BR112019010878A2

BR112019010878A2 - combinação de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células t com moduladores de ponto de verificação imunológico e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112019010878A2
Application number: BR112019010878A
Authority: BR
Inventors: Lindhofer Horst; Ruf Peter
Original assignee: Lindhofer Horst
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2019-10-01
Also published as: WO2018099539A1; RU2019119178A; US20230348619A1; KR20190087441A; AU2017369540A1; CA3043656A1; JP2019514846A; CN110312525A; US20190375852A1; WO2018099978A1; JP2021178835A; EP3548080A1; RU2019119178A3; JP7148406B2

Abstract

a presente invenção provê uma combinação de (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células t, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerosa. o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células t compreende (a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células t; (b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação para fcyri, fcyriia e/ou fcyriii humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, se liga com maior afinidade a fcyri, fcyriia e/ou fcyriii humano do que a fcyriib humano.

Description

COMBINAÇÃO DE ANTICORPOS MULTIFUNCIONAIS DE REDIRECIONAMENTO DE CÉLULAS T COM MODULADORES DE PONTO DE VERIFICAÇÃO IMUNOLÓGICO E USOS DOS MESMOS [001] A presente invenção refere-se ao campo da imunoterapia de doenças cancerígenas, em particular, à aplicação de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T e moduladores de ponto de verificação imunológico no tratamento terapêutico/curativo de doenças cancerígenas.

[002] A imunoterapia em oncologia é um campo em constante crescimento. Isto é demonstrado pela recente aprovação de Yervoy® (Ipilimumab, Bristol Myers Squibb), Opdivo® (Nivolumab, Bristol Myers Squibb) e Keytruda® (Pembrolizumab, Merck). Estes anticorpos monoclonais (mAbs) são direcionados contra a proteína associada a linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-4) ou a proteína de morte celular programada 1 (PD-1). Um terceiro alvo de câncer fortemente explorado é o ligando de morte programada 1 (PD-L1). Todos esses alvos têm em comum o fato de serem reguladores chave negativos para linfócitos T, as chamadas moléculas do ponto de verificação imunológico inibitórias. Os pontos de verificação imunológicos são moléculas do sistema imunológico, em particular, de certas células do sistema imunológico, que precisam ser ativadas (moléculas do ponto de verificação estimuladoras ou coestimuladoras) ou inativadas (moléculas do ponto de verificação inibitórias) para iniciar uma resposta imunológica. Muitos dos pontos de verificação imunológicos são regulados por interações entre o receptor especifico e os pares de ligandos. Muitas vezes, os cânceres protegem-se do sistema imunológico usando esses

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 7/151

2/140 pontos de verificação para evitar serem atacados pelo sistema imunológico.

[003] O receptor PD-1 é expressado na superfície de células T ativadas e outras células imunológicas, tais como as células B. Seus ligandos (PD-L1 e PD-L2) são expressados na superfície de células apresentadoras de antigenos, tais como células dendriticas ou macrófagos, e outras células imunológicas. A ligação de PD-L1 ou PD-L2 a PD1 desencadeia um sinal na célula T, que basicamente desliga ou inibe a célula T. Sob condições não patológicas, essa interação impede que as células T ataquem outras células do corpo. No entanto, as células cancerígenas geralmente aproveitam esse sistema e expressam altos niveis de PD-L1 em sua superfície. Assim, as células cancerígenas são capazes de desligar as células T que expressam PD-1 e, assim, suprimir a resposta imunológica anticâncer. Os inibidores de PD1 e/ou dos seus ligandos, tais como anticorpos monoclonais inibitórios/antagonistas direcionados a PD1 ou aos seus ligandos, podem reforçar a resposta imunológica contra as células cancerígenas e são, assim, promissores no tratamento de cânceres. Exemplos de anticorpos monoclonais inibitórios/antagonistas contra PD1, atualmente aprovados, incluem Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb) e Keytruda® (Pembrolizumab; Merck). Outros inibidores da via PD1, que estão atualmente em fase clinica II e/ou III

incluem Pidilizumab	(mAb	que		inibe	PD1;
CureTech/Medivation),	Durvaiumab	(mAb	que	inibe	PD-L1;
Medlmmune/AstraZeneca) ,	Avelumab	(mAb	que	inibe	PD-L1;
Merck Serono/Pfizer) e	Atezolimab	(mAb	que	inibe	PD-L1;

Roche).

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 8/151

3/140 [004] 0 Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb), um outro modulador de ponto de verificação imunológico aprovado, é um anticorpo monoclonal inibitório/antagonista contra o antígeno associado a linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4). O CTLA4 também é expressado na superfície de células T ativadas e seus ligantes são expressados na superfície de células apresentadoras de antigenos profissionais. Acredita-se que o CTLA-4 regule a proliferação de células T no inicio em uma resposta imune, principalmente nos linfonodos e afeta o funcionamento das células T reguladoras. Outro inibidor de CTLA-4, que está atualmente em fase clinica II, é, por exemplo, Tremelimumab (Medlmmune/AstraZeneca) .

[005] A ligação dos ligandos naturais B7.1 e B7.2 a CTLA-4 e de PD-L1/PD-L2 a PD-1 em células T ativadas inibe sinais positivos mediados pelo receptor de células T (TCR) ou pelo receptor CD28 coestimulador e, desse modo, leva à supressão de respostas de células T como um mecanismo natural para contornar a reação exagerada imunológica. Pesquisa intensiva e desenvolvimento clinico revelaram que o bloqueio de moléculas do ponto de verificação imunológico pelos mAbs leva à ativação de células T sustentada que pode ser aproveitada para combater o câncer. Portanto, o bloqueio de ponto de verificação imunológicos mediado por anticorpos é uma abordagem eficaz para reforçar as funções de células T reativas ao tumor.

[006] Uma vez que os anticorpos inibidores (bloqueadores) de pontos de verificação imunológicos atuam através de uma ativação mais não especifica do sistema imunológico, existem inúmeras abordagens para combiná-los

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 9/151

4/140 com outros regimes de tratamento do câncer. A firn de reduzir a carga tumoral, os anticorpos inibidores (bloqueadores) do ponto de verificação imunológico (bloqueio) foram combinados com quimioterapia. A desvantagem desta abordagem é que os agentes quimioterapêuticos fortes têm um impacto negativo na função do sistema imunológico, reduzindo a eficácia dos fármacos imunoterapêuticos. Alternativamente, os anticorpos inibidores (bloqueadores) do ponto de verificação imunológico são combinados com outros inibidores do ponto de verificação imunológico. Um exemplo é a terapia combinada de Yervoy® e Opdivo®, que foi aprovada pela FDA em 2015 para o tratamento de pacientes com melanoma de tipo selvagem, irressecável ou metastático BRAF V600. Além disso, um estudo bem-sucedido da fase 1b sobre a combinação de Durvalumab e Tremelimumab em câncer de pulmão de células não pequenas foi relatado recentemente (Antonia, Scott et ai., 2016, Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in non-small cell lung cancer: a multicentre, phase lb study; Lancet Oncol. 5 de fevereiro de 2016. pii: 31470-2045(15)00544-6. doi: 10.1016/314702045(15)00544-6. [Publicação de versão eletrônica]).

[007] A desvantagem, no entanto, é um aumento significativo dos efeitos colaterais negativos (Tsai e Daud. Nivolumab plus Ipilimumab in the treatment of advanced melanoma. Journal of Hematology & Oncology (2015) 8:123). Além disso, a combinação de moduladores de ponto de verificação entre si só tem como alvo a imunidade endógena especifica de tumor, em particular, uma vez que não são direcionados antígenos específicos de tumor.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 10/151

5/140 [008] Em vista do exposto acima, existe uma necessidade de uma imunoterapia melhorada para utilização no tratamento de uma doença cancerígena. Assim, o objetivo da presente invenção é superar as desvantagens das imunoterapias atuais para câncer esboçadas acima e prover uma nova combinação para uso no tratamento de uma doença cancerígena, que melhora a sobrevida de pacientes que

sofrem de	câncer, e que	tem um menor risco	de	efeitos
colaterais.
[009]	Este objetivo	é alcançado por meio	do	objeto

definido abaixo e nas reivindicações anexas.

[0010] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada às metodologias, aos protocolos e aos reagentes aqui descritos em particular, uma vez que estes podem variar. É também para ser entendido que a terminologia usada aqui não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitada apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como normalmente entendidos por um qualificado comum na técnica.

[0011] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Estes elementos estão listados com modalidades específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os vários exemplos descritos e as modalidades preferidas não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às modalidades explicitamente descritas. Esta descrição

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 11/151

6/140 deve ser entendida como suporte e englobar modalidades que combinam as modalidades explicitamente descritas com qualquer número dos elementos descritos e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser considerados descritos pela descrição do presente pedido a menos que o contexto indique o contrário.

[0012] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija o contrário, o termo compreende e variações, tais como, compreende e compreendendo, serão entendidos como implicando a inclusão de um membro estabelecido, inteiro ou em etapas, mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou em etapas não estabelecido. O termo consiste em é uma modalidade particular do termo compreender, em que qualquer outro membro, inteiro ou em etapas não estabelecido é excluído. No contexto da presente invenção, o termo compreender engloba o termo consistir em. O termo compreendendo abrange assim incluindo bem como consistindo, por exemplo, uma composição compreendendo X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[0013] Os termos um e uma e a e referência semelhante usada no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser elaborados para cobrir tanto o singular como o plural, assim como relativo ao gênero, salvo indicação em contrário ou claramente contradito pelo contexto. Representação de faixas de valores aqui é meramente destinada a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 12/151

7/140 valor separado dentro da faixa. Salvo indicação em contrário, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente descrito aqui. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0014] A palavra substancialmente não exclui completamente, por exemplo, uma composição que é substancialmente livre de Y pode ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra substancialmente pode ser omitida da definição da invenção.

[0015] O termo cerca de em relação a um valor numérico x significa x ± 10%.

Combinação para uso em tratamento terapêutico de uma doença cancerígena [0016] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma combinação de (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (isolado) ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um Sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano(s) do que a FcyRIIb humano;

para uso no tratamento terapêutico de uma doença

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 13/151

8/140 cancerígena .

[0017] A combinação de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T (trAbs) com moduladores de ponto de verificação imunológico representa uma nova abordagem de tratamento anticâncer que combina várias imunoterapias únicas e complementares:

[0018] Em primeiro lugar, os efeitos colaterais negativos são reduzidos. O bloqueio de moléculas do ponto de verificação imunológico inibitórias leva a uma ativação forte e inespecífica de células T que podem causar distúrbios autoimunes graves, tais, como colite, diarréia, pneumonite, hepatite etc. A combinação com anticorpos multifuncionais de células T orienta as células T para

longe do tecido	saudável	para trazê-los para	o sítio	do
tumor. Assim, as	reações	autoimunes podem ser	inibidas	ou
reduzidas.
[0019] Além	disso, o	sítio de ligação do	receptor	Fc

de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T recruta e estimula as células acessórias, tais como as células dendríticas (DCs) ou os macrófagos, através da ativação dos receptores Fc. Estas células provêm estímulos adicionais às células T, captam os detritos das células tumorais e apresentam peptídeos derivados do tumor para o sistema imunológico. Assim, os anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T não apenas levam à destruição do tumor dependente de células T, mas também induzem uma memória imunológica específica de tumor de longa duração.

[0020] Além disso, a eficácia terapêutica é melhorada pela ativação prolongada de células T. Verificou-se que a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 14/151

9/140 ativação de células T por anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T é acompanhada por uma expressão aumentada de moléculas do ponto de verificação imunológico, que, por sua vez, regula negativamente as células T ativadas. Assim, o uso combinatorial de anticorpos de bloqueio do inibidor de ponto de verificação conduz a uma ativação sustentada e prolongada de células T, que é vantajosa para o efeito antitumoral direto de anticorpos de redirecionamento de células T multifuncionais .

[0021] Em resumo, a combinação de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T com moduladores de ponto de verificação imunológico aumenta consideravelmente a eficácia antitumoral terapêutica dos fármacos isolados (Figura 1) . Além disso, pode até reduzir os efeitos colaterais negativos substanciais dos moduladores de ponto de verificação imunológico.

[0022] A seguir, os componentes da combinação para uso de acordo com a presente invenção, isto é, o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T, uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, e modalidades preferidas dos mesmos, são descritos em detalhes. Além disso, também o uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena e as modalidades preferidas da mesma, são descritas em detalhes abaixo. Entende-se que (i) uma modalidade preferida da combinação para uso de acordo com a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 15/151

10/140 presente invenção compreende uma modalidade preferida do modulador de ponto de verificação imunológico; (ii) uma modalidade preferida da combinação para uso de acordo com a presente invenção compreende uma modalidade preferida do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T, uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano; e (iii) uma modalidade preferida da combinação para uso de acordo com a presente invenção compreende uma modalidade preferida do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena. Uma modalidade mais preferida da combinação para uso de acordo com a presente invenção compreende (i) uma modalidade preferida do modulador de ponto de verificação imunológico e uma modalidade preferida do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T, uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano; (ii) uma modalidade preferida do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T, uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, e uma modalidade preferida do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena; ou (iii) uma modalidade preferida do modulador de ponto de verificação imunológico e uma modalidade preferida do uso

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 16/151

11/140 no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena. Mais de preferência, uma modalidade da combinação para uso de acordo com a presente invenção compreende (i) uma modalidade preferida do modulador de ponto de verificação imunológico; (ii) uma modalidade preferida do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T, uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano; e (iii) uma modalidade preferida do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena.

Anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T [0023] Como aqui usado (isto é, ao longo do presente pedido), o termo anticorpo abrange várias formas de anticorpos, de preferência, anticorpos monoclonais incluindo, mas não sendo limitados a, anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos, anticorpos humanos, anticorpos quiméricos, anticorpos recombinantes, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quimicamente modificados e anticorpos geneticamente modificados (anticorpos variantes ou mutantes) desde que as propriedades características de acordo com a invenção sejam mantidas. Exemplos preferidos de anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos, simulados de anticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpos, conjugados de anticorpos, anticorpos de cadeia simples, derivados de anticorpos, análogos de anticorpos e

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 17/151

12/140 fragmentos dos mesmos, respectivamente. Anticorpos recombinantes, em particular, anticorpos monoclonais recombinantes, são mais preferidos. Além disso, é também preferido que o anticorpo seja um anticorpo de multicadeias, isto é, um anticorpo compreendendo mais do que uma cadeia, que é assim diferente de um anticorpo de cadeia simples. Além disso, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno, pode ser total ou parcialmente de origem humana ou humanizado. A humanização de anticorpos é conhecida na técnica (ver, por exemplo, Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405). De preferência, pelo menos as (seis) CDRs (regiões determinantes da complementariedade) e/ou as regiões estruturais, mais de preferência as regiões variáveis, são de origem humana e/ou humanizadas. Salvo indicação em contrário, o termo anticorpo inclui, além de anticorpos compreendendo duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, também derivados, variantes e fragmentos dos mesmos. Em alguns casos, um anticorpo pode incluir menos cadeias.

[0024] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo monoclonal, ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo. Aqui, um anticorpo monoclonal (mAb ou moAb) é entendido como anticorpo feito por células imunológicas idênticas que são todos clones de uma célula precursora única, em contraste com anticorpos policlonais que são feitos a partir de várias células imunológicas diferentes. Geralmente, é possível produzir um anticorpo monoclonal que se liga

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 18/151

13/140 especificamente a uma substância específica.

[0025] O termo anticorpo humano, como aqui usado, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M. A., e van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . Anticorpos humanos podem também ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, na imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinal humana em tais camundongos mutantes da linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos no desafio do antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits, A., et al. , Proa. Natl. Acad. Sei. EUA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al. , Nature 362 (1993) 255-258, Bruggemann, M. et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340) . Anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom, H.R., e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581597) . As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); e Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) . O termo anticorpo humano, como aqui usado, compreende também anticorpos que são modificados, por exemplo, na região variável e/ou na região Fc, para gerar as propriedades de acordo com a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 19/151

14/140 invenção .

[0026] Como aqui usado, o termo anticorpo recombinante pretende incluir todos os anticorpos, que não ocorrem na natureza, em particular, anticorpos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como, anticorpos isolados de uma célula hospedeira, tal como, por exemplo, uma célula CHO ou de um animal (por exemplo, um camundongo) ou anticorpos expressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Tais anticorpos recombinantes têm regiões variáveis e constantes em uma forma rearranjada, em comparação com anticorpos de ocorrência natural.

[0027] Como aqui usado, os termos fragmento de ligação a antigeno, fragmento e fragmento de anticorpo são usados alternadamente para referir-se qualquer fragmento de um anticorpo da invenção que retém a atividade de ligação especifica de anticorpo para uso de acordo com a invenção, em particular, a especificidade contra um antigeno de superfície de células T, a especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor, e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, anticorpo de sc (cadeia simples), scFv-Fc, scFv-CH3, scDiacorpo-CH3, Diacorpo-CH3, minicorpo, scFvKIH, Fab-scFv-Fc, scDiacorpo-Fc, Diacorpo-Fc e scFv-Fc em tandem (por exemplo, como descrito em Spiess C., Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106). Os fragmentos dos anticorpos da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos por métodos que incluem digestão com

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 20/151

15/140 enzimas, tais como pepsina ou papaina e/ou por divagem de ligações dissulfeto por redução química. Alternativamente, os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por clonagem e expressão de parte das sequências das cadeias pesadas e/ou leves. A invenção também abrange fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) incluindo a região CH3 derivada das cadeias pesada e leve de um anticorpo da invenção. Por exemplo, a invenção inclui um scFv-CH3 ou um scFv-Fc compreendendo as CDRs de um anticorpo da invenção. Também são incluídos os monômeros e dímeros de cadeia pesada ou leve, anticorpos de cadeia pesada de domínio único, anticorpos de cadeia leve de domínio único, assim como anticorpos de cadeia simples, por exemplo, Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve são unidos por um ligante de peptídeo. Os fragmentos de anticorpo da invenção são tipicamente multivalentes e podem estar contidos em uma variedade de estruturas como descrito acima. Por exemplo, moléculas scFv podem ser sintetizadas para criar um triacorpo trivalente ou um tetracorpo tetravalente. As moléculas scFv incluem, de preferência, um domínio da região Fc. Embora o relatório descritivo, incluindo as reivindicações, possa, em alguns lugares, referir-se explicitamente ao(s) fragmento(s) de ligação a antígeno, fragmento(s) de anticorpo, variante (s) e/ou derivado(s) de anticorpos, entende-se que termo anticorpo ou anticorpo da invenção inclui todas as categorias de anticorpos, ou seja, fragmento(s) de ligação a antígeno, fragmento(s) de anticorpo, variante(s) e derivado(s) de anticorpos.

[0028] O anticorpo, ou o fragmento do mesmo, para uso

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 21/151

16/140 de acordo com a presente invenção é um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento do mesmo.

[0029] Como aqui usado, um anticorpo de redirecionamento de células T, ou o fragmento do mesmo, é um anticorpo, ou o fragmento do mesmo, que provê uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T bem como uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor. Isto permite que o anticorpo, ou o fragmento do mesmo, redirecione as células T para as células cancerígenas. Desse modo, uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T significa, em particular, que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que reconhece um epitopo de um antigeno de superfície de célula T. Em outras palavras, a expressão uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T significa, em particular, que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um sítio de ligação para um antigeno de superfície de células T. Por conseguinte, uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor significa, em particular, que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que reconhece um epitopo de um antigeno associado a tumor e/ou câncer. Em outras palavras, a expressão uma especificidade contra um antigeno associado a tumor e/ou câncer significa, em particular, que o anticorpo, ou o fragmento

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 22/151

17/140 de ligação a antígeno, para uso de acordo com a presente invenção, compreende um sítio de ligação para um antígeno associado a câncer e/ou tumor.

[0030] Importante, em contraste com os anticorpos convencionais (comuns) exibindo apenas uma especificidade única, os anticorpos de redirecionamento de células T são capazes de se ligar a pelo menos dois epitopos diferentes, ou seja, um epitopo em uma célula cancerígena/tumoral, e um epitopo em uma célula T, assim redirecionando a célula T para a célula cancerígena/tumoral, resultando na morte celular mediada por células T. Por conseguinte, os anticorpos de redirecionamento de células T para uso de acordo com a presente invenção exibem propriedades de redirecionamento de células T, isto é, o anticorpo é tipicamente capaz de reativar células T específicas de tumor estando no estado anérgico e/ou células T diretas para o desejado antígeno (como provido por uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor do anticorpo).

[0031] Como aqui usado, um anticorpo multifuncional, ou o fragmento do mesmo, é um anticorpo, ou o fragmento do mesmo, que é capaz de interagir com múltiplos sítios de ligação distintos simultaneamente. Uma vez que o anticorpo, ou o fragmento do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende (pelo menos) (a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T, (b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, o anticorpo multifuncional, ou o fragmento do mesmo, é pelo menos um anticorpo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 23/151

18/140 trifuncional, ou um fragmento do mesmo. Trifuncional significa que o anticorpo, ou o fragmento do mesmo, é capaz de interagir com três sítios de ligação distintos simultaneamente.

[0032] Como descrito acima, anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T compreendem um braço de ligação específico de antígeno associado a tumor (TAA), um segundo braço de ligação específico para um antígeno de superfície de células T, tal como CD3 expressado em células T, e um sítio de ligação para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano que, em particular, se ligam, de preferência, a receptores Fey de ativação, tal como FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, que estão presentes em células acessórias, tais como, macrófagos, células dendríticas (DCs) ou células exterminadoras naturais (NK) . Sem estarem ligados a qualquer teoria, foi assumido o seguinte modo de ação de anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T em terapia de tumores (Lindhofer H, Hess J, Ruf P. Trifuncional Triomab® para terapia de câncer. Em: Bispecific antibodies. Springer, Berlin, 2011, págs. 289312) : Acredita-se que a primeira etapa crucial neste modo de ação seja o redirecionamento de células T para o tumor através da reticulação mediada por anticorpos biespecíficos de um TAA com o antígeno de superfície de células T, tal como CD3. O encaixe mediado por anticorpos de um antígeno de superfície de células T, tal como CD3, como um componente do complexo receptor de células T é um poderoso primeiro estímulo para ativar células T em uma maneira independente do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), acompanhado por secreção de IFN-g e TNF-a. No

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 24/151

19/140 entanto, a ativação fisiológica de células T requer um segundo sinal. Atraídas por células T opsonizadas e células tumorais, bem como por citocinas pró-inflamatórias, células imunológicas positivas de FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII são adicionalmente encaixadas através do sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII dos anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T. Um grupamento de diferentes tipos de células imunológicas é formado na célula tumoral.

[0033] Essa formação de complexo de células triplas consistindo em células tumorais, células T e células imunológicas acessórias FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII positivas sugere várias consequências importantes: Primeiro, há estimulação mútua de células imunológicas acessórias e células T. A interação desencadeada por anticorpos multifuncionais de redirecionamento de células T e monócitos CD14-positivos resulta na regulação positiva de CD83, CD86 e CD40 (Riechelmann H, Wiesneth M, Schauwecker P, Reinhardt P, Gronau S, Schmitt A, Schroen C, Atz J, Schmitt M (2007) Adoptive therapy of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immune cells: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother 56:1 397-1406; Stanglmaier M, Faltin M, Ruf P, Bodenhausen A, Schroder P, Lindhofer H (2008) Bi20 (FBTA05), a novel tri functional bispecific antibody (anti-CD20 _ anti-CD3), mediates efficient killing of B-cell lymphoma cells even with very low CD20 expression levels. Int J Cancer 123:1181 -1189; Zeidler R, Mysliwietz J, Csanady M, Walz A, Ziegler I, Schmitt B, Wollenberg B, Lindhofer H (2000) The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 25/151

20/140 activation of accessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumour cells. Br J Cancer 83:261 266). Assim, as células T recebem um segundo sinal coestimulador na forma de interação CD40/CD40L ou CD80CD86/CD28. Como consequência, eles são profundamente e f isiologicamente ativados, como caracterizado pela alta

secreção de	IL-2 e forte proliferação com .	a detecção	do
marcador de proliferação Ki-67. Adicionalmente,	os
marcadores	de ativação de células T CD25	e CD 6 9	são
regulados	positivamente (Riechelmann H,	Wiesneth	M,
Schauwecker	P, Reinhardt P, Gronau S, Schmitt	A, Schroen	c,

Atz J, Schmitt M (2007) Adoptive therapy of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immune cells: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother 56:13971406). Por outro lado, células imunológicas acessórias são estimuladas por interação com células T e reticulação de FcgR. Essa estimulação se manifesta à medida que niveis altos de citocinas pró-inflamatórias, tal como IL-6 e IL-12 são medidos, que são principalmente secretadas por células acessórias. Além disso, a interferência entre as células acessórias e células T é indicada pela liberação de citocinas com tendência a Thl, especialmente IL-2 e IFN-g. Finalmente, as células tumorais alvejadas são eficientemente destruídas pelo ataque combinado de diferentes tipos de células efetoras imunológicas, como mostrado em configurações alogênicas, bem como em sistemas ex vivo de humanos autólogos (Gronau SS, Schmitt M., Thess B, Reinhardt P, Wiesneth M, Schmitt A, Riechelmann H (2005) Tri functional bispecific antibody-induced tumor cell lysis of squamous cell carcinomas of the upper

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 26/151

21/140 aerodigestive tract. Head Neck 27:376-382). As células e partículas tumorais necróticas e apoptóticas são fagocitadas (Riesenberg R, Buchner A, Pohla H, Lindhofer H (2001) Lysis of prostate carcinoma cells by tri functional Bispecific antibodies (alfa EpCAM _ alfa CDS). J Histochem Cytochem 49:91 1-917; Zeidler R, Mysliwietz J, Csanady M, Walz A, Ziegler I, Schmitt B, Wollenberg B, Lindhofer H (2000) . The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates activation of accessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumour cells, Br J Cancer 83:261-266) e pode ser processada e apresentada por células apresentadoras de antigeno profissional em um contexto estimulador, o pré-requisito ideal para a imunização antitumoral.

