BG105722A - Човешки моноклонални антитела за ctla-4 - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до изцяло човешки моноклонални антитела срещу човешки цитотоксичен Т-лимфоцитен антиген 4 (СТLA-4). Създадени са нуклеотидни последователности, кодиращи и аминокиселинни последователности, които включват молекули на тежката илеката верига на имуноглобулина, по-специално съседни последователности на леки и тежки вериги, заемащи комплементарните детерминантни области (CDRs), по-специално от вътрешността на FR1 и/или CDR3, и/или FR4. Изобретението се отнася и до антитела, имащи подобни свойства на свързване, и до антителаили други антагонисти с подобна функционалност.

Description

! Отпратка към свързани заявки

Настоящата заявка претендира за приоритет на U.S. С Осигуряванеа! Patent Application, регистров No. 60/113,647, подадена на 23 декември 1998, чието съдържание е включено в настоящето в цялост.

Съдържание на изобретението

Съгласно настоящето изобретение се предоставят напълно човешки моноклонални антитела срещу човешки цитотоксичен Тлимфоцитен антиген 4 (CTLA-4). Предоставят се нуклеотидни последователности кодиращи и аминокиселинни последователности включващи молекули на тежката и леката верига на имуноглобулина, по-специално съседни последователности на

• · · · · · · w · ♦ • •е · · · · · ···· ·· ·· · ·· леки и тежки вериги, заемащи комплеменарните детерминантни областит (CDRs), специфично от вътрешноста на FR1 и/или CDR3 и/или FR4. Предоставят се също така антитела, притежаващи подобни свойства на свързване и антитела (или други антагонисти), притежаващи подобна функционалност, както описаните в настоящето антитела.

Предшестващо състояние на техниката

Регулирането на имунния отговор при пациенти би ® предоставил подходящо лечение на много човешки заболявания, което би довело до специфичност на действието, което рядко се открива при използуването на конвенционални лекарствени средства. И двете, ир-регулирането, както и down-регулирането на отговорите на имунната система биха били възможни. Ролята на Ткпетките и на В-клетките е била широко изучавана и охарактеризирана във връзка с регулирането на имунния отговор. Според тези изследвания се оказва, че ролята на Т-клетките е много важна в многобройни случаи, като е изключително важна при предпазване от заболявания и лечение.

© Т-клетките притежават изключително сложни системи за контролиране на тяхните взаимодействия. Взаимодействията между Т-клетките използуват многобройни рецептори и резтворими фактори за процеса. Следователно, действието, което ще има един определен сигнал върху имунния отговор, най-общо, варира и зависи от определените фактори, рецептори и counterрецептори, които взимат участие в биосинтетичния път. Биосинтетичните пътища за down-регулиращите отговори са също толкова важни, колкото тези, които са необходими за активирането. Тимусното извличане, водещо до Т-кпетъчна ··· ♦ · · ··· ···· ·· ·· · ·· ··· толерантност е един от механизмите за предотвратяване на един имунен отговор към определен антиген. Известни са също други механизми, като секреция на супресивни (подтискащи) цитокини.

Активирането на Т-клетки се нуждае не единствено от стимулиране чрез антигенния рецептор (Т клетъчен рецептор (TCR)), но и допълнително сигнализиране чрез ко-стимулиращи повърхностни молекули, като CD28. Лигандите за CD28 са В7-1 (CD80) и В7-2 (CD88) протеини, които се експресират върху клетки представящи антигени, като дендритни клетки, активирани В® клетки или моноцити, които взаимодействат с Т-клетъчен CD28 или CTLA за предоставяне на костимулиращ сигнал. Ролята на костимулиращотоя сигнализиране се изучава при експериментален алергичен енцефаломиелит (ЕАЕ) от Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995). ЕАЕ представлява автоимунно нарушение, индуцирано от Thl клетки, насочени срещу антигените на миелина, което предоставя един in vivo модел за изучаване ролята на В7медиираното костимулиране при индуциране на патогенен имунен отговор. При използуване на лиганд от разтворим слят протеин за В7 рецептори, както и за моноклонални антитела, специфични за © CD80 или за CD86, Perrin et al. показват, че В7 костимулирането играе важна роля при клиничното определяне на резултата от болестта чрез ЕАЕ.

Взаимодействието между В7 и CD28 е един от многобройните биосентетични пътища за костимулиращо сигнализиране, който е достатъчен да даде тлъсък на съзряването и пролиферацията на антиген-специфичните Т-клетки. Липсата на костимулиране и съпътстващата инадекватност на IL-2 продуцирането, предпазва от последваща пролифепация на Т клетки и индуцира състояние на нереактивност, наречено anergy

ФФ ·· • · · ф	·· ·ΦΦΦ ф ф ф	.•4	ф ф ф
ф ф ф фффф ··	ф ф ф фф ф	ф ф фф	ф ф ффф

(анергия). Голямо разнообразие от вируси и тумори могат да блокират Т клетъчното активиране и пролиферация, което води до недостатъчна активност или нереактивност на имунната система на гостоприемника към инфектираните или трансформирани клетки. Измежду голям брой възможни Т-клетъчни нарушения, анергията може да бъде поне частично отговорна за неуспеха на гостоприемника да прочисти патогенните или туморните клетки.

Използуването на В7 протеин за медииране на антитуморен-имунитет е описано в Chen et al. Cell 71:1093-1102 ® (1992), a Townsend и Allison Science 259:368 (1993). Schwartz Cell

71:1065 (1992) разглеждат ролята на CD28, CTLA-4, и B7 при продуцирането на IL-З и имунотерапията. Harding et al. Nature 356:607-609 (1994) показват, че CD28 медиираното подаване на сигнали костимулира миши Т клетки и предпазва от индуциране на анергия в Т клетъчни клонове. Виж също U.S. Patent Nos. 5434131, 5770197, и 5773253, и International Patent Application Nos. WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217, и WO 95/33770.

От горепосоченото става ясно, че Т-клетките се нуждаят от С два типа сигнали от клетка представяща антигена (АРС) за активиране и последващо диференцииране на ефекторната функция. Първо се генерира антиген-специфичен сигнал чрез взаимодействието между TCR върху Т-клетката и МНС молекули, представящи пептиди върху АРС. На второ място има един антиген-независим сигнал, който се медиира от взаимодействието на CD28 с членове на В7 семейството (В7-1 (CD80) или В7-2 (CD86)). Точно къде CTLA-4 попада в средата на имунните отговори първоначално бе неясно. Миши CTLA-4 първи се идентифицират и клонират от Brunet et al. Nature ·· ····

328:267-270 (1987), като част от дирене на молекули, които за предпочитане се експресират върху цитотоксични Т лимфоцити. След това човешки CTLA-4 се идентифицира и клонира бързо от Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988). Мишите и човешките CTLA4 молекули притежават приблизително 76% хомоложнжст на пълната последователност и подходът допълва идентичността на последователностите в тяхните цитоплазматични домени (Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)). CTLA-4 е член на имуноглобулиновото (Ig) © свръхсемейство на протеините. Ig свръхсемейството представлява група протеини, които споделят ключови структурни характеристики или на вариабилен (V) или на константен (С) домен на Ig молекули. Членовете на Ig свръхсемейството включват, но без да се ограничават до, самите имуноглобулини, главният комплекс за хистосъвместимост (МНС) клас молекули (т.е., МНС клас I и II), и TCR молекули.

През 1991, Linsley et al. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991), предположиха, че CTLA-4 е втория рецептор за B7. Подобно, © Harper et al. J Immunol 147:1037-44 (1991) показаха, че CTLA-4 и

CD28 молекулите са близко свързани, както за мишките, така и за хората, по отношение на последователности, експресия на информацията, генна структура и хромозомално разположение. Виж също Balzano et al. Int J Cancer Suppl 7:28-32 (1992). Друго доказателство за тази роля се поднася от функционалните изслезвания. Например, Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992) показва, че CTLA4-lg индуцира дълготрайна преживяемост на присадки на панкреасни островчета. Freeman et al. Snience 262:907-909 (1993) разглеждат ролята на CTLA- 4 в

·· ·· • · · ·	·· • ·	···· •	.•6	• ·
• · ·	• ·	•	• ·
·««· ··	··	•	• ·	···

мишка с недостатъчност на В7. Разглеждането на лигандите за CTLA-4 се описва от Lenschow et al. P.N.A.S. 90:11054-11058 (1993). Linsley et al. Science 257:792-795 (1992) описва имуносупресия in vivo от разтворима форма на CTLA-4. Linsley et al- J Exp Med 176:1595-604 (1992) изготвят антитела, които свързват CTLA-4 и които не влизат в кръстосана реакция с CD28 като стигат до извода, че CTLA4 се експресира съвместно с CD28 върху активирани Т лимфоцити и съвместно регулира Т клетъчната адхезия и активиране от В7. Kuchroo et al. Cell 80:707-18 (1995) показва,че В7-1 и В7-2 костимулиращи молекули диференциирано активират Th1/Th2 синтетичния път на развитие. Yi-qun et al. Int immunol 8:37-44 (1996) показват, че има изисквания за диференциация за костимулиращите сигнали от членовете на В7 семейството чрез подложка спрямо наскоро активираните Т клетки по отношение на разтворими recall антигени. Виж също de Beer et al. Eur J Immunol 23:3120-5 (1993).

Някои групи предлагат алтернативно или разграничаващо рецептор/лиганд взаимодействие за CTLA4, в сравнение с CD28 и даже предлагат трети В-7 комплекс, който се разпознава от ВВ1 антитяло. Виж например, Hathcock et al., Science 262:905-7 (1993), Freeman et al. Science 262:907-9 (1993), Freeman et al. J Exp Med 178:2185-92 (1993). Lenschow et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11054-8 (1993), Razi-Wolf et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11182-6 (1993), и Boussiotis et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11059-63 (1993). Ho виж също Freeman et al. J Immunol 161:2708-15 (1998), който дискутира откритието, че ВВ1 антитялото свързва молекула, която е идентична на формата на клетъчната повърхност на CD74, и следователно ВВ1 mAb се свързва към протеин различен от В7-1, и този епитоп също ·· ·· ··«· ·7 ···· ·· · · *» · • ·· ··· ·· · ······ ·· · ·· ··· присъства върху В7-1 протеина. Следователтно, това наблюдение се нуждае от поле за повторно разглеждане на изследванията използуващи ВВ1 mAb при анализа на експресията и функцията на CD80.

Започвайки през 1993, като кулминацията е през 1995, изследователите започват да обрисуване ролята на CTLA-4 в Тклетъчното стимулиране. Първоначално чрез използуването на моноклонални антитела срещу CTLA-4, Walunas et al., Immunity 1:405-13 (1994) се дават доказателства за това, че CTLA-4 може ® да действа като негативен регуратор на Т-клетъчното активиране. След това Waterhouse et al. Science 270:985-988 (1995) показва, че мишки с недостатъчност на CTLA-4 акумулират Т клетъчни бласти с ир-регулирани маркери за активиране в тяхните лимфни възли и далака. Властните клетки се инфилтрират, също така, в черния дроб, сърцето, белите дробове и тъканите на панкреаса, като количествата серумен имуноглобулин са завишени и тяхните Т клетки пролиферират спонтанно и силно при стимулиране чрез Т клетъчния рецептор, въпреки че са чувстивелни на клетъчната смърт, индуцирана от © напречното омрежване на Fas рецептор и чрез гама облъчване.

Waterhouse et al. стигат до заключението, че CTLA-4 действа като негативен регулатор на Т клетъчно активиране и е жизнено важен за лимфоцитния хомеостазис. В коментар в същото издание, Allison and Knmrmel Science 270:932-933 (1995), разисква работата на Waterhouse et al. като показателна за това, че CTLA-4 действа за down-регулиране на Т-клетъчната способност на отговор или притежава инхибиторно сигнална роля в Т-клетъчното активиране и развитие. Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995) също генерира мишки с недостатъчност на CTLA4

H #· ·· ·»·· ««Q · • 4 · · ·· · · Q ·· 4 · · «·· · · · ···· ·· * ·· ···
и показва, че такива мишки лимфопролиферативно заболяване	бързо развиват с мултиорганно

лимфоцитно инфилтриране и тъканно разрушаване, с изключително тежък миокардитис и панкреатитис. Те стигнаха до извода, че CTLA-4 играе ключова роля в down-регулирането на Т клетъчното активиране и поддържане на имунологичната хомеастаза. Също така, Krummel and Allison J Exp Med 182:459i (1995) изясняват по-късно, че CD28 и CTLA-4 имат i противоположно действие върху отговора на Т-клетки към ; ® стимулиране. Те генерират антитяло към CTLA-4 и изследват | ефекта върху неговото свързване към CTLA-4 в система, ί

използуваща високо пречистени Т клетки. В тяхното съобщение те показват, че присъствието на ниски нива на В7-2 на свежо I отделени Т клетки може частично да инхибира Т-клетъчната пролиферация, като тази пролиферация се медиира чрез | взаимодействието с CTLA-4. Напречното омрежване на CTLA-4 заедно с TCR и CD28 силно инхибира пролиферацията и IL-2 | секретирането от Т клетки. Накрая резултатите показаха, че

CD28 и CTLA-4 доставят противоположни сигнали, които J © изглежда са интегрирани от Т клетката при определянето на отговора на антигена. Така те стигнали до заключението, че изходното стимулиране на Т-клетъчния антигенен рецептор се I регулира от CD28 костимулиращи сигнали, както и от инхибиторни сигнали произлизащи от CTLA-4. Виж също Krummel et al. Int Immunol 8:519-23 (1996) and U.S. Patent No. 5 | 811 097 and international Patent Application No. WO 97/20574.

| Проведени са голям брой допълнителни експерименти, j които допълнително изясняват горното дейстнвие на CTLA-4.

Например, Walunas et al., J Exp Med 183:2541-50 (1996), чрез

·· ·· • · · ·	·· ···· • · ·	.•9
• · · ···· ··	• · · ·· ·	• « · • · ···

използуването на анти-СТ1_А4 антитела, предполагат, че CILA-4 подаването на сигнали не регулира клетъчната преживяемост или способнонст на отговор на IL-2, но инхибира CD18зависимото продуциране на IL-2. Perrin et al. J Immunol 157:13336 (1996), също показва, че анти-СТЬА-4 антитела в експериментални алергични енцефаломиелити (ЕАЕ), обостря заболяването и засилва смъртността. Обострянето на болестта се свързва със засиленото продуциране на енцефалитогенни TNF-алфа, IFN-гама и IL-2. така те стигнали до заключението, че ® CTLA-4 регулира интензитета на автоимунния отговор при ЕАЕ, като намалява възпалителното продуциране на цитокини и клиничните прояви на заболяването. Виж също така Hurwitz et al. J Neuroimmunol 73:57-62 (1997) and Cepero et al. J Exp Med 188:199-204 (1998) (един анти-СТЬА-4 фуркетен рибозим, който специфично анулира CTLA-4 експресията след генния трансфер в миши Т-клетъчен модел).

Освен това, Blair et al. J immunol 160:12-5 (1998) установяват функционалните ефекти на панел от CTLA-4 моноклонални антитела (mAbs) върху подложка от човешки © CD4+ Т клетки. Тяхните резултати показват, че някои CTLA4 mAbs биха могли да инхибират пролиферативните отговори на resting CD4+ и преминаването на клетъчния цикъл от G0 към G1. Инхибиторното действие на CTLA-4 става ясно след 4 h, в момента когата експресията на CTLA-4 на повърхността на клетката става недоловима. Въпреки това, някои други CTLA-4 mAbs нямат доловимо инхибиторно действие, което означава, че свързването на mAbs самостоятелно към CTLA-4 не е достатъчно да медиира down-регулирането на Т клетъчни отговори. Интересен е факта, че докато IL-2 продукцията е ·· ·· • · · · • · · ·· ···· • · · • · · .no.

• · • · · ···· ·· · · ·· · • · · ·· ··· изключена, инхибиторните анти-СТ1_А4 mAbs позволяват индуциране и експресия на гена bd-X(L) на клетъчната преживяемост. В съгласие с тези наблюдения, клетките остават жизнеспособни и не се установява апоптозис след CTLA-4 лигиране.

Във връзка с анергията, Perez et al. Immunity 6:411-7 (1997) показват, че индуцирането на Т-клетъчна анергия се предотвратява чрез блокиране на CTLA-4, като стигат до заключението, че изходът от разпознаването на антигена от Т клетки се определя от взаимодействието на CD28 или CTLA-4 върху Т клетките с В7 молекули. Също така, VanParijis et al., J Exp Med 186:1119-28 (1997) разглежда ролята на интерлевкин 12 и костимулатори на Т-клетъчната анергия in vivo и откри, че чрез инхибирането на включването на CTLA-4 по време на индуцирането на анергия, Т клетъчната пролиферация е блокирана и не се стартира пълната Th1 диференциация. Въпреки това, Т-клетките подложени на толерогенен антиген в присъствие и на двете, IL-12 и анти-СТ1_А4 антитяло не се анергизират и проявяват поведения идентично на това на клетки, които са срещали имуногенен антиген. Тези резултати подсказват, че два процеса допринасят за индуцирането на анергия in vivo: включването на CTLA-4, което води до блокиране на способността на Т клетъчната пролиферация, и отсъствието на прототипен възпалителен цитокин, IL-12, който предотвратява диференциирането на Т клетките в Th1 ефекторни клетки. Комбинацията от IL-12 анти-СТ1_А-4 антитяло е достатъчна да превърни нормалния толерогенен стимулус в имуногенен такъв.

·· ·· ·· ····J/1 ···· ·· ··· ··· ·· ··· ·· ··· ···· · ··· ··♦·· ···· ·· ·· ·

Във връзка c инфекциите, McCoy et al. J Exp Med 186:183-7 (1997) показва, че анти-СТ1_А-4 антителата силно усилват и ускоряват Т-клетъчния имунен отговор за Nippostrongylus brasiiiensis, което води до силно намаляване броя на възрастни червеи и ранно завършване на паразитното производство на яйца. Виж също Murphy et al., J. Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani).

Във връзка c рака, Kwon al. PNAS USA 94:8099-103 (1997) установяват синергичен модел на миши модел на рак на простатата и изследват две различни манипулации, с огелд да се предизвика отговор срещу рака на простата чрез усилване на Т-клетъчното костимулиране: (i) възможност за осигуряване на директно костимулиране чрез клетките на рака на простатата, трансдуцирани да експрресират В7.1 лиганд и (ii) in vivo антитяло-медиирано блокиране на Т-клетъчния CTLA-4, който предотвратява Т-клетъчното down-регулиране. Демонстрира се, че in vivo антитяло-мед и праното блокиране на CTLA-4 засилва имунния отговор срещу рак на простата. Също така, Yang et al. Cancer Res 57-4036-41 (1997) прави изследване дали © блокирането на CTLA-4 функцията води до засилване на антитуморния Т-клетъчен отговор на различни етапи от туморния растеж. На основата на in vitro и in vivo резултати, те открили, че блокирането на CTLA-4 при хора носители на тумори засилва способността за генериране на антитуморен Тклетъчен отговор, но експресията на един такъв засилен ефект се ограничава до ранните етапи от туморния растеж при тяхния модел. По късно, Hurwitz et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:1006771 (1998) изследва, че генерирането на Т клетъчно медииран антитуморен отговор зависи от включването на Т-клетъчен • ·

рецептор от големия комплекс за хистосъвместимост/антиген, както и CD28 лигиране чрез В7. Някои тумори като SM1 карцинома на гърдата са упорити на анти-СТ1_А-4 имунотерапията. Така, чрез използуването на комбинация от CTLA-4 блокиране и ваксина, състояща се от гранулоцитстимулиращ фактор-експресиращ SM1 клетки се наблюдава регресия на родителските SM1 тумори, въпреки неефективността на всяко едно от леченията, приложено самостоятелно. Тази комбинирана терапия води до дълготраен имунитет към SM1 и зависи и от двете - CD4(+) и CD8(+) клетките. Това откритие подсказва, че CTLA-4 блокирането действа на нивото на произлезла от гостоприемника клетка представяща антиген.

Във връзка с диабета, Luhder et al. J Exp Med 187:427-32 (1998) инжектира анти-СТЦ\-4 mAb в TCR трансгенен миши модел на диабет в различни стадии на заболяването. Те открили, че включването на CTLA-4 по времето, когато потенциалните диабетогенни клетки първо се активират е основно събитие; ако е позволено включване, се осъществява инвазия на островчетата, но остава съвсем безвреден в продължение на месеци. Ако ли не, атаката е много поагресивна, и бързо следва диабет.

Във връзка с имунизирането с ваксина, Horspool et al. J Immunol 160:2706-14 (1998) откриват, че интакнти анти-СТ1_А-4 mAb, но не и Fab фрагментите, подтискат първичния хуморален отговор към pCIA/бета gal без да се засяга recall отговорите, което означава, че CTLA-4 активирането инхибира АЬ продуцирането, но и Т-клетъчното прайминг. Блокирането на лигандите за CD28 и CTLA-4, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2),

показват отделна и неприпокриваща се функция. Блокирането на CD80 при първоначалното имунизиране изцяло премахва първичните и вторични АЬ отговори, при което блокирането на CD86 поддтиска първичните, но не и вторичните отговори. Едновременното блокиране на CD80 + CD86 е по-малко ефективно при поддтискането на АЬ отговорите, отколкото самостоятелно. Засилването на костимулирането чрез съвместно инжектиране на плазмиди експресиращи В7 увеличават CTL отговорите, но не и АЬ отговорите, и без ® доказателство за ТЬ1 в Th2 изкривяването. Тези открития подсказват за комплексни и различни роли за CD28, CTLA-4, CD80, и CD86 при Т клетъчно костимулиране, следващо ваксиниране с нуклеинова киселина.

Във връзка с отхвърлянето на алографт, Markees et al. J Clin Invest 101:2446-55 (1998) откриват в миши модел на отхвърляне на кожен алографт, че приемането първоначално зависи от присъствието на IFN-гама, CTLA-4, CD4(+) Т клетки. Прибавянето на анти-СТ1_А-4 или на анти-IFN-raMa тАЬ към протокола се свързва с бързо отхвърляне на присадката, © докато aHTH-IL-4 mAb няма ефект.

По отношение на ролята на CTLA-4, във връзка с CD28, Fallarino et al. J Exp Med 188:205-10 (1998) генерира TCR трансгенен/активиращ рекомбиназа ген 2-недостатъчност/СО28-див тип или СО28-недостатъчност мишки, които са имунизирани с тумор експресиращ антиген. Примирани Т клетки от двата вида продуцирани от мишки цитокини и пролиферирани в отговор на стимулаторни клетки с липса на В7 експресия. Въпреки това, когато отговорът на CD28+/+ Т клетки се увеличи чрез костимулиране с В7-1, отговорът на CD28-/- Т клетки силно се • ·

инхибира. Това инхибиране се обръща от моноклонално антитяло срещу В7-1 или CTLA-4. Така, CTLA-4 потенциално може да инхибира Т клетъчното активиране при отсъствие на CD28, което означава, че антагонизмът на TCR-медииран сигнал е достатъчен да обясни инхибиращия ефект на CTLA-4. Също така, Lin et al. J Exp Med 188:199-204 (1998) изследват отхвърляне на сърдечни алографти в мишки с CD28недостатъчност. H-2(q) сърца се трансплантират в алогенен див тип или (Н-2(Ь)) мишки с СО28-недостатъчност. Отхвърлянето на присадката се забавя при СО28-недостатъчност в сравнение с мишки от див тип. Третирането на реципиенти от див тип с CTLA-4-имуноглобулин (lg), или с анти-В7-1 плюс анти-В7-2 mAbs значително удължават преживяемостта на алографта. В контраст, третирането на мишки с СО28-недостатъчност с CTLA-

4-lg, анти-В7-1 плюс-В7-2 mAbs, или блокиращо анти-СТ1А-4 гпАЬ, индуцира ускоряване на отхвърлянето на алографта. Това повишено ниво на отхвърляне на присадката се свързва с посериозно инфилтриране на едноядрени клетки и засилени нива на IFN-гама и IL-6 транскрипти в дорните сърца на нетретиран © див тип и CTLA-4-lg- или анти-СТ1-А-4 mAb-третирани мишки с

СО28-недостатъчност. Така, негативната регулаторна роля на CTLA-4 излиза извън неговата потенциална способност за предотвратяване на CD28 активиране чрез компетитивно свързване на лигандата. Даже при отсъствие на CD28, CTLA-4 има инхибиторна роля при регулирането на отхвърлянето на алографт.

Проведено е и друго охарактеризиране на експресията на CTLA-4. Например, Alegre et al. J immunol 157:4762-70 (1996) предлполагат, че повърхностният CTLA-4 бързо става

вътрешен, което може да обясни ниските нива на експресия, обикновено установявани върху цялата повърхност. Те стигат до извода, че и двата CD28 и IL-2 играят важна роля при иррегулирането на CTLA-4 експресията. Освен това, акумолирането на CTLA-4 изглежда първоначално се регулира от неговата бърза ендоцитоза. Също така, Castan et al. Immunology 90:265-71 (1997) на основата на in situ имунохистологичен анализ на експресията на CTLA-4, ©преполагат, че зародишните централни Т клетки, които са CTLA4 позитивни, биха могли да бъдат важни за имунното регулиране.

В съгласие, с оглед на широката основна роля, която изглежда притежава CTLA4 в имунния отговор, желателно е да се генерират антитела срещу CTLA-4, които ефективно да се използуват при имунотерапията. Освен това е желателно да се генерират антитела срешу CTLA-4, които биха могли да се използуват при хронични заболявания, при които се изисква повторено прилагане на антитела.

© КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 представя серия нуклеотидни и аминокиселинни последователности с тежки вериги и капа лека верига молекули на имуноглобулина, съгласно изобретението: 4.1.1. (Фигура 1А),

4.8.1 (Фигура 1В), 4.14.3 (Фигура 1С), 6.1.1. (Фигура 1D). 3.1.1 (Фигура 1Е), 4.10.2 (Фигура 1F). 2.1.3 (Фигура 1G), 4.13.1 (Фигура 1Н), 11.2.1 (Фигура 11). 11.6.1. (Фигура 1J), 11.7.1. (Фигура 1К),

12.3.1.1. Фигура 1 (Фигура 1L), и 12.9.1.1. (Фигура 1М).

Фигура 2 представя подреждане на последователност между предсказаната последователност на тежката верига от ·· ····

клонове 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1. 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1,

11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и 12.9.1.1. и аминокиселинната последователност от зародишната линия DP-50 (3-33).

