를 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스내로 도입하면 항체의 계획된 발현 및 조립과 B-세포 발생에서의 역할의 기초를 이루는 기작을 연구할 수 있는 기회를 제공한다. 또한, 이러한 방법은 인간 질병의 항체 치료 전망을 완성하는 중요한 이정표인 완전한 인간 단일클론 항체(Mab)의 생성을 위한 이상적인 공급원을 제공할 수 있다. 완전한 인간 항체는 마우스 또는 마우스 유도화된 Mab에 대해 내인성인 면역원성 반응 및 알러지 반응을 최소화하여, 투여된 항체의 효능 및 안전성을 증가시킬 것으로 예상된다. 완전한 인간 항체의 사용은 반복된 항체 투여를 요하는 만성 및 재발성 인간 질병, 예컨대 염증, 자가면역성 및 암의 치료에 실질적으로 유리할 것으로 예상할 수 있다.

이 목표를 향한 한 방법은, 마우스 항체 생성이 결핍된 마우스가 마우스 항체의 부재하에 인간 항체의 거대 레퍼토리를 생성할 것으로 기대하면서, 마우스 항체 생성이 결핍된 마우스 종을 인간 Ig좌의 거대 단편으로 처리하는 것이다. 거대 인간 Ig 단편은 거대 가변 유전자 다양성과 항체 생성 및 발현의 적절한 조절을 보존한다. 항체 다양화 및 선별과 인간 단백질에 대한 면역학적 관용성 결핍에 대한 마우스 기구를 이용함으로써, 이들 마우스종내 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 비롯한 해당 항원에 대한 고친화도 항체를 산출한다. 하이브리도마 기법을 사용하여, 목적하는 특이성을 보유한 항원 특이적 인간 Mab를 쉽게 제조하여 선별할 수 있다.

일반적인 방법은 1994년 공개된 바와 같이 최초 제노마우스(XenoMouse)^TM 종의 생성과 관련하여 입증하였다. Green 등, Nature Genetics 7:13-21(1994) 참조. 제노마우스^TM 종은, 코어 가변부 및 불변부 서열을 포함하는 인간 중쇄좌 및 카파 경쇄좌의 245 kb 및 190 kb 크기의 배선 형태 단편을 각각 함유하는 효모 인공 염색체(YAC)를 이용하여 공학적으로 처리하였다. 전술한 문헌 참조. 인간 Ig를 함유하는 YAC는 항체의 재배열 및 발현을 위해 마우스계에 적합한 것으로 판명되었고, 불활성화된 마우스 Ig 유전자를 치환시킬 수 있었다. 이는 B-세포 발생을 유도하고, 완전한 인간 항체의 성인 유사 인간 레퍼토리를 생산하고 항원 특이적 인간 Mab를 형성하는 능력으로 입증하였다. 이들 결과는 다수의 V 유전자, 부가의 조절 성분, 및 인간 Ig 불변부를 함유하는 인간 Ig좌의 거대 부분의 도입으로 감염 및 면역화에 대한 인간 체액 반응의 특성이 있는 실질적으로 완전한 레퍼토리를 반복할 수 있음을 제시한다. Green 등의 연구는 최근, 각각 인간 중쇄좌 및 카파 경쇄좌의 메가베이스 크기의 배선 형태 YAC 단편을 도입하여 인간 항체 레퍼토리의 약 80% 이상을 도입하여 제노마우스^TM 마우스를 생성하는 것으로 확장하였다. 본원에서 참고로 인용한 문헌 Mendez 등, Nature Genetics 15: 146-156(1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495(1998), 및 미국 특허 출원 일련번호 08/759,620호(1996년 12월 3일) 참조.

이러한 방법은 미국 특허 출원 일련 번호 07/466,008호(1990년 1월 12일 출원), 07/610,515호(1990년 11월 8일 출원), 07/919,297호(1992년 7월 24일 출원), 07/922,649호(1992년 6월 30일 출원), 08/031,801호(1993년 3월 15일 출원), 08/112,848호(1993년 8월 27일 출원), 08/234,145호(1994년 4월 28일 출원), 08/376,279호(1995년 1월 20일 출원), 08/430,938호(1995년 4월 27일 출원), 08/464,584호(1995년 6월 5일 출원), 08/464,582호(1995년 6월 5일 출원), 08/463,191호(1995년 6월 5일 출원), 08/462,837호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,853호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,857호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,859호(1995년 6월 5일 출원), 08/462,513호(1995년 6월 5일 출원), 08/724,752호(1996년 10월 2일 출원), 및 08/759,620호(1996년 12월 3일 출원)에 추가로 논의되고 설명되어 있다. 또한, Mendez 등, Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green 및 Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495(1998) 참조. 또한, 1996년 6월 12일에 승인된 유럽 특허 출원 EP 0 463 151 B1호, 국제 특허 출원 WO 94/02602호(1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 WO 96/34096호(1996년 10월 31일 공개) 및 WO 98/24893호(1998년 6월 11일 공개) 참조. 상기 인용한 특허, 출원 및 참조 문헌의 각각의 내용은 그 전문을 참고로 인용한다.

대안적인 방법으로서, 젠팜 인터내쇼날 인코포레이티드를 비롯한 기타 업체들은 "소형좌(minilocus)" 방법을 이용하였다. 소형좌 방법에서, 외인성 Ig 좌는 Ig 좌 유래의 조각(개별 유전자)을 포함함으로써 모조된다. 따라서, 하나 이상의 V_H 유전자, 하나 이상의 D_H 유전자, 하나 이상의 J_H 유전자, 뮤 불변부 및 제2 불변부(바람직하게는 감마 불변부)를 동물체내로 삽입하기 위해서 작제물에 형성한다. 이 방법은 참고로 인용한 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등)와 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호 및 제5,814,318호(각각 Lonberg 및 Kay), 미국 특허 제5,591,669 호(Krimpenfort 및 Berns), 미국 특허 제5,612,205호, 제5,721,367호, 제5,789,215호(Berns 등), 및 미국 특허 제5,643,763호(Choi 및 Dunn), 및 젠팜 인터내쇼날 미국 특허 출원 일련번호 07/574,748호(1990년 8월 29일 출원), 07/575,962호(1990년 8월 31일 출원), 07/810,279호(1991년 12월 17일 출원), 07/853,408호(1992년 3월 18일 출원), 07/904,068호(1992년 6월 23일 출원), 07/990,860호(1992년 12월 16일 출원), 08/053,131호(1993년 4월 26일 출원), 08/096,762호(1993년 7월 22일 출원), 08/155,301호(1993년 11월 18일 출원), 08/161,739호(1993년 12월 3일 출원), 08/165,699호(1993년 12월 10일 출원), 08/209,741호(1994년 3월 9일 출원)에 개시되어 있다. 또한, 그 전문을 참고로 인용한 유럽 특허 O 546 073 B1호, 국제 특허 출원 WO 92/03918호, WO92/22645호, WO 92/22647호, WO 92/22670호, WO 93/12227호, WO 94/00569호, WO94/25585호, WO 96/14436호, WO 97/l3852호, 및 WO 98/24884호 참조. 추가로, 그 전문을 참고로 인용한 Taylor 등, 1992, Chen 등, 1993, Tuaillon 등, 1993, Choi 등, 1993, Lonberg 등, (1994), Taylor 등, (1994), 및 Tuail1on 등, (1995), Fishwild 등, (1996) 참조.

본 발명은 상기 인용되고 메카니칼 리터치 카운셀("MRC")에 양도된 출원의 Surani 등의 발명자는 소형좌 방법을 사용하여 Ig좌를 보유한 돌연변이 마우스를 생성하였다. 상기 인용한 젠팜 인터내쇼날 연구소의 발명자 Lonberg 및 Kay는, 본 발명자들의 지시에 따라 Surani 등의 연구와 실질적으로 중복하여 커플링시킨 내인성 마우스 Ig 좌의 불활성화를 제안하였다.

소형좌 방법의 장점은 Ig 좌의 일부를 포함하는 작제물이 형성되어 동물내로 도입될 수 있는 신속성이다. 그러나, 소형좌 방법은 유사한 정도로 상당한 단점, 즉 이론적으로 불충분한 다양성이 소수의 V, D 및 J 유전자에 포함되어 도입되는 단점을 갖는다. 실제로, 공개된 연구는 이러한 개념을 뒷받침하는 것으로 보인다. 소형좌 방법을 사용하여 생성된 동물의 B-세포 발생 및 항체 생성은 저지되는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명을 둘러싼 조사는, 다양성을 증가시키고 동물의 면역 레퍼토리를 재구성하는 노력으로 Ig좌의 거대 부분을 도입하는 방향으로 일관되게 지향되어 왔다.

인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응은 키메라 또는 기타 인간화된 항체를 제조하는 산업을 초래했다. 키메라 항체는 인간 불변부 및 쥐 가변부를 가지지만, 일부 인간 항키메라 항체(HACA) 반응이 특히 항체의 장기간 또는 다용량 이용에 있어서 관찰될 것으로 기대된다. 따라서, CTLA-4에 대한 완전한 인간 항체를 제공하여 HAMA 또는 HACA 반응의 중요성 및/또는 효과를 저하시키는 것이 바람직하다.

인간화 및 디스플레이 기법

인간 항체 형성과 관련하여 상기 논의한 바와 같이, 감소된 면역원성을 갖는 항체를 생성하는 것이 유리하다. 어느 정도는, 적절한 라이브러리를 사용하여 인간화 기법 및 디스플레이 기법과 관련하여 이를 달성할 수 있다. 쥐 항체 또는 기타 종으로부터 유래한 항체는 당업계에 공지된 기법을 사용하여 인간화되거나 또는 영장류화될 수 있음을 인지해야 한다. 예컨대, Winter 및 Harris Immunol Today 14:43-46(1993) 및 Wright 등, Crit.Reviews in Immuno1. 12125-168(1992) 참조. 해당 항체는 재조합 DNA 기법으로 공학적으로 처리하여 CH1, CH2, CH3 힌지 도메인, 및/또는 골격틀 도메인을 해당 인간 서열로 치환할 수 있다(예컨대, WO 92/02190호 및 미국 특허 제5,530,101호, 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,792호, 제5,714,350호, 및 제5,777,085호). 또한, 키메라 면역글로불린 유전자의 작제를 위해 Ig cDNA를 사용하는 방법이 당업계에 공지되어 있다(Liu 등, P.N.A.S. 84:3439(1987) 및 J. Immuno1. 139:3521(1987)). mRNA는 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 기타 세포로부터 분리할 수 있으며, 이를 사용하여 cDNA를 생성할 수 있다. 해당 cDNA는 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시킬 수 있다(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호). 대안적으로, 라이브러리를 만들어 스크리닝함으로써 해당 서열을 분리한다. 항체의 가변부를 암호화하는 DNA 서열을 인간 불변부 서열에 융합시킨다. 인간 불변부 유전자의 서열은 Kabat 등의 문헌[(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242]에서 발견할 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 기지의 클론으로부터 쉽게 이용할 수 있다. 이소타입의 선택은 소정의 효과기 작용, 예컨대 보체 고정, 또는 항체 의존성 세포의 세포독성에 있어서의 활성에 달려있다. 바람직한 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 본 발명의 항체에 대한 특히 바람직한 이소타입은 IgG2 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변부인 카파 또는 람다를 사 용할 수 있다. 키메라성 인간화된 항체는 종래의 방법으로 발현된다.

Fv, F(ab')₂, 및 Fab는 온전한 단백질의 절단, 예컨대 프로테아제 또는 화학적 절단으로 제조할 수 있다. 혹은, 절두된 유전자를 고안한다. 예를 들어, F(ab')₂ 단편의 일부를 암호하는 키메라 유전자는 CH1 도메인 및 H쇄의 힌지 영역을 암호화하는 DNA 서열과 그 뒤의 번역 종지 코돈을 포함하여 절두된 분자를 산출한다.

한 방법으로서, 중쇄 및 경쇄 J 영역을 암호화하는 공통 서열을 사용하여 프라이머로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 고안하여 인간 C 영역 분절에 V 영역 분절을 후속 결합시키기 위해서 J 영역내로 유용한 제한 부위를 도입할 수 있다. C 영역 cDNA는 위치 지정 돌연변이로 변형시켜 인간 서열에서 유사 위치에 제한 부위를 둘 수 있다.

발현 벡터로는 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래의 에피좀 등이 있다. 편리한 벡터는 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호화하는 것으로서 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되어 발현될 수 있도록 공학적으로 조작된 적절한 제한 부위를 갖는다. 이러한 벡터에서, 스플라이싱은 일반적으로 삽입된 J 영역내 스플라이스 공여 부위와 인간 C 영역 앞의 스플라이스 허용 부위 사이, 및 인간 CH 엑손내 발생하는 스플라이스 영역에서도 발생한다. 생성 키메라 항체는 레트로바이러스 LTR, 예컨대 SV-40 초기 프로모터(Okayama 등, Mol. Cell. Bio. 3:280(1983)), 라우스 육종 바이러스 LTR(Gorman 등, P.N.A.S. 79:6777(1982)), 및 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 LTR(Grosschedl 등, Cell 41:885(1985))를 비롯한 임의의 강력 프로모터; 천연 Ig 프로모터 등이 있에 결합되어 있을 수 있다.

또한, 인간 항체 또는 기타 종에서 유래한 항체는 디스플레이형 기법, 비제한적인 예로서 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보좀 디스플레이와, 당업계에 공지된 기술을 사용한 기타 기법을 통하여 형성할 수 있으며, 당업계에 공지된 기법으로 생성 분자에 대해 추가의 성숙과정, 예컨대 친화 성숙 과정을 수행할 수 있다. Wright and Harris, 상동, Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942(1997)(리보좀 디스플레이), Parmley and Smith Gene 73:305-318(1988)(파지 디스플레이), Scott TIBS 17:241-245(1992), Cwirla 등, PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel 등, Nuc1. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom 등, Immunol. Reviews 130:43-68(1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84(1992), 및 미국 특허 제5,733,743호. 디스플레이 기법을 이용하여 인간이 아닌 항체를 생성할 수 있으며, 이러한 항체를 전술한 바와 같이 인간화시킬 수 있다.