[0034] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo trifuncional ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo trifuncional, em particular, um anticorpo trifuncional biespecífico ou um fragmento de ligação a antigeno trifuncional biespecífico do mesmo.

[0035] No contexto da presente invenção, os anticorpos trifuncionais (trAb) são entendidos, em particular, como uma classe específica de anticorpos biespecíficos recrutando e ativando células T e, em particular, células imunológicas acessórias, tais como, macrófagos, células dendríticas, células exterminadoras naturais (NK), e/ou outras células que expressam FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, simultaneamente no câncer/tumor alvejado, por exemplo, seu sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII. Assim, os

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 27/151

22/140 anticorpos biespecificos trifuncionais têm dois sítios de ligação a antígeno (isto é, dois paratopos). Tipicamente, estes dois sítios de ligação a antígeno (paratopos) permitem que os anticorpos se liguem a células cancerigenas/tumorais (antigenos de superfície de células cancerigenas/tumorais) e a células T (antigenos de superfície de células T) . Simultaneamente, por exemplo, através da sua porção Fc, em particular, seu sitio de ligação a receptor Fcy, células acessórias positivas recrutadas, por exemplo, monócitos/macrófagos, células assassinas naturais, células dendriticas ou outras células que expressam receptor Fcy. A ativação simultânea destas diferentes classes de células efetoras resulta na morte eficiente das células tumorais por vários mecanismos, tais como, fagocitose e citotoxicidade mediada por perforina. Tipicamente, o efeito liquido de um anticorpo trifuncional está ligando as células T e, em particular, as células acessórias positivas do receptor Fcy às células tumorais, conduzindo à destruição das células tumorais.

[0036] Anticorpos trifuncionais evocam a remoção de células tumorais, em particular, por meio de (i) citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpos, (ii) morte celular mediada por células T e (iii) indução de imunidade antitumoral. Em contraste, somente o primeiro modo de ação é realmente executado por anticorpos convencionais (monoclonais e monoespecificos). Além disso, em contraste com os anticorpos convencionais, os anticorpos trifuncionais têm um potencial citotóxico maior e ligam-se a antigenos, que são expressados relativamente de maneira fraca. Assim, os anticorpos trifuncionais estão em uma dose

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 28/151

23/140 equivalente mais potente (mais de 1000 vezes) na eliminação de células tumorais em comparação com os anticorpos convencionais.

[0037] Em geral, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo multiespecifico. Como aqui usado, o termo multiespecifico refere-se à capacidade para se ligar a pelo menos dois epitopos diferentes, por exemplo, em antigenos diferentes, tal como em um antígeno de superfície de células T e em um antígeno de câncer/tumor. Assim, termos como biespecificos, triespecificos, tetraspecificos etc. referem-se ao número de epitopos diferentes aos quais o anticorpo pode se ligar. Por exemplo, anticorpos monoespecificos tipo IgG convencionais têm dois sitios de ligação de epitopo idênticos (paratopos) e pode, assim, ligar-se apenas a epitopos idênticos (mas não a epitopos diferentes) . Um anticorpo multiespecifico, em contraste, tem pelo menos dois tipos diferentes de paratopos e pode, assim, ligar-se a pelo menos dois epitopos diferentes. Como aqui usado, o paratopo refere-se a um sitio de ligação a epitopo do anticorpo. Além disso, uma única especificidade pode referir-se a um, dois, três ou mais paratopos idênticos em um único anticorpo (o número real de paratopos em uma única molécula de anticorpo é referido como valência). Por exemplo, um único anticorpo IgG nativo é monoespecifico e bivalente, uma vez que tem dois paratopos idênticos. Por conseguinte, um anticorpo multiespecifico compreende pelo menos dois (diferentes) paratopos. Assim, o termo anticorpos multiespecificos refere-se a anticorpos tendo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 29/151

24/140 mais de um paratope e a capacidade de se ligar a dois ou mais epitopos diferentes. O termo anticorpos multiespecificos compreende, em particular, anticorpos biespecificos, mas tipicamente também proteína, por exemplo, anticorpo, andaimes, que se ligam, em particular, a três ou mais epitopos diferentes, isto é, anticorpos com três ou mais paratopos.

[0038] Em particular, o anticorpo multiespecífico, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, pode compreender dois ou mais paratopos, em que alguns paratopos podem ser idênticos, de modo que todos os paratopos do anticorpo pertençam a pelo menos dois tipos diferentes de paratopos e, desse modo, o anticorpo pelo menos duas especificidades. Por exemplo, o anticorpo multiespecífico ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção pode compreender quatro paratopos, em que cada um dos dois paratopos é idêntico (isto é, tem a mesma especificidade) e, assim, o anticorpo ou fragmento do mesmo é biespecífico e tetravalente (dois paratopos idênticos para cada uma das duas especificidades) . Assim, uma especificidade refere-se, em particular, a um ou mais paratopos exibindo a mesma especificidade (o que tipicamente significa que um ou mais paratopos são idênticos) e, assim, duas especificidades podem ser realizadas por dois, três, quatro, cinco, seis ou mais paratopos, desde que se refiram apenas a duas especificidades. Mais de preferência, um anticorpo multiespecífico compreende um único paratopo para cada (pelo menos dois) especificidade, isto é, o anticorpo multiespecífico compreende, no total, pelo menos dois

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 30/151

25/140 paratopos. Por exemplo, um anticorpo biespecífico compreende um único paratopo para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total de dois paratopos. É também preferido que o anticorpo compreende dois paratopos (idênticos) para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total quatro paratopos. De preferência, o anticorpo compreende três paratopos (idênticos) para cada uma das duas especificidades, isto é, o anticorpo compreende no total seis paratopos.

[0039] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo biespecífico ou um fragmento de ligação a antígeno biespecífico do mesmo.

[0040] No contexto da presente invenção, os anticorpos biespecíficos (BiAbs) compreendem (exatamente) duas especif icidades. Eles são o tipo mais preferido de anticorpos multiespecíficos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos. Um anticorpo biespecífico no contexto da presente invenção pode ser de qualquer formato de anticorpo biespecífico compreendendo um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, por exemplo, como descrito em Spiess C, Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106. Por exemplo, os BiAbs podem ser anticorpos completos, tais como, moléculas como IgG completas, ou fragmentos das mesmas que não são anticorpos inteiros, mas retêm propriedades de anticorpos. Estes podem ser pequenos formatos recombinantes, por exemplo, como moléculas de fragmentos variáveis de cadeia simples em tandem (taFvs), diacorpos (Dbs), diacorpos de cadeia simples (scDbs) e

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 31/151

26/140 vários outros derivados dos mesmos (cf. por exemplo, Byrne H. et ai. (2013) Trends Biotech, 31 (11) : 621-632 com a Figura 2 mostrando vários formatos de anticorpos biespecíficos). Vários formatos de BiAb podem redirecionar células efetoras contra células alvo que desempenham papéis-chave nos processos de doenças. Por exemplo, vários formatos de BiAb podem redirecionar células efetoras para células tumorais e uma variedade de construções de BiAb foram projetadas para redirecionar células do sistema imunológico, por exemplo, ligando-se a, e desencadeando, receptores Fc na superfície de células efetoras ou ligandose a complexos de receptor de células T (TCR).

[0041] De preferência, o anticorpo multiespecífico, em particular biespecífico, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é pelo menos bivalente, isto é, tem pelo menos dois paratopos. Mais de preferência, o anticorpo multiespecífico, em particular biespecífico, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é bivalente, trivalente, tetravalente ou hexavalente. Ainda mais de preferência, o anticorpo multiespecífico, em particular biespecífico, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é bivalente ou tetravalente. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo bivalente biespecífico, isto é, um anticorpo tendo dois paratopos: um reconhecendo um antígeno de superfície de células T e o outro reconhecendo um antígeno associado a câncer/ou tumor.

[0042] Em contraste com os termos multi específico, por exemplo, biespecífico, triespecífico, tetraespecífico e semelhantes, os termos multi funcional, por exemplo,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 32/151

27/140 trifuncional e semelhantes, referem-se ao número de sítios de ligação distintos em um sentido mais geral, isto é, incluem quaisquer sítios de ligação (não apenas os que se ligam a epitopos) . Portanto, por exemplo, um sítio de ligação a FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII conta para a categoria multi funcional, por exemplo, trifuncional e semelhantes, mas não para a categoria multi específico, por exemplo, biespecífico, triespecífico, tetraespecífico e semelhantes. Por exemplo, um anticorpo trifuncional pode ser mono, bi ou triespecífico - mas no contexto da presente invenção (em que o anticorpo tem duas especificidades e um sítio de ligação a FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII), um anticorpo trifuncional é tipicamente biespecífico.

[0043] Como aqui usado, o termo antígeno refere-se a qualquer substância estrutural que serve como um alvo para os receptores de uma resposta imunológica adaptativa, em particular, como um alvo para anticorpos, receptores de células T e/ou receptores de células B. Um epitopo, também conhecido como determinante antigênico, é a parte (ou o fragmento) de um antígeno que é reconhecido pelo sistema imunológico, em particular, por anticorpos, receptores de células T e/ou receptores de células B. Assim, um antígeno tem pelo menos um epitopo, isto é, um único antígeno tem um ou mais epitopos. Um antígeno pode ser (i) um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, (ii) um polissacarídeo, (iii) um lipídeo, (iv) uma lipoproteína ou um lipopeptídeo, (v) um glicolipídeo, (vi) um ácido nucleico ou (vii) um fármaco de molécula pequena ou uma toxina. Assim, um antígeno pode ser um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um lipídeo, uma combinação dos

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 33/151

28/140 mesmos incluindo lipoproteinas e glicolipideos, um ácido nucleico (por exemplo, DNA, siRNA, shRNA, oligonucleotideos antissentido, DNA de isca, plasmideo) ou uma pequena molécula farmacológica (por exemplo, ciclosporina A, paclitaxel, doxorrubicina, metotrexato, ácido 5aminolevulinico), ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, o antigeno é selecionado de (i) um peptideo, um polipeptideo ou uma proteína, (ii) um polissacarideo, (iii) um lipideo, (iv) uma lipoproteina ou um lipopeptideo e (v) um glicolipideo; mais de preferência, o antigeno é um peptideo, um polipeptideo ou uma proteína.

Antigeno de superfície de células T [0044] Como aqui usado, (um epitopo de) um antigeno de superfície de células T refere-se a (um epitopo de) um antigeno associado a superfície de células T ou um antigeno especifico de superfície de células T (também conhecido como marcadores de superfície de células T) . Estas são, em particular, moléculas de CD (grupamento de diferenciação) especificas para células T. As moléculas de CD são marcadores de superfície celular úteis para a identificação e a caracterização de leucócitos. A nomenclatura de CD foi desenvolvida e é mantida através do workshop de HLDA (Antigenos de Diferenciação de Leucócitos Humanos) iniciado em 1982. Se uma determinada molécula de CD é ou não encontrada em células T (e, assim, representa um antigeno de superfície de células T no contexto de presente invenção) pode ser recuperada, por exemplo, a partir de uma variedade de fontes conhecidas do qualificado na técnica, tais como http://www.ebioscience.com/resources/human-cd-chart.htm, BD

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 34/151

29/140

Bioscience's Human and Mouse CD Marker Handbook (recuperável em https ://www.bdbiosciences . com/documents/cd_marker_hanclbook .pdf), ou de www.hcdm.org. Por conseguinte, exemplos de antígenos de superfície de células T incluem, por exemplo, os marcadores de CD (humanos) indicados positivamente para células T no BD Bioscience's Human and Mouse CD Marker Handbook (recuperável em https ://www.bdbiosciences . com/documents/cd_marker_handbook. pdf) ou em outras fontes de gráficos de marcadores de CD.

[0045] De preferência, o antígeno de superfície de células T é selecionado do grupo consistindo em CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L e CD44. Isto significa que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que de preferência reconhece (é capaz de se ligar a) um epitopo de um antígeno de superfície de células T selecionado do grupo consistindo em CD3, CD2, CD4, CDS, CD6, CD8, CD28, CD40L e/ou CD44. A referida especificidade facilita, de preferência, o recrutamento de células T. Nas mesmas, CD é a abreviação para grupamento de diferenciação (grupamento de designação ou determinante de classificação) como descrito acima. Em geral, isso é conhecido como um protocolo usado para a identificação e a investigação de moléculas de superfície celular que provêm alvos para imunofenotipagem de células. Em termos de fisiologia, as moléculas de CD podem atuar de várias maneiras, muitas vezes atuando como receptores ou ligandos (a molécula que ativa um receptor) importantes para a célula. Usualmente é iniciada uma cascata de sinal,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 35/151

30/140 alterando o comportamento da célula (ver sinalização celular. Algumas proteínas de CD não desempenham um papel na sinalização celular, mas têm outras funções, tal como adesão celular. Atualmente, CD para humanos é numerado até 364. A presente invenção refere-se a moléculas de CD associadas a células T.

[0046] Mais de preferência, o antigeno de superfície de células T é CD2 ou CD3, mais de preferência, o antigeno de superfície de células T é CD3. Isto significa gue o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, gue mais de preferência reconhece um epitopo de CD2 ou CD3, mais de preferência, o anticorpo ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo para a presente invenção compreende um paratopo, gue reconhece um epitopo de CD3. O CD3 (grupamento de diferenciação 3) é um co-receptor de células T gue ajuda a ativar as células T citotóxicas. O CD3 consiste tipicamente de um complexo de proteína e é composto por guatro cadeias distintas. Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3y, uma cadeia CD3ô e duas cadeias CD3s. Estas cadeias associam-se a uma molécula conhecida como o receptor de célula T (TCR) e a cadeia-ζ (cadeia zeta) para gerar um sinal de ativação nos linfócitos T. As moléculas de TCR, cadeia-ζ e CD3 juntas constituem o complexo TCR.

Antigeno associado a câncer e/ou tumor [0047] Como agui usado, (um epitopo de) um antigeno associado a câncer e/ou tumor refere-se a (um epitopo de) um antigeno associado a câncer, um antigeno específico de câncer, um antigeno associado a tumor e/ou um antigeno

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 36/151

31/140 especifico de tumor. Tais epitopos/antigenos são tipicamente específicos de ou associados a um certo tipo de câncer/tumor. Epitopos e antigenos de câncer/tumor adequados podem ser recuperados, por exemplo, a partir de bases de dados de epitopo de câncer/tumor, por exemplo, de van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2 013; URL: http ://www. cancerimmunity .org/peptide/, em que os antigenos de tumores humanos são classificados em quatro grupos principais com base em seu padrão de expressão, ou no banco de dados Tantigen (TANTIGEN versão 1.0, 1 de dezembro de 2009; desenvolvido por Bioinformatics Core em Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http ://cvc.dfci . harvard.edu/tadb/) . Exemplos específicos de antigenos relacionados a câncer, em particular relacionados a tumores, ou específicos a tecido, úteis no contexto da presente invenção incluem os, mas não estão limitados aos, seguintes antigenos: Epha2, Epha4, PCDGF, HAAH, Mesotelina; EPCAM; NY-ESO-1, mucinas MUC1 e NIUC10 de glicoproteina p5 (especialmente versões mutadas), EGFR; antígeno de câncer 125 (CA 125), a glicoproteina epitelial 40 (EGP40) (Kievit et ai., 1997, Int. J. Cancer 71: 237-245), antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC) (Lozza et ai., 1997). Anticancer Res. 17: 525-529), catepsina E (Mota et ai., 1997, Am. J Pathol. 150: 12231229), CDC27 (incluindo a forma mutada da proteína), antigenos triosefosfato isomerase, 707-AP, antígeno micobacteriano A60 (Macs et ai., 1996, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122: 296-300), AFP, alfa(v)beta(3)-integrina, ART-4, ASC, BAGE, β-catenina/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p!90, bcrPetição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 37/151

32/140 abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver e O'Brien, 1997, South Med. J. 90: 89-90; Tsuruta et al., 1997 Urol. Int. 58: 20-24), CA125, CALLA, CAMEL anidrase carbônica, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD13, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24,

CD30, CD33,	CD37, CD38, CD40,	CD41,	CD44v3,	CD44v6,	CD47,
CD52, CD138, CEA (Huang et	al. ,	Exper	Rev. Vaccines
(2002) 1: 49-	-63), c-erb-2, CT9,	CT10,	Cyp-B, Dek-cain,	DAM-6
(MAGE-B2),	DAM-10 (MAGE-B1),	EphA2	(Zantek	et al.,	Cell
Growth Differ. (1999) 10:629-38.	Carles-Kinch et	al.,
Cancer Res.	(2002) 62:2840-7),	EphA4	(Cheng	et al.,	2002,

Cytokine Growth Factor Rev. 13:75-85), antígeno ThomsenFriedenreich associado a tumor (Dahlenborg et al., 1997, Int. J Cancer 70: 63-71), ELF2M, ETV6-AML1 , G250, GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GDla, GDIb, GD2, GD3, GnT-V, GM1, GM2, GM3, gplOO (Zajac et al., 1997, Int. J Cancer 71: 491-496), GTlb, GT3, GQ1, HAGE, HER2/neu, HLA, HLA-DR, HLA-A*020 -R170I, HPV-E7, HSP27, HSP-70, HSP70-2M , HSP-72, HSP-90, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, inibidores da apoptose, tais como, survivina, antígeno de adenocarcinoma KH-1 (Deshpande e Danishefsky, 1997, Nature 387: 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, antígeno Lewis Y, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART1, MART-1/Melan-A (Kawakami e Rosenberg, 1997, Int. Rev. Immunol. 14: 173-192), MC1R, MCSP, MDM-2, MHCII, mTOR, Miosina/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, neo-poliA polimerase, NA88-A, NFX2, NY-ESO-1, NY-ESO-la (CAG-3), PAGE-4, PAP, Proteinase 3 (Molldrem et al., Blood (1996)

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 38/151

33/140

88: 2450-7; Molldremet al., Blood (1997) 90:2529-34), P15, p53, p97, pl90, Pgp, PIK3CA, Pml/RAROC, FRAME, proteoglicano, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, SSX2, SSX4 TEL/AML1, TPI/m, tirosinase, TARP, telomerase, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT-1, antígeno Wue, alvos de superfície celular GC182, GT468 ou GT512 e, alternativamente, proteínas NY-ESO-ORF2 e CAMEL traduzidas, derivadas dos genes NY-ESO-1 e LAGE-1.

[0048] Mais de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, proteoglicano, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, alfa(v)beta(3)-integrina, HLA, HLA-DR, ASC, anidrase carbônica, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GDla, GDlb, GD2, GD3, GTlb, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gplOO, tirosinase, MUC-1, telomerase, survivina, p53, CA125, antígeno Wue, antígeno Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 e alvos de superfície celular GC182, GT468 ou GT512. Isto significa que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que de preferência reconhece (é capaz de se ligar a) um epitopo de um antígeno associado a câncer e/ou tumor selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, proteoglicano, VEGF, EGFR, mTOR, P1K3CA, RAS, alfa(v)beta(3)-integrina, HLA, HLA-DR, ASC, anidrase carbônica, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD1, CD13, CD14,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 39/151

34/140

CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII,

CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2 , GM3, GDIa, GDlb, GD2, GD3, GTlb, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2 , SSX2, SSX4, Trp2, gplOO, tirosinase, MUC-1, telomerase, survivina, p53, CA125, antígeno Wue, antígeno Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 e alvos de superfície celular GC182, GT468 ou GT512.

[0049] Particularmente de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38, mais de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38, ainda mais de preferência, o antígeno associado a câncer e ou tumor é selecionado do grupo que consiste em EpCAM, HER2/neu, GD2 e CD20, e mais de preferência o antígeno associado a câncer e/ou tumor é EpCAM. Isto significa que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que de preferência reconhece um epitopo de EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, IK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38; mais de preferência o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que reconhece um epitopo de EpCAM, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 ou CD33; ainda mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 40/151

35/140 reconhece um epitopo de EpCAM, HER2/neu, GD2 ou CD20; e mais de preferência o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um paratopo, que reconhece um epitopo de EpCAM ou GD2.

[0050] De preferência, o câncer e/ou o antigeno associado a tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a serem reconhecidos pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é EpCAM. De preferência, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é GD2. De preferência, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é Her2/neu. De preferência, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é GD3. De preferência, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é CD20. De preferência, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é CD19. De preferência, o

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 41/151

36/140 antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é CD30. Alternativamente, o antigeno associado a câncer e/ou tumor (ou um epitopo no mesmo, respectivamente) a ser reconhecido pelo anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA ou RAS.

[0051] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção se liga (i) pela sua primeira especificidade, por exemplo, pelo seu primeiro paratopo, a um epitopo do antigeno de superfície de células T

selecionado do grupo	consistindo	em	CD2, CD3, CD4, CD5,
CD6, CD8, CD28, CD40L	e CD44, de	preferência, CD2 ou CD3,
mais de preferência,	CD3; e	(ü)	pela sua segunda
especificidade, por exemplo, pelo	seu	segundo paratopo, a

um antigeno associado a câncer e/ou tumor, de preferência,

selecionado do	grupo	consistindo	nos antígenos tumorais
EpCAM, HER2/neu,	CEA,	MAGE, VEGF,	EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS,
GD2, CD19, CD20,	CD30,	CD33 e CD38	•
[0052] Mais	de	preferência	, o anticorpo, ou o
fragmento de ligação	a antigeno	do mesmo, para uso de

acordo com a presente invenção, liga-se (i) pela sua primeira especificidade, por exemplo, pelo seu primeiro paratopo, a um epitopo do antigeno de superfície de células T selecionado do grupo consistindo em CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L e CD44, de preferência, CD2 ou CD3, mais de preferência, CD3; e (ii) pela sua segunda

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 42/151

37/140 especificidade, por exemplo, pelo seu segundo paratopo, a um antígeno associado a câncer e/ou tumor, de preferência, selecionado do grupo consistindo nos antigenos tumorais EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38.

[0053] O anticorpo, ou o fragmento do mesmo de antígeno, para uso de acordo com a presente invenção, ligase de preferência pela sua primeira especificidade, por exemplo, pelo seu primeiro paratopo, a um epitopo do antígeno de superfície de células T, de preferência, CD3, e, pela sua segunda especificidade, por exemplo, pelo seu segundo paratopo, a um antígeno associado a câncer e/ou tumor, de preferência, selecionado do grupo consistindo nos antigenos tumorais EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38 ou aos gangliosidios GM1, GM2, GM3, GDI, GDlb, GD3, GTlb, GT3 ou GQ1.

[0054] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende uma primeira especificidade contra CD3 e uma segunda especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 e CD33 .

[0055] Por conseguinte, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência, um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência, um paratopo, contra EpCAM (anti-CD3 x antiEpCAM) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 43/151

38/140 ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência, um paratopo, contra GD2 (anti-CD3 x antiGD2) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra Her2/neu (anti-CD3 x anti-Her2/neu). De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra GD3 (anti-CD3 x antiGD3). De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD20 (anti-CD3 x antiCD20). De preferência, o anticorpo, ou o fragmento do mesmo de antígeno, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD19 (anti-CD3 x anti-CD19) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CEA (anti-CD3 x antiCEA). De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 44/151

39/140 ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra MAGE (anti-CD3 x antiMAGE) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra VEGF (anti-CD3 x antiVEGF) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra EGFR (anti-CD3 x antiEGFR) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra mTOR (anti-CD3 x antimTOR) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra PIK3CA (anti-CD3 x antiPIK3CA). De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra RAS (anti-CD3 x antiRAS) .