Разликите между последователността на зародишната линия DP-50 и тази от последователността в клоновете са посочени с надебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите, по-тъмно.

Фигура 3 представя подреждане на последователности ©между предсказаната тежка аминокиселинна верига на клон

2.1.3 и аминокиселинната последователност на зародишната линия DP-65 (4-31). Разликите между последователността на DP-65 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите, на антитялото като подчертани.

Фигура 4 представя подреждане на последователност между предсказаната аминокиселинната последователност на капа леката верига на клонове 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2, и

4.13.1 аминокиселинната последователност на зародишната © линия А27. Разликите между последователността на А27 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите, на антитялото като подчертани. Явните делеции в CDR1S от клоновето 4.8.1, 4.14.3, и 6.1.1. са посочени с “Os”.

Фигура 5 представя подреждане на последователност между предсказаната аминокиселинната последователност на капа леката верига на клонове 3.1.1, 11.2.1, 4.14.3, 11.6.1, 4.10.2, и 11.7.1 и аминокиселинната последователност на зародишната

линия 012. Разликите между последователността на 012 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 6 представя подреждане на последователност между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига на клонове 2.1.3, и аминокиселинната ©последователност на зародишната линия А10/А26. Разликите между последователността на А10/А26 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 7 представя подреждане на последователност между предсказаната аминокиселинната последователност на капа леката верига на клонове 12.3.1 и аминокиселинната последователност на зародишната линия А17. Разликите между последователността на А17 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата © показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите, на антитялото като подчертани.

Фигура 8 представя подреждане на последователност между предсказаната аминокиселинната последователност на капа леката верига на клонове 12.9.1 и аминокиселинната последователност на зародишната линия АЗ/А19. Разликите между последователността на АЗ/А19 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите, на антитялото като подчертани.

···· ·· ·· ··«·

Фигура 9 представя обобщение на N-терминалните аминокиселинни последовмателности, генерирани чрез директно протеиново секвениране на тежката и леката верига на антителата.

Фигура 10 представя известна охаракатеризираща информация за някои от антителата, съгласно изобртението. На фигура 10А, данните отнасящи се до клонове 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,

4.10.2, 4.14.3, и 6.1.1са обобщени. Представят се данни, ©отнасящи се до концентриране, изоелектрично фокусиране (IEF), SDS-PAGE, гелна хроматография, течна хроматография/масспектроскопия (LCMS), масспектроскопия (MALDI), N-терминалните последовмателности на леката верига. Допълнително, на фигура 10В се представя допълнителна информация, отнасяща се до IEF; отнасяща се до SDS-PAGE се представя на ЮС; и SEC на 4.1.1 антитяло на 10D.

Фигура 11 показва експресията на В7-1 и В7-2 върху Raji клетки, при използуване на aHTni-CD80-PE и анти-СО86-РЕ mAbs.

© Фигура 12 показва зависимото от концентрацията усилване на IL-2 производството при Т клетки бласт/Raji изследване, индуцирани чрез анти-СТЦ\-4 блокиращи антитела (BNI3, 4.1.1,

4.8.1, и 6.1.1).

Фигура 13 показва зависимото от концентрацията усилване на IFN-γ производството при Т клетки бласт/Raji изследване, индуцирани чрез анти-СТЦ\-4 блокиращи антитела (BNI3, 4.1.1,

4.8.1, и 6.1.1) (същите донорни Т-клетки).

Фигура 14 показва средното усилване на IL-2 производството при Т клетки от шест донора, индуцирани от

анти-СТ1_А-4 блокиращи антитела при Т клетки бласт/Raji изследване.

Фигура 15 показва средното усилване на IFN-γ производството при Т клетки от шест донора, индуцирани чрез анти-СТ1_А-4 блокиращи антитела при Т клетки бласт/Raji изследване.

Фигура 16 показва усилването на IL-2 производството в hPBMC от пет донора, индуцирани чрез анти-СТ1_А-4 блокиращи mAbs, както е измерено 72 часа след стимулиране със SEA.

Фигура 17 показва усилването на IL-2 производството в пълна кръв от три донора, индуцирани чрез анти-СТ1А-4 блокиращи mAbs, както е измерено 72 и 96 часа след стимулиране с SEA.

Фигура 18 показва инхибирането на туморния растеж с анти-миши CTLA-4 антитяло в модел на миши фибросаркомен тумор.

Фигура 19 показва усилването на IL-2 производството, индуцирано чрез анти-СТ1_А-4 антитела (4.1.1, и 11.2.1) от изобретението, при изследване от 72 часа Т бласт/Raji и Суперантиген (едноядрени кръвни клетки от периферна кръв от 6 донора).

Фигура 20 показва зависимо от дозата усилване на IL-2 производството, индуцирано чрез анти-СТ1_А-4 антитела (4.1.1, и

11.2.1) от изобретението, при 72 часово Т бласт/Raji изследване.|

Фигура 21 показва зависимо от дозата усилване на IL-2J производството, индуцирано чрез анти-СТ1_А-4 антитела (4.1.1, и|

11.2.1) от изобретението, при 72 часово изследване наI

Суперантиген на пълна кръв, стимулирана с 100 ng/ml суперантиген.| i

·· ····

Фигура 22 представя серия допълнителни нуклеотидни и аминокиселинни последователности на следните вериги на анти-СТ1_А-4 антитяло: пълна дължина 4.1.1. тежка верига (сДНК 22(a), геномна сДНК 22(b), и аминокиселинна сДНК 22(c), пълна дължина на гликозилирана 4.1.1 тежка верига (сДНК 22(d),), и аминокиселина 22(e), 4.1.1 лека верига (сДНК 22(f), и аминокиселина 22(g)), пълна дължина 4.8.1. лека верига (сДНК 22(h), и аминокиселина 22(i), 4.8.1. лека верига (сДНК 22(j) и аминокиселина 22(к), пълна дължина на 6.1.1 тежка верига (сДНК 22(1), и аминокиселина (22т)), 6.1.1 лека верига (сДНК 22(п) и аминокиселина 22(п) и аминокиселинна сДНК 22(о)), пълна дължина 11.2.1 тежка верига (сДНК 22(р) и аминокиселина 22(q)), и. 11.2.1 лека верига (сДНК 22(г) и аминокиселина 22(s)).

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно един първи аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, способно да свързва CTLA-4, включващо аминокиселинна последователност на вариабилната област на тежката верига, съдържаща съседна аминокиселинна поседователност от вътрешността на FR1 последователност, през FR3 последователност, която се кодира чрез човешко V_H333 генно семейство, и която съдържа поне едно от аминокиселинните замествания в CDR1 последователностите, CDR2 последователностите или рамкови последователности, показани на фигура 2. При един предпочитан вариант за изпълнени на изобретението, аминокиселинната поседователност включва последователност, избрана от група състояща се от SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, ·· ····

SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8,

SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID SEQ 12,

SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:63, SEQ ID N0:64, SEQ ID N0:66, SEQ

ID N0:68, и SEQ ID N0:70. При един друг предпочитан вариант за изпълнение не изобретението, антитялото съдържа, освен това, аминокиселинна последователност на вариабилната област на леката верига, съдържаща поседователност, избрана от група състояща се от последователност, включваща SEQ ID N0:14, ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID

N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22. SEQ ID N0:23. SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:65, SEQ SEQ ID N0:67, SEQ ID N0:69, и SEQ

ID N0:71.

Съгласно един втори аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, включващо аминокиселинна последователност на тежката верига, включваща SEQ ID N0:1 и аминокиселинна последователност на вариабилната област на тежката верига включваща, SEQ ID N0:14.

Съгласно един трети аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, включващо аминокиселинна последователност на тежката верига, включваща SEQ ID N0:2 и аминокиселинна последователност на вариабилна област на лека верига включваща, SEQ ID N0:15.

Съгласно един четвърти аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, включващо аминокиселинна последователност на тежката верига, включваща SEQ ID N0:4 и аминокиселинна последователност на вариабилната област на лека верига включваща, SEQ ID N0:17.

···

• · • ft ft ft ft ft

Съгласно един пети аспект на настоящето изобретение се предоставя едно изолирано човешко моноклонално антитяло, което е способно да се свързва към CTLA-4. При един предпочитан вариант за изпълнение антитялото е способно да | се съревновава за свързване на CTLA-4 с антитяло, избрано от | група състояща се от 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3,

6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1. 12.3.1.1, и 12.9.1.1. При един друг ί предпочитан вариант за изпълнение антитялото притежава ©ί подобна по същество специфичност на свързване към CTLA-4, I като антитяло избрано от група състояща се от 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, | 4.10.2, 4.13.1. 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и j 12.9.1.1. При един друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото се избира от група състояща се от 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, { 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и

12.9.1.1. При един друг предпочитан вариант за изпълнение (

антитялото не е способно да влиза в кръстосана реакция с CTLA-4 от животински видове от низсши бозайници, за предпочитане низсшите видове бозайници включват мишка, плъх и заек, и по-предпочитано мишка и плъх. При един друг I © предпочитан вариант за изпълнение антитялото е способно да

I влиза в кръстосана реакция с CTLA-4 от примати, като за предпочитане приматите включват cynomolgous и rhesus маймуни. При един друг предпочитан вариант за изпълнение | антитялото притежана селективност за CTLA-4 над CD28, В7-2, j CD44, и hlgG1 над приблизително 100:1, и за предпочитане j 500:1 или повече. При един друг предпочитан вариант за ? изпълнение афинитетът на свързване на антитялото е приблизително 10'⁹ М или повече и за предпочитане приблизително Ю¹⁰ М или повече. При един друг предпочитан ·· ···· вариант за изпълнение антитялото инхибира свързването между CTLA-4 и В7-2 с 1С₅о или по-ниско от приблизително 100 пМ, и за предпочитане по-ниско от приблизително 0,38 пМ.

При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото инхибира свързването между CTLA-4 и В7-1 с ICso по-ниско от 100 пМ или повече и за предпочитане по-ниско от приблизително 0,50 пМ. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството на IL-2 при Т ©cell бласт/Raji изследването с приблизително 500 pg/ml или повече и за предпочитане с приблизително 3846 pg/ml или повече. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството на IFN-γ при Т cell бласт/Raji изследването с приблизително 500 pg/ml или повече и за предпочитане с приблизително 1233 pg/ml или повече. При друг При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството на IL-2 при изследването за hPBMC или суперантиген от пълна кръв с приблизително 500 pg/ml или повече. При един предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството на IL-2 при изследването за © hPBMC или суперантиген от пълна кръв с приблизително 500 pg/ml или 1500 pg/ml или повече или с повече от приблизително 30% или за предпочитане 50% отнасящи се за контролата.

Съгласно един шести аспект на настоящето изобретение се предоставя хуманизирано антитяло, което притежава подобна по същество специфичност на свързване към CTLA-4 , като антитяло избрано от група, състояща се от 3.1.1, 4.1.1,

4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и

12.9.1.1. При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобртението, антитялото не влиза в кръстосана реакция с ·· ···· .:

• · • · • · ·· *··

CTLA-4 от низши видове бозайниици, за предпочитане низшите видове бозайниици включват мишка, плъх и заек, а за предпочитане мишка и плъх. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото влиза в кръстосана реакция с CTLA-4 от примати, за предпочитане приматите включват cynomolgous и rhesus маймуни. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото притежава селективност за CTLA-4 над CD28, В7-2, CD44 и hlgG1 с повече от приблизително 100:1, а за предпочитане 500:1 или повече. При друг предпочитан вариант за изпълнение селективността на свързване на антитялото е приблизително 10’⁹ М или повече, а за предпочитане е приблизително Ю’¹⁰ М или повече. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото инхибира свързването между CTLA-4 и В7-2 с 1С₅₀ по-ниско от приблизително 100 пМ, а за предпочитане по-ниско от приблизително 0,38 пМ. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото инхибира свързването между CTLA 4 и В7-1 с 1С₅о по-ниско от приблизително 100 пМ или повече, и за предпочитане по-ниско от приблизително 0,50 пМ. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството IL-2 при Т cell бласт/Raji изследването с приблизително 500 pg/ml или повече и за предпочитане с приблизително 3846 pg/ml или повече. При един друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, антитялото засилва производството на IFN-γ при Т cell бласт/Raji изследването с приблизително 500 pg/ml или повече и за предпочитане с приблизително 1233 pg/ml или повече. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото индуцира производството на IL-2 при изследването за hPBMC или суперантиген от пълна кръв с приблизително 500 ·· ···· •· • ·· •· ·· pg/ml или повече. При друг предпочитан вариант за изпълнение антитялото засилва производството на IL-2 при изследването за hPBMC или суперантиген от пълна кръв с приблизително 500 pg/ml или за предпочитане 1500 pg/ml или повече или с повече от 30% или за предпочитане 50%, по отношение на контролата.

Съгласно един седми аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, което се свързва към CTLA-4, включващо аминокиселинна последователност на тежката ©верига на FR1, FR2, и FR3, кодирана от човешки V_H 3-33 генното семейство, операционно свързано с CDR1, CDR2, и CDR3 последователност, като CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите независимо се избират измежду CDRI, CDR2, и CDR3 последователности, илюстрирани на фигура 2. При един предпочитан вариант за изпълнение, антитялото от претенция 32, включва освен това която и да е от соматичните мутации за FR1, FR2, и FR3 последователности, илюстрирани на фигура 2.

Съгласно един осми аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, което се свързва към CTLA-4, включващо © аминокиселинна последователност на тежката верига на FR1,

FR2, и FR3, кодирана от човешко V_H 3-33 генно семейство, операционно свързано в рамка с CDR1, CDR2, и CDR3 последователности, като посоченото антитяло има следните свойства: свързващ афинитет към CTLA-4 от приблизително 10~⁹ или повече; инхибира свързването между CTLA-4 и В7-1 с Ю₅о от приблизително 100 пМ или по-ниско; инхибира свързването между CTLA-4 и В7-2 с 1С₅о от приблизително 100 пМ или пониско; и усилва продуцирането на цитокини при изследване на човешки Т клетки с 500 pg/ml или повече.

мм

·· ·

Съгласно един девети аспект на настоящето изобретение се предоставя антитяло, което се свързва към CTLA-4, включващо аминокиселинна последователност на тежката верига на FR1, FR2, и FR3, операционно свързани в рамка с CDR1, CDR2, и CDR3 последователности, независимо избрани измежду CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите илюстрирани на фигури 2 и 3, което антитяло има следните свойства: свързващ афинитет към CTLA-4 от приблизително 10' ®⁹ или повече; инхибира свързването между CTLA-4 и В7-1 с един 1С₅₀ от приблизително 100 пМ или по-ниско; инхибира свързването между CTLA-4 и В7-2 с 1С₅₀ от приблизително 100 пМ или по-ниско; и усилва продуцирането на цитокини при изследване на човешки Т клетки с 500 pg/ml или повече.

Съгласно един десети аспект на настоящето изобретение се предоставя, клетъчно-културална система за изследване на Т-клетъчно стимулиране, включваща култура от човешки Т клетъчни бласти, съвместно култивирани с Raji клетъчна линия. При един предпочитан вариант за изпълнение, Т-клетъчните бласти се промиват преди да се култивират с Raji клетъчна © линия.

Съгласно един единадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя метод (изследване) за измерване на Т-клетъчното стимулиране, което включва: доставяне на култура човешки Т-клетъчни бласти и Raji клетъчна линия; довеждане на културата в контакт с определено средство; и измерване на продукцията на цитокини от културата.

Съгласно един дванадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя функционално изследване за скриниране на част за Т-клетъчно стимулиращо действие ·· ····

(функция), което включва: доставяне на култура човешки Тклетъчни бласти и Raji клетъчна линия; довеждане на културата в контакт с посочената част; и определяне на продукцията на цитокини от културата.

Съгласно един тринадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя метод (изследване) за измерване на Т-клетъчното стимулиране за CTLA-4 инхибиторното действие, който включва: довеждане на културата, включваща Т-клетъчни бласти и Raji клетъчна линия в контакт с определено средство и определяне продукцията на цитокини от културата.

Съгласно един четиринадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя метод за скриниране на средство за Т-клетъчно стимулираща активност, който включва: довеждане на средството в контакт с културата, съдържаща Т-клетъчни бласти и Raji клетъчна линия; и определяне на продукцията на цитокини от културата.

Във всеки един аспект от десети до четиринадесети, на настоящето изобретение, в един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението Т-клетъчните бласти се промиват преди да се култивират с Raji клетъчната линия. При един предпочитан вариант за изпълнение, цитокинът е IL-2 или IFNγ. При един предпочитан вариант за изпълнение продукцията на цитокин се измерва в супернатанта, изолирана от културата. При един предпочитан вариант за изпълнение средството е антитяло и за предпочитане се свързва към CTLA.-4.

Съгласно един петнадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя изследване за измерване на Тклетъчното стимулиране, който включва: доставяне на популация от моноядрени клетки от човешка периферна кръв ·· ·· • · · · • ·· • ·· • ·· ···· ·· ·· ··*· • · · • ·· • · ·· • ·· ·· ·

28..:

• * * • · ·· • «· • V··· или човешка цяла кръв, стимулирана с ентеротоксин А от стафилококус; довеждане на културата в контакт с определено средство; и измерване на продукцията на цитокини от клетъчната популация.

Съгласно един шестнадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя функционално изследване за скриниране на частица за Т-клетъчно стимулиращо действие, който включва: доставяне на популация от моноядрени клетки ©от човешка периферна кръв или човешка цяла кръв, стимулирана с ентеротоксин А от стафилококус; довеждане на културата в контакт с частицита; и определяне на продукцията на цитокини от клетъчната популация.

Съгласно един седемнадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя изследване за измерване на Тклетъчното стимулиране за CTLA-4 инхибиторно действие, което включва: довеждане на популация от моноядрени клетки от човешка периферна кръв или човешка цяла кръв, стимулирана с ентеротоксин А от стафилококус в контакт с

I определено средство и определяне продукцията на цитокини от © клетъчната популация.

Съгласно един осемнадесети аспект на настоящето изобретение се предоставя метод за скриниране на средство за Т-клетъчна стимулираща активност, който включва: довеждане на популация в контакт с популация от моноядрени клетки от човешка периферна кръв или човешка цяла кръв, стимулирана с ентеротоксин А от стафилококус; и определяне продукцията на цитокини от клетъчната популация.

ΐ Във всеки един аспект от петнадесети до осемнадесети, на ! настоящето изобретение, при един предпочитан вариант за i

·· ····

изпълнение на изобретението цитокинът е IL-2. При друг предпочитан вариант за изпълнение, продукцията на цитокин се измерва в супернатанта, изолирана от културата. При един друг предпочитан вариант за изпълнение, средството е антитяло и за предпочитане се свързва към CTLA-4.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно настоящето изобретение се предоставят пълни човешки моноклонални антитела срещу човешки CTLA-4. Предоставят се нуклеотидни последователности кодиращи и аминокиселинни последователности включващи леката и тежката вериги на молекулите на имуноглобулина, по-точно последователности съответстващи на съседни леки и тежки последователности от FR1 и CDR1 до CDR3 и FR4. Предоставят се, освен това антитела, притежаващи подобни свойства на свързване и антитела (или други антагонисти), притежаващи подобна функционалност като описаните в настоящето антитела. Също се предоставят хибридоми експресиращи такива молекули на имуноглобулини и моноклонални антитела.

ДЕФИНИЦИИ

Ако не е дефинирано друго в настоящето, научните и техническите термини, използувани във връзка с настоящето изобретение трябва да имат смисъла, който обикновено им се придава от специалистите в областа. Освен това, ако не се изисква от контекста, термините в единствено число трябва да включват множество, а термините в множествено число трябва ·· ·· • · · · • ·· • ·· • ·· ···· ·· ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· ·

3¾ • · • · • · ·· ··· да включват и единицата. Обикновено, номенклатурата използувана във връзка с, и посредством техниката на, клетъчна и тъканна култура, молекулярната биология, и белтъчната и олиго- или полинуклеотидната химия и хибридизацията, описана в настоящето, са добре известни и обикновено се използуват в състоянието на техниката. Използуват се стандартни техники за рекомбинантна ДНК, олигонукпеотиден синтез, и тъканна култура и трансформиране ©(например, електропорация, липофекция). Ензимните реакции и техниките на пречистване се провеждат съгласно препоръките на производителя или както обикновено се осъществяват в предшестващото състояние на техниката или както са описани в настоящето. Горе-посочените техники и процедури обикновено се осъществяват съгласно някои конвенционални методи, добре известни от предшестващото състояние на техниката и както са описани в различни общи и по-специфични литературни източници, които са цитирани и се обсъждат в настоящето изобретение. Виж например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, © Cold Spnng Harbor, N.Y. (1989)), който се включва в настоящето.

Номенклатурите използувани във връзка с, и лабораторните процедури и техники на, аналитичната химия, химията на органичен синтез и медицинската и фармацевтичната химия, описани в настоящето са добре известни и обикновено използувани в предшестващото състояние на техниката. Използуват се стандартни техники за химичен синтез, фармацевтични препарати, лекарствени форми и доставяне и лечение на пациентите.

Μ

Както се използува, съгласно настоящето описание, следните термини, ако не е посочено друго, трябва да се разбира, че притежават следните значения:

Терминът изолиран полинуклеотид както се използува в настоящето означава полинуклеотид от геномен, сДНК, синтетичен произход или някаква тяхна комбинация, като благодарение на своя произхода на изолиран полинуклеотид (1) не се асоциира с целия или част от полинуклеотид, при което изолираният полинуклеотид се открива в природата, (2) ® е опероционно свързан към полинуклеотид, който не е свързан към него в природата, или (3) не се среща в природата като част от една по-голяма последователност.

Терминът изолиран протеин както се използува в настоящето означава протеин от сДНК, рекомбинантна РНК, или синтетичен произход или някаква тяхта комбинация, който благодарение на произхода си, или от източника от който произлиза, изолираният протеин (1) не се асоциира с протеини съществуващи в природата, (2) е свободен от други протеини от същия източник, например свободен от миши протеини, (3) се © експресира от клетка от различен вид, или (4) не се среща в природата.

Терминът полипептид, както се използува в настоящето като генеричен термин, се отнася до нативен протеин, фрагменти, или аналози на полипептидна последователност. Следователно, нативен протеин, фрагменти, или аналози са видове от полипептидно семейство. Предпочитани полипептиди, съгласно изобретението включват молекули на тежка верига на човешки имуноглобулин и молекули на капа лека верига на човешки имуноглобулин, посочени на фигура 1, както и • · · · · · • · · . . : ··· . ........ . ·..· .:.

молекули на антитяло, образувани от комбинация, включваща молекулите на тежката верига на имуноглобулина с молекулите на тежката верига на имуноглобулина, като молекулите на капа леката верига на имуноглобулина, и обратно, така както и негови фрагменти и аналози.

Терминът естествено същестуващ както се използува в настоящето, както се прилага за един обект се отнася до факта, че един обект може да се открие в природата. Например, полипептидна или полинуклеотидна последователност, която ® присъства в един организъм (включително вируси), която може да бъде изолирана от природен източник, и която не е била преднамерено модифицирана от човека в лаборатория или по друг начин съществува естествено в природата.

Терминът “операционно свързан”, както се използува в настоящето се отнася до полинуклеотидни последователности, които са необходими за да привидат в действие експресията и процесинга на кодиращите последователности, към които те са лигирани. Естеството на такива контролни последователности е различно, според организма гостоприемник; в прокариотните © организми, такива контролни последователности обикновено включват промотор, сайт за свързване на рибозомата, и последователност за завършване на транскрибцията; в еукариотни организми, обикновено такива контролни последователности включват промотори и последователности за завършване на транскрипцията.

Терминът “контролна последователност” се очаква да включва най-малкото всички съставни части, чието присъствие е основно за експресията и процесинга, и може също така да включва допълнителни съставни части, чието присъствие има • ·

предимство, например, лидерни последователности и последователности на слят протеин.

Терминът “полинуклеотид”, както се използува в настоящето означава полимерна форма на нуклеотиди с поне 10 бази дължина, или рибонуклеотиди или дезоксирибонуклеотиди или модифицирана форма на който и да е тип нукпеотид. Терминът включва едноверижни и двуверижни форми на ДНК.

Терминът олигонуклеотид, както се използува в ® настоящето включва естествено съществуващи в природата, и мдифицирани нуклеотиди, свюрзани заедно от естествено съществуващи и несъществуващи естествено в природата връзки. Олигонуклотидите са полинуклеотиден субкомплект, обикновено включващ дължина от 200 бази или по-малко. Предпочитани олигонукпеотиди са с дължина 10 до 60 бази, а по-предпочитано 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или 40 бази дължина. Олигонуклеотидите обикновено са едноверижни, например, за проби; въпреки това, олигонуклеотидите могат да бъдат двуверижни, например, за използуване при конструиране С на генен мутант. Олигонуклеотидите на изобретението могат да бъдат сенс или антисенс олигонукпеотиди.

Терминът естествено съществуващи нуклеотиди, както се използува в настоящето, включва дезоксирибонуклеотиди и рибонуклеотиди. Терминът модифицирани нуклеотиди, както се използува в настоящето, включва нуклеотиди, с модифицирани или заместени захарни групи и други подобни. Терминът олигонуклеотидни връзки, както се използува в настоящето, включва олигонуклеотидни връзки, като фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат, фосфороамидат и други подобни. Виж например, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Annalogues: A Practical Appronch, pp. 87-108 (F. Eckstein. Ed.. Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., U.S. Patent no. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), описанието на които е включено в настоящето за справка. Един олигонуклеотид може да включва маркер за откриване, по желание.

