CN110312525A - T细胞重定向多功能抗体与免疫检查点调节剂的组合及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗性治疗癌症疾病的以下的组合：(i)免疫检查点调节剂和(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段。所述T细胞重定向多功能抗体包含(a)针对T细胞表面抗原的特异性；(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；以及(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其所述抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。

Description

T细胞重定向多功能抗体与免疫检查点调节剂的组合及其 用途
本发明涉及癌症疾病的免疫治疗领域，特别涉及T细胞重定向多功能抗体和免疫检查点调节剂在癌症疾病的治疗性/治愈性治疗中的应用。
肿瘤学中的免疫治疗是一个稳步发展的领域。最近批准的(伊匹单抗(Ipilimumab)，Bristol Myers Squibb)、(纳武单抗(Nivolumab)，Bristol MyersSquibb)和(派姆单抗(Pembrolizumab)，Merck)证明了这一点。这些单克隆抗体(mAb)针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)。第三种重点探索的癌症靶标是程序性死亡配体1(PD-L1)。所有这些靶标的共同之处在于它们是T淋巴细胞的负关键调节物，所谓的抑制性免疫检查点分子。免疫检查点是免疫系统中，特别是某些免疫细胞上的分子，其需要激活(刺激性或共刺激性检查点分子)或失活(抑制性检查点分子)以启动免疫应答。许多免疫检查点受特定受体和配体对之间的相互作用调节。通常，癌症通过使用这些检查点来保护自己免于免疫系统，以避免被免疫系统攻击。
PD-1受体在激活的T细胞和其他免疫细胞(例如B细胞)的表面上表达。其配体(PD-L1和PD-L2)在抗原呈递细胞(例如树突细胞或巨噬细胞)和其他免疫细胞的表面上表达。PD-L1或PD-L2与PD1的结合在T细胞中引发信号，该信号基本上关闭T细胞或抑制T细胞。在非病理条件下，这种相互作用防止T细胞攻击体内其他细胞。然而，癌细胞通常利用该系统并在它们的表面上表达高水平的PD-L1。因此，癌细胞能够关闭表达PD-1的T细胞，从而抑制抗癌免疫应答。PD1和/或其配体的抑制剂(例如针对PD1或其配体的抑制性/拮抗性单克隆抗体)可以促进针对癌细胞的免疫应答，因此有望治疗癌症。目前经批准的针对PD1的抑制性/拮抗性单克隆抗体的实例包括(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)和(派姆单抗；Merck)。目前处于临床II期和/或III期的PD1途径的其他抑制剂包括Pidilizumab(抑制PD1的mAb；CureTech/Medivation)、Durvalumab(抑制PD-L1的mAb；MedImmune/AstraZeneca)、Avelumab(抑制PD-L1的mAb)；Merck Serono/Pfizer)和Atezolimab(抑制PD-L1的mAb；Roche)。
(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)是另一种经批准的免疫检查点调节剂，是针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抑制性/拮抗性单克隆抗体。CTLA4也在激活的T细胞的表面上表达，其配体在专职抗原呈递细胞的表面上表达。CTLA-4被认为调节免疫应答早期(主要在淋巴结中)的T细胞增殖并影响调节性T细胞的功能。目前处于临床II期的另一种CTLA-4抑制剂是例如Tremelimumab(MedImmune/AstraZeneca)。
天然配体B7.1和B7.2与CTLA-4以及PD-L1/PD-L2与激活的T细胞上的PD-1的结合抑制由T细胞受体(TCR)或共刺激性受体CD28介导的阳性信号，从而导致T细胞应答的抑制，作为避免免疫过度反应的天然机制。深入研究和临床开发揭示，mAb对免疫检查点分子的阻断导致持续的T细胞激活，可以用来对抗癌症。因此，抗体介导的免疫检查点的阻断是加强肿瘤反应性T细胞功能的有效方法。
由于免疫检查点抑制(阻断)抗体通过免疫系统的相对非特异性激活起作用，因此有许多方法将它们与其他癌症治疗方案组合。为了降低肿瘤负荷，将免疫检查点抑制(阻断)抗体与化学治疗组合。这种方法的缺点是强化学治疗剂不利地影响免疫系统的功能，降低免疫治疗药物的效力。或者，将免疫检查点抑制(阻断)抗体与其他免疫检查点抑制剂组合。实例是和的联合治疗，该治疗于2015年经FDA批准用于治疗患有BRAFV600野生型不可切除或转移性黑素瘤的患者。此外，最近报道了关于Durvalumab和Tremelimumab的组合在非小细胞肺癌中的成功的1b期研究(Antonia,Scott等,2016,Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in non-smallcell lung cancer:a multicentre,phase 1b study；Lancet Oncol.2016年2月5日.pii:S1470-2045(15)00544-6.doi:10.1016/S1470-2045(15)00544-6.[印刷前的电子版])。
然而，缺点是不利副作用显著提高(Tsai和Daud.Nivolumab plus Ipilimumab inthe treatment of advanced melanoma.Journal of Hematology&Oncology(2015)8:123)。此外，检查点调节剂彼此的组合仅靶向内源性肿瘤特异性免疫，特别是因为没有靶向肿瘤特异性抗原。
鉴于以上所述，需要用于治疗癌症疾病的改进的免疫治疗。因此，本发明的目的是克服目前癌症免疫治疗的上面概述的缺点，并提供用于治疗癌症疾病的新组合，其提高患有癌症的患者的存活并且具有更低的副作用风险。
该目的通过下面和所附权利要求书中提出的主题实现。
尽管下面详细描述了本发明，但应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，然而，应理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。不应将各种描述的实例和优选实施方案解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。这种描述应理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的已公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被视为通过本申请的说明书公开。
除非上下文另有要求，否则在本说明书和随后的权利要求书通篇中，术语“包括”及其变化形式如“包含”和“含有”将被理解为暗示包括陈述的成员、整数或步骤，但不包括排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。术语“由...组成”是术语“包含”的特定实施方案，其中排除任何其他未陈述的成员、整数或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由......组成”。因此，术语“包含”包括“包括”以及“由......组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或者可以包含另外的一些物质，例如X+Y。
除非本文另有说明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词以及类似引用应解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将各个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。本说明书中的任何语言都不应被解释为表明对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
“基本上”一词并不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略“基本上”一词。
与数值x有关的术语“约”意指x±10％。
用于治疗性治疗癌症疾病的组合
在第一个方面，本发明提供了用于治疗性治疗癌症疾病的以下的组合：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
T细胞重定向多功能抗体(trAb)与免疫检查点调节剂的组合代表了将数种独特和互补的免疫治疗组合的新的抗癌治疗方法：
首先，降低了不利副作用。抑制性免疫检查点分子的阻断导致T细胞的强烈和非特异性激活，其可引起严重的自身免疫性疾病，例如结肠炎、腹泻、肺炎、肝炎等。与T细胞重定向多功能抗体的组合引导激活的T细胞远离健康组织以将其带至肿瘤部位。因此，可以抑制或降低自身免疫反应。
另外，T细胞重定向多功能抗体的Fc受体结合位点通过激活Fc受体募集并刺激辅助细胞例如树突细胞(DC)或巨噬细胞。这些细胞向T细胞提供额外的刺激、吸收肿瘤细胞碎片并将肿瘤衍生肽呈递至免疫系统。因此，T细胞重定向多功能抗体不仅导致T细胞依赖性肿瘤破坏，而且还诱导持久的肿瘤特异性免疫记忆。
此外，通过持续的T细胞激活提高了治疗效力。本发明人已经发现，通过T细胞重定向多功能抗体激活T细胞伴随着免疫检查点分子的表达提高，其反过来下调激活的T细胞。因此，阻断抗体的检查点抑制剂的组合使用导致持续和延长的T细胞激活，这有利于多功能T细胞重定向抗体的直接抗肿瘤作用。
因此，如本发明人所发现的，与由(i)单独的免疫检查点调节剂和/或(ii)单独的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段诱导的T细胞激活相比，根据本发明使用的组合尤其介导持续的T细胞激活。
总之，T细胞重定向多功能抗体与免疫检查点调节剂的组合显著增强了单一药物的治疗性抗肿瘤作用(图1)。而且，其甚至可以降低免疫检查点调节剂的显著不利副作用。
在下文中详细描述了根据本发明使用的组合的组分，即免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体，及其优选实施方案，所述T细胞重定向多功能抗体包含针对T细胞表面抗原的特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点。此外，下面还详细描述了在癌症疾病的治疗性治疗中的用途及其优选实施方案。应理解，(i)根据本发明使用的组合的优选实施方案包括免疫检查点调节剂的优选实施方案；(ii)根据本发明使用的组合的优选实施方案包括T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案，所述T细胞重定向多功能抗体包含针对T细胞表面抗原的特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点；并且(iii)根据本发明使用的组合的优选实施方案包括在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案。根据本发明使用的组合的更优选实施方案包括(i)免疫检查点调节剂的优选实施方案和T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案，所述T细胞重定向多功能抗体包含针对T细胞表面抗原的特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点；(ii)T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案和在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案，所述T细胞重定向多功能抗体包含针对T细胞表面抗原的特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点；或(iii)免疫检查点调节剂的优选实施方案和在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案。最优选地，根据本发明使用的组合的实施方案包括(i)免疫检查点调节剂的优选实施方案；(ii)T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案，所述T细胞重定向多功能抗体包含针对T细胞表面抗原的特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点；和(iii)在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案。
应理解，在根据本发明使用的组合中通常优选的是免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)针对不同的靶标。换言之，T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)优选不包含与根据本发明使用的组合的免疫检查点调节剂靶向相同的免疫检查点分子(或其配体)的任何特异性或结合位点。同样，换言之，免疫检查点调节剂优选不调节被根据本发明使用的组合的T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)靶向的免疫检查点分子(或其配体)。
T细胞重定向多功能抗体
如本文(即在本申请通篇)所用，术语“抗体”包括多种形式的抗体，优选单克隆抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、合成抗体、化学修饰抗体和基因工程抗体(变体或突变体抗体)，只要保留根据本发明的特征性质即可。抗体的优选实例包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物、抗体缀合物、单链抗体、抗体衍生物、抗体类似物及其各自的片段。更优选重组抗体，特别是重组单克隆抗体。此外，还优选的是抗体是多链抗体，即包含多于一条链的抗体，其因此不同于单链抗体。此外，抗体或抗原结合片段可以完全或部分是人来源的或人源化的。抗体的人源化是本领域已知的(参见，例如，Shalaby等,J.Exp.Med.175(1992),217；Mocikat等,Transplantation 57(1994),405)。优选地，至少(六个)CDR(互补决定区)和/或框架区、更优选可变区是人来源的和/或人源化的。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。在一些情况下，“抗体”可包含较少的链。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。本文中，“单克隆”抗体(mAb或moAb)被理解为由都是唯一亲本细胞的克隆的相同免疫细胞制备的抗体，其与由多种不同免疫细胞制备的多克隆抗体相反。通常，可以产生与特定物质特异性结合的单克隆抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体在现有技术中是众所周知的(van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫接种后能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全部库的或选择的人抗体。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中将使得在抗原攻击后产生人抗体(参见，例如，Jakobovits,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等,Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.等,YearImmunol.7(1993)3340)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；和Boerner,P.等,J.Immunol.147(1991)86-95)。如本文所用的术语“人抗体”还包括经修饰(例如在可变区和/或在Fc区中)以产生根据本发明的特性的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”旨在包括非天然存在的所有抗体，特别是通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如分离自宿主细胞例如CHO细胞或动物(例如小鼠)的抗体，或者使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。与天然存在的抗体相比，这样的重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可互换使用，指的是保留了根据本发明使用的抗体的特异性结合活性的本发明的抗体的任何片段，所述特异性结合活性特别是针对T细胞表面抗原的特异性，针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性以及人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点。抗体片段的实例包括但不限于sc(单链)抗体、scFv-Fc、scFv-CH3、sc双抗体-CH3、双抗体-CH3、微抗体、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc和串联scFv-Fc(例如，如Spiess C.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106中所述)。可以通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原裂解二硫键的方法从抗体获得本发明的抗体片段。或者，可以通过克隆和表达重链和/或轻链的部分序列来获得抗体片段。本发明还包括包含来源于本发明抗体的重链和轻链的CH3区的单链Fv片段(scFv)。例如，本发明包括包含来自本发明抗体的CDR的scFv-CH3或scFv-Fc。还包括重链或轻链单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域轻链抗体以及其中重链和轻链可变结构域通过肽接头连接的单链抗体例如单链Fv。本发明的抗体片段通常是多价的，并且可以包含在如上所述的各种结构中。例如，可以合成scFv分子以产生三价“三抗体”或四价“四抗体”。scFv分子优选包括Fc区的结构域。虽然本说明书(包括权利要求书)在某些地方可能明确指的是抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和/或衍生物，但应理解术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有类别的抗体，即抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和衍生物。
根据本发明使用的抗体或其片段是T细胞重定向多功能抗体或其片段。
如本文所用，“T细胞重定向”抗体或其片段是提供针对T细胞表面抗原的特异性以及针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性二者的抗体或其片段。这使得抗体或其片段能够将T细胞重定向至癌细胞。因此，“针对T细胞表面抗原的特异性”特别地意指根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别T细胞表面抗原的表位的互补位。换句话说，短语“针对T细胞表面抗原的特异性”特别地意指根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含T细胞表面抗原的结合位点。因此，“针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性”特别地意指根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别癌和/或肿瘤相关抗原的表位的互补位。换句话说，短语“针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性”特别地意指根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含癌和/或肿瘤相关抗原的结合位点。
重要的是，与仅表现出一种单一特异性的常规(“普通”)抗体相反，T细胞重定向抗体能够与至少两种不同的表位结合，即癌/肿瘤细胞上的一种表位和T细胞上的一种表位，从而将T细胞“重定向”至癌/肿瘤细胞，实现T细胞介导的细胞杀伤。因此，根据本发明使用的T细胞重定向抗体显示出T细胞重定向特性，即抗体通常能够再激活处于无免疫性状态的肿瘤特异性T细胞和/或将T细胞定向至期望的抗原(如由抗体的针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性提供)。
如本文所用，“多功能”抗体或其片段是能够同时与多种不同结合位点相互作用的抗体或其片段。由于根据本发明使用的抗体或其片段包含(至少)(a)针对T细胞表面抗原的特异性，(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性以及(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，所以“多功能”抗体或其片段至少是“三功能”抗体或其片段。“三功能”意指抗体或其片段能够同时与三种不同的结合位点相互作用。
如上所述，T细胞重定向多功能抗体包含肿瘤相关抗原(TAA)特异性结合臂，T细胞表面抗原(例如在T细胞上表达的CD3)特异性第二结合臂，以及人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其特别优先与存在于辅助细胞(如巨噬细胞、树突细胞(DC)或自然杀伤(NK)细胞)上的激活Fc受体例如FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。不受任何理论束缚，本发明人假定T细胞重定向多功能抗体在肿瘤治疗中的以下作用方式(Lindhofer H,HessJ,Ruf P.Trifunctional antibodies for cancer therapy.In:Kontermann RE(编辑),Bispecific antibodies.Springer,Berlin,2011,第289至312页)：这种作用方式的第一个关键步骤被认为是通过双特异性抗体介导的TAA与T细胞表面抗原(例如CD3)的交联而将T细胞重定向至肿瘤。抗体介导的作为T细胞受体复合物的组分的T细胞表面抗原(例如CD3)的结合是强力的第一刺激，其以不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的方式激活T细胞，伴随着TNF-a和IFN-g分泌。然而，T细胞的生理激活需要第二信号。通过调理的T细胞和肿瘤细胞以及促炎细胞因子吸引，FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII阳性免疫细胞通过T细胞重定向多功能抗体的FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点额外参与。在肿瘤细胞处形成不同免疫细胞类型的簇。
这种由肿瘤细胞、T细胞和FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII阳性辅助免疫细胞组成的三细胞复合物形成表明了数个重要的结果：首先，辅助免疫细胞和T细胞相互刺激。T细胞重定向多功能抗体引发的T细胞和CD14阳性单核细胞的相互作用导致CD83、CD86和CD40上调(Riechelmann H,Wiesneth M,Schauwecker P,Reinhardt P,Gronau S,Schmitt A,Schroen C,Atz J,Schmitt M(2007)Adoptive therapy of head and neck squamouscell carcinoma with antibody coated immune cells:a pilot clinicaltrial.Cancer Immunol Immunother56:1397-1406；Stanglmaier M,Faltin M,Ruf P,Bodenhausen A,Schroder P,Lindhofer H(2008)Bi20(FBTA05),a novel trifunctionalbispecific antibody(anti-CD20_anti-CD3),mediates efficient killing of B-celllymphoma cells even with very low CD20 expression levels.Int J Cancer 123:1181–1189；Zeidler R,Mysliwietz J,Csanady M,Walz A,Ziegler I,Schmitt B,Wollenberg B,Lindhofer H(2000)The Fc-region of a new class of intactbispecific antibody mediates activation of accessory cells and NK cells andinduces direct phagocytosis of tumour cells.Br J Cancer 83:261–266)。因此，T细胞接受CD40/CD40L或CD80-CD86/CD28相互作用形式的第二共刺激信号。结果，它们被深刻地和在生理上激活，其特征在于IL-2的高分泌和通过检测增殖标志物Ki-67的强增殖。另外，T细胞激活标志物CD25和CD69上调(Riechelmann H,Wiesneth M,Schauwecker P,Reinhardt P,Gronau S,Schmitt A,Schroen C,Atz J,Schmitt M(2007)Adoptivetherapy of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immunecells:a pilot clinical trial.Cancer Immunol Immunother 56:1397-1406)。相反，辅助免疫细胞通过与T细胞和FcgR交联的相互作用而被刺激。这种刺激表现为测量到高水平的主要由辅助细胞分泌的促炎细胞因子如IL-6和IL-12。此外，辅助细胞和T细胞之间的串扰通过Th1-偏向细胞因子尤其是IL-2和IFN-g的释放来指示。最后，靶肿瘤细胞被不同类型的免疫效应细胞的协同攻击有效地破坏，如在同种异体环境以及自体人体外系统中所示((Gronau SS,Schmitt M,Thess B,Reinhardt P,Wiesneth M,Schmitt A,Riechelmann H(2005)Trifunctional bispecific antibody-induced tumor cell lysis of squamouscell carcinomas of the upper aerodigestive tract.Head Neck 27:376–382)。坏死和凋亡的肿瘤细胞和颗粒被吞噬(Riesenberg R,Buchner A,Pohla H,Lindhofer H(2001)Lysis of prostate carcinoma cells by trifunctional bispecific antibodies(alpha EpCAM_alpha CD3).J Histochem Cytochem 49:911–917；Zeidler R,MysliwietzJ,Csanady M,Walz A,Ziegler I,Schmitt B,Wollenberg B,Lindhofer H(2000)The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates activation ofaccessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumourcells.Br J Cancer 83:261–266)并且可以在刺激性环境中由专职抗原呈递细胞处理并呈递，这是抗肿瘤免疫的理想先决条件。
如本发明人出乎意料地发现的，如本文所限定的T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)诱导免疫检查点分子例如CTLA-4的提高的表达(参见实施例2，图2)。因此，在根据本发明使用的组合中，优选的是T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)诱导免疫检查点分子例如CTLA-4的提高的表达。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是三功能抗体或其三功能抗原结合片段，特别是双特异性三功能抗体或其双特异性三功能抗原结合片段。
在本发明的上下文中，应将“三功能”抗体(trAb)特别理解为特定种类的双特异性抗体，其在靶癌/肿瘤处同时募集并激活T细胞和特别的辅助免疫细胞，例如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的其他细胞，通过例如其FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点。因此，三功能双特异性抗体具有两个抗原结合位点(即两个互补位)。通常来说，这两个抗原结合位点(互补位)允许抗体与癌/肿瘤细胞(癌/肿瘤细胞表面抗原)结合以及与T细胞(T细胞表面抗原)结合。同时，例如通过其Fc部分，特别是其Fcγ受体结合位点，募集阳性辅助细胞例如单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或表达Fcγ受体的其他细胞。这些不同种类的效应细胞的同时激活导致通过多种机理例如吞噬作用和穿孔素介导的细胞毒性有效杀死肿瘤细胞。通常来说，三功能抗体的净效应是将T细胞和特别的Fcγ受体阳性辅助细胞与肿瘤细胞连接，导致肿瘤细胞的破坏。
三功能抗体特别通过(i)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、(ii)T细胞介导的细胞杀伤和(iii)诱导抗肿瘤免疫来引起肿瘤细胞的去除。相比之下，只有第一种作用方式实际上由常规(单克隆和单特异性)抗体执行。此外，与常规抗体相比，三功能抗体具有更高的细胞毒性潜力，并且它们甚至与相对较弱地表达的抗原结合。因此，与常规抗体相比，三功能抗体在消除肿瘤细胞方面具有更有效(高于1000倍)的等效剂量。
通常，根据本发明使用的T细胞重定向多功能抗体是多特异性抗体。如本文所用，术语“多特异性”是指与例如不同抗原上，例如T细胞表面抗原上和癌/肿瘤抗原上的至少两种不同表位结合的能力。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体可以与之结合的不同表位的数目。例如，常规单特异性IgG型抗体具有两个相同的表位结合位点(互补位)，并因此仅能与相同的表位结合(但不与不同的表位结合)。相比之下，多特异性抗体具有至少两种不同类型的互补位，因此可以与至少两种不同的表位结合。如本文所用，“互补位”是指抗体的表位结合位点。此外，单一“特异性”可以是指单一抗体中的一个、两个、三个或更多个相同的互补位(一个单一抗体分子中实际的互补位的数目被称为“价”)。例如，单一天然IgG抗体是单特异性和二价的，因为其具有两个相同的互补位。因此，多特异性抗体包含至少两个(不同的)互补位。因此，术语“多特异性抗体”是指具有多于一个互补位并且具有与两种或更多种不同表位结合的能力的抗体。术语“多特异性抗体”特别包括双特异性抗体，但通常还包括特别与三种或更多种不同的表位结合的蛋白质(例如抗体)骨架，即具有三个或更多个互补位的抗体。