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 45/151

40/140 [0056] Alternativamente, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD30 (anti-CD3 x antiCD30) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD33 (anti-CD3 x antiCD33) . De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode compreender uma especificidade, de preferência um paratopo, contra CD3 e uma especificidade, de preferência um paratopo, contra um epitopo de proteína arboviral E (anti-CD3 x proteína anti-arboviral E).

[0057] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende duas especificidades selecionadas de anti-EpCAM x anti-CD3, anti-GD2 x anti-CD3, anti-CD20 x anti-CD3, antÍ-HER2/neu x anti-CD3 e anti-CD19 x anti-CD3.

Sítio de ligação a Fc/RI, Fc/RIIa e/ou Fc/RIII de humano [0058] O anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um Sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção, compreende um sitio de ligação para FcyRIIa humano. O Sitio de ligação a FcyRI,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 46/151

41/140

FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, por exemplo, a região Fc, permite que o anticorpo multifuncional recrute adicionalmente células que expressam FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, tais como, células acessórias FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII positivas, por exemplo, macrófagos, células dendriticas, células exterminadoras naturais (NK) e outras células que expressam FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII. Como os anticorpos multifuncionais são pelo menos anticorpos biespecificos (ou multiespecificos), eles são, de preferência, capazes de recrutar e ativar (i) células T e (ii) células que expressam FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, tais como, células imunológicas acessórias, por exemplo, monócitos/macrófagos, células exterminadoras naturais, células dendriticas ou outras células que expressam FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, simultaneamente nas (iii) células cancerigenas/tumorais alvejadas. A ativação simultânea destas diferentes classes de células efetoras resulta na morte eficiente das células tumorais por vários mecanismos, tais como, por exemplo, fagocitose e citotoxicidade mediada por perforina. Tipicamente, o efeito liquido de um anticorpo multifuncional preferido, que compreende um sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, está ligando as células T e as células positivas de receptor Fc às células alvo, por exemplo, células tumorais, levando à destruição das células tumorais. Anticorpos multifuncionais evocam a remoção de células tumorais por meio de (i) citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, (ii) morte celular mediada por células T e (iii) indução de imunidade antitumoral.

[0059] Em geral, os receptores Fc gama (FcyR) são uma

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 47/151

42/140 família de receptores Fc para IgG. Todos os receptores Fey (FcyR) pertencem à superfamília das imunoglobulinas e são os receptores Fc mais importantes para induzir a fagocitose de micróbios opsonizados (marcados). Esta família inclui vários membros: FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32a), FcyRIIb (CD32b), FcyRIIIa (GDI 6a) e FcyRIIIb (CD16b) em humanos e FcyRI, FcyRIIb, FcyRIII e FcyRIV em camundongos. A complexidade da família FcyR é espelhada pela presença de quatro diferentes subclasses de IgG em humanos (IgGl-IgG4) e camundongos (IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3), que se ligam com variada afinidade e especificidade a diferentes receptores Fey (para revisão ver Nimmerjahn F. e Ravetch J.V., 2008, receptores Fey como reguladores de respostas imunes, Nat Rev Immunol 8: 34-47). Tradicionalmente, as famílias FcyR são categorizadas de acordo com o nível de afinidade do receptor para subclasses de IgG específicas e o tipo de via de sinalização que desencadeia, isto é, se é inibitória ou ativadora. O FcyRIIb é conservado em camundongos e humanos e é o único FcyR inibitório conhecido; transmite sinais inibitórios através de um motivo inibitório baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) contido em sua região citoplasmática. Todos os outros FcyR, com exceção do FcyRIIIb ancorado ao GPI humano, ativam as vias de sinalização através de ITAMs contidos em suas regiões citoplasmáticas. FcyRIa é o único FcyR de alta afinidade conhecido em camundongos e humanos. Todos os outros FcyR têm uma afinidade 100-1000 vezes menor na faixa micromolecular baixa a média e mostram uma especificidade de subclasse de IgG mais ampla. O FcyRIIb inibitório é o FcyR mais amplamente expressado e está presente em

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 48/151

43/140 praticamente todos os leucócitos, com exceção das células NK e células T. Finalmente, foi demonstrado que a atividade da IgGl é regulada negativamente pelo FcyRIIb inibitório. Por conseguinte, assume-se que o FcyRIIb inibitório exerce uma função reguladora nas respostas de IgG.

[0060] O FcyRIIa humano (receptor Fc de imunoglobulina G (IgG)IIa; CD32a) é um receptor de baixa afinidade para IgG e é expressado em macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, plaquetas e células dendríticas. O FcyRIIa fornece um sinal de ativação na ligação do ligando, e resulta no início de respostas inflamatórias, incluindo citólise, fagocitose, desgranulação e produção de citocinas. Dois diferentes alotipos geneticamente determinados de FcyRIIa de humano são conhecidos geneticamente: os produtos dos alelos FcyRIIa-R131 e FcyRIIa-H131. As respostas de FcyRIIa podem ser modulados por sinais dos receptores inibitórios coexpressados, tal como FcyRIIb (CD32b), e a intensidade do sinal é dependente da razão de expressão dos receptores de ativação e inibitórios.

[0061] O anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um Sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano(s) do que a FcyRIIb humano. Isto significa que, se o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a apenas um de FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRl2 (isto é, (i) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRI, mas não a FcyRIIa ou FcyRIII; (o) o anticorpo, ou o

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 49/151

44/140 fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRlla, mas não a FcyRI ou FcyRIII, ou (iii) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a

FcyRIII, mas não a FcyRI ou FcyRlla), o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano(s) do que ao FcyRIIb humano. Contudo, se o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a mais do que um de FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRl2 (isto é, (i) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRI e FcyRlla, mas não (ii) ao anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRlla e FcyRIII, mas não a FcyRI; (iii) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRI e FcyRIII, mas não a FcyRlla ou (iv) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se a FcyRI, FcyRlla e FcyRIII), é suficiente se o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a um de FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano do que o FcyRIIb humano. Mais de preferência, contudo, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a dois de FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano (s) do que a FcyRIIb humana. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a todos os três de FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano (s) do que a FcyRIIb humano. Em particular, (i) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, de um modo muito preferido, liga-se com uma maior afinidade a cada um de FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano (s) do que o FcyRIIb

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 50/151

45/140 humano - e/ou (ii) o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, mais de preferência, liga-se com uma maior afinidade a cada um daquele (s) FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano(s), para os quais o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreende um sítio de ligação do que a FcyRIIb humano.

[0062] Em geral, FcyRI, FcyRIIa e FcyRIII humanos estão ativando receptores Fc, enquanto FcyRIIb humano é um receptor Fc inibitório. Por conseguinte, um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, que se liga com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano(s) do que a FcyRIIb humano, como descrito acima, liga-se mais a um receptor Fc de ativação do que a um receptor Fc inibitório, mudando assim a taxa de ativação/inibição para o lado de ativação e diminuindo a influência reguladora do FcyRIIb inibitório. Por conseguinte, a fagocitose e a morte direta são aumentadas.

[0063] Como aqui usado, uma maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano significa, em particular, que o ECso (concentração eficaz nos sinais de ligação meiomáxima) de um certo anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRIIa é menor que o ECso do mesmo anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRIIb. Em outras palavras, é necessária uma concentração menor do anticorpo (ou do fragmento do mesmo) para ligação meio-máxima a FcyRIIa do que para a ligação meio-máxima a FcyRIIb. Por exemplo, a razão FcyRIla/FcyRIIb (que é > 1 se o anticorpo se ligar com uma maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano), pode ser determinada por ECso (FcyRIIb)/ECso (FcyRIIa) . Os valores ECso podem ser

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 51/151

46/140 determinados, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado a enzima padrão (ELISA). Alternativamente, as afinidades de ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, também podem ser determinadas por medições de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, como descrito em Richards JO, Karki S, GA Lazar, Η H, Dang W, Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527). Em geral, as afinidades de ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, os FcyRIIa e FcyRIIb podem ser determinados por vários métodos conhecidos da pessoa qualificada. Contudo, as afinidades de ligação de um determinado anticorpo, ou fragmento do mesmo, a FcyRIIa e FcyRIIb são, em particular, obtidas usando o mesmo método para determinar as afinidades de ligação a FcyRIIa e FcyRI Ib.

[0064] Isto aplica-se de uma maneira semelhante para uma maior afinidade para FcyRI humano do que a FcyRIIb humano, o que significa em particular que a ECso (concentração eficaz em sinais de ligação meio-máximos) de um determinado anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRI é menor que a ECso do mesmo anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRIIb. Em outras palavras, é necessária uma concentração menor do anticorpo (ou do fragmento do mesmo) para uma ligação meio-máxima a FcyRIIb. Por exemplo, a razão FcyRI/FcyRIIb (que é > 1 se o anticorpo se ligar com uma maior afinidade a FcyRI humano do que a FcyRIIb humano) , pode ser determinada pela ECso (FcyRIIb)/ECso (FcyRI) . Estes valores de ECso podem ser determinados, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 52/151

47/140 a enzima padrão (ELISA). Alternativamente, as afinidades de ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, também podem ser determinadas por medições de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, como descrito em Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527). Em geral, as afinidades de ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, a FcyRI e FcyRIIb podem ser determinadas por vários métodos conhecidos da pessoa habilitada. No entanto, as afinidades de ligação de um determinado anticorpo, ou fragmento do mesmo, a FcyRI e FcyRIIb são, em particular, obtidas usando o mesmo método para determinar as afinidades de ligação a FcyRI e FcyRIIb.

[0065] Isto aplica-se também de uma maneira semelhante para uma maior afinidade a FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano, o que significa em particular que a ECso (concentração eficaz em sinais de ligação meio-máximos) de um determinado anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRIII é menor que a ECso do mesmo anticorpo, ou fragmento do mesmo, para ligação a FcyRIIb. Em outras palavras, é necessária uma concentração mais baixa do anticorpo (ou do fragmento do mesmo) para ligação meiomáxima a FcyRIII do que para ligação meio-máxima a FcyRIIb. Por exemplo, a razão FcyRI 11/FcyRI Ib (que é > 1 se o anticorpo se ligar com uma maior afinidade a FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano) , pode ser determinada pela ECso (FcyRIIb)/ECso (FcyRI11) . Os valores de ECso podem ser determinados, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado a enzima padrão (ELISA). Alternativamente, as afinidades de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 53/151

48/140 ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, também podem ser determinadas por medições de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, como descrito em Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527). Em geral, as afinidades de ligação do anticorpo, ou fragmento do mesmo, os FcyRIII e FcyRIIb podem ser determinados por vários métodos conhecidos da pessoa habilitada. Contudo, as afinidades de ligação de um determinado anticorpo, ou fragmento do mesmo, os FcyRIII e FcyRIIb são, em particular, obtidos usando o mesmo método para determinar as afinidades de ligação a FcyRIII e FcyRI Ib.

[0066] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um Sítio de ligação a FcyRI humano, em gue o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, liga-se com maior afinidade a FcyRI humano do gue a FcyRIIb humano. É também preferido gue o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um sítio de ligação para o FcyRIII humano, em gue o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a FcyRIII humano do gue a FcyRIIb humano. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende um sítio de ligação a FcyRIIa humano, em gue o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, liga-se com uma afinidade maior a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 54/151

49/140

FcyRIIa humana do que a FcyRIIb humano.

[0067] Em particular, uma taxa de ligação de FcyRIIa/FcyRIlb melhorada aumenta fortemente a fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP; Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W, Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527) e favorece a ativação e a maturação de DCs com um efeito positivo na indução da imunidade tumoral (Boruchov AM, Heller G, Veri MC, Bonvini E, Ravetch JV, Young JW (2005) Activating and inhibitory IgG Fc receptors on human DCs mediate opposing functions. J Clin Invest 115:2914-2923; Kalergis AM, Ravetch JV (2002) Inducing tumor immunity through the selective engagement of activating Fcgamma receptors on dendritic cells. J Exp Med 195:1653-1659). Em particular, Richards et al., 2008, mostraram que anticorpos que se ligam com maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano, mediam a fagocitose intensificada de células alvo revestidas de anticorpos por macrófagos (Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527). Por conseguinte, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção, que se liga com uma maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano, desencadeia a fagocitose de macrófago intensificada de células tumorais. De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção, liga-se com uma maior

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 55/151

50/140 afinidade à forma R131 do FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano.

[0068] Anticorpos exemplificativos tendo uma maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano são conhecidos na técnica. Por exemplo, Richards et al. , 2008, descreve uma variante de IgGl, que compreende uma substituição de G236A, levando a um aumento considerável na razão FcyRIla/FcyRIlb (Richards JO, Karki S, Lazar GA, Chen H, Dang W e Desjarlais JR (2008) Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7:2517-2527). Além disso, Lindhofer et al., 2011 descrevem anticorpos Triomab® tendo uma região Fc IgG2a de camundongo/IgG2b de rato, que também mostram altas razões FcyRIla/FcyRIIb (Lindhofer H, Hess J, Ruf P. Tri functional Triomab® antibodies for cancer therapy. Em: Kontermann RE (ed.), Bispecific antibodies. Springer, Berlin, 2011, p. 289-312), e, assim, intensificaram fagocitose de células alvo revestidas com anticorpos por macrófagos e aumentaram morte direta de células tumorais.

[0069] Embora o mero sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa ou FcyRIII seja suficiente, é preferido que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreenda uma porção Fc, em particular uma região Fc.

[0070] Como aqui usado, o termo porção Fc refere-se a uma sequência derivada da porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina começando na região de charneira imediatamente a montante do sitio de divagem de papaina e terminando no terminal C da cadeia pesada de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 56/151

51/140 imunoglobulina. Em particular, a porção Fc compreende urn Sitio de ligação a FcyRl, FcyRlla e/ou FcyRlll. De preferência, a porção Fc compreende um sitio de ligação a FcyRIIa. No entanto, também é preferido que uma porção Fc possa mediar uma funcionalidade diferente da ligação a um receptor Fc, por exemplo, a ligação a uma proteína do sistema de complemento. Neste caso, o sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII pode estar presente no anticorpo separado da porção Fc. Por conseguinte, uma porção Fc pode ser uma região Fc completa ou uma parte (por exemplo, um dominio) da mesma. De preferência, a porção Fc medeia a funcionalidade completa de uma região Fc completa, por exemplo, incluindo a ligação a receptor Fc e, opcionalmente, a ligação a uma proteína do sistema de complemento. Assim, o anticorpo, como usado de acordo com a presente invenção, compreende de preferência, uma região Fc completa, em que uma região Fc completa compreende pelo menos um dominio de charneira, um dominio CH2 e um dominio CH3. A porção Fc também pode compreender uma ou mais inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos em relação a uma região Fc de ocorrência natural. Por exemplo, pelo menos um de um dominio de charneira, dominio CH2 ou dominio CH3 (ou porção do mesmo) pode ser eliminado. Por exemplo, uma porção Fc pode compreender ou consistir em: (i) dominio de charneira (ou porção do mesmo) fundido a um dominio CH2 (ou porção do mesmo), (ii) um dominio de charneira (ou porção do mesmo) fundido a um dominio CH3 (ou porção do mesmo), (iii) um dominio CH2 (ou porção do mesmo) fundido a um dominio CH3 (ou porção do mesmo) , (iv) um dominio de charneira (ou porção do mesmo), (v) um dominio

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 57/151

52/140

CH2 (ou porção do mesmo) , ou (vi) um domínio CH3 ou porção do mesmo. De preferência, a porção Fc compreende uma substituição G236A.

[0071] De preferência, a porção Fc/região Fc do anticorpo, ou do fragmento do mesmo, liga-se a células positivas de receptor Fc, que de preferência, pelo menos expressa (m) FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII, mais de preferência pelo menos FcyRIIa.

[0072] De preferência, o Sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano (s) (em particular a porção Fc) no anticorpo (ou fragmento do mesmo) para uso de acordo com a presente invenção é IgG2a de camundongo/IgGb de rato. Isto significa que as partes do anticorpo (ou fragmento do mesmo), que contribuem para a ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano(s), são sequências de IgG2a de camundongo e/ou IgG2b de rato. Uma combinação de ambas é preferida, por exemplo, como provido por anticorpos heterólogos como aqui descrito. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento do mesmo, compreende uma região Fc de IgG2a de camundongo/IgG2b de rato. Isto significa, em particular, que a região Fc do anticorpo consiste em (i) uma região Fc de IgG2a de camundongo e (ii) uma cadeia da região Fc de IgG2b de rato. Tais anticorpos mostram ligação seletivamente intensificada a FcyRIIa de ativação, mas não aos seu FcyRIIb equivalente inibitório (Lindhofer H, Hess J, Ruf P. Tri functional Triomab® antibodies for cancer therapy. Em: Kontermann RE (ed.), Bispecific antibodies. Springer, Berlin, 2011, p. 289-312).

Formato de anticorpo [0073] O anticorpo, ou o fragmento de ligação a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 58/151

53/140 antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser de qualquer formato de anticorpo desde que inclua pelo menos duas especificidades como descrito acima e o sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII como descrito acima. Em particular, os anticorpos multifuncionais englobam, de preferência, anticorpos completos, tais como, moléculas inteiras IgG ou como IgG, enquanto os fragmentos de ligação a antígeno no contexto da presente invenção referem-se, de preferência, a pequenos formatos recombinantes, tais como, moléculas de fragmentos variáveis de cadeia simples em tandem (taFvs), diacorpos (Dbs), diacorpos de cadeia simples (scDbs) e vários outros derivados dos mesmos (como descrito por Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11):621-632 com a Figura 2 mostrando vários formatos de anticorpos biespecíficos, Weidle U.H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10: 1-18, em particular a Fig. 1; e Chan, A.C. e Carter, P.J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301-316, em particular Fig. 3). Exemplos preferidos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos Triomabs e quadroma.

[0074] Assim, o anticorpo ou a estrutura de andaime, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser selecionado do grupo compreendendo Triomabs; hibridoma híbrido (quadroma); plataforma anticalin multiespecífica (Pieris); Diacorpos; diacorpos de cadeia simples; Fragmentos Fv de cadeia simples em tandem; TandAbs, Abs Triespecíficos (Affimed) (105-110 kDa); Darts (redirecionamento de dupla afinidade; Macrogenics); derivados de anticorpos recombinantes multifuncionais (110 kDa); plataforma de Dock e lock;

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 59/151

54/140 plataforma Knob into hole (KIH); Anticorpo IgG biespecifico humanizado (REGN1 979) (Regeneron); anticorpos biespecificos Mab² (F-Star); DVD-Ig = imunoglobulina do dominio variável duplo (Abbvie); corpos capa-lambda; TBTI = Ig em tandem biespecifica tetravalente; e CrossMab.

[0075] O anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser selecionado de anticorpos como IgG biespecificos (BsIgG) compreendendo CrossMab; DAF (dois em um) ; DAF (quatro em um) ; DutaMab; DT-IgG; LC comum Knobsin-holes; Montagem Knobs-in-holes; Par de carga; Troca de braço Fab; SEEDcorpo; Triomab; LUZ-Y; Fcab; κλ-corpo; e Fab Ortogonal. Estes formatos de anticorpos biespecificos são mostrados e descritos, por exemplo, em Spiess C., Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, em particular, Fig. 1 e descrição correspondente, por exemplo, págs. 95-101.

[0076] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser selecionado de anticorpos ligados a IgG com uma porção de ligação a antigeno compreendendo DVD-IgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)scFv; scFV-(L) IgG; IgG(L,H)-Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zycorpo; e DVI-IgG (quatro em um). Estes formatos de anticorpos biespecificos são mostrados e descritos, por exemplo, em Spiess C, Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, em particular, Fig. 1 e descrição correspondente, por exemplo, págs. 95-101.

[0077] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 60/151

55/140 ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser selecionado de fragmentos de anticorpo biespecíficos compreendendo sc-Diacorpo-CH3; Diacorpo-CH3; Minicorpo; Minicorpo TriBi; scFv-CH3 KIH; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; HCAb tetravalente; scDiacorpo-Fc; Diacorpo-Fc; scFv-Fc em tandem; e intracorpo. Estes formatos de anticorpos biespecíficos são mostrados e descritos, por exemplo, em Spiess C., Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, em particular, a Fig. 1 e a descrição correspondente, por exemplo, págs. 95 - 101.

[0078] Em particular, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção pode ser selecionado de conjugados de anticorpo biespecíficos compreendendo IgG-IgG e Cov-XCorpo. Estes formatos de anticorpos biespecíficos são mostrados e descritos, por exemplo, em Spiess C., Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, em particular, a Fig. 1 e a descrição correspondente, por exemplo, págs. 95-101.

[0079] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo trifuncional biespecífico.

[0080] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção tem um formato como IgG (baseado em IgG, também referido como tipo IgG), pelo qual um anticorpo tendo um formato vomo IgG usualmente compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Em geral, a imunoglobulina G (IgG) é conhecida como um tipo de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 61/151

56/140 anticorpo. Entende-se aqui como um complexo de proteína composto por quatro cadeias peptídicas - duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas arranjadas em uma forma em Y típica dos monômeros de anticorpo. Cada IgG tem tipicamente dois sítios de ligação a antígeno, que podem ser diferentes ou idênticos. Representando cerca de 75% dos anticorpos séricos em humanos, a IgG é o tipo mais comum de anticorpo encontrado na circulação. Fisiologicamente, as moléculas de IgG são criadas e liberadas por células B do plasma.

[0081] Exemplos de um anticorpo tendo um formato como IgG incluem um quadroma e vários formatos de IgG-scFv (cf: Byrne H. et ai. (2013) Trends Biotech, 31 (11) :621-632; Figura 2A-E) , pelo qual um quadroma é preferido, que é de preferência gerado por fusão de dois hibridomas diferentes. Dentro da classe IgG, os anticorpos podem ser, de preferência, baseados na subclasse IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4, pelos quais um anticorpo baseado em IgGl (também referido como tipo IgGl) ou IgG2 (também referido como tipo IgG2) é preferido. Os anticorpos multifuncionais ou fragmentos de ligação a antígeno para uso de acordo com a presente invenção podem ser alternativamente baseados em qualquer classe (por exemplo, IgA, IgG, IgM etc.) e subclasse (por exemplo, IgAl, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 etc.) de imunoglobulinas.

[0082] Os formatos de anticorpos tipo IgG biespecíficos preferidos compreendem, por exemplo, hibridoma híbrido (quadroma) , knobes-into-holes com cadeia leve comum, vários formatos de IgG-scFv, vários formatos de scFv-IgG, IgG dois em um, IgG de domínio V duplo, IgG-V e

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 62/151

57/140

V-IgG, que são mostrados, por exemplo, na Figura 3c de Chan, A.C. e Carter, P.J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301-316 e descritos no referido artigo. Formatos de anticorpo como IgG biespecíficos preferidos adicionais incluem, por exemplo, DAF, CrossMab, IgG-dsscFv, DVD, IgG-dsFV, IgGscFab, scFab-dsscFv e Fv2-Fc, que são mostrados na Fig. IA de Weidle U.H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10:1-18 e descritos no referido artigo. Formatos de anticorpos semelhantes a IgG biespecíficos preferidos adicionais incluem DAF (dois em um) ; DAF (quatro em um) ; DutaMab; DT-IgG; Montagem de Knobs-in-holes; Par de carga; troca de braço Fab; SEEDcorpo; Triomab; LUZ-Y; Fcab; κλcorpo; Fab Ortogonal; DVD-IgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L,H)-Fv; IgG(Η)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KAIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zycorpo; e DVI-IgG (quatro em um) como mostrado e descrito por exemplo em Spiess C., Zhai Q. e Carter P.J. (2015) Molecular Immunology 67: 95-106, em particular Fig. 1 e descrição correspondente, por exemplo, págs. 95-101.