Терминът селективно се хибридизира както се използува в настоящето, се отнася до откриваемо и специфично свързване. Пол и нуклеотиди, олигонуклеотиди и тяхни фрагменти, съгласно настоящето изобретение селективно се хибридизират към вериги на нуклеинова киселина при условия на хибридизация и промиване, които довеждат до минимум значимимите количества откриваемо свързване към неспецифични нуклеинови киселини. Строги условия могат да се използуват за постигане на условия на селективна хибридизация, както е известно от предшестващото състояние на техниката и както се обсъжда в настоящето. Обикновено, хомоложността на последователностите нуклеинови киселини между полинуклеотидите, олигонуклеотидите и тяхните фрагменти, от изобретението, и последователността нуклеинови киселини, представляваща интерес ще бъде поне 80%, а по-специално с нарастваща, за предпочитане, хомоложност от поне 85%, 90%, 95%. 99%, и 100%. Две аминокиселинни последователности са хомоложни, ако е на • φ лице частчна и пълна идентичност на тяхните последователности. Например, 85% хомоложност означава, че 85% от аминокиселините са идентични, когато двете последователности се подредат за максимален брой съвпадения. Дупките (в която и да е от двете последователности с дупки) се предоставят за максимално съвпадане; предпочита се дължина на дупката от 5 или помалко, като 2 или по-малко е по-предпочитано. Алтернативно и предпочитано, две протеинови последователности (или ® полинуклеотидни последователности, произлезли от тях с поне аминокиселини дължина) са хомоложни, както се използува термина в настоящето, когато резултатът при подреждането е повече от 5 (в стандартни единици за допустима грешка), при използуване на програма ALIGN, с данни за мутациите на матрикса и gap penalty (“дузпа за дупките”) 6 или повече. Виж Dayhoff, М.О., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) и приложение 2 на този том, рр. 1-10. Двете последователности или тяхни части са по-предпочитано хомоложни, ако тяхните © аминокиселини са повече от или равни на 50% идентичност, когато са оптимално подредени, при използуване на програмата ALIGN. Терминът съответства на се използува в настоящето в смисъл, че полинукпеотидна последователност е хомоложна (т.е. е идентична, не стриктно свързано с еволюцията) към всички или част на сравнителна полинукпеотидна последователност, или че тази полинукпеотидната последователност е идентична на сравнителната полинукпеотидна последователност. Противоположно, терминът “комплементарен на” се използува в настоящето със значение, ♦· ····

.. . :: ,.....

........ . ·..· .:.

че комплементарната последователност е хомоложна на цялата или на част от сравнителна полинуклеотидна последователност. За сравнение, пол и нуклеотид ната последователност ТАТАС съответства на сравнителна последователност ТАТАС и е комплементарна на сравнителна а последователност GTATA.

Следните термини се използуват за описване на взаимоотношението между последователностите между две или повече полинуклеотидни или аминокиселинни последователности: “сравнителна последователност”, ® “сравнителен прозорец”, “идентичност на последователност”, “процент на идентичност на последователност”, и ’’съществена идентичност”. “Сравнителна последователност” е определена последователност, използувана като основа за сравнение на последователности; сравнителна последователност може да представлява подгрупа от по-голяма последователност, например, като сегмент от пълна дължина на сДНК или генна последователност, дадена в списък на последователности или може да включва пълна сДНК или генна последователност. Обикновено, сравнителна последователност се състои поне от © 18 нуклеотида или 6 аминокиселини дължина, често поне 24 нуклеотида или 8 аминокиселини дължина, и най-често поне 48 нуклеотида или 16 аминокиселини дължина. Тъй като два полинукпеотида или аминокиселини могат всеки (1) да включват последователност (т.е. част от пълната полинуклеотидна или аминокиселинна последователност), това е подобност между двете молекули, и (2) могат да включват също последователност, която е дивергентна между двете полинуклеотидни или аминокиселинни последователности, сравняване на последователности между две (или повече) • · »· ····

молекули характерно се провежда чрез сравняване на последователностите на двете молекули през “сравнителния прозорец” за идентифициране и сравняване на локални области на подобност на последователностите. “Сравнителен прозорец”, както се използува в настоящето се отнася до концептуален сегмент от поне 18 съседни нуклеотидни позиции или 6 аминокиселини, при което полинуклеотидна последователност или аминокиселинна последователност може да се сравнява със сравнителна последователност от поне 18 ® съседни нуклеотида или 6 аминокиселинни последователности, и при което участъкът от полинуклеотидната последователност в сравнителния прозорец може да включва прибавяния, делеции, замествания, и други подобни (т.е. дупки) от 20 процента или по-малко, при сравняване със сравнителната последователност (която не съдържа прибавяния или делеции) за оптимално подравняване на двете последователности. Отимално подравняване на последователности за подреждане на “сравнителния прозорец” може да се проведе при избор на алгоритъма за локална хомоложност на Smith и Waterman Adv. Ф Appl. Math. 2:482 (1981), чрез алгоритъма за хомоложно подреждане на Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1 970), чрез метода за търсене на хомоложност на Pearson and Lipman Proc. Nntl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), чрез компютъризирано осъществяване на тези алгоритми (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, или MacVector software packages), или чрез инспектиране, и най-доброто подреждане (т.е. водещо

до най-високия процент на хомоложност през “сравнителния прозорец” генериран чрез различните методи .

Терминът идентичност на последователност означава, че две полинуклеотидни или аминокиселинни последователности са идентични (т.е., на основата нуклеотид по нуклеотид или остатък по остатък) през сравнителния прозорец. Терминът процент на идентичност на последователност се изчислява чрез сравняване на две оптимално подредени последователности през сравнителния прозорец, като се ® определя броя на позиции, в които идентичната база на нуклеинова киселина (например, А, Т, С, G, U, or I) или остатък се среща и в двете последователности, за да се стигне до броя на съвпадащи позиции, като броя на съвпадащите позиции се разделя на общия брой позиции в сравнителния прозорец (т.е. размера на прозореца), и резултатът се умножава по 100 за да се получи процента на идентичност на последователност. Термините съществена идентичност както се използува в настоящето посочва характеристиката на полинуклеотидна или аминокиселинна последователност, при което пол и нуклеотид ът С или аминокиселината включват последователност, която притежава поне 85 процента идентичност на последователността, за предпочитане 90 до 95 процента идентичност на последователността, по-често поне 99 процента идентичност на последователността, при сравняване със сравнителна последователност през сравнителен прозорец от поне 18 нуклеотидни (6 аминокиселинни) позиции, често през сравнителен прозорец от поне 24-48 нуклеотидни (8-16 аминокиселинни) позиции, при което процентът на идентичност на последователността се изчислява чрез сравняване на

сравнителната последователност с последователността, която може да включва делеции или пробавяния, което общо да е над 20 процента или по-малко от сравнителната последоваталност през сравтинетлния прозорец. Сравнителният прозорец може да представлява подгрупа от по-голяма последователност.

Както се използува в настоящето, двадесетте конвенционални аминокиселини и тяхните съкращения следват конвенционално използуване. Виж Immunology - A Synthesis (2^nd Edition. E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, ® Sunderland. Mass. (1991)), което се включва в настоящето за справка. Стереоизомери (например, D-аминокиселини) на двадесетте конвенционални аминокиселини, неестествени аминокиселини като α-дизаместени аминокиселини, N-алкил аминокиселини, млечна киселина и други неконвенционални аминокиселини могат също да бъдат подходящи съставни части за полипептидите на настоящето изобретение. Пример за неконвенционални аминокиселини включват: 4хидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметилизин, εN-ацетилизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, Ν© формилметионин, 3-метилхистидин, 5-хидроксилизин, σ-Νметиларгинин, и други подобни аминокиселини (например, 4хидроксипролин). В анотацията на полипептида, използувана в настноящето, лявата посока е амино-терминалната посока, а дясната посока е карбокси-терминалната посока, съгласно стандартното използуване и конвенционално.

Подобно, ако не е уточнено друго, левият край на едноверижната последователност е 5’ края; дясната посока на двойноверижната полинуклеотидната последователност се отнася като 5’ посока. Посоката от 5’ към 3’ прибавяне на ···«

зараждащи се РНК транскрипти се отнася както посоката на трансрибиране; областите от последователността върху ДНК веригата, притежаващи същата последователност както РНК, и които са 5’ към 5’ края на РНК транскрипта се отнасят както “upstream последователности”; областите от последователността върху ДНК веригата, притежаващи същата последователност както РНК, и които са 3’ към 3’ края на РНК транскрипта се отнасят както “ downstream последователности”.

Както се прилага за полипептниди, терминът, съществена ® идентичност означава, че две пептидни последователности, когато са оптимално подредени, като с програмата GAP или BESFIT при използуване на теглото на стандартните дупки, споделят поне 80 процента идентичност на последователноста, за предпочитане поне 90 процента идентичност на последователноста, по-предпочитано поне 95 процента идентичност на последователноста, и най-предпочитано поне 99 процента идентичност на последователноста. За предпочитане, позициите на остатъците, които не са идентични се различават с консервативни аминокиселинни замествания. Консервативните © аминокиселинни замествания се отнасят до взаимозаменяемоста на остатъци, притежаващи подобни странични вериги. Например, аминокиселинна група, притежаваща алифатни странични вериги е глицин, аланин, валин, левцин и изолевцин; група аминокиселини, притежаващи алифатно-хидроксилни странични вериги е серин и треонин; група от аминокиселини, притежаващи амид-съдържащи странични вериги е аспаргин и глутамин; група от аминокиселини, притежаваща ароматни странични вериги е фенилаланин, тирозин и триптофан; група от аминокиселини, ····

притежаавщи базични странични вериги е лизин, аргинин и хистидин; и група от аминокиселини, притежаваща сярасъдържащи странични вериги е цистеин и метионин.

Предпочитани катнсервативни аминокиселинни заместващи групи са: валин-левцин-изолевцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспаргин

глутамин.

Както се дискутира в настоящето, наблюдавани минимални вариации в аминокиселинните последователности на антитела или имуноглобулинови молекули, се разглеждат като включени в настоящето изобретение, при положение, че вариациите в аминокиселинната последователност запазва поне 75%, по-предпочитано поне 80%, 90%, 95%, и найпредпочитано 99%. По-специално, се разглеждат консервативни аминокиселинни замествания. Консервативни замествания са тези, които се състоят вътре в едно семейство аминокиселини, които са свързани в тяхните странични вериги. Генетично кодираните аминокиселини обикновено се разделят на семейства : (1) киселинни = аспартат, глутамат; (2) основни = лизин, аргинин, хистидин; (3) не-полярни = аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаредени полярни = глицин, аспаргин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. По-предпочитани семества са : серин и треонин са алифатно-ходрокси семейство; аспаргин и глутамин са амид-съдържащо семейство; аланин, варин, левцин и изолевцин са алифатно семество; и фенилаланин, триптофан и тирозин са ароматно семейство. Например, разумно е да се очаква, че едно изолирано заместване на левцин с изолевцин или валин, на аспартат с • · • · • « • · ··

глутаман, на треонин със серин, или на подобно заместване на една аминокиселина със структурно свързана аминокиселина няма да има голям ефект върху свързването или върху свойствата на получената молекула, по-специално ако заместването не засяга аминокиселина в сайта на рамката. Дали една аминокиселина ще промени резултатите във функционалния пептид може лесно да се определи чрез изпробване на специфичната активност на полипептидното производно. Опитите са описани подробно в настоящето. Фрагменти или аналози на антитела или имуноглобулинови молекули лесно могат да се приготвят от специалистите в областа. Предпочитани амино- и карбокси-краища на фрагменти или аналози се срещат близо до местата за свързване на функционалните домени. Структурните и функционалните домени могат да се идентифицират чрез сравняване на данни от нуклеотидни и/или аминокиселинни последователности с обществени или лични бази данни за последователности. За предпочитане се използуват компютъризирани методи за сравнение за идентифициране мотиви на последователности или конформационни домени на предсказани протеини, които се срещат в други протеини или известни структури и/или функции. Известни са методи за идентифициране на протеинови последоваотелности, които са наганъти в известни три-измерни структури. Bowie et al. Science 253:164 30 (1991). И така, горните примери показват, че специалистите в областа могат да разпознаят мотиви на последователности и структурни конформации, които могат да се използуват за дефиниране на структурни и функционални домени, съгласно настоящето изобретение.

·· ····

··*

Предпочитани аминокиселинни замествания са тези, които : (1) намаляват чувствителността на протеолиза, (2) намаляват чувствителността на окисление, (3) променят афинитета на свързване при образуването на протеиновия комплекс, (4) променят афинитета на свързване и (5) предават или модифицират други физикохимични или функционални свойства на такива аналози. Аналозите могат да индуцират различни мутеини на последователности, различна от естествено срещаната в природата пептидна последователност. Например, © единични или множествени аминокиселинни замествания (за предпочитане консервативни аминокиселинни замествания) могат да се направят в естествено съществуващата в природата последователност (за предпочитане в участъка, на полипептида извън домена(ите), осъществяващи междумолекулни контакти. Консервативно аминокиселинно заместване не би трябвало съществено да промени структурните характеристики на родителската последователност (например, заместването на аминокиселина няма да се стреми да разруши спиралата, която се среща в родителската последователност или да прекъсне © друг вид вторични структури, които характеризират родителската последователност). Примери за техническиразпознати полипептидни вторични и третични структури са описани в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton. Ed.. W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introducrion to Protein Strurture (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991), всяко от които се включва в настоящето за справка.

·· ·· ····

Μ • * • · • · ·· ···

Терминът полипептиден фрагмент както се използува в настоящето, се отнася до полипептид, който притежава аминотерминална или и/или карбокси терминална делеция, но при който останалата аминокиселинна последователност е идентична на съответните позиции в естествено съществуващата в природата последователност изведена, например от пълна дължиина на сДНК последователност. Фрагментите, характерно са с дължина поне 5, 6, 8 или 10 аминокиселини, за предпочитане 14 аминокиселини дължина, ® по-предпочитано поне 20 аминокиселини дължина, обикновено поне 50 аминокиселини дължина, и даже по-предпочитано поне 70 аминокиселини дължина. Терминът аналог, както се използува в настоящето, се отнася зо полипептиди, които се състоят от сегмент от поне 25 аминокиселини, който е съществено идентичен на участък от изведената аминокиселинна последователност, и който притежава поне едно от следните свойства : (1) специфично свързване на CTLA4, при подходящи условия на свързване, (2) способност за блокиране на CTLA-4 свързването с неговити рецептори, или (3) © способност за инхибиране на CTLA-4 експресиращия клетъчен растеж in vitro или in vivo. Типично, полипептидните аналози включват консервативно аминокиселинно заместване (или прибавяне или делеция), като се има предвид естествено съществуващите в природата последователности. Аналозите, характерно са с дължина поне 20 аминокиселини, за предпочитане поне 50 аминокиселини дължина или по-дълги, и често могат да са толкова дълги колкото пълната дължина на естествено съществуващия в природата полипептид.

·· ·· • · · • · • · • · ···· ·· ·· ·· • ·· • ·· • · · ·· • · ·· ·· · • · · • · • · • · ·· · обикновено се използуват във аналози индустрия като не-пептидни лекарства с

Пептидните фармацевтичната качества, аналогични на тези на матричния пептид. Този вид не-пептидни съединения се наричат “пептидни миметици” или “пептидомиметици”. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), които са включени в настоящето за справка. Такива съединения често се разработват с помоща на компютъризирано молекулно моделиране. Пептидни миметици, които са структурно подобни на полезни терапевтични пептиди могат да се използуват за продуциране на еквивалентен терапевтичен или профилактичен ефет. Обикновено, пептидомиметиците са структурно подобни на полипептид парадигма (т.е. полипептид, който притежава биохимично свойство или фармакологична активност) като човешко антитяло, но притежава една или повече пептидни връзки по избор заместени от връзка, избрана от група, състояща се от : CH₂NH-. -CH₂S-, -СН₂-СН₂-, -CH=CH-(cis и trans), -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂-, и -CH₂SO-, чрез методи добре известни от състоянието на техниката. Системното заместване на една повече аминокиселини от консенсус последователност с аминокиселина от същия вид (например D-лизин вместо лизин) може да се използува за генериране на по-стабилни пептиди. Освен това, “принудителни” пептиди, които включват консенсус последователност или идентична по същество вариация на консенсус последователност може да се генерират по методи добре известни от състоянието на техниката (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), включено в настоящето за справка); например, чрез прибавяне на вътрешни или

DL·· ····

цистеинови остатъци, способни да образуват междумолекулни дисулфидни мостове, които циклизират пептида.

Антитяло или пептид(и) на антитяло се отнасят до интактно антитяло, или негов фрагмент на свързване, който се съревновава с интактното антитяло за специфично свързване. Фрагментите за свързване се получават чрез рекомбинантни ДНК техники, или чрез ензимно или химическо разцепване на интактните антитела. Фрагментите за свързване включват Fab, Fab'. F(ab')₂, Fv, и едноверижни антитела. Едно антитяло, различно от “биспецифично” или “бифункционално” антитяло се подразбира, че притежава всички свои сайтове за свързване идентични. Едно антитяло по същество инхибира адхезията на рецептора към противоположния рецептор, когато излишък от антитела намалява количеството на рецепторното свързване към противоположния рецептор с поне 20%, 40%, 60% или 80%, а по-често с повече от приблизително 85% (както е измерено при in vitro изследване за компететивно свързване).

Терминът епитоп включва която и да е протеинова детерминанта, способна на специфично свързване към имуноглобулин или Т-клетъчен рецептор. Епитопните детерминанти обикновено се състоят от химически активни повърхностни групирания на молекули, като аминокиселинни или захарни странични вериги и обикновено притежават специфични триизмерни структурни характеристики, както и специфични характеристики на заряда. За едно антитяло се казва, че специфично свързва антиген, когато константата на дисоцииране е < 1 μΜ, за предпочитане < 100 пМ и попредпочитано < 10 пМ.

·· ··«· • ·

Терминът средство се използува в настоящето да посочи химическо съединение, смес от химически съединения, биологична макромолекула или екстракт от биологични материали.

Както се използува в настоящето, термините маркер или белязан се отнасят до инкорпориране (включване) на откриваем маркер, например чрез вкрючване на маркирана с изотоп аминокиселина или прикрепяне към полипептид на ©биотинирани частици, които могат да бъдат отрити чрез маркиран авидин (например, стрептавидин, съдържащ флуоресцентен маркер или ензимна активност, която може да се установи чрез оптични или колориметрични методи). В някои случаи, веществото за белязане или маркерът може, също така, да е терапевтично средство. От състоянието на техниката са известни многобройни методи за маркиране на полипептиди и | гликопротеини, които могат д се използуват. Примери за j маркери за полипептиди включват, без да се ограничават до, j следните радиоизотопи или радионуклиди (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵N. ³⁵S, ⁹Ύ, Тс, ¹¹¹Ιη. ¹²⁵Ι, ¹³Ί), флуоресцентни маркери © (например, FITC, родамин, лантанидни фосфори), ензимни маркери (например, пероксидаза от ряпа, β-галактозидаза, луцифераза, алкална фосфатаза), хемилуминесценция, биотинилови групи, предварително определени полипептидни епитопи, разпознати от вторичен reporter (например, левцин j zipper двойки последователности, сайтове за свързване на j вторични антитела, домени за сасвързване на метали, епитопни tags (опашки). При някои варианти за изпълнение маркерите са 1 прикрепени чрез спейсерни-рамене с различна дължина за да намалят потенциалната стерео препятствие.

j.

I

Терминът фармацевтично или лекарсвано средство както се използува в настояще се отнася до химично съединение или състав, способно да индуцира желан терапевтичен ефект при правилно прилагане върху пациент. Други химични термини, използувани в настоящето се използуват съгласно конвенционалното използуване в състояниото на техниката, както се обяснява от The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), включено в настоящето за справка).

® Терминът антинеоплазмено средство както се използува в настояще се отнася до средство, притежаващо функционалните свойства да инхибира развитието или прогресирането на неоплазма при човека, по-специално злокечествени (ракови) лезии, като карцинома, саркома, лимфома или левкемия. Инихибирането на метастази често е свойство на антинеоплазмено средства.

Както се използува в настоящето, значително чист означава, че един вид обект присъства като преобладаващ вид (т.е., на моларна основа е по-голямо изобилие от който и да е О друг отделен вид в състава), а за предпочитане, пречистената по същество фракция представлява състав, в който даденият вид съдържа поне най-малко 50 процента (на моларна основа) от всички присъстващи макромолекулни видове. Обикновено, чист по същество състав трябва да включва повече от 80 процента от всички макромолекулни видове, присъстващи в състава, по-предпочитано повече от приблизително 85%, 90%, 95%, and 99%. По-предпочитано, посоченият вид се пречиства до есенциална хомогенност (замърсяващите видове не биха могли да се открият в състава чрез конвенционални методи за

откриване), като съставът се състои предимно от един вид макромолекули.

Терминът пациент включва човек и ветеринарни субекти.

Структура на антитялото

За основната структурна единица на антитялото е известно, че включва тетрамер. Всеки тетрамер се състои от две идентични двойки полипептидни вериги, като всяка двойка притежава една “лека” (приблизително 25 kDa) и една тежка” верига (приблизителна 50-70 kDa). Амино-терминалнаият участък на всяка от веригите включва вариабилна област от приблизително 100 до 110 или повече аминокиселини отговорни в началото за разпознаването на антигена. Карбокситерминалният участък от всяка верига дефинира константна област, отговорна в началото за ефекторните функции. Човешките леки вериги се класифицират като капа и ламбда леки вериги. Тежките вериги се класифицират като мю, делта, гама, алфа или епсилон, и дефинират изотопа на антитялото като IgM, IgD, IgG, IgA, и IgE, съответно. В леките и тежките вериги, вариабилните и константните области са свързани чрез J област от приблизително 12 или повече аминокиселини, като тежката верига включва също така D област от приблизително 10 или повече аминокиселини. Виж най-общо, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (включено в настоящето в своята цялост за всякаква цел). Вариабилните области на всяка двойка лека/тежка верига образуват стайта за свързване на антитялото.

Следователно, едно интактно IgG антитяло притежава два сайта за свързване. Изключение правят бифункционалните или

·· ·*·· J ·· • ·· • ·· • ·· ·· *

M • · • · • · «· биспецифичните антитела, двата сайта на свързване са едни и сащи.

Всички вериги показват същата обща структура от относително консервативни рамкови области (FR), свързани чрез три хипервариабилни области, наречени също така, комплементарни детерминантни области CDRs (КДО). CDRs от двете вериги на всяка двойка се подреждат чрез рамковите области, като се прави възможно свързването към специфичен епитоп. От N-края до С-края, и двете, леката и тежката верига включват домените FR1, CDR1, FR2, CDR2. FR3, CDR3, FR4. Опеделянето на аминокиселини към всеки домен е съгласно дефинициите на Kabat Sequences of Proteins Immunolological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Бифункционално или биспецифично антитяло представлява изкуствено, хибридно антитяло, притежаващо две различни двойки лека/тежка вериги и два различни сайта за свързване. Биспецифични антитела могат да се получат чрез © голямо разнообразие от методи, включително сливане на хибридоми или свързване на Fab' фрагменти. Виж например, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Освен това, биспецифични антитела могат да се получат като диатела (Holliger et al. “Diabodies”: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) или Janusins (Traunecker et al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10:36553659 (1991) и Traunecker et al. Janusin: new molecular design for

·· • ·	·· • ·	·· • ·	···· •
•	• ·	• ·	•
•	• · ·	• ·	9
• ····	• · ··	• · ··	• •

51.

• · • · • · ·«

bispecific reagents Продуцирането на

Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)). биспецифични антитела може да е

сравнително тежък работен процес в сравнение с продуцирането на конвенционални антитела и добива и степента на чистота обикновено са ниски за биспецифичните антитела. Биспецифичните антитела не съществуват под формата на фрагменти, притежаващи един единствен сайт за свйрзване (например, Fab, Fab', и Fv).

^w Човешки антитела и хуманизиране на антитела

Човешките антитела избягват някои от проблемите свързани с антителата, които притежават миши или плъши вариабилни и/или константни области. Присъствието на такива миши или плъши производни протеини може да доведе до бързото прочистване на антителата или може да доведе до генериране на имунен отговор на пациента срещу антитялото. С цел да се избегне използуването на производни миши или плъши антитела, се поставя постулата, че всеки може да развие хуманизирани антитела или да генерира напълно човешки © антитела чрез въвеждането на функция на човешко антитяло в гризач, така че гризачът да произвежда антитела, притежаващи пълни човешки последователности.

Човешки антитела

Способността да се клонират и да се реконструират човешки локуси с размер от мегабази в YACs и те да се въвеждат в мишата зародишна линия предоставя силен подход за изясняване на функционалните съставки на много голями или на прясно картирани локуси, така както и генериране на • · • · • a a *

полезни модели на човешки болести. Освен това, използуването на такава технология за заместване на миши локуси с тяхните човешки еквиваленти би могло да предостави уникално вникване в експресията и регулирането на човешките генни продукти по време на развитието, тяхната комуникация с други системи, и тяхното включване при индуцирането и прогресирането на заболяването.

Важно практическо приложение на тази стратегия представлява “хуманизирането” на миша хуморална имунна ® система. Въвеждането на локуси за човешки имуноглобулин (Ig) в мишка, в която ендогеннити Ig гени са били инактивирани предлага възможността да се изучават механизмите, подчертаващи експресирането и сглобяването на антитела, така както и тяхната роля при В-клетъчното развитие. Освен това, една такава стратегия може да предостави идеален източник за проучаване на напълно човешки моноклонални антитела (Mabs) един важен крайпътен камък при постигането на обещана антитяло-терапия при човешките заболявания. За напълно човешките антитела се очаква да намалят до минимум ф имугенността и алергичните отговори присъщи за миши или производни на миши Mabs, като по този начин нараства ефикастността и сигурността от прилагането на антитела. Използуването на напълно човешките антитела може да се очаква да предостави съществено предимство при лечението на хронични и рецидивиращи човешки заболявания, като възпалителни, автоимунни заболявания и рак, които изискват повторно прилагане на антитела.

Един подход за осъществяването на тази цел е да се проектират миши щамове с дефицит на продукция на миши •· ····

антитела с големи фрагменти на човешки Ig локуси при очакването, че такива мишки биха продуцирали широка гама от човешки антитела при отсъствие на миши антитела. Големите човешки Ig фрагменти биха предпазвали голямото разнообразие на вариабилни гени, така както и същинското регулиране и експресия на продукцията на антитела. Чрез използуването на мишата “машинария” за разнообразяването на антителата и селекцията и липсата на имунологична търпимост към човешки протеини, репертоарът на репродуцираните човешки антитела в ® тези миши щамове би трябвало да дава антитела с висок афинитет срещу който и да е антиген, представляващ интерес, включително човешки антигени. При използуване на ) хибридомната технология, антиген-специфичните човешки Mabs с желаната специфичност биха могли лесно да бъдат получени и селектирани.