이러한 기법을 사용하여, 항체는 CTLA-4 발현 세포, CTLA-4 그 자체, CTLA-4의 형태, 이의 에피토프나 펩티드, 또는 발현 라이브러리(예컨대 미국 특허 제5,703,057호 참조)로 형성할 수 있으며, 이후 전술한 바와 같이 상기 활성들에 대해 스크리닝할 수 있다.

항체 치료에 대한 추가의 기준

인지되는 바와 같이, 일반적으로 CTLA-4 발현 세포를 사멸시키는 것은 바람직하지 않다. 그 보다는 CTLA-4와 그 리간드의 결합을 단순히 저해하여 T 세포를 하향 조절로 완화시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 항체가 세포를 사멸시키는 주요 기작 중 하나는 보체 고정과 CDC에의 참여 과정이다. 항체의 불변부는 보체를 고정하고 CDC에 참여하는 항체의 능력과 관련하여 중요한 역할을 한다. 따라서, 일반적으로 보체 고정 능력을 제공하거나 또는 그렇지 않은 항체의 이소타입을 선택한다. 일반적으로 본 발명의 경우, 전술한 바와 같이, 보통 세포를 사멸하는 항체를 이용하는 것은 바람직하지 않다. 보체 고정 및 CDC할 수 있는 여러 이소타입이 있다. 비제한적인 예로는 쥐IgM, 쥐 IgG2a, 쥐IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3가 있다. 보체 고정 및 CDC할 수 없는 이소타입의 비제한적인 예로는 인간 IgG2 및 인간 IgG4가 있다.

형성된 항체가 특정 목적하는 이소타입을 초기에 보유할 필요는 없으며, 그 보다는 형성된 대로의 항체가 임의의 이소타입을 보유하고, 당업계에 공지된 종래 기법을 사용하여 이 후 항체의 이소타입을 바꿀 수 있음을 알 것이다. 이러한 기법은 직접 재조합 기법(예컨대 미국 특허 제4,816,397호 참조), 세포-세포 융합 기법(예컨대, 1991년 10월 11일에 출원된 미국 특허 출원 08/730,639호 참조)의 사용을 포함한다.

세포-세포 융합 기법에서, 목적하는 이소타입을 갖는 중쇄를 보유한 골수종 또는 기타 세포주를 제조하고, 경쇄를 보유하는 기타 골수종 또는 기타 세포주를 제조한다. 이 후, 이러한 세포를 융합시켜, 온전한 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다.

예로서, 본 명세서에서 논의된 CTLA-4 항체의 대부분은 인간 항-CTLA-4 IgG2 항체이다. 이러한 항체는 CTLA-4 분자에 대한 목적하는 결합을 보유하기 때문에, 이러한 항체중 어떤 것은, 예컨대 동일한 가변부(항체 특이성 및 그 친화도의 일부를 정함)를 보유하면서 쉽게 이소타입 전환되어 인간 IgG4 이소타입을 형성할 수 있다.

따라서, 전술한 바와 같은 목적하는 "구조적" 특성에 부합하는 항체 후보를 형성하기 때문에, 일반적으로 이소타입 전환을 통해 목적하는, 적어도 특정 부가적인 "기능" 특성을 제공할 수 있다.

기타 치료법의 고안 및 형성

본 발명에 따르고 CTLA-4에 대하여 본 명세서에서 생성하고 특성 규명한 항체의 활성을 기초로 하여, 기타 항체, 기타 길항제 또는 항체 이외의 화학적 성분을 포함하는 기타 치료 방식을 쉽게 고안할 수 있다. 그러한 방식의 비제한적인 예로는, 유사한 결합 활성 또는 기능성을 보유한 항체, 진보형 항체 치료법, 예컨대 이특이적 항체, 면역독소 및 방사능 표지된 치료법, 펩티드 치료 형성, 유전자 치료, 특히 인트라바디(intrabodies), 안티센스 치료 및 소분자 등이 있다. 또한, 전술한 바와 같이, 본 발명의 항체의 효과기 기능은 각종 치료법에 사용하기 위해서 이소타입을 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE. 또는 IgM으로 전환시켜 변화시킬 수 있다.

진보형 항체 치료의 형성과 관련하여, 보체 고정이 바람직한 특성인 경우, 예컨대 이특이성(bispecific), 면역독소 또는 방사능 표지의 사용을 통해 세포 사멸용 보체에 대한 의존성을 피할 수 있다.

이특이적 항체와 관련하여, (i) CTLA-4에 대한 특이성을 갖는 하나의 항체와, 제2 분자에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항체가 서로 접합된 2개의 항체, (ii) CTLA-4에 특이적인 하나의 쇄와 제2 분자에 특이적인 제2 쇄를 보유한 단일 항체, 또는 (iii) CTLA-4 및 기타 분자에 대한 특이성을 보유한 단일쇄 항체를 포함하는 이특이적 항체를 형성할 수 있다. 이러한 이특이적 항체는, 예를 들어 당업계에 공지된 기법을 사용하여 형성할 수 있는데, 상기 (i) 및 (ii)와 관련하여서는, 예컨대 Fanger 등의 문헌[Immunol Methods 4:72-81 (1994)]와 Wright 및 Harris의 상기 문헌을 참조하고, 상기 (iii)과 관련하여서는, 예컨대 Traunecker 등의 문헌[Int. J Cancer(Suppl.) 7:51-52(1992)]을 참조.

또한, 카파체(Kappabodies)"(III 등 "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng l0:949-57(1997)), "미니체(Minibodies)"(Martin 등, "The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6" EMBO J 13:5303-9(1994)), "2항체(Diabodies)"(Holliger 등, "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)), 또는 "야뉴신(Janusins)"(Traunecker 등, "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cel1s" EMBO J l0:3655-3659 (1991) 및 Traunecker 등, "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992))도 제조할 수 있다.

면역독소와 관련하여, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 면역독소로서 작용 하도록 항체를 변형시킬 수 있다. 예컨대 Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) 참조. 예컨대 미국 특허 제5,194,594호 참조. 방사능 표지된 항체의 제조와 관련하여, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 그러한 변형된 항체를 쉽게 제조할 수 있다. 예컨대, Junghans 등, Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(제2판, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven(1996)) 참조. 또한, 미국 특허 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호, 및 제5,697,902호 참조. 면역독소 및 방사능 표지된 분자 각각은 CTLA-4 발현 세포, 특히 본 발명의 항체가 효과적인 세포를 사멸시킬 것 같다.

치료 펩티드의 형성과 관련하여, CTLA-4 및 이의 항체(예컨대, 본 발명의 항체(소분자와 관련하여 후술되는 바와 같음))와 관련된 구조 정보를 이용하고 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써, CTLA-4에 대해 유도되는 치료 펩티드를 형성할 수 있다. 펩티드 요법 고안 및 스크리닝은 문헌[Houghten 등, Biotechniques 13:412-421(1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135(1985), Pinalla 등, Biotechniques 13:901-905(1992), Blake 및 Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513(1992)]과 관련하여 논의되어 있다. 면역독소 및 방사능표지된 분자를 제조할 수 있으며, 유사한 방식으로 항체와 관련하여 전술한 바와 같이 펩티드 성분을 제조할 수 있다.

항원에 대한 항체의 결합에 관련된 중요한 정보는 파지 디스플레이 실험을 통해서 수집할 수 있다. 일반적으로 그러한 실험은, 결합한 펩티드를 분리할 수 있는지를 결정하기 위해서 본 발명의 항체와 결합하는 무작위 펩티드를 발현하는 파 지 라이브러리를 선별하여 달성한다. 성공적인 경우, 일부 에피토프 정보를 결합한 펩티드로부터 수집할 수 있다.

일반적으로, 무작위 펩티드를 발현하는 파지 라이브러리는 박테리오파지 M13계를 주성분으로 하는 뉴 잉글랜드 바이오랩(각각 7량체 및 12량체 라이브러리, Ph.D.-7 펩티드 7량체 라이브러리 키트 및 Ph.D.-12 펩티드 12량체 라이브러리 키트)으로부터 구입할 수 있다. 7량체 라이브러리는 대략 2.0 ×10⁹개의 독립 클론의 다양성을 나타내며, 전부는 아니더라도 대부분은 20⁷=1.28 ×10⁹개의 가능한 7량체 서열을 나타낸다. 12량체 라이브러리는 대략 1.9 ×10⁹개의 독립 클론을 포함하며, 매우 소수의 샘플만이 20¹²=4.1 ×10¹⁵개의 12량체 서열의 유효 서열 스페이스를 제공한다. 7량체 및 12량체 라이브러리 각각은 제조업자의 지시에 따라서 평판을 항체로 코팅하여 적절한 항체(예컨대 IgG 항체의 경우 염소 항인간 IgG Fc)를 포집한 다음 세척하므로써 선별하거나 스크리닝한다. 결합된 파지는 0.2 M 글리신-HCl, pH2.2로 용출시킨다. 일정한 엄중도(0.5% 트윈)에서 3회 선별/증폭시킨 후에, DNA 서열 결정을 이용하여 항체 중 하나 이상과 반응성이 있는 라이브러리로부터 유래한 클론의 특성을 규명할 수 있다. 펩티드의 반응성은 ELISA로 측정할 수 있다. 펩티드의 에피토프 분석에 관한 추가의 논의에 대해서는 Scott, J.K. 및 Smith, G.P. Science 249:386-390(1990); Cwirla 등, PNAS USA 87:6378-6382(1990); Felici 등, J. Mo1. Bio1. 222:301-310(1991), 및 Kuwabara 등, Nature Biotechnology 15:74- 78 (1997) 참조.

종래의 기법을 통한 유전자 및/또는 안티센스 요법은 본 발명을 통해 쉽게 고안가능하다. 이러한 양식은 CTLA-4의 기능을 조절하는데 이용할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 여기에 관련된 기능 분석의 고안 및 사용을 용이하게 한다. 안티센스 요법에 대한 고안 및 방법은 국제 특허 출원 제WO 94/29444호에 상세히 개시되어 있다. 유전자 치료에 대한 고안 및 전략은 공지되어 있다. 그러나, 특히 인트라바디를 포함하는 유전자 치료법을 사용하면 특히 유리한 것으로 판명되었다. 예컨대, Chen 등, Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) and Marasco Gene Therapy 4:11-15(1997) 참조. 유전자 치료법의 일반적 고안 및 이와 관련된 고려 사항은 국제 특허 출원 WO 97/38137호에 논의되어 있다. 본 발명의 항체(예, 4.1.1, 4.8.1, 또는 6.1.1 등)를 암호화하는 유전자 물질은 적절한 발현계(바이러스, 약독화된 바이러스, 비바이러스, 나출형 또는 기타)에 포함시킬 수 있으며, 숙주 내에서 항체를 생체내 형성하기 위해서 숙주에게 투여할 수 있다.

소분자 치료법을 본 발명에 따라서 고려할 수 있다. 약물은 본 발명을 기초로 CTLA-4의 활성을 조절하도록 고안할 수 있다. CTLA-4 분자의 구조와 본 발명에 따른 기타 분자, 예컨대 본 발명의 항체, CD28, B7, B7-1, B7-2 등과 CTLA-4의 상호작용으로부터 수집한 정보를 이용하여 추가의 치료 양식을 합리적으로 고안할 수 있다. 이러한 측면에서, X-선 결정학, 컴퓨터 보조형(또는 조력형) 분자 모델링(CAMM), 정량 또는 정성 구조-활성 관계(QSAR) 및 유사한 기법 등의 합리적인 약물 고안 기법을 이용하여 약물 개발 노력에 집중할 수 있다. 합리적인 고안으로 CTLA- 4의 활성을 변형 또는 조절하는데 사용할 수 있는 분자 또는 이의 특정 형태와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 합성 구조를 예측할 수 있다. 이러한 구조는 화학적으로 합성하거나 또는 생물학적 시스템에서 발현할 수 있다. 이러한 방법은 Capsey 등의 문헌[Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs(뉴욕 Stockton Press (1988)]에 검토되어 있다. 실제로, 공지되거나 또는 설명되어 있는 기타 분자(예, 본 발명의 항체)와의 구조-활성 관계를 기초로 분자(펩티드, 펩티도모조체, 소분자 등)를 합리적으로 고안하는 것은 일반적으로 일상적인 것이 되어 있다. 예컨대, Fry 등, "Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor" Proc Natl Acad Sci USA 95:12022-7 (1998); Hoffman 등, "A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain" J Mol Biol 282:195-208(1998); Ginalski 등 "Modelling of active forms of protein kinases: p38--a case study" Acta Biochim Pol 44:557-64(1997); Jouko 등, "Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure" Biochem J 322:927-35(1997); Singh 등, "Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases" J Med Chem 40: 1130-5 (1997); Mandel 등, "ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure mode1ing" Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini 등, "Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists" Proc Assoc Am Physicians l08:420-31 (1996); Furet 등, "Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411" J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995) 참조.

또한, 조합 라이브러리를 고안하고 합성하여, 스크리닝 프로그램, 예컨대 고처리량 스크리닝 작업에 사용할 수 있다.

치료제 투여 및 제형화

본 발명에 따른 치료제는 적절한 담체, 부형제와, 운반, 전달, 관용성 등을 개선시키기 위해 제제내로 혼입되는 기타 제제와 함께 투여할 수 있다. 다수의 적절한 배합은 모든 약학자에게 공지된 처방서에서 찾을 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences(15판, Mack Publishing Company, 미국 펜실베니아주 이스톤(1975)), 구체적으로 그 문헌내의 Blaug, Seymour에 의한 제87장. 이들 배합물은, 예컨대 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예, Lipofectin^TM), DNA 접합체, 무수 흡수성 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 전술한 혼합물 중 어떤 것도 본 발명에 따른 치료 및 처리에 적합할 수 있지만, 배합물내 활성 성분은 그 배합물에 의해서 불활성화되서는 안되고, 배합물은 생리학적으로 투여 경로에 적합하고 관용성이 있어야 한다. 예컨대, 제약 화학자들에게 공지되어 있는 Powell 등의 문헌["Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)]과 그 문헌내 부형제 및 담체에 관련된 추가의 정보에 대한 인용문헌 참조.