[0083] Em geral, os métodos de produção de anticorpos são conhecidos na técnica. Anticorpos monoclonais originários de mamíferos, por exemplo humano, rato, camundongo, coelho, cabra ou ovelha, podem ser produzidos por métodos convencionais, por exemplo, como descritos em kõhler e Milstein (Nature 256 (1975), 495), em Harlow e Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) ou em Galfie (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) ou em DE 195 31 346. Em particular, os anticorpos multifuncionais, ou os fragmentos de ligação a antígeno, para uso de acordo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 63/151

58/140 com a presente invenção pode ser produzido por três métodos principais: (i) conjugação guímica, gue envolve reticulação guímica; (ii) fusão de duas linhas celulares de hibridoma diferentes (por exemplo, como descrito em Milstein et al. , Nature 305 (1983), 537); ou (iii) abordagens genéticas envolvendo tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, como descrito em Kurucz et al. , J. Immunol. 154 (1995), 4576; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. EUA 90 (1993), 6444) .

[0084] De preferência, os anticorpos podem ser obtidos por fusão de duas linhas celulares de hibridoma diferentes (por exemplo, como descrito em Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Desse modo, diferentes linhas celulares de hibridoma, cada uma produzindo anticorpos com uma das especificidades desejadas, são fundidas e - entre clones celulares (guadroma) produzindo uma população de anticorpo heterogênea - como guadroma (ou hibridoma híbrido), gue secretam os anticorpos multifuncionais desejados, podem ser identificados e isolados.

[0085] Abordagens alternativas incluíram conjugação guímica de dois mAbs diferentes e/ou fragmentos de anticorpos menores. As estratégias de reassociação oxidativa para ligar dois anticorpos diferentes ou fragmentos de anticorpo revelaram-se ineficientes devido à presença de reações colaterais durante a reoxidação das múltiplas ligações dissulfeto nativas. Os métodos atuais para conjugação guímica enfocam o uso de reagentes de reticulação homo ou hetero-bifuncionais.

[0086] A tecnologia de DNA recombinante produziu a maior faixa de anticorpos multifuncionais, através da

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 64/151

59/140 manipulação artificial de genes e representa a abordagem mais diversificada para geração de anticorpos (cf. Byrne H. et al. (2013) Trends Biotech, 31 (11) : 621-632) . Por conseguinte, os anticorpos multifuncionais são, em particular, obtidos por técnicas de DNA recombinante ou por tecnologias de hibridoma bi(híbrido).

[0087] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é um anticorpo heterólogo, ou um fragmento de anticorpo heterólogo. Como aqui usado, o termo heterólogo significa que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende cadeias pesadas de subclasses de imunoglobulinas distintas (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 em humanos; por exemplo, IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 em camundongos e ratos) e/ou de origem distinta (espécie).

[0088] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, que é derivado de rato e/ou camundongo. Derivado de rato e/ou camundongo significa, em particular, que a sequência de aminoácidos do anticorpo da parte CH3 da cadeia pesada, de preferência, a sequência de aminoácidos do anticorpo da região Fc da cadeia pesada, compartilha pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, mais de preferência pelo menos 98%, ainda mais de preferência pelo menos 99%, e mais de preferência 100% de identidade de sequência com uma parte CH3, ou região Fc, respectivamente, de uma cadeia pesada de imunoglobulina de rato e/ou camundongo.

[0089] Por conseguinte, os anticorpos derivados do

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 65/151

60/140 rato e/ou camundongo incluem também anticorpos compreendendo cadeias pesadas, que compartilham pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, mais de preferência pelo menos 98%, ainda mais de preferência pelo menos 99%, e mais de preferência 100% de identidade de sequência com uma cadeia pesada de imunoglobulina de rato e/ou de camundongo ao longo de todo o seu comprimento. Além disso, é também preferido que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção seja um anticorpo de rato e/ou de camundongo ou um fragmento de ligação a antigeno. Isto significa que todas as cadeias pesadas e leves compreendidas pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antigeno compartilham pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, mais de preferência pelo menos 98%, ainda mais de preferência pelo menos 99%, e mais de preferência 100% de identidade de sequência com uma cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina de rato e/ou camundongo, respectivamente.

[0090] No entanto, uma vez que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é, de preferência, para uso em indivíduos humanos, é preferido que pelo menos as três CDRs (regiões de determinação complementar) e/ou as regiões estruturais da região variável de cadeia pesada (e de cadeia leve) são de origem humana ou humanizada, a fim de garantir a especificidade contra um antigeno de superfície de células T (humanas) e a especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor (humano). Por conseguinte, um anticorpo preferido, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 66/151

61/140 presente invenção compreende uma cadeia pesada tendo (i) uma parte CH3, de preferência uma região Fc, que compartilha pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, mais de preferência pelo menos 98%, ainda mais de preferência pelo menos 99%, e mais de preferência 100% de identidade de sequência com uma parte CH3, ou região Fc, respectivamente, de uma cadeia pesada de imunoglobulina de rato e/ou camundongo; e (ii) pelo menos as três CDRs (regiões determinantes da complementariedade) e/ou as regiões estruturais da região variável de cadeia pesada são de origem humana ou humanizadas. Mais de preferência, ambas as cadeias pesadas do anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção tem (i) uma parte CH3, de preferência uma região Fc, que compartilha pelo menos 95%, de preferência pelo menos 97%, mais de preferência pelo menos 98%, ainda mais de preferência pelo menos 99%, e mais de preferência 100% de identidade de sequência com uma parte CH3, ou região Fc, respectivamente, de uma cadeia pesada de imunoglobulina de rato e/ou camundongo; e (ii) pelo menos as três CDRs (regiões determinantes da complementariedade) e/ou as regiões estruturais da região variável de cadeia pesada são de origem humana ou humanizadas. Além disso, também as pelo menos as três CDRs (regiões determinantes da complementariedade) e/ou as regiões estruturais da região variável de cadeia leve são, de preferência, de origem humana ou humanizadas.

[0091] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é selecionado de uma ou mais das

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 67/151

62/140 seguintes combinações de isotipos (em que cada isotipo/combinação significa, em particular, que pelo menos as CDRs e/ou a as regiões estruturais, de preferência, as regiões variáveis, são de preferência de origem humana ou

humanizadas - mesmo se	o	isotipo se referir	apenas	ao
rato/camundongo):
— IgG2b de Rato/IgG2a	de	Camundongo,
— IgG2b de Rato/IgG2b	de	Camundongo,

— IgG2b de Rato/IgG3 de Camundongo, — IgG2b de Rato/IgGl de Humano, — IgG2b de Rato/IgG2 de Humano, — IgG2b de Rato/IgG3 de Humano [alotipo oriental G3m (st) = que se liga à proteína A], — IgG2b de Rato/IgG4 de Humano, — IgG2b de Rato/IgG2c de Rato, — IgG2a de Camundongo/IgG3 de Humano [alotipos caucassianos G3m (b+g) = nenhuma ligação à proteína A, rotulada com * a seguir], — IgG2a de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgGl de Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG2a de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano [charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG2a de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgGl de Humano[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — [VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgGl de Humano/[VHCH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — [VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgG4 de Humano/[VHCH1,VL-CL] de Rato-IgG4 de Humano-[charneira]-IgG4 de Humano[região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 68/151

63/140 terminal de CH2 : > posição do aminoácido 251]-IgG3 de

Humano*[CH3],

- IgG2b de Rato/[VH-CH1,VL-CL]	de	Camundongo-IgGl	de
Humano - [charneira-CH2-CH3],
—IgG2b de Rato/[VH-CH1,VL-CL]	de	Camundongo-IgG2	de
Humano-[charneira-CH2-CH3] ,
- IgG2b de Rato/[VH-CH1,VL-CL]	de	Camundongo-IgG3	de

Humano-[charneira-CH2-CH3, alotipo oriental], — IgG2b de Rato/[VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgG4 de Humano-[ charneira-CH2-CH3] , — IgGl de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgGl de Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*[CH2-CH3], — IgGl de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano[charneira]-IgG4 de Humano[região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-terminal de CH2: > posição do aminoácido 251]-IgG3 de Humano*[CH3], — IgGl de Humano/Camundongo-[VH-CH1,VL-CL]-IgGl de Humano-[charneira]-IgG4 de Humano[região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-terminal de CH2: > posição do aminoácido 251]-IgG3 de Humano*[CH3], — IgGl de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano[charneira]-IgG2 de Humano[região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-terminal de CH2: > posição do aminoácido 251]-IgG3 de Humano*[CH3], — IgGl de Humano/Camundongo-lVH-CHl,VL-CL]-IgGl de Humano-[charneira]-IgG2 de Humano [região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-terminal de CH2: > posição do aminoácido 251]-IgG3 de Humano*[CH3] , — IgGl de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3],

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 69/151

64/140 — IgGl de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgGl de Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG2 de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgG2 de Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG4 de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgG4 de

Humano-[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG4 de Humano/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgG4 de

Humano-[charneira]-IgG4 de Humano[região N-terminal de CH2]-IgG3 de Humano*[região C-terminal de CH2: > posição do aminoácido 251]-IgG3 de Humano*[CH3], — IgG2b de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Rato-IgGl de Humano -[charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — IgG2b de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Humano-IgGl de Humano -[charneira]-IgG3 de Humano*[CH2-CH3], — IgG2b de Camundongo/[VH-CH1,VL-CL] de Camundongo-IgGl de Humano - [charneira]-IgG3 de Humano*-[CH2-CH3], — Camundongo-[VH-CH1,VL-CL]-IgG4 de Humano/Rato-[VHCH1,VL-CL]-IgG4 de Humano-[charneira]-IgG4 de Humano-[CH2]IgG3 de Humano*-[CH3],

- IgGl de Humano/Rato[VH-CH1,VL-CL]-IgGl de

Humano[charneira]-IgG4 de Humano-[CH2]-IgG3 de Humano*[CH3], — IgGl de Humano/Camundongo[VH-CH1,VL-CL]-IgGl de

Humano[charneira]-IgG4 de Humano-[CH2]- IgG3 de Humano*[CH3] , e — IgG4 de Humano/Humano[VH-CH1,VL-CL]-IgG4 de Humano[charneira]-IgG4 de Humano-[CH2]- IgG3 de Humano*-[CH3].

[0092] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, para uso de acordo com a invenção é um anticorpo do tipo IgG (também referido como

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 70/151

65/140 semelhante à IgG) compreendendo um Sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em particular uma região Fc. Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a invenção é um anticorpo biespecifico trifuncional, que é um anticorpo heterólogo de rato/camundongo compreendendo um Sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em particular uma Região Fc. Desse modo, um anticorpo com uma combinação de subclasse de IgG2a de camundongo e IgG2b de rato é preferido. Um anticorpo heterólogo de rato/camundongo compreendendo um Sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em particular uma região Fc, com cadeias pesadas compostas de subclasses IgG2a de murino e IgG2b de rato, cada uma, de preferência, com suas respectivas cadeias leves, é particularmente preferido.

[0093] Para anticorpos que compreendem um sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em particular uma região Fc, com cadeias pesadas compostas de subclasses de IgG2a e IgG2b de rato, em particular para anticorpos do formato Triomab, foi mostrado que tais anticorpos se ligam com uma maior afinidade a FcyRIIa humano do que a FcyRIIb humano e mostram uma razão de ligação a FcyRIIa/FcyRIIb consideravelmente melhorada (Lindhofer H, Hess J, Ruf P. Tri functional Triomab® antibodies for cancer therapy. Em: Kontermann RE (ed.), Bispecific antibodies. Springer, Berlin, 2011, págs. 289-312). Assim, tais anticorpos levam à fagocitose intensificada de células tumorais revestidas de anticorpo por macrófagos e morte direta aumentada de células tumorais. Por conseguinte, tais anticorpos são particularmente preferidos.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 71/151

66/140 [0094] Em geral, o anticorpo multifuncional para uso de acordo com a invenção apresenta, de preferência, uma das seguintes combinações de isotipos na sua região Fc: ratoIgG2b/camundongo-IgG2a, rato-IgG2b/camundongo-IgG2b, ratoIgG2b/IgGl de Humano, ou camundongo-[VH-CHI,VL-CL]-humanoIgGl/rato-[VH-CH1,VL-CL]-humano-IgGl-[charneira]-humano IGg3*-[CH2-CH3], em que * = Alotipos caucasianos G3m(b+g) = sem ligação à proteína A.

[0095] Mais de preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a presente invenção é do formato Triomab. Os triomab são anticorpos semelhantes a IgG bifecíficos tendo uma especificidade contra CD3 e uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor. Estas quimeras consistem em dois semi-anticorpos, cada um com uma cadeia leve e outra pesada, que se originam dos isotipos de IgG2a de camundongo e IgG2b de rato. Por conseguinte, a região Fc de triomabos é IgG2a de camundongo/IgG2b de rato.

[0096] De preferência, o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, para uso de acordo com a invenção é selecionado do grupo que consiste em catumaxomab (anti-CD3 x anti-EpCAM), FBTA05/limphomun (anti-CD3 X antiCD20), ertumaxomab (anti-CD3 x antÍ-HER2/neu) e/ou ektomun (anti-CD3 X anti-GD2), de preferência o anticorpo é catumaxomab e/ou ektomun.

[0097] O exemplo mais preferido de anticorpos biespecificos trifuncionais é catumaxomab (Removab®) (anti-EpCAM x anti-CD3) . Removab® foi aprovado para o tratamento de ascite maligna em 2009 pela EMA (Linke et al.

Catumaxomab - desenvolvimento clínico e direções futuras.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 72/151

67/140 (2010) mAbs 2:2). Exemplos preferidos adicionais de anticorpos biespecificos trifuncionais incluem (i) FBTA05 (também denominado limphomun), um anti-CD3 x trifuncional Anticorpo CD20, (ii) ertumaxomab, um anticorpo trifuncional anti-CD3 x anti-HER2, (iii) ektomun, um anticorpo trifuncional anti-CD3 x anti-GD2, e (iv) TRBs02, um anticorpo trifuncional especifico para melanoma humano (Ruf et al. (2004) Int J Cancer, 108: 725-732) .

Modulador de ponto de verificação imunológico [0098] Como aqui usado (isto é, ao longo do presente relatório descritivo), o termo modulador de ponto de verificação imunológico (também referido como modulador de ponto de verificação) refere-se a uma molécula ou a um composto que modula (por exemplo, reduz, inibe, ativa, estimula, aumenta, reforça ou suporta total ou parcialmente) a função de uma ou mais moléculas do ponto de verificação. Assim, um modulador de ponto de verificação imunológico pode ser um inibidor do ponto de verificação imunológico (também referido como inibidor do ponto de verificação ou inibidor) ou um ativador do ponto de verificação imunológico (também referido como ativador do ponto de verificação ou ativador). Um inibidor do ponto de verificação imunológico (também referido como inibidor do ponto de verificação ou inibidor) reduz, inibe, interfere ou modula negativamente total ou parcialmente a função de uma ou mais moléculas do ponto de verificação. Um ativador de ponto de verificação imunológico (também conhecido como ativador de ponto de verificação ou ativador) ativa, estimula, aumenta, reforça, suporta ou modula positivamente total ou parcialmente a função de uma

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 73/151

68/140 ou mais moléculas do ponto de verificação. Os moduladores de ponto de verificação imunológico são tipicamente capazes de modular (i) a auto-tolerância e/ou (ii) a amplitude e/ou a duração da resposta imunológica. De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico usado de acordo com a presente invenção modula a função de uma ou mais moléculas do ponto de verificação humanos e é, assim, um modulador de ponto de verificação humano. De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico um ativador ou um inibidor de uma ou mais molécula (s) do ponto de verificação imunológico selecionada(s) de CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR, IGOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA (CD272), CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR e/ou FasR/DcR3; ou um ativador ou um inibidor de um ou mais dos ligandos do mesmo.

[0099] Moléculas do ponto de verificação (também chamadas de moléculas do ponto de verificação imunológico ou pontos de verificação imunológicos) são moléculas, tais como proteínas, que estão tipicamente envolvidas em vias imunológicas e, por exemplo, regulam a ativação de células T, proliferação de células T e/ou Função de Células T. Por conseguinte, a função das moléculas do ponto de verificação, que é modulada (por exemplo, reduzida, inibida, interferida, ativada, estimulada, aumentada, reforçada ou suportada total ou parcialmente) pelos moduladores de ponto de verificação, é tipicamente a (regulação da) ativação de células T, proliferação de células T e/ou função de células T. As moléculas do ponto

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 74/151

69/140 de verificação imunológica, portanto, regulam e mantêm a autotolerância e a duração e a amplitude de respostas imunológicas fisiológicas. Muitas das moléculas do ponto de verificação imunológico pertencem à família B7:CD28 ou à super-família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) e, ligando-se a ligandos específicos, ativam moléculas sinalizadoras que são recrutadas para o domínio citoplasmático (cf. Susumu Suzuki et ai., 2016: Current status of immunotherapy. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2016: doi: 10.1093/jjco/hyv201 [publicação de versão eletrônica]; em particular a Tabela 1).

[00100] A família B7:CD28 compreende as vias mais frequentemente alvejadas na pesquisa do ponto de verificação imunológico, incluindo a CTLA-4-B7-1/B7-2 e a via PD-1-B7-H1(PDL1)/B7-DC(PD-L2) . Outro membro desta família é ICOS-ICOSL/B7-H2. Membros adicionais dessa família incluem CD28, B7-H3 e B7-H4.

[00101] O CD28 é constitutivamente expressado em quase todas as células T CD4+ humanas e em cerca de metade de todas as células T CD8. A ligação com os seus dois ligandos é CD80(B7-l) e CD86(B7-2), expressada em células dendríticas, induz à expansão de células T. A molécula do ponto de verificação coestimuladora CD28 compete com a molécula do ponto de verificação inibitória CTLA4 para os mesmos ligandos, CD80 e CD86 (cf. Buchbinder E.I. e Desai A., 2016: Vias CTLA-4 e PD-1 - Semelhanças, Diferenças e Implicações de Sua Inibição, American Journal of Clinicai Oncology, 39(1):98-106).

[00102] A proteína 4 citotóxica associada a linfócitos

T (CTLA4; também conhecida como CD152) é um homólogo de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 75/151

70/140

CD28 com uma afinidade de ligação muito maior a B7. Os ligandos de CTLA-4 são CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), similarmente a CD28. No entanto, ao contrário do CD28, a ligação de CTLA4 a B7 não produz um sinal estimulador, mas impede o sinal coestimulador normalmente provido pelo CD28. Além disso, presume-se que a ligação de CTLA4 a B7 produza ainda um sinal inibitório que neutraliza os sinais estimuladores da ligação de CD28:B7 e TCR:MHC. O CTLA-4 é considerado o líder de ponto de verificação imunológicos inibitórios, pois interrompe as células T potencialmente autorreativas no estágio inicial de ativação de células T nãive, tipicamente em linfonodos (Buchbinder E.I. e Desai A., 2016: Vias CTLA-4 e PD-1: Similarities, Differences and Implications of Their Inhibition; American Journal of Clinical Oncology, 39(1) : 98-106) . Inibidores de pontos de veririfação preferidos de CTLA4 incluem anticorpos monoclonais Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune). Inibidores de CTLA-4 preferidos adicionais incluem os anticorpos anti-CTLA4 descritos no WO 2001/014424, no WO 2004/035607, no US 2005/0201994 e no EP 1212422 Bl. Anticorpos CTLA-4 preferidos adicionais são descritos em US 5.811.097, em US 5.855.887, em US 6.051.227, em US 6.984.720, em WO 01/14424 em WO 00/37504, em US 2002/0039581 e em US 2002/086014. Outros anticorpos anti-CTLA-4 preferidos que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, os descritos no documento WO 98/42752; US 6.682.736 e US 6.207.156; Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 95(17):10067-10071 (1998); Camacho at al., J. Clin. Oncology, 22(145): Resumo N° 2505 (2004) (anticorpo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 76/151

71/140

CP-675206); Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998), em US 5.977.318, US 6.682.736, US 7.109.003 e em US 7.132.281.

[00103] 0 receptor de morte programada 1 (PD1) tern dois ligandos, PD-L1 (também conhecido como B7-H1 e CD274) e PDL2 (também conhecido como B7-DC e CD273). A via PD1 regula as células T previamente ativadas nos últimos estágios de uma resposta imunológica, principalmente em tecidos periféricos. Uma vantagem de ter como alvo PD1 é, portanto, que ele pode restaurar a função imunológica no microambiente tumoral. Os inibidores preferidos da via PD1 incluem Opdivo* (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), Durvalumab (Medlmmune/AstraZeneca), MEDI4736 (AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 Al), Atezolizumab (MPDL3280A, Roche/Genentech; cf. EUA 8.217.149 B2), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), Avelumab (Merck), MSB001071 8C (Merck), PDR001 (Novartis), BMS-936559 (Bristol Myers Squibb), REGN2810 (Regeneron Pharmaceuticals), MIH1 (Affymetrix), AMP-224 (Amplimune, GSK), BGB-A317 (BeiGene) e Lambrolizumab (por exemplo, descrito como hPD109A e seus derivados humanizados h409All, h409Al 6 e h409A17 em WO2008/156712; Hamid et al. , 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144).

[00104] O coestimulador de células T indutíveis (ICOS; também conhecido como CD278) é expressado em células T ativadas. Seu ligando é ICOSL (B7-H2; CD275), expressado principalmente em células B e células dendríticas. A molécula parece ser importante na função efetora de células T.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 77/151

72/140 [00105] B7-H3 (também conhecido como CD276) foi originalmente entendido como sendo uma molécula coestimuladora, mas é agora considerada como coinibidora. Um inibidor do ponto de verificação preferido de B7-H3 é o anticorpo monoclonal otimizado por Fc Enoblituzumab (MGA271; MacroGenics; cf. US 2012/0294796 Al).

[00106] B7-H4 (também conhecido como VTCN1), é expressado por células tumorais e macrófagos associados a tumor e desempenha um papel no escape tumoral. Os inibidores B7-H4 preferidos são os anticorpos descritos em Dangaj, D. et ai., 2013; Cancer Research 73(15): 4820-9 e na Tabela 1 e a respectiva descrição de Jenessa B. Smith et ai., 2014: B7-H4 as a potential target for immunotherapy for gynecologic cancers: A closer look. Gynecol Oncol 134(1): 181-189. Outros exemplos preferidos de inibidores de B7-H4 incluem anticorpos para B7-H4 humana como descrito, por exemplo, em WO 2013/025779 Al e em WO 2013/067492 Al ou formas recombinantes solúveis de B7-H4, tal como descrito em US 2012/0177645 Al.

[00107] A superfamilia de TNF compreende, em particular, 19 ligandos de proteína que se ligam a 29 receptores de citocinas. Eles estão envolvidos em muitas respostas fisiológicas, tais como, apoptose, inflamação ou sobrevida celular (Croft, M., C.A. Benedict e C.F. Ware, Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies. Nat Rev Drug Discov, 2013.12(2): págs. 147-68). As seguintes moléculas/vias do ponto de verificação são preferidas para indicações de câncer: TNFRSF4 (GX40/0X40L), TNFRSFS (CD40L/CD40), TNFRSF7 (CD27/CD70), TNFRSF8 (CD30/CD30L), TNFRSF9 (4-1BB/4-1BBL), TNFRSF10 (TRAILR/TRAIL)), TNFRSF12

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 78/151

73/140 (FN14/TWEAK), TNFRSF13 (BAFFRTACI/APRIL-BAFF) e TNFRSF18 (GITR/GITRL). Outras moléculas/vias do ponto de verificação preferidas incluem o ligando Fas e TNFRSF1 (TNFCt/TNFR) . Além disso, a via do atenuador de linfócitos T e B (BTLA)/mediador da entrada do virus da herpes (HVEM) é preferida para intensificar as respostas imunológicas, apenas semelhante ao bloqueio de CTLA-4. Por conseguinte, no contexto da presente invenção, tais moduladores de ponto de verificação são preferidos para o uso no tratamento e/ou na prevenção em câncer, que modulam uma ou mais moléculas do ponto de verificação selecionadas de TNFRSF4 (GX40/0X40L) , TNFRSFS (CD40L/CD40) , TNFRSF7 (CD27/CD70), TNFRSF9 (4-1BB/4-1BBL) , TNFRSF18 (GITR/GITRL) , ligando FasR/DcR3/Fas, TNFRSF1 (TNFOC/TNFR) , BTLA/HVEM e CTLA4 .

[00108] 0X40 (também conhecido como CD134 ou TNFRSF4) promove a expansão das células T efetoras e de memória, mas também é capaz de suprimir a diferenciação e a atividade de células T reguladoras e regular a produção de citocinas. O ligando de 0X40 é OX40L (também conhecido como TNFSF4 ou CD252). O 0X40 é transientemente expressado após o encaixe do receptor de células T e é apenas regulado positivamente nas células T ativadas por antígeno mais recentemente nas lesões inflamatórias. Os moduladores de ponto de verificação preferidos de 0X40 incluem MEDI6469 (Medlmmune/AstraZeneca), MEDI6383 (Medlmmune/AstraZeneca), MED10562 (Medlmmune/AstraZeneca), MOXR0916 (RG7888; Roche/Genentech) e GSK3174998 (GSK).