Тази обща стратегия се демонстрира във връзка с нашето генериране на първите XenoMouse™ щамове, както е публикувано през 1994. Виж Green et al. Nature Genetics 7:13-21 j (1994). XenoMouse™ щамовете се проектират c изкуствени ί © хромозоми от дрожди (YACs), съдържащи фрагменти с размер ί 245 kb и 190 kb с конфигурация на зародишна линия на локуса ! на човешкта тежка верига и локуса на капа леката верига, съответно, които съдържали последователности на вариабилни и константни области от сърцевината. Id. Човешкият Ig, I съдържащ YACs доказа, че е съвместим с мишата система и за

Ί двете, пренареждане и експресия на антитела, и е способен на ! заместване за инактивираните Ig гени. Това бе демонстрирано чрез тяхната способност да индуцират В-клетъчното развитие, да продуцират един подобен на възрастен човешки репертоар .··..··. .··.···· ⁵·⁴

от напълно човешки антитела, и да генерират антигенспецифични човешки Mabs. Тези резултати подсказват, че въвеждането на голями участъци от локуси на човешки Ig, съдържащи по-голям брой V гени, допълнителни регураторни последователности и човешки Ig константни области трябва да рекапитулират по същество целия репертоар, който е характерен за човешкия хуморален отговор към инфекция и имунизация. Работата на Green et al. наскоро бе разширена до въвеждане на повече от приблизително 80% от човешкия репертоар на антитела чрез въвеждане на конфигурация на зародишна линия с мегабазов размер, YAC фрагменти на локусите на човешката тежка верига и локуси за капа лека верига, съответно, за получаване на XenoMouse™ мишка. Виж Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), и U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, подадена на 03. 12. 1996, чиито описания са включени в настоящето за справка.

Един такъв подход по-нататък се разглежда и очертава в U.S. Patent Application Serial Nos. 07/466,008, подадена на 12. 01. 1990, 07/610,515, подадена на 08. 11. 1990, 07/919,297, подадена на 24. 07. 1992, 07/922,649, подадена на 30. 07. 1992, подаден 08/031,801, подадена на 15. 03. 1993, 08/112,848, подаден на 27. 08. 1993, 08/234,145, подаден на 28. 04. 1994, 08/376,279, подаден на 20. 01. 1995, 08/430,938, 27. 04. 1995, 08/464,584, подаден на 05. 06. 1995, 08/464,582, подаден на 05. 06.1995, 08/463,191, подаден на 05. 06. 1995, 08/462,837. подаден на 05. 06. 1995, 08/486,853, подаден на 05. 06. 1995, 08/486,857, подаден на 05. 06. 1995, 08/486,859, подаден на 05. 06. 1995, 08/462,513, подаден на 05. 06. 1995, 08/724,752, ·» ····

подаден на 02. 10. 1996, и 08/759,620, подаден на 03. 12. 1996. Виж също Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Виж също European Patent No., EP 0 463 151 B1, публикация на приемането на 12. 06. 1996, International Patent Application No., WO 94/02602, публикувана на 03. 02. 1994, International Patent Application No.. WO 96/34096, публикувана на 31. 10. 1996, и WO 98/24893, публикувана на 11. 06. 1998. описанието на всяко едно от горе-посочените патенти, заявки и литературни справки са включени в настоящето за справка, в тяхната цялост.

Един алтернативен подход, включващ GenPharm International, Inc., използува минилокус подхода. При минилокус подхода, един екзогенен Ig локус се мимициране, чрез въвеждане на части (индивидуални гени) от Ig локуса. По този начин, един или повече V_H гени, един или повече D_H гени или един или повече J_H гени, мю константна област, и втора константна област (за предпочитане гама константна област) се образуват в структура за инсериране в животното. Този подход се описва в U.S. Patent No. 5,545,807 на Surani et al. and U.S. C Patent Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633, 425, 5,661,016,

5,770,429, 5,789,650, и 5,814,318 всички на Lonberg and Kay. U.S. Patent No. 5,591,669 на Krimpenfort и Bems, U.S. Patent Nos. 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 на Berns et al., и U.S. Patent No. 5,643,763 на Choi and Dunn, и GenPharm international U.S. Patent Application Serial Nos. 07/574,748, подаден на 29. 08. 1990, 07/575,962, подаден на 31. 08. 1990, 07/810,279, подаден на 17.

12. 1991, 07/853,408, подаден на 18. 03. 1992, 07/904,068, подаден на 23. 06. 1992, 07/990,860, подаден на 16. 12. 1992, 08/053,131, подаден на 26. 04. 1993, 08/096,762, подаден на

22. 07. 1993, 08/155,301, подаден на 18. 11. 1993, 08/161,739, подаден на 03 12. 1993, 08/165,699, подаден на 10. 12. 1993, 08/209,741, подаден на 09. 03. 1994, чиито описания са включени в настоящето в тяхната цялост за справка. Виж също European Patent No. 0 546 073 В1, International Patent Application Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, и WO 98/24884, чието описание е включено в своята цялост в настоящето за справка. Виж също Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993. Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), и Tuaillon et al., (1995). Fishwild et al., (1996), чието описание е включено в своята цялост в настоящето за справка.

Изобретателите от Surani et al., цитирани по-горе и назначени от Medical Research Counsel (the MRC), продуцираха трансгенна мишка притежаваща lg локус, чрез използуване на подхода на минилокуса. Изобретателите от GenPharm International work, цитирани по-горе, Lonberg and Kay, следвайки водачеството на настоящите изобретатели, предлагат инактивиране на ендогенния миши lg локус свързан със значителна дупликация на разработката на Surani et al.

Предимство на минилокус подхода е бързината, с която могат да се генерират и да се въведат в животни структурите, включващи участъци от lg локус. Въпреки това, съизмеримо, един значителен недостатък на минилокус подхода е това, че на теория недостатъчното разнобразие се въвежда чрез въвеждането на малък брой V, D, и J гени. Всъщност, изглежда, че публикуваните работи поддържат това мнение. Развитието на В-клетки и продуцирането на антитела от животни, получени

чрез използуване на минилокус подхода изглежда осакатен. Следователно, проучванията заобикалящи настоящето изобретение правилно са насочени към въвеждането на големи участъци от Ig локуса, с цел да се постигне по-голямо разнообрацзие и с цел да се възстанови имунния репертоар на животните.

Отговорите на човешко анти-мише антитяло (НАМА) са довели индустрията да изготвя химерни или иначе казано хуманизирани антитела. Докато химерните антитела притежават човешка константна област и миша вариабилна област, очаква се отговорите на някои човешки анти-химерни антитела (НАСА) да бъдат наблюдавани, по-специално при хронични или при мулти-дозирано използуване на антитяло. Следователно е желателно да се предоставят напълно човешки антитела срещу CTLA-4 с цел да се опорочи значението и/или ефектите от НАМА или НАСА отговора.

Хуманизиране и технологии за изобразяване

Както бе разгледано по-горе във връзка с генерирането на © човешко антитяло, налице са предимства за получаване на антитела с намалена имуногенност. В известна степен това може да се осъществи във връзка с техники на хуманизиране и техники на изобразяване, при използуване на подходящи библиотеки. Трябва да се отбележи, че мишите антитела или антителата от други видове могат да бъдат хуманизирани или приматизирани (отнасящо се до примати) при използуване на техники добре известни от състоянието на техниката. Виж например, Winter and Hanis Immunol Today 14:143-46 (1993) и Wright et al. Crit. Reviews in immunol. 12125-168 (1992).

·· ····

Представляващото интерес антитяло може да се проектира чрез рекомбинантни ДНК техники за да се заместят СН1, СН2, СНЗ, въртящ се домени и/или домена на рамката със съответната човешка последователност (виж WO 92/02190 и U.S. Patent Nos. 5,530.101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, и 5,777,085). От състояниета на техниката е известно, също така, използуването на lg сДНК за конструиране на химерни имуноглобулинови гени (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) и J. Immunol.139:3521 (1987)). иРНК се изолира от ® хибридома или от друга клетка, продуцираща антитялото и използувана за получаването на сДНК. сДНК, представляваща интерес може да се амплифицира чрез полимеразна верижна реакция, при използуване на специфични праймери (U.S. Pat. Nos. 4,683,195 и 4,683,202). Алтернативно се прави библиотека и се скринира за да се изолира интересуващата ни последователност. ДНК последователностт, кодираща вариабилната област на антитялото след това се слива към последователности на човешка константна област. Последователности на гени на човешки константни области © могат да бъдат открити в Rabat et al. (1991) Sequences of

Proteins of Immunological Interest, N.I.H. публикация no. 91-3242. Гени на човешка C област са директо достъпни от известни клонове. Изборът на изотоп ще бъде направляван от желаните ефекторни функции, като фиксиране на комплемента, или активност при антитяло-зависимата цитотоксичност. Предпочитани изотопи са lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Изключително предпочитани изотопи за антитела от изобретението са lgG2 и lgG4. Може да се използува всяка от константните области на човешка лека верига, капа или ламбда. Химерното, хуманизирано антитяло се експресира след това чрез конвенционални методи.

Фрагменти от антитяло, като Fv, F(ab')₂ и Fab могат да се получат чрез разцепване на интактния протеин, например чрез протеаза или химично разцепване. Алтернативно се проектира скъсен ген. Например, химерен ген, кодиращ участък от F(ab')₂ фрагмент би включвал ДНК последователности, кодиращи СН1 домена и въртящата се област от Н веригата, следвано от транслационен стоп кодон за получаване на скъсена молекула.

® При един подход, консенсус последователности, кодиращи

J областите на тежката и леката верига могат да се използуват за проектиране на олигонукпеотиди за използуване като праймери за въвеждане на полезни рестрикционни сайтове в J областта, за последващо свързване на сегменти на V областта към сегменти от човешка С област. сДНК на С областта може да бъде модифицирана чрез сайт-насочен мутагенез за да се постави рестрикционен сайт в аналогичната позиция на човешката последователност.

Експресионните вектори включват плазмиди, ретровируси, О козмиди, YACs, епизоми получени от EBV и други подобни.

Подходящ вектор е този, който кодира функционално пълен човешки СН или CL имуноглобулинова последователност, с подходящи рестрикционни сайтове, проектирани така, че която и да е VH или VL последователност лесно да може да се инсерира и експресира. В такъв вектор, снаждането обикновено се състои между донориия сайт за снаждане в инсерираната J област и акцепторния сайт за снаждане, предшестващ човешката С област, а също така при областите за снаждане, които се намират в човешките СН екзони. Полиаденилацията и завършването на транскрипцията става при нативните хромозомални сайтове в посока downstream от кодиращите области. Полученото химерно антитяло може да се прикачи към който и да е силен промотор, включително ретровирусни LTRs, например SV-40 ранен промотор, (Okayama et al. Mol. Cell, Bio, 3:280 (1983)), Rous sarcoma вирус LTR (German et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), и moloney миша левкемия вирус LTR (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)); нативни Ig промотори и др.

Други човешки антитела или антитела от други видове ® могат да бъдат генерирани чрез технологии от изображение-тип, включително, но без да се ограничава до, фагово изображение, ретровирусно изображение, рибозомално изображение и други техники, при използуване на техники добре известни от състоянието на техниката, и получените молекули могат да се подложат на допълнително зреене, като афинитетно зреене, като такива техники са добре известни от състоянието на техниката. Wright and Harris. Supra., Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (рибозомално изображение), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (фагово изображение), Scott Q TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992). Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), и U.S. Patent No. 5,733,743. Ако се използуват изобразяващи технологии за продуциране на антитела, които не са човешки, такива антитела могат да се хуманизират както е описано по-горе.

При използуване на тези техники могат да се генерират антитела за клетки експресиращи CTLA-4, самите CTLA-4, форми на CTLA-4, негови епитопи или пептиди, и експресионни библиотеки към тях (виж например U.S. Patent No. 5,703,057) който може след това да се скринира, както е описано по-горе, за активностите, описани по-горе.

Допълнителни критерии за антитяло-терапевтични средства

Както ще бъде оценено, обикновено не е желателно да се убиват клетките експресиращи CTLA4. По-точно, някои обикновено желаят да инхибират CTLA-4 свързването с ® лиганди, за да се облекчи Т-клетъчното down регулиране. Един от главните механизми чрез които антителата убиват клетки е чрез фиксиране на комплемента и участието на CDC. Константната област на едно антитяло играе важна роля във връзка със способността на антителата да фиксират комплемента и да участват в CDC. Така, обикновено се избира дали изотипа на антитялото да доставя способността за фиксиране на комплемента или не. В случая на настоящето изобретение, обикновено, както е споменато по-горе, не се предпочита да се използува антитяло, което убива клетки. © Съществува извесетн брой изотопи, които са способни да фиксират комплемента и CDC, включително, без ограничения, следните : миши IgM, миши lgG2a, миши lgG2b, миши lgG3, човешки IgM, човешки lgG1, и човешки lgG3. Тези изотипове, които не включват, без ограничения, човешки lgG2 и човешки lgG4.

Ще бъде оценено, че антителата, които са генерирани не се нуждаят първоначално да притежават определен желан изотип, а по-скоро антитялото, както е генерирано, може да притежава който и да е изотип и изотипът на антитялото може ·· ····

да се включи след това при използуване на конвенционални техники, които да са добре известни от състоянието на техниката. Такива техники включват използуването на директни рекомбинантни техники (виж например, U.S. Patent No. 4,816,397), техники на клетка-клетка сливане (виж например, U.S, Patent Application No. 08/730,639, подадена на 11. 10. 1996), измежду други.

При клетка-клетка техниката на сливане се изготвя миеломна или друга клетъчна линия, която притежава тежка верига с който и да е желан изотип и друга миеломна или друга клетъчна линия се изготвя, която притежава леката верига. След това, такива клетки могат да бъдат сляти и може да се избира клетъчна линия, експресираща интактно антитяло.

Като пример, по-голямата част от CTLA-4 антителата, разглеждани в настоящето е човешко анти-СТ1-А-4 lgG2 антитяло. Щом такива антитела притежават желаното свързване към CTLA-4 молекула, което и да е от такива антитела може веднага да се включи кам изотип, за да генерира човешки lgG4 изотип, например, докато все още притежава същата вариабилна област (която дефинира специфичността на антитялото и някои от неговите афинитети).

Съгласно това, като се генерират кандидати за антитяло, които отговарят на желаните “структурни” качества, както бе разисквано по-горе, те обикновено могат да бъдат доставени с поне някои допълнителни “фенкционални” качества, които са желани, чрез включването на изотипа.

Проектиране и създаване на други терапевтици

Съгласно настоящето изобретение и на основата на активността на антителата, които са получени и охарактеризиране в настоящето, с оглед CTLA-4, се улеснява проектирането на терапевтичните видове включващи други антитела, други антагонисти, или химически частици различни от антителата. Такива видове включват, без ограничение, антитела, притежаващи подобна активност на свързване или функция, успешни терапевтични антитела, като биспецифични антитела, имунотоксини, и радиобелязани терапевтици, генериране на пептидни терапевтици, генна терапия, поспециално интратела, антисенс терапевтични средства, и малки молекули. Освен това, както се разисква по-горе, ефекторното действие на антителата от изобретението може да бъде променено чрез изотипно включване към lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE, или IgM за различни терапевтични употреби.

Във връзка с генерирането на успешни антитялотерапевтични средства, когато фиксирането на комплемента е желано качество, може да е възможно да се избегне зависимостта върху комплемента за клетъчното убийство, чрез използуването например на биспецифични, имунотоксини, или радиобелязани терапевтици.

Във връзка с биспецифичните антитела, биспецифичните антитела, могат да бъдат генерирани да включват (i) две антитела, едно със специфичност към CTLA-4, а другото към втора молекула, които са конюгирани заедно, (ii) единично антитяло, което притежава една верига, специфична към CTLA4, и една втора верига, специфична към една втора молекула, или (iii) единично антитяло със специфичност към CTLA-4 и

другата молекула. Такива биспецифични антитела, могат да се генерират при използуване на добре известни техники, например, във връзка с (i) и (ii) виж например Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) и Wright and Harris, no-rope, и във връзка c (iii) виж например, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

Освен това могат също да се изготвят Kappabodies (капатела) (III et al. “Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain ® variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)), Minibodies (минитела) (Martin et al. “The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13:5303-9 (1994)), Diabodies (диатела) (Holliger et al. Diabodies”: small bivalent and bispecific antibody fragments PNAS USA 90:64446448 (1993)), или Janusins (Traunecker et al. Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells EMBO J 10:3655-3659 (1991) и Traunecker et al. Janusin: new molecular design for bispecific reagents Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)).

© По отношение на имунотоксините, антителата могат да бъдат модифицирани, така че да действат като имунотоксини, при използуване на добре известни техники от състоянието на техниката. Виж например, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Виж също така U.S. Patent No. 5,194,594. по отношение на изготвянето на радиобелязани антитела, такива модифицирани антитела също могат лесно да се приготвят, при използуване на техники, добре известни от състоянието на техниката. Виж например, Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven ····

(1996)). Виж също така U.S. Patent Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, и 5,697,902. Всеки от имунотоксините и от радиобелязаните молекули е в състояние да убие клетки експресиращи CTLA-4, а по-конкретно тези клетки, в които антителата от изобретението са ефективни.

По отношение на генерирането на терапевтични пептиди, чрез използуване на структурна информация свързана с CTLA4 и негови антитела, така че антителата от изобретението (както се разглежда по-долу във връзка с малките молекули) или скриниране на пептидна банки, могат да се генерират терапевтични пептиди, които са насочени срещу CTLA-4. Проектирането и скринирането на пептидни терапевтици се разглежда във връзка с Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis

BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Имунотоксини и радиобелязани молекули могат да се изготвят, също така, и по подобен начин, във връзка с пептидни частици, както се разглежда по-горе, по отношение на антитела.

Важна информация, свързана със свързването на едно антитяло към един антиген може да се събере чрез експерименти с фагово изобразяване. Такива експерименти обикновено се провеждат чрез заснимане на фагова библиотека, експресираща случайни пептиди за свързване с антителата от изобретението, за да се определи дали могат да се изолират пептиди, които се свързват. При успех, някои информации за изотопи могат да се съберат от пептидите, които се свързват.

• 9

36.

Обикновено, фагови библиотеки експресиращи случайни пептиди могат да се доставят от New England Biolabs (7-мерни и 12-мерни библиотеки, Ph.D.-7 пептиден 7-мерен Library Kit и Ph.D.-12 пептиден 12-мерен Library Kit, съответно) на основата на бактериофаг М13 система. 7-мерната библиотека представлява разнообразие от приблизително 2.0 х 10⁹ независими клона , които представляват повечето, ако не и всички, от 20⁷ =1.28х10⁹ възможни 7-мерни последователности. 12-мерната библиотека съдържа приблизително 1.9 х 10⁹ независими клона и представляват една съвсем малка част от потенциалното пространство на последователностите от 20¹² = 4.1 х 10¹⁵ 12-мерни последователности. Всяка от 7-мерните и 12-мерните библиотеки са заснети или се скринират съгласно препоръките на производителя, в които блюдата се покриват с антитяло за залавяне на необходимото антитяло (кози античовешко IgG Fc за едно IgG антитяло, например), следвано от промиване. Свързаните фаги се елюират с 0.2 М глицин-HCI, pH

2.2. След 3 кръга на селекция/амплифициране при постоянно строги условия (0.5% Tween), при използуване на ДНК секвениране, могат да се охарактеризират клонове от библиотеките, които влизат в реакция с едно или повече от антителата. Реактивността на пептидите може да се определи чрез ELISA. За допълнителни разяснения на анализа на епитопите на пептидите виж също Scott, J.K. and Smith, G.P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990); Felici et al. J, Mol. Biol. 222:301-310 (1991), и Kuwabara et al. Nature Biotechnology 15:74-78 (1997).

Проектирането на гени и/или антисенс терапевтични средства чрез конвенционални техники се улеснява, също така, ···· &7.

• · • · • · ·· ··· чрез настоящето изобретение. Такива разновидности могат да се използуват за модулиране на функцията на CTLA-4. В тази връзка, антителата от настоящето изобретение улесняват проектирането и използуването на функционални изследвания, свързани с това. Проектирането и стратегията за антисенс терапевтични средства се разглежда детайлно в International Patent Application No. WO 94/29444. Проектирането и стратегиите за генна терапия са добре известни. Въпреки това, в частност използуването на техники на генна терапия, включващи интратела биха могли да докажат своето изключително предимство. Виж например, Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) and Marasco Gene Therapy 4:1115 (1997). Обикновеното проектиране на, и разсъждения, свързани с генната терапия, също се разглеждат в International Patent Application No. WO 97/38137. Генетичен материал, кодиращ антитяло от изобретението (като 4.1.1, 4.8.1, или 6.1.1, или други) може да бъде включен в подходяща експресонна система (било то вирусна, атенюирана вирусна, не-вирусна, гола (непокрита), или някаква друга) и да се приложат на гостоприемник за vivo генериране на антитялото в гостоприемника.

Могат да се имат предвид и терапевтици с малки молекули, съгласно настоящето изобретение. Лекарствените средства могат да се проектират, така че да модулират активността на CTLA-4, основаващи се на настоящето изобретение. Знанията извлечени от структурата на CTLA-4 молекулата и нейните взаимодействия с други молекули, съгласно настоящето изобретение, като антителата от изобретението CD28, В7, В7-1, В7-2, и други, могат да се

използуват за рационално проектиране на допълнителни терапевтични разновидности. В тази връзка, рационалните техники за проектиране на лекарствени средства като рьонтгенов-кристалографски анализ, компютърно подпомогнато молекулярно моделиране (САММ), количествена и качествена връзка между структура и активност (QSAR), и подобни технологии могат да се използуват за фокусиране на усилията за откриване на лекарствени средства. Рационалното проектиране дава възможност за предсказване на протеините или синтетичните структури, които могат да взаимодействат с молекулата или нейни специфични форми, които могат да бъдат използувани за модифициране или модулиране на активността на CTLA-4. Такива структури могат да бъдат синтезирани химично или да се експресират в биологични системи. Този подход се разглежда в Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Всъщност, рационалното проектиране на молекули (било то пептиди, пептидомиметици, малки молекули, или други подобни) на основата на известни или обрисувани, структура-активност взаимодействие с други молекули (като антитела, съгласно изобретението) вече е станало рутинно. Виж например, Fry et et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proc Natl Acad Sci U S A 95:12022-7 (1998); Hoffman et al. A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain J Mol Biol 282:195-208 (1998); Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p38-a case study Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997); Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorylation •ft ··♦· ft ft

M ft ft ft ft ft ft ft • ft sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure Biochem J 322:927-35 (1997); Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J Med Chem 40:1130-5 (1997); Mandel et al. ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling Nat Biotechnol 14:323-8 (1996); Monfardini et al. Rational design, analysis, and potential utility of GM-CSF antagonists Proc Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996); Furet et al. “Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995).

Освен това, комби натори и библиотеки могат да се проектират и да се синтезират и да се използуват при скрининг програми, като високо проходими скрининг усилия.

Терапевтично прилагане и получаване на лекарствени форми

Трябва да се вземе предвид, че прилагането на терапевтични части, съгласно изобретението ще е свързано с подходящи носители, пълнители, и други средства, които се включват в лекарствените форми за предоставяне на подобрен трасфер, доставка, поносимост, и други подобни. Голям брой лекарствени форми може да се открие в известният на всичики фармацевтични химици: Remington's Pharmaceutical Sciences (15^th ed. Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), по-точно Глава 87 от Blaug, Seymour, пак там. Тези форми включват, например, прахове, пасти, мазила, желета, парафини, масла, липиди, липиди (катйонни или анйонни), съдържащи везикули (като Lipofectin™), ДНК конюгати, безводни абсорбционни пасти,

·«	··	• *
* ·	• ·	• ·
•	• ·	• ·
•	• ·	• · ·
•	• ·	• ·
····	• ·	··

····

маслено водни и водно маслени емулсии, емулсионни карбовакс (полиетиленгликоли с различно молекулно тегло), полутвърди гелове, и полутвърди смеси, съдържащи карбовакс. Която и да е от горе-посочените смеси може да е подходяща за лечения и терапии, съгласно настоящетно изобретение, при условие, че активната съставка във формата не се активира от формата и формата е физиологично съвместима и поносима с пътя на прилагане. Виж също, Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) и цитатите в нея за допълнителна информация свързана с пълнителите и носителите, добре известни на фармацевтичните химици.

Изготвяне на антитела

Антителата, съгласно изобретението, за предпочитне се изготвят при използуване на трансгенни мишки, които притежават значителен участък от човешкото антитяло, продуциращо инсериран геном, но което е станало с недостатъчност (дефицит) за производството на ендогенни © миши антитела. След това, такива мишки са в състояние да произвеждат молекули човешки имуноглобулин и антитела, и имат недостатъчност при производството на молекули миши имуноглобулин и антитела. Използуваните техники за постигане на това са описани в патентити, заявки за патенти и литературни източници, описани в предшестващото състояние на техниката на настноящето. Въпреки това, по-спациално, предпочитан вариант за изпълнение на трансгенно продуциране на мишки и антитела от тях, се описва в U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, подаден на 03. 12. 1996, чието описание е ·· ·· ♦···

включено в настоящето за справка. Виж също така, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), чието описание е включено в настоящето за справка.

Чрез използуване на такива технологии се продуцирират изцяло човешки моноклонални антитела за разнообразни антигени. Преди всичко се имунизират XenoMouse™ миши линии с антиген, представляващ интерес, получиха се лимфатичните клетки (като В-клетки) от мишката, която експресира антитела, сливат се такива получени клетки с ® клетнъчна линия от миелоиден тип за да се получат обезсмъртени хибридомни клетъчни линии, и такива хибридомни клетки се скринират и се селекционират за да се идентифицират хибридомните клетъчни линии, които продуцират антитела, специфични за представляващия интерес антиген. Тези техники се ползуват съгласно настоящето изобретение, за изготвяне на антитяло, специфично за CTLA-4. В настоящето се описва получаването на мултиплени хибридомни клетъчни линии, които продуцират антитела, специфични за CTLA-4. Представя се, освен това, © охарактеризиране на антитела, продуцирани чрез такива клетъчни линии, включително нуклеотиден и аминокиселинен анализ, на тежката и леката вериги на подобно антитяло.

Антителата, получени от хибридомни клетъчни линии, разисквани в настоящето, са означени като 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1,

4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и

12.9.1.1. Всяко от антителата, произведени чрез горепосочените клетъчни линии са или изцяло човешки lgG2 или lgG4 тежки вериги с капа леки вериги. Най-общо, антитела съгласно изобретението, притежават много висок афинитет, ···

72.