항체 제조

본 발명의 항체는 인간 항체의 실질적인 부분을 생성하는 삽입된 게놈을 보유하지만 내인성 쥐 항체의 생성이 결여된 돌연변이 마우스를 이용하여 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생성할 수 있으며, 쥐 면역글로불린 분자 및 항체 생성은 결여되어 있다. 이를 달성하는데 이용되는 기법은 본 명세서의 배경 기술에서 기재한 특허, 출원 및 참조 문헌에 개시되어 있다. 그러나, 구체적으로 마우스 및 이로부터 유래한 항체의 유전자 조작을 통한 생성과 관련된 바람직한 구체예는, 본 명세서에서 참고로 인용한 미국 특허 출원 일련번호 08/759,620호(1996년 12월 3일 출원)에 개시되어 있다. 또한, 본 명세서에서 참고로 인용한 Mendez 등의 문헌[Nature Genetics 15:146-156(1997)] 참조.

그러한 기법을 사용하여, 본 발명자들은 각종 항원에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 생성하였다. 필수적으로, 본 발명자들은 해당 항원으로 마우스 중 제노마우스^TM 종을 면역화시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프 세포(예, B-세포)를 회수하고, 회수된 세포를 골수종 유형의 세포주와 융합시켜 무한성장성 하이브리도마 세포주를 제조하고, 이 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하여 해 당 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정한다. 본 발명자들은 CTLA-4에 특이적인 항체를 제조하기 위해서 본 발명에 따라 이들 기법을 이용하였다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 CTLA-4에 특이적인 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마 세포주를 생산하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 본 발명자들은 그러한 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 비롯하여, 그러한 세포주가 생성하는 항체의 특성을 제공한다.

본 명세서에서 논의한 하이브리도마 세포주로부터 유도된 항체는 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1로 명명한다. 전술한 세포주가 생성하는 항체 각각은 인간 카파 경쇄를 보유한 완전한 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄이다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 매우 높은 친화도를 보유한다. 통상적으로 고상 또는 액상으로 측정시 Kd가 약 10^-9 내지 약 10^-11 M이다.

인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현시킬 수 있다. 특정 항체에 대한 cDNA 또는 게놈 클론을 암호화하는 서열은 적절한 포유류 또는 비포유류 숙주 세포의 형질전환에 사용할 수 있다. 형질전환은, 예컨대 바이러스내에서(또는 바이러스 벡터내로) 폴리뉴클레오티드를 패키징하고, 숙주 세포에 이 바이러스(또는 벡터)를 형질도입하는 것을 포함하여, 숙주 세포내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 공지된 방법으로 수행하거나, 또는 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호(이들 특 허는 본 명세서에서 참고로 인용함)에 예시된 바와 같이 당업계에 공지된 형질감염 절차로 수행할 수 있다. 사용된 형질전환 절차는 형질전환시키고자 하는 숙주에 따라 달라진다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포내로 도입하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 그 비제한적인 예로는 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질 융합, 일렉트로포레이션, 입자 충격법, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 펩티드 접합체, 덴드리머(dendrimer) 및 DNA의 핵내로의 직접 현미 주입법 등이 있다.

발현용 숙주로서 이용가능한 포유류 세포주가 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)에서 입수가능한 여러 무한성장성 세포주, 예컨대 비제한적인 예로서 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO₀, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예, HepG2) 및 기타 여러 세포주 등이 있다. 비포유류 세포의 비제한적인 예로는 박테리아, 효모, 곤충 및 식물 등이 있으며, 이들 세포를 사용하여 재조합 항체를 발현할 수 있다. 글리코실화를 제거하는 항체 CH2 도메인의 위치 지정 돌연변이는 비인간 글리코실화로부터 생긴 면역원성, 약물동력학 및/또는 효과기 작용의 변화를 방지하는데 바람직할 수 있다. 발현 방법은, 어떤 시스템이 최대 수준으로 발현시키는지를 측정하여 선택하고, 구조성 CTLA-4 결합 특성을 갖는 항체를 생성한다.

또한, 생성 세포주로부터의 본 발명의 항체(또는 이로부터 유래한 기타 성분)의 발현은 다수의 기존 기술을 사용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타 민 신테타제 및 DHFR 유전자 발현계는 특정 조건하에서 발현을 증가시키는 공통적인 방법이다. 고발현 세포 클론은 종래 기술, 예컨대 유한 희석 클로닝 및 마이크로드롭 기술을 사용하여 확인할 수 있다. GS계는 유럽 특허 출원 0 216 846호, 0 256 055호 및 제0 323 997호와 유럽 특허 출원 제89303964호에 전체적으로 또는 부분적으로 개시되어 있다.

본 발명의 항체는, 해당 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 돌연변이시킨 포유류 또는 식물의 형성과 이로부터 회수가능한 형태의 항체 생성을 통하여 형질전환 방식으로 생성할 수 있다. 포유류에서의 돌연변이 생성과 관련하여, 항체를 염소, 소 또는 기타 포유류의 젖에서 생성하고, 이로부터 회수할 수 있다. 예컨대 미국 특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호 및 제5,741,957호 참조.

본 발명의 항체를 구조적으로 그리고 기능적으로 분석하였다. 항체의 구조와 관련하여, 중쇄 및 카파 경쇄의 아미노산 서열은 하이브리도마의 RT-PCR을 통해 얻은 cDNA 서열을 기초로 추정하였다. 예컨대, 실시예 3 및 4와 도 1∼8 참조. 항체의 N 말단 서열 결정은 실시예 3 및 4에서 논의한 결과의 확인을 위해서 수행하였다. 실시예 5 및 도 9 참조. 항체의 동력학 분석을 수행하여 친화도를 측정하였다. 실시예 2 참조, 본 발명의 항체(및 구체적으로 본 발명의 항체 4.1.1, 4.8.1, 및 6.1.1)는 높은 친화도(4.1.1: 1.63 ×10¹⁰ ℓ/M; 4.8.1: 3.54 ×10¹⁰ ℓ/M; 및 6.1.1: 7.2 ×10⁹ ℓ/M )를 보유한다. 또한, 항체는 등전점 전기영동(IEF), 환원 겔 전기영동(SDS-PAGE), 크기 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피/질량 분광 법, 및 질량 분광법으로 분석하였으며, 하이브리도마에 의한 항체 생성을 평가하였다. 실시예 6 및 도 10 참조.

본 발명의 항체의 기능 분석과 관련하여, 그러한 항체는 CTLA-4와 B7계열 분자의 리간드에 대한 이의 결합의 유효 억제제인 것으로 판명되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 B7-1 또는 B7-2에 대한 CTLA-4 결합을 차단하는 것으로 입증되었다. 실시예 7 참조. 실제로, 본 발명의 다수의 항체는 B7-1 및 B7-2에 대한 CTLA-4 결합을 억제하는데 있어서 나노몰 또는 나노몰 이하의 IC₅₀을 보유한다. 또한, 본 발명의 항체는 CD28, CD44, B7-2 또는 hIgG1과 비교하여 CTLA-4에 대한 우수한 선택성을 보유한다. 실시예 8 참조. 선택성은, 제2 제제 및 경우에 따라 기타 분자와의 분자 결합과 비교하여 제1 제제와 분자의 우선적 결합도를 반영하는 비율이다. 본 명세서에서, 선택성은 CD28, CD44, B7-2 또는 hIgG1과 같은 기타 분자에 대한 항체 결합과 비교하여 CTLA-4에 대한 본 발명의 항체의 우선적 결합도를 의미한다. 본 발명의 항체의 선택성 수치는 500:1 이상인 것이 일반적이다. 본 발명의 항체는 T 세포 아세포 모델에서 배양된 T 세포에 의해 특정 시토킨(예, IL-2 및 IFN-γ)의 발현을 유도하거나 증가시키는 것으로 확인되었다. 실시예 9 및 10과 도 12∼17 참조. 또한, 본 발명의 항체는 적절한 생체내 종양 모델에서 종양 성장을 억제할 것으로 기대된다. 모델의 고안은 실시예 11 및 12에 논의되어 있다.

본 발명에 따라 입증된 결과는, 본 발명의 항체를 CTLA-4에 대한 현재의 치료 항체보다 더욱 효과적인 항체로 만드는 어떤 특성을 본 발명의 항체가 보유함을 제시한다.

특히, 본 발명의 4.1.1, 4.8.1 및 6.1.1 항체는 상당히 바람직한 특성을 보유한다. 그 구조 특성, 기능 또는 활성은 전술한 바와 같은 추가의 항체 또는 기타 분자의 고안 또는 선별을 용이하게 하는 기준을 제공한다. 이러한 기준으로는 다음 사항 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 항체 중 하나 이상의 항체와 CTLA-4에 결합에 대해 경쟁하는 능력;

본 발명의 항체 중 하나 이상의 항체와 같은 CTLA-4에 대한 유사한 결합 특이성;

약 10^-9 M 이상, 바람직하게는 약 -10^-10 M 이상의 CTLA-4에 대한 결합 친화도;

바람직하게는 마우스, 래트 또는 토끼를 비롯한 하등 포유류 CTLA-4, 바람직하게는 마우스 또는 래트 CTLA-4와 교차 반응하지 않음;

바람직하게는 게잡이 원숭이 및 붉은 털 원숭이 CTLA-4를 비롯한 영장류 CTLA-4와 교차 반응함;

CD28, B7-2, CD44 또는 hIgG1보다 약 100:1 이상, 바람직하게는 약 300, 400, 또는 500:1 이상의 CLTA-4에 대한 선택도;

약 l00 nM 이하, 바람직하게는 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.38 nM 이하로 B7-2에 대한 CTLA-4의 결합을 차단하는 IC₅₀;

약 l00 nM 이하, 바람직하게는 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.50 nM 이하로 B7-1에 대한 CTLA-4의 결합을 차단하는 IC₅₀;

1종 이상의 시험관내 분석에서의 시토킨 생성 증가, 예컨대:T 세포 아세포/라지 분석에서 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 750, 1000, 1500, 2000, 3000 또는 3846 pg/㎖ 이상의 IL-2 생성 증가;

T 세포 아세포/라지 분석에서 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 750, 1000, 또는 1233 pg/㎖ 이상의 IFN-γ 생성 증가; 또는

hPBMC 또는 전혈 초항원 분석에서 약 500 pg/㎖ 이상, 바람직하게는 750, 1000, 1200, 또는 1511 pg/㎖ 이상의 IL-2 생성 증가. 또 다른 방식으로 표현하면, IL-2 생성은 분석에서의 대조군과 비교하여 약 30, 35, 40, 45, 50% 이상 증가되는 것이 바람직하다.

이들 특성 중 하나 이상을 보유한 항체(또는 이로부터 고안되거나 합성된 분자)는 본 발명에 개시된 항체와 유사한 효능을 보유할 것으로 예상된다.

전술한 바람직한 기능 특성은 종종 본 발명의 항체와 유사한 방식(즉, CTLA-4 분자와 동일 또는 유사한 에피토프에 결합)으로 어느 한 분자(즉, 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 소분자)가 CTLA-4와 결합하고 CTLA-4을 억제시킴으로써 생길 수 있다. 분자는 직접(즉, 이러한 분자를 환자에게 직접 투여) 투여할 수 있다. 혹은, 대안적으로, 분자는 간접 "투여"할 수 있다(즉, 환자에게 면역 반응을 생성하는 펩티드 등(백신과 유사함)을 투여할 수 있으며, 면역 반응은 동일하거나 유사한 에피 토프에 결합하는 항체, 또는 상기 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자 물질의 투여 후에 동일계에서 생성되는 항체 또는 단편의 생성을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체가 결합하는 CTLA-4상의 에피토프는 본 발명에 따라 치료 제제 및/또는 고안과 관련하여 유용할 수 있다. 약물 고안시, 음성 정보가 종종 유용할 수도 있다(즉, CTLA-4에 결합하는 항체가 CTLA4의 억제제로서 작용하는 에피토프에 결합하는 것으로 보이지 않는다는 사실은 유용하다). 따라서, 바람직한 기능성을 초래하지 않는 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 매우 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체와 동일하거나 또는 유사한 에피토프에 결합하는 분자(및 구체적으로 항체)는 본 발명에 따라 예측할 수 있다.

본 발명의 항체와 이들이 결합하는 에피토프가 본 발명에 따라 예측된다는 사실 외에도, 본 발명자들은 본 발명의 일부 항체, 구체적으로는 본 발명의 4.1.1 및 11.2.1 항체의 일부 예비적인 에피토프 지도작성 연구를 수행하였다.

제1 단계로서, 본 발명자들은 BIAcore 경쟁 연구를 수행하여 CTLA-4에 대한 결합에 경쟁하는 능력과 관련하여 본 발명의 일부 항체 간의 결합에 관한 대략적인 지도를 형성하였다. 이를 위해서, CTLA4는 BIAcore 칩에 결합하고, 포화 조건하에서 제1 항체가 여기에 결합하고, CTLA-4에 대한 후속 2차 항체의 결합 경쟁을 측정하였다. 이 기법으로 항체 계통을 분류할 수 있는 개략적인 지도를 형성할 수 있다.