特别地，多特异性抗体或其抗原结合片段可以包含两个或更多个互补位，其中一些互补位可以是相同的，使得抗体的所有互补位属于至少两种不同类型的互补位，并且因此，抗体具有至少有两种特异性。例如，根据本发明的多特异性抗体或其抗原结合片段可以包含四个互补位，其中每两个互补位相同(即具有相同的特异性)，并且因此，该抗体或其片段是双特异性和四价的(两种特异性中的每一种有两个相同的互补位)。因此，“一种特异性”特别是指表现出相同特异性的一个或更多个互补位(其通常意味着这样的一个或更多个互补位是相同的)，并且因此，“两种特异性”可以通过二、三、四、五、六或更多个互补位实现，只要它们仅涉及两种特异性即可。最优选地，多特异性抗体对于(至少两种中的)每一种特异性包含一个单一的互补位，即多特异性抗体包含总共至少两个互补位。例如，双特异性抗体对于两种特异性中的每一种包含一个单一的互补位，即该抗体包含总共两个互补位。还优选的是，该抗体对于两种特异性中的每一种包含两个(相同的)互补位，即该抗体包含总共四个互补位。优选地，该抗体对于两种特异性中的每一种包含三个(相同的)互补位，即该抗体包含总共六个互补位。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体或其双特异性抗原结合片段。
在本发明的上下文中，双特异性抗体(BiAb)包含(恰好)两种特异性。它们是多特异性抗体及其抗原结合片段的最优选类型。在本发明的上下文中，双特异性抗体可以是包含FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点的任何双特异性抗体形式，例如，如SpiessC.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106中所述。例如，BiAb可以是完整抗体，例如完整IgG样分子，或其片段，所述片段不是完整抗体，但保留了抗体特性。这些可以是小的重组形式，例如，作为串联单链可变片段分子(taFv)、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)和这些的多种其他衍生物(参见例如Byrne H.等(2013)Trends Biotech,31(11):621-632，图2示出了多种双特异性抗体形式)。数种BiAb形式可以使效应细胞重定向以针对在疾病过程中起关键作用的靶细胞。例如，数种BiAb形式可以使效应细胞重新靶向肿瘤细胞，并且设计多种BiAb构建体以重新靶向免疫系统的细胞，例如通过结合并引发效应细胞表面上的Fc受体或通过结合T细胞受体(TCR)复合物。
优选地，多特异性(特别是双特异性)抗体或其抗原结合片段至少是二价的，即其具有至少两个互补位。更优选地，多特异性(特别是双特异性)抗体或其抗原结合片段是二价、三价、四价或六价的。甚至更优选地，多特异性(特别是双特异性)抗体或其抗原结合片段是二价或四价的。最优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是双特异性二价抗体，即具有两个互补位的抗体：一个识别T细胞表面抗原并且另一个识别癌和/或肿瘤相关抗原。
与术语多“特异性”例如双特异性、三特异性、四特异性等相反，术语多“功能”(例如三功能等)是指更一般意义上的不同结合位点的数目，即它们包括任何结合位点(不仅是与表位结合的那些)。因此，例如FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点是对于多“功能”类别(例如三功能)“计数”，而对于“特异性”类别(例如双特异性、三特异性、四特异性等)“不计数”。例如，三功能抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性的，但在本发明上下文中(其中抗体具有两种特异性和FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点)，三功能抗体通常是双特异性的。
如本文所用，术语“抗原”是指作为适应性免疫应答的受体的靶标，特别是作为抗体、T细胞受体和/或B细胞受体的靶标的任何结构物质。“表位”，也称为“抗原决定簇”，是免疫系统，特别是抗体、T细胞受体和/或B细胞受体识别的抗原的一部分(或片段)。因此，一个抗原具有至少一个表位，即单一抗原具有一个或更多个表位。抗原可以是(i)肽、多肽或蛋白质，(ii)多糖，(iii)脂质，(iv)脂蛋白或脂肽，(v)糖脂，(vi)核酸或(vii)小分子药物或毒素。因此，抗原可以是肽、蛋白质、多糖、脂质、其组合(包括脂蛋白和糖脂)、核酸(例如DNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、诱饵DNA、质粒)或小分子药物(例如环孢霉素A、紫杉醇、多柔比星、甲氨蝶呤、5-氨基乙酰丙酸)或其任意组合。优选地，抗原选自(i)肽、多肽或蛋白质，(ii)多糖，(iii)脂质，(iv)脂蛋白或脂肽，和(v)糖脂；更优选地，抗原是肽、多肽或蛋白质。
T细胞表面抗原
如本文所用，“T细胞表面抗原(的表位”)是指T细胞表面相关抗原或T细胞表面特异性抗原(也称为“T细胞表面标志物”)(的表位)。这些特别是T细胞特异性的“CD”(分化簇“cluster of differentiation”)分子。CD分子是可用于鉴定和表征白细胞的细胞表面标志物。CD命名法是、通过开始于1982年的HLDA(人白细胞分化抗原)研讨会开发并维持、。例如，可以从本领域技术人员已知的多种来源如http://www.ebioscience.com/resources/human-cd-chart.htm,BD Bioscience的“人和小鼠CD标志物手册”(可在https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf获取)，或www.hcdm.org检索某种CD分子是否在T细胞上被发现(并且因此，代表本发明上下文中的T细胞表面抗原)。因此，T细胞表面抗原的实例包括例如在BD Bioscience的“人和小鼠CD标志物手册”(可在https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf上获取)中或在其他来源的“CD标志物图表”中肯定地指示T细胞的那些(人)CD标志物。
优选地，T细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和CD44。这意味着根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含优选识别(能够结合)选自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和/或CD44的T细胞表面抗原的表位的互补位。所述特异性优选促进T细胞的募集。其中，CD是如上所述的“分化簇”(指定或分类决定簇“cluster ofdesignation or classification determinant”)的缩写。通常，这被称为用于确定和研究为细胞免疫分型提供靶标的细胞表面分子的方案。在生理学方面，CD分子可以以多种方式起作用，通常作为对细胞重要的受体或配体(激活受体的分子)。通常启动信号级联，改变细胞的行为(参见细胞信号传导)。一些CD蛋白在细胞信号传导中不起作用，但具有其他功能，例如细胞黏附。目前，人的CD总数多至364。本发明涉及T细胞相关CD分子。
优选地，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的T细胞表面抗原不是CD28。更优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于CD28的任何特异性/结合位点。
更优选地，T细胞表面抗原是CD2或CD3，最优选地T细胞表面抗原是CD3。这意味着根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含更优选识别CD2或CD3的表位的互补位，最优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别CD3的表位的互补位。CD3(分化簇3)是有助于激活细胞毒性T细胞的T细胞共受体。CD3通常由蛋白质复合物组成，并由四个不同的链构成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。这些链与被称之为T细胞受体(TCR)的分子和ζ-链(ζ-链)结合，以在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合物。
癌和/或肿瘤相关抗原
如本文所用，“癌和/或肿瘤相关抗原(的表位)”是指癌相关抗原、癌特异性抗原、肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异性抗原(的表位)。这样的表位/抗原通常是某类癌/肿瘤特异性的或与其相关。合适的癌/肿瘤表位和抗原可以例如从癌/肿瘤表位数据库中检索，例如，从van der Bruggen P,Stroobant V,Vigneron N,Van den Eynde B.Peptide database:Tcell-defined tumor antigens.Cancer Immun 2013；URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/，其中人肿瘤抗原根据其表达模式分为四大类，或者从数据库“Tantigen”(TANTIGEN 1.0版，2009年12月1日；由Bioinformatics Core at CancerVaccine Center,Dana-Farber Cancer Institute开发；URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)。在本发明的上下文中有用的癌相关抗原、特别是肿瘤相关抗原或组织特异性抗原的具体实例包括但不限于以下抗原：Epha2、Epha4、PCDGF、HAAH、间皮素；EPCAM；NY-ESO-1、糖蛋白MUC1和NIUC10黏蛋白p5(特别是突变形式)、EGFR；癌抗原125(CA125)、上皮糖蛋白40(EGP40)(Kievit等,1997,Int.J.Cancer 71:237-245)、鳞状细胞癌抗原(SCC)(Lozza等,1997Anticancer Res.17:525-529)、组织蛋白酶E(Mota等,1997,Am.JPathol.150:1223-1229)、CDC27(包括蛋白质的突变形式)、抗原磷酸丙糖异构酶、707-AP、A60分枝杆菌抗原(Macs等,1996,J.Cancer Res.Clin.Oncol.122:296-300)，AFP、α(v)β(3)-整合素、ART-4、ASC、BAGE、β-连环蛋白/m、BCL-2、bcr-abl、bcr-abl p190、bcr-ablp210、BRCA-1、BRCA-2、CA 19-9(Tolliver和O'Brien,1997,South Med.J.90:89-90；Tsuruta等,1997Urol.Int.58:20-24)、CA125、CALLA、CAMEL、碳酸酐酶、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK-4/m、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44v3、CD44v6、CD47、CD52、CD138、CEA(Huang等,Exper Rev.Vaccines(2002)1:49-63)、c-erb-2、CT9、CT10、Cyp-B、Dek-cain、DAM-6(MAGE-B2)、DAM-10(MAGE-B1)、EphA2(Zantek等,Cell Growth Differ.(1999)10:629-38；Carles-Kinch等,Cancer Res.(2002)62:2840-7)、EphA4(Cheng等,2002,CytokineGrowth Factor Rev.13:75-85)、肿瘤相关Thomsen-Friedenreich抗原(Dahlenborg等,1997,Int.J Cancer 70:63-71)、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GnT-V、GM1、GM2、GM3、gp100(Zajac等,1997,Int.J Cancer 71:491-496)、GT1b、GT3、GQ1、HAGE、HER2/neu、HLA、HLA-DR、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP-27、HSP-70、HSP70-2M、HSP-72、HSP-90、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、细胞凋亡抑制剂例如生存素、KH-1腺癌抗原(Deshpande和Danishefsky,1997,Nature 387:164-166)、KIAA0205、K-ras、LAGE、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y抗原、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE D、MART-1、MART-1/Melan-A(Kawakami和Rosenberg,1997,Int.Rev.Immunol.14:173-192)、MC1R、MCSP、MDM-2、MHCII、mTOR、肌球蛋白/m、MUC1、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、neo-polyA聚合酶、NA88-A、NFX2、NY-ESO-1、NY-ESO-1a(CAG-3)、PAGE-4、PAP、蛋白酶3(Molldrem等,Blood(1996)88:2450-7；Molldrem等,Blood(1997)90:2529-34)、P15、p53、p97、p190、Pgp、PIK3CA、Pm1/RARα、PRAME、蛋白聚糖、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RCAS1、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SP17、SPAS-1、SSX2、SSX4TEL/AML1、TPI/m、酪氨酸酶、TARP、端粒酶、TRP-1(gp75)、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT-1、Wue抗原、细胞表面靶标GC182、GT468或GT512，以及来源于NY-ESO-1和LAGE-1基因的交替翻译的NY-ESO-ORF2和CAMEL蛋白。
更优选地，癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、α(v)β(3)-整合素、HLA、HLA-DR、ASC、碳酸酐酶、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD52、CD138、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4、Trp2、gp100、酪氨酸酶、MUC-1、端粒酶、生存素、p53、CA125、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、MCSP、EphA2和细胞表面靶标GC182、GT468或GT512。这意味着根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含优选识别(能够结合)选自以下的癌和/或肿瘤相关抗原的表位的互补位：EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、α(v)β(3)-整合素、HLA、HLA-DR、ASC、碳酸酐酶、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD52、CD138、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4、Trp2、gp100、酪氨酸酶、MUC-1、端粒酶、生存素、p53、CA125、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、MCSP、EphA2和细胞表面靶标GC182、GT468或GT512。
特别优选地，癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38，更优选地，癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38，甚至更优选地，癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、GD2和CD20，并且最优选地，癌和/或肿瘤相关抗原是EpCAM。这意味着根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含优选识别以下的表位的互补位：EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38；更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别以下的表位的互补位：EpCAM、HER2/neu、CEA、GD2、CD19、CD20或CD33；甚至更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别EpCAM、HER2/neu、GD2或CD20的表位的互补位；并且最优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含识别EpCAM或GD2的表位的互补位。
还优选的是，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的癌和/或肿瘤相关抗原不是PD-L1。更优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于PD-L1的任何特异性/结合位点。更一般地，甚至更优选的是，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的癌和/或肿瘤相关抗原不是免疫检查点分子和/或其配体。最优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于免疫检查点分子和/或其配体的任何特异性/结合位点。
优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是EpCAM。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是GD2。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是Her2/neu。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是GD3。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是CD20。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是CD19。优选地，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是CD30。或者，待由根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段识别的癌和/或肿瘤相关抗原(或其各自上的表位)是CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA或RAS。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段(i)通过其第一特异性，例如通过其第一互补位与选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和CD44，优选CD2或CD3，更优选CD3的T细胞表面抗原的表位结合；并且，(ii)通过其第二特异性，例如通过其第二互补位与优选选自肿瘤抗原EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38的癌和/或肿瘤相关抗原结合。
更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段(i)通过其第一特异性，例如通过其第一互补位与选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和CD44，优选CD2或CD3，更优选CD3的T细胞表面抗原的表位结合；并且，(ii)通过其第二特异性，例如通过其第二互补位与优选选自肿瘤抗原EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38的癌和/或肿瘤相关抗原结合。
根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段优选通过其第一特异性，例如通过其第一互补位与T细胞表面抗原，优选CD3的表位结合，并且通过其第二特异性，例如通过其第二互补位与优选选自肿瘤抗原EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38的癌和/或肿瘤相关抗原结合，或者与神经节苷脂GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD3、GT1b、GT3或GQ1结合。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含针对CD3的第一特异性和针对选自EpCAM、HER2/neu、CEA、GD2、CD19、CD20和CD33的癌和/或肿瘤相关抗原的第二特异性。
还优选的是，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的癌和/或肿瘤相关抗原不是CD19。更优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于CD19的任何特异性/结合位点。
还优选的是，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的癌和/或肿瘤相关抗原不是CD20。更优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于CD20的任何特异性/结合位点。
还优选的是，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含针对其的特异性的癌和/或肿瘤相关抗原不是CEA。更优选地，T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段不包含对于CEA的任何特异性/结合位点。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对EpCAM的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗EpCAM)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对GD2的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗GD2)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对Her2/neu的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗Her2/neu)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对GD3的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗GD3)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对CD20的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗CD20)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对CD19的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗CD19)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对CEA的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗CEA)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对MAGE的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗MAGE)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，以及针对VEGF的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗VEGF)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对EGFR的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗EGFR)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对mTOR的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗mTOR)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对PIK3CA的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗PIK3CA)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对RAS的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗RAS)。
或者，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对CD30的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗CD30)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对CD33的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗CD33)。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可包含针对CD3的一种特异性，优选一个互补位，和针对虫媒病毒E蛋白表位的一种特异性，优选一个互补位(抗CD3x抗虫媒病毒E蛋白)。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含选自抗EpCAM x抗CD3、抗CD2x抗CD3、抗CD20x抗CD3、抗HER2/neu x抗CD3、和抗CD19x抗CD3的两种特异性。更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含选自抗EpCAM x抗CD3、抗GD2x抗CD3、和抗HER2/neu x抗CD3的两种特异性。甚至更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含选自抗EpCAM x抗CD3和抗GD2x抗CD3的两种特异性。
人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点
根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点。更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRIIa的结合位点。人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点(例如Fc区)能够使多功能抗体额外募集表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的细胞，例如FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII阳性辅助细胞，如巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞，以及表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的其他细胞。由于多功能抗体至少是双特异性(或多特异性)抗体，它们优选能够在(iii)靶癌/肿瘤细胞处同时募集并激活(i)T细胞和(ii)表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的细胞，例如辅助免疫细胞，如单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突细胞或者表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的其他细胞。这些不同种类的效应细胞的同时激活导致通过不同机理例如吞噬作用和穿孔素介导的细胞毒性有效杀死肿瘤细胞。通常来说，包含FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点的优选多功能抗体的净效应是将T细胞和Fc受体阳性细胞与靶细胞(例如肿瘤细胞)连接，导致肿瘤细胞的破坏。多功能抗体通过(i)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，(ii)T细胞介导的细胞杀伤和(iii)诱导抗肿瘤免疫引起肿瘤细胞的去除。
通常，Fcγ受体(FcγR)是IgG的Fc受体家族。所有Fcγ受体(FcγR)属于免疫球蛋白超家族，并且是用于诱导调理的(标记的)微生物的吞噬作用的最重要的Fc受体。该家族包括数种成员：人中的FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)以及小鼠中的FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII和FcγRIV。FcγR家族的复杂性反映在人(IgG1至IgG4)和小鼠(IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中存在四种不同的IgG亚类，它们以不同的亲和力和特异性与不同的Fcγ受体结合(综述参见NimmerjahnF.和Ravetch J.V.,2008,Fcγreceptors as regulators of immune responses,Nat RevImmunol 8:34-47)。传统上，FcγR家族根据受体对特定IgG亚类的亲和力水平以及其引发的信号传导途径的类型(即其是抑制性的或激活的)进行分类。FcγRIIb在小鼠和人中是保守的，并且是唯一已知的抑制性FcγR；其通过包含在其胞质区中的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)来传递抑制信号。除人GPI锚定的FcγRIIIb外，所有其他FcγR通过包含在其胞质区中的ITAM来激活信号传导途径。FcγRIa是小鼠和人中唯一已知的高亲和力FcγR。所有其他FcγR在低至中等微摩尔范围内具有低100至1000倍的亲和力，并显示出更广泛的IgG亚类特异性。抑制性FcγRIIb是最广泛表达的FcγR，并且存在于除NK细胞和T细胞外的几乎所有白细胞上。最后，已经证明IgG1的活性受抑制性FcγRIIb的负调节。因此，推测抑制性FcγRIIb对IgG应答发挥“调节”功能。
人FcγRIIa(免疫球蛋白G(IgG)Fc受体IIa；CD32a)是IgG的低亲和力受体，并且在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板和树突细胞上表达。FcγRIIa在配体结合后递送激活信号，并导致开始炎性应答，包括细胞溶解、吞噬作用、脱粒和细胞因子产生。已知人FcγRIIa的两种遗传决定的结构不同的同种异型：FcγRIIa-R131和FcγRIIa-H131等位基因的产物。可以通过来自共表达的抑制性受体例如FcγRIIb(CD32b)的信号调节FcγRIIa应答，并且信号的强度取决于激活和抑制性受体的表达比例。