• ·

9 · характерно притежават Kd's от приблизително 10'⁹ до приблизително 10~¹¹ М, при измерване било то на твърдата фаза или на разтворимата фаза.

Както ще бъде отбелязано, антителата, съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат експресирани в клетъчни линии или други хибридомни клетъчни линии. Последователностите, кодиращи сДНК или геномни клонове за определеното антитяло, могат да се използуват за ©трансформиране на подходящи клетки гостоприемник на бозайник или на небозайник. Трансформирането може да се проведе по който и да е от известните методи за въвеждане на нуклеотиди в клетка гостоприемник, например, пакетиране на полинуклеотида във вирус (или във вирусен вектор) и трансдукция на клетката гостоприемник с вирус (или с вектор) или чрез процедури за трансфектиране, известни от предшестващото състояние на техниката, както се изяснява от U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, и 4,959,455 (които патенти са включени в настоящето за справка). Използуваният процес за трансформиране зависи от бозайника, © който трябва да се трансформира. Методи за въвеждане на хетероложни полинуклеотиди в клетки на бозайник са добре известни от състоянието на техниката и включват, но без да се ограничачават до, медиирана от декстран трансфекция, утаяване в калциев фосфат, трансфекция медиирана от полибрен, протопластно сливане, електропорация, бомбардиране с частици, инкапсулиране на полинуклеотида в липозоми, пептидни конюгати, дендримери, и директно микроинжектиране на ДНК в ядрата.

7«. .

····

Клетъчните на бозайници, достъпни като линии за експресиране са добре известни от състояние на техниката и включват гостоприемници предшестващото многобройни обезсмъртени клетъчни линии, достъпни от American Type Culture Collection (ATCC), включително, но без да се ограничава до, клетки от яйчник на морско свинче (СНО), NSO_o, HeLa клетки, клетки от бъбрек на бебе хамстер (ВНК), клетки от бъбрек от маймуна (COS), човешки хепатоцелуларни карциномни клетки (например Hep G2), и известен брой други клетъчни линии. Клетки от не-бозайници, включващи, но без да се ограничават до, дрожди, насекоми и растения също могат да се използуват за експресиране на рекомбинантни антитела. Сайт-насочен мутагенез на СН2 домена на антитялото за елиминиране на гликозилирането може да е предпочитано, с цел да се предотваратят промените както в имуногенността, фармакокинетиката, и/или ефекторните функци, резултат от нечовешкото гликозилиране. Методите на експресиране се избират чрез определяне на това, коя система генерира найвисокото ниво на експресия и продуцира антитела с конститутивни CTLA-4 свързващи свойства.

Освен това, експресирането на антитела от изобретението (или други тяхни частици) от производсвените клетъчни линии може да се усили при използуавне на някои известни техники. Например, глутамин синтетазната и DHFR гениите експресионни системи са обикновени подходи за усилване на експпресията при някои обстоятелства. Високо експресиращите клетъчни клонове могат да бъдат идентифицирани при използуване на конвенционални техники, като клониране при пределно разреждане и Microdrop технология. GS системата се разисква в цялост или в частност във връзка с Европейски Патент Nos. 0 216 846, 0 256 055, и 0 323 997 и заявка за Европейски Патент 89303964.4.

Антителата от изобретението могат също така, да бъдат продуцирарни трансгенетично чрез генериране на бозайник или на растение, което да е трансгенетично за интересуващите ни последователности на тежките и леките вериги на имуноглобулина и продуциране на антитялото във вид за получаване от тях. Във връзка с трансгенетичното получаване в ® бозайници, антителата могат да се продуцират в, и да се получат от, млеко на кози, крави, или други бозайници. Виж също така, U.S. Patent Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, и 5,741,957.

Антитела, съгласно настоящето изобретение, са били анализирани структурално и функционално. Във връзка със структурите на антителата, аминокиселинните последователости на тежката и капа леката вериги са били предсказани на основата на сДНК последователности, получени чрез RT-PCR от хибридоми. Виж пример 3 и 4 и фигури 1-8. С Провежда се също N-терминално секвениране на антителата, в потвърждение на резултатите, разглеждани в Примери 3 и 4. Виж Пример 5 и фигура 9. Провеждат се кинетични анализи на антителата за определяне на афинитетите. Виж Пример 2. Антитела, съгласно изобретението (и по-конкретно 4.1.1, 4.8.1, и

6.1.1 антитела от изобретението) притежават високи афинитета (4.1.1:1.63 х Ю¹⁰ I/M; 4.8.1:3.54 х 10¹° Ι/М; и 6.1.1:7.2 х 10⁹ I/M). Други антитела се анализират чрез изоелектрично фокусиране (IEF), редуцираща гелелектлофореза (SDS-PAGE), гелна хроматография/мас-спектроскопия, и масспектроскопия и се

изследва производството на антитела чрез хибридоми. Виж Пример 6 и фигура 10.

Във връзка с функционалните анализи на антителата, съгласно настоящето изобретение, такива антитела доказват, че са силни инхибитори на CTLA-4 и на неговото свързване към неговите лиганди от молекули на В7 семейството. Например, показано е за антитела, съгласно настоящето изобретение, че блокират CTLA-4 свързването или към В7-1 или към В7-2. Виж Пример 7. Всъщност, много от антителата, съгласно изобретението, притежават наномоларно и субнаномоларно IC50S, с оглед инхибирането на CTLA-4 свързването към В7-1 В7-

2. Антителата от изобретението притижават осван това, селективност за CTLA-4, при сравнение с CD28, CD44, В7-2, или hlgG1. Виж Пример 8. селективността представлява отношение, което отразява степента на преференциално свързване на молекула с едно първо средство, при сравняване с молекулите, свързващи се с едно второ средство, и по желание с други молекули. В настоящето, селективността се отнася до степента на преференциално свързване на антитяло от изобретението © към CTLA-4, като се сравни със свързването на антитялото към други молекули, като CD28, CD44, В7-2, или hlgG1. Стойностите на селективност на антителата от изобретението от над 500:1 са обикновено срещаните стойности. За антителата от изобретението е показано също, че индуцират или засилват експресията на някои цитокини (като IL-2 и IFN-γ) от култивирани Т клетки в модел на Т клетъчни бласти. Виж Пример 9 и 10 и фигури 12-17. Освен това се очаква антителата от изобретението да инхибират растежа на тумори в подходящи in

·· »··· • · ·

·· ·

7β.

• · • · • · ·· vivo туморни модели. Проектирането на тези модели се разглежда в Пример 11 и 12.

Резултатите, демонстрирани съгласно настоящето изобретение, показват че антителата от настоящето изобретение притежават известни качества, които могат да направят настоящите антитела по-ефикасни от обикновените терапевтични антитела срещу CTLA-4.

По-специално, 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1 антитела от изобретението притежават силно желани качества. Тяхните ® структурни характеристики, функции и активности предоставят критерии, които улесняват проектирането или избора на допълнителни антитела или други молекули, както се разглежда по-горе. Такива критерии включват един от следните критерии :

Способност да се съревновава за CTLA-4 с едно или повече от антителата от изобретението;

Подобна специфичност на свързване към CTLA-4, както едно или повече от антителата от изобретението;

Афинитет на свързване към CTLA-4 от приблизително 10' ⁹ М или повече и за предпочитане от приблизително Ю'¹⁰ М или С повече;

Не влиза в кръстосана реакция с CTLA-4 на низши бозайници, включително мишка, плъх, или заек и за предпочитане CTLA-4 на мишка и плъх;

Влиза в кръстосана реакция с CTLA-4 на примати, включително за предпочитане, CTLA-4 на cynomolgous и rhesus;

Селективност за CTLA-4 над CD28, В7-2, CD44, или hlgG1 от поне приблизително 100:1 или повече, и за предпочитане от приблизително 300, 400 или 500:1 или повече;

·· ·· • · · · ·· • · • · • · • · ··

7·7.

• · • · • · ·· ·· ···

Едно 1С₅о при блокиране на CTLA-4 свързването към В7-2 от приблизително 100 пМ или по-ниско, а за предпочитане 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, или 0,38 пМ или па-ниско;

Едно 1С₅₀ при блокиране на CTLA-4 свързването към В7-1 от приблизително 100 пМ или по-ниско, а за предпочитане 5, 4.

3. 2, 1. 0.5, or 0.50 пМ или по-ниско;

Едно засилване на производството на цитокини при едно или повече in vitro изследвания, например :

Едно засилване на производството на IL-2 при Т клетъчно • бласт/Raji изследването от приблизително 500 pg/ml или повече, и за предпочитане 750, 1000, 1500, 2000, 3000 или 3846 pg/ml или повече;

Едно засилване на производството на IFN-γ при Т клетъчно бласт/Raji изследването от приблизително 500 pg/ml или повече, и за предпочитане 750, 1000 или 1233 pg/ml или повече; или

Едно засилване на производството на IL-2 при изследването с hPBMC или суперантиген от пълна кръв от 500 pg/ml или повече и за предпочитане 750, 1000, 1200, или 1511 pg/ml или повече, при експресиране по друг начин е желателно ф производството на IL-2 да се засили с приблизително 30, 35, 40,

45, 50 процента или повече, по отношение на контролата в изследването.

Очаква се антителата (или молекулите, проектирани или синтезирани от тях), притежаващи едно или повече от тези качества да притежават подобна ефикастност към антителата, описани в настоящето изобретение.

Разглежданите по-горе функционални свойства често могат да са резултат от свързването към и инхибирането на CTLA-4 от молекула (те., антитяло, фрагмент на антитяло, ·· ·· .......78

пептид, или малка молекула) по подобен начин като едно антитяло от изобретението (те., свързване към същия или подобен епитоп на CTLA-4 молекула). Молекулата може да бъде или директно приложена (т.е., директно прилагане върху пациент на такива молекули). Или алтернативно, молекулата може да бъде “приложена” индиректно (т.е., пептид или друго подобно, което предизвиква имунен отговор в пациент (подобно ваксиниране), при което имунният отговор включва генериране на антитела, които се свързват към същия или подобен епитоп или антитяло или фрагмент, който е получен in situ след прилагане на генетичен материал, който кодира такива антитела или тяхни фрагменти, които се свързват към същия или подобен епитоп). Така, може да се оцени, че епитопът върху CTLA-4, към които антитела от изобретението се свързват, може да е полезен във връзка с приготвянето и/или проектирането на терапевтици, съгласно изобретението. При проектирането на лекарствени средства, често е полезна също негативната информация (т.е., полезен е факта, че едно антитяло, което се свързва към CTLA-4 изглежда не се свързва към епитоп, който © действа като инхибитор на CTLA-4). И така, епитопът, към който се свързват антителата от изобретението, което не води до желаната функционалност също може да бъде много полезно. В съответствие, се разглеждат във връзка с настоящето изобретение и молекули (и по-специално антитела), които се свързват към същите или подобни епитопи като антитела от изобретението.

Освен това, фактът, че антитела от изобртението и епитопи, към които те се свързват се имат предвид в изобретението, ние проведохме известни предварителни изследвания за картиране на някои антитела, съгласно което, изобретението и по-специално 4.1.1 и 11.2.1 антителата от изобретението.

Като първа стъпка, бяха проведени BIAcore съревнователни изследвания за генериране на груба карта за свързване между някои антитела от изобретението във връзка с тяхната способност да се съревновават за свързване към CTLA-

4. Към тази край, CTLA-4 се свързва към BIAcore chip и едно първо антитяло, при условия на насищане, свързва се към него и се измерва съревнованието между последващите вторични антитела, свързващи към CTLA-4. Тези техники дават възможност за генериране на груба карта, към което семейство могат да се класифицират антителата.

Чрез този метод се опредля, че някои антитела, съгласно изобретението биха могли да бъдат категоризирани като попадащи в следните категории епитопи:

·· ·· ·· ···· 4J0 • · · · ·· · · · · ···· · · ·· · ·· ···

Категория	антитела	Съревнование за CTLA-4 свързване
А	В01М*	Свободно кръстосано съревновние между тях; кръстосано съревнование с категория В; Известна кръстосано съревнование с категория D
В02М**
В	4.1.1	Свободно кръстосано съревновние между тях; кръстосано съревнование с категория А, С и категория D;
4.13.1
С	6.1.1	Свободно кръстосано съревновние между тях; кръстосано съревнование с категория В и категория D
3.1.1
4.8.1
11.2.1
11.6.1
11.7.1
D	4.14.3	Свободно кръстосано съревновние между категории С и В; известно кръстосано съревнование с категория А
Е	4.9.1	BNI3*** блокира 4.9.1 свързването към CTLA-4, но не и обратното
BNI3***

(*) (**) доставя се от Biostride. (***) доставя се от Pharmingen.

Като следващ етап, се стараем да се определим дали антителата от изобретението разпознават линеен епитоп върху CTLA-4 при редуциращи и нерудиращи условия върху Western блот. Наблюдава се, че нито един от 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1, или 11.2.1 антителата от изобретението изглежда не разпознават редуцирана форма на CTLA-4 върху Western блот. Съгласно това, изглежда вероятно епитопът, към който се свързва всеки от тези епитопи да не е линеен епитоп, а повероятно е да е конформационен епитоп, структурата на който да е била анулирана при редуциращи условия.

Следователно решихме да определим дали можем да научим за остатъците в CTLA-4 молекулата, които са важни за свързването на антителата от изобретението. По начин, по който използуваме, бяха проведени кинетични изпитания граничния обхват между CTLA-4 и две силно консервативни CTLA-4 молекули от примати (cynomologous и мармозетка CTLA4). BIAcore изследвания показват, че 4.1.1 антитяло от настоящето изобретение се свързва към човешко, cynomologous и от мармозетка CTLA-4 в същата степен. Въпреки това, с оглед на граничните обхвати (афинитет), 4.1.1 антитялото притежава най-високия афинитет (най-бавен граничния обхват) за хора, по-бърз граничния обхват за cynomologous, и много по-бърз граничния обхват за мармозетка. От друга страна 11.2.1 антитялото от изобретението се свързва към CTLA-4 от човек, cynomologous и мармозетка при приблизително същата скорост и притежава приблизително същия относителен граничен обхват за всеки от трите. Тази информация показва, освен това, че 4.1.1 и 11.2.1 антителата от изобретенито се свързват към различни епитопи върху CTLA-4.

За допълнително изследване дали епитопа, към който се свързват категория В и С антитела от изобретението, проведохе някои изследвания за сайт-насочен мутагенез. CTLA-4 от мармозетка притежават две важни промяни при остатъци 105 и 106, отнасящи се до човешки CTLA-4. Такива разлики са промяната на левцин в метионин при остатък 105, и промяната на гилцин в серин при остатък 106. В съгласие, бе мутирана сДНК, кодираща човешки CTLA4 да кодира мутиран CTLA4, притежаващ L105M и G106S промените. Хомоложният заместващ мутант CTLA4 не засяга свързнването на B7.2-lgG1 слятия протеин. Освен това, свързването с 11.2.1 антитялото от изобретението не е засегнато. Въпреки това, една такава молекула значително се инхибира в своята способност да се свързва с 4.1.1 антитялото от изобретението (подобно на мармозетките). След това, се мутира сДНК, кодираща CTLA4 на мармозетки за създаване на мутантен CTLA4 на мармозетки, S106G промяна. Такава промяна води до възстановяване на стабилното свързване между 4.1.1 антитялото и мутантния CTLA4 от мармозетка. Освен това, се мутира сДНК, кодираща CTLA4 от мармозетка за създаване на мутантен CTLA4 от мармозетка, който да притежава M105L промяна. Тази промяна частично възстановява свързването между 4.1.1 антитялото и мутантния CTLA4.

Всеки от тази категория В до D антитела от изобретението изглежда притежават подобни функционални свойства и изглежда, че притежават потенциала да действат като силно анти-СТ1_А4 терапевтично средство. Освен това, всяка от молекулите потвърждава кръстосаното съревнование при тяхното свързване към CTLA4. Въпреки това, както се

·· ·· • · · ·	• · *··· • · ·	• · · ·
• · · · · ·	·· ·	·· ···

наблюдава от горните разсъждения, всяка от молекулите в различните категории изглежда, че се свързва към различни конформационни епитопи върху CTLA4.

От горното става ясно, че информацията за епитопа, разглеждана по-горе, показва, че антитела (или други молекули, както се разглежда по-горе), които влизат в кръстосана реакция с антитела от изобретението вероятно ще притежават терапевтичен потенциал, съгласно настоящето изобретение. Очаква се освен това, антитела (или други молекули, както се ® разглежда по-горе), които се съревновават кръстосано с антитела от изобретението (т.е., се съревновават кръстосано с категория В, С и/или D антитела) вероятно ще притежават допълнителен терапевтичен потенциал, съгласно настоящето изобретение. Очаква се, освен това, антитела (или други молекули, както се разглежда по-горе), които се съревновават кръстосано с антитела от изобретението (т.е., се съревновават кръстосано с антитела от категория В, С и/или D антитела), и които (i) не са редуцирани при тяхното свързване към CTLA4 от мармозетка (подобно на 11.2.1 антитялото) или (й) са © редуцирани при тяхното свързване към CTLA4 от мармозетка (подобно на 4.1.1 антитялото) вероятно ще има вероятно известен допълнителен потенциал, съгласно настоящето изобретение. Антитела (или други молекули, както се разглежда по-горе), които се съревновават с категория А и Е също могат да притежават известен терапевтичен потенциал.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Следните примери, включително проведените изследвания и постигнатите резултати са представени единствено с илюстративна цел и не трябва да се считнат като ограничаващи настоящето изобретение.

ПРИМЕР 1

Генериране на анти- CTLA-4-антитяло продуциращо хибридоми

Антителата на изобретението се изготвят, подбират и изследват съгласно настоящия пример.

Изготвяне на антиген: изготвят се три отделни имуногена за имунизиране на XenoMouse™ мишки: (i) CTLA-4-lgG слят протеин, (ii) CTLA-4 пептид, и (iii) 300.19 миши лимфомни клетки, трансфектирани с мутант на CTLA-4 (Y201V), който конститутивно се експресира върху клетъчната повърхност.

(i) CTLA-4-lgG1 слят протеин:

Конструиране на експресионен вектор:

сДНК, кодираща зрелия екстрацелуларен домен на CTLA4 се амплифицира чрез PCR от човешка тимусна сДНК библиотека (Clontech) при използуване на праймери, проектирани за публикувана последователност (Eur: J Immunol 18:1901-1905 (1988)). Фрагментът се субклонира в pSR5, Sindbis вирусен експресионен плазмид (In Vitrogen), между сигналия пептид на човешки онкостатин М и човешки IgG гама 1 (lgG1) СН1/СН2/СНЗ домени. Слятият протеин не съдържа въртящ се ·· ·· ·· ···· »85 • · · · · · · · · ··· · · · · · · ···· ·· ·· · ·· ··· домен, но съдържа цистеин 120 в екстрацелуларния домен

CTLA-4 за образуване на ковалентен димер. Полученият вектор се нарича CTLA-4-lgG1/pSR5. Пълната CTLA-4-lgG1 сДНК във вектора се потвърждава секвенционно и в двете вериги. Аминокиселинната последователност на CTLA4-lg е показана по-долу. Зрялият екстрацелуларен домен за CD44 се i амплифицира чрез PCR от човешка лимфоцитна библиотека ί

(Clontech) и се субклонира в pSinRepS за генериране на I контролен протеин с идентична IgG 1 опашка.

Ф

OM-CTLA4-lgG1 слят протеин:

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAWLASSRGIASF

VCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD

SICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNG

TQIYVIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL | HQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS j RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD j О SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGK ί

j Подчертано: сигнален пептид ] Удебелено: CTLA4 екстрацелуларен домен сДНК-ите за зрелия екстрацелуларен домен CD28 се j амплифицират чрез PCR от човешка лимфоцитна (Clontech) ] след което се субклонират в pCDM8 (J. Immunol. 151: 5261-71 (1993)) за продуциране на човешки lgG1 слят протеин, съдържащ и двете - областта за разцепване на тромбин, както и въртящите се области. CTLA4 от мармозетка, Cynomologous, и Rhesus се клонират от иРНК, изолирана от PBMCs стимулирани с РНА, при използуване на стандартни техники на дегенериран PCR. Секвенирането показва, че амино-киселинните последователности на rhesus и cynomologous са идентични, с три разлики от зрелия човешки CTLA4 екстрацелуларен домен (S13N, I17T и L105M). Мармозетките проявяват десет разлики от зрелия CTLA4 екстрацелуларен домен (V21A, V33I, А41Т, A51G, ® 541, S71F, Q75K, Т88М, L105M и G106S). Използува се сайтнасочен мутагенез за постигане на единични точкови мутации на всички аминокиселини, които са различни в CTLA4 на мармозетка, за картиране на аминокиселините важни за взаимодействието на антителата с човешки CTLA4-lgG. Мутации на CTLA-IgG от човек и мармозетка за епитопно картиране се генерират чрез маркери за съответствие на сайт-насочен мутагенез (Promega). IgG слятите протеини се продуцират чрез преходно трансфектиране на Cos7 клетки и пречистване, при използуване на стандартни Protein А техники. Мутантните © CTLA4-lgG протеини се определят за свързване към антитела чрез имуноглобулин и при използуване на BIAcore анализи.

Експресия/пречистване на рекомбинантен протеин:

Рекомбинантен sindbis вирус се генерира чрез електропорация (Gibco) на клетки от бъбрек на бебе хамстер с SP6 in vitro транскрибирани CTLA-4-lgG1/pSR5 иРНК и DH-26S хелперна иРНК, както е описано от InVitrogen. Четиридесет и осем часа по-късно се получава рекомбинантен вирус и се титрува за оптимална експресия на протеин в клетки от яйчник мМИ ·· ·· ·· ···· .87 • · · · ·· · ··· ··· ··· ··· ···· ·· ·· · ·· ··· на китайски хамстер (СН0-К1). СН0-К1 клетки се култивират в суспенсия в DMEM/F12 (Gibco), съдържаща 10% топлинно инактивиран зародишен говежди серум (Gibco), Не-есенциални аминокиселини (Gibco), 4mM глутамин (Gibco), пеницилин/стрептомицин (Gibco), 10 mM Hepes pH 7,5 (Gibco). За продуциране на CTLA-4-lgG, СНО-К1 клетките се ресуспендират при 1х 10⁷ клетки/ml в DMEM/F12 и се инкубират със sindbis вирус в продължение на един час при стайна температура. След това клетките се разреждат до 1 х 10⁶/ml в ® DMEM/F12, съдържащ 1% зародишен говежди серум, без говежди IgG, при използуване на A sepharose (Pharmacia), неесенциални аминокиселини, 4 тМ глутамин, 12.5m М Hepes pH 7,5, и пеницилин/стрептомицин. Четиридесет и осем часа след инфектирането, клетките се утаяват в плътна утайка, а кондиционира ната среда се събира и се добавят таблетки с пълен протеазен инхибитор (Boehringer Mannheim), pH се довежда до 7,5, и се филтрират 0.2 μ (Nalgene). FPLC (Pharmacia) се използува за афинитетно пречистване на слятия протеин, при използуване на 5 ml протеин A HiTrap колона © (Pharmacia), при скорост 10ml/min. Колоната се промива с 30 обема PBS и се елюира с 0.1 М глицин/HCI, pH 2,8, при 1ml/min. Фракциите (1 ml) веднага се неутрализират до pH 7,5 с Tris pH 9.

Фракциите, съдържащи CTLA-4-lgG1 се идентифицират чрез SDS-PAGE, след което се концентрират при използуване на centriplus устройство (Amicon) преди да се приложат върху колона със сефароза 200 (Pharmacia) при 1 ml/min, при използуване на PBS като разтворител. Фракциите, съдържащи CTLA-4-lgG1 се обединяват, стерилизират се с филтър 0.2 μ (Millipore), разделят се на аликвотни части и се замръзяват при ··· ··· ··· ···· ·· ·· · ·· ···

-80°C. CD44-lgG1 се експресира и се пречиства при използуване на същите методи. CD28-lgG се причиства от кондиционирана среда от временно трансфектираните Cos7 клетки.

Охарактеризиране CTLA-4-lgG1:

Пречистеният CTLA-4-lgG1 мигрира като единична ивица върху SDS-PAGE, при използуване на оцветяване с coomassie (Novex). При нередуциращи условия CTLA4-lgG1 е димер (100 ® kDa), който се редуцира до 50 kDa мономер, когато се обработва с 50 mM DTT. Аминокиселинното секвениране на пречистения CTLA4-lgG1 в разтвор потвърждава N-края на CTLA-4 (MHVAQPAWLAS), и това, че онкосигналният пептид на oncostatin-M се разцепва от зрялия слят протеин. CTLA-4-lgG1 се свързва към имобилизиран B7.1-lgG по начин зависещ от концентрацията, а свързването се блокира от хамстер-античовешко анти-СТЦ\-4 антитяло (BNI3: PharMingen). Стерилният CTLA4-lgG е свободен от ендотоксини и се определя количествено чрез OD280, при използуване на 1.4 като О коефициент на екстинкция. Добивът на пречистен CTLA-4-lgG е в границите между 0.5-3 mgs/литър СНО-К1 клетки.

(ii) CTLA-4 пептид:

Следният CTLA-4 пептид се изготвя както е описано подолу:

NH₂: MHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQA DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM DTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC - CONH₂ ·· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · ··· · « · ···· ·· ·· * ·· ···

Съкращения/материали:

NMP, N-метилпиролидинон; TFE, 2,2,2-трифлуоретанол; DCM, дихлорметан; FMOC, флуоренил метоксикарбонил. Всички реагенти се доставят от Perkin Elmer, със следните изключения: TFE, Aldrich Chemical, FMOC-PAL-PEG смола, Perseptive Biosystems. Fmoc-Arg(PMC)-OH, FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOCAsp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOCGln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC® Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH и FMOC-Tyr(tBu)-OH ce използуват за тези аминокиселини, които изискват защитни групи за страничните вериги.

Пептиден синтез:

Пептидният синтез се провежда на Perkin-Elmer 431А, свабден с обратна връзка за наблюдение чрез UV абсорбцията при 301 nm (Perkin-Elmer Model 759А детектор). Пептидната последователност се съединява върху FMOC-PAL-PEG смола, при използуване на условно двойно свързани цикли. © Осъществяват се форсирани двойни свързвания при цикли

10,11,18,19, 20 и 28 до 33. Смолата се промива с 50% смес на DCM и TFE до изчерпване на всеки цикъл на ацилиране, следвано от capping на нереагиралите аминогрупи с оцетен анхидрид в NMP. Смолата се отстранява от реактора след завършване на 49-ия цикъл, а останалото продължава до изчерпване. Отцепването на пептида от смолата се провежда при използуване на Reagent К (King et al. Inlernationnl Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) в продължение • · · · · · ··· ♦♦·· ·· ·· · ·· ··· на 6 часа върху 415 mg смола доставяйки 186 mg суров CTLA-4 пептид.

