CN112739379A - 包含OX40抗原结合位点的Fc结合片段 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及结合OX40的特异性结合成员。特异性结合成员包含位于该特异性结合成员的恒定结构域中的OX40抗原结合位点，并且可用于例如癌症和传染病的治疗中。

Description

包含OX40抗原结合位点的Fc结合片段
发明领域
本发明涉及结合OX40的特异性结合成员。所述特异性结合成员包含位于该特异性结合成员的恒定结构域中的OX40抗原结合位点，并且可用于例如癌症和传染病的治疗中。
发明背景
细胞信号传导是所有生物生命的重要组成部分，通常涉及与可溶性或细胞表面表达的配体相互作用的细胞表面受体。这种相互作用导致受体、配体或两者的变化。例如，配体结合可以在受体中诱导构象变化，从而使它们簇聚成二聚体或寡聚体。然后，这种簇聚效应导致细胞内信号传导途径的激活。有许多以此方式激活的受体，包括肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员，例如OX40。
OX40(也称为CD134和TNFRSF4)主要在活化的T细胞上表达，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、1型和2型T辅助细胞(Th1和Th2)和调节性T(Treg)细胞，并也在活化的自然杀伤细胞(NK)上表达。OX40及其在抗原呈递细胞(APC)上表达的配体OX40L的相互作用导致OX40受体簇聚。OX40L与其他肿瘤坏死因子(TNF)受体的大多数配体一样，以三聚体形式在细胞表面表达。OX40激活的假设模型是，OX40与细胞表面表达的三聚体OX40L的相互作用诱导了OX40受体的簇聚，该受体以单体或预形成的三聚体形式存在于细胞表面。OX40受体的这种簇聚作用激活了NFkB信号通路(Croft，2010)。NFkB信号通路的激活反过来又增加了T细胞激活、T细胞克隆扩增、T细胞分化和存活，并增强了记忆T细胞的生成。OX40/OX40L相互作用的主要作用是调节在初次免疫反应晚期中，效应(保护性或致病性)T细胞的数量的积累，从而在以后的时间再次遇到抗原时，增加在二次免疫反应中可用于反应的记忆T细胞的数量(Croft，2010)。OX40可以如上所述直接介导其对T细胞的作用，或通过增强炎症细胞因子(例如IL2和IFNγ)的产生间接介导其对T细胞的作用。OX40信号传导还可调节Treg细胞的功能，以消除其免疫抑制活性(Croft，2010年)。
OX40激动剂的治疗功效已在小鼠肿瘤模型中得到证实。具体而言，已证明OX40激动剂(OX40L-Ig和抗OX40 mAb OX86)在黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌和结肠癌、肉瘤、肾癌和前列腺癌的小鼠肿瘤模型中具有治疗效果(Weinberg等，2000；Morris等，2001；Ali等，2004；Sadun等，2008；Redmond等，2009)。OX40激动剂单一疗法的有效性似乎与肿瘤的免疫原性相关(Kjaergaard等，2000)，提示肿瘤特异性T细胞上的OX40表达需要肿瘤抗原充分启动，而免疫原性差的肿瘤无法提供足够的启动。
抗OX40激动剂抗体的功效也正在临床试验中开展研究，既可以作为单一疗法，也可以与其他单克隆抗体(mAb)组合使用。
抗OX40 mAb作为单一疗法的临床测试包括对晚期癌症患者进行小鼠单克隆抗OX40 mAb的I期研究，该研究显示出可接受的毒性问题，并在30例患者中有12例至少有一处转移病灶消退(Curti等，2013年)。一项针对晚期实体瘤患者的人源化抗OX40 mAb(MEDI0562；MedImmune)的I期研究结果初步显示，没有剂量限制性毒性(DLT)，32例患者中有1例显示出客观反应(objective response)(Glisson等，2016)。
如上所述，抗OX40 mAb与其他mAb组合，用于癌症治疗也正在处于测试中。例如，抗OX40 mAb与抗PD-L1 mAb(度伐单抗，durvalumab)或抗CTLA4 mAb(曲美木单抗，tremelimumab)的组合(临床试验.政府标识符：NCT02705482),正处于晚期实体瘤测试中。这些组合已在临床前模型中进行了测试，并显示出改善的肿瘤消退和生存率(Guo等人，2014；Redmond等人，2014)。
抗OX40 mAb(MOXR0916；基因泰克)作为单一疗法(NCT02219724)，以及与抗PD-L1mAb(阿特珠单抗，atezolizumab)(NCT03029832)组合用于治疗局部晚期或转移性实体瘤的临床试验正在测试中。目前正在评估人源化抗OX40 mAb(GSK3174998；葛兰素史克)与抗PD-1mAb(派姆单抗，pembrolizumab)的组合，以治疗所选择的晚期或复发性实体瘤(NCT02528357)。人类抗OX40 mAb(PF-04518600；辉瑞)已在治疗局部晚期或转移性癌症的临床试验中进行了测试，被证明具有良好的耐受性，并且在48例患者中有27例达到部分缓解(2例患者)或病情稳定(25例患者)(NCT02315066；El-Khoueiry等，2017)。该mAb也已与抗4-1BB激动剂mAb(PF-05082566/埃托米鲁单抗，utomilumab)(NCT02315066)和抗PD-L1 mAb(阿维单抗，avelumab)(NCT02554812)组合进行测试，用于治疗局部晚期或转移性实体瘤。人IgG1抗OX40 mAb(BMS-986178；百时美-施贵宝)正在与抗PD-1 mAb(尼古鲁单抗，nivolumab)或抗CTLA-4mAb(伊匹单抗，ipilimumab)，或两者组合同时进行临床试验，以治疗晚期或已扩散的实体癌(NCT02737475)。
发明说明
本发明人进行了广泛的选择和亲和力成熟程序，以分离出一组抗体Fc区片段(FcabsTM)，其包含被工程化到其CH3结构域中的OX40抗原结合位点。
Fcab分子由两条相同的多肽链组成，每条多肽链包含一个截短的铰链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域。两条多肽链通过铰链区中的多个二硫键和CH3域中存在的疏水区连接在一起。如上所述，OX40配体与其受体OX40的初始连接引发了一系列事件，这些事件导致OX40受体簇聚，随后激活了NFkB细胞内信号传导途径，并随后引发了强效的T细胞活性。为了使治疗剂有效地实现活化，需要以模拟表面表达三聚体配体的方式将几种OX40单体桥接在一起。本发明人基于其结合OX40的能力分离出的抗OX40 Fcab的子集，显示能够驱动T细胞表面上的OX40簇聚和活化。这是令人惊讶的，鉴于Fcab分子的恒定结构域(尤其是两个CH3结构域)之间的刚性结构和较小的分子距离，这与抗体分子在铰链区的已知柔性相反，所述柔性使得抗-OX40抗体分子的Fab臂能够移动并结合其靶标。鉴于Fcab分子恒定结构域结合位点的紧密几何结构，预计这些结合位点将无法诱导OX40分子的簇聚和激动作用，这可能最初不在T细胞表面附近。然而，与预期相反，本文所述的本发明人获得的结果清楚地表明，抗OX40 Fcab能够在体外和体内诱导OX40的簇聚和活化。
选择Fcab以高亲和力结合二聚体OX40，即预期以高亲和力结合OX40。对二聚体OX40的高亲和力被认为有利于诱导OX40簇聚和活化。
如本文所指，“亲和力”可以指抗体分子与其同源抗原之间的结合相互作用的强度，通过KD测定。对于本领域技术人员而言显而易见的是，其中抗体分子能够与抗原形成多重结合相互作用(例如，其中抗体分子能够与抗原二价结合并且任选地抗原是二聚体)，如通过KD测得的亲和力也可能受到亲合力(avidity)的影响，其中亲合力是指抗体-抗原复合物的整体强度。
发明人鉴定的能够诱导OX40簇聚和活化的Fcab分为两组。第一组Fcab(FS20-11谱系)依赖于交联，例如一种用于OX40聚簇和活化的抗CH2域抗体，而第二组(FS20-22和FS20-31谱系)即使在没有交联的情况下也显示出低水平的OX40聚簇和激活。OX40激动剂抗体在临床上未显示任何DLT。因此，在没有交联的情况下，OX40激动剂活性预计不会成为临床治疗的问题。相反，取决于待治疗的病症，在不存在交联的情况下，Fcab的低水平的OX40激动剂活性可能是有利的。不希望被理论所束缚，据认为具有该特性的抗OX40 Fcab可用于，例如在没有交联存在下，通过诱导肿瘤反应性T细胞的有限活化和扩增的癌症治疗中，进而导致产生更大的肿瘤反应性T细胞库，然后其可被在肿瘤微环境中的交联Fcab分子进一步激活。
对TNF受体特异的常规抗体(例如OX40)通常不具有或仅具有非常中等的内在激动活性，并且需要使用外部交联剂对抗体-TNFRSF分子复合物进行二次交联，例如蛋白A或G或二抗，或者将抗体与质膜定位的Fcγ受体，以诱导更高水平的TNF受体成员簇聚和激活(Wajant，2015)。在不存在交联的情况下，TNF受体特异性抗体的水平较低或缺乏激动剂活性，可以通过以下事实来解释：正常的二价抗体可以最大程度地交联两个单体TNF受体，而这对于TNF受体的激活是不够的。因此，为了体内功效，靶向OX40的单特异性抗体需要在表达OX40的T细胞附近存在表达Fcγ受体的细胞，以实现OX40特异性抗体的交联以及随后的OX40受体的簇聚和活化。然而，认为Fcγ受体介导的交联效率低下。另外，表达Fcγ受体的细胞遍布全身，因此表达OX40的T细胞的抗体交联和活化不限于特定部位，例如肿瘤微环境。此外，需要选择这类OX40抗体的同种型以介导与Fcγ受体的有效结合以进行交联。但是，这可能导致抗体引发由Fcγ受体(例如ADCC)介导的效应子功能，从而消除了本会被抗体激活的T细胞。
本发明人已经对交联的Fcab-OX40复合物(具有mAb2形式的Fcab)进行了质谱分析，其显示17％的复合物包含两个OX40部分，表明本发明的抗OX40 Fcab可以二价结合OX40。
本发明人认识到，本发明的抗OX40 Fcab可用于制备多特异性分子，例如双特异性分子，所述分子除了结合OX40外还结合第二抗原，例如肿瘤抗原。优选地，多特异性分子也能二价结合第二抗原，尽管预期第二抗原是细胞结合的肿瘤抗原，抗原的单价结合将足以使特异性结合成员/抗体分子交联并诱导OX40簇集和激活。
本发明人已经制备了包含本发明的抗OX40 Fcab的抗体分子，其可以通过其Fab区二价结合第二抗原。本发明人已经表明，这种双特异性抗体分子能够在所述第二抗原的存在下，有条件地激活OX40，而无需通过常规抗体分子需要的，例如Fcγ受体交联来激活。无论第二抗原是细胞表面受体还是多聚体可溶性因子，都观察到相同的效果。认为抗体分子与第二抗原的结合引起抗体分子在所述抗原位点的交联，这继而导致T细胞表面上OX40的簇聚和活化。因此，抗体分子的激动活性取决于第二抗原和OX40两者的存在，或在两者同时存在时被增强。换句话说，激动活性是有条件的。另外，当存在第二抗原时，认为抗体的交联有助于经由抗体分子的恒定结构域抗原结合位点结合的OX40的簇聚，因为当观察到抗体分子的激动活性增加时，抗体分子的两个结合位点均与各自的靶标结合，但仅结合一个结合位点时不增加。因此，预期包含本发明的抗OX40 Fcab的多特异性分子以疾病依赖性方式，例如在肿瘤微环境中有效激活免疫细胞。
本发明人已经表明，包含本发明的抗OX40 Fcab的双特异性抗体分子能够体内抑制肿瘤的生长。此外，与两个单特异性抗体分子的组合相比，用这些双特异性抗体分子观察到了更有效的肿瘤生长抑制，其中一个抗体分子包含与双特异性分子相同的恒定域，另一个抗体分子具有相同的可变域结合位点，表明增强的OX40的簇集和信号传导，因此当两个结合位点存在于同一分子中时，可以观察到T细胞活化和相应的抗肿瘤作用。
如上所述，与常规抗体相反，包含本发明的抗OX40 Fcab的抗体分子不依赖于Fcγ受体交联以驱动OX40簇聚和活化。用于消除Fcγ受体结合的突变是本领域已知的，并且可以包括在本发明的分子中。然而，在某些情况下，例如癌症治疗，保留Fcγ受体结合可能是有益的。例如，如果抗体分子通过其Fab区与肿瘤抗原结合，并且OX40抗原结合位点没有被结合，则肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)将被诱导。除了T细胞活化，和随后的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，抗体分子还诱导ADCC作用。
包含本发明的抗OX40 Fcab和对第二抗原具有特异性的Fab区的抗体分子，优选二价结合OX40和第二抗原。这是有利的，因为预期两个靶标的二价结合将使表达OX40的T细胞与第二抗原之间的桥接更稳定，从而延长T细胞定位于特定部位的时间，例如肿瘤微环境，并且可以对疾病起作用，例如肿瘤。这与绝大多数常规的双特异性抗体形式不同，后者是异二聚体并通过一个Fab臂单价结合每个靶抗原。预期这样的单价相互作用不仅不稳定，而且在许多情况下首先不足以诱导TNFRSF受体例如OX40的簇聚。
包含本发明的抗OX40 Fcab的抗体分子的另一个特征是OX40和第二抗原的两个抗原结合位点都包含在抗体结构本身内。特别地，抗体分子不需要经由接头或其他手段将其他蛋白质融合至抗体分子以产生与其两个靶标均二价结合的分子。这具有许多优点。具体地，由于抗体分子不包含任何额外的融合部分，因此它们可以使用与产生标准抗体的方法相似的方法来产生。由于接头可能随时间降解，导致抗体分子的异质群体，因此该结构也有望提高抗体的稳定性。仅具有一种融合蛋白的群落中的那些抗体将不能像具有两种融合蛋白的抗体一样有效地诱导TNFRSF受体(例如OX40)的条件激动。接头的切割或降解可在将治疗剂给药于患者之前或之后发生(例如，通过酶促切割或患者体内pH)，从而导致在患者个体循环时的有效性降低。由于发明鉴定的抗体分子中没有接头，因此预期抗体分子在给药之前和之后均保留相同数目的结合位点。此外，从分子的免疫原性的角度来看，本发明的抗体分子的结构也是优选的，因为当将抗体分子施用于患者时，融合蛋白或接头或两者的引入可诱导免疫原性，导致治疗的效果降低。
因此，本发明提供：
[1]一种结合OX40的特异性结合成员，其包含位于该特异性结合成员的CH3结构域的OX40抗原结合位点，其中所述OX40抗原结合位点包含特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的第一、第二和/或第三，优选第一和第三序列，更优选为第一、第二和第三序列，其中特异性结合成员的第一、第二和第三序列为：
(i)FS20-22-49的分别在SEQ ID NO：43、54和71中列出；
(ii)FS20-22-41的分别在SEQ ID NO:43、54和45中列出；
(iii)FS20-22-47的分别在SEQ ID NO:43、54和62中列出；
(iv)FS20-22-85的分别在SEQ ID NO:43、54和80中列出；和
(V)FS20-22-38的分别在SEQ ID NO:43、44和45中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
[2]一种结合OX40的特异性结合成员，其包含位于所述特异性结合成员的CH3结构域中的OX40抗原结合位点，其中所述OX40抗原结合位点包括FS20-31-115、FS20-31-108，FS20-31-58，FS20-31-94，FS20-31-102或FS20-31-66的第一、第二和/或第三，优选第一和第三序列，更优选为第一、第二和第三序列，其中所述特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-31-115的分别在SEQ ID NO：122、142和133中列出；
(ii)FS20-31-108的分别在SEQ ID NO:122、132和133中列出；
(iii)FS20-31-58的分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出；
(iv)FS20-31-94的分别在SEQ ID NO:111、112和113中列出；
(v)FS20-31-102的分别在SEQ ID NO:122、123和102中列出；和
(vi)FS20-31-66的分别在SEQ ID NO:91、92和102中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
[3]一种结合OX40的特异性结合成员，其包含位于该特异性结合成员的CH3结构域的OX40抗原结合位点，其中所述OX40抗原结合位点包含特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的第一、第二和/或第三，优选第一和第三序列，更优选为第一、第二和第三序列，其中特异性结合成员的第一、第二和第三序列为：
(i)FS20-11-131的分别在SEQ ID NO:12、13和23中列出；
(ii)FS20-11-127的分别在SEQ ID NO:12、13和14中列出；和
(iii)FS20-11-134的分别在SEQ ID NO:12、13和32中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
[4]根据[1]的特异性结合成员，其中第三序列位于CH3结构域的92和102位之间，其中氨基酸残基编号根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行。
[5]根据[2]的特异性结合成员，其中第三序列位于CH3结构域的91和102位之间，其中氨基酸残基编号根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行。
[6]根据[3]的特异性结合成员，其中第三序列位于CH3结构域的位置96和102之间，其中氨基酸残基编号根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行。
[7]根据[3]或[6]的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员在CH3结构域的14、15、16、17或18位包含氨基酸缺失，其中氨基酸残基编号根据IMGT编号方案进行。
[8]根据[1]至[7]中任一项的特异性结合成员，其中所述第一序列位于CH3结构域的13和19位之间，其中氨基酸残基编号根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行。