[00109] O CD40 (também conhecido como TNFRSF5) é expressado por uma variedade de células do sistema imunológico incluindo células apresentadoras de antígeno.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 79/151

74/140

Seu ligando é CD40L, também conhecido como CD154 ou TNFSF5, é expressado transientemente na superficie das células T CD4+ ativadas. A sinalização de CD40 licencia as células dendríticas para amadurecer e, assim, desencadeiam a ativação e a diferenciação de células T. No entanto, o CD40 também pode ser expressado pelas células tumorais. Assim, a estimulação/a ativação de CD40 em pacientes com câncer pode ser benéfica ou deletéria. Assim, foram desenvolvidos moduladores estimuladores e inibitórios deste ponto de verificação imunológico (Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie SOrensen, Barbara Nicola Olsen e Anders Elm Pedersen, 2014: Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 96-104). Exemplos preferidos de moduladores de ponto de verificação CD40 incluem (i) anticorpos anti-CD agonisticos como descrito em Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie Sorensen, Barbara Nicola Olsen e Anders Elm Pedersen, 2014: Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 96104, tal como Dacetuzumab (SGN-40), CP-870893, FGK 4.5/FGK 45 e FGK1 1 5, de preferência Dacetuzumab e (ii) anticorpos anti-CD antagonisticos como descrito em Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie Sorensen, Barbara Nicola Olsen e Anders Elm Pedersen, 2014: Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 96-104, tai como Lucatumumab (HCD122, CHIR-12.12). Moduladores do ponto de verificação imunológicos preferidos adicionais de CD40 incluem SEA-CD40 (Seattle Genetics), ADC-1013 (Alligator

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 80/151

75/140

Biosciences), APX005M (Apexigen Inc) e R07009789 (Roche).

[00110] O CD27 (também conhecido como TNFRSF7) suporta a expansão específica de antigeno de células T nãives e desempenha um papel importante na geração de memória de células T. O CD27 também é um marcador de memória de células B. A disponibilidade transiente do seu ligando, CD70 (também conhecido como TNFSF7 ou CD27L), em linfócitos e células dendríticas regula a atividade de CD27. Além disso, sabe-se gue a coestimulação de CD27 suprime a função de célula efetora Thl7. Um modulador de ponto de verificação imunológico preferido de CD27 é Varlilumab (Celldex). Os moduladores de ponto de verificação imunológico preferidos de CD70 incluem ARGX-110 (arGEN-X) e SGN-CD70A (Seattle Genetics).

[00111] O CD137 (também conhecido como 4-1BB ou TNFRSF9) é um membro da família do receptor do fator de necrose tumoral (INF) e está cada vez mais associado à atividade coestimuladora para células T ativadas. Em particular, a sinalização de CD137 (através do seu ligando CD137L, também conhecido como TNFSF9 ou 4-1BBL) resulta na proliferação de células T e protege as células T, em particular, células T CD8+, da morte celular induzida por ativação. Os moduladores de ponto de verificação preferidos de CD137 incluem PF-05082566 (Pfizer) e Urelumab (BMS).

[00112] O gene relacionado à família de TNFR induzida por glicocorticóides (GITR, também conhecido como TNFRSF18), induz a expansão de células T, incluindo a expansão Treg. O ligando para GITR (GITRL, TNFSF18) é expressado principalmente em células apresentadoras de antigeno. Demonstrou-se gue os anticorpos para GITR

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 81/151

76/140 mostraram para promover uma resposta antitumoral através da perda de estabilidade da linhagem Treg. Os moduladores de ponto de verificação preferidos de GITR incluem BMS-986156 (Bristol Myers Squibb), TRX518 (GITR Inc) e MK-4166 (Merck).

[00113] Outra molécula do ponto de verificação preferida a ser modulada é BTLA. O atenuador de linfócitos B e T (BTLA; também conhecido como CD272) é, em particular, expressado por células T CD8+, em que a expressão de superfície de BTLA é gradualmente regulada negativamente durante a diferenciação de células T CD8+ humanas do fenótipo de célula naive para efetora. No entanto, células T CD8+ humanas específicas de tumor expressam altos níveis de BTLA. A expressão de BTLA é induzida durante a ativação de células T, e BTLA permanece expressado nas células Thl, mas não nas células Th2. Como PD1 e CTLA4, BTLA interage com um homólogo de B7, B7H4. No entanto, ao contrário de PD-1 e CTLA-4, o BTLA exibe inibição de células T via interação com receptores da família de necrose tumoral (TNF-R) , não apenas a família de B7 de receptores de superfície celular. BTLA é um ligando para a superfamília do fator de necrose tumoral (receptor), membro 14 (TNFRSF14), também conhecido como mediador da entrada do vírus do herpes (HVEM; Herpesvirus Entry Mediator, também conhecido como CD270). Os complexos BTLA-HVEM regulam negativamente as respostas imunes das células T. Os inibidores de BTLA preferidos são os anticorpos descritos na Tabela 1 de Alison Crawford e E. John Wherry, 2009: Editorial: Therapeutic potential of targeting BTLA. Journal of Leukocyte Biology 86: 5-8, em particular os anticorpos

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 82/151

77/140 humanos dos mesmos. Outros anticorpos preferidos neste contexto, que bloqueiam a interação do BTLA humano com o seu ligando, são descritos no WO 2011/014438, tal como 4C7 como descrito no WO 2011/014438.

[00114] Outra família de moléculas do ponto de verificação inclui moléculas do ponto de verificação relacionadas com as duas classes primárias de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHO) (MHC de classe I e classe II) . Esta família inclui o Receptor IgLike Exterminador (KIR) para a classe I e o gene de ativação 3 de linfócitos (LAG-3) para a classe II.

[00115] O Receptor semelhante à Imunoglobulina de Células Exterminadoras (KIR) é um receptor para moléculas de Classe I de MHC em células Exterminadoras Naturais. Um inibidor de exemplo de KIR é o anticorpo monoclonal Lirilumab (IPH 2102; Innate Pharma/BMS; cf. US 8.119.775 B2 e Benson et al., 2012, Blood 120: 4324-4333).

[00116] A sinalização de Gene-3 de ativação do Linfócito (LAG3, também conhecido como CD223) leva à supressão de uma resposta imunológica por ação a Tregs, bem como efeitos diretos sobre as células T CD8+. Um exemplo preferido de um inibidor de LAG3 é o anticorpo monoclonal anti-LAG3 BMS-98601 6 (Bristol-Myers Squibb). Outros exemplos preferidos de um inibidor de LAG3 incluem LAG525 (Novartis), IMP321 (Immutep) e LAG3-Ig como descrito no WO 2009/044273 A2 e em Brignon et al., 2009, Clin. Cancer Res. 15: 6225-6231 bem como anticorpos de camundongo ou humanizados que bloqueiam LAG3 humana (por exemplo, IMP701 como descrito no WO 2008/132601 Al), ou anticorpos totalmente humanos que bloqueiam LAG3 humano (tal como

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 83/151

78/140 descrito no EP 2320940 A2).

[00117] Outra via moléculas do ponto de verificação é a via TIM-3/GAL9). O domínio de imunoglobulina de células T e o domínio de mucina 3 (TIM-3, também conhecido como HAVcr2) é expressado em células T CD4+ humanas ativadas e regula citocinas Thl e Thl7. TIM-3 atua como um regulador negativo de função Thl/Tcl desencadeando a morte celular por interação com o seu ligando, galectina-9 (GAL9). TIM-3 é uma molécula de superfície celular específica do tipo 1 auxiliar T que está regulando a indução de tolerância periférica. Um estudo recente de fato demonstrou que os anticorpos TIM-3 poderíam intensificar significativamente a imunidade antitumoral (Ngiow, S.F., et al., Anti-TIM3 antibody promotes T cell IFN-gammamediated antitumor immunity and suppresses established tumors. Cancer Res, 2011. 71 (10) : págs. 3540-51) . Exemplos preferidos de inibidores de TIM-3 incluem anticorpos que têm como alvo TIM3 humano (por exemplo, como descrito no WO 2013/006490 A2) ou, em particular, o anticorpo bloqueador de TIM3 antihumano F38-2E2 como descrito por Jones et al., 2008, J Exp. Med. 205 (12): 2763-79.

[00118] CEACAM1 (Molécula de adesão celular relacionada a antigeno carcinoembrionário 1) é uma molécula do ponto de verificação adicional (Huang, Y.H., et al. , CEACAMI regulates TIM-3-mediated tolerance and exhaustion. Nature, 2015. 517(7534): págs. 386-90; Gray-Owen, S.D. e R.S. Blumberg, CEACAMI: contact-dependent control of immunity. Nat Rev Immunol, 2006. 6(6): págs. 433-46). Um modulador de ponto de verificação preferido de CEACAMI é CM-24 (cCAM Biotherapeutics).

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 84/151

79/140 [00119] Outra molécula do ponto de verificação imunológico é GARP, que desempenha um papel na capacidade de tumores de escapar o sistema imunológico do paciente. Atualmente em ensaios clínicos, o candidato (ARGX-115) parece demonstrar efeito interessante. Por conseguinte, o ARGX-1 15 é um modulador de ponto de verificação GARP preferido.

[00120] Além disso, vários grupos de pesquisa demonstraram que outra molécula do ponto de verificação é fosfatidilserina (também referida como PS) pode ser direcionada ao tratamento de câncer (Creelan, B.C., Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer. Cancer Control, 2014. 21 (1): págs. 80-9; Yin, Y., et al.,

Phosphatidylserine-targeting antibody induces Ml macrophage polarization and promotes myeloid-derived suppressor cell differentiation. Cancer Immunol Res, 2013. 1(4): págs. 25668). Um modulador de ponto de verificação preferido de fosfatidilserina (PS) é bavituximab (Peregrine).

[00121] Outra via do ponto de verificação é CSF1/CSF1R (Zhu, Y., et al., CSFI/CSF1R Blockade Reprograms TumorInfiltrating Macrophages and Improves Response to T-cell Checkpoint Immunotherapy in Pancreatic Cancer Models. Cancer Research, 2014. 74(18): p. 5057-5069). Os moduladores de ponto de verificação preferidos de CSF1R incluem FPA008 (FivePrime) , IMC-CS4 (Eli-Lilly) , PLX3397 (Plexxicon) e RO5509554 (Roche).

[00122] Além disso, o receptor de células exterminadoras naturais CD94/NKG2A é avaliado quanto ao seu papel no carcinoma cervical (Sheu, B.C., et al., Upregulation of inhibitory natural killer receptors

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 85/151

80/140

CD94/NKG2A with suppressed intracellular perforin expression of tumor infiltrating CD8+ I lymphocytes in human cervical carcinoma. Cancer Res, 2005. 65(7): págs. 2921-9) e em leucemia (Tanaka, J., et al., Leukemia, Cytolytic activity against primary leukemic cells by inhibitory NK cell receptor (CD94/NKG2A)-expressing T cells expanded from various sources of blood mononuclear cells 2005. 19(3): págs. 486-9). Um modulador de ponto de verificação preferido de NKG2A é IPH2201 (Innate Pharma).

[00123] Outra molécula do ponto de verificação preferida é IDO, a enzima indoleamina 2,3-dioxigenase da via da quinurenina (Ball, H.J., et al., Indoleamine 2,3dioxigenase-2; a new enzyme in the kynurenine pathway. Int J Brochem Cell Biol, 2009. 41(3): págs. 467-71). A indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima catabólica do triptofano com propriedades imunoinibitórias. Sabe-se que IDO suprime células I e NK, gera e ativa Tregs e células supressoras derivadas de mieloides e promove angiogênese tumoral. ID01 é superexpressado em muitos cânceres e foi mostrado para permitir que as células tumorais escapem do sistema imunológico (Liu, X., et al., Selective inhibition of IDO1 effectively regulates mediators of antitumor immunity. Blood, 2010. 115(17):

págs. 3520-30; Ino, K., et al., Inverse correlation between tumoral indoleamine 2,3-dioxygenase expression and tumorinfiltrating lymphocytes in endometrial cancer: its association with disease progression and survival. Clin Cancer Res, 2008. 14(8): p. 2310-7) e para facilitar a progressão crônica do tumor quando induzido por inflamação local (Muller, A.J., et al., Chronic inflammation that

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 86/151

81/140 facilitates tumor progression creates local immune suppression by inducing indoleamine 2,3 dioxygenase. Proc Natl Acad Sci EUA, 2008. 105(44) : págs. 17073-8) . Os inibidores de IDO preferidos incluem Exiguamine A, epacadostat (INCB024360; InCyte), Indoximod (NewLink Genetics), NLG919 (NewLink Genetics/Genentech), GDC-0919 (NewLink Genetics/Genentech), F001287 (Flexus Biosciences/BMS) and small molecules such as 1-methyltryptophan, in particular 1-methyl-[D]-tryptophan and the IDO inhibitors listed in Table I of Sheridan C, 2015: IDO inhibitors move center stage in immune-oncology; Nature Biotechnology 33: 321-322.

[00124] Outra molécula do ponto de verificação imunológico preferida a ser modulada é também um membro da via metabólica da quinurenina: TDO (triptofano-2,3dioxigenase). Vários estudos já demonstraram o interesse de TDO na imunidade ao câncer e autoimunidade (Garber, K., Evading immunity: new enzyme implicated in cancer. J Natl Cancer Inst, 2012. 104(5): págs. 349-52; Flatten, M., W. Wick, and B.J. Van den Eynde, Tryptophan catabolism in cancer: beyondiDO and tryptophan depletion. Cancer Res, 2012. 72(21): págs. 5435-40; Flatten, M., et al., Cancer Immunotherapy by Targeting IDOI/TDO and Their Downstream Effectors. Front Immunol, 2014. 5: p. 673) .

[00125] Outra molécula do ponto de verificação imunológico preferida a ser modulada é A2AR. O receptor de adenosina A2A (A2AR) é considerado como um ponto de verificação importante na terapia do câncer porque o microambiente do tumor tem tipicamente concentrações relativamente altas de adenosina, que está ativando o A2AR.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 87/151

82/140

Essa sinalização provê um enovelamento de retroalimentação imunológica negativa no microambiente imune (para revisão, ver Robert D. Leone et ai., 2015: A2aR antagonists: Next generation checkpoint blockade for cancer immunotherapy. Computational and Structural Biotechnology Journal 13: 265272). Inibidores A2AR preferidos incluem Istradefylline, PBS-509, ST1535, ST4206, Tozadenant, V81444, Preladenant, Vipadenant, SCH58261, SYN115, ZM241365 e FSPTP.

[00126] Outra molécula do ponto de verificação imunológico preferida a ser modulada é VISTA. O supressor Ig de dominio V de ativação de células T (VISTA; também conhecido como C10orf54) é primariamente expressado em células hematopoiéticas, de modo que a expressão consistente de VISTA nos leucócitos nos tumores possa permitir que o bloqueio de VISTA seja eficaz em uma ampla faixa de tumores sólidos. Um inibidor VISTA preferido é o JNJ-61610588 (ImmuNext), um anticorpo anti-VISTA, que entrou recentemente em um ensaio clinico de fase 1.

[00127] Outra molécula do ponto de verificação imunológico é CD122. O CD122 é a subunidade beta do receptor de interleucina-2. O CD122 aumenta a proliferação de células T efetoras CD8+.

[00128] Os exemplos mais preferidos de moléculas do ponto de verificação incluem a via CTLA4 e a via PD1 com CTLA4 e os seus ligandos CD80 e CD86 bem como PD1 com seus ligandos PD-L1 e PD-L2 (mais detalhes sobre vias de CTLA4 e PD1, bem como outros participantes são descritos em Buchbinder E.I. e Desai A., 2016: CTLA-4 and PD-1 Pathways: Similarities, Differences and Implications of Their Inhibition; American Journal of Clinical Oncology, 39(1):

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 88/151

83/140

98-106). Em geral, os exemplos preferidos de moléculas do ponto de verificação incluem CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR, IGOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1 R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR e/ou FasR/DcR3 bem como, em particular, seus ligandos.

[00129] As moléculas do ponto de verificação imunológico são responsáveis pelas interações coestimuladoras ou inibitórias de respostas de células T. Por conseguinte, as moléculas do ponto de verificação podem ser divididas em (i) moléculas do ponto de verificação (co)estimuladoras e (ii) moléculas do ponto de verificação inibitórias. Tipicamente, as moléculas do ponto de verificação (co-)estimuladoras atuam positivamente em conjunto com a sinalização do receptor de células T (TCR) induzida pela estimulação de antígeno, enquanto as moléculas do ponto de verificação inibitórias regulam negativamente a sinalização de TCR. Exemplos de moléculas do ponto de verificação (co-)estimuladoras incluem CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR e ICOS. Exemplos de moléculas do ponto de verificação inibitórias incluem CTLA4 bem como PD1 com os seus ligandos PD-L1 e PD-L2; e A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR e FasR/DcR3.

[00130] De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um ativador de uma molécula do ponto de verificação (co-)estimuladora ou uma molécula de ponto de verificação inibidora ou uma combinação das mesmas. Por conseguinte, o modulador de ponto de verificação imunológico é mais de preferência (i) um

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 89/151

84/140 ativador de CD27, CD28, CD40, CD122, CD13, 0X40, GITR e/ou IGOS ou (ii) um inibidor de A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR e/ou FasR/DcR3.

[00131] Como descrito acima, um número de moduladores (inibidores/ativadores) de CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR, IGOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, PD1, PDL-1, PD-L2, IDO, LAG-3, BTLA, TIM3, VISTA, KIR, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR e/ou FasR/DcR3 são conhecidos e alguns deles já estão em ensaios clínicos ou mesmo aprovados. Com base nestes moduladores de ponto de verificação imunológico conhecidos, podem ser desenvolvidos moduladores alternativos do ponto de verificação imunológico no (próximo) futuro. Em particular, moduladores conhecidos podem ser usados das moléculas do ponto de verificação imunológico preferidas, como tal, ou podem ser usados seus análogos, em particular, formas de anticorpos quimerizadas, humanizadas ou humanas.

[00132] Mais de preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de uma molécula do ponto de verificação inibitória (mas, de preferência, sem inibidor de uma molécula do ponto de verificação estimuladora). Por conseguinte, o modulador de ponto de verificação imunológico é ainda mais de preferência um inibidor de A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR e/ou DcR3 ou de um ligando dos mesmos.

[00133] Também é preferido que o modulador de ponto de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 90/151

85/140 verificação imunológico seja um ativador de uma molécula do ponto de verificação estimuladora ou coestimuladora (mas de preferência nenhum ativador de uma molécula do ponto de verificação inibitória). Por conseguinte, o modulador de ponto de verificação imunológico é mais de preferência um ativador de CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR e/ou ICOS ou de um ligando dos mesmos.

[00134] É mais preferido que o modulador de ponto de verificação imunológico seja um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2, ainda mais de preferência o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4, PD-1 e/ou PD-L1, e mais de preferência o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4 e/ou PD1. Um inibidor de CTLA-4 é particularmente preferido.

[00135]	Por	conseguinte, o	modulador	de	ponto de
verificação	pode	ser selecionado	a partir	de	inibidores
conhecidos	da vi	a CTLA-4 e/ou da	via PD-1.	Os	inibidores

preferidos da via CTLA-4 e da via PD-1 incluem os anticorpos monoclonais Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune), bem como o Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda®. (Pembrolizumab; Merck), Durvalumab (Medlmmune/AstraZeneca), MEDI4736 (AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 Al), MPDL3280A (Roche/Genentech; cf. US 8.217.149 B2), Pidilizumab (CT011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), MSB0010718C (Merck), MIH1 (Affymetrix) e Lambrolizumab (por exemplo, descrito como hPD109A e seus derivados humanizados h409All, h409A16 e h409A17 em WO2008/156712; Hamid et ai., 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144) . Inibidores de ponto de verificação mais preferidos incluem os inibidores de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 91/151

86/140

CTLA-4 Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e/ou os inibidores de PD-1 Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), Pidilizumab (CT011; CureTech), MED10680 (AMP-514; AstraZeneca), AMP-224 e Lambrolizumab (por exemplo, descrito como hPD109A e seus

derivados humanizados	h409All, h409A16 e	h409A17 em
W02008/156712; Hamid 0.	et al. , 2013; N. Engl.	J. Med. 369:
134-144).
[00136] No contexto	da presente invenção,	é preferido
que seja usado mais	do que um modulador	de ponto de

verificação imunológico (por exemplo, inibidor do ponto de verificação), em particular pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 moduladores do ponto de verificação imunológico distintos (por exemplo, inibidores do ponto de verificação), de preferência, 2, 3, 4 ou 5 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos são usados (por exemplo, inibidores do ponto de verificação), mais de preferência 2, 3 ou 4 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos (por exemplo, inibidores do ponto de verificação), ainda mais de preferência são usados 2 ou 3 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos (por exemplo, inibidores do ponto de verificação), e mais de preferência 2 moduladores distintos do ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) são usados. Deste modo, moduladores de ponto de verificação imunológico distintos (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) significam, em particular, que modulam (por exemplo, inibem) diferentes vias de moléculas do ponto de verificação.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 92/151

87/140 [00137] De preferência, um inibidor da via PD-1 é combinado com um inibidor da via CTLA-4. Por exemplo, como descrito acima, uma terapia combinada com Nivolumab (antiPD1) e Ipilimumab (anti-CTLA4) foi aprovada pelo FDA em 2015 para o tratamento de pacientes com BRAF V600 tipo selvagem, melanoma irressecável ou metastático. Além disso, um estudo de fase 1b bem-sucedido na combinação de Durvalumab (anti-PD-Ll) e Tremelimumab (anti-CTLA4) em câncer de pulmão de células não pequenas foi relatado recentemente (Antonia, Scott et ai., 2016, Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in nonsmall cell lung cancer: a multicentre, phase lb study; Lancet Oncol. 5 de Fevereiro de 2016. pii: S14702045(15)00544-6. doi: 10.1016/31470-2045(15)00544-6.

[Publicação de versão eletrônica]). Por conseguinte, as combinações preferidas de moduladores de ponto de verificação imunológico da via PD-1 e da via CTLA-4 são (i) Nivolumab (anti-PDl) e Ipilimumab (anti-CTLA4) ou (ii) Durvalumab (MEDI4736; anti-PD-Ll) e Tremelimumab (antiCTLA4). Combinações dos mesmos, por exemplo, Nivolumab (anti-PDl) e Tremelimumab (anti-CTLA4) ou Durvalumab (MEDI4736; anti-PD-Ll) e Ipilimumab (anti-CTLA4) são também preferidos.

[00138] Outras combinações preferidas de pelo menos dois moduladores de ponto de verificação imunológico distintos no contexto da presente invenção podem compreender uma combinação selecionada de (i) uma combinação de um inibidor de KIR e um inibidor de CTLA-4, tal como Lirilumab/Ipilimumab; (ii) uma combinação de um inibidor de KIR e um inibidor da via PD-1, tal como um

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 93/151

88/140 inibidor de PD-1, por exemplo, Lirilumab/Nivolumab; (iii) uma combinação de um inibidor de LAG3 e um inibidor da via PD-1, tal como um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1, por exemplo, como descrito em Woo et al., 2012, Cancer Res. 72:917-27 ou em Butler N. S. et al. , 2011, Nat Immunol. 13:188-95) e exemplos preferidos de tal combinação incluem Novilumab/BMS-986016 e PDR001/LAG525; (iv) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo ICOS e um inibidor do CTLA-4, por exemplo como descrito em Fu et

al.,	2011,	Cancer Res.	71	: 5445-54; (v)	uma	combinação	de
moduladores	de ponto	de	verificação	modulando 4-1BB	e
inibidores	de CTLA-4,	tal	como descrito	em	Curran et al	• r
2011,	PLoS	One 6(4):	el	9499); (vi)	uma	combinação	de

moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD1 e CD27, tal como Novilumab/Varlilumab e Atezolizumab/Varlilumab; (vii) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo 0X40 e CTLA-4, tal como MEDI6469/Tremelimumab; (viii) uma combinação de moduladores de ponto de verificação rendo como alvo 0X40 e PD-1, tais como MEDI6469/MEDI4736, MOXRO916/MPDL328OA, MEDI 6383/MEDI4736 e GSK3174998/Pembrolizumab; (ix) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD-1 e 4-1BB, tais como, Novilumab/Urelumab, Pembrolizumab/PF05082566 e Avelumab/PF-05082566; (x) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD-1 e IDO, tais como, Ipilimumab/lndoximod, Pembrolizumab/INCB024360, MEDI4736/INCB024360, MPDL328OA/GDC-O919 e Atezolizumab/INCB024360; (xi) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 94/151

89/140 como alvo PD-1 e CSF1R, tais como, Pembrolizumab/PLX3397, Novilumab/FPAO08 e MPDL3280A/RO5509554; (xii) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD-1 e GITR, tais como, Novilumab/BMS-986156 e Pembrolizumab/MK-4166; (xiii) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD-1 e CD40, tal como MPDL3280A/RO7009789; (xiv) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo PD-1 e B7-H3, tais como Pembrolizumab/MGA271; (xv) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo CTLA-4 e B7-H3, tal como Ipilimumab/MGA271 e (xvi) uma combinação de moduladores de ponto de verificação tendo como alvo KIR e 4-1BB, tal como Lirilumab/Urelumab.