Охарактеризиране на пептида:

mg аликвотни части от суровия CTLA-4 пептид се разтварят в 5 ml 6М Guanidine HCI/100 mM К₂Р0₃ при pH 6,4 и се елюират през Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 колона (16 mm x 600 mm, 120 ml основен обем-вместимост) c 2M • Guanidine.HCI /100 mM K₂PO₃ при pH 6,4 при 2 ml / min за 180 минути, събиране на фракции от no 5 ml. Фракциите се анализират чрез натоварване на 1,7 μΙ от фракциите върху NuPAGE Laemeli гел за провеждане с MES буфер за провеждане и се визуализират чрез протокол на Daichii за оцветяване със сребро. Тези фракции, проявяващи молекулно тегло от 12 KDa, както се оценява спрямо стандарти за молекулно тегло, се обединяват и се съхраняват при 4°С. Комбинираните фракции се анализрат чрез UV и гелелектрофореза. Аминокиселинното секвениране се осъществява чрез абсорбиране на 100 микролитрова проба в © ProSorb решетка (абсорбирана върху PVDF мембрана) и се промива за отстраняване на солите от буфера. Секвенирането се провежда върху Applied Biosystems 420. Наблюдава се очакваната N-терминална последователност (MHVAQPAVV L А). Имуноблотингът показва, че пептидът се разпознава от BNI3 анти-човешки CTLA-4 (PharMingen). За обезсолване, една аликвотна част, съдържаща 648 pg от материала се поставя в 3500 Da MWCO епруветка за диализиране и се диализира срещу 0.1% TFA / Н₂О при 4°С в продължение на 9 дни при

фф ·· • ф ф ·	фф фффф ф ф ф	.91	ф ф
ф ф ф фффф фф	ф ф ф фф *	ф ф фф	фф

разбъркване. Цялото съдържание на пликчето за диализа се лиофилизира до прахообразно състояние.

(iii) 300.19 клетки, трансфектирани с CTLA-4 (Y201V)

Пълната дължина на сДНК на CTLA-4 се амплифицира чрез PCR за човешка тимусна библиотека (Stratagene) и се субклоинра в pIRESneo (Clontech). Мутация на CTLA-4, която • води до конститутивна експресия на клетъчната повърхност се въвежда при използуване на MatchMaker Mutagenesis System (Promega). Мутацията на тирозин, Y201 във валин инхибира свързването на адаптин протеин АР50, който е отговарен за бързото интернализиране (въвеждане вътре) на CTLA-4 (Chuang et al. J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Свободни от микоплазма миши 300.19 лимфомни клетки се култивират в RPMI-1640, съдържаща 10% зародишен телешки серум, неесенциални аминокиселини, пеницилин/стрептомицин, 2 тМ глутамин, 12,5 mM Hepes pH 7,5, и 25 uM бета-меркаптоетанол. Клетките се подлагат на електропорация (3 х 10^б/0,4 ml RPMI © без серум) в камера от 1 ml с 20 ug CTLA-4-Y201V/plRESneo, при използуване на 200V/1180uF (Gibco CellPorator). Клетките се оставят за 10 минути, след което се прибавят 8 mis предварително затоплена RPMI среда. 48-часови клетки се разреждат до 0,5 х 10⁶/ml в пълна RPMI среда, съдържаща 1 mg/ml G418 (Gibco). Резистентните клетки се размножават и се показва, че експресират CTLA-4 върху клетъчната повърхност, при използуване на BNI3 антитяло, конюгирано с фикоеритрин (PharMingen). Клетките, експпресиращи високи нива се изолират чрез стерилно сортиране.

·· ·· ·· ···· ъЮ • · <» · · · · ··· ·· · ·· ··· ··· ··· ♦ ··· ·· ·· · ·· ···

Имунизиране и генериране на хибридоми:

XenoMouse мишки (8 до 10-седмична възраст) се имунизират (i) подкожно в основата на опашката с 1 х 10⁷ 300.19 клетки, които са трансфектирани да експресират CTLA-4, както е описано по-горе, ресуспендират се във физиологичен разтвор с фосфатен буфер (PBS) с помощно вещество пълен адювант на Freund, или (ii) подкожно в основата на опашката с (а) 10 цд от CTLA-4 слятия протеин или (Ь) 10 цд CTLA-4 пептид, • емулгиран с помощно вещество пълен адювант на Freund. При всеки случай дозата се повтаря три или четири пъти в непълен адювант на Freund. Четири дни преди сливането, мишките получават едно последно инжектиране със имуноген или клетки в PBS. Лимфоцити от далак и/или лимфни възли от имунизирани мишки се сливат с [миша не-секретираща миеломна РЗ клетъчна линия] и се подлагат на НАТ селекция, както е описано преди това (Galfre. G. and Milstein, С., Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Получава се голям панел от хибридоми, които всички секретират CTLA-4 специфични © човешки lgG₂K или lgG₄K (както се определя по-долу)

ELISA изследване:

Провежда се ELISA за определяне на антиген-специфични антитела в миши серум и в супернатанта от хибридоми, както е описано в (Coligan et al., Unit 2.1. Enzyme-linked immunosorbent assays, in Current protocols in immunology (]994)), при използуване на CTLA-4-lg слят протеин за залавяне на антителата. За животни, които са имунизирани с CTLA-4-lg слят протеин, допълнително се скринират за не-специфична

реактивност срещу човешки участък от Ig на слятия протеин. Това се осъществява при използуване на ELISA блюда, покрити с човешки lgG1, като негативна контрола за специфичност.

При един предпочитан вариант за изпълнение на ELISA изследването се използуват следните техники:

ELISA блюдата се покриват с 100 μΙ/ямка с антигена от покривния за блюдата буфер (0,1 М карбонатен буфер, pH 9,6 и NaHCO₃ (MW 84) 8,4 g/l). след това блюдата се инкубират при 4°С през цялата нощ. След инкубиране покривният буфер се отстранява и блюдото се блокира с 200 μΙ/блюдо блокиращ буфер (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0,01% Thimerosal в 1 х PBS) и се инкубира при стайна температура в продължение на 1 час. Алтернативно, блюдата се съхраняват в хладилник с блокиращ буфер и запечатване на блюда. Блокиращият буфер се отстранява и се прибавят 50 μΙ/ямка от хибридомната супернатанта, серум или други хибридомни супернатанти (позитивна контрола). Блюдата се инкубират при стайна температура в продължание на 2 часа. След инкубиране блюдата се промиват с промиващ буфер (1 х PBS). Откриващите антитела (т.е., миши анти-човешки lgG2-HRP (SB, #9070-05) за lgG2 антитела или миши анти-човешки lgG4-HRP (SB #9200-05) за lgG4 антитела) се прибавя при 100 μΙ/блюдо (миши анти-човешки lgG2-HRP @ 1:2000 или миши античовешки lgG4-HRP @ 1:1000 (всеки разреден в блокиращ буфер)). Блюдата се инкубират при стайна температура в продължение на 1 час, след което се промиват с буфер за промиване. След това, към ямките се добавят 100 μΙ/блюдо с прясно приготвен разтвор за развивитие (10 ml субстратен буфер, 5 mg OPD (о-фенилендиамин, Sigma Cat No. Р-7288), и

μΙ 30% Η₂Ο₂ (Sigma)) блюдата се оставят да прорастват 1020 минути, докато негативните контролни ямки просто започнат да проявяват цвят. След това, се прибавят 100 μΙ/ямка стопразтвор (2 М H2SO4) и блюдата се отчитат на четящо устройство за ELISA блюда, при 490 nm дължина на вълната.

Определяне на афинитетни константи на напълно човешки Mabs чрез BIAcore:

Измерването на афинитета на пречистени моноклонални антитела, Fab фрагменти, или на супернатанта на хибридоми чрез плазмон резонанс се провежда при използуване на BIAcore 2000 инструмент, при използуване на общите процедури, изтъкнати от производителя.

Кинетичните анализи на антителата се осъществяват при използуване на антигени, имобилизирани върху сензорна повърхност при ниска плътност. Три повърхности на BIAcore сензора се имобилизират с CTAL-4-lg слятия протеин при плътност в границите от приблизително 390-900, при използуване на CTLA-4-lg слят протеин при 20 или 50 μΙ/ml в 10 mM натриев ацетат при pH 5,0, при използуване на аминсвързващ комплект, доставен от производителя (BIAcore, Inc.). Четвъртата повърхност на BIAcore сензора се имобилизира с lgG1 (900 RU) и се използува като отрицателна контролна повърхност за неспецифично свързване. Кинетичният анализ се провежда при скорост на потока 25 или 50 микролитра на минута и степента на дисоциация (kd или к_оя) и асоциация (ка или к_оп) се определят при използуване на софтуер, предоставен от производителя (BIA evaluation 3.0), който позволява нагаждане на общите изчисления.

····

ПРИМЕР 2

Измерване на афинитета на анти-СТ1_А-4-антителата

В следващата таблица са представени измерванията на афинитета на някои от антителата, избрани по този начин:

ТАБЛИЦА 1

•		Твърда фаза (от BIAcore)
Хибри -дома	On-rates Ка (М-’S’’x 106	Off-rates Kd (S’xItT1)	Константа на асоцииране KA (1/М)= Ka/Kdx1010	Константа на дисоцииране KD(M)= Kd/Kax1010	Повърхнос на плътнос [RU]
	МоаЬ01	0,68	1,01	0,67	1,48	878,7
		0,70	4,66	0,15	6,68	504,5
		0,77	6,49	0,19	8,41	457,2
		0,60	3,08	0,20	5,11	397,8
	4.1.1	1,85	0,72	2,58	0,39	878,7
		1,88	1,21	1,55	0,64	504,5
		1,73	1,54	1,13	0,88	457,2
		1,86	1,47	1,26	0,79	397,8
	4.8.1	0,32	0,07	4,46	0,22	878,7
		0,31	0,23	1,33	0,75	504,5
		0,28	0,06	4,82	0,21	397,8

4.14.3	2,81	3,04	0,92	1,08	878,7
	2,88	3,97	0,73	1,38	504,5
	2,84	6,66	0,43	2,35	457,2
	3,17	5,03	0,63	1,58	397,8

6.1.1	0,43	0,35	1,21	0,83	878,7
	0,46	0,90	0,51	1,98	504,5
	0,31	0,51	0,61	1,63	457,2
	0,45	0,79	0,57	1,76	397,8
3.1.1	1,04	0,96	1,07	0,93	878,7
	0,95	1,72	0,55	1,82	504,5
	0,73	1,65	0,44	2,27	457,2
	0,91	2,07	0,44	2,28	397,8
4.9.1	1,55	13,80	0,11	8,94	878,7
	1,43	19,00	0,08	13,20	504,5
	1,35	20,50	0,07	15,20	397,8
4.10.2	1,00	2,53	0,39	2,54	878,7
	0,94	4,30	0,22	4,55	504,5
	0,70	5,05	0,14	7,21	457,2
	1,00	5,24	0,19	5,25	397,8
2.1.3	1,24	9,59	0,13	7,72	878,7
	1,17	3,10	0,09	11,20	504,5
	1,11	13,00	0,09	11,70	397,8
4.13.1	1,22	5,83	0,21	4,78	878,7
	1,29	6,65	0,19	5,17	504,5
	1,23	7,25	0,17	5,88	397,8

Наблюдава се, че антителата, приготвени съгласно настоящето изобретение притежават висок афинитет и константи на свързване.

ПРИМЕР 3

Структури на анти-СТ1_А-4-антитела, изготвени съгласно изобретението

В следващата дискусия се представя структурна информация, свързана с антитела, изготвени съгласно изобретението.

С цел да се анализира структурата на антителата, продуцирани съгласно изобретението, бяха клонирани гени, кодиращи фрагментите на тежката и леката вериги извън дадената хибридома. Кпонирането и секвенирането на гени се осъществява както следва:

Ро1у(А)⁺ иРНК се изолира от приблизително 2 X 10⁵ хибридомни клетки, произлезли от имунизирани XenoMouse мишки, при използуване на Fast-Track kit (Invitrogen). Генерирането на случайна примирана сДНК е следвана от PCR. Човешки V_H или човешки V_K специфични за семейството праймери на вариабилни области (Marks et al.. Oligonucleotide primers for poiymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes. Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) или универсален човешки V_H праймер,

MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG) е полезен при свързването c праймери, специфични за човешка Ογ2 константна област (MG-40d;

5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') или Ck константна област фкР2;както е описано по-рано в Green et al., 1994). Последователности на човешки, произлезли от Mabs транскрипти на тежка и капа вериги от хибридоми се получават чрез директно секвениране на PCR продукти, генерирани от

I poly(A⁺) РНК, при използуване на праймери описани по-горе. PCR продуктите също се клонират в pCRII при използуване на ТА кит за клониране (Invitrogen) и двата стандарта се секвенират при използуване на Prism богрило-терминаторни секвениращи китове и едно ABI 377 секвениращо устройство. Всички последователности се анализират чрез подреждане в ”V BASE директория за последователности (Tomlinson et al., MRC Cenrre for Protein Engineering, Cambridge, UK) при използуване на MacVector и Geneworks софтуерни програми.

Освен това, всяко от антителата 4.1.1,4.8.1, 11.2.1, и 6.1.1 се подлагат на ДНК последователност с пълна дължина. За такова секвениране, Poly(A)⁺ иРНК се изолира от приблизително 4 X 10⁶ хибридомни клетки, при използуване на иРНК Direct Kit (Dynal). иРНК се подлага на обратно транскрибиране при използуване на олиго-бТ(18) и Advantage RT/PCR кит (Clonetech). Базата данни за вариабилни области (V Base) се използува за проектиране на амплификационни праймери започващи при ATG стартовия сайт на тежката верига на DP50 гена (5’© TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTG

AGCTG-3') и стоп кодона на lgG2 константната област (5’TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG СТ-3’). Към ATG стартовия кодон се прибавя в 5' една оптимална Kozak последователност (ACCGCCACC). Същият метод се използува за проектиране на праймер за ATG стартовия сайт на А27 гена на капа веригата (5’TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGC

AG-З’) и стоп кодона на капа константната област

90.

• · (5-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC -3’).

012 сДНК се клонира при използуване на праймер за ATG стартовия сайт (5¹TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCC CCGCT-3) и стоп кодона на капа константната област на горния праймер. сДНК-ите на тежката верига също се клонират като геномни структури чрез сайт насочен мутагенез за прибавяне на Nhel сайт в края на вариабилния J домен и се субклонира един Nhel-фрагмент, съдържащ геномните lgG2 СН1/въртящи се/СН2/СНЗ области. Точковата мутация за генериране на Nhel сайта не променя аминокиселинната последователност на зародишната линия. Праймерните двойки се използуват за амплифициране на сДНК-ите, при използуване на Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). PCR последователността се получава чрез директно секвениране, при използуване на багрилно-терминално секвениращи китове и ABI секвениращо устройство. PCR продуктът се клонира в рЕЕ глутамин синтетазни експресионни вектори от бозайници (Lonza) и три от клоновете се секвенират за да се потвърдят соматичните мутации. За всеки клон се проверява последователността на двете вериги при най-малко три реакции. Генерира се едно агликозилирано 4.1.1 антитяло чрез сайт-насочен мутагенез на N294Q в СН2 домена. Продуцират се рекомбинантни антитела чрез преходно трансфектиране на Cos7 клетки в IgG изчерпан FCS и се пречистват при използуване на стандартни Protein А сефарозни техники. Стабилни трансфектанти се генерират чрез електропорация на миши NSO клетки и селекция в безглутаминова среда. Рекомбинантни 4.1.1 със или без

гликозилиране проявяват идентична специфичност и афинитет към CTLA4 при in vitro ELISA и BIAcore изследванията.

Анализ на използуването на гени

Следната таблица представя доказателства за използуването на гени чрез избрани хибридомни клонове антитела, съгласно настоящето изобретение.

ТАБЛИЦА 2

Използуване на тежка и лека генна вериги

Клон	Тежка верига		Капа лека верига
VH	D	JH		VK	JK
4.1.1	DP-50	DIR4 или DIR3	JH4		А27	JK1
4.8.1	DP-50	7-27	JH4		А27	JK4
4.14.3	DP-50	7-27	JH4		А27	JK3
6.1.1	DP-50	DIR5 или DIR5rc	JH4		А27	JK3
3.1.1	DP-50	3-3	JH6		012	JK3
4.10.2	DP-50	7-27	JH4		А27	JK3
2.1.3	DP-65	1-26	JH6		А10/А26	JK4
4.13.1	DP-50	2-27	JH4		А27	JK3
11.2.1	DP-50	D1-26	JH6		012	JK3
11.6.1	DP-50	D2-2 или D4	JH6		012	JK3

·· : ! : I • · ···

11.7.1	DP-50	D3-22 или D21- 9	JH4		012	JK3
12.3.1.1	DP-50	D3-3 или DXP4	JH6		А17	JK1
12.9.1.1.	DP-50	D6-19	JH4		АЗ/А19	JK4
4.9.1	DP-47	5- 24 и/или 6- 19	JH4		L5	JK1

Както може да се наблюдава, антителата, съгласно настоящето изобретение, се генерират с голямо отклонение по отношение на използуването на DP-50 вариабилната област на тежката верига. DP-50 генът също се отнася като от семейството на V_H 3-33 гените. Само едно антитяло, избрано на основата на CTLA-4 свързването и предварителни in vitro функционални изследвания показва генно използуване на тежката верига, различно от това на DP-50. Този клон 2.1.3 използува DP-65 вариабилна област на тежка верига и е с lgG4 изотип. DP-65 генът също се отнася като от V_H 4-31 генното семейство. От друга страна, клонът 4.9.1, който притежава DP-47 вариабилна област на тежката верига се свързва към CTLA-4, но инхибира свързването към В7-1 или В7-2. При XenoMouse мишки, съществуват повече от 30 различни функционелни вариабилни гени с тежка верига, с които да се генерират антитела. Следователно отклонението е паказателно за презпочитан мотив на свързване на вимодействието антитяло-антиген, като се имат предвид на комбинираните свойства на свързване към антигена и функционалната активност.

Мутационен анлиз

Както ще бъде отбелязано, анализът на генното използуване предоставя единствено ограничен поглед върху структурата на антителата. Тъй като В-клетките в XenoMouse мишки генерират транскрипти на V-D-J тежка или V-J капа лека верига, съществуват известен брой вторични процеси, които ® протичат, включително, но без да се ограничават до, соматична хипермутация, п-прибавяне, и CDR3 екстензии. Виж например, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) и U.S. Patent Application Serial No. 08/759,620, подадена на 03. 12. 1996. В съответствие, за по-нататъшно разглеждане на структурата на антителата, предсказаните аминокиселинни последователности на антителата се генерират от сДНК-и, получени от клоновете. Освен това, N-терминалните аминокиселинни последователности се получават чрез секвениране на протеина.

Фигура 1 предоставя последователности на нуклеотиди и © аминокиселини на тежката и капа леките вериги на клоновете

4.1.1 (фигура 1А), 4.8.1 (фигура 1В), 4.14.3 (фигура 10), 6.1.1 (фигура 1D), 3.1.1 (фигура IE), 4.10.2 (фигура 1F), 2.1.3 (фигура 1G), 4.13.1 (фигура 1Н), 11.2.1 (фигура 11). 11.6.1 (фигура 1J),

11.7.1 (фигура 1К), 12.3.1.1 (фигура 1L). и 12.9.1.1 (фигура 1М). На фигури 1А, 1 В, и 1D, разширените последователности на антителата, получени чрез кпониране на пълната дължина на сДНК-ите, както е описано по-горе. На такива фигури последователността на сигналния пептид (или базите кодиращи

103 • · • · • · • · • · ··· същия) са отбелязани удебелено, а използуваните последователности за 5’ PCR реакците са подчертани.

Фигура 2 предоставя подреждане на последователностите между предсказаните аминокиселинни последователности на тежката верига от клоновете 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1,

4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и 12.3.1.1, и 12.9.1.1 иаминокиселинната последователност на зародишна линия DP-50 (3-33). Разликите между последователността на DP-50 зародишната линия и тази на последователността в клоновете ® са посочени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антителата, в по-тъмно.

Фигура 3 предоставя подреждане на последователности между предсказаната аминокиселинна последователност на тежката верига от клон 2.1.3 и последователността на зародишната линия DP-65 (4-31). Разликите между DP-65 последователността на зародишната линия и тази на последователността в клона са означени удебелено. Фигурата показва, също така, позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 © последователностите на антителата, като подчертани.

Фигура 4 предоставя подреждане на последователности между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига от клонове 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2, и

4.13.1 и аминокиселинната последователност на зародишна линия А27. Разликите между последователността на А27 зародишна линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва също позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като

1.04 • · • · · • · подчертани. Явни делеции в CDR1s на клонове 4.8.1, 4.14.3, и

6.1.1 са посочени с Os.

Фигура 5 предоставя подреждане на последователности между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига от клонове 3.1.1, 11.2.1, 11.2.1, и 11.7.1 и аминокиселинната последователност на зародишна линия 012. Разликите между последователността на 012 зародишната линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва също позициите на CDR1, CDR2, ® и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 6 предоставя подреждане на последователности между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига от клон 2.1.3. и аминокиселинната последователност на зародишна линия А10/А26. Разликите между последователността на А10/А26 зародишна линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва също позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 7 предоставя подреждане на последователности © между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига от клон 12.3.1 и аминокиселинната последователност на А17 зародишна линия. Разликите между последователността на А17 зародишна линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва също позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 8 предоставя подреждане на последователности между предсказаната аминокиселинна последователност на капа леката верига от клон 12.9.1 и аминокиселинната • ·

последователност на АЗ/А19 зародишна линия. Разликите между последователността на АЗ/А19 зародишна линия и тази на последователността в клона са посочени удебелено. Фигурата показва също позициите на CDR1, CDR2, и CDR3 последователностите на антитялото като подчертани.

Фигура 22 предоставя серии от разреждания на допълнителни нуклеотидни и аминокиселинни последователности на следните анти-СТ1_А-4 вериги на антитела:

4.1.1:

пълна дължина 4.1.1 тежка верига (сДНК 22(a), геномна 22(b), и аминокиселина22(с));

пълна дължина агликозилирана 4.1.1 тежка верига (сДНК 22 (d) и аминокиселина 22(e));

пълна дължина (сДНК 22(f), и аминокиселина 22(g));

4.8.1:

пълна дължина 4.8.1 тежка верига (сДНК 22(h) и © аминокиселина22(|));

4.8.1 лека верига (cDNA 22(j) аминокиселина 22(k));

6.1.1:

пълна дължина 6.1.1 тежка верига (сДНК 22(1) и аминокиселина 22(т));

6.1.1 пълна дължина (сДНК), 22(п) и аминокиселина22(о));

···

11.2.1:

пълна дължина 11.2.1 тежка верига (сДНК 22(р) и аминокиселина 22(q)); и

11.2.1 пълна дължина лека верига (сДНК 22(г), и аминокиселина 22(s)).

Последователностите на сигналния пептид са показани удебелено и с по-голями букви. Отворените рамки за разчитане в пълната дължина 4.1.1 геномна ДНК последователност ® (фигура 22(b) са подчертани. Мутаците, въведени да направят агликозилираната 4.1.1 тежка верига и получената промяна (N294Q) са показани с двойно подчертаване и удебелени (сДНК (фигура. 22(b) и аминокиселина (Fig. 22(c)).

ПРИМЕР 4

Анализ на аминокиселинните замествания на тежките и леки вериги

На фигура 2, която предоставя подреждане на последователности между предсказаните аминокиселинни О последователности на тежката верига от клонове 4.1.1, 4.8.1,

4.14.3, 6.1.1, 3.1.1 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, и

12.9.1.1 аминокиселинната последователност на зародишна линия DP-50 (3-33), се появява интерисен модел. В добавка към факта на отклонение за тежка верига DP-50, в по-голямата част от клоновете има относително ограничена хипермутация при антителата, отнасящи се до гена на зародишна линия DP-50. Например, клонове 3.1.1 и 11.2.1 нямат мутации. Освен това, мутациите в другите клонове обикновено са консервативни промяни, включващи замяна на аминокиселини с подобни

W.

• · • · • « • · ·· · свойства на аминокиселините от зародишна линия. Мутациите в голяма част от CDR1 и CRD2 последователностите са изключително консервативни в природата. Три от тежките вериги, представени на фигура 2, 4.10.2, 4.13.1, и 4.14.3, ясно са произлезли от единично рекомбинантно събитие (т.е., произлизат от идентичен зародишен център) и са почти идентични по последователности. Ако тези трите се разглеждат като една последователност, следователно, сред 10 различни антитела, съдържащи DP50 тежката верига, 3 позиции в CDR1 и CDR2, в които се замества неполярен остатък с друг неполярен остатък, 12 в които полярен незареден остатък се заменя с друг полярен остатък и 1, в който полярен зареден остатък се заменя с друг полярен зареден остатък. Освен това има две позиции, в които два остатъка, които са много подобни структурно, глицин и аланин, се заместват едни с друг. Единствената не стриктно консервативна мутация включва 3 замествания на полярен зареден остатък с полярен незареден остатък и едно заместване на неполярен остатък с полярен остатък.

© Леките вериге на тези антитела произлизат от 5 различни

Vk гена. А27 генът е най-мащабно представен и е източник на 6 различни леки вериги. Сравняването на тези 6 последователности показва, две забележителни характерискити. Първо, в три от тях 4.8.1, 4.14.3, и 6.1.1, съдържат делеции на един или два остатъка в CDR1, рядко явление. На второ място има голямо предубеждениеи срещу зародишната линия серин в позиция шест в CDR3, в това че серинът е бил заместен в много последователности. Това

1М ft · подсказва, че серинът в тази позиция е несъвместим с CTLA4 свързването.

Ще бъде оценано, че много от горе-идентифицираните аминокиселинни заместванвия същесдтвуват в близост до или в CDR. Излиза ,че такива замествания носят известен ефект при свързването на антитялото към CTLA-4 молекулата. Такива замествания, освен това, биха могли да имат значителен ефект при афинитета на антителата.