[9]根据[1]至[8]中任一项的特异性结合成员，其中第二序列位于CH3结构域的45和78位之间，其中氨基酸残基编号根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行。
[10]根据[1]至[9]中任一项的特异性结合成员，其中所述CH3结构域是人IgG1CH3结构域。
[11]根据[1]、[4]和[8]至[10]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含分别在SEQ ID NO:72、55、63、81和46中列出的特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH3结构域序列。
[12]根据[11]的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含SEQ ID NO：72所示的特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域序列。
[13]根据[2]，[5]和[8]至[10]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含分别在SEQ ID NO:143、134、94、114、124和103中列出的特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH3结构域序列。
[14]根据[3]、[6]、[7]和[8]至[10]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含分别在SEQ ID NO:24、15和33中列出的特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH3结构域序列。
[15]根据[1]至[14]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员还包含CH2结构域，优选人IgG1的CH2结构域。
[16]根据[15]的特异性结合成员，其中所述CH2结构域具有SEQ ID NO：5、6或7中列出的序列。
[17]根据[15]至[16]中任一项的特异性结合成员，所述特异性结合成员在CH2结构域的N-末端还包含免疫球蛋白铰链区或其部分。
[18]根据[1]的特异性结合成员，其中所述铰链区或其部分，是人IgG1铰链区或其部分。
[19]根据[18]的特异性结合成员，其中所述铰链区具有SEQ ID NO：170中列出的序列或其片段。
[20]根据[18]或[19]的特异性结合成员，其中所述铰链区具有SEQ ID NO：171中所列出的序列。
[21]根据[1]、[4]、[8]至[10]，[11]至[12]和[15]至[20]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:74、57、65、83和48中列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38；或
(ii)分别在SEQ ID NO:76、59、67、85和50中列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38。
[22]根据[21]的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76中所列出的特异性结合成员FS20-22-49的序列。
[23]根据[2]、[5]、[8]至[10]、[13]，和[15]至[20]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:145、136、96、116、126和105中列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66；或
(ii)分别在SEQ ID NO:147、138、98、118、128和107中列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66。
[24]根据[3]、[6]、[7]至[10]，和[14]至[20]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:26、17和35中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134；或
(ii)分别在SEQ ID NO:28、19和37中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134。
[25]根据[1]至[24]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员结合人OX40。
[26]根据[25]的特异性结合成员，其中所述人OX40具有，包含或由SEQ ID NO：161所列出的序列组成。
[27]根据[1]、[2]、[4]、[5]、[8]至[13]、[15]至[23]和[25]至[26]，其中特异性结合成员结合食蟹猴OX40。
[28]根据[27]的特异性结合成员或抗体分子，其中食蟹猴OX40具有，包含或由SEQID NO：166所列出的序列组成。
[29]根据[1]至[28]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是多特异性分子。
[30]根据[29]的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是双特异性、三特异性或四特异性分子。
[31]根据[30]的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是双特异性分子。
[32]根据[1]至[31]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员还包含第二抗原结合位点。
[33]根据[32]的特异性结合成员，其中第二抗原结合位点是基于CDR的抗原结合位点。
[34]根据[33]的特异性结合成员，其中第二抗原结合位点包含重链可变域CDR1、CDR2和CDR3，以及轻链可变域CDR1、CDR2和CDR3。
[35]根据[33]至[34]的特异性结合成员，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变区和轻链可变区。
[36]根据[32]至[35]中任一项的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体分子。
[37]根据[36]的抗体分子，其中所述抗体分子是人IgG1分子。
[38]根据[33]至[37]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子的基于CDR的抗原结合位点结合第二抗原，所述第二抗原选自：免疫细胞抗原，和疾病抗原。
[39]根据[38]的抗体分子，其中所述疾病抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
[40]根据[38]的抗体分子，其中所述免疫细胞抗原是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员。
[41]根据[39]的抗体分子，其中所述肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
[42]根据[39]的抗体分子，其中所述病原体抗原是细菌或病毒抗原。
[43]根据[32]至[42]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子能够在存在第二抗原的情况下活化存在于T细胞上的OX40。
[44]根据[32]至[43]中任一项的抗体分子，其中所述抗体分子与OX40和第二抗原的结合引起OX40在免疫细胞上的簇聚。
[45]根据[43]或[44]的抗体分子，其中所述免疫细胞是T细胞。
[46]根据[38]、[41]和[43]至[45]中任一项的抗体分子，其中所述肿瘤抗原是癌细胞上的细胞表面抗原。
[47]根据[38]、[41]和[43]至[45]中任一项的抗体分子，其中所述肿瘤抗原是可溶性多聚体。
[48]根据[47]的抗体分子，其中可溶性多聚体至少是二聚体。
[49]根据[48]的抗体分子，其中可溶性多聚体至少是三聚体。
[50]根据[1]至[49]中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其中所述特异性结合成员或抗体分子被修饰以减少或消除特异性结合成员或抗体分子的CH2结构域与一个或多个Fcγ受体的结合。
[51]根据[1]至[50]中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其中所述特异性结合成员或抗体分子不结合Fcγ受体。
[52]根据[50]或[51]的特异性结合成员或抗体分子，其中所述Fcγ受体选自下组：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIII。
[53]根据[1]至[52]中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其中所述特异性结合成员或抗体分子缀合至生物活性分子。
[54]根据[1]至[52]中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其中所述特异性结合成员或抗体分子缀合至可检测标记。
[55]一种核酸分子，其编码[1]至[52]中任一项所述的特异性结合成员或抗体分子。
[56]根据[55]的核酸分子，其中所述的一种或多种核酸分子包含：
(i)特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH3结构域的核酸序列，分别如SEQ ID NO：73、56、64、82和47中列出的；
(ii)特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH3结构域的核酸序列，分别如SEQ ID NO：144、135、95、115、125和104中列出的；或
(iii)特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH3结构域的核酸序列，分别如SEQ ID NO：25、16和34中列出的。
[57]根据[55]或[56]的核酸分子，其中所述核酸分子包含下述特异性结合成员的核酸序列：
(i)分别如SEQ ID No：75、58、66、a84和49列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38；
(ii)分别如SEQ ID No：146、137、97、117、127和106列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66；或
(iii)分别如SEQ ID NO：27、18和36中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134。
[58]根据[55]或[56]的核酸分子，其中所述核酸分子包含下述特异性结合成员的核酸序列：
(i)分别如SEQ ID NO：77、60、68、86和51列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38；
(ii)分别为148、139、99、119、129和108中列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66。
(ii)分别如SEQ ID NO：29、20和38中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134。
[59]一种载体，其包含[55]至[58]中任一项的核酸。
[60]一种重组宿主细胞，其包含[55]至[58]中任一项的核酸，或[59]的载体。
[61]制备根据[1]至[52]中任一项的特异性结合成员或抗体分子的方法，包括在制备特异性结合成员或抗体分子的条件下培养[60]的重组宿主细胞。
[62]如[61]所述的方法，还包括分离和/或纯化所述特异性结合成员或抗体分子。
[63]一种药物组合物，其包含根据[1]至[54]中任一项的特异性结合成员或抗体分子和药学上可接受的赋形剂。
[64]根据[1]至[54]中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其用于治疗人或动物的治疗方法中。
[65]一种治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的根据[1]至[54]中任一项的特异性结合成员或抗体分子。
[66]根据[64]使用的特异性结合成员或抗体分子，或[65]所述的方法，其中所述治疗是个体癌症或传染病的治疗。
[67]根据[64]或[66]使用的特异性结合成员或抗体分子，或根据[65]或[66]的方法，其中所述治疗方法包括将所述特异性结合成员或抗体分子与第二治疗剂组合施用至个体。
附图的简要说明
图1A-C显示了Fcab FS20-11、FS20-11-127、FS20-11-131、FS20-11-134、FS20-22、FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115，以及野生型(WT)Fcab的CH3结构域的序列比对。指出了与WT序列相比，Fcab的CH3结构域中存在的AB、CD和EF结构环的位置，以及任意的氨基酸取代、缺失(以波浪号“
Figure BDA0002974976140000101
”表示)或插入。显示了根据IMGT、IMGT外显子(连续编号)、EU和Kabat编号系统的残基编号。
图2显示在存在抗人OX40 Fcabs的情况下，T细胞活化测定中IL-2的释放。每个谱系(FS20-11，FS20-22和FS20-31)中一个抗人OX40 Fcab的代表图分别在图2A、2B和2C中显示。以模拟(4420LALA)mAb2形式测试了抗人OX40 Fcab。在存在和没有交联剂(Xlink)的情况下测试IL-2的释放。分别在人IgG1骨架(G1/4420和G1/11D4)中的抗FITC抗体4420和抗OX40抗体11D4，分别作为阴性和阳性对照。测试了抗人OX40 Fcab和对照抗体在浓度增加时，对IL-2释放的影响。交联的阳性对照mAb(G1/11D4)和抗人OX40 Fcab中的IL-2释放增加，但非交联的阳性对照mAb或阴性对照mAb(G1/4420)中未观察到IL-2释放增加，这证明了T细胞活化的浓度依赖性增加。模拟(4420LALA)mAb2形式的FS20-11-131Fcab在没有交联的情况下没有活性。模拟(4420LALA)mAb2形式的FS20-22-49和FS20-31-115Fcab在没有交联的情况下显示出一些活性，并且该活性随交联而增加。
图3显示了CT26肿瘤模型中，模拟(HEL D1.3 LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab的体内抗肿瘤活性。显示了在Balb/c小鼠分组中CT26同系模型的肿瘤生长曲线。将具有(OX40/模拟mAb2 LALA)和不具有(OX40/模拟mAb2)LALA突变的模拟(HEL D1.3)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab的体内抗肿瘤活性，与阳性对照抗-小鼠OX40 mAb(人IgG1骨架中的OX86；无/OX40mAb)和阴性对照抗体(人IgG1骨架中的4420抗体；无/FITC)比较。接种肿瘤后第10、12和14天，不同分子以1mg/kg的剂量给药。绘制平均肿瘤体积加上或减去标准误差平均值的图。
图4A至D显示了在存在HPAC细胞的T细胞活化测定中IL-2释放的代表性图。在该试验中，使用递增浓度的mAb/mAb2，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，当通过交联剂(抗人CH2抗体或FITC-葡聚糖)或通过TAA+HPAC细胞交联时，靶向OX40的mAb/mAb2对T细胞活化的浓度依赖性增加。
图5A和B显示在存在HPAC细胞的T细胞活化测定中，IL-2释放的代表性图。在该试验中，使用递增浓度的mAb/mAb2，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，当通过交联剂(抗人CH2抗体或FITC-葡聚糖)或通过TAA+HPAC细胞交联时，靶向OX40的mAb/mAb2对T细胞活化的浓度依赖性增加。
图6A显示，当存在靶向OX40和EphA2的mAb2时，在存在表达EphA2的细胞(HPAC)的情况下，T细胞活化增加，而当存在其他靶向OX40的抗体但未交联时，T细胞活化不增加。这表明mAb2通过与两个靶标OX40和EphA2结合而发生交联。图6B显示在非生理学交联剂(抗Fc抗体或FITC-葡聚糖)存在下，靶向OX40活化的T细胞的抗体。如预期的那样，抗EphA2和抗FITC抗体在交联剂存在下不诱导T细胞活化。当与抗Fc抗体交联时，抗小鼠OX40抗体(G1/OX86)诱导了一些T细胞活化。当抗小鼠OX40 Fcab与模拟mAb2(FS20m-232-91AA/4420)中的抗FITC Fab配对时，与抗OX40抗体G1/OX86相比，抗小鼠OX40 Fcab通过FITC-葡聚糖交联时活化T细胞具有更低的EC50和更高的最大响应。当相同的抗OX40 Fcab与mAb2(FS20m-232-91AA/E2A)中的抗EphA2 Fab配对时，与抗OX40/抗-FITC mAb2相比，在HPAC细胞存在时活化T细胞具有更低的EC50和相当的最大响应。
