CN116323607A - 用作alk5抑制剂的萘啶衍生物 - Google Patents

Abstract

本公开文本提供式(I)的激活素受体样激酶5(ALK5)抑制剂的结晶形式和盐。还公开了包含所述结晶形式的药物组合物，使用所述结晶形式调节ALK5活性的方法和使用所述结晶形式治疗由ALK5介导的障碍的方法。式(I)

Description

用作ALK5抑制剂的萘啶衍生物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年6月10日提交的美国临时申请号63/037,144和2021年6月2日提交的美国临时申请号63/202,236的权益，将其各自通过引用以其整体并入本文。

背景技术

人纤维化疾病如系统性硬化病(SSc)、硬皮病移植物抗宿主病、肾源性系统性纤维化和辐射诱导的纤维化以及心脏、肺、皮肤、肝脏、膀胱和肾纤维化构成重大的健康问题。这些疾病通常进展为器官功能障碍，最终由于缺乏可用的治疗而导致器官衰竭和死亡，这主要是因为失控纤维化的病因机制是复杂的、异质的且难以解释的。激活的肌成纤维细胞可负责用无功能的纤维化组织替代正常组织。因此，负责刺激肌成纤维细胞中的促纤维化反应的信号传导途径具有作为开发治疗纤维化疾病的疗法的靶标的潜力。

正常组织修复涉及通过稳态调节机制的纤维化反应。然而，不受控制的纤维化可导致细胞外基质(ECM)大分子在间质间隙中的过度沉积，其随时间变硬。沿着导致肌成纤维细胞激活的分子途径存在许多位点，包括但不限于转化生长因子-β(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径。在本公开文本中重要的是涉及转化生长因子-β(TGF-β)、TGF-β受体I(TGF-βRI)和TGF-β受体II(TGF-βRII)的途径。

TGF-β信号传导通常通过TGF-β配体与TGF-βRII的结合引发。这又可募集和磷酸化TGF-βRI，也称为激活素受体样激酶5(ALK5)。一旦被磷酸化，ALK5通常采取活性构象并与Smad2或Smad3自由缔合并使其磷酸化。一旦被磷酸化，Smad2和3蛋白然后可与Smad4形成异二聚体复合物，所述异二聚体复合物可跨核膜易位并调节Smad介导的基因表达，包括例如胶原的产生。Smad蛋白是细胞内转录调节因子，因此可用作TGF-β调节基因的调节剂，所述TGF-β调节基因尤其涉及上皮和造血细胞中的细胞周期停滞、间充质细胞增殖和分化的控制、伤口愈合、细胞外基质产生、免疫抑制和致癌作用。

ALK5被认为是纤维化过程中最相关的激活素样激酶(ALK)(Rosenbloom,等人,Fibrosis:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,2017,第1627卷,第1章,第1-21页)。已经开发了几种小分子来抑制ALK5的活性，用于多种主要与肿瘤学相关的治疗适应证(参见Yingling,等人,Nature Reviews:Drug Discovery,2004年12月,第3卷,第1011-1022页)。

发明内容

迄今为止开发的ALK5抑制剂的主要问题之一是这些分子在临床前安全性研究中与心室或心脏重塑有关，这是由口服施用的显著全身暴露导致的。鉴于上述内容，需要靶向ALK5的小分子和此类化合物在治疗各种疾病如癌症和纤维化中的用途，同时限制不良副作用。

虽然此类化合物在溶解于溶液中时通常对其活性进行初步评价，但固态特征如多晶性也是重要的。药物物质如ALK5抑制剂的多晶形式可具有不同的物理特性，包括熔点、表观溶解度、溶出速率、光学和机械特性、蒸气压和密度。这些特性可对加工或制造药物物质和药物产品的能力产生直接影响。此外，这些特性的差异可导致药物的不同多晶形式的不同药代动力学特征。因此，在对来自不同制造商的药物产品的“相同性”的监管审查下，多晶性通常是重要的因素。多晶性可影响药物产品如ALK5抑制剂的质量、安全性和/或功效。因此，仍然需要ALK5抑制剂的多晶型物。

本公开文本解决了这种需要并且还提供了相关的优点。本公开文本的一个目的是以最小的全身暴露来局部递送有效的ALK5抑制剂以解决治疗期间ALK5抑制的任何非预期和不需要的全身副作用。因此，在一些方面，本公开文本提供了用于治疗特发性肺纤维化的吸入性、长效且具有肺选择性的ALK5抑制剂。本公开文本的化合物、结晶形式和盐可用于治疗其他疾病，包括但不限于肺纤维化、肝纤维化、肾小球硬化症和癌症。本公开文本的化合物可用作单一疗法或与其他疗法共同给药，无论是通过吸入、口服、静脉内、皮下还是外用递送。

在某些方面，本公开文本提供式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的结晶形式：

在一些实施方案中，式I化合物是富马酸盐。在一些实施方案中，式I化合物是单富马酸盐。在一些实施方案中，式I化合物是游离碱。

结晶形式可以是式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在13.2±0.2、14.9±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自6.5±0.2、8.9±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自9.5±0.2、10.1±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰、至少三个峰或四个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在8.9±0.2、9.5±0.2和10.1±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自6.5±0.2、13.2±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图1中所示图的峰位置一致。

在一些实施方案中，结晶形式通过包含在260℃与266℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过在约263.0℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过基本上与图2中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。结晶形式可通过具有P2₁/n空间群的微晶电子衍射表征。在一些实施方案中，单晶包括晶胞尺寸：

α＝90±0.1°；β＝94.3±0.1°；和γ＝90±0.1°。

结晶形式可以是式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在5.6±0.2、11.2±0.2和15.5±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自18.8±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自15.1±0.2、22.1±0.2和24.8±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在11.2±0.2、15.1±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自5.6±0.2、18.8±0.2和22.1±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图5中所示图的峰位置一致。

在一些实施方案中，结晶形式通过包含在259℃与267℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过在约263.2℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过基本上与图6中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。结晶形式可通过具有P-1空间群的单晶X射线衍射表征。在一些实施方案中，单晶包括晶胞尺寸：

α＝75.5±0.1°；β＝87.3±0.1°；和γ＝73.8±0.1°。

结晶形式可以是式I化合物的多晶型物形式III。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在10.5±0.2、15.8±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自7.5±0.2、19.9±0.2和20.9±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自9.0±0.2、13.2±0.2、16.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰、至少三个峰或四个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过包含在19.9±0.2、20.9±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自13.2±0.2、15.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰、至少两个峰或三个峰。在一些实施方案中，结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图9中所示图的峰位置一致。

在一些实施方案中，结晶形式通过包含在221℃与229℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过在约224.8℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，结晶形式通过基本上与图10中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

在某些方面，本公开文本提供了一种包含式I化合物或其药学上可接受的盐的结晶形式的组合物。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种包含式I化合物的富马酸盐的结晶形式的组合物。在一些实施方案中，组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式I。在一些实施方案中，组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式II。在一些实施方案中，组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物为多晶型物形式III。在一些实施方案中，组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物为单一构象多晶型物。在一些实施方案中，组合物可以在约40℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。在一些实施方案中，组合物可以在约60℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。结晶形式可以是无水的、轻微吸湿性的或两者。

在某些方面，本公开文本提供式I化合物的富马酸盐：

在某些方面，本公开文本提供了富马酸盐，其为6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸。在一些实施方案中，式I化合物是单富马酸盐。在某些方面，本公开文本提供了从6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。

在某些方面，本公开文本提供了一种药物组合物，其包含本文公开的结晶形式、组合物或富马酸盐以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于吸入。

在某些方面，本公开文本提供了一种抑制ALK5的方法，其包括使ALK5与有效量的本文公开的结晶形式、组合物或富马酸盐接触。在某些方面，本公开文本提供了一种治疗受试者中ALK5介导的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的结晶形式、组合物或富马酸盐。所述疾病或病症可选自纤维化、脱发和癌症，如纤维化。在某些方面，本公开文本提供了一种治疗纤维化的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本文公开的结晶形式、组合物或富马酸盐。纤维化可选自系统性硬化病、肾源性系统性纤维化、器官特异性纤维化、与癌症相关的纤维化、囊性纤维化和与自身免疫疾相关的纤维化。在一些实施方案中，器官特异性纤维化选自心脏纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、门静脉纤维化、皮肤纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜纤维化、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化，如肠纤维化。在一些实施方案中，肺纤维化选自特发性肺纤维化(IPF)、家族性肺纤维化(FPF)、间质性肺纤维化、与哮喘相关的纤维化、与慢性阻塞性肺病(COPD)相关的纤维化、二氧化硅诱导的纤维化、石棉诱导的纤维化和化疗诱导的肺纤维化，如特发性肺纤维化(IPF)。在一些实施方案中，肺纤维化由病毒感染诱导。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症，任选地其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤和胰腺癌。肺癌可以是非小细胞肺癌。

在实践任何主题方法时，所述方法还可以包括施用第二治疗剂，任选地其中所述第二治疗剂是免疫治疗剂，如PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自派姆单抗和度伐鲁单抗。本文公开的方法还可以包括施用有效量的辐射。在实践任何主题方法时，结晶形式、组合物或富马酸盐可以通过吸入施用。

在某些方面，本公开文本提供了一种制备式I化合物的方法，所述方法包括：

(a)使式1a化合物：

与式1b化合物：/>

偶联，以提供式1c化合物：/>

以及

(b)将式1c化合物脱保护以提供式I化合物或其互变异构体，其中：R¹是PG¹且R²不存在，或R¹不存在且R²是PG¹；并且PG¹、PG²和PG³各自独立地是氢或保护基，其中PG¹、PG²和PG³中的至少一个是保护基。PG¹、PG²和PG³可各自独立地是氢或选自以下的保护基：苄氧羰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz)、叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、四氢吡喃(THP)、氯甲酸三氯乙酯(Troc)和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(SEM)。在一些实施方案中，PG¹、PG²和PG³各自独立地选自Boc和SEM。偶联可以包含钯催化剂。在一些实施方案中，式1a化合物是7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶或7-溴-2-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶。在一些实施方案中，式1b化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。在一些实施方案中，式1c化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯或(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。

在某些方面，本公开文本提供了一种制备本文公开的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)将式I化合物、溶剂和富马酸合并，从而形成混合物；(b)搅拌混合物；以及(c)从所述混合物中分离结晶富马酸盐。可以将混合物加热，任选地加热至约80℃。在一些实施方案中，溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、四氢呋喃、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂选自2-丙醇、水及其组合。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前：(a-1)将式I化合物的三盐酸盐溶解在水中，从而形成盐溶液；(a-2)向所述盐溶液中添加碱和溶剂的混合物，从而形成包含水相和有机相的双相混合物，其中所述有机相包含式I化合物；以及(a-3)从所述双相混合物中除去所述水相。在一些实施方案中，本公开文本提供了根据本文所述的方法制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。

在某些方面，本公开文本提供了从6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。在某些方面，本公开文本提供了根据本文公开的方法制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。在某些方面，本公开文本提供了从6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺游离碱的结晶形式。在某些方面，本公开文本提供了根据本文公开的方法制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺游离碱的结晶形式。

通过引用并入

将本说明书中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。

附图说明

本公开文本的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。可通过参考以下阐述了说明性实施方案和附图的详细描述获得对本公开文本的特征和优点的理解，在所述说明性实施方案中利用了本公开文本的原理，在所述附图中：

图1示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I的X射线粉末衍射(XRPD)图。

图2示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I的示例性差示扫描量热法(DSC)热图。

图3示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I的热重分析(TGA)图。

图4示出了在约25℃的温度下观察到的式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I的动态吸湿(DMS)等温线。

图5示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II的X射线粉末衍射(XRPD)图。

图6示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II的示例性差示扫描量热法(DSC)热图。

图7示出了式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II的热重分析(TGA)图。

图8示出了在约25℃的温度下观察到的式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II的动态吸湿(DMS)等温线。

图9示出了式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的X射线粉末衍射(XRPD)图。

图10示出了式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的示例性差示扫描量热法(DSC)热图。

图11示出了式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的热重分析(TGA)图。

图12示出了在约25℃的温度下观察到的式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的动态吸湿(DMS)等温线。

具体实施方式

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开文本所属领域中的技术人员所通常理解的相同的含义。

化学结构在本文中根据IUPAC惯例命名，如在

软件(Perkin Elmer,Inc.，马萨诸塞州剑桥)中实施的。

除非上下文另有明确指示，如说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。

术语“药学上可接受的”是指当用于主题组合物和方法中时在生物学上或其他方面不是不可接受的物质。例如，术语“药学上可接受的载体”是指可以掺入组合物中并施用于患者而不引起不可接受的生物效应或以不可接受的方式与组合物的其他组分相互作用的物质，如佐剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料、着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。此类药学上可接受的物质通常满足毒理学和制造测试的所需标准，并且包括由美国食品和药物管理局鉴定为合适的非活性成分的那些物质。

术语“盐”和“药学上可接受的盐”是指从碱或酸制备的盐。药学上可接受的盐适于施用于患者，如哺乳动物(例如，对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。盐可以从无机碱、有机碱、无机酸和有机酸形成。另外，在化合物含有碱性部分(如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(如羧酸或四唑)二者时，可以形成两性离子并且包括在如本文所用的术语“盐”中。源自无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、三价铁盐、二价铁盐、锂盐、镁盐、三价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。源自有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺(包括经取代的胺、环状胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲葡糖胺(methylglucamine)、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等)的盐。源自无机酸的盐包括硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸的盐。源自有机酸的盐包括以下的盐：脂肪族羟酸(例如，柠檬酸、葡糖酸、羟乙酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族一元羧酸(例如，乙酸、酪酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如，苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟酸(例如，邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如，富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、扁桃酸、粘酸、烟酸、乳清酸、扑酸、泛酸、磺酸(例如，苯磺酸、樟脑磺酸、乙二磺酸(edisylic acid)、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、羟乙磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、昔萘酸(xinafoicacid)等。在一些实施方案中，本公开文本提供了富马酸盐、1,2-乙二磺酸盐或1-羟基-2-萘甲酸盐。在一些实施方案中，本公开文本提供了富马酸盐，如单富马酸盐。

术语“治疗有效量”是指当向有需要的受试者施用时足以影响治疗的本文所述化合物的量。例如，用于治疗肺纤维化的治疗有效量是例如减少、抑制、消除或预防受试者中纤维化形成或治疗肺纤维化的根本原因所需的化合物的量。治疗有效量可以根据预期的治疗应用(体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度)、施用方式等而变化，这可由本领域普通技术人员容易地确定。具体剂量将根据所选择的特定化合物、所遵循的给药方案、是否与其他化合物组合施用、施用的时间设定、施用其的组织和载运其的物理递送系统而变化。术语“有效量”是指足以获得所需结果(其不一定是治疗结果)的量。例如，“有效量”可以是抑制酶所需的量。

如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”是指在受试者中针对疾病、障碍或医学病症(如肺纤维化)获得有益或期望结果的方法，包括但不限于以下：(a)预防疾病或医学病症发生，例如预防疾病或医学病症的复发或预防性治疗易患所述疾病或医学病症的受试者；(b)改善疾病或医学病症，例如消除或引起受试者中所述疾病或医学病症的消退；(c)抑制疾病或医学病症，例如减缓或阻止受试者中所述疾病或医学病症的发展；或(d)减轻受试者中所述疾病或医学病症的症状。例如，“治疗肺纤维化”将包括预防纤维化发生、改善纤维化、抑制纤维化和减轻纤维化的症状(例如，增加血液中的氧水平或改善肺功能测试)。另外，通过根除或改善与潜在障碍相关的一种或多种生理症状来实现治疗益处，使得在受试者中观察到改善，尽管受试者可能仍患有潜在障碍。

本文所用的术语“治疗效果”涵盖如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除疾病或病症的出现，延迟或消除疾病或病症的症状的发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或其任何组合。

术语“拮抗剂”和“抑制剂”可互换使用，并且它们是指具有抑制靶蛋白(例如ALK5)的生物功能(例如活性、表达、结合、蛋白-蛋白相互作用)的能力的化合物。因此，术语“拮抗剂”和“抑制剂”在靶蛋白的生物学作用的情境中定义。虽然本文优选的拮抗剂与靶标特异性地相互作用(例如结合)，但通过与靶蛋白为其中成员的信号转导途径的其他成员相互作用来抑制靶蛋白的生物活性的化合物也特异性地包括在该定义内。

术语“选择性抑制”或“选择性地抑制”是指与脱靶信号传导活性相比，生物活性剂通过与靶标的直接或间接相互作用优先降低靶标信号传导活性的能力。

如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合特定抗原或对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。抗体可以是例如多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程化抗体或其抗原结合片段，并且还可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、异源缀合抗体、双特异性抗体、双抗体、三抗体或四抗体。抗原结合片段包括抗原结合结构域，并且可以是例如Fab’、F(ab’)₂、Fab、Fv、rIgG、scFv、hcAb(重链抗体)、单域抗体、V_HH、V_NAR、sdAb或纳米抗体的形式。

本文所用的术语“抗原结合结构域”是指与抗原结合的分子区域。抗原结合结构域可以是抗体或抗体片段的抗原结合部分。抗原结合结构域可以是抗体中保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。抗原结合结构域可以是抗原结合片段，并且可以识别单个抗原、两个抗原、三个抗原或更多。如本文所用，关于抗体相互作用的“识别”是指抗体或其部分的抗原结合结构域与抗原之间的缔合或结合。

“抗体构建体”是指含有抗原结合结构域和Fc结构域(例如来自Fc区内的Fc结构域)的分子，例如蛋白质、肽、抗体或其部分。抗体构建体可识别例如一种抗原或多种抗原。

“靶向部分”是指相对于其他非靶分子对靶分子具有选择性亲和力的结构。靶向部分与靶分子结合。靶向部分可包括抗体、肽、配体、受体或其结合部分。靶生物分子可以是细胞的生物受体或其他结构，如肿瘤抗原。

术语“受试者”和“患者”是指已经是或将是治疗、观察或实验对象的动物，如哺乳动物(例如人)。本文所述的方法可用于人类治疗和兽医应用。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，并且在一些实施方案中，受试者是人。“哺乳动物”包括人和家畜(如实验动物和家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔))以及非家畜(如野生动物等)。

“溶剂化物”是通过溶剂与化合物的相互作用形成的。术语“化合物”旨在包括化合物的溶剂化物。类似地，“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的盐的溶剂化物。合适的溶剂化物是药学上可接受的溶剂化物，如水合物，包括一水合物和半水合物。还包括与一种或多种结晶溶剂形成的溶剂化物。

“结晶形式”、“多晶型物”、“形式”(“Form”)和“形式”(“form”)在本文中可以互换使用，并且意在包括化合物的所有结晶形式，包括例如化合物的多晶型物、假多晶型物、盐、溶剂化物、水合物、未溶剂化的多晶型物(包括酸酐)和构象多晶型物，以及其混合物，除非提及特定的结晶形式。本公开文本的化合物包括那些化合物的结晶形式，包括例如化合物的多晶型物、假多晶型物、盐、溶剂化物、水合物、未溶剂化的多晶型物(包括酸酐)和构象多晶型物，以及其混合物。

如本文所用，术语“互变异构体”是指平衡存在且易于相互转化的化合物的两种或更多种异构体中的每一种。例如，本领域技术人员将理解1,2,3-三唑以两种互变异构形式存在：

除非另外指明，否则本文所述的化学实体旨在包括所有可能的互变异构体，即使当结构仅描绘它们中的一种时也如此。例如，即使本文中可以描绘式I化合物的单个互变异构体，但本公开文本旨在包括所有可能的互变异构体，如：

在该实施例中，根据IUPAC命名惯例，所描绘的两种互变异构体导致咪唑环的不同编号：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(A)和6-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-5-基)-N-(2-((3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(B)。尽管互变异构体A通常在本文中命名和描绘，但应理解本公开文本也包括互变异构体B，除非另外指明。

另外，本文所述的化学实体旨在包括所有可能的构象异构体和/或所有固体形式的构象多晶型物，即使当描绘的结构不提供构象细节或显现仅描绘单个构象异构体时也如此。即使式I化合物的单个构象异构体可以在本文中描绘，本公开文本也旨在包括所有可能的构象异构体。例如，式I化合物包括下文描绘的构象异构体A和C，其中五个邻接的键已经被加粗以指示萘啶环与咪唑环之间的共平面性：

在某些方面，本公开文本提供了作为基本上纯的构象多晶型物的式I化合物或其盐的结晶形式。在一些实施方案中，以至少90％过量，如至少95％、98％或99％过量提供构象多晶型物。本文所述的结晶形式可由式I化合物的单一构象异构体组成。在一些实施方案中，多于一种构象异构体存在于相同的结晶形式中。在一些实施方案中，本公开文本提供式A的构象多晶型物。在一些实施方案中，本公开文本提供式C的构象多晶型物。在一些实施方案中，式I化合物作为基本上纯的构象异构体提供。在一些实施方案中，以至少90％过量提供构象异构体。