根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。这意味着，如果抗体或其抗原结合片段仅与FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的一种结合(即，(i)抗体或其抗原结合片段与FcγRI结合，但不与FcγRIIa或FcγRIII结合；(ii)抗体或其抗原结合片段与FcγRIIa结合，但不与FcγRI或FcγRIII结合；或者(iii)抗体或其抗原结合片段与FcγRIII结合，但不与FcγRI或FcγRIIa结合)，则抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的一种结合。然而，如果抗体或其抗原结合片段与FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的多于一种结合(即，(i)抗体或其抗原结合片段与FcγRI和FcγRIIa结合，但不与FcγRIII结合；(ii)抗体或其抗原结合片段与FcγRIIa和FcγRIII结合，但不与FcγRI结合；(iii)抗体或其抗原结合片段与FcγRI和FcγRIII结合，但不与FcγRIIa结合；或者(iv)抗体或其抗原结合片段与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII结合)，则以下情况是足够的：如果抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的一种结合。然而，更优选地，抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的两种结合。最优选地，抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的所有三种结合。特别地，(i)抗体或其抗原结合片段最优选地以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的每一种结合；和/或(ii)抗体或其抗原结合片段最优选地以比与人FcγRIIb更高的亲和力与所述抗体或其抗原结合片段包含其结合位点的那些人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII中的每一种结合。
通常，人FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII是激活Fc受体，而人FcγRIIb是抑制性Fc受体。因此，如上所述的以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合的抗体或其抗原结合片段与激活Fc受体结合，而不与抑制性Fc受体结合，从而使激活/抑制比向激活侧移动，并且降低抑制性FcγRIIb的调节影响。因此，提高了吞噬作用和直接杀伤。
如本文所用，“比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa”特别是指某种抗体或其片段与FcγRIIa结合的EC50(半最大结合信号处的有效浓度)低于相同抗体或其片段与FcγRIIb结合的EC50。换句话说，与FcγRIIa的半最大结合比与FcγRIIb的半最大结合需要更低浓度的抗体(或其片段)。例如，可以通过EC50(FcγRIIb)/EC50(FcγRIIa)确定FcγRIIa/FcγRIIb比(如果抗体以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa结合，则其>1)。可以例如通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定EC50值。或者，也可以通过表面等离子体共振测量来确定抗体或其片段的结合亲和力，例如，如Richards JO,Karki S,Lazar GA,ChenH,Dang W,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding to FcgammaRIIaenhances macrophage phagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther 7:2517–2527中所述。通常，可以通过技术人员已知的多种方法确定抗体或其片段与FcγRIIa和FcγRIIb的结合亲和力。然而，特别通过相同的方法来获得某抗体或其片段与FcγRIIa和FcγRIIb的结合亲和力，以确定FcγRIIa和FcγRIIb结合亲和力。
这同样适用于“比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI”，其特别是指某种抗体或其片段与FcγRI结合的EC50(半最大结合信号处的有效浓度)低于相同抗体或其片段与FcγRIIb结合的EC50。换句话说，与FcγRI的半最大结合比与FcγRIIb的半最大结合需要更低浓度的抗体(或其片段)。例如，可以通过EC50(FcγRIIb)/EC50(FcγRI)确定FcγRI/FcγRIIb比(如果抗体以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI结合，则>1)。可以例如通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定EC50值。或者，也可以通过表面等离子体共振测量来确定抗体或其片段的结合亲和力，例如，如Richards JO,Karki S,Lazar GA,Chen H,DangW,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding to FcgammaRI enhancesmacrophage phagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther 7:2517–2527中所述。通常，可以通过技术人员已知的多种方法确定抗体或其片段与FcγRI和FcγRIIb的结合亲和力。然而，特别通过相同的方法来获得某抗体或其片段与FcγRI和FcγRIIb的结合亲和力，以确定FcγRI和FcγRIIb结合亲和力相同的方法来获得。
这同样适用于“比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIII”，其特别是指某种抗体或其片段与FcγRIII结合的EC50(半最大结合信号处的有效浓度)低于相同抗体或其片段与FcγRIIb结合的EC50。换句话说，与FcγRIII的半最大结合比与FcγRIIb的半最大结合需要更低浓度的抗体(或其片段)。例如，可以通过EC50(FcγRIIb)/EC50(FcγRIII)确定FcγRIII/FcγRIIb比(如果抗体以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIII结合，则>1)。可以例如通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定EC50值。或者，也可以通过表面等离子体共振测量来确定抗体或其片段的结合亲和力，例如，如Richards JO,Karki S,Lazar GA,Chen H,Dang W,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding toFcgammaRIII enhances macrophage phagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther7:2517–2527中所述。通常，可以通过技术人员已知的多种方法确定抗体或其片段与FcγRIII和FcγRIIb的结合亲和力。然而，特别通过相同的方法来获得某抗体或其片段与FcγRIII和FcγRIIb的结合亲和力，以确定FcγRIII和FcγRIIb结合亲和力相同的方法来获得。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRI的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI结合。还优选的是，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIII结合。最优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含人FcγRIIa的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa结合。
特别地，改善的FcγRIIa/FcγRIIb结合比强烈提高了抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP；Richards JO,Karki S,Lazar GA,Chen H,Dang W,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophagephagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther 7:2517–2527)并且有利于对诱导肿瘤免疫具有积极作用的DC的激活和成熟(Boruchov AM,Heller G,Veri MC,Bonvini E,Ravetch JV,Young JW(2005)Activating and inhibitory IgG Fc receptors on humanDCs mediate opposing functions.J Clin Invest115:2914–2923；Kalergis AM,RavetchJV(2002)Inducing tumor immunity through the selective engagement ofactivating Fcgamma receptors on dendritic cells.J Exp Med 195:1653–1659)。特别地，Richards等,2008，表明以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa结合的抗体介导巨噬细胞对抗体包被靶细胞的增强的吞噬作用(Richards JO,Karki S,Lazar GA,Chen H,Dang W,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding to FcgammaRIIaenhances macrophage phagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther 7:2517–2527)。因此，以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa结合的根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段引发肿瘤细胞的增强的巨噬细胞吞噬作用。优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa的R131形式结合。
与人FcγRIIb相比对人FcγRIIa具有更高亲和力的示例性抗体是本领域已知的。例如，Richards等,2008，描述了一种IgG1变体，其包含G236A替换，导致FcγRIIa/FcγRIIb比显著提高(Richards JO,Karki S,Lazar GA,Chen H,Dang W,Desjarlais JR(2008)Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophagephagocytosis of tumor cells.Mol Cancer Ther 7:2517–2527)。此外，Lindhofer等,2011描述了具有小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区的抗体，其也显示出高FcγRIIa/FcγRIIb比(Lindhofer H,Hess J,Ruf P.Trifunctionalantibodies for cancertherapy.In:Kontermann RE(编辑),Bispecific antibodies.Springer,Berlin,2011,第289至312页)，并因此显示出巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用增强，以及肿瘤细胞的直接杀伤提高。
虽然仅FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII结合位点是足够的，但优选的是，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含Fc部分，特别是Fc区。
如本文所用，术语“Fc部分”是指来源于免疫球蛋白重链部分的序列，其开始于紧邻木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区并终止于免疫球蛋白重链的C末端。特别地，“Fc部分”包含FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点。优选地，“Fc部分”包含FcγRIIa的结合位点。然而，还优选的是，Fc部分可介导不同于与Fc受体结合的功能，例如与补体系统的蛋白质结合。在这种情况下，FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点可与Fc部分分开存在于抗体中。因此，“Fc部分”可以是完整Fc区或其部分(例如，结构域)。优选地，“Fc部分”介导完整Fc区的全部功能，例如，包括Fc受体结合和任选地与来自补体系统的蛋白质结合。因此，根据本发明使用的抗体优选包含完整Fc区，其中完整Fc区包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。相对于天然存在的Fc区，Fc部分还可以包含一个或更多个氨基酸插入、缺失或替换。例如，铰链结构域、CH2结构域或CH3结构域(或其部分)中的至少一个可以缺失。例如，Fc部分可以包含以下或由以下组成：(i)与CH2结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)；(ii)与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)；(iii)与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)；(iv)铰链结构域(或其部分)；(v)CH2结构域(或其部分)；或者(vi)CH3结构域或其部分。优选地，Fc部分包含G236A替换。
优选地，抗体或其片段的Fc部分/Fc区与Fc受体阳性细胞结合，所述Fc受体阳性细胞优选至少表达FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII，更优选至少表达FcγRIIa。
优选地，根据本发明使用的抗体(或其片段)中人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点(特别是Fc部分)是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b。这意味着抗体(或其片段)中有助于与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合的那些部分是小鼠IgG2a和/或大鼠IgG2b序列。特别地，抗体(或其片段)包含小鼠IgG2a和/或大鼠IgG2b的人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点(特别是Fc部分)。本领域技术人员公知小鼠IgG2a和大鼠IgG2b包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点(特别是Fc部分)，因为已批准用于人的公知抗体如卡妥索单抗(catumaxomab)包含小鼠IgG2a/大鼠IgG2b的Fc部分。因此，两者((i)小鼠IgG2a的人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点，特别是Fc部分；和(ii)大鼠IgG2b的人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点，特别是Fc部分)的组合是优选的，例如如本文所述的异源抗体所提供的。最优选地，所述抗体或其片段包含小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区。这尤其意味着抗体的Fc区由(i)小鼠IgG2a Fc区链和(ii)大鼠IgG2b Fc区链组成。特别地，抗体的一条(重)链包含小鼠IgG2a重链的Fc区，而抗体的另一条(重链)包含大鼠IgG2b重链的Fc区，并且两者一起形成如本文所述的抗体的Fc区(称为“小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区”)。这样的抗体显示出选择性增强的与激活FcγRIIa的结合，但不是与抑制性对应物FcγRIIb(Lindhofer H,Hess J,Ruf P.Trifunctional antibodies for cancertherapy.In:Kontermann RE(编辑),Bispecific antibodies.Springer,Berlin,2011,第289至312页)。
抗体形式
根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以是任何抗体形式，只要其包含如上所述的至少两种特异性和如上所述的FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合位点即可。特别地，多功能抗体优选涵盖“完整”抗体，例如完整IgG-或IgG样分子，而在本发明上下文中抗原结合片段优选是指小的重组形式，例如串联单链可变片段分子(taFv)、双抗体(Db)、单链双抗体(scDb)和这些的多种其他衍生物(如由以下所述：Byrne H.等(2013)TrendsBiotech,31(11):621-632，其图2示出了多种双特异性抗体形式；Weidle U.H.等(2013)Cancer Genomics and Proteomics 10:1-18，特别是图1；以及Chan,A.C.和Carter,P.J.(2010)Nat Rev Immu 10:301-316，特别是图3)。优选的实例包括但不限于Triomabs和四价体瘤(quadroma)抗体。
因此，根据本发明使用的抗体或骨架结构或其抗原结合片段可以选自包含以下的组：Triomabs；杂交杂交瘤(四价体瘤)；多特异性anticalin平台(Pieris)；双抗体；单链双抗体；串联单链Fv片段；TandAbs，三特异性Ab(Affimed)(105至110kDa)；Darts(双亲和重定向；Macrogenics)；多功能重组抗体衍生物(110kDa)；Dock and lock平台；Knob into hole(KIH)平台；人源化双特异性IgG抗体(REGN1979)(Regeneron)；Mab2双特异性抗体(F-Star)；DVD-Ig＝双可变结构域免疫球蛋白(Abbvie)；κ-λ体；TBTI＝四价双特异性串联Ig；和CrossMab。
根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以选自包含以下的双特异性IgG样抗体(BsIgG)：CrossMab；DAF(二合一)；DAF(四合一)；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes共同LC；Knobs-in-holes组装；Charge pair；Fab臂交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-体；和正交Fab。这些双特异性抗体形式显示并描述于例如Spiess C.,Zhai Q.和CarterP.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1及相应描述例如第95至101页中。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以选自附加IgG的抗体，其中额外的抗原结合部分包括：DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；和DVI-IgG(四合一)。这些双特异性抗体形式显示并描述于例如Spiess C.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1及相应描述例如第95至101页中。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以选自包含以下的双特异性抗体片段：sc-双抗体-CH3；双抗体CH3；微抗体；TriBi微抗体；scFv-CH3KIH；scFv-KIH；Fab-scFv-Fc；四价HCAb；sc双抗体-Fc；双抗体-Fc；串联scFv-Fc；和胞内抗体。这些双特异性抗体形式显示并描述于例如Spiess C.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)MolecularImmunology 67:95-106，特别是图1及相应描述例如第95至101页中。
特别地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段可以选自包含IgG-IgG和Cov-X-Body的双特异性抗体缀合物。这些双特异性抗体形式显示并描述于例如Spiess C.,ZhaiQ.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1及相应描述例如第95至101页中。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是双特异性三功能抗体。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段具有IgG样形式(基于IgG，也称为“IgG型”)，其中具有IgG样形式的抗体通常包含两条重链和两条轻链。通常，免疫球蛋白G(IgG)被认为是一种类型的抗体。本文将其理解为由以抗体单体典型的Y形排列的四条肽链(两条相同的重链和两条相同的轻链)构成的蛋白质复合物。每个IgG通常具有两个抗原结合位点，其可以是不同的或相同的。IgG代表了人中约75％的血清抗体，是循环中最常见的抗体类型。在生理学上，IgG分子由血浆B细胞产生和释放。
具有IgG样形式的抗体的实例包括四价体瘤和多种IgG-scFv形式(参见：Byrne H.等(2013)Trends Biotech,31(11):621-632；图2A至2E)，其中优选四价体瘤，其优选通过两个不同的杂交瘤融合而产生。在IgG类别中，抗体可优选基于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类，其中基于IgG1(也称为“IgG1型”)或IgG2(也称为“IgG2型”)的抗体是优选的。根据本发明使用的多功能抗体或抗原结合片段可替代地基于任何免疫球蛋白类别(例如IgA、IgG、IgM等)和亚类(例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)。
优选的双特异性IgG样抗体形式包括例如杂交杂交瘤(四价体瘤)、具有共同轻链的knobs-into-holes、多种IgG-scFv形式、多种scFv-IgG形式、二合一IgG、双V结构域IgG、IgG-V和V-IgG，其示于例如Chan,A.C.和Carter,P.J.(2010)Nat Rev Immu 10:301-316的图3c中，并描述于所述文章中。另一些优选的双特异性IgG样抗体形式包括例如DAF、CrossMab、IgG-dsscFv、DVD、IgG-dsFV、IgG-scFab、scFab-dsscFv和Fv2-Fc，其示于WeidleU.H.等(2013)Cancer Genomics and Proteomics 10:1–18的图1A中，并描述于所述文章中。另一些优选的双特异性IgG样抗体形式包括例如DAF(二合一)；DAF(四合一)；DutaMab；DT-IgG；Knobs-in-holes组装；Charge pair；Fab臂交换；SEEDbody；Triomab；LUZ-Y；Fcab；κλ-体；正交Fab；DVD-IgG；IgG(H)-scFv；scFv-(H)IgG；IgG(L)-scFv；scFV-(L)IgG；IgG(L,H)-Fv；IgG(H)-V；V(H)-IgG；IgG(L)-V；V(L)-IgG；KIH IgG-scFab；2scFv-IgG；IgG-2scFv；scFv4-Ig；scFv4-Ig；Zybody；和DVI-IgG(四合一)，其示出并描述于例如Spiess C.,ZhaiQ.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106，特别是图1及相应描述例如第95至101页中。
一般来说，抗体的产生方法是本领域已知的。来源于哺乳动物例如人、大鼠、小鼠、兔、山羊或绵羊的单克隆抗体可通过常规方法产生，如以下中所述：和Milstein(Nature 256(1975),495)，Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual(1988),ColdSpring Harbor)或Galfie(Meth.Enzymol.73(1981),3)或DE 195 31 346。特别地，根据本发明使用的多功能抗体或其抗原结合片段可以通过三种主要方法产生：(i)化学缀合，其涉及化学交联；(ii)两种不同杂交瘤细胞系的融合(例如，如Milstein等,Nature 305(1983),537中所述)；或(iii)涉及重组DNA技术的遗传方法(例如，如Kurucz等,J.Immunol.154(1995),4576；Holliger等,Proc.Natl.Acad.Sc.USA 90(1993),6444中所述)。
优选地，抗体可以通过两种不同杂交瘤细胞系的融合来获得(例如，如Milstein等,Nature 305(1983),537中所述)。因此，将各自产生具有一种期望的特异性的抗体的不同杂交瘤细胞系融合并且在产生异源抗体群的细胞克隆(“四价体瘤”)之中，可以确定和分离分泌期望的多功能抗体的这样的四价体瘤(或“杂交-杂交瘤”)。
替代方法包括两种不同mAb和/或较小抗体片段的化学缀合。发现连接两种不同抗体或抗体片段的氧化重缔合策略是低效的，因为在多个天然二硫键的再氧化过程中存在副反应。目前用于化学缀合的方法集中于使用同源或异源双功能交联试剂。
重组DNA技术通过人工操作基因产生了最大范围的多功能抗体，并代表了最多样化的抗体产生方法(参见Byrne H.等(2013)Trends Biotech,31(11):621-632)。因此，多功能抗体特别是通过重组DNA技术或通过(杂交)杂交瘤技术获得。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是异源抗体或异源抗体片段。如本文所用，术语“异源”意指抗体或其抗原结合片段包含不同免疫球蛋白亚类(例如人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；例如小鼠和大鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)和/或不同来源(物种)的重链。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段包含来源于大鼠和/或小鼠的重链。“来源”于大鼠和/或小鼠特别意指抗体重链CH3部分的氨基酸序列，优选抗体重链Fc区的氨基酸序列与大鼠和/或小鼠免疫球蛋白重链的CH3部分或Fc区分别具有至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％、并且最优选100％的序列同一性。
因此，“来源”于大鼠和/或小鼠的抗体还包括包含以下重量的抗体：所述重链与大鼠和/或小鼠免疫球蛋白重链在其整个长度上具有至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％、并且最优选100％序列同一性。此外，还优选的是，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是大鼠和/或小鼠抗体或抗原结合片段。这意味着抗体或抗原结合片段包含的所有重链和轻链分别与大鼠和/或小鼠免疫球蛋白重链或轻链具有至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％、并且最优选100％序列同一性。
然而，由于根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段优选用于人对象，所以优选的是，重链(和轻链)可变区的至少三个CDR(互补决定区)和/或框架区是人来源的或人源化的，以确保针对(人)T细胞表面抗原的特异性和针对(人)癌和/或肿瘤相关抗原的特异性。因此，根据本发明使用的优选抗体或其抗原结合片段包含具有以下的重链：(i)CH3部分，优选Fc区，其与大鼠和/或小鼠免疫球蛋白重链的CH3部分或Fc区分别具有至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％、并且最优选100％的序列同一性；和(ii)重链可变区的至少三个CDR(互补决定区)和/或框架区是人来源的或人源化的。更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段的两条重链都具有(i)CH3部分，优选Fc区，其与大鼠和/或小鼠免疫球蛋白重链的CH3部分或Fc区分别具有至少95％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％、并且最优选100％的序列同一性；和(ii)重链可变区的至少三个CDR(互补决定区)和/或框架区是人来源的或人源化的。此外，轻链可变区的至少三个CDR(互补决定区)和/或框架区优选是人来源的或人源化的。
特别优选地，所述抗体是大鼠/小鼠抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“大鼠/小鼠抗体”是指包含以下的抗体：
(a)(重)链，其与大鼠(重)链的不同之处仅在于重链可变区的三个CDR和/或框架区是人来源的或人源化的(即，除CDR和/或框架区之外的所有序列都是大鼠(重)链序列)；和
(b)(重)链，其与小鼠(重)链的不同之处仅在于重链可变区的三个CDR和/或框架区是人来源的或人源化的(即，除CDR和/或框架区之外的所有序列都是小鼠(重)链序列)。
最优选地，所述抗体是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“小鼠IgG2a/大鼠IgG2b抗体”是指包含以下的抗体：
(a)(重)链，其与大鼠IgG2b(重)链的不同之处仅在于重链可变区的三个CDR和/或框架区是人来源的或人源化的(即，除了CDR和/或框架区之外的所有序列都是大鼠IgG2b(重)链序列)；和
(b)(重)链，其与小鼠IgG2a(重)链的不同之处仅在于重链可变区的三个CDR和/或框架区是人来源的或人源化的(即，除了CDR和/或框架区之外的所有序列都是小鼠IgG2a(重)链序列)。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段选自以下同种型组合中的一种或更多种(其中每种同种型/组合特别意指至少CDR和/或框架区、优选可变区优选地是人来源的或人源化的-即使同种型仅指大鼠/小鼠)：
—大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a，
—大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2b，
—大鼠-IgG2b/小鼠-IgG3，
—大鼠-IgG2b/人-IgG1，
—大鼠-IgG2b/人-IgG2，
—大鼠-IgG2b/人-IgG3[东方同种异型G3m(st)＝与蛋白质A结合]，
—大鼠-IgG2b/人-IgG4，
—大鼠-IgG2b/大鼠-IgG2c，