图7显示了通过G1/4420、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420+G1/E2A和FS20m-232-91AA/E2A治疗下Balb/c小鼠分组中CT26同系模型的肿瘤生长曲线。绘制平均肿瘤体积加上或减去标准误差平均值的图。使用两尾t检验比较不同组最后一天的肿瘤体积。与用对照抗体(G1/4420)治疗的组相比，用抗mOX40/抗EphA2 mAb2(FS20m-232-91AA/E2A)治疗的组显示出统计学显著的肿瘤体积减小。
图8显示了在存在可溶性VEGF的T细胞活化测定中，IL-2释放的代表性图。在此测定法中，以递增浓度的mAb/mAb2测试，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行了标记。结果表明，当通过靶向OX40的mAb/mAb2的交联剂(抗-hCH2，FITC-葡聚糖或VEGF)交联时，靶向OX40的mAb/mAb2在T细胞活化中的浓度依赖性增加。
图9显示了存在各种mAb/mAb2时的T细胞活化测定中，IL-2释放的代表性图。在此测定法中以递增的浓度测试了五种不同的mAb/mAb2，并根据其Fcab/Fab克隆命名(G1/4420、G1/R84、G1/OX86、FS20m-232-91AA/4420和FS20m-232-91AA/R84)。结果表明，在存在VEGF的情况下，抗小鼠OX40/抗VEGF mAb2(FS20m-232-91AA/R84)增强了T细胞的活化。该结果证明靶向OX40的抗体需要交联以增加T细胞的活化，并且抗OX40/抗VEGF mAb2可以被靶向VEGF的Fab交联。
图10显示了通过G1/4420、G1/R84、FS20m-232-91AA/4420+G1/R84和FS20m-232-91AA/R84治疗下，Balb/c小鼠分组中CT26同系模型的肿瘤生长曲线。将平均肿瘤体积加上或减去标准误差平均值作图，并使用两尾t检验比较不同组的最后一天的肿瘤体积。与对照组抗体无/FITC治疗组相比，抗mOX40/抗VEGF mAb2抗体治疗组的肿瘤体积具有统计学显著的减小。该结果表明，与模拟mAb2形式的OX40 Fcab和VEGF抗体的组合相比，抗mOX40/抗VEGF mAb2抗体在体内具有更好的体内抗肿瘤效果，据描述在其微环境中VEGF浓度增加，这表明通过抗-mOX40/抗-VEGF mAb2介导的OX40和VEGF的双特异性结合的体内OX40交联，可有效控制肿瘤的生长。
图11A至C显示用于T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。在该试验中，抗体以递增浓度使用，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，以OX40靶向的抗体通过其交联剂(抗hCH2；FITC-葡聚糖)交联时，其浓度对T细胞的激活呈浓度依赖性增加，并且抗OX40/抗ICOS mAb2(FS20-22-49AA/ICOSj)、抗OX40/抗CD27 mAb2(FS20-22-49AA/695)和抗OX40/抗GITR mAb2(FS20-22-49AA/6C8)在不存在其他的交联剂时均具有激动活性，优于在模拟mAb2形式的非交联抗OX40 Fcab(FS20-22-49AA/4420)的激动活性。
图12显示了用于T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。在该试验中，抗体以递增浓度使用，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，以OX40靶向的抗体通过其交联剂(抗-hCH2；FITC-葡聚糖)交联时，T细胞的活化存在浓度依赖性增加，并且不含其他交联剂的抗OX40/抗-PD1 mAb2(FS20-22-49AA/5C4)的激动活性与交联的抗OX40 Fcab(FS20-22-49AA/4420Xlink)相当。
图13显示了用于T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。在该试验中，抗体以递增浓度使用，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，以OX40靶向的抗体通过其交联剂(抗-hCH2；FITC-葡聚糖)交联时，T细胞的活化存在浓度依赖性增加，并且不含其他交联剂的抗OX40/抗-LAG3 mAb2(FS20-22-41AA/25F7)的激动活性与交联的抗OX40 Fcab(FS20-22-41AA/4420Xlink)相当。
图14显示了用于T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。在该试验中，抗体以递增浓度使用，并根据其Fcab/Fab克隆名称进行标记。结果表明，以OX40靶向的抗体通过其交联剂(抗-hCH2；FITC-葡聚糖)交联时，T细胞的活化存在浓度依赖性增加，并且不含其他交联剂的抗OX40/抗-LAG3 mAb2(FS20m-232-91AA/C9B7W)的激动活性比非交联的抗OX40 Fcab(FS20m-232-91AA/4420)更高。这表明结合LAG3的Fab交联抗OX40 Fcab并活化T细胞。
图15显示了用抗mOX40/抗LAG3 mAb2治疗的Balb/c小鼠分组中CT26同系模型的肿瘤生长曲线。将平均肿瘤体积加上或减去标准误差平均值作图，并使用两尾t检验比较不同组的最后一天的肿瘤体积。与用PBS处理的对照组相比，用抗OX40/抗LAG3 mAb2治疗的组显示出统计学显著的肿瘤体积减小。该结果表明，抗OX40/抗LAG3 mAb2抗体在体内具有抗肿瘤功效，被描述为包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中包括表达OX40和表达LAG3的T细胞，表明通过抗OX40/抗LAG3 mAb2介导的OX40和LAG3的双特异性结合的体内OX40簇聚，可以有效地控制肿瘤生长。
详细说明
本发明涉及结合OX40的特异性结合成员。OX40也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)或CD134。具体地，特异性结合成员包含位于特异性结合成员的恒定结构域中的OX40抗原结合位点。特异性结合成员优选能够双价结合OX40。特异性结合成员优选结合人OX40，更优选结合人和食蟹猴OX40。被特异性结合成员结合的OX40的部分优选是OX40细胞外结构域。人和食蟹猴OX40的细胞外结构域可以分别包含SEQ ID NO：161和SEQ IDNO：162所示的序列或由其组成。特异性结合成员优选地能够结合在细胞表面上表达的OX40，所述细胞优选为T细胞，例如CD4+ T细胞、CD8+T细胞、1型T辅助细胞(Th1)、2型T辅助细胞(Th2)，或调节T(Treg)细胞，或肿瘤浸润性T细胞或自然杀伤(NK)细胞。肿瘤浸润性T细胞是在许多癌症中发现的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的子集。
特异性结合成员优选地特异性结合OX40。术语“特异性的”可以指这样的情况，其中特异性结合成员将不显示对除其一个或多个特异性结合伴侣以外的任何分子的显著结合。术语“特异性”也适用于特异性结合成员分子对特定抗原决定簇具有特异性，例如OX40上的抗原决定簇，这些抗原决定簇被多种抗原携带的，在这种情况下，特异性结合成员将能够与多种携带该表位的抗原结合。特异性结合成员优选不与CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR和/或CD137结合，或不显示任何显著结合。
根据它们结合二聚体OX40的能力来选择本发明的特异性结合成员。特异性结合成员结合二聚OX40的亲和力可以比结合单体OX40的更高。对二聚体OX40的高亲和力被认为有利于诱导OX40簇聚和T细胞活化。已经显示出以高亲和力与TNF受体Fas结合的抗体具有降低的激动剂活性。像OX40一样，Fas需要三聚才能活化。认为诸如IgG抗体之类的二价激动剂必须能够结合Fas，然后部分解离，以募集更多的Fas单体并形成活性信号复合物。以高亲和力结合Fas单体的抗体被认为锁定在非信号传递状态(Chodorge等人，2012)。
特异性结合成员优选以70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM或更高的亲和力(KD)结合二聚人OX40。优选地，特异性结合成员以1nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合人OX40。
FS20-22和FS20-31谱系的特异性结合成员也已显示出结合二聚食蟹猴OX40。与食蟹猴OX40以及人OX40的结合是有益的，因为其允许在施予人之前测试食蟹猴中的特异性结合成员的功效和毒性。FS20-11谱系的特异性结合成员显示与二聚体食蟹猴OX40结合，但亲和力较低，这表明它们不太适合食蟹猴的临床前测试。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员优选以150nM、140nM、120nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、4nM、3nM、或2nM或更高的亲和力(KD)结合二聚食蟹猴OX40。优选地，特异性结合成员以2nM的亲和力(KD)或更高的亲和力结合食蟹猴OX40。
如本实施例所述，认为与人和食蟹猴抗原结合的相似性可能是有利的，因为希望在食蟹猴研究中mAb2的行为可以推断到人中。在食蟹猴中进行抗体分子的功效和毒性研究被认为是有益的，这可以预示特异性结合成员在人类中的功效和毒性。
因此，在优选的实施方案中，特异性结合成员与二聚食蟹猴OX40结合的亲和力，与结合二聚人OX40的亲和力相比，不超过10倍，优选不超过5倍的更低或更高。
例如，可以通过表面等离振子共振(SPR)、例如Biacore，来确定抗体分子与关联抗原例如人或食蟹猴OX40的结合亲和力。
特异性结合成员可能阻断OX40与其配体OX40L的相互作用，优选人OX40和人OX40L之间。特异性结合成员阻断OX40L与OX40结合的能力可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。
术语“特异性结合成员”描述了包含含有OX40抗原结合位点恒定域的免疫球蛋白或其片段。因此，如本文所用，术语“特异性结合成员”包括抗原结合片段，所述抗原结合片段包含位于特异性结合成员恒定结构域中的OX40抗原结合位点。恒定域可以是CL、CH1、CH2、CH3或CH4域，优选恒定域是CH1、CH2或CH3域，更优选为CH2或CH3域，最优选为CH3域。特异性结合成员可以部分，或全部合成产生。
优选地，特异性结合成员包含CH2和CH3结构域，其中所述的CH2或CH3结构域，优选CH3结构域，包含OX40抗原结合位点。特异性结合成员优选是两条(相同)多肽链的二聚体，每条包含CH2和CH3结构域。在一个优选的实施方案中，特异性结合成员在CH2结构域的N-末端，还包含免疫球蛋白铰链区或其部分。这种分子在本文中也称为抗原结合Fc片段，或FcabTM。铰链区可以由SEQ ID NO：170中列出的序列或其片段组成，或包含SEQ ID NO：170中列出的序列或其片段。优选地，该片段是SEQ ID NO：170中所列出序列的C-末端片段。该片段的长度可以最多为20，最多为10，最多8或最多6个氨基酸。该片段的长度可以至少为3，至少为4，至少为5或至少为6个氨基酸。在一个优选的实施方案中，铰链区具有SEQ ID NO：171中所列出的序列。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员是抗体分子，优选单克隆抗体或其片段。抗体分子优选是人的或人源化的。抗体分子可以是免疫球蛋白G分子，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子，优选为IgG1、IgG2或IgG4分子，更优选为IgG1分子或其片段。
由于抗体可以多种方式修饰，因此术语“抗体分子”应解释为涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能性等价物和同源物，无论是天然的还是全部或部分合成的。包含CH3结构域的抗体片段的一个实例是抗体的Fc结构域。包含CDR序列和CH3结构域的抗体片段的一个实例是微抗体，其包含连接至CH3结构域的scFv(Hu等，1996)。
特异性结合成员包含OX40抗原结合位点。OX40抗原结合位点位于特异性结合成员的恒定结构域中，优选CH3结构域。在特异性结合成员的恒定结构域中，OX40抗原结合位点包含一个或多个修饰的结构环。抗体恒定结构域结构环的工程化以产生靶抗原的抗原结合位点在本领域中是已知的，并且在例如Wozniak-Knopp等，2010年，和专利公开号WO2006/072620和WO2009/132876中描述。
优选地，OX40抗原结合位点包含修饰的AB，CD和/或EF结构环。本发明人已经认识到，在某些情况下，AB和EF环序列在抗原结合中比CD环序列发挥更大的作用。从以下事实可以明显看出这一点：Fcabs FS20-22和FS20-11结合OX40，但在其CD环序列中不包含任何修饰(参见图1)。因此，在一个优选的实施方案中，OX40抗原结合位点包含修饰的AB和EF结构环。在另一个优选的实施方案中，OX40抗原结合位点包含修饰的AB、CD和EF结构环。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员的CH3结构域的95和96位的残基是野生型的，即优选地，分别为精氨酸(R)和色氨酸(W)。这两个残基都位于EF结构环中。除非另有说明，否则本文中的氨基酸残基位置根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案编号。IMGT编号方案在Lefranc等，2005中进行了描述。
因此，特异性结合成员的OX40抗原结合位点可包含第一、第二和/或第三序列，优选第一和第三序列，或第一、第二和第三序列，其中第一、第二和第三序列序列分别位于特异性结合成员的恒定结构域，优选CH3结构域的AB，CD和EF结构环中。
第一、第二和第三序列可以是以下的CH3结构域的第一、第二和第三序列：特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38，更优选为特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85，更优选为特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47，最优选为特异性结合成员FS20-22-49。
可选地，第一、第二和第三序列可以是以下的CH3结构域的第一、第二和第三序列：特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66，更优选为特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102，更优选为特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108，更加优选地为特异性结合成员FS20-31-115。
作为进一步的选择，第一、第二和第三序列可以是以下的CH3结构域的第一、第二和第三序列：特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134，更优选特异性结合成员FS20-11-131。
特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49、FS20-22-85、FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108、FS20-31-115、FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的CH3结构域序列分别如SEQ ID NO:46、55、63、72、81、94、103、114、124、134、143、15、24和33中所示。
特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85和FS20-22-38的第一、第二和第三序列可以分别是FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85和FS20-22-38的CH3结构域中下述位置的序列：
(i)14至18、45.1至77和97至101；或
(ii)14至18、45.1至77和93至101。
在结合OX40的FS20-31谱系亲和力成熟后，鉴定出所有的76个特异性结合成员，在CH3结构域的77位上包含天冬氨酸(D)残基，表明该残基可能对这些分子中的OX40结合可能很重要。类似地，FS20-31中所有的特异性结合成员在CH3结构域的45.3位保留了野生型谷氨酸(E)残基，表明该残基对于这些分子中的OX40结合也可能很重要。因此，特异性结合成员可能包含特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的第一序列和第三序列，其中第一序列是位于特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH3结构域中14至18位的序列，第二个序列是位于92至101位，或97-101位的序列，并且其中特异性结合成员还包含在CH3结构域的77位的天冬氨酸(D)残基，和任选地在CH3结构域的45.3位的谷氨酸(E)残基。特异性结合成员可以进一步任选地在CH3结构域的45.1、45.2和/或45.4位包含氨基酸取代。
可选地，特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102和FS20-31-66的第一、第二和第三序列可以分别是位于FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102和FS20-31-66的CH3结构域中以下位置的序列：
(i)14至18、45.1至77和97至101；或
(ii)14至18、45.1至77和92至101。
特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的第一、第二和第三序列可以分别是FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的CH3结构域中下述位置之间的序列：