式I化合物的结晶形式的发现是特别具有挑战性的，因为游离碱和富马酸盐形式的化合物的结晶倾向低。诸位发明人发现式I化合物及其富马酸盐展现出异常宽的介稳区。此外，尽管结晶产物在母液中的溶解度低，但是显著的产率损失于母液中。在结晶过程中还观察到不佳的杂质清除，并且通常发现结晶形式纯度的小变化对溶解度具有显著影响。

出人意料的是，诸位发明人发现游离碱和富马酸盐形式的结晶随着温度升高而加速，这与技术人员基于典型的温度和溶解度关系所预期的通常趋势相反。不希望受任何特定理论束缚，诸位发明人假设游离碱和富马酸盐形式的竞争性构象多晶型物具有抑制式I化合物或其盐的结晶度的作用。虽然上文对于式I化合物的构象异构体A和C描述的键旋转在溶液中自由发生，但认为在结晶时沉降成由上文描绘表示的两种构象中的一种。多晶型物形式I被认为是动力学多晶型物构象，在2D中由上述构象异构体A粗略描绘，而多晶型物形式II被认为是热力学多晶型物构象，在2D中由上述构象异构体C粗略描绘。

本文所述的式I化合物包含两个不对称中心，因此可产生非对映异构体，其不对称中心各自可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-。在一些实施方案中，为了优化本公开文本的化合物的治疗活性，例如治疗纤维化，可能期望碳原子具有特定构型(例如(R,R)、(S,S)、或(S,R)/(R,S))或富含具有此类构型的立体异构形式。在一些实施方案中，所示和命名的式I化合物为(3R,5S)构型，其等同于(3S,5R)构型。本领域技术人员将理解，除非另外指明，否则少量的其他立体异构体可存在于本公开文本的组合物中，条件是组合物作为整体的效用不因此类其他异构体的存在而消除。在一些实施方案中，式I化合物作为基本上纯的立体异构体提供。在一些实施方案中，以至少90％非对映体过量提供立体异构体。

还应理解，由于化合物的内部对称性，下文描绘的化合物A和D代表相同的化合物，尽管所描绘的结构可导致不同的IUPAC名称(例如，6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3R,5S)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(A)和6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(D)。

当本文针对物理特性(如分子量)或化学特性(如化学式)使用范围时，旨在包括范围的所有组合和子组合及其中的具体实施方案。

当提及数字或数值范围时，术语“约”意指所提及的数字或数值范围是在实验变异性内(或在统计实验误差内)的近似值，并且因此，所述数字或数值范围可以例如在所述数字或数值范围的1％与15％之间变化。任选地，术语“约”可表示数字或数值范围在指定数字或范围的±5％内。

当提及例如X射线粉末衍射图或差示扫描量热法热图时，术语“基本上”包括不一定与本文描绘的那些相同，但当被本领域普通技术人员考虑时落入实验误差或偏差的限值内的图案或热图。例如，如果第一衍射图中至少90％的峰位于参考衍射图的峰位置的±0.5度2θ-如±0.4度2θ、±0.3度2θ或±0.2度2θ内，则可认为第一X射线粉末衍射图的峰基本上与参考衍射图的峰一致。

肺功能测试包括检查肺工作情况的测试。例如，肺活量测定法测量肺可以容纳的空气量以及从肺中强有力地排空空气的程度。用力呼气量(FEV)是人在用力呼吸期间能够呼气的空气量的量度。例如，FEV1是人可以在一秒内从其肺中排出的空气量。用力肺活量(FVC)是FEV测试期间呼出的空气总量。FEV1/FVC的比率，也称为气流指数或Tiffeneau-Pinelli指数，是用于评估患者肺功能健康的量度。<70％的比率表明肺中存在阻塞性缺陷，如慢性阻塞性肺病(COPD)。>80％的比率表明肺中存在限制性缺陷，如肺纤维化。限制性肺病中>80％的比率是由于FEV1和FVC都降低，但是FVC的下降大于FEV1的下降，导致高于80％的值。

术语“转化生长因子-β”也可称为TGF-β、转化生长因子β-1或TGF-β-1。它还被切割成潜伏相关肽(LAP)。

术语“TGF-β受体II”也可称为TβRII、II型TGF-β受体、TGF-βRII、TGF-β受体2型、TGFR-2、TGF-βII型受体、转化生长因子-β受体II型、TGF-β受体II型或TβR-II。

术语“TGF-β受体I”也可称为TβRI、I型TGF-β受体、TGF-βRI、TGF-β受体1型、TGFR-1、53kD的激活素A受体II型样蛋白激酶、激活素受体样激酶5、ALK-5、ALK5、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶受体R4、SKR4、TGF-βI型受体、转化生长因子-β受体I型、TGF-β受体I型、转化生长因子β受体I、TGF-β受体1或TβR-I。

本公开文本提供能够选择性地结合和/或调节ALK5的化合物。在一些实施方案中，所述化合物通过与一种或多种氨基酸和/或一种或多种金属离子结合或相互作用来调节ALK5。这些化合物的结合可破坏ALK5下游信号传导。

本文公开的多晶型物可通过根据本领域的任何适当的方法表征。例如，根据本公开文本制备的多晶型物可通过X射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)、热重分析(TGA)、热台显微镜和/或光谱法(例如拉曼、固态核磁共振(ssNMR)和红外(IR))表征。

XRPD：本公开文本的多晶型物可通过XRPD表征。XRPD峰的相对强度可以根据粒度、样品制备技术、样品安装程序和所使用的具体仪器而变化。此外，仪器变化和其他因素可影响2θ值。因此，XRPD峰分配可例如变化±0.5度2θ，如±0.4、±0.3或±0.2度2θ。

DSC：本公开文本的多晶型物还可以通过其特征性DSC热图，如图2、图6或图10中描绘的热图来鉴定。在DSC热图中观察到的温度可取决于温度变化率，以及样品制备技术和所用的具体仪器。因此，本文报道的与DSC热图相关的值可以变化例如±6℃，如±5℃或±4℃。

TGA：本公开文本的多晶型物还可以产生与无定形材料或另一种固体形式不同的热行为。热行为可在实验室中通过热重分析(TGA)来评估，其可用于区分一些多晶型形式与其他多晶型形式。本文所述的多晶型物可通过热重分析表征。

一般合成程序

式I化合物或其盐的多晶型物可如下文和实施例中所述由容易获得的起始材料合成。本文所用的材料是可商购的或通过本领域通常已知的合成方法制备。下文实施例不限于所列出的化合物或任何特定的取代基，其用于说明目的。虽然描述和描绘了各种步骤，但是在一些情况下，这些步骤可以以与下文实施例中所示不同的顺序来进行。可以对这些合成反应方案进行各种修改，并且这些修改对于参考本公开文本的本领域技术人员而言是显而易见的。例如，在给出典型或优选的工艺条件(例如，反应温度、结晶温度、反应时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)的情况下，除非另有说明，否则也可使用其他工艺条件。在一些情形下，反应或结晶在室温下进行并且不进行实际温度测量。应理解，室温意指在通常与实验室环境中的环境温度相关的范围内的温度，并且通常将在约15℃至约30℃，如约20℃至约25℃的范围内。

通常，式I化合物可根据以下反应方案制备：

方案1

在一些实施方案中，式I化合物可根据方案1制备。例如，可以使杂芳基卤化物1a与受保护的胺1b进行C-N偶联反应-任选地Pd催化的偶联反应，如Buchwald-Hartwig胺化，以提供式1c的杂芳基胺。1c的脱保护可以得到式I化合物。

在某些方面，本公开文本提供了一种制备式I化合物的方法，所述方法包括任选地经由Buchwald-Hartwig胺化形成C-N键。在一些实施方案中，所述方法还包括除去一个或多个保护基，如氨基保护基。

在某些方面，本公开文本提供了一种制备式I化合物的方法，所述方法包括：

(a)使式1a化合物：

与式1b化合物：

偶联，以提供式1c化合物：

以及

(b)将式1c化合物脱保护以提供式I化合物：

或其互变异构体，

其中：R¹是PG¹且R²不存在，或R¹不存在且R²是PG¹；并且PG¹、PG²和PG³各自独立地是氢或保护基。在一些实施方案中，PG¹、PG²和PG³各自与其所附接的氮原子一起独立地形成氨基甲酸酯、乙酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苄胺、三苯甲胺、亚苄基胺或磺酰胺。在一些实施方案中，PG¹、PG²和PG³各自独立地是氢或选自以下的保护基：苄氧羰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz)、叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、四氢吡喃(THP)、氯甲酸三氯乙酯(Troc)和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(SEM)。在一些实施方案中，PG¹、PG²和PG³各自独立地选自Boc和SEM。在一些实施方案中，PG¹、PG²和PG³各自独立地选自Boc、THP和SEM。在一些实施方案中，PG¹是SEM。在一些实施方案中，PG¹是THP。在一些实施方案中，PG²和PG³各自是Boc。在一些实施方案中，PG¹是SEM且PG²和PG³各自是Boc。在一些实施方案中，PG¹是氢。在一些实施方案中，PG²是氢。在一些实施方案中，PG³是氢。在一些实施方案中，PG¹和PG²各自是氢，且PG³是保护基，如Boc、THP或SEM。在一些实施方案中，PG¹是氢且PG²和PG³各自独立地是保护基，如Boc、THP或SEM。在一些实施方案中，PG¹和PG²各自独立地是氢或保护基，且PG³是保护基。在一些实施方案中，1a与1b的摩尔比在1:1与1:1.5之间，如1:1.2。

在一些实施方案中，偶联包含钯催化剂，如Pd₂dba₃。在一些实施方案中，偶联包含配体。配体可以是膦配体，任选地双齿膦配体，如XantPhos。在一些实施方案中，偶联包含碱，如t-BuONa。在一些实施方案中，偶联包含钯催化剂、配体和碱。在一些实施方案中，偶联包含Pd₂dba₃、XantPhos和t-BuONa。在一些实施方案中，偶联是Buchwald-Hartwig胺化。偶联可以包含溶剂，如甲苯。

在一些实施方案中，脱保护包含酸，如TFA或HCl。如果在脱保护中形成盐，则该方法还可包括例如通过添加碱如NaOH或NH₄OH使盐游离碱化。

在一些实施方案中，式1a化合物是7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶或7-溴-2-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶。在一些实施方案中，式1b化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。在一些实施方案中，式1c化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯或(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。在一些实施方案中，式1a化合物是7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶，式1b化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯，且式1c化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。

在某些方面，本公开文本提供了一种制造式I化合物的富马酸盐的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)将式I化合物、溶剂和富马酸合并，从而形成混合物；(b)搅拌混合物；以及(c)从所述混合物中分离结晶形式。在一些实施方案中，式I化合物与富马酸的摩尔比在1:1与1:1.5之间，如1:1.1。在一些实施方案中，将富马酸添加至式I化合物在溶剂中的浆液，任选地作为富马酸在溶剂中的溶液。在一些实施方案中，将混合物加热，任选地加热至约80℃。可以将混合物保持在约80℃，任选地持续至少一小时或至少两小时。在一些实施方案中，在搅拌之前或之后向混合物中添加水。混合物的体积可以在搅拌期间减少，任选地通过真空蒸馏。在一些实施方案中，在搅拌后，将混合物在0℃与60℃之间保持至少8小时，如8至72小时。在一些实施方案中，在分离之前将混合物在室温下保持8至24小时。在一些实施方案中，在分离之前将混合物在50℃下保持约72小时。可以通过任何常规方式如沉淀、过滤、浓缩、离心、真空干燥等从混合物中分离结晶化合物。优选地，通过过滤从混合物中分离结晶化合物。在一些实施方案中，溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂是选自丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷、和低级醇(例如，C_1-6烷基-OH)与水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇和水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇。在一些实施方案中，溶剂是THF。

在某些方面，本公开文本提供了一种制造式I化合物的富马酸盐的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)形成式I化合物、溶剂和富马酸的浆液，任选地其中所述溶剂是2-丙醇；(b)将所述浆液加热至至少50℃，任选地至少80℃；(c)向所述浆液中添加水；(d)将所述浆液冷却至降低的温度，任选地至约50℃，并将所述浆液在所述降低的温度下保持至少12小时，如至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时；以及(e)从所述浆液中分离所述结晶形式，任选地通过过滤进行。在一些实施方案中，式I化合物与富马酸的摩尔比在1:1与1:1.5之间，如1:1。在一些实施方案中，将富马酸添加至式I化合物在溶剂中的浆液中。可以通过任何常规方式如沉淀、过滤、浓缩、离心、真空干燥等从混合物中分离结晶化合物。在一些实施方案中，溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂是选自丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷、和低级醇(例如，C_1-6烷基-OH)与水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇和水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇。

在某些方面，本公开文本提供了一种制造式I化合物的富马酸盐的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)将富马酸溶解在溶剂和水的混合物中，任选地其中所述溶剂是2-丙醇，从而形成富马酸溶液；(b)将富马酸溶液添加至式I化合物在溶剂中的浆液中，任选地其中所述溶剂是2-丙醇，从而形成结晶浆液；(c)将所述结晶浆液加热至升高的温度，任选地加热至至少60℃、至少70℃或至少80℃，从而形成结晶溶液；(d)任选地通过真空蒸馏除去一部分溶剂，同时将所述结晶溶液保持在升高的温度±30℃，从而形成第二浆液；(e)任选地，将所述第二浆液在升高的温度下保持至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟；(f)任选地经至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时或至少5小时将所述第二浆液冷却至约室温；(g)将所述第二浆液在约室温下保持至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时或至少12小时；(h)从所述第二浆液中分离所述结晶形式，任选地通过过滤进行；(i)任选地，用溶剂冲洗所述结晶形式，任选地其中所述溶剂是2-丙醇；以及(j)任选地，干燥所述结晶形式。在一些实施方案中，式I化合物与富马酸的摩尔比在1:1与1:1.5之间，如1:1.1。可以通过任何常规方式如沉淀、过滤、浓缩、离心、真空干燥等从混合物中分离结晶化合物。优选地，通过过滤从混合物中分离结晶化合物。在一些实施方案中，溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂是选自丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷、和低级醇(例如，C_1-6烷基-OH)与水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇和水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是2-丙醇。

在一些实施方案中，所述方法在(a)之前还包括：(a-1)将式I化合物的三盐酸盐溶解在水中，从而形成盐溶液；(a-2)向所述盐溶液中任选地在约室温下经至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟或至少60分钟添加碱和溶剂的混合物，如水性NH₄OH和2-甲基四氢呋喃的混合物，从而形成悬浮液；(a-3)任选地，将所述悬浮液加热至至少30℃、至少40℃或至少50℃；(a-4)使所述悬浮液分离成两相；(a-5)除去水相；(a-6)任选地，添加另外的溶剂，如2-甲基四氢呋喃，并减少所得溶液的体积(任选地通过真空蒸馏进行)；(a-7)任选地，将金属清除剂如Silicycle siliametS硫醇添加到溶液中并搅拌至少30分钟、至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟或至少150分钟，然后将金属清除剂任选地通过过滤除去；(a-8)减少溶液的体积(任选地通过真空蒸馏进行)，从而形成浓缩溶液；(a-9)用第二溶剂稀释所述浓缩溶液，任选地其中所述第二溶剂是2-丙醇；以及(a-10)减少溶液的体积(任选地通过真空过滤进行)，从而形成式I化合物在溶剂中的浆液。

在某些方面，本公开文本提供了一种制备式I化合物的富马酸盐的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)将式I化合物和富马酸悬浮在溶剂中，任选地其中所述溶剂是THF；(b)将所述悬浮液任选地在约室温下搅拌至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时或至少24小时；(c)从所述悬浮液中分离结晶形式，任选地通过过滤进行；(d)任选地，用溶剂冲洗所述结晶形式，任选地其中所述溶剂是THF；以及(e)任选地，干燥所述结晶形式。在一些实施方案中，式I化合物与富马酸的摩尔比在1:1与1:1.5之间，如1:1.1。在一些实施方案中，将富马酸添加至式I化合物在溶剂中的浆液，任选地作为富马酸在溶剂中的溶液。可以通过任何常规方式如沉淀、过滤、浓缩、离心、真空干燥等从混合物中分离结晶化合物。优选地，通过过滤从混合物中分离结晶化合物。在一些实施方案中，溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂是选自丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷、和低级醇(例如，C_1-6烷基-OH)与水的混合物。在一些实施方案中，溶剂是THF。

在某些方面，本公开文本提供了一种制造式I化合物的结晶形式的方法，所述方法包括：(a)将式I化合物的盐溶解在水中，从而形成盐溶液，任选地其中所述盐是三盐酸盐；(b)向所述盐溶液中任选地在约室温下经至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟或至少10分钟添加碱和溶剂的混合物，如水性NH₄OH和2-甲基四氢呋喃的混合物，从而形成悬浮液；(c)任选地，将所述悬浮液加热至至少30℃、至少40℃或至少50℃，持续至少5分钟，如至少10分钟；(d)使所述悬浮液分离成两相；(e)除去水相；(f)任选地，任选地通过真空蒸馏减少有机相的体积；(g)任选地，添加第二溶剂如异丙醇，并减少所得溶液的体积(任选地通过真空蒸馏进行)；(h)任选地，添加另外的第二溶剂，如异丙醇；(i)将所述溶液加热至至少30℃、至少35℃或至少40℃，持续至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时或至少12小时，从而形成浆液；(j)任选地，将所述浆液冷却至室温并搅拌至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时或至少72小时；以及(k)从所述浆液中分离所述结晶形式，任选地通过过滤进行；(l)任选地，用第二溶剂冲洗所述结晶形式，任选地其中所述第二溶剂是异丙醇；以及(m)任选地，干燥所述结晶形式。在一些实施方案中，式I化合物的盐与水性NH₄OH的摩尔比在1:1与1:5之间，如约1:3.5。可以通过任何常规方式如沉淀、过滤、浓缩、离心、真空干燥等从混合物中分离结晶化合物。优选地，通过过滤从混合物中分离结晶化合物。在一些实施方案中，溶剂和第二溶剂各自独立地选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、2-甲基四氢呋喃、水及其组合。在一些实施方案中，溶剂是2-甲基四氢呋喃。在一些实施方案中，第二溶剂是异丙醇。

本文所述的多晶型物不受用于产生式I化合物的起始材料限制。在一些实施方案中，式I化合物或其盐的多晶型物选自I型、II型、III型及其混合物。在某些方面，本公开文本提供了根据本文所述的方法制备的式I化合物的富马酸盐的结晶形式。在某些方面，本公开文本提供了根据本文所述的方法制备的式I化合物的游离碱的结晶形式。在某些方面，本公开文本提供了根据本文所述的方法制备的结晶形式。

如果需要，本文所述的化学实体和中间体的分离和纯化可通过任何合适的分离或纯化程序如过滤、萃取、结晶、柱色谱、薄层色谱、厚层色谱、高效液相色谱或其组合来实现。合适的分开和分离程序的具体说明可参考以下实施例。然而，也可以使用其他等效的分开或分离程序。在结晶之前，式I化合物或其盐可以以至少50％化学纯度，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％化学纯度分离得到。在一些实施方案中，本文所述的结晶形式通过使化学纯度小于约99％，如小于约95％、小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％或小于约70％的式I化合物或其盐结晶来获得。

在一些实施方案中，本文所述的多晶型物，如多晶型物形式I、形式II或形式III，在室温下是稳定的。在一些实施方案中，本文所述的多晶型物可以在室温下储存延长的时间段而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，本文所述的多晶型物可在室温下储存至少10天，如至少30天、至少60天、至少90天或至少120天的时间段。本文所述的多晶型物在升高的温度和/或高相对湿度(RH)下可以是稳定的。例如，本文所述的多晶型物，如多晶型物形式I、形式II或形式III，可以在约40℃和75％ RH下储存至少10天-如至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。优选地，在储存后，式I化合物或其盐的化学纯度是至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的式I化合物或其盐呈与储存前相同的结晶形式。

多晶型物形式I

在某些方面，式I化合物或其盐的结晶形式是多晶型物形式I。多晶型物形式I是式I化合物的单富马酸盐。多晶型物形式I可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图1中所示的那些一致。面积相对强度大于1％的峰列于表1中。该图显示在5-35度2θ范围内的尖锐衍射峰。衍射图中的这些和其他峰可用于鉴定这种形式。