—小鼠-IgG2a/人-IgG3[高加索同种异型G3m(b+g)＝不与蛋白质A结合，以下用*标记]，
—小鼠-IgG2a/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—小鼠-IgG2a/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—小鼠-IgG2a/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链]-人-IgG4[CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链-CH2-CH3]，
—大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG2-[铰链-CH2-CH3]，
—大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG3-[铰链-CH2-CH3，东方同种异型]，
—大鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链-CH2-CH3]，
—人-IgG1/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*[CH2-CH3]，
—人-IgG1/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG4[CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—人-IgG1/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG4[CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—人-IgG1/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG2[CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—人-IgG1/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG2CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—人-IgG1/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—人-IgG1/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—人-IgG2/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG2-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—人-IgG4/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—人-IgG4/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链]-人-IgG4[CH2的N-末端区]-人-IgG3*[CH2的C-末端区：>第251位氨基酸]-人-IgG3*[CH3]，
—小鼠-IgG2b/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
—小鼠-IgG2b/人-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*[CH2-CH3]，
—小鼠-IgG2b/小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人-IgG3*-[CH2-CH3]，
小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*-[CH3]，
—人-IgG1/大鼠[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1[铰链]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*[CH3]，
—人-IgG1/小鼠[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1[铰链]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*[CH3]，和
—人-IgG4/人[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG4-[铰链]-人-IgG4-[CH2]-人-IgG3*-[CH3]。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是IgG型(也称为“IgG样”)抗体，其包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，特别是Fc区。更优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段是三功能双特异性抗体，其是包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，特别是Fc区的异源大鼠/小鼠抗体。因此，具有小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的亚类组合的抗体是优选的。特别优选的是这样的异源大鼠/小鼠抗体：其包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，特别是Fc区，并具有由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b亚类组成的重链，各自优选具有相应的轻链。
对于包含人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，特别是Fc区，并具有由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b亚类组成的重链的抗体，特别是对于Triomab形式的抗体，显示这样的抗体以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRIIa结合，并显示出显著提高的FcγRIIa/FcγRIIb结合比(Lindhofer H,Hess J,Ruf P.Trifunctional antibodies for cancer therapy.In:Kontermann RE(编辑),Bispecificantibodies.Springer,Berlin,2011,第289至312页)。因此，这样的抗体导致巨噬细胞对抗体包被的肿瘤细胞的吞噬作用增强，并且肿瘤细胞的直接杀伤提高。因此，这样的抗体是特别优选的。
一般来说，根据本发明使用的多功能抗体优选在其Fc区显示以下同种型组合中的一种：大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2a、大鼠-IgG2b/小鼠-IgG2b、大鼠-IgG2b/人-IgG1、或小鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1/大鼠-[VH-CH1,VL-CL]-人-IgG1-[铰链]-人IgG3*-[CH2-CH3]，其中*＝高加索同种异型G3m(b+g)＝不与蛋白A结合。
最优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段具有Triomab形式。Triomab是具有针对CD3的特异性和针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性的三功能双特异性IgG样抗体。这些嵌合体由源于亲本小鼠IgG2a和大鼠IgG2b同种型的两个半抗体组成，每个半抗体具有一条轻链和一条重链。因此，Triomab的Fc区是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b。
优选地，根据本发明使用的抗体或其抗原结合片段选自卡妥索单抗(抗CD3x抗EpCAM)、FBTA05/lymphomun(抗CD3x抗CD20)、ertumaxomab(抗CD3x抗HER2/neu)、和/或ektomun(抗CD3x抗GD2)，优选地抗体是卡妥索单抗和/或ektomun。
三功能双特异性抗体的最优选实例是卡妥索单抗(抗EpCAM x抗CD3)。2009年，EMA批准用于治疗恶性腹水(Linke等Catumaxomab–clinicaldevelopment and future directions.(2010)mAbs 2:2)。三功能双特异性抗体的另一些优选实例包括(i)FBTA05(也称为“lymphomun”)，三功能抗CD3x抗CD20抗体；(ii)ertumaxomab，三功能抗CD3x抗HER2抗体；(iii)ektomun，三功能抗CD3x抗GD2抗体；和(iv)TRBs02，对人黑素瘤具有特异性的三功能抗体(Ruf等(2004)Int J Cancer,108:725-732)。
免疫检查点调节剂
如本文(即在本说明书通篇)所用，术语“免疫检查点调节剂”(也称为“检查点调节剂”)是指调节(例如，完全或部分地降低、抑制、干扰、激活、刺激、提高、增强或支持)一种或更多种检查点分子的功能的分子或化合物。因此，免疫检查点调节剂可以是“免疫检查点抑制剂”(也称为“检查点抑制剂”或“抑制剂”)或“免疫检查点激活剂”(也称为“检查点激活剂”或“激活剂”)。“免疫检查点抑制剂”(也称为“检查点抑制剂”或“抑制剂”)完全或部分地降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点分子的功能。“免疫检查点激活剂”(也是被称为“检查点激活剂”或“激活剂”)完全或部分地激活、刺激、提高、增强、支持或正调节一种或更多种检查点分子的功能。免疫检查点调节剂通常能够调节免疫应答的(i)自身耐受性和/或(ii)大小和/或持续时间。优选地，根据本发明使用的免疫检查点调节剂调节一种或更多种人检查点分子的功能，并因此是“人检查点调节剂”。优选地，免疫检查点调节剂是选自以下的一种或更多种免疫检查点分子的激活剂或抑制剂：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA(CD272)、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、GITR、TNFR和/或FasR/DcR3；或者其一种或更多种配体的激活剂或抑制剂。
检查点分子(也称为“免疫检查点分子”或“免疫检查点”)是通常参与免疫途径，并且例如调节T细胞激活、T细胞增殖和/或T细胞功能的分子，例如蛋白质。因此，由检查点调节剂调节(例如，完全或部分地降低、抑制、干扰、激活、刺激、提高、增强或支持)的检查点分子的功能通常是T细胞激活、T细胞增殖和/或T细胞功能(的调节)。因此，免疫检查点分子调节并维持生理免疫应答的自身耐受性以及持续时间和大小。许多免疫检查点分子属于B7:CD28家族或者属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并且其通过与特定配体结合激活被募集至细胞质结构域的信号传导分子(参见Susumu Suzuki等,2016:Current status ofimmunotherapy.Japanese Journal of Clinical Oncology,2016:doi:10.1093/jjco/hyv201[印刷前的电子版]；特别是表1)。
B7:CD28家族包含免疫检查点研究中最频繁靶向的途径，包括CTLA-4-B7-1/B7-2途径和PD-1-B7-H1(PDL1)/B7-DC(PD-L2)途径。该家族的另一名成员是ICOS-ICOSL/B7-H2。该家族的其他成员包括CD28、B7-H3和B7-H4。
CD28在几乎所有的人CD4+T细胞和约一半的所有CD8T细胞上组成性表达。与其在树突细胞上表达的两种配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的结合促进T细胞扩增。共刺激性检查点分子CD28与抑制性检查点分子CTLA4竞争相同的配体CD80和CD86(参见BuchbinderE.I.和Desai A.,2016:CTLA-4 and PD-1 Pathways–Similarities,Differences andImplications of Their Inhibition；American Journal of Clinical Oncology,39(1):98-106)。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4；也称为CD152)是对B7具有高得多的结合亲和力的CD28同源物。与CD28类似，CTLA-4的配体是CD80(B7-1)和CD86(B7-2)。然而，与CD28不同，CTLA4与B7的结合不会产生刺激信号，但会阻止通常由CD28提供的共刺激信号。此外，假设CTLA4与B7的结合甚至产生抵消CD28:B7和TCR:MHC结合的刺激信号的抑制信号。CTLA-4被认为是抑制性免疫检查点的“前导”，因为其在初始T细胞激活的初始阶段(通常在淋巴结中)使潜在的自身反应性T细胞停止(Buchbinder E.I.和Desai A.,2016:CTLA-4 andPD-1 Pathways:Similarities,Differences and Implications of Their Inhibition；American Journal of Clinical Oncology,39(1):98-106)。CTLA4的优选检查点抑制剂包括单克隆抗体(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)。另一些优选的CTLA-4抑制剂包括在WO 2001/014424、WO 2004/035607、US2005/0201994和EP 1212422 B1中公开的抗CTLA4抗体。另外优选的CTLA-4抗体描述于US5,811,097、US 5,855,887、US 6,051,227、US 6,984,720、WO 01/14424、WO 00/37504、US2002/0039581和US 2002/086014中。可以在本发明的上下文中使用的其他优选的抗CTLA-4抗体包括，例如，在WO 98/42752；US 6,682,736和US 6,207,156；Hurwitz等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等,J.Clin.Oncology,22(145):Abstract No.2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等,Cancer Res.,58:5301-5304(1998)，在US 5,977,318、US 6,682,736、US 7,109,003和US 7,132,281中公开的那些抗CTLA-4抗体。在本发明的上下文，CTLA-4是特别优选的检查点分子。
程序性死亡1受体(PD1)具有两种配体，PD-L1(也称为B7-H1和CD274)和PD-L2(也称为B7-DC和CD273)。PD1途径在免疫应答的后期调节先前激活的T细胞，主要在外周组织中。因此，靶向PD1的优点是其可以恢复肿瘤微环境中的免疫功能。优选的PD1途径抑制剂包括(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)、(派姆单抗；Merck)、Durvalumab(MedImmune/AstraZeneca)、MEDI4736(AstraZeneca；参见WO 2011/066389A1)、Atezolizumab(MPDL3280A、Roche/Genentech；参见US 8,217,149 B2)、Pidilizumab(CT-011；CureTech)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)、Avelumab(Merck)、MSB-0010718C(Merck)、PDR001(Novartis)、BMS-936559(Bristol Myers Squibb)、REGN2810(RegeneronPharmaceuticals)、MIH1(Affymetrix)、AMP-224(Amplimmune、GSK)、BGB-A317(BeiGene)和Lambrolizumab(例如在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17；Hamid等,2013；N.Engl.J.Med.369:134-144)。
诱导型T细胞共刺激分子(ICOS；也称为CD278)在激活的T细胞上表达。其配体是主要在B细胞和树突细胞上表达的ICOSL(B7-H2；CD275)。该分子似乎在T细胞效应功能中很重要。
B7-H3(也称为CD276)最初被理解为共刺激性分子，但现在被认为是共抑制性的。B7-H3的优选检查点抑制剂是Fc优化的单克隆抗体Enoblituzumab(MGA271；MacroGenics；参见US 2012/0294796A1)。
B7-H4(也称为VTCN1)由肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞表达，并在肿瘤逃逸中发挥作用。优选的B7-H4抑制剂是在Dangaj,D.等,2013；Cancer Research 73(15):4820-9中和在Jenessa B.Smith等,2014:B7-H4 as a potential target for immunotherapy forgynecologic cancers:A closer look.Gynecol Oncol 134(1):181–189的表1及相应描述中所述的抗体。B7-H4抑制剂的其他优选实例包括如例如在WO 2013/025779 A1和WO 2013/067492 A1中公开的人B7-H4的抗体，或可溶性重组形式的B7-H4的抗体，例如在US 2012/0177645 A1中所公开的。
TNF超家族特别包含与29种细胞因子受体结合的19种蛋白质-配体。它们参与许多生理反应，例如细胞凋亡、炎症或细胞存活(Croft,M.,C.A.Benedict,和C.F.Ware,Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies.Nat Rev Drug Discov,2013.12(2):第147至68页)。以下检查点分子/途径对于癌症指征是优选的：TNFRSF4(OX40/0X40L)、TNFRSFS(CD40L/CD40)、TNFRSF7(CD27/CD70)、TNFRSF8(CD30/CD30L)、TNFRSF9(4-1BB/4-1BBL)、TNFRSF10(TRAILR/TRAIL))、TNFRSF12(FN14/TWEAK)、TNFRSF13(BAFFRTACI/APRIL-BAFF)和TNFRSF18(GITR/GITRL)。另一些优选的检查点分子/途径包括Fas-配体和TNFRSF1(TNFα/TNFR)。此外，B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)/疱疹病毒进入介质(HVEM)途径对于增强免疫应答是优选的，就像CTLA-4阻断一样。因此，在本发明的上下文中，这样的检查点调节剂优选用于癌症的治疗和/或预防，其调节选自以下的一种或更多种检查点分子：TNFRSF4(OX40/0X40L)、TNFRSFS(CD40L/CD40)、TNFRSF7(CD27/CD70)、TNFRSF9(4-1BB/4-1BBL)、TNFRSF18(GITR/GITRL)、FasR/DcR3/Fas配体、TNFRSF1(TNFα/TNFR)、BTLA/HVEM和CTLA4。
OX40(也称为CD134或TNFRSF4)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增，但其也能够抑制T调节细胞的分化和活性并调节细胞因子的产生。OX40的配体是OX40L(也称为TNFSF4或CD252)。OX40在T细胞受体接合后瞬时表达，并且仅在炎性病变内最近的抗原激活的T细胞上上调。OX40的优选检查点调节剂包括MEDI6469(MedImmune/AstraZeneca)、MEDI6383(MedImmune/AstraZeneca)、MEDI0562(MedImmune/AstraZeneca)、MOXR0916(RG7888；Roche/Genentech)和GSK3174998(GSK)。
CD40(也称为TNFRSF5)由多种免疫系统细胞(包括抗原呈递细胞)表达。其配体是CD40L，也称为CD154或TNFSF5，其在激活的CD4+T细胞表面瞬时表达。CD40信号传导“允许”树突细胞成熟，并从而触发T细胞激活和分化。然而，CD40也可以由肿瘤细胞表达。因此，癌症患者中CD40的刺激/激活可能是有益的或有害的。因此，开发了该免疫检查点的刺激性和抑制性调节剂(Sufia Butt Hassan,Jesper Freddie Barbara Nicola Olsen和Anders Elm Pedersen,2014:Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy:an update ofrecent and ongoing clinical trials,Immunopharmacology and Immunotoxicology,36:2,96-104)。CD40检查点调节剂的优选实例包括(i)如Sufia Butt Hassan,JesperFreddie Barbara Nicola Olsen和Anders Elm Pedersen,2014:Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy:an update of recent and ongoing clinicaltrials,Immunopharmacology and Immunotoxicology,36:2,96-104中所述的激动性(agonistic)抗CD抗体，例如Dacetuzumab(SGN-40)、CP-870893、FGK 4.5/FGK 45和FGK115，优选Dacetuzumab；以及(ii)如Sufia Butt Hassan,Jesper Freddie BarbaraNicola Olsen和Anders Elm Pedersen,2014:Anti-CD40-mediated cancerimmunotherapy:an update of recent and ongoing clinical trials,Immunopharmacology and Immunotoxicology,36:2,96-104中所述的拮抗性抗CD抗体，例如Lucatumumab(HCD122，CHIR-12.12)。CD40的另一些优选的免疫检查点调节剂包括SEA-CD40(Seattle Genetics)、ADC-1013(Alligator Biosciences)、APX005M(Apexigen Inc)和RO7009789(Roche)。
CD27(也称为TNFRSF7)支持初始T细胞的抗原特异性扩增，并在T细胞记忆的产生中发挥着重要作用。CD27也是B细胞的记忆标志物。其配体CD70(也称为TNFSF7或CD27L)在淋巴细胞和树突细胞上的瞬时可用性调节CD27的活性。此外，已知CD27共刺激抑制Th17效应细胞功能。CD27的优选免疫检查点调节剂是Varlilumab(Celldex)。CD70的优选免疫检查点调节剂包括ARGX-110(arGEN-X)和SGN-CD70A(Seattle Genetics)。
CD137(也称为4-1BB或TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并且与激活的T细胞的共刺激活性越来越相关。特别地，CD137信号传导(通过其配体CD137L，也称为TNFSF9或4-1BBL)引起T细胞增殖并保护T细胞(特别是CD8+T细胞)免于激活诱导的细胞死亡。CD137的优选检查点调节剂包括PF-05082566(Pfizer)和Urelumab(BMS)。
糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR，也称为TNFRSF18)促进T细胞扩增，包括Treg扩增。GITR的配体(GITRL，TNFSF18)主要在抗原呈递细胞上表达。GITR的抗体已显示出通过丧失Treg谱系稳定性来促进抗肿瘤反应。GITR的优选检查点调节剂包括BMS-986156(Bristol Myers Squibb)、TRX518(GITR Inc)和MK-4166(Merck)。
待调节的另一种优选的检查点分子是BTLA。B和T淋巴细胞弱化子(BTLA；也称为CD272)特别是由CD8+T细胞表达，其中在人CD8+T细胞从初始向效应细胞表型的分化过程中BTLA的表面表达逐渐下调。然而，肿瘤特异性人CD8+T细胞表达高水平的BTLA。在T细胞激活期间诱导BTLA表达，并且BTLA在Th1细胞但不在Th2细胞上保持表达。与PD1和CTLA4一样，BTLA与B7同源物B7H4相互作用。然而，与PD-1和CTLA-4不同，BTLA通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)的相互作用显示出T细胞抑制，而不只是细胞表面的B7家族受体。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，TNFRSF14也称为疱疹病毒进入介质(HVEM；Herpesvirus Entry Mediator，也称为CD270)。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。优选的BTLA抑制剂是Alison Crawford和E.John Wherry,2009:Editorial:Therapeuticpotential of targeting BTLA.Journal of Leukocyte Biology 86:5-8的表1中所述的抗体，特别是其人抗体。本上下文中，阻断人BTLA与其配体相互作用的另一些优选的抗体公开于WO 2011/014438中，例如WO 2011/014438中所述的“4C7”。
另一个检查点分子家族包括与两个主要类型的主要组织相容性复合体(MHC)分子(MHC I类和II类)相关的检查点分子。该家族包括I类的杀伤lg样受体(KIR)和II类的淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是自然杀伤细胞上MHC I类分子的受体。KIR的示例性抑制剂是单克隆抗体Lirilumab(IPH 2102；Innate Pharma/BMS；参见US 8,119,775B2和Benson等,2012,Blood 120:4324-4333)。
淋巴细胞激活基因-3(LAG3，也称为CD223)信号传导通过对Treg的作用以及对CD8+T细胞的直接作用导致免疫应答的抑制。LAG3抑制剂的优选实例是抗LAG3单克隆抗体BMS-986016(Bristol-Myers Squibb)。LAG3抑制剂的其他优选实例包括如WO 2009/044273 A2和Brignon等,2009,Clin.Cancer Res.15:6225-6231中公开的LAG525(Novartis)、IMP321(Immutep)和LAG3-Ig，以及阻断人LAG3的小鼠或人源化抗体(例如，如WO 2008/132601 A1中所述的IMP701)，或阻断人LAG3的完全人抗体(例如EP 2320940 A2中所公开的)。
另一种检查点分子途径是TIM-3/GAL9途径。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3，也称为HAVcr-2)在激活的人CD4+T细胞上表达并调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3通过在与其配体半乳糖凝集素-9(GAL9)相互作用时引起细胞死亡来充当Th1/Tc1功能的负调节物。TIM-3是T辅助1型特异性细胞表面分子，其调节外周耐受的诱导。近期研究确实证明TIM-3抗体可显著增强抗肿瘤免疫(Ngiow,S.F.,等,Anti-TIM3 antibodypromotes T cell IFN-gammamediated antitumor immunity and suppressesestablished tumors.Cancer Res,2011.71(10):第3540至51页)。TIM-3抑制剂的优选实例包括人TIM3的抗体(例如，如WO 2013/006490A2中所公开的)，或特别是如由Jones等,2008,J Exp Med.205(12):2763-79所公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2。
CEACAM1(癌胚抗原相关细胞黏附分子1)是另一种检查点分子(Huang,Y.H.,等,CEACAM1 regulates TIM-3-mediated tolerance and exhaustion.Nature,2015.517(7534):第386至90页；Gray-Owen,S.D.和R.S.Blumberg,CEACAM1:contact-dependentcontrol of immunity.Nat Rev Immunol,2006.6(6):第433至46页)。CEACAM1的优选检查点调节剂是CM-24(cCAM生物治疗药物)。
另一种免疫检查点分子是GARP，其在肿瘤逃脱患者的免疫系统的能力中发挥作用。目前在临床试验中，候选物(ARGX-115)似乎表现出有趣的效果。因此，ARGX-115是优选的GARP检查点调节剂。
此外，多个研究组已经证明，作为磷脂酰丝氨酸(也称为“PS”)的另一种检查点分子也可被靶向用于癌症治疗(Creelan,B.C.,Update on immune checkpoint inhibitorsin lung cancer.Cancer Control,2014.21(1):第80至9页；Yin,Y.,等,Phosphatidylserine-targeting antibody induces Ml macrophage polarization andpromotes myeloid-derived suppressor cell differentiation.Cancer Immunol Res,2013.1(4):第256至68页)。磷脂酰丝氨酸(PS)的优选检查点调节剂是巴维昔单抗(Bavituximab)(Peregrine)。
另一个检查点途径是CSF1/CSF1R(Zhu,Y.,等,CSF1/CSF1R Blockade ReprogramsTumor-Infiltrating Macrophages and Improves Response to T-cell CheckpointImmunotherapy in Pancreatic Cancer Models.Cancer Research,2014.74(18):第5057至5069页)。CSF1R的优选检查点调节剂包括FPA008(FivePrime)、IMC-CS4(Eli-Lilly)、PLX3397(Plexxicon)和RO5509554(Roche)。
此外，评价了CD94/NKG2A自然杀伤细胞受体在宫颈癌(Sheu,B.C.,等,Up-regulation of inhibitory natural killer receptors CD94/NKG2A with suppressedintracellular perforin expression of tumor infiltrating CD8+T lymphocytes inhuman cervical carcinoma.Cancer Res,2005.65(7):第2921至9页)和白血病(Tanaka,J.,等,Cytolytic activity against primary leukemic cells by inhibitory NK cellreceptor(CD94/NKG2A)-expressing T cells expanded from various sources ofblood mononuclear cells.Leukemia,2005.19(3):第486至9页)中的作用。NKG2A的优选检查点调节剂是IPH2201(Innate Pharma)。