이 과정을 통해, 본 발명자들은 본 발명의 일부 항체가 다음 에피토프 카테고리 내에 속하는 것으로 분류될 수 있음을 결정하였다:

카테고리	항체	CTLA-4 결합에 대한 경쟁
A	B01M*	서로 자유롭게 교차 경쟁함; 카테고리 B와 교차 경쟁; 일부는 카테고리 D와 교차 경쟁
	B02M**
B		4.1.1	서로 자유롭게 교차 경쟁함; 카테고리 A, C 및 D와 교차 경쟁
	4.13.1
		C
6.1.1			서로 자유롭게 교차 경쟁함; 카테고리 B 및 C와 교차 경쟁
3.1.1
	4.8.1
		11.2.1
			11.6.1
			11.7.1
D
	4.14.3
		카테고리 C 및 B와 교차 경쟁; 일부는 카테고리 A와 교차 경쟁
			E	4.9.1	BNI3은 CTLA4에 대한 4.9.1 결합을 차단하지만, 그 역은 성립하지 않음
				BNI3***
			(*)(**) 바이오스트라이드에서 입수가능 (***) 파미겐에서 입수가능

다음 단계로서, 본 발명자들은 본 발명의 항체가 웨스턴 블롯 상에서 환원 및 비환원 조건하에 CTLA-4 상의 선형 에피토프를 인식할 수 있는지를 측정하려고 하였다. 본 발명자들은 본 발명의 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1 또는 11.2.1 항체 중 어떤 것도 웨스턴 블롯 상에서 CTLA4의 환원형을 인식하지 않는 것으로 보임을 관찰하였다. 따라서, 이들 각각의 항체가 결합된 에피토프는 선형 에피토프가 아니며, 그 구조가 환원 조건하에서 와해될 수 있는 입체 에피토프일 것 같다.

따라서, 본 발명자들은 본 발명의 항체의 결합에 중요한 CTLA-4 분자내 잔기에 관하여 터득할 수 있는지를 결정하고자 하였다. 본 발명자들이 이용한 한 방법은 인간 CTLA-4와 2개의 고도로 보존된 영장류 CTLA-4 분자(게잡이 원숭이 및 명주 원숭이 CTLA-4) 사이에서의 해리 속도(off-rate)의 동력학 평가를 수행하는 것이었다. BIAcore 연구는 본 발명의 4.1.1 항체가 동일한 속도로 인간, 게잡이 원숭이 및 명주 원숭이 CTLA-4에 결합한다는 것을 입증하였다. 그러나, 해리 속도(친화도)와 관련하여, 4.1.1 항체는 인간의 경우 최대 친화도(최저의 해리 속도)를, 게잡이 원숭이의 경우에는 더 빠른 해리 속도를, 명주 원숭이의 경우 휠씬 더 빠른 해리 속도를 나타내었다. 한편 본 발명의 11.2.1 항체는 거의 동일한 속도로 인간, 게잡이 원숭이 및 명주 원숭이 CTLA-4에 결합하고, 3종 각각에 대하여 대략 동일한 비교 해리 속도를 보유한다.

본 발명의 카테고리 B 및 C 항체가 결합하는 에피토프를 추가로 연구하기 위해서, 본 발명자들은 일부 위치 지정 돌연변이 연구를 수행하였다. 명주 원숭이 CTLA4는 인간 CTLA4와 비교하여 잔기 105번 및 106번에서 2개의 중요한 변화를 보유하였다. 이러한 차이는 잔기 105번에서의 류신의 메티오닌으로의 변화와 잔기 106에서 글리신의 세린으로의 변화이다. 따라서, 본 발명자들은 L105M 및 G106S 변화를 보유한 돌연변이된 CTLA4를 암호화하도록 인간 CTLA4를 암호화하는 cDNA를 돌연변이시켰다. 상동성 치환 돌연변이 CTLA4는 B7.2-IgG1 융합 단백질의 결합에 영향을 주지 않는다. 또한, 본 발명의 11.2.1 항체와의 결합은 영향을 받지 않았다. 그러나, 이러한 분자는 본 발명의 4.1.1 항체(명주 원숭이와 유사)와 결합하는 능력을 상당히 억제하였다. 그 다음, 본 발명자들은 명주 원숭이 CTLA4를 암호화하는 cDNA를 돌연변이시켜 S106G 변화를 보유한 돌연변이 명주 원숭이 CTLA4를 형성하였다. 그러한 변화는 4.1.1 항체 및 명주 원숭이 CTLA4 돌연변이 간의 안정한 결합의 복원을 초래하였다. 또한, 본 발명자들은 명주 원숭이 CTLA4를 암호화하는 cDNA를 돌연변이시켜 M105L 변화를 보유한 돌연변이 명주 원숭이 CTLA-4를 형성하였다. 이러한 변화는 4.1.1 항체 및 돌연변이 CTLA4 간의 결합을 부분적으로 복원시켰다.

본 발명의 카테고리 B 내지 D 항체 각각은 유사한 기능적 특성을 보유하는 것으로 보이며, 강력한 항-CTLA4 치료제로서 작용하는데 유효한 것으로 보인다. 또한, 각 분자는 CTLA4에 대한 결합에서 교차 경쟁한다. 그러나, 상기 논의 내용으로부터 관찰되는 바와 같이, 상이한 카테고리내 각 분자는 CTLA4에서 별도의 입체 에피토프에 결합하는 것으로 보인다.

전술한 내용으로부터, 상기 논의한 에피토프 정보는 본 발명의 항체와 교차 경쟁하는 항체(또는 전술한 바와 같은 기타 분자)가 본 발명에 따른 일부 치료 가 능성을 보유함을 제시한다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 항체와 교차 경쟁하는(즉, 카테고리 B, C 및/또는 D 항체와 교차 경쟁하는) 항체(또는 전술한 바와 같은 기타 분자)는 본 발명에 따른 일부 추가의 치료 가능성을 보유할 것임이 예측된다. 추가로, 본 발명의 항체와 교차 경쟁(즉, 카테고리 B, C 및/또는 D 항체와 교차 경쟁)하고, (i) 명주 원숭이 CTLA4에 대한 결합이 감소된 항체(11.2.1 항체와 유사), 또는 (ii) 명주 원숭이 CTLA4에 대한 결합이 감소한 항체(4.1.1 항체와 유사)(또는 전술한 바와 같은 기타 분자)는 본 발명에 따른 일부 추가의 치료 가능성을 보유할 것임이 예측된다. 카테고리 A 및 E와 경쟁하는 항체(또는 전술한 바와 같은 기타 분자)는 일부 치료 가능성을 보유한다.

수행된 실험 및 얻은 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시용으로 제공하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예 1

항-CTLA-4 항체 생성 하이브리도마의 형성

본 실시예에 따라서 본 발명의 항체를 제조, 선별 및 분석하였다.

항원 제조: XenoMouse^TM 마우스의 면역화를 위해서 3개의 특징적인 면역원을 제조하였다: (i) CTLA-4-IgG 융합 단백질, (ii) CTLA-4 펩티드 및 (iii) 세포 표면에서 구조적으로 발현되는 CTLA-4(Y201V)의 돌연변이체로 형질감염된 300.19 쥐 림프종 세포.

(i) CTLA-4-IgG1 융합 단백질:

발현 벡터 작제:

CTLA-4의 성숙 세포외 도메인을 암호화하는 cDNA는, 공개된 서열로 고안된 프라이머를 사용하여 인간 흉선 cDNA 라이브러리(클론테크)로부터 PCR 증폭시켰다(Eur. J Immunol 18:1901-1905(1988)). 단편은 신드비스(Sindbis) 바이러스 발현 플라스미드인 pSR5(인비트로겐)내로 인간 온코스타틴 M 신호 펩티드와 인간 IgG 감마1(IgG1) CH1/CH2/CH3 도메인 사이에 직접 서브클로닝하였다. 융합 단백질은 힌지 도메인을 함유하지 않지만, CTLA-4의 세포외 도메인내 시스테인 120을 함유하여 공유 결합의 이량체를 형성한다. 생성 벡터를 CTLA-4-IgG1 pSR5라고 명명하였다. 벡터내 완전한 CTLA-4-IgG1 cDNA는 양 가닥에서 확인된 서열이었다. CTLA-4-IgG 단백질의 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다. CD44의 성숙 세포외 도메인은 인간 림프구 라이브러리(클론테크)로부터 PCR 증폭시키고, pSinRep5 내로 서브클로닝하여 동일한 IgG1 꼬리를 보유한 대조군 단백질을 형성하였다.

OM-CTLA4-IgG1 융합 단백질:

밑줄 친 서열: 신호 펩티드

굵은 글씨로 표시한 서열: CTLA-4 세포외 도메인

CD28의 성숙 세포외 도메인에 대한 cDNA를 인간 림프구 라이브러리(클론테크)로부터 PCR 증폭한 다음 pCDM8(J. Immunol. 151:5261-71 (1993))내로 서브클로닝하여 트롬빈 분해 및 힌지 영역을 함유하는 인간 IgG1 융합 단백질을 생성하였다. 명주 원숭이, 게잡이 원숭이 및 붉은 털 원숭이 CTLA-4는, 축퇴성 PCR의 표준 기법을 이용하여 PHA 자극된 PBMC로부터 분리한 mRNA로부터 클로닝하였다. 서열 결정으로부터, 붉은 털 원숭이 및 게잡이 원숭이 아미노산 서열은 성숙 인간 CTLA-4 세포외 도메인과 다른 3개의 아미노산(S13N, I17T 및 L105M)을 갖는 동일한 서열임이 입증되었다. 명주 원숭이는 성숙 인간 CTLA-4 세포외 도메인과 다른 10개의 아미노산(V21A, V33I, A41T, A51G, 54I, S71F, Q75K, T88M, L105M 및 G106S)을 보유함이 입증되었다. 위치 지정 돌연변이를 이용하여, 인간 CTLA4-IgG와 항체의 상호작용에 중요한 아미노산을 맵핑하기 위해서 명주 원숭이 CTLA-4에서 상이한 모든 아미노산의 단일점 돌연변이를 만들었다. 에피토프 맵핑용 인간 및 명주 원숭이 CTLA4-IgG의 돌연변이는 정합마커 위치 지정 돌연변이 유발법(프로메가)으로 형성하였다. IgG 융합 단백질은 Cos7 세포의 일시적 형질감염으로 생성하고 표준 프로테인 A 기법을 사용하여 정제하였다. 쥐 CTLA4-IgG 단백질을 면역 블롯팅하고 BIAcore 분석을 이용하여 항체와의 결합에 대해 평가하였다.

재조합 단백질 발현/정제:

재조합 신드비스 바이러스는 인비트로겐이 제시한 바와 같이 SP6 시험관내 전사된 CTLA-4-IgG1/pSR5 mRNA 및 DH-26S 헬퍼 mRNA로 어린 햄스터 신장 세포를 일 렉트로포레이션(기브코)하여 형성하였다. 48 시간 후에, 재조합 바이러스를 수거하고, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1)내 최적 단백질 발현에 대한 역가를 측정하였다. CHO-K1 세포는 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청(기브코), 비필수 아미노산(기브코), 4 mM 글루타민(기브코), 페니실린/스트렙토마이신(기브코), 10 mM Hepes pH 7.5(기브코)를 함유하는 DMEM/F12(기브코)내의 현탁액에서 배양하였다. CTLA-4-IgG를 생성하기 위해서, CHO-K1 세포를 DMEM/F12에서 1 ×10⁷ 세포/㎖로 재현탁시키고, 실온에서 1 시간 동안 신드비스 바이러스와 항온배양하였다. 그 다음 세포는 단백질 A 세파로스(파마시아)를 사용하여 소 IgG를 고갈시킨 1% 태아 소 혈청, 비필수 아미노산, 4 mM 글루타민, 12.5 mM Hepes pH7.5 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12에서 1 ×10⁶/㎖로 희석하였다. 48 시간 후에, 감염 세포를 펠렛화하고, 조정 배지를 수거하고, 완전 프로테아제 억제제 정제(뵈링거 만하임)로 보충한 다음 pH를 7.5로 조정하고, 0.2 μ(날겐)으로 여과시켰다. 10 ㎖/분 유속으로 5 ㎖ 단백질 A HiTrap 컬럼(파마시아)을 이용한 FPLC(파마시아)를 사용하여 융합 단백질을 친화도 정제하였다. 컬럼은 PBS 30 베드 부피로 세척하고, 1 ㎖/분에서 0.1 M 글리신/HCl pH 2.8로 용출시켰다. 분획(1 ㎖)을 트리스 pH9를 사용하여 pH7.5로 즉시 중화시켰다. CTLA-4-IgG1을 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 확인하고, 센트리플러스 50(아미콘)을 사용하여 농축시킨 다음, 용매로서 PBS를 사용하여 1 ㎖/분의 유속으로 세파로스 200 컬럼(파마시아)에 가하였다. CTLA-4-IgG1을 함유하는 분획을 모으고, 0.2μ(밀리포어)에서 멸균 여과시키고, 분액화하고, -80℃에서 냉동하였다. 동일한 방법을 사용하여 CD44-IgG1을 발현하고 정제하였다. 일시적으로 형질감염된 Cos7 세포 유래의 조정 배지로부터 CD28-IgG를 정제하였다.

CTLA-4-IgG1의 특성 규명

정제된 CTLA-4-IgG1은 콜로이드 코싸미 염색(Novex)을 이용하여 SDS-PAGE에서 단일 밴드로서 이동하였다. 비환원 조건하에서, CTLA-4-IgG1는 이량체(100 kDa)였으며, 이는 50 mM DTT로 처리한 경우 50 kDa 단량체로 환원되었다. 용액내 정제된 CTLA-4-IgG1의 아미노산 서열 결정으로 CTLA-4의 N-말단(MHVAQPAVVLAS)과, 온코스타틴-M 신호 펩티드가 성숙 융합 단백질로부터 분해된다는 것을 확인하였다. CTLA-4-IgG1은 농도 의존 방식으로 고정된 B7.1-IgG에 결합하고, 그 결합은 햄스터-항-인간 항-CTLA-4 항체(BNI3: 파밍겐)에 의해 차단되었다. 멸균 CTLA-4-IgG1에는 내독소가 없었으며, 흡광 계수로서 1.4를 이용한 OD 280으로 정량하였다. 정제된 CTLA-4-IgG의 수율은 CHO-K1 세포의 0.5∼3 mg/ℓ 범위였다.