(i)13和19、45.2和78、96和102；
(ii)11和19、45.2和78、96和102；
(iii)13和19、45和78，以及96和102；或
(iv)11和19、45和78，以及96和102。
第一、第二和第三序列可以分别为特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85、FS20-22-38、FS20-31-115、FS20-31-10、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-66、FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134中的完整AB、CD和EF结构环序列。CH3结构域序列中AB、CD和EF结构环的位置，是根据例如IMGT、IMGT外显子、EU或Kabat编号系统确定的，这在技术人员的能力范围内，并在Hasenhindl等.(2013)中述及。在一个优选的实施方案中，根据IMGT编号系统的AB、CD和EF结构环分别位于特异性结合成员的CH3结构域的10和19位、42和79位以及91和102位之间。因此，在一个优选的实施方案中，第一、第二和第三序列分别为特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85、FS20-22-38、FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-66、FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134CH3结构域的10和19位、42和79位，以及91和102位之间的序列。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-22-49，分别在SEQ ID NO:43、54和71中列出；
(ii)FS20-22-41，分别在SEQ ID NO:43、54和45中列出；
(iii)FS20-22-47，分别在SEQ ID NO:43、54和62中列出；
(iv)FS20-22-85，分别在SEQ ID NO:43、54和80中列出；或
(v)FS20-22-38，分别在SEQ ID NO:43、44和45中列出；
其中第一、第二和第三序列优选分别位于特异性结合成员的CH3结构域的14至18位、45.1至77位和93至101位。
在一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-22-49，分别在SEQ ID NO:43、54和71中列出；
(ii)FS20-22-41，分别在SEQ ID NO:43、54和45中列出；
(iii)FS20-22-47，分别在SEQ ID NO:43、54和62中列出；或
(iv)FS20-22-85，分别在SEQ ID NO:43、54和80中列出。
在一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-22-49，分别在SEQ ID NO:43、54和71中列出；
(ii)FS20-22-41，分别在SEQ ID NO:43、54和45中列出；或
(iii)FS20-22-47，分别在SEQ ID NO:43、54和62中列出。
在另一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点分别包含特异性结合成员FS20-22-49的第一、第二和第三序列，分别在SEQ ID NO:43、54和71中列出。
特异性结合成员可以在特异性结合的CH3结构域的91位处进一步包含亮氨酸(L)。特别地，包含含有FS20-22-85的第一、第二和第三序列的OX40抗原结合位点的特异性结合成员，可在特异性结合成员的CH3结构域的91位处包含亮氨酸。
在一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-31-115，分别在SEQ ID NO:122、142和133中列出；
(ii)FS20-31-108，分别在SEQ ID NO:122、132和133中列出；
(iii)FS20-31-58，分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出；
(iv)FS20-31-94，分别在SEQ ID NO:111、112和113中列出；
(v)FS20-31-102，分别在SEQ ID NO:122、123和102中列出；或
(vi)FS20-31-66，分别在SEQ ID NO：91、92和102中列出；
其中第一、第二和第三序列优选分别位于特异性结合成员的CH3结构域的14至18位、45.1至77位和92至101位。
在一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-31-115，分别在SEQ ID NO:122、142和133中列出；
(ii)FS20-31-108，分别在SEQ ID NO:122、132和133中列出；
(iii)FS20-31-58，分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出；
(iv)FS20-31-94，分别在SEQ ID NO:111、112和113中列出；或
(v)FS20-31-102，分别在SEQ ID NO:122、123和102中列出。
在一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-31-115，分别在SEQ ID NO:122、142和133中列出；或
(ii)FS20-31-108，分别在SEQ ID NO:122、132和133中列出。
在另一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点分别包含特异性结合成员FS20-31-115的第一、第二和第三序列，分别示于SEQ ID NO：122、142和133。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-11-131，分别在SEQ ID NO:12、13和23中列出；
(ii)FS20-11-127，分别在SEQ ID NO:12、13和14中列出；或
(iii)FS20-11-134，分别在SEQ ID NO:12、13和32中列出；
其中第一、第二和第三序列优选位于特异性结合成员的CH3结构域的13和19、45和78以及96和102位之间。
在一个更优选的实施方案中，特异性结合成员的OX40抗原结合位点分别包含特异性结合成员FS20-11-131的第一、第二和第三序列，分别在SEQ ID NO:12、13和23中列出。
特异性结合成员可进一步在特异性结合成员的CH3结构域的12位上包含谷氨酸(E)，在94位上包含天冬酰胺(N)和/或在103位上包含亮氨酸(L)。特别地，包含含有FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的第一、第二和第三序列的OX40抗原结合位点的特异性结合成员，可在特异性结合成员的CH3结构域的12位上包含谷氨酸，以及103位上包含亮氨酸。另外地，包含含有特异性结合成员FS20-11-131的第一、第二和第三序列的OX40抗原结合位点的特异性结合成员，可在特异性结合成员的CH3结构域的94位处包含天冬酰胺。
包含含有特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的AB、CD和EF结构环序列的OX40抗原结合位点的特异性结合成员，可在特异性结合成员的CH3结构域的103位包含亮氨酸。
如果特异性结合成员的OX40抗原结合位点包含特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的第一、第二和第三序列或AB、CD和EF结构环序列，特异性结合成员可能在该特异性结合成员的CH3结构域的13和19位之间，例如14、15、16、17或18位处，包含氨基酸缺失。在这些特定结合成员中存在的缺失被认为是由于引物错误而发生的，因此缺失的确切位置尚不清楚。在图1A中，该缺失显示在CH3结构域的18位，但可以同样地位于14、15、16或17位。
氨基酸残基位置，包括本文所述的氨基酸序列、取代、缺失和插入的位置，作为IMGT编号的替代方法，可以根据IMGT外显子编号(也称为连续编号)、EU编号或Kabat编号进行编号。CH3结构域残基位置的IMGT编号、IMGT外显子编号、EU编号和Kabat编号之间的一致性如图1所示。因此，例如，在本申请中，第一、第二和第三序列分别位于特定结合成员的CH3结构域的14至18、45.1至77和93至101位，其中残基位置根据IMGT编号方案编号，第一、第二和第三序列位于CH3域的18至22、46至50和74至82位，其中残基位置根据IMGT外显子编号方案进行编号，如图1所示。可选地，如本文所述，CH3结构域中氨基酸残基的位置，包括氨基酸序列的位置，取代、缺失和插入的位置，可以参考它们在野生型CH3结构域中的位置来定义，野生型CH3结构域的序列在SEQ ID NO：4中所列出。IMGT编号与野生型CH3域序列之间的一致性也显示在图1中。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包含CH3结构域，其包含，具有或由特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85的CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47的CH3结构域序列，最优选特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85的CH3结构域序列分别示于SEQID NO:46、55、63、72和81。
在一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包含CH3结构域，其包含，具有或由特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102的CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108的CH3结构域序列，最优选CH3结构域序列特异性结合成员FS20-31-115的CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115的CH3结构域序列分别在SEQ ID NO:94、103、114、124、134和143中列出。
在另一个可选的优选实施方案中，特异性结合成员包含CH3结构域，其包含，具有或由特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH3结构域序列组成，更优选地，特异性结合成员FS20-11-131的CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的CH3结构域序列在SEQ ID NO：15、24和33中列出。
特异性结合成员的CH3结构域可任选地在CH3结构域序列的直接C末端包含额外的赖氨酸残基(K)。
可以采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术的技术来生产保留原始抗体特异性的其他抗体或嵌合分子。这一技术涉及将CDR或可变区引入不同的免疫球蛋白中。将一种免疫球蛋白的CDR引入另一种免疫球蛋白的方法，在例如EP-A-184187、GB 2188638A和EP-A-239400中述及。可以采用类似的技术将组成本发明的特异性结合成员的OX40抗原结合位点的恒定结构域序列引入恒定结构域，例如另一个特异性结合成员的CH3结构域，从而导致在其恒定结构域中包含OX40抗原结合位点的特异性结合成员。或者，可以用本发明的特异性结合成员的恒定结构域序列替换特异性结合成员的整个恒定结构域序列，以制备在其恒定结构域中包含OX40抗原结合位点的特异性结合成员。类似地，可以将根据本发明的包含OX40抗原结合位点的特异性结合成员的恒定结构域序列的相应片段替换为特异性结合成员的恒定结构域序列的片段。
另外，特异性结合成员可包含免疫球蛋白G分子的CH2结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子的CH2结构域。优选地，特异性结合成员包含IgG1分子的CH2结构域。CH2结构域可以具有如SEQ ID NO：5中所列出的序列。已知CH2结构域与Fcγ受体和补体结合。CH2结构域与Fcγ受体的结合是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)所必需的，而与补体的结合则是补体依赖性细胞毒性(CDC)所必需的。在一些实施方案中，特异性结合成员引发ADCC和/或CDC。在特异性结合成员包含肿瘤抗原的第二抗原结合位点的情况下，这是优选的。不希望被理论所束缚，认为当特异性结合成员不与OX40结合时，特异性结合成员与肿瘤细胞的结合将引起ADCC或CDC介导的对肿瘤细胞的杀伤。该作用将是另外的T细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤，其中特异性结合成员既与肿瘤抗原结合又与OX40结合，从而导致T细胞的活化。
特异性结合成员的CH2结构域可包含一种或多种减少或消除CH2结构域结合一种或多种Fcγ受体(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII)，和/或补体的突变。发明人推测减少或消除与Fc受体γ的结合将减少或消除特异性结合成员介导的ADCC。类似地，减少或消除与补体的结合预期将减少或消除特异性结合成员介导的CDC。减少或消除CH2结构域与一种或多种Fcγ受体和/或补体结合的突变是本领域已知的(Wang等，2018)。这些突变包括Bruhns等，2009年和Hezareh等，2001年中所述的LALA突变，该突变涉及将CH2域的IMGT位置的1.3和1.2处的亮氨酸残基替换为丙氨酸(L1.3A和L1.2A)。可选的，通过将CH2结构域-中IMGT位置的84.4位的天冬酰胺(N)突变为丙氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，从而将保守的N-链糖基化位点突变产生糖基抗体，已知这能降低IgG1效应子功能(Wang等，2018)。作为另一替代方案，已知补体激活(C1q结合)和ADCC可通过将CH2结构域的IMGT位置114位的脯氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸(P114A或P114G)而降低(Idusogie等，2000；Klein等，2016)。这些突变可以被组合，以产生具有进一步降低或没有ADCC或CDC活性的特异性结合成员。
因此，特异性结合成员可包含CH2结构域，其中CH2结构域包含：
(i)1.3和1.2位的丙氨酸残基；和/或
(ii)114位的丙氨酸或甘氨酸；和/或
(iii)84.4位的丙氨酸，谷氨酰胺或甘氨酸；
其中氨基酸残基是根据IMGT编号方案编号的。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包含CH2结构域，其中CH2结构域优包含：
(i)1.3和1.2位的丙氨酸残基；和/或
(ii)114位的丙氨酸或甘氨酸；
其中氨基酸残基是根据IMGT编号方案编号的。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包含CH2结构域，其中CH2结构域包含：
(i)1.3位的丙氨酸残基；和
(ii)1.2位的丙氨酸残基；
其中氨基酸残基是根据IMGT编号方案编号的。
例如，CH2结构域可以具有如SEQ ID NO：6中所列出的序列。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包含CH2结构域，其中CH2结构域包含：
(i)1.3位的丙氨酸残基；
(ii)1.2位的丙氨酸残基；和
(iii)114位的丙氨酸；
其中氨基酸残基是根据IMGT编号方案编号的。
例如，CH2结构域可以具有如SEQ ID NO：7中所列出的序列。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-22-49，FS20-22-41，FS20-22-47或FS20-22-85的CH2和CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47的CH2和CH3结构域序列，最优选特异性结合成员FS20-22-49的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85的CH2和CH3结构域序列分别显示在SEQ ID NO:48、57、65、74和83中，从第7氨基酸开始。
在一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-22-49，FS20-22-41，FS20-22-47或FS20-22-85的CH2和CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47的CH2和CH3结构域序列，最优选特异性结合成员FS20-22-49的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85的CH2和CH3结构域序列分别显示在SEQ ID NO:50、59、67、76和85中，从第7氨基酸开始。