另一种优选的检查点分子是IDO，来自犬尿氨酸途径的吲哚胺2,3-双加氧酶(Ball,H.J.,等,Indoleamine 2,3-dioxygenase-2；a new enzyme in the kynureninepathway.Int J Biochem Cell Biol,2009.41(3):第467至71页)。吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。已知IDO抑制T细胞和NK细胞，产生并激活Treg和来源于骨髓的抑制细胞，并促进肿瘤血管生成。IDO1在许多癌症中过表达，并且显示出允许肿瘤细胞逃避免疫系统(Liu,X.,等,Selective inhibition of ID01 effectivelyregulates mediators of antitumor immunity.Blood,2010.115(17):第3520至30页；Ino,K.,等,Inverse correlation between tumoral indoleamine 2,3-dioxygenaseexpression and tumor-infiltrating lymphocytes in endometrial cancer:itsassociation with disease progression and survival.Clin Cancer Res,2008.14(8):第2310至7页)并且当通过局部炎症诱导时促进慢性肿瘤进展(Muller,A.J.,等,Chronicinflammation that facilitates tumor progression creates local immunesuppression by inducing indoleamine 2,3 dioxygenase.Proc Natl Acad Sci US A,2008.105(44):第17073至8页)。优选的IDO抑制剂包括Exiguamine A、epacadostat(INCB024360；InCyte)、Indoximod(NewLink Genetics)、NLG919(NewLink Genetics/Genentech)、GDC-0919(NewLink Genetics/Genentech)、F001287(Flexus Biosciences/BMS)和小分子例如1-甲基-色氨酸(特别是1-甲基-[D]-色氨酸)以及Sheridan C.,2015:IDO inhibitors move center stage in immune-oncology；Nature Biotechnology 33:321-322的表1中列出的IDO抑制剂。
另一种待调节的优选的免疫检查点分子也是犬尿氨酸代谢途径的成员：TDO(色氨酸-2,3-双加氧酶)。数项研究已经证明了TDO对癌症免疫和自身免疫的益处(Garber,K.,Evading immunity:new enzyme implicated in cancer.J Natl Cancer Inst,2012.104(5):第349至52页；Platten,M.,W.Wick,和B.J.Van den Eynde,Tryptophan catabolismin cancer:beyond！DO and tryptophan depletion.Cancer Res,2012.72(21):第5435至40页；Platten,M.,等,Cancer Immunotherapy by Targeting IDOl/TDO and TheirDownstream Effectors.Front Immunol,2014.5:第673页)。
另一种待调节的优选的免疫检查点分子是A2AR。腺苷A2A受体(A2AR)被认为是癌症治疗中的重要检查点，因为肿瘤微环境通常具有相对高浓度的腺苷，其激活A2AR。这样的信号传导在免疫微环境中提供负免疫反馈环(综述参见Robert D.Leone等,2015:A2aRantagonists:Next generation checkpoint blockade for cancerimmunotherapy.Computational and Structural Biotechnology Journal 13:265-272)。优选的A2AR抑制剂包括伊曲茶碱(Istradefylline)、PBS-509、ST1535、ST4206、Tozadenant、V81444、Preladenant、Vipadenant、SCH58261、SYN115、ZM241365和FSPTP。
另一种待调节的优选的免疫检查点分子是VISTA。T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA；也称为C10orf54)主要在造血细胞上表达，因此肿瘤内白细胞上VISTA的一致表达可允许VISTA阻断在广泛的实体肿瘤中有效。优选的VISTA抑制剂是JNJ-61610588(ImmuNext)，其为最近进入了1期临床试验的抗VISTA抗体。
另一种免疫检查点分子是CD122。CD122是白介素-2受体β亚单位。CD122提高CD8+效应T细胞的增殖。
检查点分子的最优选实例包括“CTLA4途径”和“PD1途径”，具有CTLA4及其配体CD80和CD86以及PD1与其配体PD-L1和PD-L2(CTLA4和PD-1途径以及其他参与者的更多细节描述在Buchbinder E.I.和Desai A.,2016:CTLA-4 and PD-1 Pathways–Similarities,Differences and Implications of Their Inhibition；American Journal of ClinicalOncology,39(1):98-106中。更一般地，检查点分子的优选实例包括CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、GITR、TNFR和/或FasR/DcR3以及特别是它们的配体。
然而，还可能优选的是，免疫检查点调节剂不是抗CD28抗体。更优选地，免疫检查点调节剂不针对CD28(即，CD28优选不是如本文限定的免疫检查点调节剂的靶标)。
此外，还可能优选的是，免疫检查点调节剂不是PD-1的抑制剂。更优选地，免疫检查点调节剂不是PD-1途径(也称为“PD-1轴”，其除PD-1本身外还包括其配体PD-L1和PD-L2)的抑制剂/拮抗剂。
免疫检查点分子负责T细胞应答的共刺激性或抑制性相互作用。因此，检查点分子可以分为(i)(共)刺激性检查点分子和(ii)抑制性检查点分子。通常来说，(共)刺激性检查点分子与由抗原刺激诱导的T细胞受体(TCR)信号传导一致地发挥积极作用，而抑制性检查点分子负调节TCR信号传导。(共)刺激性检查点分子的实例包括CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS。抑制性检查点分子的实例包括CTLA4以及PD1及其配体PD-L1和PD-L2；以及A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和FasR/DcR3。
优选地，免疫检查点调节剂是(共)刺激性检查点分子的激活剂或抑制性检查点分子的抑制剂或其组合。因此，免疫检查点调节剂更优选是(i)CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS的激活剂；或者(ii)A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PDL-1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或FasR/DcR3的抑制剂。
如上所述，CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、PD1、PDL-1、PD-L2、IDO、LAG-3、BTLA、TIM3、VISTA、KIR、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或FasR/DcR3调节剂(抑制剂/激活剂)中的许多是已知的，并且它们中的一些已经在临床试验中或甚至经批准。基于这些已知的免疫检查点调节剂，在(不久的)将来可以开发替代的免疫检查点调节剂。特别地，可以使用优选的免疫检查点分子已知的调节剂本身，或者可以使用其类似物，特别是嵌合的、人源化的或人形式的抗体。
更优选地，免疫检查点调节剂是抑制性检查点分子的抑制剂(但优选不是刺激性检查点分子的抑制剂)。因此，免疫检查点调节剂甚至更优选是A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或DcR3或者其配体的抑制剂。
还优选的是，免疫检查点调节剂是刺激性或共刺激性检查点分子的激活剂(但优选不是抑制性检查点分子的激活剂)。因此，免疫检查点调节剂更优选是CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS或其配体的激活剂。
更优选的是，免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂，甚至更优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的抑制剂，并且最优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。CTLA-4的抑制剂是特别优选的。
因此，检查点调节剂可以选自CTLA-4途径和/或PD-1途径已知的抑制剂。CTLA-4途径和PD-1途径的优选抑制剂包括单克隆抗体(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)以及(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)、(派姆单抗；Merck)、Durvalumab(MedImmune/AstraZeneca)、MEDI4736(AstraZeneca；参见WO 2011/066389 A1)、MPDL3280A(Roche/Genentech；参见US 8,217,149 B2)、Pidilizumab(CT-011；CureTech)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)、MSB-0010718C(Merck)、MIH1(Affymetrix)和Lambrolizumab(例如在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17；Hamid等,2013；N.Engl.J.Med.369:134-144)。更优选的检查点抑制剂包括CTLA-4抑制剂(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和/或PD-1抑制剂(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)、(派姆单抗；Merck)、Pidilizumab(CT-011；CureTech)、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)、AMP-224和Lambrolizumab(例如在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409All、h409A16和h409A17；Hamid O.等,2013；N.Engl.J.Med.369:134-144)。
在本发明的上下文中，优选的是使用多于一种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，特别是使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，优选使用2、3、4或5种不同的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，更优选使用2、3或4种不同的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，甚至更优选使用2或3种不同的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，并且最优选使用2种不同的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)。因此，“不同的”免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)特别意指它们调节(例如，抑制)不同的检查点分子途径。
优选地，PD-1途径的抑制剂与CTLA-4途径的抑制剂组合。例如，如上所述，纳武单抗(抗PD1)和伊匹单抗(抗CTLA4)的联合治疗于2015年由FDA批准用于治疗患有BRAF V600野生型、不可切除或转移性黑素瘤的患者。此外，最近报道了Durvalumab(抗PD-L1)和Tremelimumab(抗CTLA4)的组合在非小细胞肺癌中的成功的1b期研究(Antonia,Scott等,2016,Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in non-small cell lung cancer:a multicentre,phase 1b study；Lancet Oncol.2016Feb5.pii:S1470-2045(15)00544-6.doi:10.1016/S1470-2045(15)00544-6.[印刷前的电子版])。因此，PD-1途径和CTLA-4途径的免疫检查点调节剂的优选组合是(i)纳武单抗(抗PD1)和伊匹单抗(抗CTLA4)；或(ii)Durvalumab(MEDI4736；抗PD-L1)和Tremelimumab(抗CTLA4)。其组合例如纳武单抗(抗PD1)和Tremelimumab(抗CTLA4)或Durvalumab(MEDI4736；抗PD-L1)和伊匹单抗(抗CTLA4)也是优选的。
在本发明的上下文中，至少两种不同的免疫检查点调节剂的其他优选组合可以包括选自以下的组合：(i)KIR抑制剂和CTLA-4抑制剂的组合，例如Lirilumab/伊匹单抗；(ii)KIR抑制剂和PD-1途径抑制剂(例如PD-1抑制剂)的组合，例如Lirilumab/纳武单抗；(iii)LAG3抑制剂和PD-1途径抑制剂(例如PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂)的组合，例如如Woo等,2012,Cancer Res.72:917-27或Butler N.S.等,2011,Nat Immunol.13:188-95)中所述，而且这样的组合的优选实例包括Novilumab/BMS-986016和PDR001/LAG525；(iv)靶向ICOS的检查点调节剂和CTLA-4抑制剂的组合，例如如Fu等,2011,Cancer Res.71:5445-54中所述；(v)调节4-1BB的检查点调节剂和CTLA-4抑制剂的组合，例如Curran等,2011,PLoS One 6(4):el 9499中所述；(vi)靶向PD1和CD27的检查点调节剂的组合，例如Novilumab/Varlilumab和Atezolizumab/Varlilumab；(vii)靶向OX40和CTLA-4的检查点调节剂的组合，例如MEDI6469/Tremelimumab；(viii)靶向OX40和PD-1的检查点调节剂的组合，例如MEDI6469/MEDI4736，MOXR0916/MPDL3280A、MEDI6383/MEDI4736和GSK3174998/派姆单抗；(ix)靶向PD-1和4-1BB的检查点调节剂的组合，例如Novilumab/Urelumab、派姆单抗/PF-05082566和Avelumab/PF-05082566；(x)靶向PD-1和IDO的检查点调节剂的组合，例如伊匹单抗/Indoximod、派姆单抗/INCB024360、MEDI4736/INCB024360、MPDL3280A/GDC-0919和Atezolizumab/INCB024360；(xi)靶向PD-1和CSF1R的检查点调节剂的组合，例如派姆单抗/PLX3397、Novilumab/FPA008和MPDL3280A/RO5509554；(xii)靶向PD-1和GITR的检查点调节剂的组合，例如Novilumab/BMS-986156和派姆单抗/MK-4166；(xiii)靶向PD-1和CD40的检查点调节剂的组合，例如MPDL3280A/RO7009789；(xiv)靶向PD-1和B7-H3的检查点调节剂的组合，例如派姆单抗/MGA271；(xv)靶向CTLA-4和B7-H3的检查点调节剂的组合，例如伊匹单抗/MGA271；和(xvi)靶向KIR和4-1BB的检查点调节剂的组合，例如Lirilumab/Urelumab。
最优选地，根据本发明使用的免疫检查点调节剂与T细胞重定向多功能抗体或其片段的组合包含至少(α)CTLA-4的抑制剂和(β)PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂，优选至少(α)CTLA-4的抑制剂和(β)PD-1的抑制剂。这样的优选组合的实例包括(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和(派姆单抗；Merck)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和Durvalumab(MedImmune/AstraZeneca)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和MEDI4736(AstraZeneca；参见WO2011/066389 A1)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和MPDL3280A(Roche/Genentech；参见US 8,217,149 B2)的组合，(伊匹单抗；Bristol MyersSquibb)和Pidilizumab(CT-011；CureTech)的组合，(伊匹单抗；Bristol MyersSquibb)和MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)的组合，(伊匹单抗；Bristol MyersSquibb)和MSB-0010718C(Merck)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和MIH1(Affymetrix)的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和AMP-224的组合，(伊匹单抗；Bristol Myers Squibb)和Lambrolizumab的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和(派姆单抗；Merck)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和Durvalumab(MedImmune/AstraZeneca)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和MEDI4736(AstraZeneca；参见WO 2011/066389 A1)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和MPDL3280A(Roche/Genentech；参见US 8,217,149B2)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和Pidilizumab(CT-011；CureTech)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和MSB-0010718C(Merck)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和MIH1(Affymetrix)的组合，Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和AMP-224的组合以及Tremelimumab(Pfizer/MedImmune)和Lambrolizumab的组合。
在本发明的上下文中，优选的是使用相同检查点途径的多于一种的免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，特别是使用相同检查点途径的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，优选使用相同检查点途径的2、3、4或5种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，更优选使用相同检查点途径的2、3或4种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，甚至更优选使用相同检查点途径的2或3种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)，并且最优选使用相同检查点途径的2种免疫检查点调节剂(例如，检查点抑制剂)。待调节的优选的检查点途径是PD-1途径或CTLA-4途径。例如，MEDI4736和MEDI0680的组合可用来调节特别是抑制PD-1途径。
在本发明的上下文中，免疫检查点调节剂可以是任何种类的分子或试剂，只要其完全或部分地降低、抑制、干扰、激活、刺激、提高、增强或支持如上所述的一种或更多种检查点分子的功能即可。特别地，免疫检查点调节剂与一种或更多种检查点分子(例如检查点蛋白质)或其前体(例如在DNA水平或RNA上)结合，从而调节(例如，完全或部分地降低、抑制、干扰、激活、刺激、提高、增强或支持)种如上所述的一种或更多检查点分子的功能。优选的免疫检查点调节剂是寡核苷酸、siRNA、shRNA、核酶、反义RNA分子、免疫毒素、小分子抑制剂和抗体或其抗原结合片段(例如，检查点分子阻断抗体或抗体片段、拮抗剂抗体或抗体片段、或者激动剂抗体或抗体片段)。
优选地，免疫检查点调节剂是寡核苷酸。这样的寡核苷酸优选用于降低蛋白质表达，特别是用于降低检查点蛋白质(例如上述检查点受体或配体)的表达。寡核苷酸是短DNA或RNA分子，通常包含2至50个核苷酸，优选3至40个核苷酸，更优选4至30个核苷酸，甚至更优选5至25个核苷酸，例如4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。寡核苷酸通常通过固相化学合成在实验室中制备。寡核苷酸可以是单链或双链的，然而，在本发明的上下文中，寡核苷酸优选是单链的。更优选地，检查点调节剂寡核苷酸是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是与所选序列，特别是与选自检查点蛋白质的DNA或RNA序列(或其片段)的序列互补的DNA或RNA的单链。反义RNA通常用于阻止信使RNA链(例如检查点蛋白质的mRNA)的蛋白质翻译，例如，通过与mRNA结合。反义DNA通常用于靶向特定的、互补(编码或非编码)RNA。如果发生结合，这样的DNA/RNA杂合体可以被酶核糖核酸酶H降解。此外，吗啉代-反义寡核苷酸可以用于脊椎动物中的基因敲减。例如，Kryczek等,2006(Kryczek I,Zou L,Rodriguez P,Zhu G,Wei S,Mottram P,等B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophagepopulation in human ovarian carcinoma.J Exp Med.2006；203:871–81)设计了B7-H4特异性吗啉代，其特异性阻断巨噬细胞中B7-H4表达，使得具有肿瘤相关抗原(TAA)特异性T细胞的小鼠中T细胞增殖提高并且肿瘤体积减小。
优选地，免疫检查点调节剂是siRNA。小干扰RNA(siRNA)有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是长度通常为20至25个碱基对的一类双链RNA分子。在RNA干扰(RNAi)途径中，siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因(例如编码检查点蛋白的基因)的表达。siRNA通过使mRNA在转录后分解而起作用，导致无翻译。外源siRNA的转染可用于基因敲减，然而，该效应可能仅是短暂的，尤其是在快速分裂的细胞中。这可以例如通过RNA修饰或通过使用siRNA的表达载体来克服。还可以修饰siRNA序列以在两条链之间引入短环。得到的转录物是短发夹RNA(shRNA，也称为“小发夹RNA”)，其可以通过Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。shRNA是RNAi的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。因此，免疫检查点调节剂优选是shRNA。shRNA通常需要使用表达载体，例如质粒，或者病毒或细菌载体。
优选地，免疫检查点调节剂是免疫毒素。免疫毒素是与毒素连接的包含靶向部分(例如抗体)的嵌合蛋白，所述靶向部分通常靶向特定细胞(例如癌细胞)上的抗原。在本发明的上下文中，包含靶向检查点分子的靶向部分的免疫毒素是优选的。当免疫毒素与携带抗原(例如检查点分子)的细胞结合时，其被通过胞吞作用摄入，然后毒素可以杀死细胞。免疫毒素优选包含与毒素(的片段)连接的(修饰的)抗体或抗体片段。对于连接，方法是本领域公知的。免疫毒素的靶向部分通常包含靶向特定细胞类型的抗体的Fab部分。毒素通常是细胞毒性的，例如来源于细菌的蛋白质或植物蛋白质，已从中去除了天然结合域，使得免疫毒素的靶向部分将毒素引导至靶细胞上的抗原。然而，免疫毒素也可以包含抗体或抗体片段以外的靶向部分，例如生长因子。例如，含有毒素和生长因子的重组融合蛋白也称为重组免疫毒素。
优选地，免疫检查点调节剂是小分子药物(也称为“小分子抑制剂”)。小分子药物是低分子量(至多900道尔顿)的有机化合物，其通常与生物过程(的调节)相互作用。在本发明的上下文中，作为免疫检查点调节剂的小分子药物是分子量不高于900道尔顿的有机化合物，其完全或部分地降低、抑制、干扰、或负调节如上所述的一种或更多种检查点分子的功能。900道尔顿的分子量上限允许快速扩散穿过细胞膜的可能性和口服生物利用度。更优选地，作为免疫检查点调节剂的小分子药物的分子量不高于500道尔顿。例如，本领域已知的多种A2AR拮抗剂是分子量低于500道尔顿的有机化合物。
最优选地，免疫检查点调节剂是抗体或其抗原结合片段。这样的免疫检查点调节剂抗体或其抗原结合片段特别包括与免疫检查点受体结合的抗体或其抗原结合片段，或与免疫检查点受体配体结合的抗体。优选地，免疫检查点调节剂抗体或其抗原结合片段是免疫检查点受体或免疫检查点受体配体的激动剂或拮抗剂。抗体型检查点调节剂的实例包括如上所述目前经批准的免疫检查点调节剂，即(伊匹单抗；Bristol MyersSquibb)、(纳武单抗；Bristol Myers Squibb)和(派姆单抗；Merck)以及如上所述的其他抗检查点受体抗体或抗检查点配体抗体。
优选地，根据本发明使用的组合中的免疫检查点调节剂是可以部分或完全阻断PD-1途径(特别是PD-1、PD-L1或PD-L2)的抗体或抗原结合片段(例如，它们可以是PD-1途径的部分或完全拮抗剂)，更优选地，抗体可以部分或完全阻断PD-1(例如，它们可以是PD-1的部分或完全拮抗剂)。这样的抗体或抗原结合片段包括抗PD-1抗体、人抗PD-1抗体、小鼠抗PD-1抗体、哺乳动物抗PD-1抗体、人源化抗PD-1抗体、单克隆抗PD-1抗体、多克隆抗PD-1抗体、嵌合抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗PD-1 adnectin、抗PD-1结构域抗体、单链抗PD-1片段、重链抗PD-1片段和轻链抗PD-1片段。例如，抗PD-1抗体可以是抗原结合片段。优选地，抗PD-1抗体能够与人PD-1结合并且部分或完全阻断(人)PD-1的活性(例如，它们可以是PD-1的部分或完全拮抗剂)，从而特别释放表达PD-1的免疫细胞的功能。
优选地，根据本发明使用的组合中的免疫检查点调节剂是可以部分或完全阻断CTLA-4途径的抗体或抗原结合片段(例如，它们可以是CTLA-4途径的部分或完全拮抗剂)。这样的抗体或抗原结合片段包括抗CTLA4抗体、人抗CTLA4抗体、小鼠抗CTLA4抗体、哺乳动物抗CTLA4抗体、人源化抗CTLA4抗体、单克隆抗CTLA4抗体、多克隆抗CTLA4抗体、嵌合抗CTLA4抗体、MDX-010(伊匹单抗)、tremelimumab、抗CD28抗体、抗CTLA4 adnectin、抗CTLA4结构域抗体、单链抗CTLA4片段、重链抗CTLA4片段和轻链抗CTLA4片段。例如，抗CTLA4抗体可以是抗原结合片段。优选地，抗CTLA4抗体能够与人CTLA4结合并且部分或完全阻断CTLA4的活性(例如，它们可以是CTLA-4的部分或完全拮抗剂)，从而特别释放表达CTLA-4的免疫细胞的功能。
优选的免疫检查点调节剂和优选的T细胞重定向多功能抗体的优选组合
如上所述，根据本发明使用的优选组合包含如本文所述的优选免疫检查点调节剂。此外，根据本发明使用的优选组合包含如本文所述优选的T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段，其包含针对T细胞表面抗原的(优选)特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的(优选)特异性和人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的(优选)结合位点。
根据本发明使用的更优选的组合包含(i)如本文所述的优选免疫检查点调节剂；和(ii)如本文所述的优选T细胞重定向多功能抗体或抗原结合片段，其包含针对T细胞表面抗原的(优选)特异性、针对癌和/或肿瘤相关抗原的(优选)特异性以及人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的(优选)结合位点。下面描述根据本发明使用的优选组合的优选实施方案。
在根据本发明使用的优选组合中，T细胞重定向多功能抗体是三功能双特异性IgG型抗体，其中
a)针对T细胞表面抗原的特异性是(人)CD3的特异性(结合位点)；
b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性是EpCAM、HER2/neu、GD2或CD20的特异性(结合位点)；以及
c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区。
更优选地，T细胞重定向多功能抗体是卡妥索单抗和/或ektomab。
还优选的是，在根据本发明使用的组合中，免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂，并且更优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。最优选地，免疫检查点调节剂是CTLA-4的抑制剂。
例如，根据本发明使用的优选组合包含
—具有以下的三功能双特异性IgG型抗体：
a)对于(人)CD3的特异性(结合位点)；
b)对于EpCAM、HER2/neu、GD2或CD20的特异性(结合位点)；和
c)小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区；以及
—CTLA-4、PD-L1、PD-L2和/或PD-1的抑制剂，优选CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。
根据本发明使用的组合的另一个优选实例包含
—具有以下的三功能双特异性IgG型抗体：
a)对于(人)CD3的特异性(结合位点)；
b)对于EpCAM、HER2/neu或GD2的特异性(结合位点)；和
c)小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区；以及