表1

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在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在13.2±0.2、14.9±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自6.5±0.2、8.9±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在6.5±0.2、8.9±0.2和17.5±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自9.5±0.2、10.1±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在9.5±0.2、10.1±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含选自6.5±0.2、8.9±0.2、9.5±0.2、10.1±0.2、13.2±0.2、14.9±0.2、17.5±0.2、18.5±0.2、19.5±0.2和22.8±0.2度2θ的至少三个峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在6.5±0.2、8.9±0.2、9.5±0.2、10.1±0.2、13.2±0.2、14.9±0.2、17.5±0.2、18.5±0.2、19.5±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自10.5±0.2、12.3±0.2、16.7±0.2、18.0±0.2、19.0±0.2、19.8±0.2、20.4±0.2、20.5±0.2、21.0±0.2、22.1±0.2、22.5±0.2、23.3±0.2、23.5±0.2、23.7±0.2、24.1±0.2、24.9±0.2、25.5±0.2、25.6±0.2和26.1±0.2度2θ的至少一个峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在8.9±0.2、9.5±0.2和10.1±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自6.5±0.2、13.2±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在6.5±0.2、13.2±0.2和17.5±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自14.9±0.2、18.5±0.2、19.5±0.2和22.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在14.9±0.2、18.5±0.2、19.5±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在6.5±0.2、13.2±0.2和17.5±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自8.9±0.2、9.5±0.2和22.8±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在8.9±0.2、9.5±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自10.1±0.2、14.9±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在10.1±0.2、14.9±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在10.5±0.2、12.3±0.2和13.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自14.9±0.2、18.0±0.2和22.1±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在14.9±0.2、18.0±0.2和22.1±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自8.9±0.2、9.5±0.2和10.1±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在8.9±0.2、9.5±0.2和10.1±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在6.5±0.2、8.9±0.2、9.5±0.2、10.1±0.2、10.5±0.2、12.3±0.2、13.2±0.2、14.9±0.2、16.7±0.2、17.5±0.2、18.0±0.2、18.5±0.2、19.0±0.2、19.5±0.2、19.8±0.2、20.4±0.2、20.5±0.2、21.0±0.2、22.1±0.2、22.5±0.2、22.8±0.2、23.3±0.2、23.5±0.2、23.7±0.2、24.1±0.2、24.9±0.2、25.5±0.2、25.6±0.2和26.1±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

与相对峰高相比，XRPD图的峰位置对实验参数如样品制备和仪器几何形状相对不太敏感。结晶形式可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图1中所示图的峰位置一致。

多晶型物形式I还可以通过其特征性DSC热图来鉴定。如图2中所描绘，以10℃/分钟加热速率记录的多晶型物形式I的示例性DSC热图展现出在约260.0℃开始、在约263.0℃处峰值和108.1J/g吸热下面积的熔融吸热。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在约240℃至280℃，如245℃-275℃、250℃-270℃、255℃-270℃、258℃-268℃、259℃-267℃、260℃-266℃、261℃-265℃或262℃-264℃范围内的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在约260℃-266℃，如约263℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过包含在约263℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过在约263.0℃±3℃，如约263.0℃±2℃或263.0℃±1℃的温度下显示吸热热流率最大值的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式I通过基本上与图2中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

多晶型物形式I还可以通过其特征性TGA曲线来鉴定，其示例性例子描绘于图3中。在一些实施方案中，多晶型物形式I显示小于3％的质量损失直至大于约250℃。多晶型物形式I在熔融后分解，如通过在约254℃开始时发生的显著重量损失所证明的。

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过图4中所描绘的DMS等温线表征。当暴露于5％-90％相对湿度时，观察到的总水分增加按重量计为约1.30％。在两个连续的吸附-解吸循环后获得的固体显示出与起始材料相同的XRPD图，表明在该实验之后形式没有变化。这些数据表明多晶型物形式I在水的存在下不转化为水合形式并且是轻微吸湿性的。

多晶型物形式I可以通过微晶电子衍射(MicroED)分析来鉴定。在表2中提供了晶胞参数和空间群详情。在200kV下操作的配备有Ceta-D检测器并在低温温度(低于-170℃)下操作的Thermo Fisher Scientific Glacios低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)上收集数据。以大约

的剂量率收集数据，并使用程序DIALS(先进光源的衍射积分)对数据集进行索引、精修、积分和缩放。基于由中子散射得到的值，用原子间距离对氢原子建模，并且还建模为骑式。/>

表2

在一些实施方案中，多晶型物形式I通过具有P2₁/n空间群的微晶电子衍射表征。多晶型物形式I的单晶可以包括以下晶胞尺寸：

α＝90±0.1°；β＝94.3±0.1°；和γ＝90±0.1°。在一些实施方案中，多晶型物形式I的单晶包括以下晶胞尺寸：/>

α＝90±0.3°；β＝94.3±0.3°；和γ＝90±0.3°。

在一些实施方案中，多晶型物形式I的化学纯度大于60％，如大于70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，多晶型物形式I的化学纯度大于约90％。在一些实施方案中，多晶型物形式I的化学纯度大于约95％。在一些实施方案中，多晶型物形式I的化学纯度大于约99％。多晶型物形式I的化学纯度可以通过任何适当的分析技术如HPLC分析来测量。

在一些实施方案中，多晶型物形式I在室温下是稳定的。多晶型物形式I可以在室温下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在室温下储存30天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在室温下储存120天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式I在升高的温度和/或相对湿度(RH)下是稳定的。例如，多晶型物形式I可以在约40℃和约75％ RH下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在40℃和75％ RH下储存30天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在40℃和75％ RH下储存120天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式I可以在约60℃下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在60℃下储存30天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在60℃下储存120天后，多晶型物形式I的化学纯度为至少95％，如至少98％。

多晶型物形式II

在某些方面，式I化合物或其盐的结晶形式是多晶型物形式II。多晶型物形式II是式I化合物的单富马酸盐。多晶型物形式II可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图5中所示的那些一致。面积相对强度大于1％的峰列于表3中。该图显示在5-35度2θ范围内的尖锐衍射峰。衍射图中的这些和其他峰可用于鉴定这种形式。

表3

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在5.6±0.2、11.2±0.2和15.5±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自18.8±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在18.8±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自15.1±0.2、22.1±0.2和24.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在15.1±0.2、22.1±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含选自5.6±0.2、11.2±0.2、15.1±0.2、15.5±0.2、18.8±0.2、20.6±0.2、22.1±0.2、22.9±0.2和24.8±0.2度2θ的至少三个峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在5.6±0.2、11.2±0.2、15.1±0.2、15.5±0.2、18.8±0.2、20.6±0.2、22.1±0.2、22.9±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自11.6±0.2、11.9±0.2、12.1±0.2、12.8±0.2、16.9±0.2、17.6±0.2、19.3±0.2、19.7±0.2、20.9±0.2、23.3±0.2、24.4±0.2、25.7±0.2、26.1±0.2、27.4±0.2、28.5±0.2、29.2±0.2、29.7±0.2和30.2±0.2度2θ的至少一个峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在11.2±0.2、15.1±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自5.6±0.2、18.8±0.2和22.1±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在5.6±0.2、18.8±0.2和22.1±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自15.5±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在15.5±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在15.5±0.2、20.6±0.2和22.1±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自11.2±0.2、15.1±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在11.2±0.2、15.1±0.2和22.9±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自5.6±0.2、18.8±0.2和24.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在5.6±0.2、18.8±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在15.1±0.2、16.9±0.2和19.7±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自5.6±0.2、11.2±0.2和24.8±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在5.6±0.2、11.2±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自15.5±0.2、18.8±0.2、20.6±0.2、22.1±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在15.5±0.2、18.8±0.2、20.6±0.2、22.1±0.2和22.9±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在5.6±0.2、11.2±0.2、11.6±0.2、11.9±0.2、12.1±0.2、12.8±0.2、15.1±0.2、15.5±0.2、16.9±0.2、17.6±0.2、18.8±0.2、19.3±0.2、19.7±0.2、20.6±0.2、20.9±0.2、22.1±0.2、22.9±0.2、23.3±0.2、24.4±0.2、24.8±0.2、25.7±0.2、26.1±0.2、27.4±0.2、28.5±0.2、29.2±0.2、29.7±0.2和30.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

与相对峰高相比，XRPD图的峰位置对实验参数如样品制备和仪器几何形状相对不太敏感。结晶形式可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图5中所示图的峰位置一致。

多晶型物形式II还可以通过其特征性DSC热图来鉴定。如图6中所描绘，以10℃/分钟加热速率记录的多晶型物形式II的示例性DSC热图展现出在约259.2℃开始、在约263.2℃处峰值和115.9J/g吸热下面积的熔融吸热。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在约240℃至280℃，如245℃-275℃、250℃-270℃、255℃-270℃、258℃-268℃、259℃-267℃、260℃-266℃、261℃-265℃或262℃-264℃范围内的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在约259℃-267℃如约263℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过包含在约263℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过在约263.2℃±3℃，如约263.2℃±2℃或263.2℃±1℃的温度下显示吸热热流率最大值的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式II通过基本上与图6中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

多晶型物形式II还可以通过其特征性TGA曲线来鉴定，其示例性例子描绘于图7中。在一些实施方案中，多晶型物形式II显示小于3％的质量损失直至大于约250℃。多晶型物形式II在熔融后分解，如通过在约255℃开始时发生的显著重量损失所证明的。

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过图8中所描绘的DMS等温线表征。当暴露于5％-90％相对湿度时，观察到的总水分增加按重量计为约0.85％。在两个连续的吸附-解吸循环后获得的固体显示出与起始材料相同的XRPD图，表明在该实验之后形式没有变化。这些数据表明多晶型物形式II在水的存在下不转化为水合形式并且是轻微吸湿性的。因此，多晶型物形式II可表征为无水的、轻微吸湿性的或两者。

多晶型物形式II可以通过单晶X射线衍射分析来鉴定。在表4中提供了晶胞参数和晶系以及空间群详情。在配备有Oxford Cryosystems Cobra冷却装置的Rigaku Atlas CCD衍射仪上收集数据。使用Cu-Kα辐射收集数据，并使用Bruker AXS SHELXTL软件解析和精修晶体结构。将附接到碳的氢原子以几何方式放置，并允许用骑式各向同性位移参数精修。使附接到杂原子的氢原子位于差分傅立叶图中，并且允许用各向同性位移参数自由精修。

表4

在一些实施方案中，多晶型物形式II通过具有P-1空间群的单晶X射线衍射表征。多晶型物形式II的单晶可以包括以下晶胞尺寸：

α＝75.5±0.1°；β＝87.3±0.1°；和γ＝73.8±0.1°。在一些实施方案中，多晶型物形式II的单晶包括以下晶胞尺寸：/>

α＝75.5±0.3°；β＝87.3±0.3°；和γ＝73.8±0.3°。

在一些实施方案中，多晶型物形式II的化学纯度大于60％，如大于70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，多晶型物形式II的化学纯度大于约90％。在一些实施方案中，多晶型物形式II的化学纯度大于约95％。在一些实施方案中，多晶型物形式II的化学纯度大于约99％。多晶型物形式II的化学纯度可以通过任何适当的分析技术如HPLC分析来测量。

在一些实施方案中，多晶型物形式II在室温下是稳定的。多晶型物形式II可以在室温下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在室温下储存30天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在室温下储存120天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式II在升高的温度和/或相对湿度(RH)下是稳定的。例如，多晶型物形式II可以在约40℃和约75％RH下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在40℃和75％RH下储存30天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在40℃和75％ RH下储存120天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式II可以在约60℃下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在60℃下储存30天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在60℃下储存120天后，多晶型物形式II的化学纯度为至少95％，如至少98％。

多晶型物形式III

在某些方面，式I化合物或其盐的结晶形式是多晶型物形式III。多晶型物形式III是式I化合物的游离碱。多晶型物形式III可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图9中所示的那些一致。面积相对强度大于1％的某些峰列于表5中。该图显示在5-35度2θ范围内的尖锐衍射峰。衍射图中的这些和其他峰可用于鉴定这种形式。

表5

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在10.5±0.2、15.8±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自7.5±0.2、19.9±0.2和20.9±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在7.5±0.2、19.9±0.2和20.9±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自9.0±0.2、13.2±0.2、16.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在9.0±0.2、13.2±0.2、16.8±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含选自7.5±0.2、9.0±0.2、10.5±0.2、13.2±0.2、15.8±0.2、16.8±0.2、19.9±0.2、20.9±0.2、25.2±0.2和25.8±0.2度2θ的至少三个峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在7.5±0.2、9.0±0.2、10.5±0.2、13.2±0.2、15.8±0.2、16.8±0.2、19.9±0.2、20.9±0.2、25.2±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自9.2±0.2、14.6±0.2、15.0±0.2、18.1±0.2、18.3±0.2、22.2±0.2和23.8±0.2度2θ的至少一个峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在19.9±0.2、20.9±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自13.2±0.2、15.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在13.2±0.2、15.8±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自7.5±0.2、9.0±0.2、10.5±0.2和16.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在7.5±0.2、9.0±0.2、10.5±0.2和16.8±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在7.5±0.2、15.8±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自9.0±0.2、13.2±0.2和20.9±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在9.0±0.2、13.2±0.2和20.9±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自10.5±0.2、16.8±0.2、19.9±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在10.5±0.2、16.8±0.2、19.9±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在9.0±0.2、16.8±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。X射线粉末衍射图还可包含选自7.5±0.2、10.5±0.2和19.9±0.2度2θ的至少一个峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含在7.5±0.2、10.5±0.2和19.9±0.2度2θ处的峰。在一些实施方案中，X射线粉末衍射图还包含选自13.2±0.2、15.8±0.2和20.9±0.2度2θ的至少一个峰。X射线粉末衍射图还可包含在13.2±0.2、15.8±0.2和20.9±0.2度2θ处的峰。

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在7.5±0.2、9.0±0.2、9.2±0.2、10.5±0.2、13.2±0.2、14.6±0.2、15.0±0.2、15.8±0.2、16.8±0.2、18.1±0.2、18.3±0.2、19.9±0.2、20.9±0.2、22.2±0.2、23.8±0.2、25.2±0.2和25.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

与相对峰高相比，XRPD图的峰位置对实验参数如样品制备和仪器几何形状相对不太敏感。结晶形式可通过X射线粉末衍射图表征，其中峰位置基本上与图9中所示图的峰位置一致。

多晶型物形式III还可以通过其特征性DSC热图来鉴定。如图10中所描绘，以10℃/分钟加热速率记录的多晶型物形式III的示例性DSC热图展现出在约224.0℃开始、在约224.8℃处峰值和168.4J/g吸热下面积的熔融吸热，以及在约134.8℃开始、在约204.2℃处峰值和3.9J/g吸热下面积的次要预熔融吸热。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在约200℃至240℃，如205℃-235℃、210℃-235℃、215℃-230℃、220℃-230℃、221℃-229℃、222℃-228℃、223℃-227℃或224℃-226℃范围内的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在约221℃-229℃，如约225℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过包含在约225℃处的吸热的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过在约224.8℃±3℃，如约224.8℃±2℃或224.8℃±1℃的温度下显示吸热热流率最大值的差示扫描量热法热图表征。在一些实施方案中，多晶型物形式III通过基本上与图10中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

多晶型物形式III还可以通过其特征性TGA曲线来鉴定，其示例性例子描绘于图11中。在一些实施方案中，多晶型物形式III显示小于3％的质量损失直至大于约242℃。多晶型物形式III在熔融后分解，如通过在约260℃开始时发生的显著重量损失所证明的。

在一些实施方案中，多晶型物形式III通过图12中所描绘的DMS等温线表征。当暴露于5％-90％相对湿度时，观察到的总水分增加按重量计为约0.6％。在两个连续的吸附-解吸循环后获得的固体显示出与起始材料相同的XRPD图，表明在该实验之后形式没有变化。这些数据表明多晶型物形式III在水的存在下不转化为水合形式并且是轻微吸湿性的。

在一些实施方案中，多晶型物形式III的化学纯度大于60％，如大于70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，多晶型物形式III的化学纯度大于约90％。在一些实施方案中，多晶型物形式III的化学纯度大于约95％。在一些实施方案中，多晶型物形式III的化学纯度大于约99％。多晶型物形式III的化学纯度可以通过任何适当的分析技术如HPLC分析来测量。

在一些实施方案中，多晶型物形式III在室温下是稳定的。多晶型物形式III可以在室温下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在室温下储存30天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在室温下储存120天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式III在升高的温度和/或相对湿度(RH)下是稳定的。例如，多晶型物形式III可以在约40℃和约75％ RH下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在40℃和75％RH下储存30天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在40℃和75％ RH下储存120天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，多晶型物形式III可以在约60℃下储存延长的时间段-如至少10天、至少30天、至少60天、至少90天或至少120天-而没有结晶形式的显著化学降解或变化。在一些实施方案中，在60℃下储存30天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。在一些实施方案中，在60℃下储存120天后，多晶型物形式III的化学纯度为至少95％，如至少98％。

在某些方面，本公开文本提供了一种组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的结晶形式：

在一些实施方案中，组合物包含式I化合物的富马酸盐的结晶形式。在一些实施方案中，结晶形式为式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I。在一些实施方案中，组合物中至少90％，如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式I。组合物中多晶型物形式I与所有其他多晶型物的比率可为至少1:1w/w，如至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或至少10:1w/w。

在一些实施方案中，结晶形式为式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II。在一些实施方案中，组合物中至少90％，如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式II。组合物中多晶型物形式II与所有其他多晶型物的比率可为至少1:1w/w，如至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或至少10:1w/w。

在一些实施方案中，组合物包含式I化合物的游离碱的结晶形式。在一些实施方案中，结晶形式为式I化合物的游离碱的多晶型物形式III。在一些实施方案中，组合物中至少90％，如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的式I化合物为多晶型物形式III。组合物中多晶型物形式III与所有其他多晶型物的比率可为至少1:1w/w，如至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或至少10:1w/w。

在某些方面，本公开文本提供了一种包含式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的一种或多种结晶形式的组合物。在一些实施方案中，组合物包含式I化合物的富马酸盐或游离碱的一种或多种结晶形式。一种或多种结晶形式可以选自多晶型物形式I、多晶型物形式II和多晶型物形式III。

在一些实施方案中，组合物可以在约40℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。在一些实施方案中，组合物可以在约60℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。

缀合物

在某些方面，本公开文本提供了一种包含式I化合物的缀合物，所述式I化合物例如直接或通过接头共价连接至抗体构建体或靶向部分，从而形成缀合物。接头可以是不可切割的接头或可切割的接头。缀合物可由下式表示：

其中A′是抗体构建体或靶向部分；L¹是接头；D′是式I化合物或其盐；并且p是1至20的整数。在一些实施方案中，p是1至10如1至8、2至8、1至6、3至5或1至3的整数。

在一些实施方案中，缀合物由下式表示：

其中A′是抗体构建体或靶向部分；D′是式I化合物或其盐；并且p是1至20的整数。在一些实施方案中，p是1至10如1至8、2至8、1至6、3至5或1至3的整数。

因此，式I化合物或其盐可经由接头L¹附接至A′，或在没有中间接头的情况下直接附接至A′。在一些实施方案中，化合物或盐共价附接至A′或L¹。技术人员将理解，可以修饰式I化合物以向A′或L¹引入合适的附接位点。

在一些实施方案中，L¹或D′经由氨基酸序列的末端或经由氨基酸的侧链(如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链)结合至A′。在一些实施方案中，L¹或D′经由一个或多个聚糖或四至六个氨基酸的短肽标签结合至A′。L¹或D′可经由任何合适的官能团(如硫醇、胺、酰胺、醇、酮、羧酸或酯)缀合至A′。

接头可以在任何可用位置附接到本公开文本的化合物或盐。例如，接头L¹可经由式I化合物的氮原子附接：

式I化合物在本文中典型地以其非缀合形式描绘，但是技术人员将理解，接头L¹可以共价结合至用于附接的任何合适的原子，如化合物的可取代氮或碳。L¹可以是可切割的或不可切割的接头。接头可以进一步结合至A′。优选地，L¹不影响缀合物的活性部分与一个或多个结合靶标的结合。共价连接可以通过接头上的官能团与化合物上的官能团之间的反应，以及通过接头上的官能团与A′上的官能团之间的反应形成。如本文在缀合物的情境中所用，术语“接头”包括(i)未附接形式的接头，其包含能够将接头共价附接至式I化合物的官能团和能够将接头共价附接至抗体构建体或靶向部分的官能团；(ii)与式I化合物结合的呈部分附接形式的接头，其中所述接头包含能够将接头共价附接至抗体构建体或靶向部分的官能团；(iii)与抗体构建体或靶向部分结合的呈部分附接形式的接头，其中所述接头包含能够将接头共价附接至式I化合物的官能团；和(iv)与抗体构建体或靶向部分和式I化合物二者结合的呈完全附接形式的接头。