(ii) CTLA-4 펩티드:

다음 CTLA-4 펩티드를 하기와 같이 제조하였다:

약어/재료

NMP, N-메틸피롤리디논; TFE, 2,2,2-트리플루오로에탄올; DCM, 디클로로메탄; FMOC, 플루오레닐 메톡시카르보닐. 다음의 예외 시약을 제외하고는 모든 시약 은 퍼킨 알머가 공급하였다: TFE, 알드리치 케미칼, FMOC-PAL-PEG 수지, 퍼셉티브 바이오시스템즈. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH 및 FMOC-Tyr(tBu)-OH는 측쇄 보호기를 요하는 아미노산을 위해 사용하였다.

펩티드 합성:

펩티드 합성은, 301 nm에서의 UV 흡광도를 통한 피드백 모니터링을 구비하도록 개장한 퍼킨-엘머 431A에서 수행하였다(퍼킨-엘머 모델 759A 검출기). 펩티드 서열은 조정 이중 커플링 사이클을 이용하여 FMOC-PAL-PEG 수지에서 조립하였다. 강제된 이중 커플링은 10, 11, 18, 19, 20 및 28 내지 33 사이클로 수행하였다. 각 아실화 사이클의 완료시 DCM 및 TFE의 50% 혼합물로 수지를 세척한 다음, NMP 중 아세트산 무수물로 미반응된 아미노기를 캡핑하였다. 사이클 49를 완성한 후에 수지를 반응기로부터 제거하고, 남은 사이클을 계속 수행하여 완료하였다. 수지로부터의 펩티드 분해는 미정제 CTLA-4 펩티드 186 ㎎을 제공하는 수지 415 ㎎ 상에서 6 시간 동안 시약 K(King 등, International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266(1990))를 사용하여 수행하였다.

펩티드 특성 규명:

미정제 CTLA-4 펩티드 25 ㎎ 분액을 pH6.4에서 5 ㎖ 6M 구아니딘 HCl/100 mM K₂PO₃에 용해시키고, 파마시아 하이 로드 슈퍼덱스 75 16/60 컬럼(16 mm ×600 mm, 120 ㎖ 층 부피)상에서 180분 동안 2 ㎖/분으로 2M 구아니딘.HCl/100 mM K₂PO₃(pH 6.4)로 용출시켜 5 ㎖ 분획을 수거하였다. 분획 1.7 ㎕를 NuPAGE 라멜리 겔에 적재하고, MES 전개 완충액으로 전개하고, 다이치 실버 염색 프로토콜로 가시화하여 그 분획을 분석하였다. 분자량 표준물과 대비하여 판단되는 바와 같이, 12 KDa 분자량을 나타내는 이들 분획을 함께 모으고, 4℃에서 보관하였다. 조합 분획은 UV 및 겔 전기영동으로 분석하였다. 아미노산 서열 결정은 ProSorb 카트리지(PVDF 막에 흡수됨)내 100 ㎕ 샘플을 흡수하고, 완충염을 제거하기 위해 세척하여 수행하였다. 서열 결정은 어플라이드 바이오시스템즈 420에서 수행하였다. 예측되는 N 말단 서열(MHVAQPAVVLA)이 관찰되었다. 면역 블롯팅으로 펩티드는 BNI3 항인간 CTLA-4(파미겐)에 의해 인식됨을 입증하였다. 탈염하기 위해서, 재료 648 ㎍을 함유하는 분액을 3500 DaMWCO 투석관에 두고, 교반하면서 9일 동안 4℃에서 0.1% TFA/H₂O에 대해 투석하였다. 투석 백내의 전체 내용물을 분말로 동결건조하였다.

(iii) CTLA-4(Y201V)로 형질감염된 300.19 세포

전길이 CTLA-4 cDNA는 인간 흉선 cDNA(스트라타젠)로부터 PCR 증폭하고, pIRESneo(클론테크)내로 서브클로닝하였다. 구조성 세포 표면 발현을 초래하는 CTLA-4의 돌연변이는 매치마커 돌연변이유발 시스템(프로메가)을 사용하여 도입하였다. 티로신 Y201의 발린으로의 돌연변이는, CTLA-4의 신속한 내면화에 관여하는 아답틴 단백질 AP50의 결합을 억제한다(Chuang 등, J. Immunol. 159:144-151(1997)). 마이코플라즈마를 함유하지 않는 300.19 쥐 림프종 세포는 10% 태아 송아지 혈청, 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 12.5 Mm Hepes pH7.5 및 25 μM 베타-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640에서 배양하였다. 20 ㎍ CTLA-4-Y201V/pIRESneo를 보유한 1 ㎖ 챔버에서 200V/1180 μF(기브코 셀포레이터)를 사용하여 세포를 일렉트로포레이션하였다. 세포를 10분 동안 정치한 다음, 미리 가온된 완전한 RPMI 배지 8 ㎖에 두었다. 48시간째에, 1 ㎎/㎖ G418(기브코)을 함유하는 완전 RPMI 배지에서 세포를 0.5 ×10⁶/㎖로 희석하였다. 내성 세포는 증식하여, 피코에리트린(파미겐)과 접합된 BNI3 항체를 사용하여 세포 표면에서 CTLA-4를 발현하는 것으로 확인되었다. 높은 수준으로 발현하는 세포를 멸균 분류로 분리하였다.

면역화 및 하이브리도마 형성:

XonoMouse 마우스(8∼10주령)는 (i) 완전 프로인트 보조제와 인산염 완충 염수(PBS)에 재현탁되고, 전술한 CTLA-4를 발현하도록 형질감염된 1×10⁷의 300.19 세포로 꼬리 기부를 피하주사로 면역화시키거나, 또는 (ii) 완전 프로인트 보조제 중에 유화시킨 (a) 10 ㎍ CTLA-4 융합 단백질 또는 (b) 10 ㎍ CTLA-4 펩티드로 꼬리 기부를 피하주사로 면역화시켰다. 각 경우, 투여는 불완전 프로인트 보조제에서 3회 또는 4회 반복하였다. 융합 4일 전에, 마우스에게 PBS 중 면역원 또는 세포를 최종 주사하였다. 면역화된 마우스에서 유래한 비장 및/또는 림프절을 [쥐 비분비성 골수종 P3 세포주]와 융합시키고, 전술한 바와 같이 HAT 선별하였다(Galfre, G. 및 Milstein C., "Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures," Methods Enzymol. 73:3-46(1981)). CTLA-4 특이적 인간 IgG₂κ또는 IgG₄κ(전술한 바와 같이 검출됨) 항체를 분비하는 모든 하이브리도마의 거대 패널을 회수하였다.

ELISA 분석: 마우스 혈청 및 하이브리도마 상청액 중 항원 특이적 항체 측정에 대한 ELISA는 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 사용하여 문헌[Coligan 등, Unit2.1, "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current protocols in immunology(1994)]에 개시된 바와 같이 수행하여 항체를 포집하였다. CTLA-4-Ig 융합 단백질로 면역화시킨 동물의 경우, 본 발명자들은 융합 단백질의 인간 Ig 부분에 대한 비특이적 반응성에 대해 추가로 스크리닝한다. 이는 특이성에 대한 음성 대조군으로서 인간 IgG1으로 코팅된 ELISA 평판을 사용하여 수행한다.

바람직한 ELISA 분석에서, 다음 기법을 사용한다.

ELISA 평판은 평판 코팅 완충액(0.1 M 탄산염 완충액, pH 9.6 및 NaHCO₃(MW 84) 8.4 g/ℓ)에서 항원 100 ㎕/웰로 코팅한다. 평판을 4℃에서 밤새 항온배양한다. 항원 처리 후에, 코팅 완충액을 제거하고, 200 ㎕/웰 차단 완충액(1 × PBS 중 0.5% BSA, 0.1% 트윈20, 0.01% 치메로살)으로 평판을 차단하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다. 혹은, 평판은 차단 완충액 및 평판 시일러와 함께 냉장고에서 보관한다. 차단 완충액을 제거하고, 50 ㎕/웰의 하이브리도마 상청액, 혈청 또는 기타 하이브리도마 상청액(양성 대조군)과 HAT 배지 또는 차단 완충액(음성 대조군)을 첨가하였다. 평판은 2 시간 동안 실온에서 항온처리한다. 항온 처리 후에, 평판은 세척 완충액(1 ×PBS)으로 세척한다. 검출 항체(즉, IgG2 항체의 경우 마우스 항-인간 IgG2-HRP(SB, #9070-05) 또는 IgG4 항체의 경우 마우스 항-인간 IgG4-HRP(SB, #9200-05))를 100 ㎕/웰(마우스 항-인간 IgG2-HRP 약 1:2000 또는 마우스 항-인간 IgG4-HRP 약 1:1000(차단 완충액 중에 각각 희석됨))로 첨가한다. 평판을 1 시간 동안 실온에서 항온처리한 다음, 세척 완충액으로 세척한다. 이 후, 100 ㎕/웰의 새로 제조한 현상액(10 ㎖ 기질 완충액, 5 ㎎ OPD(o-페닐렌디아민, 시그마 카탈로그 번호 P-7288) 및 10 ㎕ 30% H₂O₂(시그마))을 웰에 첨가한다. 음성 대조군웰이 겨우 색을 나타내기 시작할 때까지 평판을 10∼20분 동안 현상시킨다. 그 다음 정지액(2M H₂SO₄) 100 ㎕/웰을 첨가하고, 파장 490 nm에서 ELISA 평판 판독기로 평판을 판독한다.

BIAcore에 의한 완전한 인간 Mab의 친화도 상수 측정:

플라즈몬 공명에 의한 정제된 인간 단일클론 항체, Fab 단편 또는 하이브리도마 상청액의 친화도 측정은, 제조자가 요약한 일반적인 절차에 따라서 BIAcore 2000 기구를 사용하여 수행하였다.

항체의 동력학 분석은 저밀도에서 센서 표면상에 고정된 항원을 사용하여 수행하였다. BIAcore 센서칩의 3개의 표면은, 제조업자(바이어코어 인코포레이티드)가 공급한 아민 커플링 키트를 사용하여 pH5.0에서 10 mM 아세트산나트륨 중 20 또는 50 ㎍/㎖의 CTLA-4-Ig 융합 단백질을 이용하여 대략 390-900 범위의 밀도로 CTLA-4-Ig 융합 단백질로 고정하였다. BIAcore 센서칩의 4번째 표면은 IgG1(900RU) 으로 고정하고, 비특이적 결합에 대해 음성 대조군 표면으로 사용하였다. 동력학 분석은 1분당 25 또는 50 ㎕의 유속으로 수행하고, 해리(kd 또는 k_off) 또는 결합(ka 또는 k_on) 속도는 전역 대입 연산(global fitting calculation)용인 제조업자가 제공한 소프트웨어(BIA 평가 3.0)를 사용하여 수행하였다.

실시예 2

항-CTLA-4 항체의 친화도 측정

다음 표에서, 이러한 방식으로 선택된 일부 항체에 대한 친화도 측정이 제공된다:

[표 1]

관찰되는 바와 같이, 본 발명에 따라서 제조한 항체는 고 친화도 및 결합 상수를 보유한다.

실시예 3

본 발명에 따라 제조된 항-CTLA-4-항체의 구조

하기 논의에서는 본 발명에 따라 제조된 항체와 관련된 구조 정보를 제공한 다.

본 발명에 따라 제조된 항체의 구조를 분석하기 위해서, 본 발명자들은 특정 하이브리도마의 중쇄 및 경쇄 단편을 암호화하는 유전자를 클로닝하였다. 유전자 클로닝 및 서열 결정은 다음과 같이 수행하였다.

폴리(A)⁺ mRNA는 패스트-트랙 키트(인비트로겐)를 사용하여 면역화된 XenoMouse 마우스로부터 유도된 대략 2 ×10⁵ 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. 무작위로 프라이밍된 cDNA를 형성한 다음 PCR하였다. 인간 V_H 및 인간 V_κ 계열 특이적 가변부 프라이머(Marks 등,"0ligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes." Eur. J Immunol. 21:985-991 (1991)) 또는 보편적인 인간 V_H 프라어머, MG-30(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG)을 인간 Cγ2 불변부 (MG-4Od;5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') 또는 C_κ 불변부 (hκP2; 앞서 Green 등의 문헌(1994)에 제시된 바와 같음)에 특이적인 프라이머와 함께 사용하였다. 하이브리도마에서 유래한 인간 Mab-유도된 중쇄 및 카파쇄 전사체의 서열은 전술한 프라이머를 사용하여 폴리(A⁺) RNA로부터 형성된 PCR 생성물을 직접 서열 결정하여 얻었다. PCR 생성물은 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 사용하여 pCRII내로 클로닝하고, 양 가닥은 프리즘 염료-종결인자 서열 결정 키트 및 ABI377 서열 결정 기기를 사용하여 서열 결정하였다. 모든 서열은 MacVector 및 Geneworks 소프트웨 어 프로그램을 사용하여 "V BASE 서열 디렉토리"(Tomlinson 등, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)로 정렬하여 분석하였다.