在另一个替代的优选的实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102的CH2和CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108的CH2和CH3结构域序列，最优选特异性结合成员FS20-31-115的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115的CH2和CH3结构域序列分别显示在SEQ ID NO:96、105、116、126和145中，从第7氨基酸开始。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102的CH2和CH3结构域序列，更优选特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108的CH2和CH3结构域序列，最优选特异性结合成员FS20-31-115的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115的CH2和CH3结构域序列分别显示在SEQ ID NO:98、107、118、128和147中，从第7氨基酸开始。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包含，具有或由特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-11-131的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131或FS20-11-134的CH2和CH3域序列分别显示在SEQ ID NO:17、26和35中，从第7氨基酸开始。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包含，具有或由特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH2和CH3结构域序列组成，优选特异性结合成员FS20-11-131的CH2和CH3结构域序列，其中特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131或FS20-11-134的CH2和CH3域序列分别显示在SEQ ID NO:19、28和37中，从第7氨基酸开始
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的序列组成，优选为特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85的序列，更优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47的序列，最优选特异性结合成员FS20-22-49的序列，其中特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85的序列分别在SEQ ID NO:48、57、65、74和83中列出。
在一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的序列组成，优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41，FS20-22-47或FS20-22-85的序列，更优选特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47的序列，最优选特异性结合成员FS20-22-49的序列，其中特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85的序列，分别在SEQ ID NO:50、59、67、76和85中列出。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的序列组成，优选为特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102的序列，更优选特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108的序列，最优选特异性结合成员FS20-31-115的序列，其中特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115的序列分别在SEQ ID NO:96、105、116、126、136和145中列出。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的序列组成，优选为特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102的序列，更优选特异性结合成员FS20-31-115或FS20-31-108的序列，最优选特异性结合成员FS20-31-115的序列，其中特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115的序列分别在SEQ ID NO:98、107、118、128和147中列出。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的序列组成，更优选地，特异性结合成员FS20-11-131的序列，其中特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的序列分别在SEQ ID NO：17、26和35中列出。
在另一个替代的优选实施方案中，特异性结合成员包括，具有或由特异性结合成员的序列FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134组成，更优选地，特异性结合成员FS20-11-131的序列，其中特异性结合成员FS20-11-127、FS20-11-131和FS20-11-134的序列分别在SEQ ID NO：19、28和37中列出。
在一个优选的实施方案中，除了位于特异性结合成员恒定结构域中的OX40抗原结合位点之外，特异性结合成员还包含与一个或多种另外的抗原结合的一个或多个另外的抗原结合位点。一个或多个另外的抗原结合位点优选特异性地结合其同源抗原。
一个或多个另外的抗原结合位点可以结合OX40或另一种抗原。因此，特异性结合成员可以是多特异性分子，例如双特异性、三特异性或四特异性分子，优选双特异性分子。在一个优选的实施方案中，特异性结合成员能够同时结合OX40和一种或多种其他抗原。
已知抗体分子具有包含离散结构域的模块化结构，该结构域可以以多种不同方式组合以产生多特异性，例如双特异性、三特异性或四特异性的抗体形式。示例性的多特异性抗体形式在Spiess等人，(2015)和Kontermann(2012)中述及。本发明的特异性结合成员可以以这种多特异性抗体形式使用。这具有附加的优点，通过在恒定结构域存在抗原结合位点将另外的抗原结合位点引入这种多特异性抗体形式，例如特异性结合成员的CH3结构域。
例如，本发明的特异性结合成员可以是异二聚抗体分子，例如异二聚完整免疫球蛋白分子或其片段。在这种情况下，抗体分子的一部分将具有本文所述的一个或多个序列。例如，在本发明的特异性结合成员是双特异性异二聚抗体分子的情况下，该特异性结合成员可以包含含有如本文所述的CH3结构域的重链，与结合除OX40以外的抗原的重链配对。制备异源二聚抗体的技术是本领域已知的，包括旋钮入孔(KIHs)技术，该技术涉及对抗体分子的CH3结构域进行改造以产生“旋钮”或“孔”以促进链异二聚化。可选的，可以通过将电荷对引入抗体分子中来制备异二聚抗体，以避免由于静电排斥而使CH3域均二聚化，并通过静电吸引来引导异二聚化。异二聚体抗体形式的实例包括CrossMab、mAb-Fv、SEED抗体和KIHIgG。
可选的，本发明的多特异性特异性结合成员可包含完整的免疫球蛋白分子或其片段以及另外的一个或多个抗原结合部分。抗原结合部分可以例如是Fv、scFv或单结构域抗体，并且可以与完整的免疫球蛋白分子或其片段融合。包含与完整免疫球蛋白分子融合的其他抗原结合部分的多特异性抗体分子的实例包括DVD-IgG、DVI-IgG、scFv4-IgG、IgG-scFv和scFv-IgG分子(Spiess等人，2015年；图1)。包含与含有CH3域的免疫球蛋白片段融合的其他抗原结合部分的多特异性抗体分子的实例，例如包括scDiabody-CH3、Diabody-CH3和scFv-CH3 KIH(Spiess等人，2015；图1)。
其他合适的多特异性形式对于技术人员将是显而易见的。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员包含结合第二抗原的第二抗原结合位点，其中第二抗原结合位点优选是基于CDR的抗原结合位点。基于CDR的抗原结合位点是抗体可变区中的抗原结合位点。一个基于CDR的抗原结合位点是由六个CDR组成的；三个轻链可变域(VL)CDR和三个重链可变域(VH)CDR。
对抗给定抗原的抗体分子的制备以及此类抗体分子的CDR序列的确定是众所周知的，并且许多合适的技术是本领域已知的。CDR序列可以根据，例如Kabat等，1991或国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)(Lefranc等，2015)确定。
例如，特异性结合成员可以是mAb2(TM)双特异性抗体。如本文所指，mAb2双特异性抗体是IgG免疫球蛋白，其在其每个可变区中包括基于CDR的抗原结合位点，并且在恒定域中包括至少一个抗原结合位点。当本发明的特异性结合成员是mAb2形式时，该特异性结合成员除了在其特异性结合成员的恒定结构域中的OX40抗原结合位点之外，还在其每个可变区中包含基于CDR的抗原结合位点。
抗原结合位点的三个VH结构域CDR可以位于免疫球蛋白VH结构域内，并且三个VL结构域CDR可以位于免疫球蛋白VL结构域内。例如，基于CDR的抗原结合位点可以位于抗体可变区中。
特异性结合成员对第一抗原的基于CDR的抗原结合位点可有一个或优选多于一个，例如两个。因此，特异性结合成员可包含一个VH和一个VL结构域，但优选包含两个VH和两个VL结构域，即两个VH/VL结构域对，就如天然存在的IgG分子一样。
在一些优选的实施方案中，特异性结合成员可以是包含两个可变区的免疫球蛋白，每个可变区包含第二抗原的基于CDR的抗原结合位点。
在一个优选的实施方案中，该抗体因此是结合OX40和第二抗原的抗体，该抗体分子包含：
(i)OX40的两个抗原结合位点，位于抗体分子的两个CH3结构域；和
(ii)第二抗原的两个基于CDR的抗原结合位点，每个由免疫球蛋白VH结构域和免疫球蛋白VL结构域形成。
在一个更优选的实施方案中，该抗体是完整的免疫球蛋白分子，例如，与OX40和第二种抗原结合的完整的IgG1分子，该抗体分子包含：
(i)OX40的两个抗原结合位点，位于抗体分子的两个CH3结构域；和
(ii)第二抗原的两个基于CDR的抗原结合位点，每个由免疫球蛋白VH结构域和免疫球蛋白VL结构域形成；和
其中免疫球蛋白分子进一步包含CH1、CH2和CL结构域。
OX40的激活需要OX40在T细胞表面上簇聚，进而刺激细胞内信号传导途径和T细胞激活。在没有特异性结合成员交联的情况下，特异性结合成员与T细胞表面上的OX40的结合可能不会导致OX40形成簇，或者可能仅诱导OX40的有限簇聚，因此可能不会导致T细胞活化，或者可能只会导致有限的T细胞活化。
本发明人已经表明，在不存在特异性结合成员的交联的情况下，特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127和FS20-11-134不会T细胞活化。相反，在没有交联的情况下，FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85、FS20-22-38、FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102和FS20-31-66诱导有限的T细胞活化。这些特异性结合成员的OX40激动作用在特异性结合成员的交联中被诱导或增加(参见实施例5)。
如上所述，通过与Fcγ受体结合而使抗体分子交联既低效，又不能靶向特定的位置，例如，疾病的位点，因为表达Fcγ受体的细胞在整个人体中都存在。因此，由第二抗原结合位点结合的第二抗原优选不是Fcγ受体。
因此，在优选的实施方案中，本发明的特异性结合成员包含结合第二抗原的第二抗原结合位点，其中第二抗原能够结合并交联多个特异性结合成员。
例如，本发明人已经表明，其中第二抗原是表面抗原，例如细胞表面抗原，其可以是单体的或多聚的，并且以高浓度和/或簇聚在表面，例如细胞表面，特异性结合成员与第二抗原的结合导致或增强T细胞活化。不希望被理论所束缚，例如据认为，特异性结合成员与丰富的细胞表面抗原的结合导致高浓度的特异性结合成员结合至细胞表面，使得特异性结合成员有足够近的距离来驱动OX40的簇聚和T细胞活化。因此，在优选的实施方案中，第二抗原是表面抗原，其以高浓度在表面上表达，例如细胞表面。
本发明人还表明，其中第二种抗原是一种多聚体可溶性分子，例如多聚体可溶性因子，特异性结合成员与第二抗原的结合导致或增强T细胞活化。在一个优选的实施方案中，当第二抗原是可溶性分子时，第二抗原因此是多聚体抗原，例如二聚体、三聚体或更高阶的多聚体，并因此能够交联几个特异性结合成员。
如本文所述，特异性结合成员包含结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述特异性结合成员仅在结合第二抗原时才活化T细胞，或者在结合第二抗原时其T细胞活化活性增强，特异性结合成员也称为条件激动剂。这种T细胞与第二种抗原结合的活化活性独立于特异性结合成员与Fcγ受体和/或外部交联剂(如蛋白A或G或二级抗体)的结合，因此允许特异性结合成员的条件激动剂活性，靶向第二抗原存在的位点。例如，在第二抗原是疾病抗原的情况下，特异性结合成员可以选择性地在疾病部位而不是在个体的其他部位激活T细胞，或者可以选择性地在疾病部位而不是个体的其他部位增强T细胞的活化。
另外，与依赖于通过其他机制交联(例如外部交联剂，或通过Fcγ受体相互作用进行交联)的特异性结合成员相比，特异性结合成员仅在与第二抗原结合时才活化T细胞，或在与第二抗原结合时其T细胞活化活性被增强，优选增强T细胞活化活性，因为OX40的活化更有效，所以相对于其他特异性结合成员，本文描述的特异性结合成员可以在较低浓度下实现T细胞活化。
因此，与特异性结合成员不交联时相比，当特异性结合成员交联，例如通过与第二抗原结合时，本发明的特异性结合优选诱导T细胞活化的增加。
抗体分子或特异性结合成员活化T细胞的能力可以使用T细胞活化测定法来测量。T细胞在活化时释放IL-2。因此，T细胞活化测定可以测量IL-2的释放，以确定抗体分子或特异性结合成员诱导的T细胞活化的水平。
例如，抗体分子或特异性结合成员活化T细胞的能力可以通过在T细胞活化实验中当特异性结合成员或抗体分子交联时，测量T细胞实现IL-2的半数最大释放所需的抗体分子或特异性结合成员的浓度来确定。以下将其称为抗体分子或特异性结合成员的EC50。较低的EC50表示，T细胞在T细胞活化测定中，需要较低浓度的抗体分子或特异性结合成员实现IL-2的半数最大释放，因此抗体分子或特异性结合成员具有较高的T细胞活化活性。特异性结合成员或抗体分子可以使用例如抗CH2抗体进行交联。
在一个优选的实施方案中，抗体分子或特异性结合成员在T细胞活化测定中的EC50，是FS20-22-49/4420(包含LALA突变)在同一试验中的EC50的50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍之内，其中FS20-22-49/4420(LALA)由SEQ ID No：78中列出的重链和由SEQ ID NO：156中列出的轻链组成或包含由SEQ ID No：78中列出的重链和由SEQ ID NO：156中列出的轻链。
在一个优选的实施方案中，在存在抗体分子或特异性结合成员的交联的情况下，在T细胞活化测定中的抗体分子或特异性结合成员的EC50比没有交联时低10倍、20倍、30倍或40倍。
例如，在T细胞活化测定中，抗体分子或特异性结合成员的EC50可以小于等于5nM、小于等于4nM、小于等于3nM、小于等于2nM、小于等于1nM、小于等于0.5nM、小于等于0.3nM、小于等于0.2nM或小于等于0.1nM，优选小于等于0.1nM。
另外或可替代地，抗体分子或特异性结合成员活化T细胞的能力可以通过在抗体分子或特异性结合成员存在下，在T细胞活化测定中测量由T细胞释放的最大IL-2浓度来确定，其中抗体分子或特异性结合成员是交联的。
在一个优选的实施方案中，抗体分子或特异性结合成员存在下，在交联的情况下，在T细胞活化测定中由T细胞释放的IL-2的最大浓度，为在同一测定中，FS20-22-49/4420(包含LALA突变)存在下T细胞释放的IL-2的最大浓度的20％或10％之内，其中FS20-22-49/4420(LALA)由在SEQ ID NO：78中列出的重链和在SEQ ID NO：156中列出的轻链组成，或包含在SEQ ID NO：78中列出的重链和在SEQ ID NO：156中列出的轻链。
T细胞活化测定可以是本文所述的T细胞测定，例如本实施例中所述的pan-T细胞测定。
例如，T细胞活化测定可以是基于从人外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞的IL-2释放测定。例如，T细胞活化测定可包括从白细胞耗竭锥中分离人PBMC。分离PBMC的方法是本领域已知的，并在本实施例中描述。然后可以从PBMC分离T细胞。从PBMC分离T细胞的方法是本领域已知的，并在本实施例中描述。
T细胞活化测定法可以包含制备所需数量的T细胞，例如在合适的培养基例如T细胞培养基中制备。可以以1.0x 106细胞/ml的浓度制备所需数量的T细胞。然后可以使用合适的T细胞活化试剂刺激T细胞，该试剂提供T细胞活化所需的信号。例如，T细胞活化试剂可以是包含CD3和CD28的试剂，如包含CD3和CD28的珠粒。分离的T细胞可以与T细胞活化试剂一起孵育过夜以活化T细胞。之后，可以洗涤活化的T细胞以将T细胞与T细胞活化试剂分离，并以合适的浓度例如2.0×106细胞/ml重悬于T细胞培养基中。然后可以将活化的T细胞添加到涂有抗人CD3抗体的板上。
可以制备每种测试抗体分子或特异性结合成员的适当稀释液，并将其添加至孔中。然后可以将T细胞与测试抗体在37℃，5％CO2中孵育24小时。可以收集上清液并进行测定以确定上清液中IL-2的浓度。用于确定溶液中IL-2浓度的方法是本领域已知的，并且在本实施例中进行了描述。可以将人IL-2的浓度对抗体分子或特异性结合成员的对数浓度作图。所得曲线可通过对数(激动剂)对响应方程拟合。