接头L¹可以是短的、柔性的、刚性的、可切割的(例如，通过溶酶体酶)、不可切割的、亲水性的或疏水性的。接头可以含有具有不同特征的区段，如柔性区段和刚性区段。接头可以对例如血流中的胞外环境具有化学稳定性，或者可以包括不稳定或选择性稳定的部分。在一些实施方案中，接头包含被选择性切割的部分，例如在细胞、特定器官或血浆中被选择性切割的部分。接头可能对酶如蛋白酶敏感。接头可能对胞内过程或蛋白酶不敏感。接头可能是酸不稳定的、蛋白酶敏感的或光不稳定的。在一些实施方案中，接头包含肽、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、聚乙二醇、亚烷基、亚烯基、亚炔基、二硫化物、腙、聚醚、聚酯、聚酰胺、氨基苄基氨基甲酸酯或其组合。

在一些方面，本公开文本提供了式I化合物，其中所述化合物任选地经由接头L¹共价结合至A′。在一些实施方案中，抗体构建体是抗体。在一些实施方案中，本公开文本提供式I化合物，其中所述化合物共价结合至接头L¹以形成化合物-接头。如果化合价允许，A′或L¹可以共价附接至化合物的任何位置。本文公开的接头L¹可包含约10至约500个原子，如10至400个原子、10至300个原子、30至400个原子或30至300个原子。

抗体、抗体构建体或靶向部分的靶标可取决于缀合物的期望治疗应用。典型地，靶标是存在于其中期望递送ALK5抑制剂的细胞(如T细胞)的表面上的分子，并且抗体优选地在结合靶标时内化。对于其中缀合物旨在通过降低TGF-β活性来刺激免疫系统的应用，可能期望产生与T细胞表面分子结合的抗体、抗体构建体或靶向部分。不希望受任何特定理论束缚，认为将ALK5抑制剂递送至T细胞可激活CD4⁺和/或CD8⁺T细胞活性并抑制调节性T细胞活性，两者促成肿瘤的免疫耐受。因此，在本公开文本的缀合物中结合至T细胞表面分子的抗体、抗体构建体或靶向部分(A′)可用于治疗各种癌症，如下文所述的那些。在一些实施方案中，A′结合CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、T_REG细胞或其任何组合。在一些实施方案中，A′结合泛T细胞表面分子，如CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD25、CD28、CD70、CD71、CD103、CD184、Tim3、LAG3、CTLA4或PD1。结合T细胞表面分子并被认为内化的抗体的例子包括OKT6、OKT11、OKT3、OKT4、OKT8、7D4、OKT9、CD28.2、UCHT1、M290、FR70、派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和多塔利单抗。

本文公开的抗体、抗体构建体或靶向部分可包含与肿瘤抗原或与纤维化发病机理相关的抗原特异性结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合T细胞、B细胞、星形细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、APC、成纤维细胞、纤维细胞或与纤维化发病机理相关的细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向CTLA4、PD-1、OX40、LAG-3、GITR、GARP、CD25、CD27、PD-L1、TNFR2、ICOS、41BB、CD70、CD73、CD38或VTCN1。在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向PDGFRβ、整合素αvβ1、整合素αvβ3、整合素αvβ6、αvβ8、内皮唾液酸蛋白、FAP、ADAM12、LRRC15、MMP14、PDPN、CDH11、F2RL2、ASGR1或ASGR2。

方法

在一些方面，本公开文本提供了一种抑制TGFβ信号传导的方法，其包括使细胞与有效量的本文公开的结晶形式接触。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种抑制ALK5的方法，其包括使ALK5与有效量的本文公开的结晶形式接触。ALK5或TGFβ信号传导的抑制可通过本领域已知的各种方法评估。非限制性例子包括显示(a)ALK5的激酶活性降低；(b)TGFβ/TGFβ-RII复合物与ALK5之间的结合亲和力降低；(c)TGFβ信号传导途径下游磷酸化细胞内信号传导分子的水平降低，如pSMAD2或pSMAD3水平降低；(d)ALK5与下游信号传导分子如SMAD2和SMAD3的结合降低；和/或(e)ATP水平增加或ADP水平降低。试剂盒和可商购的测定可用于测定上述中的一种或多种。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗受试者中ALK5介导的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自纤维化和癌症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肺纤维化，如特发性肺纤维化或病毒诱导的纤维化。在一些实施方案中，所述疾病或病症是肠纤维化。在一些实施方案中，所述疾病或病症是脱发。在一些实施方案中，所述疾病是神经退行性疾病，如阿尔茨海默病。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种逆转衰老症状的方法。例如，所述方法可增强神经发生、减少神经炎症、改善认知表现、再生肝组织和/或降低p16水平。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗纤维化的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，纤维化由ALK5介导。在一些实施方案中，纤维化选自系统性硬化病、系统性纤维化、器官特异性纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、门静脉纤维化、皮肤纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜纤维化、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。在一些实施方案中，纤维化是肺纤维化，如特发性肺纤维化(IPF)、家族性肺纤维化(FPF)、间质性肺纤维化、与哮喘相关的纤维化、与慢性阻塞性肺病(COPD)相关的纤维化、二氧化硅诱导的纤维化、石棉诱导的纤维化或化疗诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。在一些实施方案中，纤维化是TGF-β介导的肺纤维化。在一些实施方案中，患者已被诊断患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一些实施方案中，纤维化是急性纤维化。在一些实施方案中，纤维化是慢性纤维化。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗由病毒感染诱导的肺纤维化的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。肺纤维化可由如下病毒诱导：红病毒、依赖病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒、哺乳动物腺病毒、α疱疹病毒亚科、水痘疱疹病毒、γ疱疹病毒亚科、β疱疹病毒亚科、玫瑰疹病毒、正痘病毒、副痘病毒、软疣痘病毒、正肝DNA病毒、肠病毒、鼻病毒、肝病毒、口蹄疫病毒、杯状病毒、星状病毒、α病毒、风疹病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副粘病毒、麻疹病毒、风疹病毒、肺炎病毒、水疱病毒、丽沙病毒(lyssavirus)、布尼亚病毒、汉坦病毒、内罗病毒、白蛉病毒、冠状病毒、沙粒病毒、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒亚科、泡沫病毒亚科或丝状病毒。在一些实施方案中，纤维化是病毒诱导的纤维化，如病毒诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，纤维化选自EBV诱导的肺纤维化、CMV诱导的肺纤维化、疱疹病毒诱导的肺纤维化和冠状病毒诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，纤维化选自EBV诱导的肺纤维化、CMV诱导的肺纤维化、HHV-6诱导的肺纤维化、HHV-7诱导的肺纤维化、HHV-8诱导的肺纤维化、H5N1病毒诱导的肺纤维化、SARS-CoV诱导的肺纤维化、MERS-CoV诱导的肺纤维化和SARS-CoV-2诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，肺纤维化是冠状病毒诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，肺纤维化是SARS-CoV-2诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，肺纤维化是COVID-19诱导的肺纤维化。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗急性肺损伤(ALI)的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。ARDS可以处于早期急性损伤期或纤维增生期。在一些实施方案中，ARDS是纤维增生性ARDS。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗由ARDS引起的纤维化的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。由ARDS引起的纤维化可能是肺纤维化。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗由ALI引起的纤维化的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。由ALI引起的纤维化可能是肺纤维化。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗肠纤维化的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，肠纤维化由ALK5介导。在一些实施方案中，将结晶形式以有效延迟与肠纤维化相关的一种或多种特征的进展、降低其发生率或降低其程度的量施用。在一些实施方案中，将结晶形式以有效逆转已形成的纤维化的量以单剂量或多剂量施用。

在一些方面，本公开文本提供了一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，癌症由ALK5介导。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤和胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌，如非小细胞肺癌。在一些方面，本公开文本提供了一种治疗癌症如非小细胞肺癌的方法，其包括向患者施用有效量的本文公开的结晶形式和免疫治疗剂。在一些实施方案中，癌症是III期非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述方法还包括向患者施用辐射。在一些实施方案中，免疫治疗剂是PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗、度伐鲁单抗、BGB-A317、曲美木单抗和伊匹单抗。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自派姆单抗和度伐鲁单抗。

本文所述的结晶形式，包括多晶型物形式I、多晶型物形式II和多晶型物形式III，是限制TGFβ活性的ALK5抑制剂。TGFβ是参与全身纤维化疾病的引发和发展的几种因子之一。因此，预期本公开文本的结晶形式可用于通过施用治疗有效量的本文公开的结晶形式来治疗、预防和/或减少患者的纤维化。通过抑制ALK5，预期该结晶形式在遭受细胞外基质过度沉积的身体区域中加强纤维化的形成。下文描述了这些区域。

系统性纤维化疾病

系统性硬化病(SSc)是一种自身免疫障碍，其影响皮肤和内部器官并导致自身抗体产生、小血管的血管内皮细胞激活和由成纤维细胞功能障碍引起的组织纤维化。转化生长因子β(TGF-β)已被鉴定为SSc中病理性纤维发生的调节因子(Ayers,N.B.,等人,Journalof Biomedical Research,2018,32(1),第3-12页)。作者认为，“了解TGF-β途径在系统性硬化病病理学中所起的重要作用可为治疗提供潜在的出口，并使得更好地了解这种严重疾病”。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗SSc的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

多灶性纤维硬化(MF)和特发性多灶性纤维硬化(IMF)是以不同部位的纤维损伤为特征的障碍，并包括腹膜后纤维化、纵隔纤维化和木样甲状腺炎。多灶性纤维硬化和特发性多灶性纤维硬化都被认为是IgG₄相关纤维化/疾病的结局，并且TGF-β被认为是参与纤维化的引发和发展的一个因子(Pardali,E.,等人,Int.J.Mol.Sci.,18,2157,第1-22页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗多灶性纤维硬化或特发性多灶性纤维硬化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗肾源性系统性纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。肾源性系统性纤维化是一种罕见疾病，主要发生在进行或不进行透析的晚期肾衰竭人中。Kelly等人进行的研究(J.Am.Acad.Dermatol.,2008,58,6,第1025-1030页)表明，TGF-β以及Smad 2/3显现与在肾源性系统性纤维化中观察到的纤维化相关。

硬皮病性移植物抗宿主病(GVHD)是同种异体骨髓移植后两至三个月出现的同种异体造血干细胞移植物的常见并发症。该疾病导致产生自身抗体以及皮肤和内部器官纤维化。使用鼠皮肤GVHD模型，已经表明早期皮肤和肺病的进展可以用TGF-β中和抗体抑制(McCormick,L.L.,等人,J.Immunol.,1999,163,第5693-5699页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗硬皮病性GVHD的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

器官特异性纤维化疾病

心脏纤维化是指由于心脏成纤维细胞的异常增殖导致ECM在心肌中过度沉积而导致的心脏瓣膜的异常增厚。成纤维细胞分泌胶原，胶原用作心脏的结构支撑。然而，当胶原在心脏中过度分泌时，壁和瓣膜增厚可导致组织在三尖瓣和肺动脉瓣上积聚。这又导致柔韧性丧失，最终导致瓣膜功能障碍，导致心力衰竭。一种具体类型的心脏纤维化是高血压相关的心脏纤维化，如Diez(J.Clin.Hypertens.,2007,7月9(7),第546-550页)所述。根据Diez，患有左心室肥大的高血压患者的心脏组织组成发生变化，并导致心脏组织的结构重塑。一种变化涉及I型和III型胶原分子的合成和降解之间平衡的破坏，导致胶原纤维在心脏组织中的过度积聚。其他类型的心脏纤维化包括心肌梗塞后和Chagas病诱导的心肌纤维化。在Chagas病中，转化生长因子β1(TGF-β1)与Chagas病的病理生理学有关，其中动物模型表明TGF-β1途径在感染期间上调(Araujo-Jorge,T.C.,等人,Clin.Pharmacol.Ther.,2012,92(5),第613-621页；Curvo,E.,Mem Inst Oswaldo Cruz,2018,第113(4)卷,e170440,第1-8页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗各种形式的心脏纤维化(如高血压相关的心脏纤维化、心肌梗塞后或Chagas病诱导的心肌纤维化)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

肾纤维化涵盖与TGF-β的异常表达和活性相关的多种障碍，包括但不限于糖尿病性和高血压性肾病、尿路梗阻诱导的肾纤维化、炎性/自身免疫诱导的肾纤维化、马兜铃酸肾病、进行性肾纤维化和多囊肾病。如上所述，纤维化涉及ECM的过度积聚，当正常组织被瘢痕组织替代时，这又导致功能丧失(Wynn,T.A.,J Clin Invest.,2007,117,第524-529页)。早在2005年，ALK5抑制剂正在肾病模型中研究(Laping,N.J.,Current Opinion inPharmacology,2003,3,第204-208页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗肾纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

一种特别难以治疗的纤维化疾病是特发性肺纤维化(IPF)。IPF是一种慢性、进行性和致命性纤维化肺病，只有通过肺移植才能提高存活率。目前的口服疗法如尼达尼布和吡非尼酮已经显示出减缓疾病的进展，但具有导致患者中断和缺乏依从性的副作用。尽管靶向各种途径的其他疗法正在开发中，但IPF患者的需求仍未得到满足。

尽管ALK5是纤维化疾病途径中的重要且已知的组分，但ALK5抑制剂在IPF中的功效尚未实现，这是由于全身不良作用，尤其是在心脏中的不良作用。因此，本公开文本的目的之一是开发具有高肺选择性和快速全身清除的ALK5抑制剂。本公开文本的一个优选实施方案是用本文所述的结晶形式治疗患有特发性肺纤维化的患者，例如通过每天一次或两次施用具有最小全身暴露的可吸入ALK5抑制剂。吸入的ALK5抑制剂可以作为单一疗法施用或与其他口服IPF疗法共同给药。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗特发性肺纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，结晶形式通过吸入施用。

家族性肺纤维化是一种遗传性疾病，其中两个或更多个家族成员患有确认的IPF。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗家族性肺纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

肺纤维化是与病毒感染如SARS和COVID-19相关的典型临床特征。已显示SARS介导的TGF-β信号传导促进SARS-CoV感染的宿主细胞的纤维化并阻断细胞凋亡(Zhao,X.等人,J.Biol.Chem.,2008,283(6),第3272-3280页)。在感染SARS-CoV-2的患者中类似地观察到TGF-β表达增加，最终导致肺纤维化的发展。SARS-CoV-2介导的TGF-β信号传导可促进成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞分化，并阻断宿主细胞凋亡。(Xiong,Y.等人,EmergingMicrobes&Infections,2020,9(1),第761-770页)。预期本公开文本的结晶形式抑制由病毒感染介导的增加的TGF-β信号传导，并预防、停止、减缓或逆转与感染相关的肺纤维化的进展。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗由病毒感染诱导的肺纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。在一些实施方案中，肺纤维化由SARS-CoV或SARS-CoV-2诱导。在一些实施方案中，结晶形式通过吸入施用。

慢性肺病如间质性肺病(ILD)、慢性阻塞性肺病(COPD)和特发性肺纤维化(IPF)可导致肺动脉高压(PH)。肺动脉高压是一种以肺中高血压为特征的进行性疾病。世界卫生组织(WHO)定义了PH的五个分类(WHO第I组：肺动脉高压(PAH)；WHO第II组：左心疾病引起的肺动脉高压；WHO第III组：肺疾病和/或缺氧引起的肺动脉高压；WHO第IV组：慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)；和WHO第V组：多因素机制不明的肺动脉高压)。TGF-β信号传导牵涉于PH的发病机理中。此外，在重度PH的野百合碱(MCT)模型中对ALK5的抑制显示以剂量依赖性方式，即通过降低RV收缩压、降低RV舒张压、增加心输出量和减少RV肥大来减弱PH的发展和减少肺血管重塑(Zaiman,A.L.；等人,Am.J.Respir.Crit.Care Med.,2008,177,第896-905页)。预期本公开文本的结晶形式抑制肺组织中的TGF-β信号传导并预防、停止、减缓或逆转PH的进展，特别是在WHO第III组PH中。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗肺动脉高压的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。肺动脉高压可以是WHO第III组肺动脉高压，如肺纤维化相关的肺动脉高压(PH-PF)或间质性肺病相关的肺动脉高压(PH-ILD)。在一些实施方案中，结晶形式通过吸入施用。

其他类型的间质性肺病包括但不限于(1)由细菌、病毒或真菌引起的间质性肺炎；(2)通常与自身免疫性病症如类风湿性关节炎或硬皮病相关的非特异性间质性肺炎；(3)吸入粉尘、霉菌或其他刺激物引起的过敏性肺炎；(4)隐源性机化性肺炎；(5)急性间质性肺炎；(6)脱屑性间质性肺炎；(7)结节病；和(8)药物诱导的间质性肺病。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗间质性肺病的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

转化生长因子(TGF)-β(1)和激活素A均牵涉于哮喘中的气道重塑中(Kariyawasam,H.H.,J Allergy Clin Immunol.,2009,9月,124(3),第454-462页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗哮喘的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

慢性阻塞性肺病(COPD)是一种以气道炎症和肺气肿引起的可逆性差的进行性气流受限为特征的肺障碍，而IPF与扩散能力受损相关(Chilosi,M.,等人.,Respir.Res.,2012,13(1),3,第1-9页)。然而，两种疾病都显示肺泡实质的进行性丧失，导致呼吸功能的重度损害。与肺气肿相关的纤维化是已知的，并且研究已经表明TGF-β1参与慢性窦疾病、肺纤维化、哮喘和COPD(Yang,Y.C.,等人,Allergy,2012,67,第1193–1202页)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗COPD的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

导致纤维化的其他类型的肺损伤包括二氧化硅诱导的尘肺病(硅肺病)、石棉诱导的肺纤维化(石棉肺)和化疗剂诱导的肺纤维化。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗损伤诱导的纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗肝纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。当肝脏反复或连续受损时，例如在慢性肝炎患者中，纤维化在肝脏中发展。TGF-β信号传导参与疾病进展的所有阶段，从最初的肝损伤到炎症和纤维化，再到肝硬化和癌症(Fabregat,I.,等人,The FEBS J.,2016,283(12),第2219-2232页)。

相关病症涉及由特发性非肝硬化性门静脉高血压(INCPH)引起的纤维化。该疾病病因不明，其特征在于门静脉周纤维化和门静脉的小中分支受累。根据Nakanuma等人，硬皮病和INCPH患者的小门静脉和皮肤发现是相似的(Nakanuma,Y.,Hepatol.Res.,2009,39,第1023-1031页)。转化生长因子-β(TGF-β)和结缔组织生长因子(分别是纤维化相关生长因子和血管内皮生长因子)在血清、皮肤和门静脉中增加，表明这些可能是INCPH中门静脉闭塞的机制。此外，Kitao等人基于这些发现提出了内皮间质转化(EndMT)理论(Kitao,A.,等人,Am.J.Pathol.,2009,175,第616-626页)。血清中TGF-β的增加可作为EndMT的有效诱导剂。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗INCPH的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

其他类型的肝纤维化包括酒精性和非酒精性肝纤维化、丙型肝炎诱导的肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化或胆管炎和寄生虫诱导的肝纤维化(血吸虫病)。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗酒精性肝纤维化、非酒精性肝纤维化、丙型肝炎诱导的肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆汁性胆管炎或寄生虫诱导的肝纤维化(血吸虫病)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

原发性胆汁性胆管炎(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)是两种类型的慢性肝病，其通常导致肝硬化和肝衰竭。患有PBC或PSC的患者的肝活检通常显示炎症和纤维化。抑制已显示结合并激活上皮细胞上的TGFβ1的整合素αvβ6可抑制啮齿动物中的胆纤维化。(eng,Z-W.,等人,Hepatology,2016,63,第217-232页)。因此，还预期抑制TGF-β途径可抑制PBC和PSC中的纤维化过程。预期本公开文本的结晶形式可抑制肝组织中的TGF-β信号传导并预防、停止、减缓或逆转PBC和PSC的进展。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的结晶形式。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种任选地在患有PBC或PSC的受试者中治疗肝纤维化的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的结晶形式。

纤维化皮肤病症包括但不限于肥厚性疤痕、瘢痕疙瘩和局部或系统性硬化病(硬皮病)。如前所述，TGF-β是结缔组织积聚的有效刺激物并牵涉于硬皮病和其他纤维化障碍的发病机理中(Lakos,G.,等人,Am.J.Pathol.,2004,165(1),第203-217页)。Lakos等人表明，Smad3在正常皮肤成纤维细胞中作为促纤维化TGF-β应答的关键胞内信号转导物，并发现TGF-β/Smad3信号传导的靶向破坏调节硬皮病小鼠模型中的皮肤纤维化。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗皮肤纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