[00139] Mais de preferência, a combinação do modulador de ponto de verificação imunológico e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T ou fragmento dos mesmos, para uso de acordo com a presente invenção, compreende pelo menos (CC) um inibidor de CTLA-4 e (β) um inibidor de PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2, de preferência pelo menos (CC) um inibidor de CTLA-4 e (β) um inibidor de PD-1. Exemplos de tal combinação preferida incluem uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Durvalumab (Medlmmune/AstraZeneca), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e MEDI4736 (AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 Al), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e MPDL3280A

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 95/151

90/140 (Roche/Genentech; cf. US 8.217.149 B2), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Pidilizumab (CT-011; CureTech), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e MED10680 (AMP-514; AstraZeneca), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e MSB-0010718C (Merck), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e M1H1 (Affymetrix), uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e AMP-224, uma combinação de Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) e Lambrolizumab, uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e Durvalumab (Medlmmune/AstraZeneca), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e MEDI4736 (AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 Al), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e MPDL3280A (Roche/Genentech; cf. US 8.217.149 B2), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e Pidilizumab (CT-011; CureTech), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca, uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e MSB-0010718C (Merck), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e MIH1 (Affymetrix), uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e AMP-224 e uma combinação de Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) e Lambrolizumab.

[00140] No contexto da presente invenção, é também preferido que seja usado mais do que um modulador de ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidor do ponto

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 96/151

91/140 de verificação) da mesma via do ponto de verificação, em particular, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 moduladores de ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) da mesma via do ponto de verificação são usados, de preferência 2, 3, 4 ou 5 moduladores de ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) da mesma via de preferência são usados, mais de preferência 2, 3 ou 4 moduladores de ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) da mesma via do ponto de verificação, ainda mais de preferência 2 ou 3 moduladores de ponto de verificação imunológico (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) da mesma via do ponto de verificação, e ainda mais de preferência 2 moduladores de ponto de verificação imunológicos (por exemplo, inibidores do ponto de verificação) da mesma via do ponto de verificação são usados. Vias de ponto de verificação preferidas a serem moduladas são a via PD-1 ou a via CTLA-4. Por exemplo, uma combinação de MEDI4736 e MEDI0680 pode ser usada para modular, em particular, para inibi a via PD-1.

[00141] No contexto da presente invenção, os moduladores de ponto de verificação imunológico podem ser qualquer tipo de molécula ou agente, desde que reduza, iniba, interfira, ative, estimule, aumente, reforce ou suporte total ou parcialmente a função de uma ou mais moléculas do ponto de verificação como descrito acima. Em particular, o modulador de ponto de verificação imunológico liga-se a uma ou mais moléculas do ponto de verificação, tais como, proteínas do ponto de verificação, ou aos seus

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 97/151

92/140 precursores, por exemplo, no nível de DNA ou RNA, modulando assim (por exemplo, reduzindo, inibindo, interferindo, ativando, estimulando, aumentando, reforçando ou suportando total ou parcialmente) a função de uma ou mais moléculas do ponto de verificação como descrito acima. Os moduladores de ponto de verificação imunológicos preferidos são oligonucleotideos, siRNA, shRNA, ribozimas, moléculas de RNA antissentido, imunotoxinas, inibidores de molécula pequena e anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos de bloqueio de molécula do ponto de verificação ou fragmentos de anticorpos, anticorpos antagonistas ou fragmentos de anticorpos ou anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpo).

[00142] De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um oligonucleotideo. Um tal oligonucleotideo é, de preferência, usado para diminuir a expressão da proteína, em particular para diminuir a expressão de uma proteína de ponto de verificação, tal como os receptores do ponto de verificação ou ligandos descritos acima. Os oligonucleotideos são moléculas de DNA ou RNA curtas, compreendendo tipicamente de 2 a 50 nucleotideos, de preferência de 3 a 40 nucleotideos, mais de preferência de 4 a 30 nucleotideos e ainda mais de preferência de 5 a 25 nucleotideos, tais como, por exemplo 4, 5, 6 7, 8, 9 ou 10 nucleotideos. Os oligonucleotideos são usualmente feitos no laboratório por síntese química em fase sólida. Os oligonucleotideos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, no entanto, no contexto da presente invenção, o oligonucleotideo é, de preferência, de cadeia simples. Mais de preferência, o oligonucleotideo modulador de ponto de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 98/151

93/140 verificação é um oligonucleotideo antissentido. Os oligonucleotideos antissentido são cadeias simples de DNA ou RNA que são complementares a uma sequência escolhida, em particular a uma sequência escolhida da sequência de DNA ou RNA (ou o fragmento do mesmo) de uma proteína de ponto de verificação. O RNA antissentido é tipicamente usado para prevenir a tradução de proteína de cadeias de RNA mensageiro, por exemplo, de mRNA para uma proteína de ponto de verificação, ligando-se ao mRNA. O DNA antissentido é tipicamente usado para ter como alvo um RNA especifico, complementar (codificante ou não codificante). Se a ligação ocorrer, tal híbrido de DNA/RNA pode ser degradado pela enzima RNase H. Além disso, os oligonucleotideos antissentido de morfolino podem ser usados para knockdowns de genes em vertebrados. Por exemplo, Kryczek et al., 2006 (Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, Zhu G, Wei S, Mottram P, et al. , B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J Exp Med. 2006; 203:871-81) projetou urn morfolino especifico para B7-H4 que especificamente bloqueou a expressão de B7H4 em macrófagos, resultando em proliferação de células T aumentada e volumes tumorais reduzidos em camundongos com células T especificas de antígeno associado a tumor (TAA).

[00143] De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é urn siRNA. RNA de interferência pequena (siRNA), às vezes conhecido como RNA de interferência pequena ou RNA de silenciamento, é uma classe de moléculas de RNA de cadeia dupla, que é tipicamente 2025 pares de bases de comprimento. Na via interferência por RNA (RNAi), o siRNA interfere na expressão de genes

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 99/151

94/140 específicos, tais como genes que codificam proteínas de ponto de verificação, com sequências nucleotídicas complementares. O siRNA funciona causando a quebra do mRNA após a transcrição, resultando em nenhuma tradução. A transfecção de siRNA exógeno pode ser usada para knockdown de genes, no entanto, o efeito pode ser apenas transiente, especialmente em células de divisão rápida. Isto pode ser superado, por exemplo, por modificação de RNA ou usando um vetor de expressão para o siRNA. A sequência de siRNA também pode ser modificada para introduzir um enovelamento curto entre as duas cadeias. O transcrito resultante é um RNA tipo grampo de cabelo curto (shRNA, também RNA tipo grampo de cabelo pequeno) , que pode ser processado em um siRNA funcional pela Dicer em sua maneira usual. O shRNA é um mediador vantajoso do RNAi, pois tem uma taxa relativamente baixa de degradação e decaimento. Por conseguinte, o modulador de ponto de verificação imunológico é de preferência um shRNA. shRNA tipicamente requer o uso de um vetor de expressão, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor viral ou bacteriano.

[00144] De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é uma imunotoxina. As imunotoxinas são proteínas químicas que contêm uma porção de direcionamento (tal como um anticorpo), que é tipicamente tem como alvo um antígeno em uma certa célula, tal como uma célula de câncer, ligada a uma toxina. No contexto da presente invenção, uma imunotoxina compreendendo uma porção de direcionamento, que tem como alvo uma molécula do ponto de verificação é preferida. Quando a imunotoxina se liga a uma célula portadora do antígeno, por exemplo, a molécula

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 100/151

95/140 do ponto de verificação, é absorvida pela endocitose, e a toxina pode então matar a célula. As imunotoxinas compreendem, de preferência, um anticorpo ou fragmento de anticorpo (modificado), ligado a (fragmento de) uma toxina. Para ligação, os métodos são bem conhecidos na técnica. A porção de direcionamento da imunotoxina compreende tipicamente uma porção Fab de um anticorpo que tem como alvo um tipo celular especifico. A toxina é usualmente citotóxica, tal como uma proteína derivada de uma proteína bacteriana ou de planta, da qual o dominio de ligação natural foi removido de modo que a porção de direcionamento da imunotoxina direcione a toxina para o antígeno na célula alvo. No entanto, as imunotoxinas podem também compreender uma porção de direcionamento diferente de um anticorpo ou fragmento de anticorpo, tal como um fator de crescimento. Por exemplo, proteínas de fusão recombinantes contendo uma toxina e um fator de crescimento são também referidas como imunotoxinas recombinantes.

[00145] De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um fármaco de molécula pequena (também referido como inibidor de molécula pequena). Um fármaco de molécula pequena é um composto orgânico de baixo peso molecular (até 900 daltons) que tipicamente interage com (a regulação de) um processo biológico. No contexto da presente invenção, um fármaco de molécula pequena que é um modulador de ponto de verificação imunológico, um composto orgânico tendo um peso molecular não maior que 900 daltons, que inibe, interfere com ou modula negativamente a função, total ou parcialmente uma ou mais moléculas do ponto de verificação como descrito acima. O limite de peso molecular

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 101/151

96/140 superior de 900 daltons permite a possibilidade de se difundir rapidamente através das membranas celulares e para biodisponibilidade oral. Mais de preferência, o peso molecular do fármaco de molécula pequena que é um modulador de ponto de verificação imunológico, não é maior que 500 daltons. Por exemplo, vários antagonistas A2AR conhecidos na técnica são compostos orgânicos tendo um peso molecular abaixo de 500 daltons.

[00146] Mais de preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Tais anticorpos moduladores de ponto de verificação imunológico ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos incluem, em particular, anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam a receptores do ponto de verificação imunológico ou anticorpos que se ligam a ligandos do receptor do ponto de verificação imunológico. De preferência, os anticorpos moduladores de ponto de verificação imunológico ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são agonistas ou antagonistas de receptores de ponto de verificação imunológico ou de ligandos do receptor do ponto de verificação. Exemplos de moduladores de ponto de verificação do tipo anticorpo incluem moduladores de ponto de verificação imunológico, que são atualmente aprovados como descrito acima, ou seja: Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb), Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb) e Keytruda® (Pembrolizumab; Merck) e adicionalmente anticorpos anti-receptor de ponto de verificação adicionais ou anticorpos anti-ligando de ponto de verificação como descrito acima.

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 102/151

97/140 [00147] De preferência, os moduladores de ponto de verificação imunológico na combinação usada de acordo com a presente invenção são anticorpos ou fragmentos de ligação a antigeno que podem bloquear parcial ou totalmente a via da PD-1 (por exemplo, podem ser antagonistas parciais ou totais da via PD-1, em particular PD-1, PD-L1 ou PD-L2, mais de preferência, o anticorpo pode bloquear parcial ou totalmente PD-1 (por exemplo, eles podem ser antagonistas parciais ou totais de PD-1). Esses anticorpos ou fragmentos de ligação a antigeno incluem anticorpos anti-PD-1, anticorpos anti-PD-1 humanos, anticorpos anti-PD-1 de camundongo, anticorpos anti-PD-1 de mamíferos, anticorpos anti-PD-1 humanizados, anticorpos anti-PD-1 monoclonais, anticorpos PD-1 policlonais, anticorpos anti-PD-1 quiméricos, anticorpos anti-PD-Ll, anticorpos anti-PD-L2, adnectinas anti-PD-1, anticorpos anti-domínio PD-1, fragmentos anti-PD-1 de cadeia simples, fragmentos anti-PD1 de cadeia pesada e fragmentos anti-PD-1 de cadeia leve. Por exemplo, o anticorpo anti-PD-1 pode ser um fragmento de ligação a antigeno. De preferência, o anticorpo anti-PD-1 capaz de se ligar a PD-1 humano e bloquear parcial ou totalmente a atividade de PD-1 (humano) (por exemplo, podem ser antagonistas parciais ou totais de PD-1), em particular, desse modo liberando a função de células imunológicas que expressam PD-1.

[00148] De preferência, os moduladores de ponto de verificação imunológico na combinação usada de acordo com a presente invenção são anticorpos ou fragmentos de ligação a antigeno que podem bloquear parcial ou totalmente a via

CTLA-4 (por exemplo, podem ser antagonistas parciais ou

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 103/151

98/140 totais da via CTLA-4). Estes anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno incluem anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-CTLA4 humanos, anticorpos anti-CTLA4 de camundongo, anticorpos anti-CTLA4 de mamífero, anticorpos anti-CTLA4 humanizados, anticorpos anti-CTLA4 monoclonais, anticorpos anti-CTLA4 policlonais, anticorpos anti-CTLA4 quiméricos, MDX-010 (ipilimumab), tremelimumab, anticorpos anti-CD28, adnectinas anti-CTLA4, anticorpos anti-dominio CTLA4, fragmentos anti-CTLA4 de cadeia simples, fragmentos anti-CTLA4 de cadeia pesada e fragmentos anti-CTLA4 de cadeia leve. Por exemplo, o anticorpo anti-CTLA4 pode ser um fragmento de ligação a antígeno. De preferência, o anticorpo anti-CTLA4 é capaz de se ligar a CTLA4 humano e bloquear parcial ou totalmente a atividade de CTLA4 (por exemplo, pode se antagonistas parciais ou totais de CTLA4) , desse modo em particular liberando a função de células imunológicas que expressam CTLA4.

Combinações preferidas de um modulador de ponto de verificação imunológico preferido e um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T preferido [00149] Como descrito acima, uma combinação preferida para uso de acordo com a presente invenção compreende um modulador de ponto de verificação imunológico preferido como aqui descrito. Além disso, uma combinação preferida para uso de acordo com a presente invenção compreende um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T preferido, ou um fragmento de ligação a antígeno, como aqui descrito compreendendo uma especificidade (preferida) contra um antígeno de superfície de células T, uma especificidade (preferida) contra um antígeno associado a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 104/151

99/140 câncer e/ou tumor e um sitio de ligação (preferido) para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano.

[00150] Uma combinação mais preferida para uso de acordo com a presente invenção compreende (i) um modulador de ponto de verificação imunológico preferido como descrito aqui e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T preferido, ou um fragmento de ligação a antigeno, como descrito aqui compreendendo uma especificidade (preferida) contra um antigeno de superfície de células T, uma especificidade (preferida) contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor e um sitio de ligação (preferido) para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano. Nas seguintes modalidades preferidas de uma combinação preferida para uso de acordo com a presente invenção são descritas.

[00151] Em uma combinação preferida para uso de acordo com a presente invenção, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T é um anticorpo do tipo IgG biespecifico trifuncional, em que

a) a especificidade contra um antigeno de superfície de células T é uma especificidade (sitio de ligação) para CD3 (humano);

b) a especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor é uma especificidade (sitio de ligação) para EpCAM, HER2/neu, GD2 ou CD20; e

c) o Sitio de ligação a FcyRl, FcyRlla e/ou FcyRlll humano é uma região Fc de IgG2a de camundongo/IgG2b de rato.

[00152] Mais de preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T é catumaxomab e/ou

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 105/151

100/140 ektomab.

[00153] É também preferido na combinação para uso de acordo com a presente invenção que o modulador de ponto de verificação imunológico seja um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2 e mais, de preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico seja um inibidor de CTLA-4 e/ou PD-1. Mais de preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4.

[00154] Por exemplo, uma combinação preferida para uso de acordo com a presente invenção compreende

- um anticorpo biespecifico tipo IgG trifuncional tendo

a) uma especificidade (sitio de ligação) para CD3 (humano);

b) uma especificidade (sitio de ligação) para EpCAM, HER2/neu, GD2 ou CD20; e

c) uma região Fc de IgG2a de camundongo/IgG2b de rato; e

- um inibidor de CTLA-4, PD-L1, PD-L2 e/ou PD-1, de preferência, um inibidor de CTLA-4 e/ou PD-1.

[00155] Mais de preferência, a combinação para uso de acordo com a presente invenção compreende (i) catumaxomab ou ektomab e (ii) um inibidor de CTLA-4.

Uso em tratamento terapêutico de uma doença cancerígena [00156] A combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, como aqui descrito, é para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena.

[00157] Tal combinação do modulador de ponto de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 106/151

101/140 verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como aqui descrito, é capaz de iniciar ou intensificar a eficácia de moduladores de ponto de verificação, em particular, em condições terapêuticas, como mostrado pelos presentes exemplos.

[00158] Como aqui usado, tratamento terapêutico

refere-se a	tratamento	após o início	de	uma doença. Em
particular,	tratamento	terapêutico	não	inclui medidas
preventivas	aplicadas antes do início	de	uma doença. Uma
vez que o	início de	uma doença	está	frequentemente

associado ao(s) sintoma(s) da doença, indivíduos humanos ou animais são frequentemente tratados terapeuticamente após o diagnóstico ou pelo menos uma (forte) suposição de que o indivíduo sofre de uma determinada doença. O tratamento terapêutico visa, em particular, (i) fazer progresso em, melhorar ou curar uma doença (estado) ou (ii) inibir ou retardar a progressão de uma doença (por exemplo, aumentando o tempo médio de sobrevida para pacientes com câncer) . Contudo, a prevenção do início de uma doença não pode ser tipicamente conseguida por tratamento terapêutico.

[00159] A combinação como aqui descrita é para uso (para a preparação de um medicamento) para o tratamento terapêutico de uma doença cancerígena. O termo doença, como usado no contexto da presente invenção, destina-se a ser geralmente sinônimo, e é usado indistintamente com os termos distúrbio e condição (como em condição médica), em que todos refletem uma condição anormal do corpo humano ou animal ou de uma das suas partes que prejudica o

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 107/151

102/140 funcionamento normal, é tipicamente manifestada pelos sinais e sintomas de distinção, e faz com que o humano ou animal tenha uma duração ou qualidade de vida reduzida.

[00160] As doenças cancerígenas são um grupo de doenças envolvendo crescimento celular anormal, em particular com o potencial para invadir ou espalhar-se para outras partes do corpo. Células cancerigenas/teciduais podem tipicamente mostrar as seis marcas de câncer, ou seja: (i) crescimento e divisão celular sem o sinal apropriado; (ii) crescimento e divisão contínuos, mesmo com sinais contrários; (iii) evitar a morte celular programada; (iv) número ilimitado de divisões celulares; (v) promover a construção de vasos sanguíneos; e (vi) invasão de tecido e formação de metástases.

[00161] As doenças cancerígenas incluem doenças causadas por apoptose deficiente. O câncer pode ser um tumor sólido, câncer no sangue ou câncer linfático. Em particular, o câncer pode ser benigno, maligno e/ou metastático.

[00162] De preferência, no tratamento terapêutico de doença cancerígena, a combinação para uso de acordo com a presente invenção inibe/atrasa o crescimento em curso/adicional de um tumor (ou de metástases) ou diminui o tamanho do tumor (ou o número de metástases) ou previne a recorrência do tumor e/ou das metástases.

[00163] Exemplos preferidos de doenças cancerígenas são, de preferência, selecionados de neurinoma acústico, carcinoma anal, astrocitoma, basalioma, sindrome de Behcet, câncer da bexiga, blastemas, câncer dos ossos, metástases cerebrais, tumores cerebrais, câncer cerebral

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 108/151

103/140 (glioblastomas), câncer da mama (carcinoma de mama), Linfoma de Burkitt, carcinóides, câncer cervical, carcinoma do cólon, câncer colorretal, carcinoma de corpo uterino, craniofaringonoma, sindrome de CUP, carcinoma endometrial, câncer de vesícula biliar, tumores genitais, incluindo cânceres do trato geniturinário, glioblastoma, gliomas, tumores de cabeça/pescoço, hepatomas, linfoma histocitico, sindromes de Hodgkin ou linfomas e linfomas não Hodgkin, tumor hipofisário, câncer intestinal, incluindo tumores do intestino delgado, e tumores gastrointestinais, sarcoma de Kaposi, câncer renal, carcinoma renal, câncer laringeo ou câncer de laringe, leucemia, incluindo leucemia mieloide aguda (LMA), eritroleucemia, leucemia linfoide aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC) e leucemia linfocitica crônica (CLL), tumor da pálpebra, câncer de fígado, metástases hepáticas, carcinomas pulmonares (= câncer de pulmão = carcinoma brônquico), carcinomas de pulmão de células pequenas e carcinomas de pulmão de células não pequenas, e adenocarcinoma de pulmão, linfomas, câncer linfático, melanomas malignos, carcinomas mamários (= câncer de mama), meduloblastomas, melanomas, meningiomas, Micose fungoide, doenças neoplásicas, neurinoma, câncer esofágico, carcinoma esofágico (câncer esofágico), oligodendroglioma, câncer de ovário (carcinoma ovariano), carcinoma ovariano, carcinoma pancreático (= câncer pancreático), câncer peniano, câncer do pênis, câncer da faringe, tumor hipofisário, plasmocitoma, câncer da próstata (= tumores da próstata), carcinoma retal, tumores retais, câncer renal, carcinomas renais, retinoblastoma, sarcomas, doença de Schneeberger, câncer de pele, por

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 109/151

104/140 exemplo, câncer de pele melanoma ou não melanoma, incluindo carcinomas de células basais e escamosas, bem como psoriase, pênfigo vulgar, tumores de tecidos moles, espinalioma, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de garganta, timoma, carcinoma de tireoide, câncer de lingua, câncer uretral, câncer uterino, câncer vaginal, vários tumores induzidos por virus, tais como, por exemplo, carcinomas induzidos por virus papiloma (por exemplo, carcinoma cervical = câncer cervical), adenocarcinomas, tumores induzidos por virus da herpes (por exemplo, linfoma de Burkitt, linfoma de células B induzido por EBV, carcinoma do colo do útero), tumores induzidos por heptatite B (carcinomas hepatocelulares) , linfomas induzidos por HTLV-Ί e HTLV-2, câncer vulvar, condições ou complicação de verrugas, etc.

[00164] Outros exemplos preferidos de cânceres a serem tratados com a combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento do mesmo, como aqui descrito incluem câncer do cérebro, câncer da próstata, câncer da mama, câncer do ovário, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer renal, melanoma, carcinoma intestinal, carcinoma de pulmão, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, leucemia mieloide crônica, carcinoma colorretal, carcinoma gástrico, carcinoma endometrial, leucemia mieloide, carcinoma de células escamosas do pulmão, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, tumor da bexiga, leucemia promielocitica, carcinoma de pulmão de células não pequenas, plasmocitoma e

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 110/151

105/140 sarcoma .

[00165] Mais de preferência, a doença cancerígena é selecionada de câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer da mama, melanoma, câncer da próstata, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, linfomas de não Hodgkin, tumor da bexiga, plasmocitoma e/ou sarcoma.

[00166] Em geral, uma combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento do mesmo, como aqui descrito, significa que a terapia com o modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito é combinada com a terapia com o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou o fragmento do mesmo, como aqui descrito. Em outras palavras, mesmo que se um componente (o modulador de ponto de verificação ou o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) não seja administrado, por exemplo, no mesmo dia do outro componente (o outro do modulador de ponto de verificação ou anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T), suas programações de tratamento são interligadas. Isto significa que uma combinação no contexto da presente invenção em particular não inclui o inicio de uma terapia com um componente (o modulador de ponto de verificação ou o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) após a terapia com o outro componente (o outro de modulador de ponto de verificação ou anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) está terminado. Em geral, uma programação de tratamento interligado do modulador de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 111/151

106/140 ponto de verificação e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T - e, portanto, uma combinação do modulador de ponto de verificação e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T - significa que:

(i) nem toda administração do modulador de ponto de verificação (e, portanto, a terapia completa de modulador de ponto de verificação) é completada por mais de uma semana (de preferência por mais de 3 dias, mais de preferência por mais de 2 dias, ainda mais de preferência por mais de um dia) antes de a primeira administração do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (e, portanto, a terapia completa com o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) iniciar; ou (ii) nem toda administração do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (e, portanto, a terapia completa com o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) é completada por mais de uma semana (de preferência por mais de 3 dias, mais de preferência por mais de 2 dias, ainda mais de preferência por mais do que um dia) antes da primeira administração do modulador de ponto de verificação (e, portanto, a terapia completa do modulador de ponto de verificação) ser iniciada.