—CTLA-4、PD-L1、PD-L2和/或PD-1的抑制剂，优选CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。
最优选地，根据本发明使用的组合包含(i)卡妥索单抗或ektomab；以及(ii)CTLA-4的抑制剂。
在癌症疾病的治疗性治疗中的用途
如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的组合用于治疗性治疗癌症疾病。
如本发明实施例所示，如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的这样的组合能够启动或增强检查点调节剂的功效，特别是在治疗性环境中。
如本文所用，“治疗性治疗”是指疾病发作后的治疗。特别地，“治疗性治疗”不包括在疾病发作之前实施的预防措施。由于疾病的发作通常与疾病的症状相关，因此通常在诊断或者至少(强烈)假定对象患有特定疾病后对人或动物对象进行“治疗性”治疗。治疗性治疗特别旨在(i)减轻、改善或治愈疾病(状态)；或者(ii)抑制或延迟疾病的进展(例如，通过提高癌症患者的平均存活时间)。然而，预防疾病的发作通常不能通过治疗性治疗实现。
如本文所述的组合用于治疗性治疗癌症疾病(用于制备用于其的药物)。在本发明的上下文中使用的术语“疾病”通常意指以下的同义词，并且可与以下互换使用：术语“障碍(disorder)”和“病症(condition)”(如在医疗状况中)，因为所有这些都反映了人或动物体或其一部分的损害正常功能的异常状况，其通常通过区分体征和症状来表现，并使人或动物具有减少的持续时间或生存质量。
癌症疾病是涉及异常细胞生长的一组疾病，特别是具有侵入或扩散至身体的其他部位的潜力。癌细胞/组织通常可显示癌症的六种标志，即(i)在没有适当的信号的情况下细胞生长和分裂；(ii)即使给出相反的信号也持续生长和分裂；(iii)逃避程序性细胞死亡；(iv)无限数目的细胞分裂；(v)促进血管构建；以及(vi)侵入组织以及形成转移。
癌症疾病包括由凋亡缺陷引起的疾病。癌症可以是实体肿瘤、血液癌症或淋巴癌。特别地，癌症可以是良性的、恶性的和/或转移性的。
优选地，在癌症疾病的治疗性治疗中，根据本发明使用的组合抑制/延迟肿瘤(或转移瘤)的进行/进一步生长或降低肿瘤的大小(或转移的数量)或防止肿瘤和/或转移瘤的复发。
癌症疾病的优选实例优选选自听神经鞘瘤(acusticus neurinoma)、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、Behcet综合征、膀胱癌、胚细胞瘤、骨癌、脑转移瘤、脑肿瘤、脑癌(胶质母细胞瘤)、乳腺癌(乳房癌)、Burkitt淋巴瘤、类癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、子宫体癌(corpus carcinoma)、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、CUP综合征、子宫内膜癌、胆囊癌(gall bladder cancer)、生殖器肿瘤(包括泌尿生殖道的癌症)、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头/颈部肿瘤、肝细胞瘤、组织细胞淋巴瘤、霍奇金综合征或淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、垂体肿瘤、肠癌(包括小肠肿瘤和胃肠道肿瘤)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾癌症、肾癌、喉癌或喉头癌、白血病(包括急性髓细胞白血病(AML)、红白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓细胞白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL))、眼睑肿瘤、肝癌、肝转移癌、肺癌(＝肺癌＝支气管癌)、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肺腺癌、淋巴瘤、淋巴癌、恶性黑素瘤、乳房癌(＝乳腺癌)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、蕈样真菌病、肿瘤性疾病神经鞘瘤、食管癌症、食管癌(＝食管癌症)、少突神经胶质瘤、卵巢癌症(＝卵巢癌)、卵巢癌、胰腺癌(＝胰腺癌症)、阴茎癌症、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、前列腺癌(＝前列腺肿瘤)、直肠癌、直肠肿瘤、肾癌症、肾癌、成视网膜细胞瘤、肉瘤、Schneeberger病、皮肤癌(例如黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌、包括基底细胞和鳞状细胞癌以及银屑病)、寻常型天疱疮、软组织肿瘤、spinalioma、胃癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、舌癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、各种病毒诱发的肿瘤如乳头状瘤病毒诱发的癌(例如宫颈癌＝宫颈癌)、腺癌、疱疹病毒诱发的肿瘤(例如Burkitt淋巴瘤、EBV诱导的B细胞淋巴瘤、宫颈癌)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1-和HTLV-2诱导的淋巴瘤、外阴癌、疣病症或损害等。
用如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其片段的组合治疗的癌症的进一步优选实例包括脑癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肺癌、肝癌、肾癌、黑素瘤、肠癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、慢性髓细胞白血病、结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌、骨髓性白血病、肺鳞状细胞癌、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、膀胱肿瘤、早幼粒细胞白血病、非小细胞肺癌、浆细胞瘤和肉瘤。
更优选地，所述癌症疾病选自肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱肿瘤、浆细胞瘤和/或肉瘤。
一般来说，如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其片段的“组合”意味着用如本文所述的免疫检查点调节剂的治疗与用如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其片段的治疗组合。换句话说，即使一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)不与另一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体中的另一种)在例如同一天施用，其治疗方案也是交错的。这意味着在本发明的上下文中的“组合”特别不包括在用另一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体中的另一种)完成治疗后用一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)开始治疗。更一般地，检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体的“交错”治疗方案-以及因此检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体的组合-意味着：
(i)不是在完成检查点调节剂的每次施用(并因此完整的检查点调节剂治疗)多于一周(优选多于3天，更优选多于2天，甚至更优选多于一天)之后，开始T细胞重定向多功能抗体的第一次施用(并因此完整的T细胞重定向多功能抗体治疗)；或者
(ii)不是在完成T细胞重定向多功能抗体的每次施用(并因此完整的T细胞重定向多功能抗体治疗)多于一周(优选多于3天，更优选多于2天，甚至更优选多于一天)之后，开始检查点调节剂的第一次施用(并因此完整的检查点调节剂治疗)。
例如，在根据本发明使用的如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的组合中，一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)可以每周施用一次，而另一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体中的另一种)可以每月施用一次。为了在该实例中实现本发明意义上的“组合”，每月施用的组分在还施用每周施用的另一种组分的同一周内施用至少一次。
如上概述，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂和/或T细胞重定向多功能抗体的施用可能需要多次连续施用，例如多次注射。因此，施用可以重复至少两次，例如一次作为初次免疫注射，后一次作为加强注射。
特别地，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂和/或T细胞重定向多功能抗体可以重复或连续施用。由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂和/或T细胞重定向多功能抗体可以重复或连续施用至少1、2、3或4周；2、3、4、5、6、8、10或12个月；或者2、3、4或5年的时间。例如，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂可以每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周一次、每两周、每三周、每月一次或每两个月施用。例如，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体可以每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周一次、每两周、每三周、每月一次或每两个月施用。
优选地，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段根据递增剂量方案施用。一般来说，“递增剂量方案”是指重复施用抗体，其中初始剂量(即，抗体的第一次施用的单剂量，例如一般情况下或与一个单一治疗周期相关)低于最终剂量(即，抗体的最终施用的单剂量，例如一般情况下或与一个单一治疗周期相关)。特别地，抗体的剂量随着递增剂量方案的重复抗体施用增加。特别地，递增剂量方案包括以递增的方式施用两个或更多个不同的“剂量水平”，即从最低剂量水平开始，然后是下一个更高的剂量水平，任选地然后是下一个更高的剂量水平等。术语“剂量水平”是指抗体的特定剂量/量。例如，“10μg”的剂量水平意指一次或重复(例如，两次或三次)施用10μg单剂量的抗体，直至下一个更高剂量水平(例如，一次或重复施用50μg单剂量的抗体)开始。因此，在每个剂量水平，可以施用一个或更多个(例如，两个或三个)单剂量。如果在(单)剂量水平施用多于一个单剂量，则这意味着(该剂量水平的)单剂量是相同的，即在(单)剂量水平的每个单剂量下施用的抗体的量是相同的。因此，在递增剂量方案中，除了初始剂量，即第一次抗体施用之外，在每次单一抗体施用中，施用的单剂量高于在前抗体施用的单剂量(以进入下一个更高剂量水平)或与在前抗体施用的单剂量相同(以维持“实际”剂量水平)。因此，术语“在前施用”是指直接在所讨论的(抗体)施用之前的(抗体)施用。例如，对于第三次(抗体)施用，“在前施用”是第二次(抗体)施用，但不是第一次(抗体)施用；或者对于第四次(抗体)施用，“在前施用”是第三次(抗体)施用，但不是第一次(抗体)施用或第二次(抗体)施用。例如，在递增剂量方案中(i)初始剂量可以是最低剂量，并且在每次后续(抗体)施用时，单剂量可以高于相应的在前(抗体)施用，使得在每个剂量水平上施用仅一个单剂量；或者(ii)在一次或更多次(但不是全部)(抗体)施用时，单剂量可以与相应的在前(抗体)施用中的相同(使得在一个或更多个剂量水平(例如在每个剂量水平)施用多于一个单剂量)。
优选地，根据本发明使用的组合在一个或更多个治疗周期中施用。在本发明的上下文中，治疗周期是可以在有规律的时间表中重复的一个或更多个治疗的过程，其间有休息时间。例如，根据本发明使用的组合可以在一个治疗周期(例如，一个单剂量或重复剂量)中施用，然后，可以观察癌症或肿瘤是否复发。特别是当癌症/肿瘤复发时，可以进行另一个治疗周期。然而，另一个治疗周期也可以作为预防措施进行。特别地，在一个治疗周期内两次治疗之间(例如，抗体的两个单剂量之间和/或检查点调节剂的两个单剂量之间)的间隔优选不超过一个月(31天)，更优选不超过3周，而一个治疗周期结束和下一个治疗周期开始之间的间隔(特别是与施用抗体和/或免疫检查点调节剂有关)优选为至少一个月，优选至少两个月，更优选至少3个月，甚至更优选至少4个月并且最优选至少6个月。换句话说，在一个治疗周期内两次治疗/施用(抗体和/或检查点调节剂)之间的间隔优选少于一个月(例如，不多于两周或三周)，而两个治疗周期之间的间隔(与施用抗体和/或检查点调节剂有关)优选多于一个月(例如，至少两个月或三个月)。
优选地，一个治疗周期包括抗体和/或免疫检查点调节剂的(i)一个单一施用或(ii)一个初始剂量(第一次施用)和一个或更多个后续施用。患者可能会经受一个单一或多个治疗周期。每个治疗周期通常由抗体和/或免疫检查点调节剂的2至28，优选2至20，更优选3至10，甚至更优选5至8，例如6或7个单一施用构成。
优选地，一个治疗周期包括一个或更多个剂量水平。换句话说，优选的是一个治疗周期包括(i)重复施用相同的单剂量(一个单剂量水平)或(ii)施用一个或更多个递增的单剂量(其中如上所述在每个剂量水平下可以施用一个或更多个单剂量)。在后一种情况下，初始剂量水平(第一次施用的施用剂量)之后的剂量水平通常高于初始剂量水平。特别地，初始剂量水平可优选包含仅一个单一施用，即在治疗/治疗周期(第一次施用)刚开始时最低剂量仅施用一次。在这种情况下，一个或更多个后续施用的单剂量高于初始剂量。
换句话说，优选的是在治疗周期内(从初始剂量开始到最终剂量结束)，每个单一施用的单剂量(初始剂量除外)不低于施用的在前剂量，即每个后续剂量等于或高于在前剂量。更优选地，治疗周期遵循如上所述的递增剂量方案。甚至更优选地，如果施用多于一个治疗周期，则每个治疗周期都遵循如上所述的递增剂量方案。因此，每个治疗周期的剂量方案可以相同或不同。如上所述，例如递增剂量方案还可以包括与前一剂量相等的剂量(即，在一个(单)剂量水平内施用多于一个单剂量)。例如，仅初始剂量可以较低并且随后施用的所有单剂量可以相同(并且高于初始剂量)，或者初始剂量可以较低，第二次施用的单剂量可以高于初始剂量，但低于随后施用的所有单剂量，随后施用的所有单剂量优选相同(并且高于初始剂量和第二剂量)。因此，优选的是在初始剂量之后施用的一个或更多个单剂量高于在前施用的单剂量。
治疗周期的最终剂量(水平)通常反映在一个治疗周期内施用的抗体的最高单剂量；即治疗周期的最大单剂量。特别地，在治疗周期结束时，可以施用一、二、三、四、五或更多个反映最大单剂量的单剂量。
一般来说，剂量递增的指导原则是避免使患者暴露于亚治疗剂量，同时维持安全性并维持快速增加。优选地，在一个相同的治疗周期内，因此没有一个单剂量低于前一个。
通常来说，单个治疗周期包括抗体和/或免疫检查点抑制剂的至少初始施用和第二次施用。在优选的实施方案中，单个治疗周期可以包括抗体和/或免疫检查点抑制剂的初始施用、第二次施用、第三次施用、第四次施用、第五次施用、以及优选的第六次施用。在单个治疗周期内，抗体和/或免疫检查点抑制剂的后续施用可以优选地在在前施用之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天施用，优选地，后续施用在在前施用之后2至15天施用，更优选地，后续施用在在前施用之后2至10天施用，甚至更优选地，后续施用在在前施用之后3至8天施用。
在根据本发明使用的如本文所述的免疫检查点调节剂和如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的组合中，免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体优选大约同时施用。
本文使用的“大约同时”特别意指同时施用或直接在施用免疫检查点调节剂之后施用T细胞重定向多功能抗体，或直接在施用T细胞重定向多功能抗体之后施用免疫检查点调节剂。技术人员理解“直接在......之后”包括准备第二次施用所需的时间，特别是对第二次施用的部位进行暴露并消毒以及适当准备“施用装置”(例如，注射器、泵等)所需的时间。同时施用还包括以下情况：检查点调节剂的施用周期和T细胞重定向多功能抗体的施用周期重叠，或者例如，一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)在较长时间例如30分钟、1小时、2小时或甚至更长时间内施用，例如通过输注，而另一种组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)在该长时间内的某个时间施用。如果使用不同的施用途径和/或不同的施用部位，则大约同时施用免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体是特别优选的。
在根据本发明使用的本文所述的免疫检查点调节剂和本文所述的T细胞重定向多功能抗体的组合中，还优选的是连续施用免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体。例如，优选在T细胞重定向多功能抗体之前施用免疫检查点调节剂。还优选的是，在T细胞重定向多功能抗体之后施用免疫检查点调节剂。
在连续施用中，在第一组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)的施用和第二组分(检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体中的另一种)的施用之间，第一组分(检查点调节剂或T细胞重定向多功能抗体)的施用和第二组分(检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体中的另一种)的施用之间时间间隔优选不多于一周，更优选不多于3天，甚至更优选不多于2天，并且最优选不多于24h。特别优选的是，检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体在同一天施用，第一组分(检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体)的施用和第二组分(检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体中的另一种)的施用之间的时间优选不多于6小时，更优选不多于3小时，甚至更优选不多于2小时并且最优选不多于1小时。
然而，特别优选的是，在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后施用免疫检查点调节剂。更优选地，在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用免疫检查点调节剂。换句话说，在优选的实施方案中，施用T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段(首先施用)和施用免疫检查点调节剂(在抗体之后施用)之间的间隔为至少6小时，优选至少12小时，更优选至少18小时，甚至更优选至少24小时，更优选至少36小时并且最优选至少48小时。例如，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的第一次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用。作为另一个实例，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的最终施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用。最优选地，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的每次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的每次施用之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用。因此，特别优选的是，(在治疗周期中或一般情况下)(i)免疫检查点调节剂的第一次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用；并且(ii)免疫检查点调节剂的最终施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用。
还优选的是，在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用免疫检查点调节剂。换句话说，在一个优选的实施方案中，施用T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段(首先施用)和施用免疫检查点调节剂(在抗体之后施用)之间的间隔不多于96小时，优选不多于84小时，更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时。例如，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的第一次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用。作为另一个实例，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的最终施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用。最优选地，(在治疗周期中或一般情况下)免疫检查点调节剂的每次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的每次施用之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用。因此，特别优选的是，(在治疗周期中或一般情况下)(i)免疫检查点调节剂的第一次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用；并且(ii)免疫检查点调节剂的最终施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用。
最优选地，(在治疗周期中或一般情况下)(i)免疫检查点调节剂的第一次施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后12至96小时、优选24至84小时、更优选36至72小时、并且最优选48至60小时施用；和/或(ii)免疫检查点调节剂的最终施用在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后12至96小时、优选24至84小时、更优选36至72小时、并且最优选48至60小时施用。
本发明人出人意料地发现，通过如本文所述的T细胞重定向多功能抗体激活T细胞后免疫检查点分子的表达提高。如本申请的实施例2中所示，通过如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的T细胞激活提高了免疫检查点分子特别是CTLA-4的表达，CTLA-4被认为是如上所述抑制性免疫检查点的“前导”，其在抗体施用后48至72小时达到峰值。鉴于这些发现，如果免疫检查点调节剂在免疫检查点分子的表达提高或甚至达到峰值时发挥其作用，则如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的T细胞激活(其在癌症和肿瘤疾病的治疗中是重要的)可以特别延长。上述优选的施用顺序(首先是抗体，然后是免疫检查点调节剂)和时间间隔是基于那些发现并且代表预期会导致延长T细胞的激活从而提高治疗癌症和/或肿瘤疾病效力的施用方案。
优选地，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂和由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体以治疗有效量施用。如本文所用，“治疗有效量”是足以减轻所治疗的疾病或病症的症状或者足以抑制或延迟疾病进展的量。换句话说，“治疗有效量”意指足以显著诱导疾病或病症的积极改变的T细胞重定向多功能抗体和/或检查点调节剂的量，即，引起组织、系统、动物或人中所寻求的生物学或医学响应的T细胞重定向多功能抗体和/或检查点调节剂的量。该术语还包括足以降低疾病进展、显著降低或抑制肿瘤生长并因此引起所寻求的(免疫)应答的T细胞重定向多功能抗体和/或免疫检查点调节剂的量(即“抑制有效量”)。然而，同时，“治疗有效量”优选足够小以避免严重的副作用，即允许优点和风险之间的合理关系。这些限度的确定通常在合理的医学判断范围内。此外，T细胞重定向多功能抗体和/或检查点调节剂的“治疗有效量”将结合以下进一步变化：待治疗的特定癌症状况，以及待治疗患者的年龄和身体状况、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、特定组分(检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体)的活性、病情的严重程度、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、所用的特定可药用载体的性质以及在伴随医生的知识和经验范围内的类似因素。
因此，作为单剂量或多剂量向个体施用的剂量将根据多种因素而变化，所述因素包括药代动力学特性、对象状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、体型)、症状的程度、同步治疗、治疗频率和期望的效果。
优选地，对于癌症治疗，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体的治疗有效单剂量为每次注射约0.001mg至10mg、优选约0.01mg至5mg、更优选约0.1mg至2mg，或者每次注射约1nmol至1mmol、特别是每次注射10nmol至100μmol、优选每次注射0.1μmol至10μmol。还优选的是，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体的治疗有效剂量(每kg体重)(特别是用于癌症治疗)为约0.01μg/kg至100μg/kg，优选约0.1μg/kg至50μg/kg，更优选约1μg/kg至25μg/kg，甚至更优选约2μg/kg至20μg/kg并且最优选约2.5μg/kg至5μg/kg。
更优选地，如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段以0.1至5000μg的单剂量、优选以1至1000μg的单剂量、更优选以2μg至750μg的单剂量、甚至更优选以3μg至700μg的单剂量、更优选以5μg至600μg的单剂量、并且最优选以10μg至500μg的单剂量施用。
在本发明的情况下，“单剂量”(或“每个剂量”)是在一个施用时间向一个患者施用的单个剂量。
最优选地，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段以不多于1mg、优选不多于0.9mg、更优选不多于0.8mg、甚至更优选不多于0.75mg、更优选不多于0.6mg、并且最优选不多于0.5mg的单剂量施用。
优选地，抗体或其抗原结合片段的初始剂量为0.5至200μg，优选1至150μg，更优选2至100μg，最优选5至70μg。初始剂量是第一次施用的单剂量，并且优选一个治疗周期的最低剂量。
优选地，抗体或其抗原结合片段的第一后续剂量水平超出初始剂量水平(作为初始剂量施用的量)优选1.1至10.0倍，更优选1.2至5.0倍，并且甚至更优选1.5至3.0倍，而且任选地，第二后续剂量水平和每个随后的剂量水平超出初始剂量水平(作为初始剂量施用的量)1.1至10.0倍，优选1.5到5.0倍。
抗体或其抗原结合片段的(治疗周期内的)最大剂量优选选自25μg至1000μg，优选50μg至750μg，更优选75μg至500μg。
优选地，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂的治疗有效剂量(每kg体重)(特别是用于癌症治疗)为约0.01mg/kg至100mg/kg，优选约0.05mg/kg至50mg/kg，更优选约0.1mg/kg至25mg/kg，甚至更优选约0.5mg/kg至15mg/kg并且最优选约1mg/kg至10mg/kg。
由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂可以通过多种施用途径施用，例如全身或局部。用于全身施用的途径通常包括例如经皮，经口和肠胃外途径，其包括皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、皮内和腹膜内途径和/或鼻内施用途径。用于局部施用的途径通常包括例如局部施用途径，但也可以直接在病痛部位施用，例如瘤内施用。
优选地，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂通过肠胃外施用途径施用。更优选地，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂通过静脉内、瘤内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内或结节内途径施用。甚至更优选地，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂静脉内和/或皮下施用。
优选地，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂通过相同的施用途径施用，优选通过相同的肠胃外施用途径施用，更优选静脉内或皮下施用。
然而，还优选的是，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂通过不同的施用途径，优选通过不同的肠胃外施用途径施用，更优选地，由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂静脉内施用，并且由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体通过瘤内、皮内、皮下、肌肉内、或结节内途径施用，优选地由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体皮下施用。
由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂可以在相同或不同的组合物中提供。
优选地，由根据本发明使用的组合包含的T细胞重定向多功能抗体和由根据本发明使用的组合包含的免疫检查点调节剂在不同的组合物中提供。因此，T细胞重定向多功能抗体和检查点调节剂可以使用不同的其他组分，例如不同的载剂。此外，T细胞重定向多功能抗体和免疫检查点调节剂可以通过不同的施用途径施用并且剂量(特别是剂量的关系)可以根据实际需要进行调整。
然而，还优选的是，免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体在相同的组合物中提供。下面更详细地描述包含免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体两者的这样的组合物(“根据本发明的组合物”)。
无论组合物是否仅包含免疫检查点调节剂(而不包含T细胞重定向多功能抗体)、仅包含T细胞重定向多功能抗体(而不包含检查点调节剂)或包含两者，这样的组合物都可以是药物组合物。
特别地，仅包含免疫检查点调节剂(而不包含T细胞重定向多功能抗体)、仅包含T细胞重定向多功能抗体(而不包含检查点调节剂)或包含两者这样的组合物优选地是任选包含可药用载体和/或载剂，或任何赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料的(药物)组合物。