® ПРИМЕР 5

Анализ на N-терминална аминокиселинна последователност на антитела, съгласно изобретението

С цел по-нататъшно проверяване на структарата и състава на антителата, съгласно изобретението, идентифицирарни погоре, се секвенират някои антитела, при използуване на PerkinElmer секвенатор. И девете, тежката и леката капа верига на антителата се изолират и пречистват при използуване на техники на препаративна гел-електрофореза и електроблотинг, след което се подлагат на директно секневиране, както е © описано в пример 6. По-голямата част от последователностите на тежката верига се блокират в тяхния амино-край. Следователно, такива антитела първо се обработват с пироглутамат аминопептидаза и се секвенират след това.

Резултатите от тези експреминет са показани на Фигура 9. Фигура 9 предоставя, също така, молекулното тегло на тежката и леката вериги, както са определени чрез масспектроскопия (MALDI).

109.

•φ •φ •φ • φ φ φ φ φ φ φφφ

ПРИМЕР 6

Допълнително охарактеризиране на антитела, съгласно изобретението

Фигура 10 предоставя известна допълнителна охарактеризираща информация по отношение на антителата, съгласно изобретението. Във фигурата, данните свързани с клонове 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3, и 6.1.1 са обобщени. Предоставени са следните данни: концентрация, изоелектрично фокусиране (IEF), SDS-PAGE, гелна хроматография, FACS, масспектроскопия (MALDI) и N-терминално секвенирне на леката верига.

Обикновено данните се генерират както следва :

Материали и методи

Концентрацията на протеина се определя при 280 nm на UV скенерно устройство (200-350 nm), където 1.58 абсорбционни единици при 280 пт са равни на 1 mg/ml.

SDS-PAGE се провежда при използуване на Never © NuPAGE система за електрофореза с 10% NuPAGE гел и MES промиващ буфер. Пробите се приготвят чрез разреждане 3:1 с 4 х NuPAGE буфер за пробата (+/-) бета-меркаптоетанол, загряване и-5 ug от протеина се зареждат върху гела. Гелът се оцветява с Brilliant Blue R оцветяващ разтвор (Sigma cat. # В-6529) и се определя молекулния размер чрез сравняване на оцветените ивици с Perfect Protein Markers (Novagen cat #69149-3).

·· • · • · • · • · ··

1.Ж .: ·: : : ·· ···

За N-терминално секвениране пробите се пропускат върху NuPAGE гелове, прехвърлят се на Pro Blot имобилизационна мембрана (Applied Biosystems), след което се оцветяват с Coomassie Blue R-250. Оцветените протеинови ивици се изрязват и се подлагат на секвенционен анализ чрез автоматизирано разграждане по Edman върху Applied Biosystems 494 Precise НТ Секвенатор.

Изоелектрично фокусиране (IET) се провежда при използуване на Pharmacia IEF 3-9 pHast гелове (cat # 17-054301). Пробите се разреждат в 10% глицерол до ~ 0.8 mg/ml и 1 ul се зарежда върху гела, след което се оцветява със сребро. PI определянето се осъществява чрез сравняване на оцветените ивици в широки граници (pH 3-10) IEF стандарти (Pharmacia cat# 17-0471-01).

Гелна хроматография (SEC) се провежда във физиологичен разтвор с фосфатен буфер, (PBS) върху Pharmacia SMART система, при използуване на Superdex 75 PC 3.2/30 колона. Молекулният размер се определя чрез сравняване на времето на задържане на пиковете с времето на задържане на гела.

За FACS изследвания се приготвят човешки периферни Т клетки в продължение на 48 часа. Т клетките се промиват еднократно, ресуспендират се във FACS буфер при 1 х 10⁶ клетки/100 ul и се оцветяват за CD3 повърхностно експресиране с 10 ul анти-СОЗ-FITC (Immunotech, Marseille, France) за 30 минути при стайна температура. Клетките се промиват

Ml

двукратно, след което се фиксират, пермеабилизират се (правят се пропускриви мембраните им) (Fix and Perm, Caltag), и се оцветяват за вътреклетъчно CTLA-4 експресиране с 10 ul антиCD152-PE (Pharmingen). Поточната цитометрия се осъществява при използуване на Becton Dickinson FACSort Установяват се квадранти чрез анализ на релевантните изотипни контролни антитела (Caltag).

Както се разглежда по-горе, за анти-СТЦ\-4 антитела е ® показано, че притежават известни силни имуно-модулиращи активности. Следните ексресименти се провеждат с цел да се определи дали антителата, съгласно настоящето изобретение притежават такива активности. Най-общо, експериментите се проектират да установят способността на антителата да инхибират взаимодействието между CTLA-4 и В7 молекули, селективността между CTLA-4 и В7 молекули и CD28, и да дадат начало на Т клетъчно продуциране на цитокини, включително, но без да се ограничава до, IL-2 и/или IFN-γ експресия. Освен това се предприема разглеждане на крастосаната реактивност ф на антителата от изобретението с някои човешки тъкани и

CTLA-4 молекули в други видове (например, мишка и примати).

ПРИМЕР 7

Компетитивна ELISA: инхибиране на CTLA-4/B7-1 или В7-2 взаимодествието чрез антитяло, съгласно изобретението

Провежда се in vitro изследване за да се определи, дали антителата, съгласно изобретението, са способни да инхибират свързването на CTLA-4 или с В7-1 или с В7-2. Както може да се оцени, антителата от изобретението, които са способни да инхибират свързването на CTLA-4 с В7 молекули се очаква да са кандидати за имунорегулатори чрез CTLA-4 биосинтетичния път. При изследването се използуват следните материали и методи:

Материали и методи

96-ямкови MaxiSorp блюда (Nunc, Denmark, 20 #439454) се покриват с 3 nM B7.1-lg(G1) или B7.2-lg(G1) (Repligen, Inc. ® Needham, МА) в Dulbecco's PBS и се инкубират при 4°С през цялата нощ. На втория ден, B7-lg се отстарнява и блюдата се блокират с 1% BSA плюс 0.05% Tween-20 в D-PBS в продължение на два часа. Блюдата с промиват 3 пхъти с промивен буфер (0.05% Tween-20 в D-PBS). Антитялото, при подходящи тестови концентрации и CTLA4-lg(G4) (0.3 nM крайна концентрация) (Repligen. Inc. Needham, МА) предварително се смесват за 15 минути, след което се добавят към блюда покрити с B7-lg (60 ul общ обем) и се инкубират при RT за 1,5 часа. Блюдата се промиват 3 пъти и 50 μΙ от 1 до 1000 © разреждане на HRP-маркирано миши анти-1дС4 антитяло (Zymed, San Francisco, СА, #05-3820) се прибавя и се инкубира RT за 1 час. Блюдата се промиват и се прибавя ЗХ 50 μΙ ТМВ Microwell пероксидазен субстрат (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, #50-30 76-04), и се инкубират при RT за 20 минути, след което към блюдата се прибавят 50 μΙ 1 N H₂SO₄. Блюдата се отчитат при 450 nm, при използуване на Molecular Devices четящо устройство за блюда (Sunnyvale, СА). Всички проби се тестват в две повторения. Максималният сигнал се определя като CTLA-4-lg свързване при отсъствие на тестово

1.13

антитяло. Неспецифичното свързване се определя като абсорбция в присъствие на CTLA-4-lg и тестово антитяло.

Резултатите от изследванията са представени на таблица IIIA и IIIB. В таблица IIIA са показани резултатите за голямото разнообразие от антитела, съгласно изобретението. В таблица IIIB, резултатите са показани като сравнение на 4.1.1 антитялото от изобретението с 11.2.1 антитялото от изобретението от различни експерименти.

ТАБЛИЦА IIIA

Клон CTLA-4-lg	Изотип	CTLA4/B7.2 компт. ELISA IC50(nM)	CTLA4/B7.1 комп. ELISA IC50(nM)
СТЗ.1.1	igO2	0,45 ± 0,07 (n=3)	0,63 ± 0,010 (n=2)
СТ4.1.1	lgG2	0,38 ± 0,06 (n=5)	0,50 ± 0,05 (n=2)
СТ4.8.1	lgG2	0,57 ± 0,03 (n=3)	0,17 ± 0,28 (n=2)
СТ4.9.1	lgG2	некомпететивно (n=3)	некомпеттивно (n=2)
СТ4.10.2	lgG2	1,50 ± 0,37 (n=3)	3,39 ± 0,31 (n=2)
СТ4.13.1	igG2	0,49 ± 0,05 (n= 3)	0,98 ± 0,11 (n=2)

...... 1.14 • · · · ·

СТ4.14.3	lgG2	0.69 ± (п=3)	0,11	1,04 ± (п=2)	0,15
СТ6.1.1	lgG2	0.39 ± (п=3)	0,06	0,67 ± (п=2)	0,07

ТАБЛИЦА IIIB

Клон CTLA-4- Ig	Изотип	CTLA4/B7.2 комп. ELISA IC50(nM)	CTLA4/B7.1 комп. ELISA IC50(nM)
СТ4.1.1	lgG2	0,55 + 0,08 (п=4)	0,87 ± 0,14 (п=2)
СТ11.2.1	lgG2	0,56 ± 0,05 (п=4)	0,81 ± 0,24 (п=2)

ПРИМЕР 8

Селективни антитела от изобретението, по отношенение © на CTLA-4 спрямо CD28 или В7-2

Друго in vitro изследване се провежда за определяне селективността на антителата от изобретението като се има предвид CTLA-4 versus (спрямо) CD28 или В7-2. Използуват се следните материали и методи, във връзка с експериментите:

CTLA-4 селективна ELISA: материали и методи

96-ямково FluroNUNC блюдо (Nune Cat No.475515) се покрива с четири антигена : CTLA-4/lg, CD44/lg, CD28/lg, и B7.2/lg (антигени, генерирани в парник). Антигените се покриват ·· ·· ·· ···· 1.15 ···· ♦· · ...

• · · * · · ..

в блюдата през цялата нощ при +4°С при 1 ug/ml 100 ul/ямка в 0,1 М натриево бикарбонатен буфер, pH 9,6. След това блюдото се промива с PBST (PBS + 0.1% Tween-20) три кратно, при използуване на NUNC промивка за блюда. Блюдото се блокира с PBST + 0.5% BSA при 150 ul/ямка. Блюдото се инкубира при стайна температура за 1 час, след което се промива с PBST трикратно. След това анти-СТ!_А-4 антителата от изобретението се разреждат в блок при 1 pg/ml и се прибавят към блюдото. Блюдото се инкубира при стайна температура за 1 час, след ® което се промива с PBST трикратно. Ямките, които съдържат антителата от изобретението се третират след това с 100 μΙ/ямка анти-човешки lgG2-HRP (Southern Biotech Cat No.907005) при 1:4000 разреждане в блок. Един ред също се третира с анти-човешки IgG (Jackson Cat No. 209-035-088) за нормализиране при покриване на блюдото. Това антитяло се разрежда до 1:5000 в блок и се прибавя при 100 ul/ямка. Също така, един ред се третира с анти-човешки CTLA-4-HRP (Pharmingen Cat No. 345815/Custom HRP конюгат) като позитивна контрола. Това антитяло се използува при 0.05 ug/ml © разреден в блок. Блюдото се инкубира при стайна температура за 1 час, след което се промива с PBST трикратно. LBA хемилуминесцентен субстрат (Pierce) се прибавя при 100 μΙ/ямка и блюдото се инкубира на клатачка за 5 минути. След това блюдото се отчита при използуване на lumi-imager устройство за 2-минутно излагане.

IGEN CTLA-4-lg изследване за селективно свързване: материали и методи

М-450 Dynabeads (Dynal A.S, Oslo, Nonvay #140.02) се промиват 3 X c Na-фосфатен буфер, pH 7,4 и се ресуспендират

·♦··

в Na-фосфатен буфер 1,0 pg CTLA-4-lg(G1), 1,0 pg CD28-lg(G1) или 1,0 to 3,0 pg B7.2-lg(G1) (Repligen, Inc. Needham, МА) се прибавят към 100 μΙ перли и се инкубират през цялата нощ на ротационно устройство при 4°С. На втория ден, перлитне се промиват 3 X в 1% BSA плюс 0.05% Tween-20 в Dulbecco's PBS и се блокират за 30 минути. Перлите се разреждат 1 към 10 с блокиращ буфер и 25 μΙ от перлите с покритие се прибавят към 12 х 75 mm полипропиленови епруветки. Всички проби се тестват в две повторения. Към епруветките се прибавят 50 μΙ ® тестово антитяло (1 pg/ml крайна концентрация) или блокиращ буфер, и се инкубират 30 минути върху Origen 1.5 Analyzer carousel (въртележка) (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) при стайна температура, вортексира се при 100 rpm. Към епруветките се прибавят 25 μΙ рутенилирано мише анти-човешко lgG1. lgG2 или lgG4 (Zymed. Inc. San Francisco, CA #05-3300, 053500 и 05-3800) (крайна концентрация от 3 pg/ml м 100 μΙ общ обем). Епруветките се инкубират 30 минути при стайна температура върху въртележка, вортексираща при 100 rpm. Добавят се по 200 рд от буфера за Origen изследването (IGEN © international. Inc.. Gaithersburg, MD #402-050-03) на епруветка и за кратко се вортексират, след което епруветките се преброяват в Origen Analyzer и се определят ECL (електрохемилуминесцентни еденици) единици за всяка епруветка. Определят се нормализиращите фактори за да се коригират разликите в свързването на слятите протеини към Dynabeads, a ECL единиците се коригират за неспецифично свързване преди да се изчисли отношението на специфичност.

Резултатите от изследванията са представени на таблици IVA и IVB.

фффф фф фф ф ф ф фф фф фффф • · · · I « · ф · ф · ф ф

ТАБЛИЦА IVA

Клон	Изотип	CTLA4/CD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/CD44 ELISA	CTLA4/CD28 IGEN	CTLA4/B7. IGEN
3.1.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n= 195:1 (n=1
4.1.1	igG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 485:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 261:1 (n=1)	>500:1 (n= 107:1 (n=1
4.8.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2) 190:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=
4.9.1	lgG2	>500:1 (n=2) 244:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 33:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=
4.10.2	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1)	>500:1 (n=
4.13.1	lgG2	>500:1 (n=2) 46:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=1) 329:1 (n=1)	>500:1 (n=
4.14.3	lgG2	>500:1 (n=2) 80:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 10:1 (n=1)	>500:1 (n=2) 126:1 (n=1)	>413:1 (n=1)	>234:1 (n=
6.1.1	igG2	>500:1 (n=2) 52:1 (n=1)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=

ТАБЛИЦА IVB

Клон	Изотип	CTLA4/ICD28 ELISA	CTLA4/B7.2 ELISA	CTLA4/hlgC ELISA
4.1.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=2)	>500:1 (n=3)
11.2.1	lgG2	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)	>500:1 (n=3)

• ·

1.18 • · 9

ПРИМЕР 9

Човешки сигнален модел на Т-клетки

С цел по-нататъшно дефиниране на активността на антителата, съгласно изобретенито, да действат като имунни регулатори, се разработват няколко изследвания с Т-клетки, за да се определи количествено засилването на Т-клетъчното производство на IL-2 при блокиране на CTLA-4 сигнала с антителата. Във връзка с експеримента се използуват следните материали и методи :

Материали и методи

Свежо изолирани човешки Т-клетки се приготвят при използуване на Histopaque (Sigma, St Louis, МО #A-70543) и T-kwik (Lympho-Kwik, One Lambda, Canoga Park, CA, #LK-50-T), и се стимулират c PHA (1 pg/ml) (пречистен фитохемаглутинин, Murex Diagnostics Ltd. Dartford, England, #HA 16) (RPMI1640, съдържаща L-глутамин, MEM не-есенциални аминокиселини, пеницилин, стрептомицин, 25 mM Hepes и 10% FBS) при концентрация от 1 х 10⁶ клетки/ml и се инкубират при 37°С © за 2 дни. Клетките се промиват и се разреждат в среда до х 10⁶ клетки/ml. Raji клетки ( Burkitt лимфома, човешки АТСС No: CCL 86 class II American Type Cullture Collection, Rockville, MD) се третират c митомицин C (Sigma St. Louis, MO, # M-4287) (25 pg/ml за един час при 37°С. Raji клетките се промиват 4 X в PBS и се ресуспендират при 2 х 10⁶ клетки/ml. Човешки Т-клетъчни бласти (5x10⁵/ml), Raji клетки (5 х 10⁵/ml) и анти-СТ1А-4 антитела или изотипно-съвпадащо контролно антитяло при различни концентрации, се добавят към 96-ямкови микротитърни блюда и блюдата се инкубират при 37°С в • ft ·· ft ft ft ft • ft

149 ft··· ·· ft ft • ft ft ft • ft ft продължение на 72 часа. Общото количество на ямка е 200 μΙ. Седемдесет и два часа след стимулирането блюдата се центрофугират и супернатантата се остравяна и се замразява за по-късно определяне на IL-2 (Quantikine IL-2 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, #D2050) и IFN-γ (Quantikine IFN-g ELISA kit, R&D Systems). Усилването на цитокините се дефинира като разликата между нивото на цитокини в културите, съдържащи aHTH-CTLA-4 блокиращо mAb спрямо едно изотипно• съвпадащо контролно антитяло. За поточни цитометрични експерименти, Raji клетки се промиват с 1 х FACS буфер (PBS съдържащ 2% топъл инактивиран FCS, 0,025% натриев азид). Клетъчните плътни утайки се ресуспендират в FACS буфер при 1 х 10⁶ клетки/100 μΙ и се инкубират с 10 μΙ анти-СО80-РЕ (Becton Dikinson, San Jose, СА) или анти-СО86-РЕ (Pharmingen, San Diego, СА) в продължение на 30 минути при стайна температура. Клетките се промиват двукратно и се суспендират повторно в 1 ml FACS буфер. Поточната цитометрия се провежда при използуване на Becton Dickinson FACSort. Извеждат се хистограми чрез анализ на релевантните изотипни© съвпадащи контролни антитела (Caltag, Burlingame, СА).

Най-общо сме разработили изследване, което може да се използува за бързо определяне на Т-клетъчно IL-2 иррегулиране. Както може да бъде оценено, стимулирането на Т-клетки е зависимо от В7 и CD28. Освен това промитите Т бласти не правят откриваеми IL-2, a Raji клетки не правят откриваеми IL-2 даже след стимулиране с LPS или PWM. Въпреки това, в комбинация, Т-бласти съвместно култивирани с Raji клетки могат да моделират В7, CTLA-4, и CD28 сигнални

...... 120 ·· ·· • · · · събития и ефекта на антителата върху тях може да бъде определен.

Фигура 11 показва експресирането на В7-1 и В7-2 върху Raji клетки при използуване на aHTni-CD80-PE и анти-СО86-РЕ mAbs, при използуване на проточна цитометрия (FACs), както е описано в пример 6.

Фигура 12 показва засилването на IL-2 продуцирането по начин зависим от концентрацията при Т клетъчен бласт/Raji изследване, индуцирано от CTLA-4 блокиращи антитела (BNI3 ® (PharMingen) и 4.1.1,4.8.1, и 6.1.1 антителата от изобретението).

Фигура 13 показва засилването на IFN-γ продуцирането по начин зависим от концентрацията при Т клетъчен бласт/Raji изследване, индуцирано от CTLA-4 блокиращи антитела (BNI3 (PharMingen) и 4.1.1, 4.8.1, и 6.1.1 антителата от изобретението)(същите донорни Т-клетки).

Фигура 14 показва средното засилване на IL-2 продуцирането при Т клетъчно бласт/Raji изследване. Интересно е да се вземе предвид, че CTLA4.9.1 се свързва към CTLA-4, но не блокира В7 свързването. Така, простото © свързване към CTLA-4 не е достатъчно само по себе си да достатви функционално антитяло от изобретението.

Фигура 15 показва средното засилването на IFN-y продуцирането при Т клетъчно бласт/Raji изследване.

Фигура 19 показва сравнение между 4.1.1 и 11.2.1 антителата от изобретението, при концентрация от 30 gg/ml при 72-часови Т клетъчно бласт/Raji изследване, както е описано в този пример 9 и изследването за Суперантиген, описано в пример 10.

·· ····

121 .

Фигура 20 показва засилването на IL-2 продуцирането по начин зависим от концентрацията при Т клетъчно бласт/Raji изследване, индуцирано от 4.1.1, и 11.2.1 CTLA4 антителата от изобретението.

Следващата таблица IVc предоставя информация, свързана със средното засилване и границата на засилване на цитокиновия отговор при Raji и SEA изследванията от изобретението. Всеки от експериментите, включени в резултатите се основава на доза от 30 pg/ml и се измерва на 72-рия час. Показани са голям брой донори, използувани при експериментите, както и отговори.

ТАБЛИЦА IVC

изследване	mAb	Цито -кин	Средно засилване pg/ml	SEM	Граница на засилване pg/ml	η	Отго -вор на донора
Т клетъчно бласт/Raji	4.1.1	IL-2	3329	408	0 до 8861	42	19 от 21
Т клетъчно бласт/Raji	4.1.1	IFN-γ	3630	980	600 до 13939	17	13 от 13
Т клетъчно бласт/Raji	11.2.1	IL-2	3509	488	369 до 6414	18	14 от 14
SEA (РВМС)	4.1.1	IL-2	2800	312	330 до 6699	42	17 от 17
SEA (РВМС)	11.2.1	IL-2	2436	366	147 до 8360	25	15 от 15

.. .. .. .... 122 ···· ·· · ··

SEA (пълна кръв)	4.1.1	IL2	6089	665	-168 18417	ДО	46	15 от 17
SEA (пълна кръв)	11.2.1	IL2	6935	700	-111 11803	до	25	12 от 14

ПРИМЕР 10

Модел на сигнал на човешки Т-клетки

Разработваме второ клетъчно изследване, с цел да се определи количествено засилването на Т-клетъчно IL-2 иррегулиране при блокиране на CTLA-4 сигнала с антителата. Използуват се следните материали и методи, във връзка с експериментите:

Материали и методи

Човешки РВМС се приготвя, при използуване на Accupsin. Микротитърни блюда, предварително покрити с анти-СОЗ антитяло (Ieu4, Becton Dickinson) (60 ng/ml) и се инкубират в продължение на 2 часа при 37°С. Към ямките се добавя hPBMC при 200,000 клетки на ямка. Ентеротоксин А от Staphylcoccus (SEA) (Sigma) се прибавя към ямките при 100 ng/ml. Антителата се прибавят към ямките, обикновено при 30 gg/ml. След това клетките се стимулират в продължение на 48, 72 или 96 часа. Блюдата се центрофугират в желания момент и супернатантите се отстраняват от блюдата. След това супернатантите се проверяват за IL-2 производство, при използване на ELISA (R&D Systems).

·· ····

123

Резултатите от тези експерименти са показани на фигури 16, 17, и 21. На фигура 16, индуцирането на IL-2 производството в hPBMC от 5 донора се измерват 72 часа след стимулирането. На фигура 17 са показани резултатите от измерванията на пълна кръв, като се анализира разликата в индуцирането на IL-2 производството в кръвта на трима донори, както е измерено на 72 и 96-ия час, след стимулирането.

На фигура 21 се вижда засилването на IL-2 производството в пълна кръв от двама донори, измерени на 72-ия час, след стимулирането.

ПРИМЕР 11

Модел на тумор в животно

Поставяме модел на тумор в животно за in vivo анализа на анти-миши-СТ1_А4 антитела в инхибираща растежа на тумори среда. В модела прораства миши фибросаркомен тумор и животните се третират с анти-миши-СП-А4 антитела. Материалите и методите за установяването на модела са представени по-долу:

Материали и методи

Женски A/J мишки (6-8 седмична възраст) се инжектират подкожно на врата, откъм страната на гръба, с 0,2 ml Sa1N туморни клетки (1х10⁶) Baskar 1995). Инжектират се интраперитонеално на 0, 4, 7 и 14-ия ден след инжектирането на туморни клетки. Измерването на туморите се провежда по време на 3-4 седмичния експеримент, при използуване на Starrett SPC Plus електронен дебеломер (Athol, МА), а размера ·· ·· ·· ···· 1«2<4 • ♦ · » · · : j ···· ·· ·· « _tA

на туморите се изразява като повърхността покрита от растежа на тумора (mm²).

Фигура 18 показва инхибирането на туморния растеж с анти-миши-СТ1_А4 антитяло в модел на миши фибросаркомен тумор. Както е показано на фигура 18, животните, третирани с анти-миши-СТ1_А4 имат редуциране на туморния растеж, при сравняване с животни, третирани с изотипно контролно антитяло. В съответствие, анти-миши-СТ1_А4 mAbs са способни да инхибират растежа на фибросаркома в миши модел на тумор.

Очаква се антителата, които реагират кръстосано с мише CTLA-4 да се осъществят подобно в модела. Въпреки това, от антителата от изобретението, които са проверени, нито едно не врлиза в кръстосана реакция с миши CTLA4.

ПРИМЕР 12

Модел на тумор в животно

С цел да се направят допълнителти проучвания на активността на антителата, съгласно изобретението, се © проектира ксенографтен SCID миши модел за тестване на изкореняването на установени тумори и тяхните производни метастази. В модела, SCID мишки се доставят с присадени човешки Т клетки и се имплантират с произлизащи от пациент не-малки белодробни клетки (NSCL) или колоректални карциномни (СС) клетки. Имплантирането се прави в гонадалната (половата) мастна подложка на SCID мишки. Туморите се оставят да израстнат, след което се отстраняват. Мишките развиват човекоподобен тумор и метастази в черния ·· ····

135 .

• · ·· • · · • · · • · · ·· «·· дроб. Такъв модел се описва в Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282-288 (1996).

Очаква се антителата от изобретенито да инхибират растежа на тумори, образувани в такива мишки.