肠纤维化是炎性肠病(IBD)的常见并发症并且是严重的临床问题。TGF-β被牵涉作为肠纤维化的主要驱动因子。此外，TGF-β1信号传导通过在肠平滑肌中诱导胰岛素样生长因子I(IGF-I)和机械生长因子(MGF)产生而促成纤维狭窄性克罗恩病中的狭窄形成。(Latella,G.,Rieder,F.,Curr.Opin.Gastroenterol.,2017,33(4),第239-245页)。因此，抑制TGF-β信号传导可减缓、阻止或逆转肠中纤维化的进展。然而，IBD患者所关注的不良副作用(如炎症和瘤形成)可能由TGF-β信号传导的系统性抑制引起。本公开文本的一个目标是开发对胃肠道具有高选择性且快速清除的ALK5抑制剂。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗肠纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的结晶形式，例如通过每天一次或两次施用具有最小全身暴露的口服ALK5抑制剂。在一些实施方案中，受试者患有炎性肠病，如克罗恩病或结肠炎。治疗功效的程度可以是关于受试者的初始状况(例如，基线Mayo得分、基线Lichtiger得分、或一种或多种症状的严重程度或发生率)，或关于参考群体(例如，未治疗的群体、或用不同药剂治疗的群体)。肠纤维化的严重程度可以使用任何合适的方法评估，如延迟增强MRI、超声弹性成像、剪切波弹性成像、磁化MRI、或通过直接检测大分子(如胶原)。优选地，用本公开文本的结晶形式治疗降低纤维化的严重程度，如从重度纤维化降低到中度或轻度纤维化。在一些实施方案中，治疗增加肠组织弹性、降低组织硬度和/或降低胶原水平。在一些实施方案中，治疗预防肌成纤维细胞积聚、抑制促纤维化因子的表达和/或抑制纤维化组织的积聚。

涉及TGF-β途径的其他类型的器官特异性纤维化或纤维化疾病包括但不限于辐射诱导的纤维化(各种器官)、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜硬化、弥漫性筋膜炎、迪皮特朗病(Dupuytren’s disease)、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗辐射诱导的纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜硬化、弥漫性筋膜炎、迪皮特朗病、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化或视网膜纤维化的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的结晶形式。

尽管本公开文本的目的之一是局部或以靶向方式治疗纤维化疾病和肺部疾病，但本文所述的结晶形式也可用于全身治疗患者。可全身治疗的疾病包括例如肿瘤疾病，如胶质母细胞瘤、胰腺癌和肝细胞癌、转移至肺部的乳腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、囊性纤维化和其他形式的原发性癌症亚型的转移。一些前述疾病也可以局部治疗。

本文公开的结晶形式可治疗的其他纤维化疾病包括血管性水肿、抗衰老和脱发。脱发包括全秃、普秃、雄激素性脱发、斑秃、弥漫性脱发、产后脱发和牵引性脱发。

其他适应证

在某些方面，本公开文本提供了一种逆转衰老的一种或多种症状的方法，其包括向受试者施用本文公开的结晶形式。所述方法还可以包括施用MAPK途径的激活剂，如催产素。所述方法可在以下一个或多个方面有效：增强海马体中的神经发生、减少神经炎症、改善认知能力、减少肝肥胖、减少肝纤维化和减少p16⁺细胞数量。在一些实施方案中，本文所述的方法增加干细胞活性。干细胞活性的增加可以允许受试者产生新的肌纤维和/或在海马体中形成新的神经元。用ALK5抑制剂如本文所述的结晶形式治疗可预防或减缓年龄相关疾病如阿尔茨海默病的发作。(参见Mehdipour,M.等人Aging 2018,10,5628-5645)。

在实践任何主题方法时，可以将结晶形式例如作为固体或悬浮液直接施用于受试者，或者可以将结晶形式用于制备施用于受试者的组合物，如溶液。因此，提及向受试者施用结晶形式包括施用从式I化合物的结晶形式制备的组合物，无论式I化合物在向受试者施用时是以结晶形式还是以溶液形式存在。

药物组合物

在某些方面，本公开文本提供了一种药物组合物。药物组合物可以包含本文公开的结晶形式，如多晶型物形式I、多晶型物形式II或多晶型物形式III，以及药学上可接受的载体。药物组合物可以包含本文公开的盐，如式I化合物的富马酸盐，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于口服施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于吸入。在一些实施方案中，药物组合物由结晶形式制备，即使式I化合物在药物组合物中呈溶液形式。在一些实施方案中，药物组合物包含本文公开的结晶形式和另外的治疗剂。此类治疗剂的非限制性例子在下文中描述。

药物组合物通常包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和至少一种本文公开的结晶形式(本文也称为活性剂)。活性剂可以以适于特定施用模式的任何形式提供，如游离碱、游离酸或药学上可接受的盐。本文所述的化合物的所有互变异构体都包括在本公开文本的范围内。另外，本文所述的化合物涵盖非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等一起的溶剂化形式。

合适的施用途径包括但不限于口服、静脉内、直肠、阴道、气雾剂、肺、鼻、经粘膜、外用、透皮、耳、眼和肠胃外施用模式。此外，仅作为例子，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴管内和鼻内注射。

在某些实施方案中，本文所述的结晶形式是以局部而非全身性方式施用，例如通过将结晶形式(通常呈贮库制剂或缓释配制品形式)直接注射到器官中。在一些实施方案中，通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用长效配制品。在一些实施方案中，本文所述的结晶形式以快速释放配制品、延长释放配制品或中间释放配制品的形式提供。在一些实施方案中，本文所述的结晶形式以雾化配制品的形式提供。在一些实施方案中，本文所述的结晶形式通过吸入局部施用至肺部。

本公开文本的结晶形式在宽剂量范围内有效。例如，在成人的治疗中，每天0.01至1000mg、0.5至100mg、1至50mg或5至40mg的剂量可施用于有需要的受试者。确切剂量将取决于施用途径、施用结晶形式的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。

本公开文本的结晶形式可以以单剂量施用。在一些实施方案中，本文公开的结晶形式以多剂量施用，如每天约一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。在一些实施方案中，给药约每月一次、每两周一次、每周一次或隔天一次。在一些实施方案中，本公开文本的结晶形式和另外的治疗剂以约每天一次至约每天6次一起施用。在一些实施方案中，施用持续超过约6、10、14、28天、2个月、6个月或超过约1年。在一些实施方案中，只要有必要，就维持给药方案。本公开文本的结晶形式可以持续长期施用，例如用于治疗慢性效应。

本公开文本的药物组合物通常含有治疗有效量的本公开文本的结晶形式。然而，本领域技术人员将认识到，药物组合物可含有大于治疗有效量(例如，散装组合物)或小于治疗有效量(例如，设计用于共施用以实现治疗有效量的单独单位剂量)。

通常，本公开文本的药物组合物含有按重量计约0.01％至约95％的活性剂；包括例如按重量计约0.05％至约30％；以及按重量计约0.1％至约10％的活性剂。

任何常规载体或赋形剂可用于本公开文本的药物组合物中。特定载体或赋形剂或载体或赋形剂的组合的选择将取决于用于治疗特定患者的施用模式或医学病症或疾病状态的类型。另外，本公开文本的药物组合物中使用的载体或赋形剂可以是市售的。常规配制技术描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,LippincottWilliams&White,Baltimore,Maryland(2000)；和H.C.Ansel等人,Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippincott Williams&White,Baltimore,Maryland(1999)中。

可用作药学上可接受的载体的材料的代表性例子包括但不限于以下：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，如微晶纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗生理盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其他在药物组合物中使用的非毒性相容物质。

通常通过将活性剂与药学上可接受的载体和一种或多种任选的成分充分且紧密地混合或共混来制备药物组合物。然后可使用常规程序和设备将所得均匀共混的混合物成形或装入片剂、胶囊、丸剂等中。

在一方面，药物组合物适于吸入施用。用于吸入施用的药物组合物通常为气雾剂或散剂的形式。通常使用吸入器递送装置施用此类组合物，如干粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)、喷雾吸入器或类似递送装置。

在特定的实施方案中，使用干粉吸入器通过吸入施用药物组合物。这种干粉吸入器通常将药物组合物作为自由流动的散剂施用，所述散剂在吸气期间分散在患者的气流中。为了获得自由流动的散剂组合物，通常将治疗剂与合适的赋形剂如乳糖、淀粉、甘露醇、右旋糖、聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或其组合一起配制。通常，将治疗剂微粉化并与合适的载体组合以形成适于吸入的组合物。

用于干粉吸入器的代表性药物组合物包含乳糖和本文公开的结晶形式的微粉化形式。这种干粉组合物可以例如通过将干磨的乳糖与治疗剂合并，然后将组分干混来制得。然后通常将组合物装入干粉分配器中，或装入与干粉递送装置一起使用的吸入药筒或胶囊中。

适合于通过吸入施用治疗剂的干粉吸入器递送装置在本领域中描述并且此类装置的例子是可商购的。例如，代表性干粉吸入器递送装置或产品包括Aeolizer(Novartis)；Airmax(IVAX)；ClickHaler(Innovata Biomed)；Diskhaler(GlaxoSmithKline)；Diskus/Accuhaler(GlaxoSmithKline)；Ellipta(GlaxoSmithKline)；Easyhaler(Orion Pharma)；Eclipse(Aventis)；FlowCaps(Hovione)；Handihaler(Boehringer Ingelheim)；Pulvinal(Chiesi)；Rotahaler(GlaxoSmithKline)；SkyeHaler/Certihaler(SkyePharma)；Twisthaler(Schering-Plough)；Turbuhaler(AstraZeneca)；Ultrahaler(Aventis)等。

本公开文本的药物组合物可以使用定量吸入器通过吸入施用。此类定量吸入器通常使用压缩的推进剂气体排出测定量的治疗剂。因此，使用定量吸入器施用的药物组合物通常包含治疗剂在液化推进剂中的溶液或悬浮液。可以使用任何合适的液化推进剂，包括氢氟烷烃(HFA)，如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟正丙烷(HFA227)；和氯氟烃，如CCl₃F。在特定实施方案中，推进剂是氢氟烷烃。在一些实施方案中，氢氟烷烃配制品含有助溶剂(如乙醇或戊烷)和/或表面活性剂(如山梨糖醇酐三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油)。

用于定量吸入器的代表性药物组合物包含按重量计约0.01％至约5％的本公开文本的结晶形式；按重量计约0％至约20％的乙醇；以及按重量计约0％至约5％的表面活性剂；其余为HFA推进剂。此类组合物通常通过将冷冻或加压的氢氟烷烃添加到含有治疗剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的合适容器中来制备。为了制备悬浮液，将治疗剂微粉化，然后与推进剂合并。然后将组合物装入气雾剂罐中，该气雾剂罐通常形成定量吸入器装置的一部分。

适合于通过吸入施用治疗剂的定量吸入器装置在本领域中描述并且此类装置的例子是可商购的。例如，代表性定量吸入器装置或产品包括AeroBid Inhaler System(Forest Pharmaceuticals)；Atrovent Inhalation Aerosol(Boehringer Ingelheim)；Flovent(GlaxoSmithKline)；Maxair吸入器(3M)；Proventil吸入器(Schering)；SereventInhalation Aerosol(GlaxoSmithKline)等。

本公开文本的药物组合物可以使用喷雾吸入器通过吸入施用。此类喷雾器装置通常产生高速空气流，该高速空气流使药物组合物以雾的形式喷射，并进入患者的呼吸道。因此，当配制用于喷雾吸入器时，可将结晶形式溶解于合适的载体中以形成式I化合物的溶液。替代性地，可将结晶形式微粉化或纳米研磨并与合适的载体合并以形成悬浮液。

用于喷雾吸入器的代表性药物组合物包括溶液或悬浮液，其包含约0.05μg/mL至约20mg/mL的本公开文本的结晶形式和与雾化配制品相容的赋形剂。在一个实施方案中，溶液具有约3至约8的pH。

适合于通过吸入施用治疗剂的喷雾器装置在本领域中描述并且此类装置的例子是可商购的。例如，代表性喷雾器装置或产品包括

Softmist^TM吸入器(BoehringerIngelheim)；/>

肺部递送体系(Aradigm Corp.)；PARI LC/>

可重复使用喷雾器或PARI/>

快速喷雾器系统(Pari GmbH)等。

本公开文本的药物组合物可以制备成旨在用于口服施用的剂型。用于口服施用的合适的药物组合物可以是胶囊、片剂、丸剂、锭剂、扁囊剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂的形式；或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水液体乳剂；或作为酏剂或糖浆等；各自含有预定量的本公开文本的结晶形式作为活性成分。

当旨在以固体剂型口服施用时，本公开文本的药物组合物将通常包含活性剂和一种或多种药学上可接受的载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或替代性地，此类固体剂型还可包含：填充剂或增量剂、粘合剂、保湿剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂、着色剂和缓冲剂。释放剂、润湿剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于本发明的药物组合物中。

替代配制品可以包括控释配制品、用于口服施用的液体剂型、透皮贴剂和肠胃外配制品。常规赋形剂和制备此类替代配制品的方法描述于例如上文Remington的参考文献中。

以下非限制性实施例说明本公开文本的代表性药物组合物。

干粉组合物

将本公开文本的微粉化结晶形式(1g)与研磨的乳糖(25g)共混。然后将此共混的混合物以足以提供每剂约0.1mg至约4mg结晶形式的量装入可剥离泡罩包装的单独泡罩中。使用干粉吸入器施用泡罩的内容物。

干粉组合物

将本公开文本的微粉化结晶形式(1g)与研磨的乳糖(20g)共混以形成结晶形式与研磨乳糖的重量比为1:20的散装组合物。将共混的组合物装入干粉吸入装置中，所述装置能够递送每剂量约0.1mg至约4mg之间的结晶形式。

定量吸入器组合物

将本公开文本的微粉化结晶形式(10g)分散于通过将卵磷脂(0.2g)溶解于去矿物质水(200mL)中制备的溶液中。将所得悬浮液喷雾干燥，然后微粉化以形成包含平均直径小于约1.5μm的颗粒的微粉化组合物。然后将微粉化组合物装入含有加压1,1,1,2-四氟乙烷的定量吸入器药筒中，其量足以在通过定量吸入器施用时提供每剂量约0.1mg至约4mg式I化合物。

喷雾器组合物

代表性喷雾器组合物如下。将本公开文本的结晶形式(2g游离碱等效物)溶解于含有80mL反渗透水、按重量计0.1％-1％无水柠檬酸和0.5-1.5当量盐酸的溶液中，随后添加氢氧化钠以将pH调节至3.5-5.5。然后，添加按重量计4％-6％的D-甘露醇，并将溶液补足至100mL。然后将溶液通过0.2μm过滤器过滤并在使用前在室温下储存。使用提供每剂量约0.1mg至约4mg式I化合物的喷雾器装置施用溶液。

试剂盒

在某些方面，本公开文本提供了一种包含一个或多个单位剂量的本文所述的结晶形式或药物组合物的试剂盒，任选地其中所述试剂盒还包含使用所述结晶形式或药物组合物的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等，所述一个或多个容器中的每一个包含有待在本文所述的方法中使用的单独要素之一。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以用各种材料(如玻璃或塑料)制成。

本文提供的制品可含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料包括在例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252中发现的那些。药物包装材料的例子包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶、以及适用于所选配制品以及预期施用方式和治疗的任何包装材料。例如，所述一个或多个容器可包含本文所述的一种或多种结晶形式，任选地在组合物中或与本文公开的另一种药剂组合。所述一个或多个容器可任选地具有无菌接入端口(例如，容器是静脉注射液袋或带有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。此类试剂盒可任选地包含结晶形式和与其在本文所述的方法中的使用有关的识别描述或标签或说明。

在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器，每个容器具有从商业和用户观点来看使用本文所述的结晶形式所需的一种或多种各种材料(如试剂-任选地呈浓缩形式，和/或装置)。此类材料的非限制性例子包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、载体、包装、容器、小瓶和/或列出内容物的管标签和/或使用说明书，以及具有使用说明书的包装插页。通常还将包括一组指令。标签任选地在容器上或与容器相关联。例如，当形成标签的字母、数字或其他字符被贴附、模制或蚀刻到容器本身上时，标签在容器上；当标签存在于也容纳容器的插座或载体内时，标签与容器相连，例如作为包装说明书。此外，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。此外，标签指示如在本文所述的方法中使用内容物的指南。在某些实施方案中，药物组合物呈现于包装或分配器装置中，所述装置含有一个或多个含有本文所提供结晶形式的单位剂型。包装可含有金属或塑料箔，如泡罩包装。在一些实施方案中，包装或分配器装置附有施用说明书。任选地，包装或分配器附有与容器相连的通知，所述通知的形式由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定，所述通知反映了所述机构对用于人或兽医施用的药物形式的批准。例如，此类通知是由美国食品和药物监督管理局批准的处方药物标签，或批准的产品插页。在一些实施方案中，制备了在相容的药物载体中配制的含有本文所提供的结晶形式的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗所指示病症。

组合疗法

本公开文本的结晶形式和药物组合物可与一种或多种通过相同机制或不同机制起作用以治疗疾病的治疗剂组合使用。可以将一种或多种药剂在单独的组合物中或在同一组合物中依序或同时施用。用于组合疗法的有用的药剂种类包括但不限于用于治疗心脏、肾、肺、肝、皮肤、免疫和肿瘤病症的化合物。

在实践任何主题方法时，ALK5抑制剂(例如，本文公开的结晶形式，如多晶型物形式I、多晶型物形式II或多晶型物形式III)和第二治疗剂可依序施用，其中在两个不同的时间点将两种药剂引入受试者。这两个时间点可以间隔超过2小时、1天或更多天、1周或更多周、1个月或更多月，或根据本文公开的任何间歇方案时间表。

在一些实施方案中，将ALK5抑制剂和第二治疗剂同时施用。这两种药剂可以形成同一组合物的一部分，或者这两种药剂可以以一个或多个单位剂量提供。

在一些实施方案中，ALK5抑制剂或第二治疗剂经胃肠外、口服、吸入、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、肌内、脂质体、通过导管或支架局部递送、皮下、脂肪内或鞘内施用。如本文所用，治疗有效量的ALK5抑制剂和第二治疗剂的组合是指ALK5抑制剂和第二治疗剂的组合，其中所述组合足以实现预期应用，包括但不限于本文所定义的疾病治疗。在主题方法中还考虑亚治疗量的ALK5抑制剂和第二治疗剂组合用于治疗预期的疾病状况的用途。虽然以亚治疗量存在，但组合的各组分在预期应用中协同产生有效作用和/或减少副作用。

施用的ALK5抑制剂和第二治疗剂的量可根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度)、施用方式等而变化，这可容易地由本领域普通技术人员确定。

测量ALK5的免疫应答和/或生物效应的抑制可包括对生物样品(如来自受试者的样品)进行测定。可根据测定选择多种样品中的任一种。样品的例子包括但不限于血液样品(例如血浆或血清)、呼出气体冷凝物样品、支气管肺泡灌洗液、痰样品、尿样品和组织样品。

可以监测用ALK5抑制剂和第二治疗剂治疗的受试者以确定治疗的有效性，并且可以基于受试者对治疗的生理反应调整治疗方案。例如，如果ALK5抑制的生物效应的抑制高于或低于阈值，则可分别降低或增加给药量或频率。替代性地，可以根据免疫应答调整治疗方案。所述方法还可以包括如果确定疗法是有效的，则继续疗法。所述方法可包括如果确定疗法有效，则维持、递减、减少或停止疗法中一种或多种化合物的施用量。所述方法可包括如果确定无效，则增加疗法中一种或多种化合物的施用量。替代性地，所述方法可包括如果确定无效，则停止疗法。在一些实施方案中，如果生物效应的抑制高于或低于阈值，如在缺乏应答或不良反应中，则停止使用ALK5抑制剂和第二治疗剂进行治疗。生物效应可以是多种生理指标中的任一种的变化。

可与本文公开的结晶形式组合使用的具体药剂包括但不限于

(尼达尼布)和/>

(吡非尼酮)。在一些实施方案中，本文公开的结晶形式与吡非尼酮组合施用，任选地其中通过吸入施用吡非尼酮。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗受试者中的纤维化如特发性肺纤维化的方法，其包括向所述受试者施用ALK5抑制剂如多晶型物形式I、多晶型物形式II或多晶型物形式III以及尼达尼布或吡非尼酮。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗受试者中的癌症如肺癌的方法，其包括向所述受试者施用ALK5抑制剂如多晶型物形式I、多晶型物形式II或多晶型物形式III以及尼达尼布或吡非尼酮。/>