在本发明的上下文中，可药用载体通常包括药物组合物的液体或非液体基础。如本文所用的术语“相容性”意指药物组合物的这些组分能够与如上限定的抗体或其抗原结合片段混合，使得在通常使用条件下不会发生显著降低药物组合物药物有效性的相互作用。当然，可药用载体和载剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适合于向待治疗的对象施用。
优选地，药物组合物为冻干粉末的形式或液体组合物的形式，优选水溶液形式。因此，本发明的药物组合物可以作为干燥、冻干粉末或更优选溶液(溶解在载剂中)提供。如果由制造商作为冻干粉末提供，则其通常在临施用前溶解在合适的溶液(水溶液；例如注射用水或盐水，任选缓冲液例如PBS)中。液体药物的小瓶可以是一次性使用或多次使用。
在另一个优选实施方案中，检查点调节剂、T细胞重定向多功能抗体和/或药物组合物(包含其一者或两者)不是冻干的。因此，优选的是，检查点调节剂、T细胞重定向多功能抗体和/或药物组合物(包含其一者或两者)不是冻干的，而是在溶液中、优选在水溶液中、更优选在水性缓冲溶液中提供。
因此特别优选的是，药物组合物以液体形式提供。因此，可药用载体通常包含一种或更多种(相容性)可药用液体载体。(相容性)可药用液体载体的实例包括无热原水、等张盐水或缓冲(水)溶液，例如柠檬酸盐缓冲溶液；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸，其他无机或有机聚合物例如PLGA优选为本发明活性剂提供持续释放作用。优选地，在液体药物组合物中，载体可以是无热原水；等张盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。特别是对于药物组合物的注射或灌注，可以使用水或优选缓冲剂，更优选水性缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂。
因此，优选的是，药物组合物包含缓冲剂，优选有机酸缓冲剂(即基于有机酸的缓冲剂)，例如柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和酒石酸盐缓冲剂，更优选地，药物组合物包含柠檬酸盐缓冲剂。因此，有机酸缓冲剂优选选自柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂和磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂，更优选选自柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂和酒石酸盐缓冲剂。特别优选的是，缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。一般来说，缓冲剂(还)可以含有钠盐(优选至少30mM的钠盐)、钙盐(优选至少0.05mM的钙盐)和/或任选地钾盐(优选至少1mM的钾盐)。钠、钙和/或钾盐可以以其卤化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)的形式，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式存在。但不限于此，钠盐的实例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，并且钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，前述阳离子的有机阴离子可以包含在缓冲剂中。
药物组合物还可以包含盐水(0.9％NaCl)、林格-乳酸盐溶液或PBS(磷酸盐缓冲盐水)。例如，药物组合物可以作为抗体或其抗原结合片段在合适的缓冲剂例如如上所述的有机酸缓冲剂、优选柠檬酸盐缓冲剂中的储备溶液提供，并且仅在临施用前，可以将储备溶液用盐水(0.9％NaCl)、林格-乳酸盐溶液或PBS稀释，以实现待施用的抗体浓度。
此外，一种或更多种相容性固体或液体填充剂或稀释剂或包封化合物也可用于适于向待治疗对象施用的药物组合物。可包含在药物组合物中的化合物的其他实例包括糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；兽脂；固体助流剂，例如硬脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可属的油；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸。此外，根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。因此，药物组合物还可以包含稳定剂，例如80或20。任选地，赋予如本文所述抗体或其抗原结合片段持续释放特性的赋形剂也可以包含在药物组合物中。
在一个优选的实施方案中，药物组合物除了以下外不包含其他组分：(i)如本文所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段或如本文所述的免疫检查点调节剂；(ii)如本文所述的缓冲剂；以及任选的(iii)注射用水、盐水和/或PBS。
如本文所述的组合物，特别是药物组合物可以适合于通过重复施用来递送。
在组合物，特别是药物组合物的情况下或其制备的情况下有用的其他材料以及制剂加工技术等陈述在“Remington的“The Science and Practice of Pharmacy”,第22版,2012,University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams&Wilkins的第5部分”中。
待治疗的对象优选地是人或非人动物，特别是哺乳动物或人。更优选地，待治疗的对象优选地是人。优选地，对象是被诊断有癌症的患者。例如，可以根据本发明治疗年轻(小于15岁)或年长(大于60岁)的患者。对于年长患者，特别有利的是通过需要医生的途径施用药物，从而确保依从性。同时，施用应该优选无痛的。
一般来说，无论其年龄如何，患有癌症疾病的患者(优选未进行免疫抑制治疗)可以特别受益于根据本发明的T细胞重定向多功能抗体和免疫检查点抑制剂的组合的使用。
与糖皮质激素组合
优选地，根据如本文所述的本发明使用的组合还包含
(iii)糖皮质激素。
换句话说，用于治疗性治疗癌症疾病的根据本发明的优选组合包含
(i)免疫检查点调节剂；
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合；以及
(iii)糖皮质激素。
应理解，上述免疫检查点调节剂的优选实施方案，如上所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的优选实施方案，以及如上所述的组合或其用途(例如，关于制剂、待治疗的疾病、施用等)的优选实施方案相应地适用于还包含糖皮质激素的根据本发明的组合。
糖皮质激素(GC)是一类与糖皮质激素受体结合的皮质类固醇。GC是免疫系统中反馈机制的一部分，其降低免疫功能的某些方面，例如降低炎症。虽然众所周知GC可以干扰癌细胞中的某些异常机制，并因此GC被以高剂量用于治疗某些类型的癌症(例如淋巴瘤和白血病，其中GC对淋巴细胞增殖发挥出抑制作用)，但是在本发明的上下文下，糖皮质激素并不是施用来治疗癌症或肿瘤疾病本身的，而是降低T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段和/或免疫检查点调节剂的副作用。因此，在本发明上下文中，糖皮质激素既是不作为(i)癌症的独立治疗施用，也不(ii)作为治疗癌症的化学治疗方案的一部分施用，所述化学治疗例如C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)，m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)和MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)。特别地，根据本发明的组合确实优选不包含(另外的)化学治疗剂，例如环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼、多柔比星、甲氨蝶呤和博来霉素。此外，待用根据本发明的组合治疗的癌症疾病可以不包括淋巴瘤和/或白血病，特别是如果根据本发明的组合包含糖皮质激素的话。换句话说，优选地，除了淋巴瘤和/或白血病之外的癌症疾病可以用根据本发明的组合治疗，特别是如果其包含糖皮质激素的话。
优选地，糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定(prednylidene)、地夫可特、氯泼尼醇(cloprednole)、氟可龙(fluocortolone)和布地奈德(budenoside)。
最优选地，糖皮质激素是地塞米松。地塞米松显示出非常强的糖皮质激素活性，而盐皮质激素活性基本上不存在。因此，地塞米松是非常有效的糖皮质激素。此外，地塞米松是具有长持续效果(生物半衰期36至54小时)的糖皮质激素，因此特别适用于需要持久或持续的糖皮质激素活性的治疗。在许多其他应用中，地塞米松还特别适用于患有心功能不全或张力过强的患者。此外，地塞米松的强烈消炎和免疫抑制(抗变应性)活性在治疗上是重要的。此外，有利的是，在静脉注射地塞米松后几分钟内达到最大血浆浓度。
优选地，糖皮质激素静脉内(i.v.)或经口(p.o.)施用。
通常根据所用糖皮质激素的类型选择糖皮质激素的剂量。对于地塞米松，单剂量可优选为1至100mg，更优选2至80mg，甚至更优选5至70mg，最优选10至50mg，例如10mg、20mg或40mg，特别优选10或20mg。对于泼尼松龙或泼尼松，由于其较低的效力，剂量通常会更高。例如，泼尼松龙或泼尼松的单剂量可优选为50至500mg，更优选100至400mg，甚至更优选150至300mg，并且最优选200至250mg。基于多种糖皮质激素的周知的糖皮质激素效力，技术人员可以容易地检索其他糖皮质激素的类似剂量范围。例如，倍他米松显示出与地塞米松基本相同的糖皮质激素活性，并因此以基本上相同的剂量施用，而例如，泼尼立定(prednilydene)显示出与泼尼松和泼尼松龙基本相同的糖皮质激素活性，并因此以基本上相同的剂量施用。
一般来说，可以在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段、和/或免疫检查点调节剂之前；与T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段、和/或免疫检查点调节剂大约同时；或者在T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段、和/或免疫检查点调节剂之后施用糖皮质激素。优选地，在施用T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之前和/或在施用免疫检查点调节剂之前施用糖皮质激素。因此，优选的是，在施用T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之前不长于6小时、优选不长于5小时、更优选不长于4小时、甚至更优选不长于3小时、更优选不长于2小时并且最优选不长于1小时；和/或在施用免疫检查点调节剂之前不长于6小时、优选不长于5小时、更优选不长于4小时、甚至更优选不长于3小时、更优选不长于2小时并且最优选不长于1小时施用糖皮质激素。
例如，结合如上所述的施用T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)和免疫检查点调节剂的优选实施方案，在一个特别优选的实施方案中，首先施用糖皮质激素，然后是T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)，其可以例如在施用糖皮质激素后不长于1或2小时施用，然后，施用免疫检查点调节剂，例如在施用T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少24小时、甚至更优选至少36小时并且最优选至少48小时。任选地，糖皮质激素因此也可以在施用免疫检查点调节剂之前，例如在施用免疫检查点调节剂之前不长于1或2小时施用。
在需要重复施用T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)和/或免疫检查点调节剂的治疗方案中，糖皮质激素优选至少在抗体/检查点调节剂的剂量提高之前(例如，在递增剂量方案中每个剂量水平的第一次施用时)施用。更优选地，糖皮质激素在每次施用T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)和/或免疫检查点调节剂之前施用。因此，施用方案的上述特别优选的实施方案优选适用于每次的抗体/检查点调节剂施用，包括例如T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)和/或免疫检查点调节剂的第一次和/或最终施用。
还优选的是，糖皮质激素与T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段大约同时施用，和/或糖皮质激素与免疫检查点调节剂大约同时施用。因此，短语“大约同时”具有与如上定义的(其适用于本申请通篇)相同的含义。
根据本发明使用的药盒
在另一方面，本发明还提供用于治疗性治疗癌症疾病特别是人对象中的癌症疾病的药盒(kit)，特别是成套药盒(kit of parts)，其包含：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
特别地，根据本发明使用的这样的药盒包含(i)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂和(ii)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体。此外，这样的药盒用于治疗性治疗如上所述的癌症疾病，特别是如上所述的人对象中的癌症疾病。换句话说，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂的优选实施方案在根据本发明的药盒中也是优选的。因此，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案在根据本发明的药盒中也是优选的。此外，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案对于根据本发明的药盒也是优选的。
例如，如上所述，免疫检查点调节剂以及/或者T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段可以在相同的组合物或不同的组合物中提供。
此外，基于如上所述的T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的优选单剂量，T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段优选以单剂量在根据本发明的药盒中提供，其中每个单剂量不大于1mg，优选每个单剂量不大于0.9mg，更优选每个单剂量不超过大于mg，甚至更优选每个单剂量不大于0.75mg并且最优选每个单剂量不大于0.5mg。
此外，根据本发明的药盒优选包含
(iii)糖皮质激素。
在这种情况下再一次，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的糖皮质激素的优选实施方案对于根据本发明的药盒也是优选的。例如，如上所述，糖皮质激素优选选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地糖皮质激素是地塞米松。
药盒的不同组分可以包装在一个或更多个容器中。上述组分可以以冻干或干燥形式提供，或者溶解在合适的缓冲剂中。例如，药盒可以包含包含如上所述的免疫检查点调节剂的(药物)组合物和包含如上所述的T细胞重定向多功能抗体的(药物)组合物，例如每种组合物放在单独的容器中。药盒还可以包含如上所述的包含免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体两者的(药物)组合物。
药盒还可以包含另外的试剂，包括例如用于储存和/或重构上面提到的组分的缓冲剂、洗涤溶液等等。
另外，根据本发明的成套药盒可任选地包含使用说明。优选地，所述药盒还包含包装插页或标签，其具有对于通过使用免疫检查点调节剂和T细胞重定向多功能抗体的组合来治疗如本文所述的癌症疾病的说明书。任选地，组合(以及因此，药盒的包装插页或标签的说明书)还可以包括(iii)如上所述的糖皮质激素。特别地，使用如上所述根据本发明的组合的说明书可包括如上所述的施用方案，特别是其优选实施方案。
根据本发明使用的组合物
在另一方面，本发明还提供了包含以下的组合物：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
特别地，根据本发明的这样的组合物包含(i)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂和(ii)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体。换句话说，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂的优选实施方案在根据本发明的组合物中也是优选的。因此，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案在根据本发明的组合物中也是优选的。
此外，上文描述(在根据本发明使用的组合的上下文中)了包含如上所述的免疫检查点调节剂和如上所述的T细胞重定向多功能抗体的组合物以及这样的组合物的优选实施方案。应理解，对于组合物的相同描述，特别是如上所述的相同优选实施方案，相应地适用于如本文所述的组合物。
例如，根据本发明的组合物优选包含
(iii)糖皮质激素。
在这种情况下再一次，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的糖皮质激素的优选实施方案对于根据本发明的组合物也是优选的。例如，如上所述，糖皮质激素优选选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地糖皮质激素是地塞米松。
优选地，该组合物用于医药，更优选地，该组合物用于治疗性治疗癌症疾病，特别是在人对象中。因此，这样的组合物用于治疗性治疗如上所述的癌症疾病，特别是如上所述的人对象中。换句话说，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案对于根据本发明的组合物也是优选的。
因此，组合物优选包含可药用载体。这样的可药用载体的优选实例如上所述。
还优选的是，(药物)组合物用于治疗患有癌症疾病的对象，优选人对象的方法。
根据本发明的方法和联合治疗
在另一方面，本发明提供用于治疗性治疗癌症或在有此需要的对象中启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括向对象施用
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
特别地，根据本发明的这样的方法包括施用(i)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂和(ii)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体。此外，这样的方法可用于治疗性治疗如上所述的癌症疾病，特别是如上所述的人对象中。换句话说，如上所述(在根据本发明使用的组合的的上下文中)的免疫检查点调节剂的优选实施方案在根据本发明的方法中也是优选的。因此，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案在根据本发明的方法中也是优选的。此外，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案对于根据本发明的方法也是优选的。
例如，如上所述，免疫检查点调节剂以及/或者T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段可以在相同的组合物或不同的组合物中提供。作为另一个实例，根据本发明的方法优选包括向对象施用
(iii)糖皮质激素。
在这种情况下再一次，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的糖皮质激素的优选实施方案对于根据本发明的方法也是优选的。例如，如上所述，糖皮质激素优选选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地糖皮质激素是地塞米松。
优选地，所述对象是被诊断有癌症的人对象。
此外，在上文根据本发明的组合的上下文中描述的施用方案的优选实施方案也适用于根据本发明的方法。因此，(i)免疫检查点调节剂，和/或(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，和/或任选地，(iii)糖皮质激素优选如上所述施用。
在另一方面，本发明还提供延长对象中T细胞激活的方法，其包括向对象施用以下的组合：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
如本发明人出人意料地发现，如本文限定的T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)诱导免疫检查点分子例如CTLA-4的提高的表达(参见实施例2，图2)。即，如本申请的实施例2中所示，通过如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的T细胞激活提高了免疫检查点分子特别是CTLA-4的表达，CTLA-4被认为是如上所述抑制性免疫检查点的“前导”。一般来说，如本文所述的T细胞重定向多功能抗体的T细胞激活在癌症和肿瘤疾病的治疗中是至关重要的。免疫检查点分子(例如CTLA-4)抵消T细胞激活，特别是由于它们的提高的表达。因此，免疫检查点调节剂的施用延长了T细胞重定向多功能抗体(或其抗原结合片段)的T细胞激活，因为其抵消了免疫检查点分子的提高的表达，在没有免疫检查点调节剂的情况下，这将终止(或至少降低)抗体介导的T细胞激活。
特别地，根据本发明的这样的方法包括施用(i)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂和(ii)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体，以及任选地(iii)如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的糖皮质激素。换句话说，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的免疫检查点调节剂的优选实施方案在根据本发明的方法中也是优选的。因此，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案在根据本发明的方法中也是优选的。此外，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的在癌症疾病的治疗性治疗中的用途的优选实施方案对于根据本发明的方法(包括例如，优选的施用方案)也是优选的。
在另一方面，本发明还提供用于治疗性治疗癌症的联合治疗，其中所述联合治疗包括施用
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)(分离的)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
这样的联合治疗的优选实施方案是如上所述的T细胞重定向多功能抗体的优选实施方案，如上所述的检验点调节剂的优选实施方案，和/或-更一般地-根据本发明使用的组合的优选实施方案。根据本发明的药盒和根据本发明的(药物)组合物可用于根据本发明的方法和/或联合治疗中。
例如，如上所述，免疫检查点调节剂以及/或者T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段可以在相同的组合物或不同的组合物中提供。作为另一个实例，根据本发明的联合治疗优选包括向对象施用
(iii)糖皮质激素。
在这种情况下再一次，如上所述(在根据本发明使用的组合的上下文中)的糖皮质激素的优选实施方案对于根据本发明的联合治疗也是优选的。例如，如上所述，糖皮质激素优选选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地糖皮质激素是地塞米松。
待用这样的联合治疗治疗的对象与对于根据本发明使用的组合所描述的相同。优选地，将免疫检查点调节剂以及T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段施用于人对象。
此外，在根据本发明的组合的背景下，上述施用方案的优选实施方案也适用于根据本发明的联合治疗。因此，(i)免疫检查点调节剂，和/或(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，和/或任选地，(iii)糖皮质激素优选如上所述施用。
附图简述
在下文中将给出附图的简要描述。附图旨在更详细地说明本发明。然而，它们并不意在以任何方式限制本发明的主题。
图1示意性地示出了包含针对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性和针对T细胞(例如CD3)的特异性的T细胞重定向三功能抗体和检查点分子阻断抗体的治疗性组合背后假定的机理。通过三功能抗体激活T细胞并将其重定向至靶肿瘤细胞。从而，通过T细胞介导的细胞毒性机制如诱导细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解来消除肿瘤细胞。细胞毒性T细胞上抑制性免疫检查点分子如CTLA-4和PD-1的上调(1)不利地影响T细胞介导的抗肿瘤活性。通过检查点分子阻断抗体阻断抑制性免疫检查点分子阻止了T细胞下调并促进持续的T细胞激活。因此，增强了肿瘤细胞的破坏(2)。
图2示出了实施例2的诱导用三功能抗体激活的T细胞上的CTLA-4表达。将从小鼠脾细胞富集的T细胞(i)与1μg/ml三功能抗体Surek、未成熟树突细胞(5％)、经辐照的B78-D14肿瘤细胞(2.5％；上组)，或(ii)与1μg/ml BiLu、未成熟树突细胞(5％)和经辐照的B16-EpCAM肿瘤细胞(2.5％；下组)一起在37℃下体外孵育3天。对于对照，未添加三功能抗体。每天通过鉴别CD4+T细胞和CD8+T细胞的FACS分析来测量CTLA-4和CD69的细胞表面表达。示出了三个独立实验的概况。误差棒表示标准偏差。
图3示出了实施例3的B78-D14黑素瘤模型中治愈性联合治疗的结果。HB304单一治疗无治疗效果(A)：将小鼠(n＝5)用5×105个B78-D14活肿瘤细胞腹膜内(i.p.)攻击，并在肿瘤细胞接种后第2天和第5天接受100μg的HB304抗体(i.p.)(组B)或用PBS载剂对照进行处理(组A)。总体存活率无差异，所有小鼠死亡(p＝0.4)。向Surek中添加HB304提高了其治疗效力(B)：将小鼠(n＝10)用1×105个B78-D14活肿瘤细胞i.p.攻击，并在第2+5天接受单独的50μg Surek(组A)或50μg Surek+100μg HB304(组B)。对照小鼠未接受抗体(组C)。当与HB304抗体组合时，Surek单一治疗的总体存活率从60％提高至90％(p＝0.08；对数秩)。
图4示出了实施例4的B16-EpCAM黑素瘤模型中治愈性联合治疗的结果。将小鼠(n＝10)用1×105个活B16-EpCAM肿瘤细胞静脉内(i.v.)攻击，并在第2+5天用10μg三功能抗体BiLu处理(组B)，或在第9、12、19、26、33、40天用100μg CTLA-4阻断抗体HB304处理(组D)，或者小鼠接受BiLu+HB304的适当组合处理(组C)。对照小鼠未接受抗体处理(组A)。
实施例
在下文中，给出了说明本发明的多种实施方案和方面的具体实施例。然而，本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案。给出以下制备和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解和实施本发明。然而，本发明的范围不受示例性实施方案和方法的限制，这些实施方案仅意在作为本发明的单个方面的举例说明，并且这些方法在本发明的范围内在功能上是等同的。实际上，除了本文所述的那些之外，通过前面的描述、附图和以下实施例，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。所有这样的修改都落入所附权利要求书的范围内。
实施例1：三功能抗体的产生
通过所述的四价体瘤技术产生三功能抗体(“TrAbs”)(Ruf P,LindhoferH.Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctionalbispecific antibody.Blood.2001；98:2526-2534；Ruf P,B,Eiβler N,MocikatR,Hess J,M,Wosch S,Suckstorff I,Zehetmeier C,Lindhofer H.GangliosideGD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeuticactivity in a mouse melanoma model.Journal of translational medicine.2012；10:219)。通过应用连续pH洗脱的蛋白A色谱然后阳离子交换色谱纯化步骤来纯化来源于四价体瘤的上清液。Surek(Eiβler N,Ruf P,Mysliwietz J,Lindhofer H,Mocikat,R.Trifunctional bispecific antibodies induce tumor-specific T cells andelicit a vaccination effect.Cancer research.2012；72:3958-3966；Ruf P,B,Eiβler N,Mocikat R,Hess J,M,Wosch S,Suckstorff I,Zehetmeier C,Lindhofer H.Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surekdemonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model.Journal oftranslational medicine.2012；10:219；Eiβler N,Mysliwietz J,Deppisch N,Ruf P,Lindhofer H,Mocikat R.Potential of the trifunctional bispecific antibodysurek depends on dendritic cells:rationale for a new approach of tumorimmunotherapy.Molecular medicine.2013；19:54-61；Deppisch N,Ruf P,Eiβler N,NeffF,Buhmann R,Lindhofer H,Mocikat R.Efficacy and tolerability of a GD2-directedtrifunctional bispecific antibody in a preclinical model:Subcutaneousadministration is superior to intravenous delivery.Molecular cancertherapeutics.2015；14:1877-1883)是通过亲本杂交瘤17A2(抗小鼠CD3，大鼠IgG2b)和Me361(抗GD2，小鼠IgG2a)的融合产生的trAb(Ruf P,M,Ellwart J,Wosch S,Kusterer E,Lindhofer H.Two new trifunctional antibodies for the therapy ofhuman malignant melanoma.International journal of cancer.2004；108:725-732)。BiLu(Ruf P,Lindhofer H.Induction of a long-lasting antitumor immunity by atrifunctional bispecific antibody.Blood.2001；98:2526-2534)包含相同的抗CD3特异性并且还包含来源于克隆C215的识别人EpCAM的小鼠IgG2a结合臂。为了生产HB304(抗小鼠CTLA-4)，使用仓鼠杂交瘤克隆UC10-4F10-11(Walunas TL,Lenschow DJ,Bakker CY,Linsley PS,Freeman GJ,Green JM,Thompson CB,Bluestone JA.CTLA-4can function asa negative regulator of T cell activation.Immunity.1994；1:405-413)。在化学成分确定的无蛋白培养基中培养细胞系。所有抗体均由Trion Research GmbH生产。