与特异性结合成员的第二抗原结合位点结合的第二抗原可以是免疫细胞抗原或疾病抗原。疾病抗原包括致病性抗原和肿瘤抗原。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员的第二抗原结合位点结合免疫细胞抗原。
被特异性结合成员结合的免疫细胞抗原可以存在于OX40的相同免疫细胞或不同免疫细胞上。
免疫细胞抗原可以是除OX40以外的肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员。TNFRSF受体是膜结合的细胞因子受体，其包含细胞外富含半胱氨酸的结构域，其结合肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)的一个或多个配体。
TNFRSF受体可以位于免疫细胞的表面上。在结合TNFRSF配体后，TNFRSF受体在免疫细胞表面上形成簇，从而激活免疫细胞。例如，结合配体的TNFRSF受体可以形成多聚体，例如三聚体或多聚体簇。配体结合的TNFRSF受体簇的存在刺激了激活免疫细胞的细胞内信号传导途径。
不希望受理论的束缚，据认为通过使OX40和第二TNFRSF受体两者都结合在免疫细胞表面上，特异性结合成员将引起OX40和第二TNFRSF受体两者簇聚并激活免疫细胞。换句话说，当两个靶点都结合时，特异性结合成员将充当TNFRSF受体激动剂。
TNFRSF受体包括CD27、CD40、EDA2R、EDAR、FAS、LTBR、RELT、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF6B、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A-10D、TNFRSF11A、TNFRSF19B、TNFRSFF12C、TNFRSFF12C和TNFRSF25。
在一个优选的实施方案中，TNFRSF受体是TNFRSF9(CD137；4-1BB)。
CD27(TNFRSF7：基因ID 939)具有NP_001233.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001242.4的参考核苷酸序列编码。CD40(TNFRSF5：基因ID 958)具有NP_001241.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001250.5的参考核苷酸序列编码。EDA2R(TNFRSF27：基因ID60401)具有NP_001186616.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001199687.2。的参考核苷酸序列编码。EDAR(基因ID 10913)具有NP_071731.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_022336，3的参考核苷酸序列编码。FAS(TNFRSF6：基因ID 355)具有NP_000034.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_000043.5的参考核苷酸序列编码。LTBR(TNFRSF3：基因ID 4055)具有NP_001257916.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001270987.1。的参考核苷酸序列编码。RELT(TNFRSF19L：基因ID 84957)具有NP_116260.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_032871.3的参考核苷酸序列编码。TNFRSF1A(基因ID 7132)具有NP_001056.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_001065.3的参考核苷酸序列编码。TNFRSF1B(基因ID 7133)具有NP_001057.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_001066.2的参考核苷酸序列编码。TNFRSF6B(基因ID 8771)具有NP_003814.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_003823.3的参考核苷酸序列编码。TNFRSF8(基因ID 943)具有参考氨基酸序列NP_001234.3，并且可以由NM_001243.4的参考核苷酸序列编码。TNFRSF9(基因ID 3604)具有NP_001552的参考氨基酸序列，并且可以由NM001561的参考核苷酸序列编码。TNFRSF10A(基因ID 8797)具有NP_003835.3的参考氨基酸序列，并且可以由NM_003844.3。的参考核苷酸序列编码。TNFRSF10B(基因ID 8795)具有参考氨基酸序列NP_003833.4，并且可以由NM_003842.4的参考核苷酸序列编码。TNFRSF10C(基因ID 8794)具有NP_003832.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_003841.4的参考核苷酸序列编码。TNFRSF10D(基因ID 8793)具有参考氨基酸序列NP_003831.2，并且可以由NM_003840.4的参考核苷酸序列编码。TNFRSF11A(基因ID 8792)具有XP_011524547.1的参考氨基酸序列，并且可以由XM_11526245.2的参考核苷酸序列编码。TNFRSF11B(基因ID4982)具有NP_002537.3的参考氨基酸序列，并可以由NM_002546.3的参考核苷酸序列编码。TNFRSF12A(基因ID 51330)具有NP_057723.1参考氨基酸序列，并且可以由NM_016639.2的参考核苷酸序列编码。TNFRSF13B(基因ID 23495)具有NP_0036584.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_012452.2的参考核苷酸序列编码。TNFRSF13C(基因ID 115650)具有NP_443177.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_052945.3的参考核苷酸序列编码。TNFRSF14(基因ID 8764)具有NP_001284534.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001297605.1的参考核苷酸序列编码。TNFRSF17(基因ID 608)具有NP_001183.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001192.2的参考核苷酸序列编码。TNFRSF18(基因ID 8784)具有NP_004195.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_004186.1的参考核苷酸序列编码。TNFRSF19(基因ID 55504)具有NP_001191387.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001204585.1的参考核苷酸序列编码。NFRSF21(基因ID 27242)具有NP_055267.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_014452.4的参考核苷酸序列编码。TNFRSF25(DR3：基因ID 8718)结合至配体TNFSF15(TL1A)，具有参考氨基酸序列NP_001034753.1，并且可以由NM_001039664.1的参考核苷酸序列编码。
或者，与第二抗原结合位点结合的免疫细胞抗原可以是在免疫系统中除TNFRSF成员外具有调节功能的分子，例如免疫共刺激分子或抑制性检查点分子。此类免疫调节分子的实例包括ICOS(CD278)、LAG3、PD1、PD-L1、PD-L2、B7H3、B7H4、CTLA4、TIGIT、BTLA、HVEM、T细胞免疫球蛋白、含粘蛋白域3(TIM-3)、CD47、CD73、A2aR、CD200、CD200R、集落刺激因子1受体(CSF-1R)、VISTA CD28、CD80、LLT1、半乳凝素-9、NKG2A、NKG2D，和KIR。
存在免疫细胞抗原的免疫细胞可以属于任何免疫细胞亚群，可以是T细胞、肿瘤浸润性白细胞(TIL)、骨髓谱系细胞(例如抗原呈递细胞(APC)、NK细胞和/或B细胞。当免疫细胞抗原是TNFRSF受体时，存在TNFRSF受体的免疫细胞优选是T细胞。
或者，第二抗原结合位点可结合如上所述的疾病抗原。不希望受到理论的束缚，据认为特异性结合成员与OX40和疾病抗原的结合将导致疾病附近的T细胞活化。此后，活化T细胞可以引发、促进或参与免疫应答，例如针对病原体或癌细胞的免疫应答。免疫系统在识别和消除癌细胞中的作用在Chen和Mellman，2013年中概述。
特异性结合成员的第二抗原结合位点可以结合肿瘤抗原。肿瘤抗原是主要存在于肿瘤环境中而非普遍存在于个体中其他环境的抗原。例如，肿瘤抗原可以存在于肿瘤细胞的表面上或可以存在于肿瘤微环境的其他基质细胞上，或存在于肿瘤附近的生物体液中。因此，肿瘤抗原是个体中肿瘤细胞位置的标志。
在一些实施方案中，肿瘤抗原可以是位于癌细胞表面的抗原。肿瘤抗原可能在肿瘤细胞上被上调或过表达，而在没有肿瘤的相同组织的相应的正常体细胞中，肿瘤抗原可能不会被大量表达。
在一些实施方案中，与在不存在肿瘤的相应正常组织的基质细胞相比，在肿瘤微环境的基质细胞上肿瘤抗原被上调或过表达。
肿瘤抗原可以存在于细胞表面，可能无法很快被内化。
可以使用本领域已知的方法鉴定适合于被特异性结合成员靶向的肿瘤抗原。例如，可将靶向OX40受体和肿瘤抗原的特异性结合成员用于OX40表达细胞与肿瘤抗原表达细胞共培养的实验中，并测定OX40表达细胞的活化，例如通过T细胞活化测定法、增殖测定法或细胞毒性测定法。
细胞表面肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。
癌细胞表达的肿瘤抗原可以包括，例如，由癌症生殖系基因编码的癌-睾丸(CT)抗原，例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-I、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1/CT7、MAGE-C2、NY-ESO-I、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1和XAGE及其免疫原性片段或变异体(Simpson等，2005；Gure等，2005；Velazquez等，2007；Andrade等，2008；Tinguely等，2008；Napoletano等，2008)。
其他细胞表面肿瘤抗原包括，例如AFP、αvβ3(玻连蛋白受体)、αvβ6、B细胞成熟剂(BCMA)、CA125(MUC16)、CD4、CD20、CD22、CD33、CD52、CD56、CD66e、CD80、CD140b、CD227(MUC1)、EGFR(HER1)、EpCAM、GD3神经节苷脂、HER2、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CD5、CD19、CD21、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、HLA-DR、抗独特型、癌胚抗原(CEA)(例如癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5))、TAG-72、叶酸结合蛋白、A33、G250、铁蛋白、糖脂(例如神经节苷脂)、碳水化合物(例如CA-125)、IL-2受体、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、IGF1R、B7H3、B7H4、PDL1、CD200、EphA2和间皮素或其变体。这些和其他细胞表面肿瘤抗原在Carter等人，2004；Scott和Renner，2001年；Cheever等，2009；Tai和Anderson，2015年；以及Podojil和Miller，2017年中述及。
其他肿瘤抗原包括“应激”癌细胞采用非AUG翻译起始机制产生的框架外肽-MHC复合物(Malarkannan等，1999)。
其他肿瘤抗原包括肿瘤细胞或肿瘤微环境细胞表面上的肽-MHC复合物，其中肽-MHC复合物包含突变的细胞内肿瘤抗原的肿瘤特异性新抗原肽片段，而肽新抗原包含一个或更多的肿瘤特异性突变(Gubin等，2015)。其他肿瘤抗原是本领域公知的(例如参见WO00/20581中的实施例；癌症疫苗和免疫疗法(2000)，Eds Stern，Beverley和Carroll，剑桥大学出版社，剑桥)。这些肿瘤抗原的序列很容易从公共数据库中获得，但也可以在WO1992/020356 A1、WO1994/005304 A1、WO1994/023031 A1、WO1995/020974 A1、W01995/023874 A1和W01996/026214 A1中找到。
示例性的肿瘤抗原包括HER2，FAP、EpCAM、CEACAM5、CD20、CD73、PSMA、间皮素、EphA2、IGF1R、CD200、αvβ6、BCMA、PD-L1、B7H3、B7H4和EGFR。
例如，肿瘤抗原可以是间皮素(MSLN)。
HER2(ERBB2；基因ID 2064)可以具有NP_001005862.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_001005862.2的参考核苷酸序列编码。FAP(基因ID 2191)可以具有NP_001278736.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001291807.1的参考核苷酸序列编码。EpCAM(基因ID4072)可以具有NP_002345.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_002354.2的参考核苷酸序列编码。
CEACAM5(基因ID 1048)可以具有NP_001278413.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001291484.2。的参考核苷酸序列编码。CD20(MS4A1；基因ID 931)可以具有NP_068769.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_021950.3。的参考核苷酸序列编码。CD73(NT5E；基因ID4907)可以具有NP_001191742.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001204813.1的参考核苷酸序列编码。PSMA(FOLH1；基因ID 2346)可以具有NP_001014986.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001014986.1的参考核苷酸序列编码。间皮素(MSLN；基因ID 10232)可以具有NP_001170826.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001177355.2的参考核苷酸序列编码。EphA2(基因ID 1969)可以具有NP_001316019.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001329090.1的参考核苷酸序列编码。IGF1R(基因ID 3480)可以具有NP_000866.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_000875.4的参考核苷酸序列编码。CD200(基因ID 4345)可以具有NP_001004196.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001004196.3的参考核苷酸序列编码。αvβ6是由整联蛋白亚基αV和整联蛋白亚基β6组成的异二聚体。整联蛋白亚基αV(ITGAV；基因ID 3685)可以具有NP_001138471.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001144999.2。的参考核苷酸序列编码。整联蛋白亚基β6(ITGB6；基因ID 3694)可以具有NP_000879.2的参考氨基酸序列，并可以由NM_000888.4的参考核苷酸序列编码。BCMA(TNFRSF17；基因ID 608)可以具有NP_001183.2的参考氨基酸序列，并可以由NM_001192.2的参考核苷酸序列编码。PD-L1(CD274；基因ID 29126)可以具有NP_001254635.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001267706.1的参考核苷酸序列编码。B7H3(CD276；基因ID 80381)可以具有NP_001019907.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_001024736.1的参考核苷酸序列编码。B7H4(VTCN1；基因ID 79679)可以具有NP_001240778.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001253849.1的参考核苷酸序列编码。EGFR(基因ID 1956)可以具有NP_001333826.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001346897.1的参考核苷酸序列编码。