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者中的增殖性障碍(例如肺癌)的方法，其包括向所述受试者施用ALK5抑制剂和免疫治疗剂。TGF-β已被证明调节淋巴细胞分化、抑制T细胞增殖和增强肿瘤生长。此外，TGF-β已被证明阻止免疫疗法耐药性患者中免疫系统的最佳激活(参见

S.J.Oncolo.2018,1-9；其通过引用以其整体并入本文)。不希望受任何特定理论束缚，诸位发明人预期抑制ALK5可增强特定免疫疗法的功效。因此，预期用免疫治疗剂(如度伐鲁单抗或派姆单抗)和ALK5抑制剂(如本公开文本的结晶形式)治疗改善癌症受试者(如患有非小细胞肺癌的受试者)的临床结局。预期该组合产生协同效应。还预期协同组合用于放射疗法、免疫疗法和ALK5抑制的三重组合。此外，ALK5抑制剂甚至在局部施用(例如通过吸入施用至肺)时也可刺激局部和全身免疫应答，从而允许治疗局部递送部位以外的组织中的原发性或转移性肿瘤。例如，吸入的ALK5抑制剂可以与免疫治疗剂组合施用以治疗黑色素瘤、肾细胞癌、结肠癌或乳腺癌。

在一些实施方案中，将ALK5抑制剂和免疫治疗剂依序或同时施用。在一些实施方案中，ALK5抑制剂和免疫治疗剂在治疗增殖性障碍方面比单独任一种药剂更有效。在一些实施方案中，ALK5抑制剂和免疫治疗剂在治疗增殖性障碍中产生协同效应。协同效应可以是在可比条件下大于以可比量单独使用的任一药剂的治疗效果。协同效应可以是大于通过将每种单独药剂的效果相加所预期的结果的治疗效果。在一些实施方案中，增殖性障碍是癌症病症。在一些实施方案中，癌症病症是肺癌，如非小细胞肺癌。

术语“免疫治疗剂”是指诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的任何药剂。这包括向受试者施用活性剂，或对受试者进行任何类型的干预或过程，目的是改变免疫应答。免疫治疗剂可例如通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制或克服抑制内源性宿主免疫应答的机制来例如增加或增强受试者中现有免疫应答的有效性或功效。

“免疫应答”是指免疫系统细胞(包括例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)以及由这些细胞或肝脏中的任一种产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或自受试者体内消除：侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织。

在一个实施方案中，免疫治疗剂可包括PD-1抑制剂。在另一个实施方案中，免疫治疗剂可以包括CTLA-4抑制剂。在再另一个实施方案中，免疫治疗剂可以包括B7抑制剂。

示例性PD-1抑制剂：适用于主题方法的PD-1抑制剂可选自多种类型的分子。例如，PD-1抑制剂可以是生物或化学化合物，如有机或无机分子、肽、肽模拟物、抗体或抗体的抗原结合片段。适用于主题方法的药剂的一些示例性类别在以下章节中详述。用于本公开文本的PD-1抑制剂可以是本领域已知的任何PD-1抑制剂，并且可以包括在施用于患者后导致患者中PD-1途径被抑制的任何实体。PD-1抑制剂可以通过任何生物化学机制抑制PD-1，包括破坏PD-1/PD-L1、PD1/PD-L2和PD-L1/CD80相互作用中的任何一种或多种。

在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD1和/或CD80。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配偶体是PD1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一些另外的实施方案中，抗PD-1抗体能够抑制PD-1与PD-L1之间的结合。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体能够抑制PD-1与PD-L2之间的结合。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1与PD-1之间和/或PD-L1与CD80之间的结合。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-L2抗体。在一些另外的实施方案中，抗PD-L2抗体能够抑制PD-1与PD-L2之间的结合。在又另一个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗或派姆单抗。在一些实施方案中，PD-1抑制剂选自阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗、度伐鲁单抗和BGB-A317。

抑制PD-1途径可增强患者对癌细胞的免疫应答。PD-1与PD-L1之间的相互作用损害T细胞应答，表现为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的减少和T细胞受体介导的增殖的减少，导致T细胞无能、耗竭或凋亡和癌细胞的免疫逃避。这种免疫抑制可通过使用PD-1抑制剂(包括例如抗PD-1和/或抗PD-L1 Ab)抑制PD-L1与PD-1之间的局部相互作用而逆转。PD-1抑制剂可以改善或恢复抗肿瘤T细胞功能。

适用于本公开文本的抗PD-1抗体可使用本领域熟知的方法产生。示例性PD-1抑制剂包括但不限于：纳武单抗(BMS936558)、派姆单抗(MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、AMP-224、AMP-514、BMS-936559、RG7446(MPDL3280A)、MDX-1106(Medarex Inc.)、MSB0010718C、MEDI4736和HenGrui mAB005(WO 15/085847)。其他PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括WO 04/056875、WO 06/121168、WO 07/005874、WO 08/156712、WO 09/014708、WO 09/114335、WO 09/101611、WO 10/036959、WO 10/089411、WO 10/027827、WO 10/077634、WO11/066342、WO 12/145493、WO 13/019906、WO 13/181452、WO 14/022758、WO 14/100079、WO14/206107、WO 15/036394、WO 15/085847、WO 15/112900、WO 15/112805、WO 15/112800、WO15/109124、WO 15/061668、WO 15/048520、WO 15/044900、WO 15/036927、WO 15/035606；美国公开号2015/0071910；和美国专利号7,488,802；7,521,051；7,595,048；7,722,868；7,794,710；8,008,449；8,354,509；8,383,796；8,652,465；和8,735,553中所述的那些，所有这些通过引用并入本文。一些抗PD-1抗体可从例如ABCAM(AB137132)、BIOLEGEND(EH12.2H7、RMP 1-14)和AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(J105、J116、M1H4)商购获得。

示例性CTLA-4抑制剂：适用于主题方法的CTLA-4抑制剂可选自多种类型的分子。例如，CTLA-4抑制剂可以是生物或化学化合物，如有机或无机分子、肽、肽模拟物、抗体或抗体的抗原结合片段。适用于主题方法的药剂的一些示例性类别在以下章节中详述。用于本公开文本的CTLA-4抑制剂可以是本领域已知的任何CTLA-4抑制剂，并且可以包括在施用于患者后导致患者中CTLA-4途径被抑制的任何实体。CTLA-4抑制剂可以通过任何生物化学机制抑制CTLA-4，包括破坏CTLA-4/CD80和CTLA-4/CD86相互作用中的一种或两种。

在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是抑制CTLA-4与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，CTLA-4配体结合配偶体是CD80和/或CD86。在另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是抑制CD80与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，CD80结合配偶体是CTLA-4。在另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是抑制CD86与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，CD86结合配偶体是CTLA-4。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一些另外的实施方案中，抗CTLA-4抗体能够抑制CTLA-4与CD80之间的结合。在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体能够抑制CTLA-4与CD86之间的结合。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是抗CD80抗体。在一些实施方案中，抗CD80抗体能够抑制CTLA-4与CD80之间的结合。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂是抗CD86抗体。在一些另外的实施方案中，抗CD86抗体能够抑制CTLA-4与CD86之间的结合。在又另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是曲美木单抗或伊匹单抗。

抑制CTLA-4途径可增强患者对癌细胞的免疫应答。CTLA-4与其天然配体CD80和CD86之一之间的相互作用向T细胞递送负调节信号。这种免疫抑制可通过使用CTLA-4抑制剂(包括例如抗CTLA-4Ab，抗CD80 Ab或抗CD86 Ab)抑制CD80或CD86与CTLA-4之间的局部相互作用而逆转。CTLA-4抑制剂可以改善或恢复抗肿瘤T细胞功能。

适用于本公开文本的抗CTLA-4抗体可使用本领域熟知的方法产生。示例性CTLA-4抑制剂包括但不限于曲美木单抗和伊匹单抗(也称为10D1或MDX-010)。其他CTLA-4抗体和其他CTLA-4抑制剂包括WO 98/042752、WO 00/037504、WO 01/014424和WO 04/035607；美国公开号2002/0039581、2002/086014和2005/0201994；美国专利号5,811,097；5,855,887；5,977,318；6,051,227；6,207,156；6,682,736；6,984,720；7,109,003；7,132,281；7,605,238；8,143,379；8,318,916；8,435,516；8,784,815；和8,883,984；欧洲专利号1212422；Hurwitz等人,PNAS 1998,95(17):10067-10071；Camacho等人,J Clin Oncology 2004,22(145):摘要号2505(抗体CP675206)；以及Mokyr,等人,Cancer Research1998,58:5301-5304中所述的那些；其各自通过引用并入本文。

本文还提供了一种包含本公开文本的结晶形式和一种或多种其他治疗剂的药物组合物。治疗剂可以选自上文指定的药剂类别和上文描述的具体药剂的列表。在一些实施方案中，药物组合物适于递送至肺。在一些实施方案中，药物组合物适于吸入或雾化施用。在一些实施方案中，药物组合物是干粉或液体组合物。

此外，在方法方面，本公开文本提供了一种治疗哺乳动物的疾病或障碍的方法，其包括向哺乳动物施用本公开文本的结晶形式和一种或多种其他治疗剂。

当在组合疗法中使用时，可以将药剂配制在单一药物组合物中，或可以将药剂在单独的组合物中提供，所述单独的组合物通过相同或不同的施用途径同时或在单独的时间施用。可以将此类组合物单独包装或可以作为试剂盒包装在一起。试剂盒中的两种或更多种治疗剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。

实施例

出于说明本公开文本的各种实施方案的目的给出以下实施例，而不意味着以任何方式限制本公开文本。本发明的实施例以及本文所述的方法和组合物是目前优选实施方案的代表，是示例性的，并且不旨在限制本公开文本的范围。本领域技术人员将会想到涵盖在由权利要求的范围限定的本公开文本的精神内的其中的变化以及其他用途。

除非另外指明，否则以下缩写具有以下含义，并且本文所用并且未定义的任何其他缩写具有其标准的、普遍接受的含义：

AcOH ＝乙酸

Atm ＝气氛

Boc₂O ＝二碳酸二叔丁酯

BSA ＝牛血清白蛋白，级分V

d ＝天数

DCM ＝二氯甲烷或亚甲基氯

DMF ＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO ＝二甲基亚砜

DTT ＝二硫苏糖醇

EDTA ＝乙二胺四乙酸

EGTA ＝乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸

EtOAc或EA＝乙酸乙酯

g ＝克

h ＝小时

HEPES ＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

KHMDS＝双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾

MeOH＝甲醇

min＝分钟

Pd₂(dba)₃＝三(二亚苄基丙酮)二钯(0)

PE＝石油醚

RT、rt或r.t.＝室温

SEMCl＝2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基氯

SiO₂＝二氧化硅或硅石

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

Tris-HCl＝三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐

Tween-20＝聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯

Xantphos＝4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨

除非另有说明，否则所有材料(如试剂、起始材料和溶剂)均购自商业供应商，如Sigma-Aldrich、Fluka Riedel-de

等，并且未经进一步纯化而使用。

除非另有说明，否则反应在氮气气氛下进行。通过薄层色谱法(TLC)、分析型高效液相色谱法(分析型HPLC)和质谱法监测反应进程，其细节在具体实施例中给出。

反应如各制备中具体描述地进行；通常，通过萃取和其他纯化方法(如依赖于温度和溶剂的结晶和沉淀)来纯化反应混合物。此外，常规地通过制备型HPLC，通常使用Microsorb C18和Microsorb BDS柱填料和常规洗脱剂纯化反应混合物。通常通过液相色谱-质谱法(LCMS)测量反应进程。异构体的表征通常通过核欧沃豪斯效应谱法(NOE)进行。反应产物的表征常规地通过质谱和/或¹H-NMR光谱法进行。对于NMR测量，将样品溶解在氘代溶剂(CD₃OD、CDCl₃或DMSO-d₆)中，并且在标准观察条件下用VarianGemini 2000仪器(400MHz)获得¹H-NMR谱。化合物的质谱测定鉴定通常使用电喷雾电离方法(ESMS)用Applied Biosystems(加利福尼亚州福斯特市)型号API 150EX仪器或Agilent(加利福尼亚州帕洛阿尔托)型号1200LC/MSD仪器进行。

实施例1：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三氟乙酸(I三氟乙酸盐)的合成。

步骤A-1：7-溴-2-甲基-1,5-萘啶(1-2)的合成。在100℃下，将(E)-丁-2-烯醛(30.66g，437mmol)在甲苯(90mL)中的溶液逐滴添加至5-溴吡啶-3-胺(18.0g，104.0mmol)在HCl(1.8L，6M)中的溶液中，并将混合物在100℃下搅拌1h。一次性添加另外量的在甲苯(90mL)中的(E)-丁-2-烯醛(30.66g，437mmol)，并将混合物在100℃下再搅拌4h。真空除去溶剂至干，将残余物的pH用NaHCO₃固体调节至pH 8.0。将该程序重复四次，并将粗产物合并，并通过柱色谱法(PE:EA＝100:1至5:1)纯化，得到呈黄色固体的1-2(71g，95％纯度，15.3％产率)。C₉H₈BrN₂的[M+H]⁺计算值222.99，实测值222.9。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.89(d,J＝1.6Hz,1H),8.46(d,J＝1.6Hz,1H),8.23(d,J＝8.8Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),2.76(s,3H)。

步骤A-2：甲基5-氯-2-氟苯甲酮(1-4)的合成。向5-氯-2-氟苯甲酸1-3(80g，458.3mmol)在MeOH(800mL)中的混合物中逐滴添加SOCl₂(162g，1374.9mmol)。将反应在15℃下搅拌16h，然后在真空中浓缩。然后将浓缩物用H₂O(500mL)稀释并通过添加饱和水性NaHCO₃调节至pH 8。将混合物用EtOAc(3x300mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2x300mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩并通过柱色谱法(PE:EA＝100:1至20:1)纯化，得到呈无色油状物的化合物1-4(80g，95％纯度，93％产率)。C₈H₇ClFO₂的[M+H]⁺计算值189.01，实测值189.0。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.95(dd,J＝6.0,2.8Hz,1H),7.52-7.46(m,1H),7.14(t,J＝5.6Hz,1H),3.96(s,3H)。

步骤A-3：2-(7-溴-1,5-萘啶-2-基)-1-(5-氯-2-氟苯基)乙-1-酮(1-5)的合成。在-78℃将KHMDS(81mL，81.08mmol，1M)逐滴添加到化合物1-2(9g，40.54mmol)和化合物1-4(23g，121.62mmol)在THF(250mL)中的混合物中。然后将混合物在-78℃搅拌1h，然后温热至15℃并再搅拌30min。将混合物用H₂O(400mL)淬灭以形成黄色固体沉淀物。重复该程序一次，并过滤合并的沉淀物。将所得滤饼用H₂O(50mL)洗涤并进一步用PE/EA＝5:1(180mL)滴定，得到呈黄色固体的中间体1-5(27g，95％纯度，88％产率)。C₁₆H₉BrClFN₂O的[M+H]⁺计算值378.96，实测值378.9。

步骤A-4：1-(7-溴-1,5-萘啶-2-基)-2-(5-氯-2-氟苯基)乙烷-1,2-二酮(1-6)的合成。将1-5(10.9g，28.7mmol)和SeO₂(15.9g，144mmol)在二噁烷(200mL)中的溶液在100℃搅拌3.5h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。在真空中浓缩滤液，得到呈黄色固体的1-6(11g，97％产率，82％纯度)。C₁₆H₇BrClFN₂O₂的[M+H]⁺计算值392.95，实测值393.0。

步骤A-5：7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶(1-8)的合成。将1-6(11.0g，22.92mmol)、1,3,5,7-四氮杂金刚烷1-7(9.6g，68.76mmol)和NH₄OAc(10.6g，137.5mmol)在AcOH(100mL)中的溶液加热至95℃。30min后，添加另外的AcOH(100mL)，并将反应混合物搅拌2h。将反应混合物在真空中浓缩并用饱和水性NaHCO₃(300mL)碱化至pH 9。将混合物用EA(3x400mL)萃取。将合并的有机相用盐水(2x400mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到残余物。将残余物通过柱(EA:MeOH＝1:0至10:1)纯化，得到呈黄色固体的1-8(6.0g，55％产率，95％纯度)。C₁₇H₉BrClFN₄的[M+H]⁺计算值402.98，实测值403.1。

步骤A-6：7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶(1-9)的合成。在0℃下向1-8(6.0g，14.86mmol)在DMF(120mL)中的溶液中添加NaH(773mg，19.32mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1h。然后将SEMCl(3.0g，17.83mmol)添加至混合物中。将反应混合物在20℃搅拌2h，然后用H₂O(200mL)稀释并用EA(3x300mL)萃取。将有机层用盐水(2x300mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱(PE:EA＝10:0至3:1)纯化，得到呈黄色固体的1-9(3.3g，42％产率，98％纯度。C₂₃H₂₃BrClFN₄OSi的[M+H]⁺计算值533.06，实测值533.2。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.93(d,J＝2.0Hz,1H),8.49–8.38(m,2H),8.25(s,1H),7.87–7.81(m,1H),7.72–7.62(m,2H),7.42(t,J＝8.9Hz,1H),5.32(s,2H),3.42(t,J＝8.2Hz,2H),0.78(t,J＝8.2Hz,2H),-0.08(s,9H)和¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.08(d,J＝2.2Hz,1H),8.77(dd,J＝2.2,0.9Hz,1H),8.39(dd,J＝8.8,1.0Hz,1H),8.26(s,1H),7.71(dd,J＝6.3,2.8Hz,1H),7.59(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(ddd,J＝8.8,4.2,2.8Hz,1H),7.20(dd,J＝9.9,8.8Hz,1H),5.87(s,2H),3.36–3.29(m,2H),0.60(dd,J＝8.6,7.4Hz,2H),-0.29(s,9H)。

步骤A-7：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三氟乙酸(I三氟乙酸盐)的合成。向1-9(33.30mg，0.062mmol)和(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(27.0mg，0.075mmol)在PhCH₃(0.249mL)中的溶液中添加Pd₂dba₃(1.43mg，1.56μmol)、XantPhos(0.90mg，1.56μmol)和叔丁醇钠(18.0mg，0.187mmol)。将所得混合物用N₂脱气，并加热至100℃保持2h。将反应通过硅藻土塞过滤并在真空中浓缩。将所得残余物溶于TFA(0.50mL)中，并加热至50℃保持1h。将粗产物在真空中浓缩并通过制备型HPLC色谱法，使用在水(含有0.05％三氟乙酸)中的乙腈的梯度(2％至60％)纯化，得到标题TFA盐(33.4mg)。C₂₅H₂₈ClFN₇的[M+H]⁺计算值480.2073，实测值480.2067。¹H NMR(601MHz,甲醇-d₄)δ9.29(s,1H),8.88(d,J＝2.7Hz,1H),8.39(d,J＝8.8Hz,1H),8.02(d,J＝2.7Hz,1H),7.80(dd,J＝6.0,2.7Hz,1H),7.72(ddd,J＝9.0,4.4,2.7Hz,1H),7.55(dd,J＝8.9,0.9Hz,1H),7.42(t,J＝9.1Hz,1H),4.02–3.93(comp m,6H),3.67(t,J＝6.1Hz,2H),3.39(t,J＝13.3Hz,2H),1.46(d,J＝6.5Hz,6H)。

实施例2：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(I)的合成。

步骤B-1：(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2-3)的合成。向2-1(10.00g，18.73mmol)、2-2(8.04g，22.48mmol)和XantPhos(0.434g，0.749mmol)在甲苯(50mL)中的溶液中添加t-BuONa(5.40g，56.2mmol)。将所得混合物转移至Pd₂dba₃(0.686g，0.749mmol)在甲苯(15mL)中的混合物中，同时冲洗(35mL甲苯)。将所得混合物用N₂脱气，并加热至100℃保持12h。将反应物通过硅藻土塞过滤，用1.5体积甲苯冲洗，并将滤液浓缩，得到粗油状物。将粗产物溶解于DCM中，并通过制备型硅胶色谱法，使用在己烷中的EtOAc的梯度(20％至50％)纯化，得到呈油状物的化合物2-3(7.61g，50.1％产率)。

步骤B-2：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(I)的合成。向2-3(23.0g，28.4mmol)在甲苯(100mL)中的溶液中添加5M水性HCl(56.8mL，284mmol)。将所得混合物加热至80℃并搅拌5小时，然后冷却至室温并添加水(50mL)。将甲苯层分离，然后丢弃。将水相用EtOAc(100mL)萃取，并将EtOAc层分离并丢弃。将MeTHF(100mL)添加到水相中，并将所得混合物用5M水性NaOH调节至pH12。将水相用MeTHF(2x)萃取，并将合并的有机层经Na₂SO₄干燥并浓缩以将体积减少至70mL。添加三氟甲苯(200mL)并将总体积蒸馏至115mL。添加新鲜的三氟甲苯(115mL)，并将所得混合物搅拌过夜，得到细浆液。过滤并干燥，得到标题化合物(10.2g，73.5％产率，98.2％纯度)。C₂₅H₂₇ClFN₇的[M+H]⁺计算值480.20，实测值480.2。