또한, 항체 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1, 및 6.1.1 각각을 전길이 DNA 서열화하였다. 그러한 서열 결정을 위해서, 폴리(A⁺) mRNA는 mRNA 디렉트 키트(다이날)를 사용하여 대략 4×10⁶ 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. mRNA는 올리고-dT(18) 및 어드밴티지 RT/PCR 키트(클론테크)를 사용하여 역전사시켰다. 가변부 데이타베이스(V BASE)를 사용하여 중쇄 DP50 유전자(5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3')의 ATG 개시 부위에서 시작하여 IgG2 불변부(5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT-3')의 종지 코돈에 이르는 증폭 프라이머를 고안하였다. 최적 코자크 서열(ACCGCCACC)을 ATG 개시 부위에 대한 5'에 첨가하였다. 동일한 방법을 사용하여 카파쇄 A27 유전자(5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3')의 ATG 개시 부위에 대한 프라이머와 카파 불변부(5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3')의 종지 코돈을 고안하였다. 012 cDNA는 ATG 개시 부위(5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT-3)에 대한 프라이머 및 상기 카파 불변부 종지 코돈 프라이머를 사용하여 클로닝하였다. 중쇄 cDNA는 가변 J 도메인의 말단에 NheI 부위를 첨가한 위치 지정 돌연변이 유발과 게놈 IgG2 CH1/힌지/CH2/CH3 영역을 함유하는 NheI 단편의 서브클로닝으로 게놈 작제물로서 클로닝하였다. NheI 부위를 형성하는 점 돌연변이는 배선 유래의 아미노산 서열을 변경하지 않았다. 프라이머쌍은 어드밴티지 하이 피델러티(Advantage High fidelity) PCR 키트(클론테크)를 사용하여 cDNA를 증폭시키는 데 사용하였다. PCR 서열은 염료-종결인자 서열결정 키트와 ABI 서열 결정기를 사용하여 직접 서열 결정하여 얻었다. PCR 생성물은 pEE 글루타민 신테타제 포유류 발현 벡터(론자)내로 클로닝하고 3개의 클론을 서열 결정하여 체세포 변이를 확인하였다. 각 클론에 대하여, 그 서열은 3종 이상의 반응으로 양 가닥에서 확인하였다. 탈글리코실화된 4.1.1 항체는 CH2 도메인내 N294Q의 부위 지정 돌연변이 유발법으로 형성하였다. 재조합 항체는 IgG 고갈된 FCS 중 Cos7 세포의 일시적인 형질감염으로 생성하고, 표준 단백질 A 세파로즈 기법을 사용하여 정제하였다. 안정한 형질감염체는 쥐 NSO 세포의 일렉트로포레이션과 글루타민 무함유 배지에서의 선별로 형성하였다. 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않은 재조합체 4.1.1은 시험관내 EISA 및 BIAcore 분석에서 CTLA-4에 대한 동일한 특이성 및 친화도를 나타내었다.

유전자 유용성 분석

다음 표는 본 발명에 따른 항체의 선택된 하이브리도마 클론으로 입증되는 유전자 유용성을 개시한다.

[표 2]

중쇄 및 경쇄 유전자 유용성

관찰되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 DP-50 중쇄 가변부의 이용 측면으로 강하게 편중되어 형성하였다. DP-50 유전자는 V_H 3-33 계열 유전자라고도 부른다. CTLA-4 결합 및 예비적인 시험관내 기능 분석을 기초로 선별한 유일한 항체는 DP-50 이외의 중쇄 유전자 유용성을 나타내었다. 그 클론 2.1.3은 DP-65 중쇄 가변부를 이용하고, IgG4 이소타입이다. DP-65 유전자는 V_H 4-31 계열 유전자라고도 부른다. 한편, 클론 4.9.1은 DP-47 중쇄 가변부를 보유하는데, CTLA-4에는 결합하지만 B7-1 또는 B7-2에 대한 결합은 저해하지 않는다. XenoMouse 마우스에는, 항체를 형성하는 30개 이상의 특징적인 기능성 중쇄 가변 유전자가 있다. 따라서, 편중성은 항원에의 결합과 기능 활성의 조합 특성에 대하여 항체-항원 상호작용의 바람직한 결합 모티프의 지표이다.

돌연변이 분석

인지되는 바와 같이, 유전자 이용 분석은 제한된 항체 구조 개관만을 제공한다. XenoMouse 동물의 B 세포가 확률적으로(stocastically) V-D-J 중쇄 또는 V-J 카파 경쇄 전사체를 형성할 때, 예컨대 체세포 과잉돌연변이, n-첨가 및 CDR3 연장을 일으키는 여러 2차 프로세스가 있다. 예컨대, Mendez 등, Nature Genetics 15:146-156(1997) 및 미국 특허 출원 일련번호 08/759,620호(1996년 12월 3일에 출원) 참조. 항체 구조를 추가로 조사하기 위해서 항체의 추정 아미노산 서열을 클론으로부터 얻은 cDNA로부터 형성하였다. 또한, N-말단 아미노산 서열은 단백질 서열 결정을 통해 얻었다.

도 1은 클론 4.1.1(도 1A), 4.8.1(도 1B), 4.14.3(도 1C), 6.1.1(도 1D), 3.1.1(도 1E), 4.10.2(도 1F), 2.1.3(도 1G), 4.13.1(도 1H), 11.2.1(도 1I), 11.6.1(도 1J), 11.7.1(도 1K), 12.3.1.1(도 1L), 및 12.9.1.1(도 1M)의 중쇄 및 카파 경쇄의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열을 제공한다. 도 1A, 1B 및 1D에서, 항체 4.1.1, 4.8.1, 및 6.1.1의 연장된 서열은 전술한 바와 같이 cDNA를 전길이 클로닝하여 얻었다. 이 도면에서, 신호 펩티드 서열(또는 이를 암호화하는 염기)은 굵은 글씨로 표시하고, 5'PCR에 이용되는 서열은 밑줄로서 표시한다.

도 2는 클론 4.1.1, 4.8.1, 4.l4.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1에서 유래한 추정 중쇄 아미노산 서열과 배선 DP-50(3-33) 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. DP-50 배선 서열과 클론내의 서열과의 차이는 굵은 글씨로 표시한다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 음영을 넣어 도시한다.

도 3은 클론 2.1.3의 추정 중쇄 아미노산 서열과 배선 DP-65(4-31) 아미노산 서열의 서열 정렬을 제공한다. D-65 배선 서열과 클론내 서열 간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 도시한다.

도 4는 클론 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2, 및 4.13.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A27 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 도시한다. A27 배선 서열과 클론내 서열 간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로 표시한다. 클론 4.8.1, 4.14.3, 및 6.1.1의 CDR1에서의 명백한 결실은 "0"로 표시되어 있다.

도 5는 클론 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 및 11.7.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 0l2 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. 012 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 표시한다.

도 6은 클론 2.1.3의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 Al0/A26 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. Al0/A26 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 표시한다.

도 7은 클론 12.3.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A17 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. A17 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 표시한다.

도 8은 클론 12.9.1의 추정 카파 경쇄 아미노산 서열과 배선 A3/A19 아미노산 서열 간의 서열 정렬을 제공한다. A3/A19 배선 서열과 클론내 서열간의 차이는 굵은 글씨로 표시되어 있다. 이 도면은 항체의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열의 위치를 밑줄로서 표시한다.

도 22는 다음 항-CTLA-4 항체쇄의 일련의 추가의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다:

4.1.1:

전길이 4.1.1 중쇄(cDNA 22(a), 게놈 22(b), 및 아미노산 22(c));

전길이 탈글리코실화된 4.1.1 중쇄(cDNA 22(d) 및 아미노산 22(e));

4.1.1 경쇄(cDNA 22(f) 및 아미노산 22(g));

4.8.1:

전길이 4.8.1 중쇄(cDNA 22(h) 및 아미노산 22(i));

4.8.1 경쇄(cDNA 22(j) 및 아미노산 22(k));

6.1.1:

전길이 6.1.1 중쇄(cDNA 22(l) 및 아미노산 22(m));

6.1.1 경쇄(cDNA 22(n) 및 아미노산 22(o));

11.2.1:

전길이 11.2.1 중쇄(cDNA 22(p) 및 아미노산 22(q)); 및

11.2.1 경쇄(cDNA 22 (r) 및 아미노산 22(s)).

신호 펩티드 서열은 굵고 큰 자구로 표시되어 있다. 전길이 4.1.1 게놈 DNA 서열(도 22(b))에서의 오픈 해독틀은 밑줄로 표시되어 있다. 또한, 탈글리코실화된 4.1.1 중쇄를 제조하기 위해서 도입된 돌연변이 및 생성된 변화(N294Q)는 이중선 및 굵은 글씨체로 표시되어 있다(cDNA(도 22(b) 및 아미노산(도 22(c)).

실시예 4

중쇄 및 경쇄 아미노산 치환 분석

클론 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 및 12.9.1.1에서 유래한 추정 중쇄 아미노산 서열 및 배선 DP-50(3-33) 아미노산 간의 서열 정렬을 제공하는 도 2에서, 관심을 끄는 패턴이 형성된다. 대부분의 클론에서 중쇄 DP-50이 편중된다는 사실 외에도, 배선 DP-50 유전자와 비교하여 항체에서 비교적 한정된 과잉돌연변이가 있다. 예를 들어, 클론 3.1.1 및 11.2.1에는 돌연변이가 없었다. 또한, 기타 클론에서의 돌연변이는 일반적으로 보존성 변화, 예컨대 배선내 아미노산의 유사한 특성을 갖는 아미노산으로의 치환이다. 여러 CDR1 및 CDR2 서열내의 돌연변이는 천연 상태에서 특히 보존성이다. 도 2에 제시된 중쇄 중 3개, 즉 4.10.2, 4.13.1 및 4.14.3은 분명 단일 재조합 사건으로부터 유도된 것이며(즉, 동일한 배선 중심으로부터 유도), 서열이 거의 동일하다. 이들 3개가 단일 서열로서 간주되는 경우, DP50 중쇄를 함유한 10개의 상이한 항체 중에서, CDR1 및 CDR2 내에는 비극성 잔기가 또 다른 비극성 잔기로 대체된 3개의 위치, 극성 비하전된 잔기가 또 다른 극성 비하전된 잔기로 대체된 12개 위치, 및 극성 하전된 잔기가 또 다른 극성 하전된 잔기로 대체된 1개의 위치가 있다. 또한, 구조적으로 매우 유사한 2개의 잔기, 즉 글리신 및 알라닌이 서로 치환된 2개의 위치가 있다. 엄격히 보존성이 아닌 유일 돌연변이는 극성 비하전된 잔기의 극성 하전된 잔기로의 3개의 치환과, 극성 잔기의 비극성 잔기로의 1개의 치환을 포함한다.

이들 항체의 경쇄는 5개의 상이한 Vk 유전자로부터 유도된다. A27 유전자는 가장 많이 나타나고, 6개의 상이한 경쇄의 공급원이다. 이들 6개 서열의 비교는 2개의 주목할만한 특징을 나타낸다. 먼저, 이들 중 3개의 클론 4.8.1, 4.14.3 및 6.1.1은 희소 사건으로서 CDR1내에 1 또는 2개 잔기의 결실을 보유한다. 둘째, CDR3내 6번 위치에서의 세린이 모든 서열에서 치환되었다는 점에서 그 위치는 배선 세린을 강력하게 회피한다. 이는 이 위치에서의 세린이 CTLA-4 결합에 부적합함을 제시하는 것이다.

상기 확인된 여러 아미노산 치환체는 CDR에 아주 근접하여 또는 그 내부에 존재한다는 것을 알 수 있다. 그러한 치환체는 CTLA-4 분자에 대한 항체 결합에 다소 영향을 갖는 것으로 보인다. 또한, 그러한 치환은 항체의 친화도에 상당한 영향을 준다.

실시예 5

본 발명에 따른 항체의 N-말단 아미노산 서열 분석

상기 확인된 본 발명의 항체의 조성 및 구조를 추가로 입증하기 위해서, 본 발명자들은 퍼킨-엘머 서열기를 사용하여 항체의 일부를 서열 결정하였다. 항체의 중쇄 및 카파 경쇄를 분리하고, 예비 겔 전기영동 및 면역 블로팅 기법을 이용하여 정제한 다음 실시예 6에 개시된 바와 같이 직접 서열 결정하였다. 중쇄 서열의 대부분은 그 아미노 말단에서 차단되었다. 따라서, 그러한 항체는 피로글루타메이트 아미노펩티다제로 먼저 처리한 다음 서열 결정하였다.

이 실험 결과는 도 9에 제시되어 있다. 도 9는 질량 분광기(MALDI)로 측정되는 바와 같이 중쇄 및 경쇄의 분자량을 제공하였다.

실시예 6

본 발명의 항체의 추가 특성 규명

도 10은 본 발명의 일부 항체에 관한 일부 부가적인 일정 특성 규명 정보를 제공한다. 이 도면에는, 클론 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 및 6.1.1과 관련된 데이타가 요약되어 있다. 다음 데이타가 제공된다. 농도, 등전점 전기영동(IEF), SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, FACS, 질량 분광법(MALDI), 및 경쇄 N-말단 서열.

일반적으로, 이 데이타는 다음과 같이 얻었다.

재료 및 방법

단백질 농도는 UV 주사(200-350 nm)으로부터 280 nm에서 측정하였으며, 280 nm에서의 1.58 흡광도 유니트는 1 ㎎/㎖와 동일하다.

SDS-PAGE는 10% NuPAGE 겔 및 MES 전개 완충액과 Novex NuPAGE 전기영동계를 사용하여 수행하였다. 샘플은 4 ×NuPAGE 샘플 완충액 (+/-) 베타-머캅토에탄올을 이용하여 3:1로 희석하여 제조하고, 가열한 다음, ∼5 ㎍ 단백질을 겔에 적재하였 다. 겔을 브릴리언트 블루 R 염색 용액(시그마 카탈로그 #B-6529)으로 염색하고, 분자 크기는 "퍼펙트 프로테인 마커"(노바겐 카탈로그 #69149-3)와 염색된 밴드를 비교하여 추정하였다.

N-말단 서열 결정의 경우, 샘플은 NuPAGE 겔 위에서 전술한 바와 같이 조작하고, 프로 블롯 고정화막(어플라이드 바이오시스템즈)으로 전달하고, 코마씨 블루 R-250으로 염색하였다. 염색된 단백질 밴드를 절제하고, 어플라이드 바이오시스템즈 494 프로사이즈 HT 서열 결정기 상에서 자동화된 에드만 분해로 서열 분석하였다.