[00167] Por exemplo, na combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como aqui descrito para uso de acordo com a presente invenção, um componente (o modulador de ponto de verificação ou o anticorpo multifuncional redirecionamento

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 112/151

107/140 de células T) pode ser administrado uma vez por semana e o outro componente (o outro de modulador de ponto de verificação ou de anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) pode ser administrado uma vez por mês. Para conseguir neste exemplo uma combinação no sentido da presente invenção, o componente administrado mensalmente deve ser administrado pelo menos uma vez na mesma semana, em que também é administrado o outro componente administrado semanalmente.

[00168] Como descrito acima, a administração do modulador de ponto de verificação imunológico e/ou do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode requerer múltiplas administrações sucessivas, por exemplo, múltiplas injeções. Assim, a administração pode ser repetida pelo menos duas vezes, por exemplo, uma vez como injeções primárias de imunização e, mais tarde, como injeções de reforço.

[00169] Em particular, o modulador de ponto de verificação imunológico e/ou o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção, pode ser administrado repetida ou continuamente. O modulador de ponto de verificação imunológico e/ou o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode ser administrado repetida ou continuamente durante um periodo de pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ou 12 meses; ou 2, 3, 4 ou 5 anos. Por exemplo, o modulador de ponto de verificação

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 113/151

108/140 imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode ser administrado duas vezes por dia, uma vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês ou a cada dois meses. Por exemplo, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode ser administrado duas vezes por dia, uma vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, uma vez por mês ou a cada dois meses.

[00170] Na combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como aqui descrito para uso de acordo com a presente invenção, o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são, de preferência, administrados aproximadamente ao mesmo tempo.

[00171] Aproximadamente ao mesmo tempo, como aqui usado, significa, em particular, administração simultânea ou que diretamente após administração do modulador de ponto de verificação imunológico, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T é administrado ou diretamente após a administração do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, o modulador de ponto de verificação é administrado. A pessoa qualificada entende que diretamente após inclui o tempo necessário para preparar a segunda administração - em particular o tempo necessário para expor e desinfectar a localização para a segunda administração, bem como a preparação apropriada do

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 114/151

109/140 dispositivo de administração (por exemplo, seringa, bomba etc.) . A administração simultânea também inclui se os períodos de administração do modulador de ponto de verificação e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T se sobrepuserem ou se, por exemplo, um componente (modulador de ponto de verificação ou anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) for administrado durante um longo período de tempo, tais comom 30 min, 1 h, 2 h ou mais, por exemplo, por infusão, e o outro componente (modulador de ponto de verificação ou anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) é administrado em algum momento durante um período tão longo. A administração do modulador de ponto de verificação imunológico e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T aproximadamente ao mesmo tempo é particularmente preferida se forem usadas diferentes vias de administração e/ou diferentes sítios de administração.

[00172] É também preferido na combinação do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como aqui descrito para uso de acordo com a presente invenção que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são administrados consecutivamente. Por exemplo, o modulador de ponto de verificação imunológico é, de preferência, administrado antes do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T. É também preferido que o modulador de ponto de verificação imunológico seja administrado após o anticorpo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 115/151

110/140 multifuncional de redirecionamento de células T.

[00173] Em administração consecutiva, o intervalo de tempo entre a administração do primeiro componente (o modulador de ponto de verificação do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) e a administração do segundo componente (o outro do modulador de ponto de verificação e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) é, de preferência, não mais do que uma semana, mais de preferência não mais do que 3 dias, ainda mais de preferência não mais de 2 dias, e mais de preferência não mais do que 24 h estão entre a administração do primeiro componente (o modulador de ponto de verificação ou o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) e administração do segundo componente (o outro do modulador de ponto de verificação e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T). É particularmente preferido que o modulador de ponto de verificação e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T sejam administrados no mesmo dia com o tempo entre a administração do primeiro componente (o modulador de ponto de verificação do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) e a administração do segundo componente (o outro do modulador de ponto de verificação e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) sendo, de preferência, não mais do que 6 horas, mais de preferência

não	mais que 3 horas, ainda mais de	preferência não mais
que	2 horas	e mais de preferência não	mais que 1 h.
	[00174]	De preferência, o modulador de ponto de
verificação	imunológico compreendido	pela combinação para

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 116/151

111/140 uso de acordo com a presente invenção e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz, como aqui usado, é a quantidade que é suficiente para o alívio dos sintomas da doença ou condição a ser tratada ou para inibir ou retardar a progressão da doença. Em outras palavras, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou do modulador de pontos de verificação que é suficiente para induzir de modo significativo uma modificação positiva de uma doença ou um distúrbio, isto é, uma quantidade do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou do modulador de ponto de verificação, que provoca a resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal ou humano que está sendo procurado. O termo também inclui a quantidade do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou do modulador de ponto de verificação imunológico suficiente para reduzir a progressão da doença, ou seja, para reduzir ou inibir o crescimento do tumor e, desse modo, induzir a resposta (imune) a ser procurada (ou seja, uma quantidade efetiva de inibição). Ao mesmo tempo, contudo, uma quantidade eficaz terapêutica é, de preferência, suficientemente pequena para evitar efeitos colaterais graves, isto é, para permitir uma relação sensata entre vantagem e risco. A determinação desses limites tipicamente está dentro do escopo do julgamento médico sensato. Uma quantidade

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 117/151

112/140 terapeuticamente eficaz do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou do modulador de ponto de verificação, além disso, variará em conexão com a condição de câncer particular a ser tratada e também com a idade e condição fisica do paciente a ser tratado, o peso corporal, estado geral de saúde, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, a atividade dos componentes específicos (modulador de ponto de verificação e anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T), a gravidade da condição, a duração do tratamento, a natureza da terapia de acompanhamento, do carreador farmaceuticamente aceitável particular usado, e fatores semelhantes, dentro do conhecimento e da experiência do médico acompanhante.

[00175] A dose administrada, como doses únicas ou múltiplas, a um individuo irá assim variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo propriedades farmacocinéticas, condições e características do individuo (sexo, idade, peso corporal, saúde, tamanho), extensão dos

sintomas, tratamentos, frequência	de tratamento	e o efeito
desejado.
[00176] De preferência, para	tratamento de	câncer, a
dose única terapeuticamente	eficaz do	anticorpo

multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção é de cerca de 0,001 mg a 10 mg, de preferência de cerca de 0,01 mg a 5 mg, mais de preferência de cerca de 0,1 mg a 2 mg por injeção ou de cerca de 1 nmol a 1 mmol por injeção, em particular de 10 nmol a 100 qmol por injeção, de preferência de 0,1 qmol a 10 qmol por

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 118/151

113/140 injeção. É também preferido que a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendida pela combinação para uso de acordo com a presente invenção seja (por kg de peso corporal) , em particular, para tratamento de câncer, de cerca de 0,01 gg/kg a 100 gg/kg, de preferência de cerca de 0,1 gg/kg a 50 gg/kg, mais de preferência de cerca de 1 gg/kg a 25 gg/kg, ainda mais de preferência de cerca de 2 gg/kg a 20 gg/kg e mais de preferência de cerca de 2,5 gg/kg a 5 gg/kg.

[00177] De preferência, a dose terapeuticamente eficaz do modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção é (por kg de peso corporal) , em particular para tratamento de câncer, de cerca de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg, de preferência de cerca de 0,05 mg/kg a 50 mg/kg, mais de preferência de cerca de 0,1 mg/kg a 25 mg/kg, ainda mais de preferência de cerca de 0,5 mg/kg a 15 mg/kg e mais de preferência de cerca de 1 mg/kg a 10 mg/kg.

[00178] O anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode ser administrado por várias vias de administração, por exemplo, sistemicamente ou localmente. As vias para administração sistêmica em geral incluem, por exemplo, vias transdérmicas, orais e parentéricas, que incluem vias subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intraarteriais, intradérmicas e intraperitoneais e/ou vias de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 119/151

114/140 administração intranasais. As vias para administração local em geral incluem, por exemplo, vias de administração tópicas, mas também administração direta no sitio da aflição, tal como administração intratumoral.

[00179] De preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são administrados por uma via administração parentérica. Mais de preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são administrados por via intravenosa, intratumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intranasal ou intranodal. Ainda mais de preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são administrados por via intravenosa e/ou subcutânea.

[00180] De preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e pelo modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são administrados pela mesma via administração, de preferência

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 120/151

115/140 através da mesma via de administração parentérica, mais de preferência por via intravenosa ou subcutânea.

[00181] No entanto, é também preferível que o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção sejam administrados através de vias distintas de administração, de preferência através de vias parentéricas distintas de administração, mais de preferência o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção é administrado intravenosamente e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção é administrado através de via intratumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intranodal, de preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção é administrado subcutaneamente.

[00182] O anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção pode ser provido na mesma ou em composições distintas.

[00183] De preferência, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção e o modulador de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 121/151

116/140 ponto de verificação imunológico compreendido pela combinação para uso de acordo com a presente invenção são providos em composições distintas. Desse modo, outros componentes diferentes, por exemplo, veículos diferentes, podem ser usados para o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e para o modulador de ponto de verificação. Além disso, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e o modulador de ponto de verificação imunológico podem ser administrados através de diferentes vias de administração e as doses (em particular a relação das doses) podem ser ajustadas de acordo com a necessidade real.

[00184] No entanto, também é preferido que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T sejam providos na mesma composição. Uma tal composição compreendendo ambos, o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T é descrita em mais detalhes abaixo (composição de acordo com a presente invenção).

[00185] Não importa se uma composição compreende apenas o modulador de ponto de verificação imunológico (e não o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T), somente o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (e não o modulador de ponto de verificação) ou ambos, tal composição pode ser uma composição farmacêutica.

[00186] Em particular, uma tal composição, que compreende apenas o modulador de ponto de verificação imunológico (e não o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T) , apenas o anticorpo

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 122/151

117/140 multifuncional de redirecionamento de células T (e não o modulador de ponto de verificação) ou ambos, de preferência, é composição (farmacêutica) que compreende opcionalmente um carreador e/ou carreador farmaceuticamente aceitável, ou qualquer excipiente, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecidos dos qualificados na técnica.

[00187] No contexto da presente invenção, um carreador farmaceuticamente aceitável inclui tipicamente a base liquida ou não liquida da composição farmacêutica. O termo compatível, como aqui usado, significa que estes constituintes da composição farmacêutica são capazes de serem misturados com o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido acima, de modo a não ocorrer interação que reduza substancialmente a eficácia farmacêutica da composição farmacêutica sob condições típicas de uso. Os carreadores e veículos farmaceuticamente aceitáveis devem, evidentemente, ter pureza suficientemente alta e toxicidade suficientemente baixa para os tornar adequados para administração a um indivíduo a ser tratado.

[00188] De preferência, a composição farmacêutica está na forma de um pó liofilizado ou na forma de uma composição liquida, de preferência, uma solução aquosa. Assim, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser provida como um pó seco liofilizado ou, mais de preferência em solução (dissolvido em um veiculo) . Se provido como um pó liofilizado pelo fabricante, é usualmente dissolvido em uma solução apropriada (solução aquosa; tal como água para injeção ou solução salina, opcionalmente tamponada tal como PBS) pouco antes da administração. Frascos de medicação

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 123/151

118/140 liquida podem ser de uso único ou multiuso.

[00189] Em outra modalidade preferida, o modulador de ponto de verificação, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou a composição farmacêutica (compreendendo um ou ambos os mesmos) não é(são) liofilizado(s). Assim, prefere-se que o modulador de ponto de verificação, o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e/ou a composição farmacêutica (compreendendo um ou ambos do(a)(s) mesmo(a)(s)) não seja(m)) liofilizado(a)(s), mas provido em uma solução, de preferência em uma solução aquosa, mais de preferência em uma solução aquosa tamponada.

[00190] É assim particularmente preferido que a composição farmacêutica seja provida na forma liquida. Assim, o carreador farmaceuticamente aceitável compreenderá tipicamente um ou mais carreadores líquidos farmaceuticamente aceitáveis (compatíveis). Exemplos de carreadores líquidos farmaceuticamente aceitáveis (compatíveis) incluem água isenta de pirogênio, solução salina istônica ou soluções tamponadas (aquosas), por exemplo, soluções tamponadas de citrato; polióis, tais como, por exemplo, polipropilenoglicol, glicerol, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ácido alginico, polimeros inorgânicos ou orgânicos adicionais, tais como, PLGA, de preferência, para prover um efeito de liberação sustentada ao presente agente ativo. De preferência, em uma composição farmacêutica liquida, o carreador pode ser água isenta de pirogênio; solução salina isotônica ou soluções tamponadas (aquosas), por exemplo, soluções tamponadas de fosfato, citrato etc. Particularmente para injeção ou instilação da

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 124/151

119/140 composição farmacêutica, água ou, de preferência, um tampão, mais de preferência um tampão aquoso, tal como tampão de citrato, pode ser usada(o).

[00191] Por conseguinte, é preferido que a composição farmacêutica compreenda um tampão, de preferência, um tampão de ácido orgânico (isto é, um tampão baseado em um ácido orgânico), tal como tampão de citrato, tampão de succinato e tampão de tartarato, mais de preferência a composição farmacêutica compreende um tampão de citrato. O tampão de ácido orgânico é assim, de preferência, selecionado do grupo consistindo em tampão de citrato, tampão de succinato, tampão de tartarato e tampão de fosfato-citrato, mais de preferência, selecionado do grupo consistindo em tampão de citrato, tampão de succinato e tartarato. É particularmente preferido que o tampão seja um tampão de citrato. Em geral, um tampão pode (também) conter um sal de sódio, de preferência pelo menos 30 mM de sal de sódio, sal de cálcio, de preferência pelo menos 0,05 mM de sal de cálcio e/ou opcionalmente sal de potássio, de preferência pelo menos 1 mM de um sal de potássio. Os sais de sódio, cálcio e/ou potássio podem ocorrer na forma dos seus halogenetos, por exemplo, cloretos, iodetos, ou brometos, na forma dos seus hidróxidos, carbonates, hidrogenocarbonatos ou sulfatos, etc. Sem se limitar a estes, exemplos de sais de sódio incluem, por exemplo, NaCl, NaI, NaBr, Na2COs, NaHCOs, Na2SÜ4, exemplos dos sais opcionais de potássio incluem, por exemplo, KC1, Kl, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4, e exemplos de sais de cálcio incluem, por exemplo, CaCÍ2, Cal2, CaBr2, CaCCC, CaSCh, Ca (OH) 2. Além disso, ânions orgânicos dos cátions acima mencionados podem

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 125/151

120/140 estar contidos no tampão.

[00192] A composição farmacêutica pode também compreender solução salina (NaCl a 0,9%), solução de Ringer-Lactato ou PBS (solução salina tamponada com fosfato). Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser provida como solução de carga do anticorpo, ou do fragmento de ligação a antigeno do mesmo, em um tampão apropriado, tal como um tampão de ácido orgânico como descrito acima, de preferência, tampão de citrato e apenas imediatamente antes da administração da solução de carga pode ser diluído em solução salina (NaCl a 0,9%), solução de Ringer-Lactato ou PBS para atingir a concentração de anticorpo a ser administrada.

[00193] Além disso, podem ser usados um ou mais compostos sólidos compatíveis ou enchedores líguidos ou diluentes ou encapsulantes bem como a composição farmacêutica, gue são adeguados para administração a um indivíduo a ser tratado. Outros exemplos de compostos gue podem ser compreendidos pela composição farmacêutica incluem açúcares, tais como, por exemplo, lactose, glucose e sacarose; amidos, tais como, por exemplo, amido de milho ou amido de batata; celulose e seus derivados, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose, acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; sebo; agente de deslizamento sólidos, tais como, por exemplo, ácido esteárico, estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, tais como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo a partir de teobroma; polióis, tais como, por exemplo, polipropilenoglicol, glicerol,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 126/151

121/140 sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ácido alginico. Além disso, conservantes, estabilizantes, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, como necessário. A composição farmacêutica pode, assim, também compreender agentes estabilizantes, tais como, Tween 80® ou Tween 20®. Opcionalmente, excipientes que conferem propriedades de liberação sustentada ao anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como aqui descrito, pode também ser compreendido pela composição farmacêutica.

[00194] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica não compreende outros componentes além (i) do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou do fragmento de ligação a antígeno, como aqui descrito ou do modulador de ponto de verificação imunológico como aqui descrito; (ii) um tampão como aqui descrito; e, opcionalmente, (iii) água para injeção, solução salina e/ou PBS .

[00195] As composições, em particular, composições farmacêuticas, como aqui descritas, podem ser adaptadas para ministração por administração repetida.

[00196] Materiais adicionais, bem como técnicas de processamento de formulação e semelhantes, que são úteis no contexto de composições, em particular composições farmacêuticas, ou no contexto da sua preparação, são apresentados na Part 5 of Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 22^a Edição, 2012, University of the Sciences na Filadélfia, Lippincott Williams & Wilkins.

[00197] 0 individuo a ser tratado é, de preferência, um animal humano ou não humano, em particular, um mamífero ou um humano. Mais de preferência, o individuo a ser tratado

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 127/151

122/140 é, de preferência um humano. De preferência, os indivíduos são pacientes diagnosticados com câncer. Por exemplo, pacientes jovens (menos de 15 anos de idade) ou idosos (com mais de 60 anos de idade) podem ser tratados de acordo com a presente invenção. Para pacientes idosos, é particularmente vantajoso administrar o fármaco por uma via que requer um médico, pois assim a adesão é assegurada. Ao mesmo tempo, a administração deve ser, de preferência, livre de dor.

[00198] Em geral, os pacientes tendo uma doença cancerígena, independentemente da sua idade, que de preferência não está sob tratamento imunossupressor, podem beneficiar particularmente do uso da combinação do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T e do inibidor do ponto de verificação imunológico de acordo com a invenção.

Kit para uso de acordo com a presente invenção [00199] Em um aspecto adicional, a presente invenção também provê um kit, em particular um kit de partes, compreendendo (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (isolado) ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 128/151

123/140 antígeno do mesmo se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano;

para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena, em particular em um indivíduo humano.

[00200] Em particular, tal kit para uso de acordo com a presente invenção compreende (i) o modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) e (ii) o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) . Além disso, tal kit é para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima, em particular em um indivíduo humano como descrito acima. Em outras palavras, as modalidades preferidas do modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas no kit de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, modalidades preferidas do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas no kit de acordo com a presente invenção. Além disso, modalidades preferidas do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são

também preferi	das para	o kit de acordo	com	a presente
invenção.
[00201] Os	vários	componentes do	kit	podem ser
acondicionados	em um ou	mais recipientes	. Os	componentes

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 129/151

124/140 acima podem ser providos em uma forma liofilizada ou seca ou dissolvida em um tampão adequado. Por exemplo, o kit pode compreender uma composição (farmacêutica) que compreende o modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima e uma composição (farmacêutica) compreendendo o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima, por exemplo, com cada composição em um recipiente separado. O kit pode também compreender uma composição (farmacêutica) compreendendo ambos, o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, como descrito acima.

[00202] O kit também pode compreender reagentes adicionais incluindo, por exemplo, tampões para armazenamento e/ou reconstituição dos componentes acima referenciados, soluções de lavagem e semelhantes.

[00203] Além disso, o kit de partes de acordo com a presente invenção pode opcionalmente conter instruções de uso. De preferência, o kit compreende ainda um folheto informativo ou uma bula com instruções para tratar uma doença cancerígena, como aqui descrito, usando uma combinação do modulador de ponto de verificação imunológico e do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T. Composição para uso de acordo com a presente invenção [00204] Em um aspecto adicional, a presente invenção também provê uma composição compreendendo (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (isolado) ou um fragmento de ligação a antigeno

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 130/151

125/140 do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um Sítio de ligação a FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRlla e/ou FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano.

[00205] Em particular, uma tal composição de acordo com a presente invenção compreende (i) o modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) e (ii) o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) . Em outras palavras, as modalidades preferidas do modulador de ponto de verificação descritos acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidos na composição de acordo com a presente invenção. Consequentemente, modalidades preferidas do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas na composição de acordo com a presente invenção.

[00206] Além disso, uma composição compreendendo o modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima e modalidades preferidas de tal composição são descritas acima (no contexto da

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 131/151

126/140 combinação para uso de acordo com a presente invenção). Entende-se que a mesma descrição, em particular, as mesmas modalidades preferidas como descritas acima para a composição, aplica-se de acordo com a composição como aqui descrito.

[00207] De preferência, a composição para uso em medicina, mais de preferência, a composição é para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena, em particular em um indivíduo humano. Por conseguinte, uma tal composição é para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima, em particular em um indivíduo humano como descrito acima. Em outras palavras, as modalidades preferidas do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas para a composição de acordo com a presente invenção.

[00208] Por conseguinte, a composição compreende, de preferência, um carreador farmaceuticamente aceitável. Exemplos preferidos de tal carreador farmaceuticamente aceitável são como descritos acima.

[00209] É também preferido que a composição (farmacêutica) seja usada em um método para tratar um indivíduo, de preferência, um indivíduo humano, que está sofrendo de uma doença cancerígena.

Método e terapia combinada de acordo com a presente invenção [00210] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para o tratamento terapêutico do câncer ou iniciação, intensificação ou prolongamento de uma resposta

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 132/151

127/140 antitumoral em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (isolado) ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um Sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano.

[00211] Em particular, tal método de acordo com a presente invenção compreende a administração (i) do modulador de ponto de verificação imunológico como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) e (ii) do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) . Além disso, tal método é útil no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima, em particular em um indivíduo humano como descrito acima. Em outras palavras, as modalidades preferidas do modulador de ponto de verificação imunológico, como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção), são também preferidas no método de acordo com a presente invenção. Por conseguinte, modalidades preferidas do anticorpo multifuncional de

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 133/151

128/140 redirecionamento de células T como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas no método de acordo com a presente invenção. Além disso, modalidades preferidas do uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerígena como descrito acima (no contexto da combinação para uso de acordo com a presente invenção) são também preferidas para o método de acordo com a presente invenção.

[00212] De preferência, o indivíduo é um indivíduo humano diagnosticado com câncer.

[00213] Em um aspecto adicional, a presente invenção também provê uma terapia combinada para tratamento terapêutico de câncer, em que a terapia combinada compreende a administração de (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T (isolado), ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, liga-se com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano.

[00214] Modalidades preferidas de tal terapia combinada são modalidades preferidas do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T como descrito acima, modalidades do modulador de pontos de verificação como

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 134/151

129/140 descrito acima e/ou - em geral - modalidades preferidas da combinação para uso de acordo com a presente invenção. O kit de acordo com a presente invenção e a composição (farmacêutica) de acordo com a presente invenção podem ser usados no método e/ou na terapia combinada de acordo com a presente invenção.

[00215] Os indivíduos a serem tratados com tal terapia combinada são os mesmos descritos para a combinação para uso de acordo com a presente invenção. De preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo são administrados a um indivíduo humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00216] A seguir, uma breve descrição das figuras anexas será provida. As figuras pretendem ilustrar a presente invenção em mais detalhes. Contudo, não se destinam a limitar o objeto da invenção de qualquer forma.

[00217] A Figura 1 mostra esquematicamente os mecanismos assumidos subjacentes a uma combinação terapêutica de anticorpos trifuncionais de redirecionamento de células T compreendendo uma especificidade contra um antígeno associado a tumores (TAA) e uma especificidade contra uma célula T (por exemplo, CD3) e anticorpos de bloqueio de moléculas do ponto de verificação. As células T são ativadas e redirecionadas para as células tumorais alvejadas por anticorpos trifuncionais. Consequentemente, as células tumorais são eliminadas por mecanismos citotóxicos mediados por células T como indução de apoptose ou lise celular mediada por perforina. A regulação positiva

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 135/151

130/140 de moléculas de pontos de verificação imunológicos inibitórias como CTLA-4 e PD-1 em células T citotóxicas (1) tem um impacto negativo sobre a atividade antitumoral mediada por células T. O bloqueio das moléculas inibitórias do ponto de verificação imunológico por anticorpos de bloqueio de moléculas do ponto de verificação previne a regulação negativa de células T e promove a ativação sustentada de células T. Por conseguinte, a destruição de células tumorais é intensificada (2).