实施例2：在trAb诱导的T细胞激活后CTLA-4上调
为了研究肿瘤定向三功能抗体激活的T细胞的表面上免疫检查点分子CTLA-4是否上调，将来自小鼠脾细胞的富集T细胞与三功能抗体(Surek或BiLu，参见实施例1；1μg/ml)、其相应无增殖能力的(经辐照的)肿瘤靶细胞B78-D14(2.5％；对于Surek)或B16-EpCAM(2.5％；对于BiLu)和未成熟树突细胞(5％)一起在37℃下体外孵育3天。
简单地说，B78-D14(Haraguchi M,Yamashiro S,Yamamoto A,Furukawa K,Takamiya K,Lloyd KO,Shiku H,Furukawa K.Isolation of GD3 synthase gene byexpression cloning of GM3 alpha-2,8-sialyltransferase cDNA using anti-GD2monoclonal antibody.Proceedings of the national academy of sciences of theUnited States of America.1994；91:10455-10459)和B16-EpCAM(Ruf P,LindhoferH.Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctionalbispecific antibody.Blood.2001；98:2526-2534)细胞分别在补充有8.9％和5％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中生长。此外，向B78-D14中添加400μg/ml G418和500μg/ml潮霉素B。在施用前将细胞在PBS中充分洗涤。基于细胞形态和转基因的表达定期确定细胞系的身份。通过在100ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的存在下在补充有20％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和链霉素、50μM 2-巯基乙醇、丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI 1640中培养来自C57BL/6小鼠的骨髓前体细胞来制备未成熟DC。每两天更换培养基，在第7天将细胞在-140℃下冷冻。将冷冻的DC解冻、计数并直接应用于T细胞刺激测定。将通过用抗IgG+M抗体(Dianova，Hamburg，Germany)淘选B淋巴细胞而从初始C57BL/6小鼠的脾脏中分离的4×106个T细胞与2×105个DC和105个经辐照(100Gy)的肿瘤细胞在24孔板中共同培养3天。以1μg/ml添加TrAb。将细胞在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、10mM HEPES和50μM 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中培养。
对于对照，未添加三功能抗体。在时间点0h、24h、48h和72h，使用HB304抗体通过鉴别CD4+T细胞和CD8+T细胞的FACS分析来测量CTLA-4的细胞表面表达。即，使用FACSCalibur流式细胞仪和cell quest分析程序(BD Bioscience，Heidelberg，Germany)通过荧光激活细胞分选(FACS)进行T细胞分析。将T细胞表面标志物用针对CD4(克隆RM4-5；BDBiosciences)和CD8(53-6.7，eBioscience，San Diego，USA)的荧光标记的mAb直接染色。使用荧光标记的HB304抗体测量CTLA-4的细胞表面表达。与相应的同种型对照相比，确定阳性细胞的百分比。另外，通过如上所述的FACS分析在时间点0h、24h、48h和72h通过测量T细胞激活标志物CD69来评价T细胞的激活状态，其中将T细胞表面标志物CD69用荧光标记的mAb(H1.2F3；BD Bioscience)直接染色。
结果示于图2中。两种三功能抗体均诱导强烈的CD4+以及CD8+T细胞激活，随后是CTLA-4的上调。与24h后已达到峰值的CD69相比，CTLA-4的表达延迟1至2天，并在48至72h达到峰值。在未激活的T细胞中未观察到CTLA-4表达。总之，这些结果清楚地表明，通过三功能抗体的T细胞激活之后是CTLA-4的上调。
实施例3：trAb与抗CTLA-4处理组合改善了直接肿瘤杀伤
为了评价三功能T细胞重定向抗体和抑制性检查点分子阻断抗体联合治疗的治疗/治愈潜力，在治疗/治愈环境中使用良好确立的GD2+小鼠黑素瘤模型B78-D14((Ruf P,B,Eiβler N,Mocikat R,Hess J,M,Wosch S,Suckstorff I,ZehetmeierC,Lindhofer H.Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surekdemonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model.Journal oftranslational medicine.2012；10:219)。将该模型肿瘤(B16F0来源的黑素瘤B78-D14)被改造以表达GD2。该神经节苷脂是对于靶向小细胞肺癌和神经外胚层起源的恶性肿瘤例如人的成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤或黑素瘤有希望的抗原。
对GD2和小鼠CD3具有特异性的trAb Surek(Ruf P,B,Eiβler N,MocikatR,Hess J,M,Wosch S,Suckstorff I,Zehetmeier C,Lindhofer H.GangliosideGD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeuticactivity in a mouse melanoma model.Journal of translational medicine.2012；10:219)作为替代trAb使GD2与小鼠T细胞上的CD3受体交联。
作为检查点抑制剂阻断抗体的实例，使用伊匹单抗替代抗体HB304(克隆UC10-4F10-11；Walunas TL,Lenschow DJ,Bakker CY,Linsley PS,Freeman GJ,Green JM,Thompson CB,Bluestone JA.CTLA-4can function as a negative regulator of T cellactivation.Immunity.1994；1:405-413)，其针对小鼠CTLA-4。
C57BL/6小鼠购自Taconic(Ry，Denmark)。动物实验至少进行两次，每组包括5只雌性动物。为了测试trAb诱导的肿瘤排斥，使小鼠接受1×105个B78-D14活肿瘤细胞的攻击，并在第2天和第5天用50μg Surek进行处理。在第2天和第5天，与Surek同时给予100μgHB304。所有细胞和抗体腹膜内递送。在每个实验包括仅接受肿瘤细胞和PBS的对照组。当肿瘤生长迹象变得明显时，对小鼠实施安乐死。所有动物实验按照动物福利法规，并经主管当局批准。
结果示于图3中。在用B78-D14黑素瘤致死攻击之后2天开始的用三功能抗体Surek和抗CTLA-4抗体HB304联合治疗之后，B78-D14攻击的小鼠的总体存活率改善。第一个实验证明在B78-D14肿瘤模型中HB304单一治疗是无效的：与未接受抗体处理的对照组相比，未观察到存活延长(图3A)。然而，当HB304抗体与三功能抗体(Surek)组合时，小鼠的总体存活率从60％(Surek单一治疗)提高至90％(Surek+HB304组合)。总体存活率的这种明显改善的表明三功能抗体与抗CTLA-4阻断抗体的组合提高了其治疗效力(图3B)。
实施例4：使用不同的肿瘤模型trAb与抗-CTLA-4处理的组合也改善了直接肿瘤杀伤
已经表明，通过在非免疫原性肿瘤模型B78-D14(实施例3)中添加CTLA-4阻断抗体可以提高三功能抗体的治疗效力，本实施例的目的是在更具免疫原性的肿瘤模型B16-EpCAM(Ruf P,Lindhofer H.Induction of a long-lasting antitumor immunity by atrifunctional bispecific antibody.Blood.2001；98:2526-2534)中评价联合治疗的治疗/治愈潜力，B16-EpCAM表达由临床相关的trAb卡妥索单抗识别的抗原。
对EpCAM和小鼠CD3具有特异性的trAb BiLu(Ruf P,Lindhofer H.Induction ofa long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecificantibody.Blood.2001；98:2526-2534)作为替代trAb使EpCAM与小鼠T细胞上的CD3受体交联。
C57BL/6小鼠购自Taconic(Ry，Denmark)。动物实验至少进行两次，每组包括10只雌性动物。为了测试trAb诱导的肿瘤排斥，将小鼠用1×105个有活B16-EpCAM肿瘤细胞静脉内(i.v.)攻击，并在第2和5天用10μg三功能抗体BiLu处理(组B)，或在第9、12、19、26、33、40天用100μg CTLA-4阻断抗体HB304处理(组D)，或使小鼠接受两种抗体方案的组合处理(组C(组B+组D方案的组合))。对照小鼠接受肿瘤细胞和PBS，但不接受抗体处理(组A)。当肿瘤生长迹象变得明显时，对小鼠实施安乐死。所有动物实验按照动物福利法规，并经主管当局批准。
结果示于图4中。首先，建立由肿瘤攻击后在第9、12、19、26、33和40天进行的六次注射组成的HB304维持治疗。该维持治疗显著延长了小鼠的总体存活，并且对于三功能抗体BiLu单一治疗比较有效，两者具有20％长期存活者(图4)。有趣的是，两种抗体的组合进一步将小鼠的存活率提高至40％。此外，与BiLu处理组B中59天的中位存活期和HB304处理组中51天的中位存活期相比，组合组C达到110天的最长中位存活期。对照组A中的小鼠全部死亡，中位存活期为41天。因此，CTLA-4阻断抗体与三功能抗体BiLu的组合具有明显的阳性治疗效果。

Claims (88)

1.用于治疗性治疗癌症疾病的以下的组合：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
2.根据权利要求1使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段针对不同靶标。
4.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段诱导免疫检查点分子的提高的表达。
5.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中与由(i)单独的所述免疫检查点调节剂或(ii)单独的所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段诱导的T细胞激活相比，所述组合介导持续的T细胞激活。
6.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和CD44。
7.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞表面抗原不是CD28。
8.根据权利要求6或7使用的所述组合，其中所述T细胞表面抗原是CD2或CD3，优选地所述T细胞表面抗原是CD3。
9.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述癌和/或肿瘤相关抗原不是PD-L1。
10.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述癌和/或肿瘤相关抗原不是免疫检查点分子和/或其配体。
11.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、α(v)β(3)-整合素、HLA、HLA-DR、ASC、碳酸酐酶、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30 CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD47、CD52、CD138、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4、Trp2、gp100、酪氨酸酶、MUC-1、端粒酶、生存素、p53、CA125、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、MCSP、EphA2和细胞表面靶标GC182、GT468或GT512。
12.根据权利要求11使用的所述组合，其中所述癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、MAGE、VEGF、EGFR、mTOR、PIK3CA、RAS、GD2、CD19、CD20、CD30、CD33和CD38，优选地所述癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、CEA、GD2、CD19、CD20和CD33，更优选地所述癌和/或肿瘤相关抗原选自EpCAM、HER2/neu、GD2和CD20，并且甚至更优选地所述癌和/或肿瘤相关抗原是EpCAM或GD2。
13.根据权利要求12使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含针对CD3的第一特异性和针对选自EpCAM、HER2/neu、CEA、GD2、CD19、CD20和CD33的癌和/或肿瘤相关抗原的第二特异性。
14.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段不包含针对CD19的特异性。
15.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段不包含针对CEA的特异性。
16.根据权利要求13、14和15中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的两种特异性：抗EpCAM x抗CD3、抗CD20 x抗CD3、抗HER2/neu x抗CD3、抗GD2 x抗CD3和抗CD19 x抗CD3。
17.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc部分。
18.根据权利要求17使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区。
19.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点、特别是所述Fc部分是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b。
20.根据权利要求19使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含小鼠IgG2a/大鼠IgG2b Fc区。
21.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体具有IgG样形式。
22.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是异源抗体或其抗原结合片段。
23.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含来源于大鼠和/或小鼠的重链。
24.根据权利要求23使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是大鼠和/或小鼠抗体或其抗原结合片段。
25.根据权利要求24使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是大鼠/小鼠抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求26使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是小鼠IgG2a/大鼠IgG2b抗体或其抗原结合片段。
27.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段是三功能抗体，特别是三功能双特异性抗体。
28.根据权利要求27使用的所述组合，其中所述抗体或其抗原结合片段选自卡妥索单抗、lympomun、ertumaxomab、ektomab，优选地所述抗体是卡妥索单抗和/或ektomab。
29.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂是选自以下的一种或更多种免疫检查点分子的激活剂或抑制剂：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、GITR、TNFR和/或FasR/DcR3；或其一种或更多种配体的激活剂或抑制剂。
30.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂是刺激性或共刺激性检查点分子的激活剂或抑制性检查点分子的抑制剂或其组合。
31.根据权利要求29或30使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂是抑制性检查点分子的抑制剂，优选以下的抑制剂：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD40、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、CEACAM1、GARP、PS、CSF1R、CD94/NKG2A、TDO、TNFR和/或DcR3，或其配体。
32.根据权利要求29或30使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂是刺激性或共刺激性检查点分子的激活剂，优选以下激活剂：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和/或ICOS，或其配体。
33.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂不是抗CD28抗体，优选地所述免疫检查点调节剂不针对CD28。
34.根据权利要求29至33中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂是CTLA-4、PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂；更优选地，所述免疫检查点调节剂是CTLA-4和/或PD-1的抑制剂。
35.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中使用多于一种免疫检查点调节剂，特别是使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的免疫检查点调节剂，优选地使用2、3、4或5种不同的免疫检查点调节剂，更优选地使用2、3或4种不同的免疫检查点调节剂，甚至更优选地使用2或3种不同的免疫检查点调节剂，并且最优选地使用2种不同的免疫检查点调节剂。
36.根据权利要求35使用的所述组合，其中使用至少(α)CTLA-4的抑制剂和(β)PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抑制剂，优选地使用至少(α)CTLA-4的抑制剂和(β)PD-1的抑制剂。
37.根据权利要求29至34中任一项使用的所述组合，其中所述抗体是卡妥索单抗和/或ektomab，并且所述免疫检查点调节剂是CTLA-4的抑制剂。
38.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体大约同时施用。
39.根据权利要求1至37中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体相继施用。
40.根据权利要求39使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之前施用。
41.根据权利要求39使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后施用。
42.根据权利要求41使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后至少6小时、优选至少12小时、更优选至少18小时、甚至更优选至少24小时、更优选至少36小时并且最优选至少48小时施用。
43.根据权利要求41或42使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之后不多于96小时、优选不多于84小时、更优选不多于72小时并且最优选不多于60小时施用。
44.根据权利要求41至43中任一项使用的所述组合，其中(i)所述免疫检查点调节剂的第一次施用在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的第一次施用之后12至96小时、优选24至84小时、更优选36至72小时、并且最优选48至60小时施用；和/或(ii)所述免疫检查点调节剂的最终施用在所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段的最终施用之后12至96小时、优选24至84小时、更优选36至72小时并且最优选48至60小时施用。
45.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体通过相同的施用途径施用。
46.根据权利要求1至44中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体通过不同的施用途径施用。
47.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体在不同的组合物中提供。
48.根据权利要求1至38和45中任一项使用的所述组合，其中所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体在相同的组合物中提供。
49.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述组合用于治疗性治疗人对象中的癌症疾病。
50.根据权利要求49使用的所述组合，其中所述癌症疾病选自肺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱肿瘤、浆细胞瘤和/或肉瘤。
51.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段以0.1至5000μg的单剂量、优选以1至1000μg的单剂量、更优选以2μg至750μg的单剂量、甚至更优选以3μg至700μg的单剂量、更优选以5μg至600μg的单剂量、并且最优选以10μg至500μg的单剂量施用。
52.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段以不多于1mg、优选不多于0.9mg、更优选不多于0.8mg、甚至更优选不多于0.75mg并且最优选不多于0.5mg的单剂量施用。
53.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其中所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段根据递增剂量方案施用。
54.根据前述权利要求中任一项使用的所述组合，其还包含
(iii)糖皮质激素。
55.根据权利要求54使用的所述组合，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地所述糖皮质激素是地塞米松。
56.根据权利要求54或55使用的所述组合，其中所述糖皮质激素在施用所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之前和/或在施用所述免疫检查点调节剂之前施用。
57.根据权利要求56使用的所述组合，其中所述糖皮质激素在施用所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段之前不长于6小时、优选不长于5小时、更优选不长于4小时、甚至更优选不长于3小时、更优选不长于2小时并且最优选不长于1小时和/或在施用所述免疫检查点调节剂之前不长于6小时、优选不长于5小时、更优选不长于4小时、甚至更优选不长于3小时、更优选不长于2小时并且最优选不长于1小时施用。
58.根据权利要求54至57中任一项使用的所述组合，其中所述糖皮质激素与所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段大约同时施用，和/或所述糖皮质激素与所述免疫检查点调节剂大约同时施用。
59.用于治疗性治疗特别是人对象中的癌症疾病的药盒，其包含：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
60.根据权利要求59使用的所述药盒，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段分别如权利要求2至28和/或29至37中任一项中限定。
61.根据权利要求59或60使用的所述药盒，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段在相同的组合物或不同的组合物中提供。
62.根据权利要求59至61中任一项使用的所述药盒，其中所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段以单剂量提供，其中每个单剂量不超过1mg，优选地每个单剂量不超过0.9mg，更优选地每个单剂量不超过0.8mg，甚至更优选地每个单剂量不超过0.75mg并且最优选地每个单剂量不超过0.5mg。
63.根据权利要求59至62中任一项使用的所述药盒，其还包含
(iii)糖皮质激素。
64.根据权利要求63使用的所述药盒，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地所述糖皮质激素是地塞米松。
65.根据权利要求59至64中任一项使用的所述药盒，其中所述药盒还包含包装插页或标签，所述包装插页或标签具有使用(i)所述免疫检查点调节剂和(ii)所述抗体或其抗原结合片段以及任选地(iii)所述糖皮质激素的组合治疗癌症的说明书。
66.根据权利要求65使用的所述药盒，其中所述说明书包括如权利要求38至46、49至53和56至58中任一项中所限定的施用方案。
67.组合物，其包含
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段分别如权利要求2至28和/或29至37中任一项中限定。
69.根据权利要求67或68所述的组合物，其还包含
(iii)糖皮质激素。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地所述糖皮质激素是地塞米松。
71.根据权利要求67至70中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含可药用载体。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的组合物，其用于医药。
73.根据权利要求72使用的所述组合物，其用于治疗性治疗特别是人对象中的癌症疾病。
74.用于在有此需要的对象中治疗性治疗癌症或启动、增强或延长抗肿瘤应答的方法，其包括向所述对象施用
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
75.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段分别如权利要求2至28和29至37中任一项中限定。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段在相同的组合物或不同的组合物中提供。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用
(iii)糖皮质激素。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地所述糖皮质激素是地塞米松。
79.根据权利要求74至78中任一项所述的方法，其中所述对象是被诊断有癌症的人对象。
80.根据权利要求74至79中任一项所述的方法，其中(i)所述免疫检查点调节剂，和/或(ii)所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，和/或任选地(iii)所述糖皮质激素如权利要求38至46、49至53、和56至58中任一项中所限定施用。
81.延长对象中T细胞激活的方法，其包括向对象施用以下的组合：
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
82.用于治疗性治疗癌症的联合治疗，其中所述联合治疗包括施用
(i)免疫检查点调节剂和
(ii)T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段包含：
(a)针对T细胞表面抗原的特异性；
(b)针对癌和/或肿瘤相关抗原的特异性；和
(c)人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII的结合位点，其中所述抗体或其抗原结合片段以比与人FcγRIIb更高的亲和力与人FcγRI、FcγRIIa和/或FcγRIII结合。
83.根据权利要求82所述的联合治疗，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段分别如权利要求2至28和/或29至37中任一项中限定。
84.根据权利要求82或83所述的联合治疗，其中所述免疫检查点调节剂和/或所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段在相同的组合物或不同的组合物中提供。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的联合治疗，其中所述方法还包括向所述对象施用
(iii)糖皮质激素。
86.根据权利要求85所述的联合治疗，其中所述糖皮质激素选自泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、曲安奈德、倍他米松、地塞米松、乙酸可的松、泼尼立定、地夫可特、氯泼尼醇、氟可龙和布地奈德，最优选地所述糖皮质激素是地塞米松。
87.根据权利要求82至86中任一项所述的联合治疗，其中向人对象施用所述免疫检查点调节剂和所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段。
88.根据权利要求82至87中任一项所述的联合治疗，其中(i)所述免疫检查点调节剂，和/或(ii)所述T细胞重定向多功能抗体或其抗原结合片段，和/或任选地(iii)所述糖皮质激素如权利要求38至46、49至53、和56至58中任一项中所限定施用。
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