등전점 전기영동(IEF)은 파마시아 IEF 3-9 pHast 겔(카탈로그 17-0543-01)을 사용하여 수행하였다. 샘플은 10% 글리세롤에서 ∼0.8 ㎎/㎖로 희석하고, 1 ㎕를 겔상에 적재한 다음, 은 염색하였다. pI는 염색된 밴드와 광범위한(pH3-10) IEF 표준물(파마시아 카탈로그 #17-0471-01)을 비교하여 추정하였다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 슈퍼덱스 75 PC 3.2/30 컬럼을 사용하여 파마시아 SMART 시스템 상에서 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 수행하였다. 분자 크기는 겔의 체류 시간과 피크의 체류 시간을 비교하여 추정하였다.

FACS 연구의 경우, 인간 말초 T 세포를 제조하고, 48 시간 동안 자극하였다. T 세포를 1회 세척하고, 1 ×10⁶ 세포/100 ㎕에서 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 실온에서 30분 동안 항-CD3-FITC(프랑스 마르세이유에 소재하는 뮤노테크) 10 ㎕로 CD3 표면 발현에 대해 염색하였다. 세포를 2회 세척한 다음, 고정하고, 투과시키고 (픽스 앤드 펌, 칼택), 항-CD152-PE(파미겐)로 세포내 CTLA-4 발현에 대해 염색하였다. 유동 세포계측법은 벡톤 디킨슨 FACSort를 사용하여 수행하였다. 관련 이소타입 대조군 항체(칼택)의 분석으로 상한을 설정하였다.

전술한 바와 같이, 항-CTLA-4 항체는 일부 강력한 면역 조절 활성을 보유하는 것으로 입증되었다. 다음 실험은, 본 발명에 따른 항체가 그러한 활성을 보유하는지를 측정하기 위해서 수행하였다. 일반적으로, 이들 실험은, CTLA-4와 B7 분자간의 상호작용을 억제하는 항체의 능력을 평가하고, CTLA-4 및 B7 분자와 CD28 사이에서 선택적이며, T 세포 시토킨 생성, 비제한적인 예로서 IL-2 및/또는 IFN-γ발현을 촉진하도록 고안하였다. 또한, 특정 인간 조직 및 다른 종(예, 마우스 및 영장류)의 CTLA-4 분자와 본 발명의 항체의 교차 반응성을 검사하였다.

실시예 7

경쟁 ELISA: 본 발명의 항체에 의한 CTLA-4/B7-1 또는 B7-2 상호작용의 억제

본 발명의 항체가 B7-1 또는 B7-2와 CTLA-4의 결합을 억제할 수 있는지를 검사하기 위해서 시험관내 분석을 수행하였다. 인지되는 바와 같이, B7 분자와 CTLA-4의 결합을 억제할 수 있는 본 발명의 항체는 CTLA-4 경로를 통해 면역 조절에 대한 후보인 것으로 추정된다. 이 분석에서, 다음 재료 및 방법을 이용하였다.

재료 및 방법

듈베코 PBS 중 3 nM B7.1-Ig(G1) 또는 B7.2-Ig(G1)(미국 매사츄세츠주 니드함에 소재하는 리플리겐 인코포레이티드)를 96웰 MaxiSorp 평판(덴마크의 눙크, #439454)상에 코팅하고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 2일째에, B7-Ig를 제거하 고, 2시간 동안 D-PBS 중 1% BSA + 0.05% 트윈-20으로 평판을 차단하였다. 평판을 세척 완충액(D-PBS 중 0.05% 트윈-20)으로 3×세척하였다. 적절한 시험 농도의 항체 및 CTLA-4-Ig(G4)(0.3 nM 최종 농도)(미국 매사츄세츠주 니드함에 소재하는 리플리겐 인코포레이티드)를 15분 동안 예비 혼합한 다음 B7-Ig 피복된 평판(60 ㎕ 총 부피)에 첨가하고, 1.5 시간 동안 실온에서 항온처리히였다. 평판을 3× 세척하고, HRP-표지된 마우스 항-인간 IgG4 항체(미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재하는 자임드, #05-3820) 1∼1000 희석액 50 ㎕를 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 평판을 3×세척하고, 50 ㎕ TMB 마이크웰 퍼옥시다제 기질(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 커크가드 & 페리, #50-76-04)을 첨가하고, 20분 동안 실온에서 항온처리한 다음, 1N H₂SO₄ 50 ㎕를 평판에 첨가하였다. 몰리큘라 디바이스 평판 판독기(미국 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 평판을 450 nm에서 판독하였다. 모든 샘플은 이중으로 시험하였다. 최대 신호는 시험 항체의 부재하에 CTLA-4-Ig 결합으로서 한정되었다. 비특이적 결합은 CTLA-4-Ig 및 시험 항체의 부재하에 흠광도로서 정의되었다.

분석 결과는 하기 표 1a 및 표 1b에 재시되어 있다. 표 1a에서, 본 발명의 각종 항체에 대한 결과가 제시되어 있다. 표 1b에는, 별도의 실험에서 얻은 본 발명의 11.2.1 항체와 본 발명의 4.1.1 항체를 비교한 결과가 제시되어 있다.

실시예 8

CTLA-4 대비 CD28 또는 B7-2에 관한 본 발명의 항체의 선택성 비율

CTLA-4 대비 CD28 또는 B7-2와 관련된 본 발명의 항체의 선택성을 측정하기 위해서, 또 다른 시험관내 분석을 수행하였다. 실험과 관련하여 다음 재료 및 방법을 이용하였다.

CTLA-4 선택성 ELISA: 재료 및 방법

96웰 FluroNUNC 평판(눙크 카탈로그 475515번)을 4종의 항원, 즉 CTLA-4/Ig, CD44/Ig, CD28/Ig 및 B7.2/Ig(조직내에서 형성된 항원)으로 평판 코팅하였다. 항원은 0.1M 중탄산나트륨 완충액, pH9.6에서 1 ㎍/㎖ 100㎍/웰에서 4℃하에 밤새 평판코팅하였다. 그 다음 NUNC 평판 세척기를 사용하여 PBST(PBS + 0.1% 트윈20)로 3회 세척하였다. 평판은 150 ㎕/웰에서 PBST+0.5% BSA로 차단하였다. 평판을 RT에서 1 시간 동안 항온처리한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그 다음 본 발명의 항-CTLA-4 항체를 1 ㎍/㎖의 블록으로 희석한 다음, 평판에 첨가하였다. 평판을 RT에서 1 시간 동안 항온배양한 다음 PBST로 3회 세척하였다. 본 발명의 항체를 함유하는 웰은 블록에서 1:4000으로 희석하여 100 ㎕/웰의 항-인간 IgG2-HRP(서던 바이오테크 카탈로그 9070-05)로 처리하였다. 또한, 1열을 항-인간 IgG(잭슨 카탈로그 209-035-088번)로 처리하여 평판코팅을 위해 표준화시켰다. 항체는 블록에서 1:5000으로 희석하고, 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 또한, 1열은 양성 대조군으로서 항-인간 CTLA-4-HRP(파밍엔 카탈로그 번호 345815/커스텀 HRP 접합됨)로 처리하였다. 이 항체는 블록에서 희석된 0.05 ㎍/㎖로 사용하였다. 평판은 실온에서 1 시간 동안 항온배양한 다음, PBST로 3회 세척하였다. LBA 화학발광 기질(피어스)을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 평판은 5분 동안 평판진탕기에서 항온배양하였다. 그 다음 2분 동안 노출시켜 발광 영상기를 사용하여 평판을 판독하였다.

IGEN CTLA-4-Ig 선택성 결합 분석: 재료 및 방법

M-450 다이나비드(Dynal A.S. 노르웨이 오슬로에 소재, #140.02)는 인산나트륨 완충액, pH7.4로 3×세척하고, 인산나트륨 완충액에 재현탁시켰다. 1.0 ㎍ CTLA-4-Ig(G1), 1.0 ㎍ CD28-Ig(G1) 또는 1.0 내지 3.0 ㎍ B7.2-Ig(G1)(미국 매사츄세츠주 니드함에 소재하는 리플리겐 인코포레이티드)를 비드 100 ㎕에 첨가하고, 4℃하에 회전기에서 밤새 항온배양하였다. 2일째, 듈베코 PBS 중 1% BSA + 0.05% 트윈-20으로 비드를 3 ×세척하고, 30분 동안 차단하였다. 차단 완충액을 사용하여 비드를 1∼10으로 희석하고, 코팅된 비드 25 ㎕를 12 ×75 mm 폴리프로필렌관에 첨가하였다. 모든 샘플은 2중으로 시험하였다. 시험 항체 50 ㎕(1 ㎍/㎖ 최종 농도) 또는 차단 완충액을 관에 첨가하고, 100 rpm으로 와동시키면서 실온에서 오리젠 1.5 어날라이저 회전식 원형 콘베이어(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 IGEN 인터내쇼날 인코포레이티드)에서 30분 동안 항온배양하였다. 25 ㎕의 루테닐화된 쥐 항-인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4(자임드 인코포레이티드, 샌프란시스코, 카탈로그 번호 05-3300, 05-3500 및 05-3800)(100 ㎕의 총 부피 중 최종 농도 3 ㎍/㎖)를 관에 첨가하였다. 관 1개당 오리젠 분석 완충액(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 IGEN 인터내쇼날 인코포레이티드, 카탈로그 번호 402-050-03) 200 ㎕를 첨가하고, 간단히 와동시킨 다음, 그 관을 오리젠 어날라이저에서 계수하고, 각 관에 대해 ECL(전기화학발광) 유닛을 측정하였다. 표준화 인자를 결정하여 다이나비드에 대한 융합 단백질의 결합 차이를 보정하고, ECL 유닛은 선택성 비율을 계산하기 전에 비특이적 결합에 대해 보정하였다.

분석 결과는 표 2a 및 표 2b에 제공되어 있다.

실시예 9

인간 T-세포 신호 모델

면역 조절인자로서 작용하는 본 발명의 항체의 활성을 추가로 한정하기 위해서, 본 발명자들은 특정 T-세포 분석을 개발하여 항체로 CTLA-4 신호의 차단시 T-세포 IL-2 생성의 증강을 정량하였다. 본 실험과 관련하여 다음 재료 및 방법을 이용하였다.

재료 및 방법

새로 분리된 인간 T 세포는 히스토파크(Histopaque)(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마, #A-70543) 및 T-퀵(T-kwik)(림포-퀵, 원 람다, 미국 캘리포니아주 캐노가 파크, #LK-50-T)를 사용하여 제조하고, 1 ×10⁶ 세포/㎖의 농도로 배지(L-글루타민, MEM 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신, 25 mM Hepes 및 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640)에서 PHA(1 ㎍/㎖)(정제된 식물성혈구응집소, 영국 다트포드에 소재하는 뮤렉스 다이아그나스틱스 리미티드, #HA 16으로 자극한 다음 2일 동안 37℃에서 항온배양하였다. 세포를 세척하고, 배지에서 2×10⁶ 세포/㎖로 희석하였다. 라지(Raji) 세포(Burkitt 림프종, 인간 ATCC CCL86 클래스 II 미국 매릴랜드주 록빌에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소)를 1시간 동안 37℃에서 미토마이신 C(미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마, #M-4287)(25 ㎍/㎖)로 처리하였다. 라지 세포를 PBS 중에 4×세척하고, 2 ×10⁶ 세포/㎖로 재현탁시켰다. 인간 T 세포 아세포(5 ×10⁵/㎖), 라지 세포(5 ×10⁵/㎖) 및 항-CTLA-4 항체 또는 이소타입 정합형 대조군 항체를 각종 농도로 96웰 미량역가 평판에 첨가하고, 이 평판을 72 시간 동안 37℃에서 항온배양하였다. 웰당 총 부피는 200 ㎕였다. 자극 72시간 후에 평판을 회전시키고, 상청액을 제거하고, 나중에 IL-2(Quantikine IL-2 ELISA 키트, R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네폴리스, #D2050) 및 IFN-γ(Quantikine IFN-g ELISA 키트, R&D 시스템즈)를 측정하기 위해 냉동시켰다. 시토킨 증가는, 항-CTLA-4 차단 mAb 대비 이소타입 정합형 대조군 항체를 함유하는 배양물 중 시토킨 수준 간의 차이로서 정의된다. 유동 세포계측법 실험을 위해서, 라지 세포를 FACS 완충액(2% 열 불활성화된 FCS, 0.025% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS)으로 1×세척하였다. 세포 펠렛은 1 ×10⁶ 세포/100 ㎕로 FACS 완충액에서 재현탁시키고, 항-CD80-PE(미국 캘리포니아주 샌어제이에 소재하는 벡톤 디킨슨) 및 항-CD86-PE(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 파미겐)과 함께 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 2회 세척하고, 1 ㎖ FACS 완충액에서 재현탁시켰다. 유동 세포계측법은 벡톤 디킨슨 FACSort를 사용하여 수행하였다. 히스토그램 마커는 관련 이소타입 대조군 항체(미국 캘리포니아주 버링게임에 소재하는 칼택) 분석으로 설정하였다.

일반적으로, 본 발명자들은 T-세포 IL-2 상향조절을 신속하게 측정하는데 사용할 수 있는 분석법을 개발하였다. 인지되는 바와 같이, T 세포의 자극은 B7 및 CD28 의존성이다. 또한, LPS 또는 PMW로 자극하여도 세척된 T 세포 아세포는 검출가능한 IL-2를 만들지 않으며 라지 세포는 검출가능한 IL-2를 형성하지 않는다. 그러나, 라지 세포와 함께 동시배양된 T-아세포는 B7, CTLA-4 및 CD28 신호 전달 사건의 모델을 형성할 수 있으며, 여기서 항체의 효과를 평가할 수 있다.

도 11은 실시예 6에 개시된 바와 같이 유동 세포계측법(FACs)을 이용하여 항-CD80-PE 및 항-CD-86-PE mAb를 사용한 라지 세포상의 B7-1 및 B7-2의 발현을 도시한다.

도 12는 CTLA-4 차단 항체(BNI3(파밍엔) 및 본 발명의 항체 4.1.1, 4.8.1, 및 6.1.1)가 유도하는 T 세포 아세포/라지 분석에서의 IL-2 생성의 농도 의존성 증가를 도시한다.