在其他实施方案中，肿瘤抗原可以是可溶性肿瘤抗原，例如由癌细胞产生或响应于癌细胞的生长因子。可溶性因子可能在肿瘤附近的生物体液中被上调或过表达。可溶性肿瘤抗原可以是多聚体，例如二聚体或三聚体。可溶性肿瘤抗原在肿瘤部位或肿瘤微环境中的浓度可能高于个体体内其他部位。肿瘤微环境和相关的可溶性肿瘤抗原在Bhome等人，(2015)中有更详细的描述。
合适的可溶性肿瘤抗原包括VEGF、HGF、SDF1和TGF-β、例如TGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3和TGF-β-4。
VEGF(VEGFA；基因ID 7422)具有NP_001020537.2的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001025366.2的参考核苷酸序列编码。HGF(基因ID 3082)具有NP_000592.3的参考氨基酸序列，并且可以由NM_000601.5的参考核苷酸序列编码。SDF1(CXCL12；基因ID 6387)具有NP_000600.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_000609.6的参考核苷酸序列编码。TGF-β-1(TGFB1；基因ID 7040)可以具有NP_000651.3的参考氨基酸序列，并且可以由NM_000660.6的参考核苷酸序列编码。TGF-β-2(TGFB2；基因ID 7042)可以具有NP_001129071.1的参考氨基酸序列，并可以由NM_001135599.3的参考核苷酸序列编码。TGF-β-3(TGFB3；基因ID7043)可以具有NP_001316867.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001329938.1的参考核苷酸序列编码。TGF-β-4(LEFTY2；基因ID 7044)可以具有NP_001165896.1的参考氨基酸序列，并且可以由NM_001172425.2的参考核苷酸序列编码。
在另一个优选的实施方案中，疾病抗原是病原性抗原。
在感染性疾病部位的附近，预期通过特异性结合成员活化T细胞用于治疗感染性疾病。感染性疾病可以是急性或持续性感染性疾病，但优选是持续性感染性疾病。
病原性抗原优选是由人病原体表达的抗原，例如病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原(例如原生动物抗原)，优选病毒或细菌抗原。病原性抗原是主要存在于病原体上或感染性疾病部位附近的抗原，而不是普遍存在于个体的其他部位的抗原。
例如，病原性抗原可以是存在于病毒、细菌、真菌或寄生虫的表面上的抗原，或者是由病毒、细菌、真菌或寄生虫表达的可溶性抗原。病毒、细菌、真菌或寄生虫可以是本文其他地方提到的病毒、细菌、真菌或寄生虫。
当病原性抗原是可溶性抗原时，该抗原可能在感染性疾病部位附近的生物体液中被上调或过表达。例如，可溶性病原体抗原可以在感染性疾病部位或其附近以比个体体内其他地方更高的浓度存在。可溶性病原体抗原可以是多聚体，例如二聚体或三聚体。
可以使用本领域已知的方法鉴定适合于被特异性结合成员靶向的病原体抗原。例如，可将靶向OX40受体和病原性抗原的特异性结合成员用于OX40表达细胞与病原体或病原性抗原共培养的实验中，并测定OX40表达细胞的活化，例如通过T细胞活化测定法、增殖测定法或细胞毒性测定法。
适合被特异性结合成员靶向的许多病原体抗原在本领域中是进一步已知的，并且本领域技术人员可以根据要治疗的传染病来选择。病毒抗原的实例包括由人免疫缺陷病毒(HIV)表达的蛋白p24、gp120和gp41，由乙肝病毒(HBV)表达的乙肝表面抗原(HBsAg)以及由流感病毒表达的血凝素和神经氨酸酶。细菌抗原的实例包括结核分枝杆菌表达的Rv1733、Rv2389和Rv2435n。
特异性结合成员还可包含第一、第二或第三序列、AB、CD或EF结构环序列、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链的变体和/或本文公开的重链序列的变体。合适的变体可以通过改变序列或突变以及筛选的方法获得。在一个优选的实施方案中，包含一个或多个变体序列的特异性结合成员保留了亲本特异性结合成员的一个或多个功能特征，例如对OX40的结合特异性和/或结合亲和力。例如，包含一个或多个变体序列的特异性结合成员结合OX40的亲和力优选与(亲本)特异性结合成员相同或更高。亲本特异性结合成员是不包含已被并入变体特异性结合成员中的氨基酸取代、缺失和/或插入的特异性结合成员。
例如，特异性结合成员可以包含第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链和/或重链序列，其与本文公开的第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链和/或重链序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域序列与特异性结合成员FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47和FS20-22-85的CH3结构域具有至少95％的序列同一性。特异性结合成员FS20-31-115的CH3结构域序列与特异性结合成员FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102和FS20-31-108的CH3结构域具有至少92％的序列同一性。特异性结合成员FS20-11-131的CH3结构域序列与特异性结合成员FS20-11-127和FS20-11-134的CH3结构域具有至少97％的序列同一性。
因此，在优选的实施方案中，特异性结合成员具有或包含CH3结构域序列，其与SEQID NO：15、24、33、46、55、63、72、81、94、103、114、124、134或143列出的CH3结构域序列具有至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，优选至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％，或至少99.9％的序列同一性。
在一个优选的实施方案中，本发明的特异性结合成员包含CH2结构域序列，其与SEQ ID NO：5、6或7中列出的CH2结构域序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
在一个优选的实施方案中，本发明的特异性结合成员包含CH2结构域序列，其与SEQ ID NO：17、19、26、28、35、37、48、50、57、59、65、67、74、76、83、85、96、98、105、107、116、118、126、128、136、138、145或147中列出的CH2结构域序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
通常参考GAP算法(威斯康星州GCG软件包，Accelerys有限公司，圣地亚哥，美国)来定义序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch算法比对两个完整序列，最大化地增加匹配数并最小化地减少缺口数。通常，使用缺口创建罚分为12，缺口延伸罚分为4的默认参数。可以优选使用GAP，但是也可以使用其他算法，例如BLAST(使用Altschul等，1990年中的方法)、FASTA(使用Pearson和Lipman，1988年中的方法)或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman，1981年)或TBLASTN程序，参见的Altschul等，1990年，同上文，通常采用默认参数。特别地，可以使用psi-Blast算法(Altschul等，1997)。
特异性结合成员可包含第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列，CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列，与在此公开的第一、第二或第三序列，AB、CD或EF结构环序列、CH3结构域、CH2结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、CDR、VH结构域、VL结构域、轻链或重链序列相比，具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，优选小于等于20个改变、小于等于15个改变、小于等于10个改变、小于等于5个改变、小于等于4个改变、小于等于3个改变、小于等于2个改变，或小于等于1个改变。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)的CH3结构域序列，与SEQ ID NO：15、24、33、46、55、63、72、81、94、103、114、124、134或143中列出的CH3结构域序列相比，优选小于等于20个改变、小于等于15个改变、小于等于10个改变、小于等于5个改变、小于等于4个改变、小于等于3个改变、小于等于2个改变，或小于等于1个改变。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员可包含具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)的CH2结构域序列，与SEQ ID NO：5、6或7中列出的CH2结构域序列相比，优选小于等于20个改变、小于等于15个改变、小于等于10个改变、小于等于5个改变、小于等于4个改变、小于等于3个改变、小于等于2个改变，或小于等于1个改变。
在一个优选的实施方案中，特异性结合成员可包含或具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)的序列，与SEQ ID NO：17，19、26、28、35、37、48、50、57、59、65、67、74、76、83、85、96、98、105、107、116、118、126、128、136、138、145或147中列出的Fcab结构域序列相比，优选小于等于40个改变、小于等于30个改变、小于等于20个改变、小于等于15个改变、小于等于10个改变、小于等于5个改变、小于等于4个改变、小于等于3个改变、小于等于2个改变，或小于等于1个改变。
当特异性结合成员包含本文公开的CH3结构域、CH2和CH3结构域、Fcab、轻链或重链序列的变体时，该变体优选在位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中的第一、第二和第三序列中，不包含任何氨基酸改变。例如，变体在特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中可以不包含任何氨基酸改变。
在一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的优选实施方案中，该取代可以是保守取代，例如根据下表所示。在一些实施方案中，中间列中相同类别的氨基酸被彼此取代，即例如非极性氨基酸被另一非极性氨基酸取代。在一些实施方案中，最右边一列中同一行中的氨基酸被取代。
Figure BDA0002974976140000361
在一些实施方式中，取代在功能上可以是保守的。即，在一些实施方案中，与等效的未取代的特异性结合成员相比，取代可能不影响(或可能基本上不影响)包含取代的特异性结合成员的一种或多种功能特性(例如结合亲和力)。
还预期了一种特异性结合成员，其包含位于该特异性结合成员的恒定结构域，优选CH3结构域中的OX40抗原结合位点，并且与本发明的特异性结合成员竞争与OX40的结合，或者与本发明的特异性结合成员在OX40上具有相同的表位。用于确定两个特异性结合成员竞争抗原的方法是本领域已知的。例如，可以使用表面等离振子共振，例如Biacore，映射方法来确定两个特异性结合成员与抗原的竞争结合。
在一些实施方案中，特异性结合成员可以不包含基于CDR的抗原结合位点。
特别地，特异性结合成员可以不包含结合CD137的基于CDR的抗原结合位点。
另外或可替代地，特异性结合成员可以不包含结合间皮素(MSLN)的基于CDR的抗原结合位点。
例如，特异性结合成员可以不包含结合CD137或MSLN的基于CDR的抗原结合位点，其中特异性结合成员包含位于特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中的第一、第二和第三序列，位于特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域的AB、CD和EF结构环序列，和/或特异性结合成员FS20-22-49的CH3结构域序列。
例如，特异性结合成员可以不包含下面列出的抗CD137mAb FS30-10-16的CDR，和/或VH和/或VL结构域。
FS30-10-16mAb的重链CDR
CDR1(IMGT)GFTFSSYD
CDR1(Kabat)SYDMS
CDR2(IMGT)IDPTGSKT
CDR2(Kabat)DIDPTGSKTDYADSVKG
CDR3(IMGT)ARDLLVYGFDY
CDR3(Kabat)DLLVYGFDY
FS30-10-16mAb的VH结构域
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS
FS30-10-16mAb的轻链CDR
CDR1(IMGT)QSVSSSY
CDR1(Kabat)RASQSVSSSYLA
CDR2(IMGT)GAS
CDR2(Kabat)GASSRAT
CDR3(IMGT)QQSYSYPVT
CDR3(Kabat)QQSYSYPVT
FS30-10-16mAb的VL结构域
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIK
特别地，特异性结合成员可以不包含，或不由SEQ ID NO:172和173分别所示的FS20-22-49-AA/FS30-10-16的重链和轻链序列组成。
特异性结合成员可以与生物活性分子或可检测标记物缀合。在这种情况下，特异性结合成员可以被称为缀合物。此类缀合物可用于治疗本文所述的疾病。
例如，生物活性分子可以是免疫系统调节剂，例如细胞因子，优选人细胞因子。例如，细胞因子可以是刺激T细胞活化和/或增殖的细胞因子。与特异性结合成员缀合的细胞因子的实例包括IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF和IFN-γ。
或者，生物活性分子可以是配体陷阱，例如细胞因子的配体陷阱，例如TGF-β或IL-6。
可以与特异性结合成员偶联的合适检测标记在本领域中是已知的，包括放射性同位素，例如碘-125、碘-131、钇-90、铟-111和锝99；以及荧光染料，例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和花青染料衍生物，例如Cy7和Alexa750；发色染料，例如二氨基联苯胺；乳胶珠酶标记，例如辣根过氧化物酶；具有光谱隔离的吸收或发射特性的荧光粉或激光染料；化学部分，例如生物素，可以通过与特定的同源可检测部分结合来检测，例如抗生物素蛋白标记。
特异性结合成员可通过任何合适的共价或非共价键，例如二硫键或肽键，与生物活性分子或可检测标记缀合。当生物活性分子是细胞因子时，细胞因子可以通过肽接头与特异性结合成员连接。合适的肽接头是本领域已知的，并且长度可以是5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15个氨基酸。
在一些实施方案中，生物活性分子可以通过可裂解的接头与特异性结合成员缀合。接头可允许在治疗部位从特异性结合成员释放生物活性分子。接头可包括酰胺键(例如肽接头)、二硫键或腙类。肽接头可通过例如，位点特异性蛋白酶切割，二硫键可通过胞质溶胶的还原环境切割，而腙类可通过酸介导的水解切割。
缀合物可以是包含特异性结合成员和生物活性分子的融合蛋白。在这种情况下，可以通过肽接头或肽键将生物活性分子与特异性结合成员缀合。当特异性结合成员是多链分子时，例如当特异性结合成员是或包含Fcab或mAb2时，生物活性分子可以与特异性结合成员的一条或多条链缀合。例如，生物活性分子可以与mAb2分子的一条或两条重链缀合。融合蛋白的优点是易于生产和纯化，有利于临床级材料的生产。
本发明还提供了分离的核酸分子或编码本发明的特异性结合成员的分子。技术人员使用本领域众所周知的方法来制备这种核酸分子将没有困难。
在一个优选的实施方案中，核酸分子编码以下特异性结合成员的CH3结构域：FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38，优选FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85，更优选FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47，最优选FS20-22-49。
在一个替代的优选实施方案中，核酸分子编码以下特异性结合成员的CH3结构域：FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66，优选FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102，更优选FS20-31-115或FS20-31-108，最优选FS20-31-115。
在另一个可供选择的优选实施方案中，核酸分子编码特异性结合成员的CH3结构域：FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134，最优选FS20-11-131。
这些特异性结合成员的CH3结构域序列在本文中述及。
例如，编码以下特异性结合成员的CH3结构域的核酸分子：
(i)FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49或FS20-22-85，分别在SEQID NO：47、56、64、73和82中列出；
(ii)FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108或FS20-31-115，分别在SEQ ID NO：95、104、115、125、135和144中列出；或