实施例3：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐(I·3HCl)的合成。

经35分钟在20℃下在高搅拌下将化合物2-3(11.0g，13.57mmol)在甲苯(89mL)中的溶液添加至12M水性HCl(30.6mL，373mmol)中。1小时后，停止搅拌，并将甲苯层分离并丢弃。然后在20℃下经30分钟将2-丙醇(45.9mL)添加至水溶液中。将I·3HCl的晶种添装至该溶液中，并将混合物搅拌16小时，之后形成稠浆液。经3小时向浆液中添装更多的2-丙醇(107mL)。在20℃下再保持24小时后，将产物过滤并用2-丙醇(24mL)冲洗。将滤饼在真空下在45℃下干燥20小时，得到I·3HCl(5.65g，69％产率，98.2％纯度)。

实施例4：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸(I富马酸盐)的多晶型物形式I的制备。

向I(2.0g，4.17mmol)在2-丙醇(20mL)中的悬浮液中添加富马酸(0.484g，4.17mmol)。将浆液加热至80℃的内部温度并保持2小时。然后添加水(2mL)，并将浆液在80℃下再保持1小时，然后冷却至50℃并保持3天。在该保持之后，将浆液冷却至环境温度，过滤，并将湿滤饼在氮气下干燥。将得到的富马酸盐分离为多晶型物形式I，产率为81％(2g)，HPLC纯度为98.5％。

实施例5：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸(I富马酸盐)的多晶型物形式II的制备。

在氮气覆盖下，在20℃下经30min在搅拌下向化合物I·3HCl(4.0g，6.79mmol)在水(40.0mL)中的溶液中添加2-甲基四氢呋喃(40.0mL)和26％水性NH₄OH(8.0mL，53.4mmol)的混合物。然后将混合物加热至40℃。停止搅拌并使混合物沉降。将底层(含水)分离为废物。向有机层中添装另外的2-甲基四氢呋喃(12.0mL)，并将混合物真空蒸馏至36mL的体积。向该有机溶液中添装0.8g Silicycle siliametS硫醇(1.41mmol/g，40-63μm)。在20℃下搅拌2小时后，通过过滤除去Silicycle siliametS硫醇，并用2-甲基四氢呋喃(4.0mL)正向冲洗。然后将有机滤液真空蒸馏至16mL。然后将该溶液用2-丙醇(48.0mL)稀释并真空蒸馏至16mL，得到浆液。在单独的器皿中，在25℃下，将富马酸(0.867g，7.47mmol)溶解在2-丙醇(64.0mL)和水(4.0mL)的混合物中。经20min将富马酸溶液添加至I游离碱的浆液中。然后将浆液加热至80℃，使得固体完全溶解。在保持内部温度在60℃与85℃之间的同时，将溶液真空蒸馏至40mL。然后将所得浆液在80℃下保持1h，然后经3小时将内部温度升至25℃。在25℃下保持过夜后，将浆液过滤并用2-丙醇(16.0mL)正向冲洗。将I富马酸盐的湿滤饼在烘箱中在40℃下在真空及氮排放下干燥过夜，得到98.2％产率(3.25g)的I富马酸盐的多晶型物形式II，其HPLC纯度为98.2％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.50(d,J＝2.7Hz,1H),8.11(d,J＝8.7Hz,1H),8.00(s,1H),7.72(dd,J＝2.7,6.4Hz,1H),7.48(m,2H),7.22(t,J＝9.1Hz,1H),7.13(d,J＝2.6Hz,1H),6.73(s,2H),3.42(m,4H),3.20(dd,J＝2.9,12.8Hz,2H),2.82(t,J＝6.2,2H),2.16(t,J＝11.8Hz,2H),1.34(d,J＝6.6Hz,6H)。¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ170.0,158.5,151.3,145.9,145.3,143.8,136.7,135.8,134.8,134.4,132.4,131.2,129.9,128.9,127.7,123.0,117.7,117.1,108.4,56.0,55.1,51.7,39.6,15.1.IR：3400(N-H),2450,2359(脂肪族C-H),1607,1450,1354(杂芳族环主链),1491(CH₃δ不对称伸缩),1213(C-F)cm^-1。

实施例6：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸(I富马酸盐)的多晶型物形式II的替代制备。

将I(32.9mg)和富马酸(10.5mg)悬浮在THF(0.5mL)中。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，然后过滤，用THF(2mL)洗涤并在环境条件下干燥数小时，以提供I富马酸盐的多晶型物形式II。

实施例7：6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺(I游离碱)的多晶型物形式III的制备。

在氮气覆盖下，经5min在搅拌下向化合物I·3HCl(10.0g，16.97mmol)在水(200mL)中的溶液中添加2-甲基四氢呋喃(200mL)和26％水性NH₄OH(7.5mL，59.4mmol)的混合物。然后在氮气下将混合物加热至40℃保持10min。停止搅拌并使混合物沉降。将底层(含水)分离为废物。将有机层真空蒸馏至大约70mL的体积。向有机层中添装脱气的异丙醇(200mL)，并将所得混合物真空蒸馏至30mL的体积。添加另外的异丙醇(20mL)，并将所得混合物在40℃脱气3次，然后添加晶种并在40℃搅拌过夜。将所得浆液冷却至室温并在氮气下搅拌3天。将浆液过滤并在氮气下干燥，得到结晶I游离碱(5.5g，67％产率，99％纯度)。

实施例8：X射线粉末衍射分析。

使用配备有Lynxeye 1D检测器的Bruker D8-Advance X射线衍射仪，以输出电压45kV和电流40mA，使用Cu-Kα辐射

获得图1、图5和图9中描绘的X射线粉末衍射图。仪器以布拉格-布伦塔诺(Bragg-Brentano)几何形式操作，其中入射狭缝、发散狭缝和散射狭缝被设定为使样品处的强度最大化。为了测量，将少量粉末(5-25mg)轻轻压在样品架上以形成光滑表面并进行X射线曝光。以θ-2θ模式从2θ为2°至35°以0.02°的步长和每步2秒的扫描速度扫描样品，总共扫描时间为1小时。数据采集由Bruker DiffracSuite测量软件控制并由Jade软件(7.7版)分析。式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的代表性XRPD图分别描绘于图1、图5和图9中。式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的观察到的XRPD 2θ峰位置和d间距分别示于表1、表3和表5中。/>

实施例9：热分析。

使用TA Instruments Model Discovery DSC仪器进行差示扫描量热法(DSC)测量。用TRIOS软件收集数据并使用TA仪器通用分析软件分析。将式I化合物的结晶形式的样品称重到用TZero密封盖覆盖的铝盘中。使用10℃/min的线性加热斜坡将样品从40℃加热至280℃。式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的代表性DSC热图分别显示于图2、图6和图10中。

使用配备有高分辨能力的TA Instruments Model Discovery TGA模块进行热重分析(TGA)测量。使用TA Instruments TRIOS软件收集数据并使用TA仪器通用分析软件分析。将称重的样品置于铂盘上，并以10℃/分钟加热速率从环境温度扫描至300℃。在使用期间用氮气流吹扫天平和炉室。式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的代表性TGA迹线分别显示于图3、图7和图11中。

实施例10：动态吸湿分析。

使用VTI大气微量天平SGA-100系统(VTI Corp.,Hialeah,FL 33016)对式I化合物的结晶形式的称重样品进行动态吸湿(DMS)分析。在2小时的初始干燥步骤(大约0％RH)后，在25℃下以5％ RH/步的扫描速率在5％至90％ RH的湿度范围内等温完成吸附和解吸的两个循环。式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III的代表性DMS迹线分别显示于图4、图8和图12中。

实施例11：微晶电子衍射。

将连续碳网格压于式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I的样品上。轻轻敲击网格以除去多余的样品并在室温下夹持。将网格在设定为40℃的真空烘箱中干燥15分钟，然后储存在液氮中。

使用在200kV下操作的配备有Ceta-D检测器并在低温(低于-170℃)下操作的Thermo Fisher Scientific Glacios低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)进行电子显微镜检查。在平行照射条件下以非常低的剂量收集衍射数据集。在数据收集过程中使用20μm聚光器孔径，从而在样本上产生大约0.6μm直径的光束。使用Leginon软件进行自动数据收集。Leginon通过TEM用户界面记录衍射倾斜序列，其中相机设置为以滚动快门模式以2x2装仓进行连续记录。采集与缓慢倾斜功能同步。

使用程序DIALS(先进光源的衍射积分)对数据集进行索引、精修、积分和缩放。Xia2用于转换文件类型，并且XPREP用于分析可能的空间群。在SHELXD中通过双空间定相进行初始定相。在Olex2的SHELXL中进行了精修，并在PLATON(CheckCIF)中进行了验证。基于由中子散射得到的值，用原子间距离对氢建模。基于理想化的几何形状，也将氢建模为“骑式”，并且不允许针对实验密度自由精修。在表2中提供了晶胞参数和空间群详情。

实施例12：单晶X射线衍射。

将式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II的晶体固定在玻璃纤维上。使用Cu-Kα辐射，在配备有Oxford Cryosystems Cobra冷却装置的Rigaku Atlas CCD衍射仪上收集数据。使用Bruker AXS SHELXTL软件对晶体结构进行解析和精修。将附接到碳原子的氢原子以几何方式放置，并允许用骑式各向同性位移参数精修。使附接到杂原子的氢原子位于差分傅立叶图中，并且允许用各向同性位移参数自由精修。在表4中提供晶胞参数以及晶系和空间群详情。

实施例13：稳定性研究。

将本文公开的结晶形式的样品，如式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I和多晶型物形式II以及式I化合物(游离碱)的多晶型物形式III储存在25℃和60％相对湿度(RH)下或在40℃和75％ RH的加速条件下，然后通过HPLC分析。记录式I化合物和检测到的杂质的相对峰面积。

实施例14：测量pKi的生化ALK5(TGF-βR1)测定。

使用重组人ALK5(TGF-βR1)蛋白(产品号PR9075A或等同物，Life Technologies)和市售激酶测定(

(镧系螯合物激发)Ultra ULight^TM激酶测定，产品号TRF0130-M和TRF02108-M，Perkin Elmer)测定式I化合物的表观pKi值，如下所述。

在384孔板(24列x16孔/行)中进行测定。使用

550液体处理器(Labcyte)在100％ DMSO中制备各种中间浓度的式I化合物。从中间浓度开始制备一系列浓度(10μM至25pM，对应于高达10 5nL的体积)，并将其喷射到最终测定板中以用于产生单独的剂量反应曲线。对于测定板内的单独列，每孔中105nL DMSO用于建立最大测定信号。另外，在另一列孔中使用105nL的100μM SD-208-一种选择性TGF-βR1抑制剂(目录号S7624，SelleckChemicals)，以建立最小测定信号。

使用多道分配器，将8μL酶混合物(1.25x终浓度)添加至每孔中。酶混合物由250pMALK5酶和62.5nM肽底物(

(镧系螯合物激发)Ultra ULight^TM-DNA拓扑异构酶2-α(Thr1342))组成，其在测定缓冲液(50mM HEPES，10mM MgCl₂，1mM EGTA，0.01％Tween-20，pH7.5室温)中制备，在使用前添加2mM DTT。然后将板用粘合密封件密封并使其在室温下平衡60分钟。

接下来，将2μL 125μM ATP(5x终浓度，在含有2mM DTT的测定缓冲液中制备125μMATP)添加至孵育的混合物中，用

环境盖(产品号LLS-0310，Labcyte)覆盖并立即转移至37℃。使反应在37℃下进行60分钟，然后在室温下通过添加在检测混合物(12mMEDTA，在检测缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.5％ BSA(级分V)，pH 7.0)中制备的4nM检测抗体)中的10μL检测抗体(/>

(镧系螯合物激发)超铕抗磷DNA拓扑异构酶2-α(Thr1342))终止反应。然后在Perkin Elmer EnVision读板器上使用铕特异性读取器设置来读取板，其中激发和发射波长分别设定为320nm或340nm和665nm。这些数据用于基于DMSO和SD-208背景对照计算酶抑制百分比值。

对于剂量-反应分析，将抑制百分比对化合物浓度作图，并用GraphPad Prism V5软件(GraphPad Software,Inc.，加利福尼亚州拉荷亚)从4参数稳健拟合模型确定pIC₅₀值。该模型通过将S形剂量-反应(可变斜率)方程拟合至数据获得pIC₅₀值。结果表示为pIC₅₀(IC₅₀的负对数)，随后使用Cheng-Prusoff等式转换为pK_i(解离常数K_i的负对数)。pK_i值越高(K_i值越低)，ALK5活性的抑制越大。当在生化ALK5测定中测试时，式I化合物展现出9.5与10.4之间的pK_i值。

实施例15：细胞ALK5功效测定以在BEAS-2B细胞中测量pIC₅₀，TGF-β刺激的pSMAD3形成的抑制。

在BEAS-2B细胞(人肺上皮细胞系)中测量式I化合物抑制TGF-β刺激的SMAD3磷酸化的效力。临在SMAD3磷酸化之前，TGF-β通过激活素受体样激酶5(ALK5)发信号。当AlphaLISA SureFire Ultra试剂盒(Perkin Elmer)定量测量裂解物中的pSMAD3水平时，该测定证明测试化合物的ALK5细胞效力。

BEAS-2B细胞使用补充有10％胎牛血清(ATCC)、25mM HEPES(Life Technologies)和1xPen-Strep(Life Technologies)的50％ DMEM(Life Technologies)和50％ F-12(Life Technologies)培养基生长。将细胞在设定为37℃、5％ CO₂的加湿培养箱中培养，并使用具有0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的0.25％胰蛋白酶进行胰蛋白酶化。

对于测定，将BEAS-2B细胞以7,500个细胞/孔(25μL/孔)接种在384孔板中并培养过夜。在给药前，吸出生长培养基，并将孔用补充有25mM HEPES(Life Technologies)和1％牛血清白蛋白(Roche)的HBSS缓冲液(具有钙和镁的HBSS，Life Technologies)冲洗。将化合物在DMSO中连续稀释，然后用补充的HBSS缓冲液(50μL/孔)进一步稀释以在0.3％ DMSO下产生3x最终测定浓度的化合物板。然后将稀释的化合物添加至细胞(8μL/孔)并在37℃、5％ CO₂下孵育1小时。在化合物孵育后，将在补充的HBSS缓冲液中重构的TGF-β(R&DSystems)添加至细胞(12μL/孔，终浓度10ng/mL)并再孵育30分钟，之后立即用AlphaLISA裂解缓冲液(PerkinElmer)裂解细胞。以2小时间隔添加AlphaLISA受体和检测珠(PerkinElmer)，然后孵育过夜以在第二天读取。通过分析pSMAD3信号相对于基线(未用化合物处理的经TGF-β刺激的细胞)的剂量依赖性定量变化来确定化合物的效力。数据表示为pIC₅₀(负十进制对数IC₅₀)值。当在BEAS-2B细胞中测试时，式I化合物展现出6.8与7.6之间的pIC₅₀值。

实施例16：通过早熟染色体凝聚测量的细胞毒性[15](pCC₁₅)。

在人肺上皮细胞系Beas2B细胞中测量式I化合物对细胞三磷酸腺苷(ATP)水平的影响。ATP的水平与细胞活力相关并且经常被测量以测定化合物的潜在细胞毒性。使用裂解细胞并产生与ATP存在量成比例的发光信号的CellTiter-Glo来测定测试化合物对细胞活力的影响。

使Beas2B细胞在补充有10％胎牛血清(ATCC)、25mM HEPES(Life Technologies)和1xPen-Strep(Life Technologies)的50％ DMEM(Life Technologies)和50％ F-12(Life Technologies)培养基中生长。将细胞在设定为37℃、5％ CO₂的加湿培养箱中培养，并使用具有0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的0.25％胰蛋白酶进行胰蛋白酶化。

对于测定，将Beas2B细胞以500个细胞/孔(25μL/孔)接种在384孔板中并培养过夜。将化合物在DMSO中连续稀释，然后用生长培养基(40μL/孔)进一步稀释以在0.6％DMSO下产生6x最终测定浓度的化合物板。然后将稀释的化合物添加至细胞(5μL/孔)并在37℃、5％ CO₂下孵育48小时。化合物孵育后，将CellTiter-Glo(Promega)直接添加至细胞(30μL/mL)。将测定板密封并在黑暗环境中以700rpm振荡15分钟，然后以1500rpm离心2分钟以使裂解物沉降在孔底部。通过分析ATP相对于基线(未用化合物处理的细胞)和用60μM AT9283(良好表征的细胞毒性化合物)处理的孔的剂量依赖性定量变化来测定化合物对细胞活力的作用。数据表示为pCC₁₅(负十进制对数CC₁₅)值。当在Beas2B细胞中测试时，式I化合物展现出5.1与5.7之间的pCC₁₅值。

实施例17：体外人肝微粒体固有清除率(HLM Cl_int)。

肝微粒体用于体外测定式I化合物的肝清除率。用补充有2mM NADPH(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)的缓冲至pH 7.4的100mM磷酸钾(BD Biosciences，马萨诸塞州沃本)制备微粒体孵育辅因子溶液。将10mM测试化合物的DMSO原液稀释并掺加到辅因子溶液中以产生0.2μM浓度(0.02％v/v DMSO)。将冷冻的人肝微粒体(Bioreclamation IVT，马里兰州，巴尔的摩)的等分试样解冻并稀释到100mM磷酸钾缓冲液中以产生0.2mg/mL的微粒体蛋白质浓度。将辅因子/药物和微粒体溶液在保持在37℃的水浴中分别预热4分钟。通过将等体积的辅因子/药物溶液与微粒体溶液合并来开始孵育(n＝1)。测试化合物的最终浓度为0.1μM，最终蛋白质浓度为0.1mg/mL，以及最终NADPH浓度为1mM。在时间0、3、8、15、30和45分钟收集样品以监测测试化合物的消失。在每个时间点，取出50μL孵育样品并掺入25μL水+3％甲酸+内标中用于终止反应。然后将样品注射到AB Sciex API 4000三重四极质谱仪上用于通过LC-MS/MS定量。流动相A由含有0.2％甲酸的HPLC级水组成，并且流动相B由含有0.2％甲酸的HPLC级乙腈组成，所有样品通过Thermo HyPURITY C18 50x2.1mm柱(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。HLM Cl_int数据以μL/min/mg单位报告。参见Riley,R.J.,等人,DrugMetab.Dispos.,2005,9月,33(9),第1304-1311页。式I化合物展现出大于250μL/min/mg的HLM Cl_int。

实施例18：肺PK/PD。

生命期部分(In-Life Portion)

使C57bl/6n小鼠在使用前适应至少3天。在实验当天，将动物分组成5个样本量(TGF-β刺激组n＝10)。式I化合物(在PBS中的3％甘油中配制；pH＝4)经口服吸入(OA；通过捂住鼻子使动物被迫将溶液吸入肺部)进行预治疗。使用50μL给药体积进行所有口服吸入，并伴有适当的媒介物对照组。在化合物OA治疗后，将动物返回到它们的饲养笼中并监测。化合物预治疗在收获前4小时进行，用于筛选和剂量-反应研究；持续时间研究具有可变的化合物预治疗时间。在收获前一小时，用PBS媒介物或重组人TGF-β1蛋白(0.01μg/动物，溶解于1份4mM HCl和2份在PBS中的3％甘油中)经由第二次口服吸入来激发动物。在收获前五分钟，将动物在异氟烷下深度麻醉，并通过颈椎脱位实施安乐死。在收获期间收集支气管肺泡灌洗液(BALF)、血浆和左肺叶。

样品收集和处理

通过开放式心脏穿刺收集血浆。全血收集后，将样品置于EDTA包被的管中以防止凝结。将血液样品在4℃下以15300xg离心4分钟以分离血浆。立即分离血浆，冷冻并提交用于生物分析(BA)。

为了收集BALF，通过气管用0.7mL PBS冲洗肺部3次。将几乎完全由组织来源的巨噬细胞组成的BALF立即以700xg离心15分钟。离心后，除去上清液，将BALF重悬浮于1X细胞裂解缓冲液中，并立即冷冻。在BA提交之前，将BALF解冻并在冷水上超声处理30分钟以裂解打开细胞。