도 13은 CTLA-4 차단 항체(BNI3(파밍엔) 및 본 발명의 항체 4.1.1, 4.8.1, 및 6.1.1)가 유도하는 T 세포 아세포/라지 분석(동일한 공여 T 세포)에서의 IFN-γ 생성의 농도 의존성 증가를 도시한다.

도 14는 T 세포 아세포/라지 분석에서 CTLA-4 차단 항체가 유도하는 6개의 공여체 유래의 T 세포에 있어서 IL-2 생성의 평균 증가를 도시한다. 단일클론 항체 CT4.9.1은 CTLA-4에 결합하지만, B7 결합은 차단하지 않는다는 것을 고려하면 흥미롭다. 따라서, CTLA-4에 대한 단순한 결합은 본 발명의 기능성 항체를 제공하는데 단독으로는 불충분하다.

도 15는 T 세포 아세포/라지 분석에서 CTLA-4 차단 항체가 유도하는 6개의 공여체 유래의 T 세포에 있어서 IFN-γ생성의 평균 증가를 도시한다.

도 19는 실시예 9에 개시된 바와 같은 72시간 T세포 아세포/라지 분석 및 실시예 10에 개시된 바와 같은 초항원 분석에서 30 ㎍/㎖ 농도에서의 본 발명의 4.1.1 항체 및 11.2.1 항체 간의 비교를 도시한다.

도 20은 T 세포 아세포/라지 분석에 있어서 본 발명의 4.1.1 CTAL-4 항체와 11.2.1 CTLA-4 항체가 유도하는 IL-2 생성의 농도 의존성 증가를 도시한다.

다음 표 2c는 본 발명의 라지 및 SEA 분석에서 시토킨 반응의 평균 증가와 증가 범위에 관련된 정보를 제공한다. 결과에 포함된 각 실험은 30 ㎍/㎖ 용량의 항체를 기초로 하였으며, 72시간째에 측정하였다. 실험에 사용된 공여체의 수와 반응 공여체의 수가 제시되어 있다.

분석	mAb	시토킨	평균 증가 (pg/㎖)	SEM	증가 범위 (pg/㎖)	n	반응 공여체
T 세포 아세포/라지	4.1.1	IL-2	3329	408	0∼8861	42	21 공여체 중 19
T 세포 아세포/라지	4.1.1	IFN-γ	3630	980	600∼13939	17	13 공여체 중 13
T 세포 아세포/라지	11.2.1	IL-2	3509	488	369∼6424	18	14 공여체 중 14

SEA(PBMC)	4.1.1	IL-2	2800	312	330∼6699	42	17 공여체 중 17
SEA(PBMC)	11.2.1	IL-2	2438	366	147∼8360	25	15 공여체 중 15

SEA(전혈)	4.1.1	IL-2	6089	665	-168∼18417	46	17 공여체 중 15
SEA(전혈)	11.2.1	IL-2	6935	700	-111∼11803	25	14 공여체 중 12

실시예 10

인간 T 세포 신호 모델

본 발명자들은 항체를 이용하여 CTLA-4 신호의 차단시 T 세포 IL-2 상향조절의 증가를 정량하기 위해서 제2의 세포 분석법을 개발하였다. 본 실험과 관련하여 다음 재료 및 방법을 사용하였다.

재료 및 방법

인간 PBMC는 아큐스핀을 사용하여 제조하였다. 미량역가 평판은 항-CD3 항체(leu4, 벡톤 디킨슨)(60 ng/㎖)로 예비코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 항온배양하였다. hPBMC를 웰당 200,000 세포로 웰에 첨가하였다. 스타필로코커스 엔테로톡신 A(SEA)(시그마)를 100 ng/㎖로 웰에 첨가하였다. 항체를 웰에, 일반적으로 30 ㎍/㎖로 첨가하였다. 그 다음 세포를 48, 72 및 96 시간에 자극하였다. 목적하는 시점에서 평판배양물을 원심분리하고, 상청액을 웰로부터 제거하였다. 이 후, IL-2 생성에 대하여 ELISA(R&D 시스템즈)를 사용하여 상청액을 검사하였다.

이들 실험 결과는 도 16, 17 및 21에 제시되어 있다. 도 16에서는, 자극 72 시간 후에 5개의 공여체 유래의 hPBMC에서 IL-2 생성 유도를 측정하였다. 도 17에서는, 자극 72 시간 및 96 시간 후에 측정시 3개의 공여체 유래의 전혈 중 IL-2 생성 유도의 차이를 분석한, 전혈의 측정 결과를 도시한다.

도 21는 자극 후 72 시간째에 측정한 경우 2 공여체의 전혈에 있어서 IL-2의 생성 증가를 도시한다.

실시예 11

종양 동물 모델

본 발명자들은 종양 성장을 억제하는데 있어서, 항-쥐-CTLA-4 항체의 생체내 분석에 대한 동물 종양 모델을 설정하였다. 모델에서, 쥐 섬유육종 종양을 성장시키고, 동물은 항-쥐-CTLA-4 항체로 처리한다. 모델의 설정을 위한 재료 및 방법은 하기에 제시되어 있다.

재료 및 방법

암컷 A/J 마우스(6∼8 주령)에게 SalN 종양 세포(1 ×10⁶) 0.2 ㎖를 경부 등 부분에 피하 주사하였다(Baskar 1995). 종양 세포를 주사한 지 0, 4, 7 및 14일 째에 항-쥐 CTLA-4 또는 이소타입 정합형 대조군 항체(파밍엔, 미국 캘리포니아주 샌디에고, 200 ㎍/동물)를 복강내 주사하였다. 스타렛 SPC와 전자 캘리퍼(미국 매사츄세츠주 아톨)를 사용하여 3∼4주의 실험 기간 동안 종양을 측정하고, 종양 크기는 종양 성장으로 피복되는 표면적(mm²)으로 표현하였다.

도 18은 쥐 섬유육종 종양 모델에서 항-쥐 CTLA-4 항체를 이용한 종양 성장 억제를 도시한다. 도 18에서 도시되는 바와 같이, 항-CTLA-4로 처리된 동물은 이소타입 대조군 항체로 처리한 동물과 비교하여 종양 성장 감소를 나타내었다. 따라서, 항-쥐 CTLA-4 mAb는 마우스 종양 모델에서 섬유육종의 성장을 억제할 수 있다.

CTLA-4와 교차반응성인 항체는 이 모델에서 유사하게 작용할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 교차 반응성을 검사하기 위한 본 발명의 항체 중 어떤 항체도 쥐 CTLA-4와 교차 반응성이 없다.

실시예 12

종양 동물 모델

본 발명의 항체의 활성을 추가로 조사하기 위해서, 이종이식 SCID 마우스 모델을 고안하여 설정된 종양 및 이의 유도된 전이의 제거를 시험하였다. 이 모델에서, SCID 마우스에게 이식된 인간 T 세포를 제공하며, 환자 유래의 비-소세포 폐세포(NSCL) 또는 결직장암(CC) 세포를 이식하였다. SCID 마우스의 생식선 지방 패드로 이식하였다. 종양을 성장시킨 다음 제거하였다. 마우스는 인간 유사 종양 및 간 전이를 발생시켰다. 이러한 모델은 Bumpers 등의 문헌[J. Surgical Res. 61:282-288(1996)]에 개시되어 있다.

본 발명의 항체는 그러한 마우스에서 형성된 종양의 성장을 억제할 것으로 예상된다.

참조 문헌

특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등과 그 문헌내에서 인용한 문헌을 비롯하여 본 명세서에서 인용한 모든 참조 문헌은 그 전문을 참고로 인용한다. 또한, 다음 문헌은, 그러한 문헌에서 인용된 참조문을 비롯하여 그 전문을 본 명세서에서 참고로 인용한다.

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미국 특허 출원 일련 번호 08/234,145호(1994년 4월 28일 출원)

미국 특허 출원 일련 번호 08/724,752호(1996년 10월 2일 출원)

미국 특허 출원 일련 번호 08/730,639호(1996년 10월 11일 출원)

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미국 특허 제4,399,216호

미국 특허 제4,681,581호

미국 특허 제4,683,195호

미국 특허 제4,683,202호

미국 특허 제4,735,210호

미국 특허 제4,740,46l호

미국 특허 제4,816,397호

미국 특허 제4,912,040호

미국 특허 제4,959,455호

미국 특허 제5,101,827호

미국 특허 제5,l02,990호(RE 35,500)

미국 특허 제5,151,510호

미국 특허 제5,194,594호

미국 특허 제5,434,131호

미국 특허 제5,530,101호

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미국 특허 제5,585,089호

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미국 특허 제5,661,016호

미국 특허 제5,693,761호

미국 특허 제5,693,792호

미국 특허 제5,697,902호

미국 특허 제5,703,057호

미국 특허 제5,714,350호

미국 특허 제5,721,367호

미국 특허 제5,733,743호

미국 특허 제5,770,197호

미국 특허 제5,770,429호

미국 특허 제5,773,253호

미국 특허 제5,777,085호

미국 특허 제5,789,215호

미국 특허 제5,789,650호

미국 특허 제5,811,097호

유럽 특허 EP 0 546 073 B1호

유럽 특허 EP 0 463 151 B1호(1996년 6월 12일에 공고됨)

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국제 특허 출원 WO 98/24893호(1998년 6월 11일 공개)

등가물

전술한 설명 및 실시예는 일부 본 발명의 바람직한 구체예를 상세히 설명하고, 본 발명자들이 고려하는 최상의 모드를 개시한다. 그러나, 비록 문헌에 전술한 바와 같이 상세히 기술하였지만, 본 발명은 여러 방식으로 실시할 수 있음을 인지해야 할 것이며, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 따라 해석해야 한다.

<110> Hanson, Douglas Charles Neveu, Mark Joseph Mueller, Eileen Elliott Hanke, Jeffrey Herbert Gilman, Steven Christopher Davis, C. Geoffrey Corvalan, Jose Ramon <120> Human Monoclonal Antibodies to CTLA-4 <130> ABX-PF1-PCT <140> PCT/US99/30895 <141> 1999-12-23 <150> US 60/113,647 <151> 1998-12-23 <160> 147 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 463 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 145 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Claims (45)

1. 인간 CTLA-4에 대해 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유동물 숙주 세포주로서, 상기 항체는 서열 번호 1에 있는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열 번호 14에 있는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 1에 있는 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열 및 서열 번호 14에 있는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
4. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 인간 B7-1 및 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하며, 상기 인간 단일클론 항체의 중쇄는 인간 DP50 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 인간 A27 Vκ 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
5. 제1항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 인간 B7-1 및 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하며, 상기 인간 단일클론 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 138에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 인간 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 141에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 A27 Vκ 유전자를 이용하는 경쇄를 포함하고 인간 B7-1 및 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하고, 추가로 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 DP50 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 CD28, 인간 B7-2, 인간 CD44, 및 hIgG1 에 대하여 100:1 초과의 인간 CTLA-4에 대한 선택성을 가지고, 5 nM 미만의 IC₅₀ 으로 인간 CTLA-4와 인간 B7-2 사이의 결합을 저해하며, 추가로 상기 인간 단일클론 항체의 중쇄는 인간 DP50 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 인간 A27 Vκ 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
8. 제4항에 있어서, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 인간 DP50 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
9. 제4항에 있어서, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 인간 DP50 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 인간 A27 Vκ 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
10. 제5항에 있어서, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 138에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
11. 제5항에 있어서, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 141에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
12. 제5항에 있어서, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 138에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 141에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
13. 제6항에 있어서, 상기 항체의 경쇄가 서열번호 14에 있는 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 포함하며, 상기 항체의 중쇄가 서열번호 1에 있는 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
14. 제7항에 있어서, 상기 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 138에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 141에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
15. 제7항에 있어서, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 서열번호 14에 있는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
16. 제7항에 있어서, 상기 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 서열번호 14에 있는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 글루타민 합성효소 발현 시스템을 추가로 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
18. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 100 nM 이하의 IC₅₀으로 인간 B7-1 또는 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 5 nM 이하의 IC₅₀으로 인간 B7-1에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 2 nM 이하의 IC₅₀으로 인간 B7-1에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 5 nM 이하의 IC₅₀으로 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 2 nM 이하의 IC₅₀으로 인간 B7-2에 대한 인간 CTLA-4의 결합을 저해하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
23. 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 인간 A27 Vκ 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
24. 제2항 또는 제16항에 있어서, 상기 서열번호 1에 있는 중쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열 및 서열번호 14에 있는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 포함하는 항체가 각각 서열번호 1 및 서열번호 14 에서의 중쇄 및 경쇄 불변부 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포주.
25. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 숙주 세포주가 CHO 세포주인 것인 포유동물 숙주 세포주.
26. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 숙주 세포주가 NSO 세포주인 것인 포유동물 숙주 세포주.
27. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물 숙주 세포주가 무한성장성 세포주(immortalized cell line)인 것인 포유동물 숙주 세포주.
28. CTLA-4에 대한 결합을 경쟁하는 인간 단일클론 항체를 발현 및 회수하는 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 포유동물 숙주 세포주 내에서 상기 인간 단일클론 항체를 발현시키는 단계 및 상기 인간 단일클론 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체를 단백질 A와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
30. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체를 크기 배제 크로마토그래피시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
31. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체의 단백질 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
32. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체를 N-말단 서열분석시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
33. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체를 엘라이자(ELISA)에서의 항원 특이성에 대하여 시험하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
34. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 인간 A27 Vκ 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 발현되는 것인 방법.
35. 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 경쇄 FR1 내지 FR4 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 141에서의 뉴클레오티드 서열에 대하여 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항체 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 발현되는 것인 방법.
36. 제28항에 있어서, 상기 세포주가 CHO 세포주인 것인 방법.
37. 제28항에 있어서, 상기 세포주가 NSO 세포주인 것인 방법.
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