ЛИТЕРАТУРНИ ИЗТОЧНИЦИ ® Всички цитирани тук литературни източници, включително патенти, патентни заявки, литература, книги и други подобни и цитираните в настоящето литератури, в обхват, в който не са вече посочени, са включени в настоящето като справка в тяхната цялост. Освен това, следните литературни източници са включени също в тхната цялост, включително литературните източници, цитирани в посочените литературни източници:

Alegre et al. J Immunol 157:4762-70 (1996) © Allison and Krummel Science 270:932-933 (1995)

Balzano et al. Int J Cancer Suppl 7:28-32 (1992)

Blair et al. J Immunol 160:12-5 (1998)

Blake and Litzi-Davis BioConjugale Chem. 3:510-513 (1992)

Boussiotis et al. Proc Natl Acad Sci U SA 90:11059-63 (1993) ·· ·· ·· ··*· ♦ · · · · ·

• · · · · · ··«··· «

Bowie et al. Science 253:164 (1991)

Bruggeman et al. PNAS USA 86:6709-6713 (1989)

Bruggeman, M. and Neuberger, M.S. in Methods: A companion to

Methods in Enzymology 2:159-165 (Lerner et al. eds. Academic Press (1991))

Bruggemann et al., Human antibody production in transgenic mice: expression from 100 kb of the human IgH locus. Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991)

Bruggemann, M. and Neuberger, M.S. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice. Inlmunology Today 17:391-397 (1996)

Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987)

Bumpers et al J. Surgical Res. 61:282-288 (1996)

Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988))

Castan etal. Immunology 90:265-71 (1997)

Cepero et al. J Exp Med 188:199-204 (1998)

9 9 • 9 ·	·· • ·	···» •	№
• · ·	··	•	··	··

Chen et al. Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the J_H locus International Immunology 5:647-656 (1993)

Chen et al. Cell 71:1093-1102(1992)

Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994)

Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)

Choi et al. Transgenic mice containing a human heavy chain immunoglobulin gene fragment cloned in a yeast artificial chromosome Nature Genetics 4:117-123 (1993)

Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)

Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)

Chuang etal. J. Immunol. 159:144-151(1997)

Coligan et al., Unit 2.1. Enzyme-linked immunosorbent assays, in Current protocols in immunology (1994)

Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990)

Dariavach etal. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)

• e 9 · · »	·· ·♦·· • · ·	^β	• ··
• · · ···· ··	• · · ·· ·	• ·	• ···

Dayhoff, M.0., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1 -10 de Boer et al. Eur J Immunol 23:3120-5 (1993)

Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Evanset al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)

Fallarino et al. J Exp Med 188:205-10 (1998)

Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994)

Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986)

Fishwild et al.. High-avidity human IgGy monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nature Biotech. 14:845851 (1996).

Freeman etal. J Exp Med 178:2185-92 (1993)

Freeman et al. J Immunol 161:2708-15 (1998)

Freeman et al. Science 262:907-9 (1993)

Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul. W.. ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y (1989)) • · • · · · · ·

129

Galfre, G. and Milstein, C., Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)

Gorman et al. P.N AS. 79:6777 (1982)

Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)

Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) ® Grosschedlet al. Cell 41:885 (1985)

Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997)

Harding et al. Nature 356:607-609 (1994)

Harper et al. J Immunol 147:1037-44 (1991)

Hathcock et al. Science 262:905-7 (1993) © Hoganboom etal. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)

Horspool etal. J Immunol 160:2706-14(1998)

J

I Houghten etal. Biolechniques 13:412-421 (1992)

Houghten PNAS USA 82:5131 -5135 (1985)

Hurwitz et al. J Neuroimmunol 73:57-62 (1997) ·· ·· ·«·· .1.30 • · · · · · ·

Hurwitz et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95:10067-71 (1998)

Immunology- A Synthesis (2^nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren,

Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))

Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds..

Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))

Jakobovits et al., Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial-chromosome. Nature 362:255-258 (1993)

Jakobovits, A. et al., Analysis of homozygous mutant chimeric mice: Deletion of the immunoglobulin heavy-chain joining region blocks Bcell development and antibody production. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555 (1993)

Jakobovits, A., Humanizing the mouse genome. Current Biology 4:761-763 (1994)

Jakobovits, A., Production of fully human antibodies by transgenic mice. Currenl Opinion in Biotechnology, 6:561-566(1995]

Junghans et al. in Cancer Chenmotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition. Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))

Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,

N.I.H. publication no. 91-3242

Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))

Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)

Krummel and Allison J Exp Med 182:459-65 (1995)

Krummel etal. Int Immunol 8:519-23 (1996)

A ^w Kuchroo et al. Cell 80:707-18 (1995)

Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997)

LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986)

Lenschow et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:11054-8 (1993)

Lenschow et al. Science 257:789-792 (1992) © Lin etal. J Exp Med 188:199-204 (1998)

Linsley et al. J Exp Med 176:1595-604 (1992)

Linsley etal. J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)

Linsley et al. Science 257:792-795 (1992)

Liuetal. J.Immunol.139:3521 (1987)

Liu etal. P.N.A.S. 84:3439 (1987)

Lonberg et al.. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368:856-859 (1994)

Luhderetal. J Exp Med 187:427-32 (1998)

Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997)

Markees et al. J Clin Invest 101:2446-55 (1998)

Marks et al., Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes.Eur. J. Immunol. 21:985-991(1991)

McCoy et al], J Exp Med 186:183-7 (1997) © Mendez etal. Nuture Genetics 15:146-156 (1997)

Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)

Okayama etal. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)

Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988]

Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A. 85:2444 (1988) • * · · · · · · · ···· ·· · · · · · · · ·

Perez et al. Immunity 6:411 -7 (1997) j

Perrin et al. Immunol Res 14:189-99 (1995)

Perrin et al. Jlmmunol 157:1333-6 (1996)

Pinalla et al. Biotechnigues 13:901-905 (1992)

Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton. E., W. H. 4ft

Freeman and Company, New York(1984))

Razi-Wolf et al. Proc Natl Acad Sci U S A 90:11182-6 (1993) j Remington's Pharmaceutical Sciences (15^th ed, Mack Publishing ί Company, Easton, PA (1975)), particularly Chapter 87 by Blaug,

I Seymour j

Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992) © Russel etal. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)

Schwartz Cell 71:1065 (1992)

Scott TIBS 17:241-245 (1992) | Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)

Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Inlmunol. 79: 315-321 (1990) .··. ···; .KJ4.

Stecetal. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984)

Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)

Taylor et al., A transgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and light chain immunoglobulins. Nucleic Acids Research 20:6287-6295 (1992) • Taylor et al.. Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenous IgM.” International Immunology 6:579-591 (1994)

The McCraw-Hill Dictionery of Chemical Terms (Parker. S., Ed.. McGraw-Hill, San Francisco (1985))

Thornton et at Nature 354:105 (1991)

Tivol et al. Immunity 3:541-7 (1995) © Townsend and Allison Science 259:368 (1993)

Trauneckeretal. Int. J. Cancer (Suppl. 7:51-52 (1992)

Tuaillon et al. Analysis of direct and inverted DJ_H rearrangements in a human Ig heavy chain transgenic minilocus J. Immunol. 154:64536465 (1995)

Tuaillon et al., Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in μ and γ transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724 (1993)

Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)

Van Parijs et al. J Exp Med 186:1119-28 (1997)

Veberand FreidingerTINS p.392 (1985)

Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)

Walunas et al. Immunity Т.405-13 (1994)

Walunas et al. J Exp Med 183:2541-50 (1996)

Waterhouse et al. Science 270:985-988 (1995)

Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993)

Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)

Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 (1997)

Yi-qun et al. Int Immunol 8:37-44 (1996)

Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991)

·· ·· ·· ···· • · · · · · ·
• ·· · ·· ·· ·	·· ···

Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp- 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991))

Fry et al. Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptor and erbB2, by a new class of tyrosine kinase inhibitor Proc Natl Acad Sci U S A 95:12022-7 (1998) e Hoffman et al. A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and

Cdk- interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain J Mol Biol 282:195-208 (1998)

Ginalski et al. Modelling of active forms of protein kinases: p3 8-a case study Acta Biochim Pol 44:557-64 (1997)

Jouko et al. Identification of csk tyrosine phosphorylation sites and a tyrosine residue important for kinase domain structure Biochem J 322:927-35 (1997) ® Singh et al. Structure-based design of a potent, selective, and irreversible inhibitor of the catalytic domain of the erbB receptor subfamily of protein tyrosine kinases J Med Chem 40:1130-5 (1997)

Mandel et al. ABGEN: a knowledge-based automated approach for antibody structure modeling Nat Biotechnol 14:323-8 (1996)

Monfardini et al. Rational design, analysis, and potential utility of ! GM-CSF antagonists Proc Assoc Am Physicians 108:420-31 (1996)

I ·· ···· • · • ·· · ·· ·· · ·· ···

Furet et al. Modelling study of protein kinase inhibitors: binding mode of staurosporine and origin of the selectivity of CGP 52411 J Comput Aided Mol Des 9:465-72 (1995)

III et al.’’Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions Protein Eng 10:949-57 (1997)

Martin et al. The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6 EMBO J 13:5303-9 (1994)

Заявка за патент от САЩ No. 07/466,008. подадена 12.01.1990

Заявка за патент от САЩ No. 07/574.748. подадена 29.08.1990

Заявка за патент от САЩ No. 07/575.962, подадена 31.08.1990

Заявка за патент от САЩ No. 07/610.515, подадена 8.11.1990

Заявка за патент от САЩ No. 07/810,279, подадена 17.12.1991

Заявка за патент от САЩ No. 07/853,408, подадена 18.03.1992

Заявка за патент от САЩ No. 07/904,068, подадена 23.06.1992

Заявка за патент от САЩ No. 07/919,297, подадена 24.07.1992

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

Заявка за патент от

САЩ N0. 07/922,649,

САЩ N0. 07/990,860,

САЩ No. 08/031,801,

САЩ No. 08/053.131,

САЩ No. 08/096,762,

САЩ No. 08/112,848,

САЩ No. 08/155.301,

САЩ No. 08/161.739,

САЩ No. 08/165.699,

САЩ No. 08/209,741, подадена 30.07.1992 подадена 16.12.1992 подадена 15.03.1993 подадена 26.04.1993 подадена 22.07.1993 подадена 27.08.1993 подадена 18.11.199 подадена 3.12.1993 подадена 10.12.1993 подадена 9. 03.1994 ·« ·· ·· ··♦· *··· · · · · ф • ·· · ·· ·· · ·· ···

Заявка за патент от САЩ No. 08/234.145, подадена 28.04.1994

Заявка за патент от САЩ No. 08/724,752, подадена 2.11.1996

Заявка за патент от САЩ No. 08/730,639, подадена 11. 10. 1996

Заявка за патент от САЩ No- 08/759.620, подадена 3.12.1996

Заявка за патент от САЩ No. 08/759,620, подадена 3.12.1996

Патент на САЩ No. 4,399,216

Патент на САЩ No. 4,681,581

Патент на САЩ No. 4,683.195

Патент на САЩ No. 4,683,202

Патент на САЩ No. 4,735,210

Патент на САЩ No. 4,740.461

Патент на САЩ No. 4,816.397

Патент на САЩ No. 4,912,040

Патент на САЩ No. 4,959,455

Патент на САЩ No. 5.101,827

Патент на САЩ No. 5,102,990 (RE 35,500)

Патент на САЩ No- 5,151,510

Патент на САЩ No. 5,194,594 © Патент на САЩ No. 5,434,131

Патент на САЩ No. 5,530.101

Патент на САЩ No. 5,545,806

Патент на САЩ No. 5,545,807

Патент на САЩ No. 5,585,089

Патент на САЩ No. 5,591,669

Патент на САЩ No. 5,612.205

Патент на САЩ No. 5,625,126

Патент на САЩ No. 5,625,825

Патент на САЩ No. 5,633,425

Патент на САЩ No. 5,643.763

Патент на САЩ No. 5,648,471

Патент на САЩ No. 5.661,016

Патент на САЩ No. 5,693.761

Патент на САЩ No. 5,693,792

Патент на САЩ No. 5,697,902

Патент на САЩ No. 5,703.057

Патент на САЩ No. 5,714,350

Патент на САЩ No. 5,721,367

Патент на САЩ No. 5.733,743

Патент на САЩ No. 5.770.197

Патент на САЩ No. 5,770,429

Патент на САЩ No. 5,773.253

Патент на САЩ No. 5.777,085

Патент на САЩ No. 5,789,215

Патент на САЩ No. 5.789.650

Патент на САЩ No. 5,811,097

Европейски патент No. ЕР 0 546 073 В1 © Европейски патент No. ЕР 0 463 151 В1, публикуван 12.06.1996

Международна заявка за патент No. WO 92/02190

Международна заявка за патент No. WO 32/03918

Международна заявка за патент No. WO 92/22645

Международна заявка за патент No. WO 92/22647

Международна заявка за патент No. WO 92/22670

Международна заявка за патент No. WO 93/00431

Международна заявка за патент No. WO 93/12227

Международна заявка за патент No. WO 94/00569 ·· ·♦ • ♦ · ?

• ·· • ·t

99 • 99 ··· ···

Международна заявка за патент No. WO 94/02602, публикувана на 3.02.1994

Международна заявка за патент No. WO 94/25585 Международна заявка за патент No. WO 94/29444 Международна заявка за патент No. WO 95/01994 Международна заявка за патент No. WO 95/03408 Международна заявка за патент No. WO 95/24217 Международна заявка за патент No. WO 95/33770 Международна заявка за патент No. WO 96/14436 Международна заявка за патент No. WO 96/34096, публикувана на 31.10.1996

Международна заявка за патент No, WO 97/13852 Международна заявка за патент No. WO 97/20574 Международна заявка за патент No. WO 97/38137 Международна заявка за патент No. WO 98/24884, Международна заявка за патент No. WO 98/24S93, публикувана на 11.06.1998

ЕКВИВАЛЕНТНИ

Горното описание и примери дават подробности за някои варианти за изпълнение на изобретението и описват най-добрия начин, визиран от изобретателите. Ще бъде оценено, въпреки това, че без значение колко подробни обяснения са дадени в горния текст, изобретението може да се осъществи по много начини и изобретението трябва да се тълкува, съглсно прилежащите патентни претенции и които и да са тяхни еквиваленти.

Claims (34)

1. Човешко моноклонално антитяло, което свързва цитотоксичния Т лимфоцитен антиген 4 (CTLA-4) или негов антиген-свързващ фрагмент.

2. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че посоченото антитяло или негов фрагмент инхибира свързването на човешки CTLA-4 към В7-1 с 1С₅₀ с приблизително 100 пМ или по-малко и инхибира свързването на човешки CTLA-4 към В7-2 с 1С₅о с приблизително 100 пМ или по-малко и където посоченото антитяло притежава поне едно свойство избрано от група състояща се от

a) свързва човешки CTLA-4 с афинитет на свързване от приблизително 10’⁹ или повече;

b) засилва производството на цитокини с 500 pg/ml или повече при изследване на човешки Т клетки

c) засилва производството IL-2 с 500 pg/ml или повече при изследване на човешки Т клетки

d) засилва производството на интерферон-γ с 500 pg/ml или повече при изследване на човешки Т клетки

e) не свързва CTLA-4 от мишка, плъх или заек, и

f) свързва CTLA-4 от cynomolgous и rhesus маймуни.

3. Метод за получаване на антитяло, което се свързва към CTLA-4, характеризиращ се с това, че включва:

а) имунизират се бозайници различни от човек с имуноген, включващ CTLA-4, при което животното е в състояние да експресира чавешки антитела в В клетки на животното;

Заместваща страница ·· ···· 14?

• • ·· • · • · • · ···· • • · · · • · « · • • · · • · ·· ·· • • ф ·♦

b) изолират се В клетки от бозайника;

c) посочените В клетки или клетъчни линии произлизащи от тях се скринират за антитела, които се свързват към CTLA-4;

d) култивира се линия, експресираща антитела, които се свързват CTLA-4; и

e) изолират се антителата, които се свързват към CTLA-4.

4. Антитяло, което се свързва към CTLA-4, което е получено по метода съгласно претенция 3.

5. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция от

1, 2 и 4, характеризащо се с това, че посоченото антитяло инхибира свързването на човешки CTLA-4 към В7-1 с 1С₅о помалко от приблизително 0,50 пМ и инхибира свързването на човешки CTLA-4 към В7-2 с ICso с по-малко от приблизително 0,38 пМ.

6. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че включва лека верига на © аминокиселинна последователност избрана от група състояща се от

a) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки А27 V_L ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

b) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки 012 V_L ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

Заместваща страница • · ♦ · · · · · · ···· ·· ·· · ·· ···

c) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки А10/А26 V_L ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

d) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки А17 V_L ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация; и

e) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки АЗ/А19 V_L ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация.

7. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 6, характеризащо се с това, че посочената аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки А27 V_L ген съдържа поне 1 мутация, избрана от групъ състояща се от :

a) поне една аминокиселина в CDR1 е делетирана в сравнение с аминокиселинната последователност от зародишна линия на човешки А27 V_L ген;

b) сериновият остатък в позиция 6 в зародишната линия CDR3, показана на фигура 4 на човешкия V_L А27 ген се © замества, и

c) CDR1 съдържа поне едно консервативно или неконсервативно аминокиселинно заместване, в сравнение с аминокиселинната последователност от зародишна линия на човешки А27 V_L ген

8. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция 1, 2 и 4 до 7, характеризащо се с това, че съдържа лека верига на CDR1, CDR2 или CDR3 последователност показани на коя да е от фигури 4 и 8.

Заместваща страница ·♦ ·· ·· ··<· >44 ♦ ·· · · · · ··· ···♦ ·· • · ·· 0

9. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 8, характеризащо се с това, че CDR1, CDR2 или CDR3 аминокиселинната последователност се избира от група състояща се от

a) CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинната последователност на антитяло 4.1.1, антитяло 4.8.1, антитяло

4.14.3, антитяло 6.1.1, антитяло 4.10.2, или 4.13.1., както е показано на фигура 4;

©b) CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинната последователност на антитяло 3.1.1, антитяло 11.2.1, антитяло

11.6.1, антитяло 11.7.1, както е показано на фигура 5;

с) CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинната последователност на антитяло 2.1.3, както е показано на фигура 6;

d) CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинната последователност на антитяло 12.3.1, както е показано на фигура 7, и

е) CDR1, CDR2 и CDR3 аминокиселинната последователност на антитяло 12.9.1, както е показано на © фигура 8.

10. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция 1, 2 и 4 до 9, характеризащо се с това, че съдържа лека верига на аминокиселинна последователост, избрана от група състояща се от аминокиселинните последователности посочени на SEQ ID N0: 14-26, 65, 67, 69 или 71.

11. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция 1, 2 и 4 до 10, характеризащо се с това, че включва тежка верига

Заместваща страница ·· ·· ·♦ ··♦· 4tfLR · • · · · ·· · ·' Π»⁴·* · · ······ ··· ·······<··· ··· ··· ··· ···· ·· ·· · ·· ··· съдържаща аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки V_H 3-33 (DP-50) ген или посочената последователност с поне 1 мутация.

12. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че включва тежка верига на аминокиселинна последователност избрана от група състояща се от

a) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки V_H 3-33 (DP-50) ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

b) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки V_H 4-31 (DP-65) ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

c) аминокиселинна последователност от зародишна линия на човешки V_H DP-47 ген или посочената последователност от зародишна линия с поне 1 мутация;

13. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1 или 11, характеризащо се с това, че съдържа тежка верига на CDR1, CDR2 или CDR3 последователност показани фигури 2.

14. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция 1, характеризащо се с това, че тежката верига съдържа на CDR1, CDR2 или CDR3 аминокиселинни последователности от антитяло, показано на фигури 2.

15. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 14, характеризащо се с това, че съдържа тежка

Заместваща страница

• ·· • · · ·· *·«· • · · иго · • · ·· • • • · · • · · • · *· ·· · ·· ··

верига на аминокиселинна последователост, избрана от група състояща се от аминокиселинните последователности посочени на SEQ ID NO: 1-8, 10-13, 63, 66, 68 или 70.

16. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1, характеризащо се с това, че посоченото антитяло или фрагмент се избира от група състояща се от

а) антитяло или фрагмент, съдържащо вариабилна област ®на тежка верига на аминокиселинна последователност показана на SEQ ID NO: 63 и включваща освен това вариабилната област на аминокиселинната последователност на леката верига, показана на SEQ ID NO: 65;

b) антитяло или фрагмент, съдържащо вариабилна област на тежка верига на аминокиселинна последователност показана на SEQ ID NO: 66 и включваща освен това вариабилната област на аминокиселинната последователност на леката верига, показана на SEQ ID N0: 67;

с) антитяло или фрагмент, съдържащо вариабилна област на тежка верига на аминокиселинна последователност показана © на SEQ ID N0: 68 и включваща освен това вариабилната област на аминокиселинната последователност на леката верига, показана на SEQ ID N0: 69;

d) антитяло или фрагмент, съдържащо вариабилна област на тежка верига на аминокиселинна последователност показана на SEQ ID N0: 70 и включваща освен това вариабилната област на аминокиселинната последователност на леката верига, показана на SEQ ID N0: 71.

Заместваща страница ·· ·· • · · ·· ···· • · ·

М7

17. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 16, характеризащо се с това, че посоченото антитяло или фрагмент се избира от група състояща се от

a) аминокиселинна последователност на тежка верига на SEQ ID NO: 63 и аминокиселинната последователност на леката верига на SEQ ID N0: 65, като на посоченото антитяло липсват сигналните пептиди, показани на посочените последователности;

b) аминокиселинна последователност на тежка верига на SEQ ID N0: 66 и аминокиселинната последователност на леката верига на SEQ ID N0: 67, като на посоченото антитяло липсват сигналните пептиди, показани на посочените последователности;

c) аминокиселинна последователност на тежка верига на SEQ ID N0: 68 и аминокиселинната последователност на леката верига на SEQ ID N0: 69, като на посоченото антитяло липсват сигналните пептиди, показани на посочените последователности;

d) аминокиселинна последователност на тежка верига на SEQ ID N0: 70 и аминокиселинната последователност на леката верига на SEQ ID N0: 71, като на посоченото антитяло липсват сигналните пептиди, показани на посочените последователности.

18. Антитяло или фрагмент, съгласно претенция 1, характеризащо се с това, че притежава едно или повече качества, избрани от група състояща се от:

а) компететивно инхибира свързването към CTLA-4 чрез антитялото, съгласно претенция 16 или 17;

Заместваща страница ·· ♦· ·· ···· 4»4*O • « · · · · · · > · ··· · · · ··· ···· · · · · · ·· «··

b) свързва същия епитоп както антитялото, съгласно претенция 16 или 17;

c) притежава специфичност на свързване, която е по същество същата както антитялото съгласно пертенция 16 или 17;

19. Антитяло, което компететивно инхибира свързването към CTLA-4 чрез антитяло 4.1.1, 4.8.1, 6.1.1 или 11.2.1, притежаващо аминокиселинна последователност показана на ® фигура 22.

20. Антитялото, съгласно претенция 19, характеризиращо се с това, че включва CDR последователност идентична на CDR последователността на антитяло посочено на фигура 22.

21. Антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция 1, 2 и 4 до 5, характеризащо се с това, че съдържа поне едно от следните:

a) човешки FR1, FR2 и FR3 последователности, кодирани © от човешко V_H 3-33 ген но семейство или посоченото ген но семейство с консервативни замествания, единично неконсерватино заместване или и двете; или

b) човешки FR1, FR2 и FR3 последователности, кодирани от човешко V_K А27 генно семейство или посоченото генно семейство с консервативни замествания, единично неконсерватино заместване или и двете.

Заместваща страница ·♦ ·· ♦· ···· MQ ···· · · · ·Ι · • · · · · · * · · ·*«· «· ·· · 4« ·♦♦

22. Антитяло, което се свързва към CTLA-4, което съдържа аминокиселинна последователност, избрана от група състояща се от:

a) аминокиселинна последователност, включваща аминокиселинни остатъци 1-89 от SEQ ID NO 5, операционно свързани към CDR3 аминокиселинна последователност, която се кодира от D7-27 гена и JH4 гена,

b) посочената аминокиселинна последователност, ©включваща освен това мутации при позиции 24, 40 и 47 от аминокиселинните остатъци 1-89 от SEQ ID N0 5 и

с) посочената аминокиселинна последователност включваща освен това мутации при позиции 1, 3 и 7 от CDR3 аминокиселинната последователност.

I j

23. Клетъчно културална система за изследване на

Т-клетъчно стимулиране, включваща кулура от човешки Т

I клетъчни бласти, съвместно култивирани с Raji клетъчна линия.

!

24. Изследване за измерване на Т-клетъчно стимулиране, © характеризиращо се с това , че включва следните етапите:

; а) доставя се култура от Т клетъчни бласти и Raji клетъчна ί

линия,

Ь) културата се привежда в контакт със средство; и j с) измерва се производството на цитокини от културата.

I

25. Фармацевтичен състав, използуван при лечението на рак, възпаления или автоимунни заболявалия, характеризиращ се с това, че включва антитяло или фрагмент, съгласно коя да е от претенции 1, 2 и 4 до 22 и фармацевтично приемлив носител.

Заместваща страница ·· ·· • ♦ · * ·· ···· • · · .1$о.

• · · ···· ·· • · · ·· · • · · »· ···

26. Клетъчна линия, която продуцира антитялото или фрагмент, съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 22.

27. Изолирана нуклеинова киселина, която кодира тежката верига или леката верига на антитялото или фрагмент, съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 22, или фрагмент на посочената нуклеинова киселина.

28. Изолирана нуклеинова киселина, съгласно претенция 27, характеризираща се с това, че е операционно свързна към последователност за контрол на експресията.

29. Клетка гостоприемник, притежаваща изолирана нуклеиновата киселина от претенция 27 или 28.

30. Трансгенен бозайник или растение, притежаващи изолирана нуклеинова киселина от претенция 27 или 28, като трансгенният бозайник или растение експресират посочената нуклеинова киселина.

31. Метод за засилване на производството на цитокини в Т-клетки в субект, характеризиращ се с това, че включва етап, при който се прилага върху субекта антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 22, или фармацевтичен състав, съгласно претеция 25.

32. Метод за засилване на цитотоксичния Т-клетъчен отговор в субект, характеризиращ се с това, че включва етап, при който се прилага върху субекта антитяло или фрагмент,

Заместваща страница ·· ·· • · · >5.1.

• · ···· ·· • · ·· · • · ·· · съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 22 или фармацевтичен състав, съгладно претенция 25.

33. Метод за лечение на тумори в субект, характеризиращ се с това, че включва етап, при който върху субекта се прилага комбинация, включваща антитяло или фрагмент, съгласно коя да е претенция от 1, 2 и 4 до 22 или фармацевтичен състав, съгладно претенция 25 и клетки експресиращи гранулоцитмакрофаг колония стимулиращ фактор.

34. Метод, съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че посоченото антитяло или фрагмент не участва в цитотоксичност зависима от комплемента.