收集BALF后立即收获左肺叶。将肺样品在500μL的1x细胞裂解缓冲液中均化。均化后，将样品分开：将一半样品立即置于旋转肉架上10分钟，而另一半立即冷冻用于BA分析。然后将置于旋转肉架上的样品以10,000xg离心10分钟，以将上清液中的蛋白质与沉淀的碎片分离。收集上清液后，进行总蛋白定量测定(Bradford)以归一化所有样品的浓度。使用Hamilton star液体处理系统，将每个样品在1x细胞裂解缓冲液中稀释至2mg/mL蛋白质。将样品储存在-80℃或立即使用Meso-scale Discovery系统处理。

使用Meso-scale Discovery定量磷酸化SMAD3(pSMAD3)和总SMAD3(tSMAD3)

Meso-scale Discovery(MSD)是一种电化学蛋白质定量测定，其需要在底部附接碳电极的专用微孔板。这些碳电极允许生物试剂更多地附接到微孔板，因此当与传统的ELISA相比时允许更灵敏的读出。与标准夹心ELISA相似，MSD需要使用与样品中一种或多种靶蛋白结合的包被抗体。样品孵育后，使用一抗结合目的表位。添加一抗后，使用具有SULO-TAG检测的二抗，以允许定量目的表位。最后，通过使SULFO-TAG发光的电脉冲读取微孔板，其用作测定的最终读出。

将包被抗体(SMAD3，克隆＝5G-11)在专用MSD微孔板中在4℃下孵育过夜。第二天，将微孔板在3％ BSA(牛血清白蛋白)中封闭70分钟以防止非特异性蛋白质结合到微孔板的底部。在洗涤步骤后，将50μg肺样品加载到MSD板中并在室温下孵育2小时。将板再次洗涤以除去未结合的样品；将磷酸化SMAD3(pSMAD3；克隆＝EP568Y)或总SMAD3(tSMAD3)一抗孵育1小时。洗涤步骤后，将抗兔SULFO标记检测抗体孵育50分钟。在最后的洗涤步骤之后，将MSD读取缓冲液添加至每个样品中。使用MSD特异性读板器(Sector S 600)进行pSMAD3和tSMAD3定量。

数据分析

立即使用异常值分析(Grubbs检验，α＝0.05)分析样品。除去异常值后，将原始pSMAD3除以tSMAD3发光读数。在筛选和剂量-反应研究中，将pSMAD3/tSMAD3比率相对于TGF-β诱导组(设定为100％)归一化，以使刺激之间的可变性最小化。首先，用学生t检验将3％甘油/PBS组与3％甘油/TGF-β进行比较(截止值：p＝0.05)，以确保存在pSMAD3窗口。使用单向ANOVA(fisher的未校正LSD)将所有药物治疗组与3％甘油/TGF-β组比较，以确定是否观察到统计学显著差异。使用媒介物pSMAD3作为基线值计算pSMAD3抑制百分比，并显示为最终读出。用4参数非线性回归算法拟合剂量-反应曲线；将最小反应设定为0％pSMAD3抑制，并将最大反应设定为100％pSMAD3抑制。从回归获得化合物效力并报告为ID50。

PK研究

定量血浆、肺和巨噬细胞药物浓度。相对于BALF中回收的总药物，将总巨噬细胞浓度归一化为总巨噬细胞体积。用于计算的肺泡巨噬细胞体积基于Krombach等人的出版物(Environmental Health Perspectives,1997年9月,第105卷,增刊5,第1261-1263页)，其估计大鼠肺泡巨噬细胞体积为大约1200μm³或1.2e^-9mL。假设小鼠肺泡巨噬细胞体积与大鼠相似。归一化的回收总巨噬细胞浓度＝(从BALF回收的总药物)/(总细胞计数*1.2e^-9mL)。式I化合物展现出(肺AUC_0-t):(血浆AUC_0-t)比率大于75。

实施例19：心脏PK/PD。

生命期部分

使C57bl/6n小鼠在使用前适应至少3天。在实验当天，将动物分组成5-10个样本量。测试化合物经口服吸入(OA；通过捂住鼻子使动物被迫将溶液吸入肺部)进行预治疗。使用50μL给药体积进行所有口服吸入，并伴有媒介物对照组(PBS中的3％甘油，pH＝4)。在化合物OA治疗后，将动物返回到它们的饲养笼中并监测。化合物预治疗在收获前2或4小时进行。在收获前一小时，用PBS媒介物或重组人TGF-β1蛋白(1μg/动物，溶解于1份4mM HCl和2份在PBS中的3％甘油中)经由尾静脉注射来激发动物。在收获前五分钟，将动物在异氟烷下深度麻醉，并通过颈椎脱位实施安乐死。在收获期间收集血浆、左肺叶和整个心脏。

样品收集和处理

如上所述在肺PK/PD实验中收获血浆。以与肺PK/PD实验中左肺叶相同的方式处理整个心脏。将左肺叶在500μL水中均化并提交用于BA分析。

使用Meso-scale Discovery定量磷酸化SMAD3(pSMAD3)和总SMAD3(tSMAD3)

使用MSD以与上述左肺叶相同的方式处理心脏样品。以与肺PK/PD实验相同的方式进行数据分析。定量血浆、肺和心脏药物浓度。如通过SMAD3磷酸化抑制所测量的，在用式I化合物治疗后全身存在最小靶标接合。

实施例20：在同基因癌症模型中的功效研究。

当单独施用或与免疫治疗剂组合施用时，预期式I化合物在同基因癌症模型中抑制肿瘤生长。根据IACUC指南，6-8周龄BALB/c小鼠用于体内功效研究。将可商购的4T1细胞(0.5-2.0x10⁴个细胞/小鼠)皮下植入BALB/c小鼠的右侧腹中。当肿瘤达到直径大约8-10mm的可触及大小时，手术去除原发性肿瘤，并将小鼠随机分配到媒介物对照或化合物治疗组。替代性地，将CT26细胞(0.5-2.0x10⁴个细胞/小鼠)静脉内注射到BALB/c小鼠中以产生癌症模型。手术后两天或注射CT26细胞后7天，用(1)媒介物对照，(2)通过口服吸入或鼻内以适当量和频率给予的式I化合物(在PBS中的3％甘油中配制；pH＝4)，(3)以适当量和频率给予的免疫治疗剂(例如派姆单抗或度伐鲁单抗)，或(4)各自以适当量和频率给予的式I化合物和免疫治疗剂治疗小鼠。

体重每周测量两次。治疗2至4周后，收获每只动物的肺和肝，并使用克隆发生转移测定法测定每个组织样品中的转移细胞数。可对细胞进一步进行FACS分析、T细胞功能测定和RNA提取中的一种或多种。预期用式I化合物治疗的动物组展现出肺肿瘤负荷的减少。ALK5抑制剂对免疫应答的激活可刺激局部和全身抗肿瘤T细胞激活，因此也可观察到肝肿瘤负荷的减少。相对于在用单独的任一单一药剂治疗的动物中观察到的肿瘤负荷的减少，预期式I化合物当与免疫治疗剂组合施用时会增加肺肿瘤负荷的减少。预期式I化合物与免疫治疗剂协同地相互作用以抑制肿瘤生长并增加存活。

实施例21：在鼠DSS诱导的肠纤维化模型中的预防性研究。

预期式I化合物在鼠结肠炎模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。将6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠标记并称重。用2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)处理动物的饮用水7天以诱导急性结肠炎，然后用正常饮用水处理2天。然后完成三个3周循环的2.5％ DSS处理(1周在水中的2.5％ DSS；2周正常水)以诱导肠纤维化。

在DSS施用的第一天开始，通过口服管饲法(例如，每天一次)用媒介物对照或式I化合物以适当的量和频率治疗小鼠。在第一次DSS施用后9周处死动物，然后收获结肠的远端、中间和近端切片用于组织学分析、RNA提取和细胞因子测量。预期式I化合物降低结肠中的ALK5活性并减缓或预防肠纤维化，如通过以下中的一项或多项所证明：相对于媒介物治疗的对照，(1)结肠重量与结肠长度的比率降低；(2)组织学观察到的细胞外基质沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(Col1a1)和结缔组织生长因子(Ctgf)表达降低；和(4)结肠中TGF-β1和IL6的产生减少。

实施例22：鼠DSS诱导的肠纤维化模型中的功效研究。

预期式I化合物在鼠结肠炎模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。将6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠标记并称重。用2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)处理动物的饮用水7天以诱导急性结肠炎，然后用正常饮用水处理2天。然后完成三个3周循环的2.5％ DSS处理(1周在水中的2.5％ DSS；2周正常水)以诱导肠纤维化。

在DSS施用的3个循环中的第二个之后，通过口服管饲法(例如，每天一次)用媒介物对照或式I化合物以适当的量和频率治疗小鼠。在第一个DSS循环后6、9或12周处死动物，然后收获结肠的远端、中间和近端切片用于组织学分析、RNA提取和细胞因子测量。预期式I化合物降低结肠中的ALK5活性并减缓、停止或逆转肠纤维化，如通过以下中的一项或多项所证明：相对于媒介物治疗的对照，(1)结肠重量与结肠长度的比率降低；(2)组织学观察到的细胞外基质沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(Col1a1)和结缔组织生长因子(Ctgf)表达降低；和(4)结肠中TGF-β1和IL6的产生减少。

实施例23：结肠炎的过继性T细胞转移模型中的功效研究。

预期式I化合物在结肠炎的过继性T细胞转移模型中减缓、停止或逆转肠纤维化的进展。将6-8周龄雌性CB17 SCID小鼠标记并称重，然后施用从Balb/C小鼠脾脏分离的CD4⁺CD25^-CD62L⁺幼稚T细胞(IP；1x10⁶个细胞)以诱导结肠炎。

一旦观察到腹泻和体重下降10％或更大(通常在第2周左右)，则通过口服管饲法(例如，每天一次)用媒介物对照或式I化合物以适当的量和频率治疗小鼠。在诱导结肠炎后45天处死动物，然后收获结肠的远端、中间和近端切片用于组织学分析、RNA提取和细胞因子测量。预期式I化合物降低结肠中的ALK5活性并减缓、停止或逆转肠纤维化，如通过以下中的一项或多项所证明：相对于媒介物治疗的对照，(1)结肠重量与结肠长度的比率降低；(2)组织学观察到的细胞外基质沉积减少；(3)结肠组织中胶原1(Col1a1)和结缔组织生长因子(Ctgf)表达降低；和(4)结肠中TGF-β1和IL6的产生减少。

实施例24：在重度肺动脉高压的野百合碱模型中的功效研究。

预期式I化合物在重度肺动脉高压的野百合碱(MCT)模型中减缓、停止或逆转肺动脉高压的进展。将雄性Sprague-Dawley大鼠标记、称重并随机分为对照组和MCT治疗组。MCT治疗组中的大鼠被施用单剂量的MCT(60mg/kg，s.c.)，然后用(1)媒介物对照；(2)西地那非(30mg/kg，p.o.，b.i.d.)；或(3)以适当量和频率给予的式I化合物(配制在PBS中的3％甘油中；pH＝4)通过口服吸入来治疗。

治疗2周后，将动物用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，以最终监测肺和全身动脉压以及心率。然后收获每只动物的肺用于组织学分析。预期式I化合物降低肺中ALK5活性并减缓、停止或逆转肺动脉高压的进展，如通过以下中的一项或多项所证明的：(1)收缩肺动脉压降低；(2)右心室(RV)收缩压降低；(3)RV舒张压降低；(4)心输出量增加；(5)RV肥大减少；(6)血管和/或肺泡细胞内pSmad2或pSmad3染色减少；(7)中膜厚度减小；(8)血管平滑肌细胞增殖减少；(9)血管平滑肌肥大减少；和(10)基质金属蛋白酶(MMP)-2和/或MMP-9的表达降低。

Claims (87)

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的结晶形式：

2.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述式I化合物是富马酸盐。

3.根据权利要求1或2所述的结晶形式，其中所述结晶形式是式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式I。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在13.2±0.2、14.9±0.2和22.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

5.根据权利要求4所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自6.5±0.2、8.9±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰。

6.根据权利要求4所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含在6.5±0.2、8.9±0.2和17.5±0.2度2θ处的峰。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自9.5±0.2、10.1±0.2、18.5±0.2和19.5±0.2度2θ的至少一个峰。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在8.9±0.2、9.5±0.2和10.1±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

9.根据权利要求8所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自6.5±0.2、13.2±0.2和17.5±0.2度2θ的至少一个峰。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中所述峰位置基本上与图1中所示图的峰位置一致。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在260℃与266℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过在约263.0℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过基本上与图2中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过具有P2₁/n空间群的微晶电子衍射表征。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的结晶形式，其中单晶包括晶胞尺寸：

α＝90±0.1°；β＝94.3±0.1°；和γ＝90±0.1°。

16.根据权利要求1或2所述的结晶形式，其中所述结晶形式是式I化合物的富马酸盐的多晶型物形式II。

17.根据权利要求1、2或16所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在5.6±0.2、11.2±0.2和15.5±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

18.根据权利要求17所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自18.8±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ的至少一个峰。

19.根据权利要求17所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含在18.8±0.2、20.6±0.2和22.9±0.2度2θ处的峰。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自15.1±0.2、22.1±0.2和24.8±0.2度2θ的至少一个峰。

21.根据权利要求1、2或16所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在11.2±0.2、15.1±0.2和24.8±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

22.根据权利要求21所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自5.6±0.2、18.8±0.2和22.1±0.2度2θ的至少一个峰。

23.根据权利要求1、2和16至22中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中所述峰位置基本上与图5中所示图的峰位置一致。

24.根据权利要求1、2和16至23中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在259℃与267℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

25.根据权利要求1、2和16至24中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过在约263.2℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

26.根据权利要求1、2和16至25中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过基本上与图6中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

27.根据权利要求1、2和16至26中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过具有P-1空间群的单晶X射线衍射表征。

28.根据权利要求1、2和16至27中任一项所述的结晶形式，其中单晶包括晶胞尺寸：

α＝75.5±0.1°；β＝87.3±0.1°；和γ＝73.8±0.1°。

29.根据权利要求1所述的结晶形式，其中所述式I化合物为游离碱形式。

30.根据权利要求1或29所述的结晶形式，其中所述结晶形式是式I化合物的多晶型物形式III。

31.根据权利要求1、29或30所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在10.5±0.2、15.8±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

32.根据权利要求31所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自7.5±0.2、19.9±0.2和20.9±0.2度2θ的至少一个峰。

33.根据权利要求31所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含在7.5±0.2、19.9±0.2和20.9±0.2度2θ处的峰。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自9.0±0.2、13.2±0.2、16.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰。

35.根据权利要求1、29或30所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在19.9±0.2、20.9±0.2和25.2±0.2度2θ处的峰的X射线粉末衍射图表征。

36.根据权利要求35所述的结晶形式，其中所述X射线粉末衍射图还包含选自13.2±0.2、15.8±0.2和25.8±0.2度2θ的至少一个峰。

37.根据权利要求1和29至36中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过X射线粉末衍射图表征，其中所述峰位置基本上与图9中所示图的峰位置一致。

38.根据权利要求1和29至37中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过包含在221℃与229℃之间温度处的吸热的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

39.根据权利要求1和29至38中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过在约224.8℃±3℃的温度处显示吸热热流率最大值的以10℃/分钟加热速率记录的差示扫描量热法热图表征。

40.根据权利要求1和29至39中任一项所述的结晶形式，其中所述结晶形式通过基本上与图10中所示的一致的差示扫描量热法热图表征。

41.一种组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的结晶形式。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式I。

43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物的富马酸盐为多晶型物形式II。

44.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物为多晶型物形式III。

45.根据权利要求41所述的组合物，其中所述组合物中按重量计大于约90％、95％或99％的式I化合物为单一构象多晶型物。

46.根据权利要求41至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物可以在约40℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。

47.根据权利要求41至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物可以在约60℃和75％相对湿度下储存至少30天而没有显著的结晶形式的降解或变化。

48.根据权利要求41至47中任一项所述的组合物，其中所述结晶形式是无水的、轻微吸湿性的或两者。

49.一种式I化合物的富马酸盐：

50.一种富马酸盐，其为6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸。

51.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至40中任一项所述的结晶形式、根据权利要求41至48中任一项所述的组合物或根据权利要求49或50所述的富马酸盐以及药学上可接受的载体。

52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于吸入。

53.一种抑制ALK5的方法，其包括使ALK5与有效量的根据权利要求1至40中任一项所述的结晶形式、根据权利要求41至48中任一项所述的组合物或根据权利要求49或50所述的富马酸盐接触。

54.一种治疗受试者中ALK5介导的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至40中任一项所述的结晶形式、根据权利要求41至48中任一项所述的组合物或根据权利要求49或50所述的富马酸盐。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病或病症选自纤维化、脱发和癌症。

56.根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病或病症是纤维化。

57.一种治疗纤维化的方法，其包括向患者施用治疗有效量的根据权利要求1至40中任一项所述的结晶形式、根据权利要求41至48中任一项所述的组合物或根据权利要求49或50所述的富马酸盐。

58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述纤维化选自系统性硬化病、肾源性系统性纤维化、器官特异性纤维化、与癌症相关的纤维化、囊性纤维化和与自身免疫病相关的纤维化。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述器官特异性纤维化选自心脏纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、门静脉纤维化、皮肤纤维化、膀胱纤维化、肠纤维化、腹膜纤维化、骨髓纤维化、口腔粘膜下纤维化和视网膜纤维化。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述肺纤维化选自特发性肺纤维化(IPF)、家族性肺纤维化(FPF)、间质性肺纤维化、与哮喘相关的纤维化、与慢性阻塞性肺病(COPD)相关的纤维化、二氧化硅诱导的纤维化、石棉诱导的纤维化和化疗诱导的肺纤维化。

61.根据权利要求59所述的方法，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述肺纤维化由病毒感染诱导。

63.根据权利要求59所述的方法，其中所述器官特异性纤维化是肠纤维化。

64.根据权利要求54所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤和胰腺癌。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

67.根据权利要求53至66中任一项所述的方法，其包括施用第二治疗剂。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述第二治疗剂是免疫治疗剂。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述免疫治疗剂是PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自派姆单抗和度伐鲁单抗。

71.根据权利要求53至70中任一项所述的方法，其还包括施用有效量的辐射。

72.根据权利要求53至71中任一项所述的方法，其中通过吸入施用所述结晶形式或组合物。

73.一种制备式I化合物的方法：

所述方法包括：

(a)使式1a化合物：

与式1b化合物：

偶联，以提供式1c化合物：

以及

(b)将式1c化合物脱保护以提供式I化合物，其中：R¹是PG¹且R²不存在，或R¹不存在且R²是PG¹；并且PG¹、PG²和PG³各自独立地是氢或保护基，其中PG¹、PG²和PG³中的至少一个是保护基。

74.根据权利要求73所述的方法，其中PG¹、PG²和PG³各自独立地是氢或选自以下的保护基：苄氧羰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(Moz)、叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、甲苯磺酰基(Ts)、四氢吡喃(THP)、氯甲酸三氯乙酯(Troc)和三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(SEM)。

75.根据权利要求74所述的方法，其中PG¹、PG²和PG³各自独立地选自Boc和SEM。

76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述偶联包含钯催化剂。

77.根据权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述式1a化合物是7-溴-2-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶或7-溴-2-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶。

78.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述式1b化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。

79.根据权利要求73至78中任一项所述的方法，其中所述式1c化合物是(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(4-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-5-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯或(2S,6R)-4-(2-((叔丁氧基羰基)(6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-4-基)-1,5-萘啶-3-基)氨基)乙基)-2,6-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。

80.一种制备根据权利要求1至40中任一项所述的结晶形式的方法，所述方法包括：

(a)将所述式I化合物、溶剂和富马酸合并，从而形成混合物；

(b)搅拌所述混合物；以及

(c)从所述混合物中分离所述结晶富马酸盐。

81.根据权利要求80所述的方法，其中将所述混合物任选地加热至约80℃。

82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述溶剂选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、2-丙醇、异丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1,4-二噁烷、乙酸异丙酯、甲苯、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷、四氢呋喃、水及其组合。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述溶剂选自2-丙醇、水及其组合。

84.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中，在(a)之前，所述方法还包括：

(a-1)将所述式I化合物的三盐酸盐溶解在水中，从而形成盐溶液；

(a-2)向所述盐溶液中添加碱和溶剂的混合物，从而形成包含水相和有机相的双相混合物，其中所述有机相包含所述式I化合物；以及

(a-3)从所述双相混合物中除去所述水相。

85.一种从6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。

86.一种根据权利要求80至84中任一项所述的方法制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺富马酸的结晶形式。

87.一种从6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺三盐酸盐制备的6-(5-(5-氯-2-氟苯基)-1H-咪唑-4-基)-N-(2-((3S,5R)-3,5-二甲基哌嗪-1-基)乙基)-1,5-萘啶-3-胺游离碱的结晶形式。

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