[00218] A Figura 2 mostra, para o Exemplo 2, a indução da expressão de CTLA-4 em células T ativadas com anticorpos trifuncionais. Células T enriquecidas de células de baço de camundongo foram incubadas (i) com lgg/ml de anticorpo trifuncional Surek, células dendríticas imaturas (5%), células tumorais B78-D14 irradiadas (2,5%; painel superior), ou (ii) com 1 gg/ml de BiLu, células dendríticas imaturas (5%) e células tumorais B16-EpCAM irradiadas (2,5%; painel inferior) in vitro a 37°C durante 3 dias. Para controles, nenhum anticorpo trifuncional foi adicionado. Todos os dias, a expressão da superfície celular de CTLA-4 e CD69 foi medida por análise de FACS,

discriminando	entre células T CD4+ e CD8+.	Um sumário	de
três experimentos independentes é mostrado, indicam desvio padrão.	Barras de erro
[00219] A	Figura 3 mostra, para o	Exemplo 3,	os
resultados da	terapia combinada curativa	no modelo	de

melanoma B78-D14. A monoterapia com HB304 não teve efeito terapêutico (A): Camundongos (n = 5) foram intraperitoneais (i.p.) desafiados com 5 x 10⁵ células tumorais vitais B78D14 e receberam 100gg do anticorpo HB304 (i.p.) nos dias 2

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 136/151

131/140 e 5 após inoculação de células tumorais (grupo B) ou foram tratados com controle de veiculo PBS (grupo A) . Não houve diferença na sobrevida total, todos os camundongos morreram (p = 0,4). A adição de HB304 a Surek aumenta a sua eficácia terapêutica (B): Os camundongos (n = 10) foram i.p. provocaram com 1 x 10⁵ células tumorais vitais B78-D14 e receberam 50 gg de Surek apenas (grupo A) ou 50 gg de Surek + 100 gg de HB304 (grupo B) nos dias 2 + 5. Os camundongos de controle não receberam anticorpo (grupo C). A sobrevida total de monoterapia com Surek foi aumentada de 60% para 90% quando combinada com anticorpos HB304 (p = 0,08; logrank).

[00220] A Figura 4 mostra, para o Exemplo 4, os resultados da terapia combinada curativa no modelo de melanoma B16-EpCAM. Os camundongos (n = 10) foram intravenosamente (iv) desafiados com 1 x 10⁵ células tumorais B16-EpCAM vitais e tratados com 10 gg do anticorpo trifuncional BiLu nos dias 2+5 (grupo B), ou com 100 gg de anticorpo de bloqueio de CTLA-4 HB304 nos dias 9, 12, 19, 26, 33, 40 (grupo D), ou os camundongos receberam um tratamento combinado apropriado de BiLu + HB304 (grupo C). Os camundongos de controle não receberam tratamento com anticorpo (grupo A).

EXEMPLOS [00221] A seguir, são apresentados exemplos particulares que ilustram várias modalidades e aspectos da invenção. Contudo, a presente invenção não deve ser limitada no seu escopo pelas modalidades especificas aqui descritas. A(o)s seguintes preparações e exemplos são dada(o)s para permitir que os qualificados na técnica

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 137/151

132/140 entendam mais claramente e pratiquem a presente invenção. A presente invenção, no entanto, não está limitada no seu escopo pelas modalidades exemplificadas, que se destinam apenas como ilustrações de aspectos únicos da invenção, e os métodos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção além das aqui descritas tornar-se-ão prontamente evidentes para os qualificados na técnica a partir da descrição anterior, figuras anexas e os exemplos abaixo. Todas essas modificações estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Exemplo 1: Geração de anticorpos trifuncionais [00222] Os anticorpos trifuncionais (TrAbs) foram produzidos pela tecnologia quadroma como descrito (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a long-lasting antitumor immunity by a tri functional bispecific antibody. Blood. 2001; 98: 2526-2534; Ruf P, Schafer B, EiBler N, Mocikat R, Hess J, Ploscher M, Wosch S, Suckstorff I, Zehetmeier C, Lindhofer H. Ganglioside GD2-specific tri functional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine. 2012; 10: 219) . Os sobrenadantes derivados de quadroma foram purificados por cromatografia de proteína A, aplicando a eluição sequencial do pH seguido de uma etapa de purificação por cromatografia de troca catiônica. Surek (EiPler N, Ruf P, Mysliwietz J, Lindhofer H, Mocikat, R. Trifunctional Bispecific antibodies induce tumor-specific T cells and elicit a vaccination effect. Cancer research. 2012; 72: 3958-3966; Ruf P, Schafer B, EiPier N, Mocikat R, Hess J, Ploscher M, Wosch S, Suckstorff I, Zehetmeier C,

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 138/151

133/140

Lindhofer H. Ganglioside GD2-specific tri functional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine. 2012; 10: 219; EiPler N, Mysliwietz J, Deppisch

N, Ruf P, Lindhofer H, Mocikat R. Potential of the tri functional bispecific antibody surek depends on dendritic cells: rationale for a new approach of tumor immunotherapy Molecular medicine. 2013; 19: 54-61; Deppisch N, Ruf P, Eipier N, Neff F, Buhmann R, Lindhofer H, Mocikat R. Efficacy and tolerability of a GD2-directed tri functional bispecific antibody in a preclinical model: Subcutaneous administration is superior to intravenous delivery. Molecular cancer therapeutics. 2015; 14: 18771883) é um trAb que foi gerado pela fusão dos hibridomas parentais 17A2 (CD3 anti-camundongo, IgG2b de rato) e Me361 (anti-GD2, IGg2 de camundongo) (Ruf P, Jãger M, Eilwart J, Wosch S, Kusterer E, Lindhofer H. Two new tri functional antibodies for the therapy of human malignant melanoma. International journal of cancer. 2004; 108: 725-732). BiLu (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a long-lasting antitumor immunity by a tri functional bispecific antibody. Blood. 2001; 98: 2526-2534) compreende a mesma especificidade anti-CD3 e inclui adicionalmente um braço de ligação de IGg2 de camundongo reconhecendo EpCAM humano, que foi derivado do C215 de clone. Para produção de HB304 (CTLA-4 anti-camundongo), o clone de hibridoma de hamster UC104F10-11 (Walunas TL, Lenschow DJ, Bakker CY, Linsley PS, Freeman GJ, Green JM, Thompson CB, Bluestone JA. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity. 1994; 1: 405-413) foi usado. Linhas celulares

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 139/151

134/140 foram cultivadas em meio isento de proteína quimicamente definido. Todos os anticorpos foram fabricados por Trion Research GmbH.

Exemplo 2: CTLA-4 é regulado positivamente após ativação de células T induzidas por trAb.

[00223] Investigar se a molécula do ponto de verificação imunológico CTLA-4 é regulada positivamente na superfície de células T ativadas por anticorpos trifuncionais direcionados por tumor, células T enriquecidas de células de baço de camundongo foram incubadas com os anticorpos trifuncionais (Surek ou BiLu, cf. Exemplo 1; 1 qg/ml) , as suas células alvo tumorais incompetentes (irradiadas) de proliferação correspondentes B78-D14 (2,5%; para Surek) ou B16-EpCAM (2,5%; para BiLu) e células dendriticas imaturas (5%) in vitro a 37° por 3 dias. Resumidamente, B78-D14 (Haraguchi M, Yamashiro S, Yamamoto A, Furukawa K, Takamiya K, Lloyd KO, Shiku H, Furukawa K. Isolation of GD3 synthase gene by expression cloning of GM3 alpha-2, 8-sialyltransferase cDNA using antiGD2 monoclonal antibody. Anais da academia nacional de ciências dos Estados Unidos da América. 194; 91: 1045510459) e células B16-EpCAM (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a long-lasting antitumor immunity by a tri functional bispecific antibody. Blood. 2001; 98: 2526-2534) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 8,9% e 5%, respectivamente, soro fetal de vitelo, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1 mM e 1 x de aminoácidos não essenciais. Além disso, 400 qg/ml de G418 e 500 qg/ml de Higromicina B foram adicionados a B78-D14. As células foram extensivamente lavadas em PBS antes da aplicação. A

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 140/151

135/140 identidade das linhas celulares foi regularmente confirmada com base na morfologia celular e na expressão dos transgenes. As DCs imaturas foram preparadas pela cultura de precursores de medula óssea de camundongos C57BL/6 em RPMI 1640 suplementado com FCS a 20%, 2mM de L-glutamina, 100U/ml de penicilina e estreptomicina, 50μΜ de 2mercaptoetanol, piruvato de sódio e aminoácidos não essenciais na presença de 100 ng/ml de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF). O meio foi substituído a cada segundo dia, as células foram congeladas a -140°C no dia 7. As DCs congeladas foram descongeladas, contadas e aplicadas diretamente aos ensaios de estimulação das células T. 4xl0⁶ células T, que foram isoladas de baços de camundongos C57BL/6 nãive por método de aderência de linfócitos B com anticorpos anti-IgG + M (Dianova, Hamburgo, Alemanha), foram co-cultivadas com 2xl0⁵ de DCs e 10⁵ células tumorais irradiadas (lOOGy) em placas de 24 poços por três dias. TrAbs foram adicionados a 1 μρ/πιΐ. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de vitelo a 10%, L-Glutamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1 mM, Ix de aminoácidos não essenciais, HEPES a 10 mM e 2-mercaptoetanol a 50 μΜ.

[00224] Para controles, nenhum anticorpo trifuncional foi adicionado. Nos momentos Oh, 24h, 48h e 72h, a expressão da superfície celular de CTLA-4 foi medida por análise de FACS, discriminando entre células T CD4+ e CD8+ usando o anticorpo HB304. Ou seja, as análises de células T foram realizadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando um citômetro de fluxo Calibur FACS e o programa de análise de pesquisa celular (BD

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 141/151

136/140

Bioscience, Heidelberg, Alemanha). Marcadores de superfície de células T foram corados diretamente com mAbs rotulados com fluorescência contra CD4 (clone RM4-5; BD Biosciences) e CD8 (53-6,7, eBioscience, San Diego, EUA). A expressão da superfície celular de CTLA-4 foi medida usando anticorpo HB304 rotulado com fluorescência. A porcentagem de células positivas foi determinada em comparação com os controles de isotipos correspondentes. Adicionalmente, o estado de ativação das células T foi avaliado medindo o marcador de ativação de células T CD69 (nos momentos Oh, 24h, 48h e 72h por análise de FACS como descrito acima, em que o CD69 marcador de superfície de células T foi diretamente corado com mAb rotulado com fluorescência (H1.2F3; BD Bioscience). Os resultados são mostrados na Figura 2. Ambos os anticorpos trifuncionais induziram uma forte ativação de células T CD4+ bem como CD8+ que foi seguido pela regulação positiva de CTLA-4. Em comparação com o CD69, que já atingiu o pico após 24 horas, a expressão de CTLA-4 foi atrasada em 1-2 dias e atingiu o pico em 48-72 horas. Não foi observada expressão de CTLA-4 em células T não ativadas. Em resumo, estes resultados demonstram claramente que a ativação de células T por anticorpos trifuncionais é seguida pela regulação positiva de CTLA-4.

Exemplo 3: A morte direta do tumor é melhorada por combinação do tratamento com trAb e anti-CTLA-4 [00225] Avaliar o potencial terapêutico/curativo de uma terapia combinada de anticorpos de redirecionamento de células T trifuncionais e anticorpos de bloqueio de moléculas do ponto de verificação inibitória, o bem estabelecido modelo de melanoma de camundongo GD2+ B78-D14

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 142/151

137/140 (Ruf P, Schafer B, EiPlerN, Mocikat R, Hess J, Plõscher M, Wosch S, Suckstorff I, Zehetmeier C, Lindhofer H. Ganglioside GD2-specific tri functional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine. 2012; 10:219) foi usado em um ambiente terapêutico/curativo. Este modelo de tumor (melanoma B78-D14 derivado de B16F0) foi modificado para expressar o GD2. Este gangliosidio é urn antigeno promissor para o direcionamento de câncer de pulmão de células pequenas e malignidades de origem neuroectodérmica, tais como, neuroblastoma, glioma, sarcoma ou melanoma em humanos .

[00226] 0 trAb Surek, que é especifico para GD2 e CD3 de camundongo (Ruf P, Schãfer B, EiPler N, Mocikat R, Hess J, Plõscher M, Wosch S, Suckstorff I, Zehetmeier C, Lindhofer H. Ganglioside GD2-specific tri functional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine. 2012; 10: 219), serviu como GD2 de reticulação de trAb substituto com o receptor CD3 em células T de murino.

[00227] Como um exemplo de anticorpos de bloqueio de inibidores de ponto de verificação, o anticorpo substituto de Ipilimumab HB304 (clone UC10-4F10-11; Walunas TL, Lenschow DJ, Bakker GY, Linsley PS, Freeman GJ, Green JM, Thompson CB, Bluestone JA. CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity, 1994, 1: 405-413), que é direcionado contra CTLA-4 de camundongo.

[00228] Camundongos C57BL/6 foram adquiridos da laconic (Ry, Dinamarca). Os experimentos em animais foram realizados pelo menos duas vezes com 5 animais fêmeas

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 143/151

138/140 incluídas em cada grupo. Para testar a rejeição de tumor induzida por trAb, os camundongos receberam um desafio de 1 x 10⁵ células de tumor vital B78-D14 e foram tratados nos dias 2 e 5 com 50 qg de Surek. 100 qg de HB304 foram administrados simultaneamente com Surek nos dias 2 e 5. Todas as células e todos os anticorpos foram administrados

i.p. Os grupos de controle gue receberam células tumorais e apenas PBS foram incluídos em cada experimento.Os camundongos foram eutanasiados guando os sinaisde crescimento do tumor se tornaram visíveis. Todosos experimentos com animais estavam de acordo comos regulamentos de bem-estar animal e haviam sido aprovados pela autoridade competente.

[00229] Os resultados são mostrados na Figura 3. Após a terapia combinada com o anticorpo trifuncional Surek e o anticorpo anti-CTLA-4 HB304, gue começou 2 dias após um desafio letal com melanoma B78-D14, a sobrevida total de camundongos desafiados com B78-D14 foi melhorada. Os primeiros experimentos demonstraram gue a monoterapia com HB304 no modelo de tumor B78-D14 era ineficaz: não foi observado nenhum prolongamento da sobrevida em comparação com o grupo de controle gue não recebeu tratamento com anticorpo (Figura 3A) . No entanto, guando os anticorpos HB304 foram combinados com anticorpos trifuncionais (Surek), a sobrevida total de camundongos aumentou de 60% (monoterapia com Surek) para 90% (combinação de Surek + HB304). Esta sobrevida total claramente melhorada demonstra gue uma combinação dos anticorpos de blogueio trifuncionais com anti-CTLA-4 aumenta a sua eficácia terapêutica (Figura 3B) .

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 144/151

139/140

Exemplo 4: A morte direta do tumor também melhorada por combinação do tratamento com trAb e anti-CTLA-4 usando um modelo de tumor diferente.

[00230] Tendo demonstrado que a eficácia terapêutica de anticorpos trifuncionais pode ser melhorada pela adição de anticorpos de bloqueio de CTLA-4 no modelo tumoral não imunogênico B78-D14 (Exemplo 3), o objetivo do presente exemplo para avaliar o potencial terapêutico/curativo de uma terapia combinada no modelo de tumor mais imunogênico B16-EpCAM (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific antibody. Blood. 2001; 98: 2526-2534), que expressa o antígeno reconhecido pelo Catabentamab trAb clinicamente relevante.

[00231] 0 trAb BiLu, que é especifico para EpCAM e CD3 de camundongo (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a longlasting antitumor immunity by a tri functional bispecific antibody. Blood. 2001; 98: 2526-2534), serviu como EpCAM de reticulação de trAb substituto com o receptor CD3 em células T de murino.

[00232] Camundongos C57BL/6 foram adquiridos da laconic (Ry, Dinamarca). Os experimentos em animais foram realizados pelo menos duas vezes com 10 animais fêmeas incluídos em cada grupo. Para testar a rejeição de tumor induzida por trAb, os camundongos foram intravenosamente (i.v.) desafiados com 1 x 10⁵ células tumorais B16-EpCAM vitais e foram tratados com 10 μg do anticorpo trifuncional BiLu nos dias 2 e 5 (grupo B) , ou com 100 μρ do anticorpo de bloqueio de CTLA-4 HB304 nos dias 9, 12, 19, 26, 33, 40 (grupo D), ou camundongos receberam um tratamento de combinação de ambos as programações de anticorpos (grupo C

Petição 870190072465, de 29/07/2019, pág. 145/151

140/140 (combinação de programações de grupos B + D) ) . Os camundongos de controle receberam células tumorais e PBS, mas nenhum tratamento com anticorpo (grupo A) . Os camundongos foram eutanizados quando os sinais de crescimento do tumor se tornaram visíveis. Todos os experimentos com animais estavam de acordo com os regulamentos de bem-estar animal e haviam sido aprovados pela autoridade competente.

[00233] Os resultados são mostrados na Figura 4. Primeiramente, uma terapia de manutenção do HB304 consistindo em seis injeções nos dias 9, 12, 19, 26, 33 e 40 após o desafio do tumor ter sido estabelecido. Esta terapia de manutenção prolongou significativamente a sobrevida total de camundongos e foi comparativamente eficaz para a monoterapia com BiLu de anticorpo trifuncional com 20% de sobreviventes a longo prazo em ambos os grupos (Figura 4) . Curiosamente, a combinação de ambos os anticorpos aumentou adicionalmente a taxa de sobrevida de camundongos para 40%. Além disso, a maior sobrevida mediana de 110 dias foi alcançada no grupo C de combinação, em comparação com 59 dias no grupo de tratamento BiLu B, e 51 dias no grupo de tratamento HB304. Os camundongos M no grupo de controle A morreram todos com sobrevida mediana de 41 dias. Assim, a combinação de anticorpos de bloqueio de CTLA-4 com o anticorpo trifuncional BiLu teve um claro impacto terapêutico positivo.

Claims

1. Combinação caracterizada pelo fato de ser de:

(i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que a FcyRIIb humano;

para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerosa.

2. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é um anticorpo monoclonal.

3. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície de células T é selecionado do grupo consistindo em CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L e CD44.

4. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície de células T é CD2 ou CD3, de preferência, o antígeno de superfície de células T é CD3.

5. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 7/19

2/12 reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do

grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, proteoglicano, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, alfa (v)beta(3)-integrina, HLA, HLA-DR, ASC, anidrase carbônica, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38,

CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII,

CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GDla, GDlb, GD2, GD3, GTlb, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gplOO, tirosinase, MUC-1, telomerase, survivina, p53, CA125, antígeno Wue, antígeno Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 e alvos de superficie celular GC182, GT468 ou GT512.

6. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

5, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do grupo que consiste em EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 e CD38, de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 e CD33, mais de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor é selecionado do grupo que consiste em EpCAM, HER2/neu, GD2 e CD20, e ainda mais de preferência, o antígeno associado a câncer e/ou tumor é EpCAM ou GD2.

7. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma primeira especificidade contra CD3 e uma segunda especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 8/19

3/12 tumor selecionado do grupo consistindo em EpCAM, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 e CD33.

8. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende duas especificidades selecionadas de anti-EpCAM x anti-CD3, anti-CD20 x anti-CD3, antÍ-HER2/neu x anti-CD3, anti-GD2 x anti-CD3 e anti-CD19 x anti-CD3.

9. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma porção Fc.

10. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma região Fc.

11. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em particular a porção Fc, é IgG2a de camundongo/IgG2b de rato.

12. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreende uma região Fc de IgG2a de camundongo/IgG2b de rato.

13. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem um formato IgG-like.

14. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 9/19

4/12 o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, é um anticorpo heterólogo, ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

15. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada, que é derivada de rato e/ou camundongo.

16. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

15, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, é um anticorpo de rato e/ou camundongo, ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

17. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

16, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, é um anticorpo de rato/camundongo, ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

18. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, é um anticorpo IgG2a de camundongo/IgG2b de rato, ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

19. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, é um anticorpo trifuncional, em particular, um anticorpo biespecifico, trifuncional.

20. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou o

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 10/19

5/12 fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é selecionado do grupo que consiste em catumaxomab, lymphomun, ertumaxomab, ektomab, de preferência, o anticorpo é catumaxomab e/ou ektomab.

21. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é um ativador ou um inibidor de uma ou mais molécula(s) de ponto de verificação imunológico selecionada (s) de CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR e/ou FasR/DcR3; ou um ativador ou um inibidor de um ou mais dos ligandos dos mesmos.

22. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é um ativador de uma molécula de ponto de verificação estimuladora ou coestimuladora ou um inibidor de uma molécula de ponto de verificação inibidora ou uma combinação dos mesmos.

23. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de uma molécula de ponto de verificação inibidora, de preferência, um inibidor de A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR e/ou DcR3 ou de um ligando dos mesmos.

24. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 11/19

6/12

21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é um ativador de uma molécula de ponto de verificação estimuladora ou coestimuladora, de preferência, um ativador de CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, 0X40, GITR e/ou ICOS ou de um ligando dos mesmos.

25. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4, PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2; mais de preferência, o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4 e/ou PD-1.

26. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que são usados mais do que um modulador de ponto de verificação imunológico, em particular, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 moduladores de ponto de verificação imunológico são usados, de preferência 2, 3, 4 ou 5 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos, mais de preferência 2, 3 ou 4 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos, ainda mais de preferência, 2 ou 3 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos e, mais de preferência, 2 moduladores de ponto de verificação imunológico distintos são usados.

27. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que pelo menos (CC) um inibidor de CTLA-4 e (β) um inibidor de PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2 são usados, de preferência, pelo menos (CC)um inibidor de CTLA-4 e (β) um inibidor de PD-1 são usados.

28. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 12/19

7/12 reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é catumaxomab e/ou ektomab e o modulador de ponto de verificação imunológico é um inibidor de CTLA-4.

29. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são administrados aproximadamente ao mesmo tempo.

30. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são administrados consecutivamente.

31. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é administrado antes do anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T.

32. Combinação para uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico é administrado após o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T.

33. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são administrados através da mesma via de administração.

34. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 13/19

8/12 administrados por meio de vias distintas de administração.

35. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são providos em composições distintas.

36. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e 33, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T são providos na mesma composição.

37. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a combinação é para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerosa em um indivíduo humano.

38. Combinação para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a doença cancerosa é selecionada de câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de ovário, câncer de mama, melanoma, câncer de próstata, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, Linfomas de não Hodgkin, tumor de bexiga, plasmocitoma e/ou sarcoma.

39. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 14/19

9/12 a câncer e/ou tumor; e (c) um sitio de ligação para FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, se liga com uma maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que o FcyRIIb humano;

para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerosa, em particular em um individuo humano.

40. Kit para uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo, são como definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 28 e 35 a 36.

41. Kit para uso, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, o kit caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma bula ou um rótulo com instruções para tratar o câncer usando uma combinação do modulador de ponto de verificação imunológico e do anticorpo, ou o fragmento de ligação a antigeno do mesmo.

42. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antigeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antigeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sítio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 15/19

10/12

FcyRIII humano, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que o FcyRIIb humano.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e/ou o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, são como definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 28 e 35 a 36.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a composição compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.

45. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizada pelo fato de ser para uso em medicina.

46. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento terapêutico de uma doença cancerosa, em particular, em um individuo humano.

47. Método para tratamento terapêutico de câncer ou iniciação, intensificação ou prolongamento de uma resposta antitumoral em um individuo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao individuo (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 16/19

11/12 (b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do que o FcyRIIb humano.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e/ou o anticorpo, ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, são como definidos em qualquer

uma das reivindicações 2 a 28 e 35 a 3 6. 49. Método, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um indivíduo

humano diagnosticado com câncer.

50. Terapia combinada para tratar terapeuticamente câncer, a terapia combinada caracterizada pelo fato de que compreende a administração de (i) um modulador de ponto de verificação imunológico e (ii) um anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo:

(a) uma especificidade contra um antígeno de superfície de células T;

(b) uma especificidade contra um antígeno associado a câncer e/ou tumor; e (c) um sitio de ligação a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga com maior afinidade a FcyRI, FcyRIIa e/ou FcyRIII humano do

Petição 870190049782, de 28/05/2019, pág. 17/19

12/12 que o FcyRIIb humano.

51. Terapia combinada, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e/ou o anticorpo, ou fragmento de ligação a antigeno do mesmo, são como definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 28 e 35 a 36.

52. Terapia combinada, de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizada pelo fato de que o modulador de ponto de verificação imunológico e o anticorpo multifuncional de redirecionamento de células T, ou um fragmento de ligação a antigeno do mesmo, são administrados a um indivíduo humano.