(iii)FS20-11-127、FS20-11-131或FS20-11-134分别在SEQ ID NO：16、25和34中列出。
在一个优选的实施方案中，核酸分子编码以下特异性结合成员：FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38，优选FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47或FS20-22-85，更优选FS20-22-49、FS20-22-41或FS20-22-47，最优选FS20-22-49。
在一个替代的优选实施方案中，核酸分子编码以下特异性结合成员：FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66，优选FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94或FS20-31-102，更优选FS20-31-115或FS20-31-108，最优选FS20-31-115。
在另一个可选的优选实施方案中，核酸分子编码以下特异性结合成员：FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134，最优选FS20-11-131。
例如，编码以下特异性结合成员序列的核酸分子：
(i)FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85,分别在SEQID NO：49、58、66、75和84中列出；和
(ii)FS20-22-38、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85，分别于SEQID NO：51、60、68、77和86中列出。
编码以下特异性结合成员的特异性结合成员的序列的核酸分子：
(i)FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102和FS20-31-108和FS20-31-115，分别在SEQ ID NO：97、106、117、127、137和146中列出；和(ii)FS20-31-58、FS20-31-66、FS20-31-94、FS20-31-102、FS20-31-108和FS20-31-115，分别在SEQ ID NO：99、108、119、129、139和148中列出。
编码以下特异性结合成员序列的核酸分子：
(i)FS20-11-127、FS20-11-131或FS20-11-134，分别于SEQ ID NO：18、27和36中列出；和
(ii)FS20-11-127、FS20-11-131或FS20-11-134，分别于SEQ ID NO：20、29和38中列出。
分离的核酸分子可以用于表达本发明的特异性结合成员。核酸通常将以重组载体的形式提供以用于表达。因此，本发明的另一方面提供了一种包含如上所述的核酸的载体。可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。优选地，载体包含合适的调控序列以驱动核酸在宿主细胞中的表达。载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。
如本文所述的核酸分子或载体可以被引入宿主细胞。将核酸或载体引入宿主细胞的技术在本领域中是已经建立的，并且可以采用任何合适的技术。适用于产生重组特异性结合成员的一系列宿主细胞是本领域已知的，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞、例如CHO、NS0或HEK细胞，例如HEK293细胞。最优选的宿主细胞是CHO细胞。
本发明的另一方面提供了一种产生本发明的特异性结合成员的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码该特异性结合成员的核酸，并任选地分离和/或纯化由此产生的特异性结合成员。培养宿主细胞的方法是本领域众所周知的。该方法可以进一步包括分离和/或纯化特异性结合成员。纯化重组特异性结合成员的技术是本领域公知的，包括例如HPLC，FPLC或亲和色谱，例如HPLC。在一些实施方案中，可以使用特异性结合成员上的亲和标签进行纯化。该方法还可包括将特异性结合成员配制成药物组合物，任选地与如下所述的药学上可接受的赋形剂或其他物质一起。
如上所述，OX40在免疫系统的细胞上表达，包括活化的T细胞，特别是CD4+T细胞、CD8+T细胞、1型T辅助(Th1)细胞、2型T辅助(Th2)细胞和调节性T(Treg)细胞和肿瘤浸润性T细胞以及活化的自然杀伤(NK)细胞。已经显示OX40激活在增强T细胞激活、T细胞克隆扩增、T细胞分化和存活以及记忆T细胞的产生中起作用。考虑到OX40的免疫应答增强活性，已经在癌症治疗的背景下研究了OX40激动剂分子。
因此，本文所述的特异性结合成员可用于治疗应用，特别是在癌症的治疗中。另外，预期特异性结合成员可用于治疗感染性疾病，例如持续性感染性疾病。
如本文所述的特异性结合成员可以用于治疗人体或动物体的方法。本发明的相关方面提供了：
(i)本文所述的特异性结合成员用作药物，
(ii)本文所述的特异性结合成员用于治疗疾病或病症的方法，
(iii)本文所述的特异性结合成员在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途；和，
(iv)治疗个体的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本文所述的特异性结合成员。
个体可以是患者，优选人类患者。
治疗可以是达到某种期望的治疗效果的任何治疗或疗法，例如，抑制或延缓病情进展，并且包括降低进展速度、中止进展速度、改善、治疗或缓解(部分或全部)病情，预防、改善、延迟、减轻或抑制一种或多种病症和/或症状，或在无治疗的情况下延长个人或病人的生存期。
还包括作为预防措施(即预防措施)的治疗。例如，如本文所述，可以地治疗易患疾病或诸如癌症之类的疾病的发生或再发生的个体。这种治疗可以预防或延迟个体中疾病的发生或再发生。
所描述的治疗方法可以包括向个体施用除特异性结合成员之外至少一种其他的治疗。因此，本文所述的特异性结合成员可以单独或与一种或多种其他治疗联用施予个体。当特异性结合成员与另一种治疗联合施予个体时，附加治疗可与特异性结合成员同时、依次或与特异性结合成员分开给予患者。如果附加治疗与特异性结合成员进行，则该特异性结合成员和附加治疗可作为联合制剂给予个体。例如，附加疗法可以是用于待治疗疾病的已知疗法或治疗剂。
虽然特异性结合成员可以单独给药，但特异性结合成员通常以药物组合物的形式给药，该药物组合物可包括除特异性结合成员外的至少一种组分。因此，本发明的另一方面提供了一种包含如本文所述的特异性结合成员的药物组合物。还提供了一种包括将特异性结合成员配制成药物组合物的方法。
除特异性结合成员外，药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。本文所用的术语“药学上可接受的”属于化合物、材料、组分、组合物、和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适合与相关受试者(如人类)组织接触时使用，且无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理收益/风险比。在与制剂的其他成分相容的意义上，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。载体或其他物质的确切性质将取决于给药途径，可以是输液、注射或任何其他合适的途径，如下所述。
对于肠胃外，例如皮下或静脉内给药，例如通过注射、包含特异性结合成员的药物组合物可以是肠胃外可接受的水溶液形式，其不含热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。可以根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，例如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，可以在给药之前以冻干形式提供特异性结合成员以供重构。例如，冻干的特异性结合成员可以在施用给个体之前在无菌水中重构并与盐水混合。
给药剂量可以是“治疗有效剂量”，这足以显示出对个体的益处。实际给药量、给药速度和时间，将取决于所治疗药物的性质和严重程度、所治疗的特定个体、个体的临床状况、疾病原因、分娩部位组成、特异性结合成员的类型、给药方法、给药时间表和其他医生已知的因素。治疗处方，例如剂量的决定等属于全科医生和其他医生的责任，并且可能取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。免疫球蛋白的适当剂量在本领域是众所周知的(Ledermann等人.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；和Bagshawe等，(1991)抗体、免疫缀合物和放射性药物4：915-922)。可以使用本文所述的具体剂量，或在《医师手册》(2003)中指出的剂量，适用于所施予抗体分子。对于抗体分子，特异性结合成员的治疗有效量或合适剂量可以通过在动物模型中比较体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括待治疗区域的大小和位置以及特异性结合成员的精确性质。
对于全身性应用，典型的免疫球蛋白剂量范围为100μg至1g，对于局部应用，其范围为1μg至1mg。可以施用最初的较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。这是用于成人个体的单次治疗的剂量，可以针对儿童和婴儿按比例调整剂量，也可以针对其他特异性结合成员形式按分子量调整剂量。
根据医生的判断，可以每天、每周两次、每周或每月一次的间隔重复治疗。个体的治疗方案可能取决于特定结合成员组合物的药代动力学和药效学性质、给药途径和所治疗疾病的性质。
治疗可以是周期性的，并且两次给药之间的时间可以是大约两周或更久，例如，大约三周或更久、大约四周或更久、大约每月一次或更久、大约五周或更久，或者大约六周或更久。例如，治疗可以是每两到四周或每四到八周。合适的制剂和给药途径如上所述。
在一个优选的实施方案中，本文所述的特异性结合成员可以用于治疗癌症的方法。
癌症的特征可能是恶性癌细胞的异常增殖。当提到特定类型的癌症，例如乳腺癌时，这是指相关组织(例如乳房组织)的恶性细胞的异常增殖。位于乳房中但是另一组织(例如卵巢组织)的恶性细胞异常增殖的结果的继发性癌症不是本文所指的乳腺癌，而是卵巢癌。
该癌症可以是原发性或继发性癌症。因此，本文所述的特异性结合成员可用于治疗个体癌症的方法，其中所述癌症是原发性肿瘤和/或肿瘤转移。
使用本文所述的特异性结合成员治疗的癌症的肿瘤可包含表达OX40的肿瘤浸润性T细胞，例如表达在他们的细胞表面。在一实施方案中，肿瘤可能已经确定包含表达OX40的肿瘤浸润性T细胞。用于确定抗原在细胞表面上表达的方法是本领域已知的，并且包括，例如流式细胞术。
例如，使用本文所述的特异性结合成员治疗的癌症可以选自白血病，例如急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病、白血病(CLL)；淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；实体癌，例如肉瘤(例如软组织肉瘤)、皮肤癌(例如默克尔细胞癌)、黑素瘤、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、脑癌(例如胶质母细胞瘤)、乳腺癌、子宫/子宫内膜癌症、卵巢癌(例如卵巢浆液性囊腺瘤)、前列腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))、结直肠癌(例如结直肠癌)、宫颈癌(例如宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、食道癌、胰腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌(例如胆管癌)、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌。
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的特异性结合成员治疗的癌症是实体癌。更优选地，使用本文所述的特异性结合成员治疗的癌症是选自以下的实体癌：肉瘤、黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫/子宫内膜癌症、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌和胃癌。
在癌症的情况下，治疗可以包括抑制癌症的生长，包括完全的癌症缓解，和/或抑制癌症的转移，以及抑制癌症的复发。癌症生长通常是指许多指标中的任何一个，这些指标表明癌症内的状态已发展为更发达的形式。因此，用于测量抑制癌症生长的指标包括癌细胞存活率的降低、肿瘤体积或形态的降低(例如，使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其他成像方法确定)、肿瘤生长延迟，肿瘤脉管系统的破坏，迟发型超敏性皮肤测试的性能的改善、抗癌免疫细胞或其他抗癌免疫反应活性的增加，以及肿瘤特异性抗原水平的降低。在个体中激活或增强对癌性肿瘤的免疫应答可以改善个体抵抗癌症生长的能力，特别是在受试者中已经存在的癌症的生长和/或降低在个体中癌症生长的倾向。
在癌症治疗的背景下，本文所述的特异性结合成员可与另一种抗癌治疗剂或治疗剂(例如已证明是合适的抗癌治疗剂或治疗剂或预期适合于治疗所讨论的癌症)联合施用给个体。例如，可以将特异性结合成员与化疗剂、放射疗法、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、过继性细胞转移(ACT)疗法(例如过继性NK细胞疗法或嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、自体肿瘤浸润淋巴(TILs)、或γ/δT细胞疗法)或激素治疗剂联合施予个体。
不希望被理论所束缚，本文所述的特异性结合成员被认为可以充当抗癌疗法中的佐剂。具体地，例如与单独使用化疗和/或放射疗法，或抗肿瘤疫苗相比，将特异性结合成员与化疗和/或放射疗法联合，或与抗肿瘤疫苗联合施予个体，被认为将引发针对癌症的更高的免疫应答。
与本文所述的特异性结合成员联合施用的一种或多种化疗剂可以选自：紫杉烷类、细胞毒性抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、PARP抑制剂、B-Raf酶抑制剂、MEK抑制剂、c-MET抑制剂、VEGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、烷基化剂、铂类似物、核苷类似物、抗叶酸剂、沙利度胺衍生物、抗肿瘤化疗剂等。紫杉烷类包括多西紫杉醇、紫杉醇和纳布紫杉醇；细胞毒性抗生素包括放线菌素、博来霉素和蒽环类药物、如阿霉素、米托蒽醌和戊柔比星(valrubicin)；酪氨酸激酶抑制剂包括厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、阿西替尼(axitinib)、PLX3397、伊马替尼(imatinib)、考比替尼(cobemitinib)和曲美替尼(trametinib)；PARP抑制剂包括吡拉帕尼(piraparib)；B-Raf酶抑制剂包括维罗非尼(vemurafenib)和达布拉非尼(dabrafenib)；烷基化剂包括达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺和替莫唑胺(temozolomide)；铂类似物包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；核苷类似物包括阿扎胞苷(azacitidine)、卡培他滨(capecitabine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和吉西他滨(gemcitabine)、以及抗叶酸药物包括甲氨蝶呤和培美曲塞(pemetrexed)。适用于本发明的其他化疗剂包括地法替尼(defactinib)、恩替司他(entinostat)、艾瑞布林(eribulin)、伊立替康(irinotecan)和长春碱(vinblastine)。
与本文所述的抗体分子一起给药的优选治疗剂是阿霉素、米托蒽醌、环磷酰胺、顺铂和奥沙利铂。
与本文所述的特异性结合成员联合给药的放射疗法可以是体外放射疗法或近距放射疗法。
与本文所述的特异性结合成员联合给药的免疫治疗剂可以是治疗性抗体分子，核酸细胞因子或基于细胞因子的疗法。例如，治疗性抗体分子可以结合免疫调节分子，例如抑制性检查点分子或免疫共刺激分子，或肿瘤抗原，例如细胞表面肿瘤抗原或可溶性肿瘤抗原。治疗特异性结合成员可以结合的免疫调节分子的例子包括CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、PD-L1、PD-1、CD47、CD73、CSF-1R、KIR、CD40、HVEM、IL-10和CSF-1。治疗性抗体分子可以结合的先天免疫系统的受体的实例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、RIG-I样受体(例如RIG-I和MDA-5)和STING。治疗性抗体分子可以结合的肿瘤抗原的实例包括HER2、EGFR、CD20和TGF-β。
与本文所述的特异性结合成员联合给药的核酸可以是siRNA。
基于细胞因子或细胞因子的疗法可以选自下组：IL-2，缀合的IL2的前药、GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-9、IL-15、IL-18、IL-21和I型干扰素。
用于治疗癌症的抗肿瘤疫苗已经在临床中实施，并且在科学文献中进行了详细讨论(例如Rosenberg，2000)。这主要涉及通过提升免疫系统对自体或同种异体癌细胞表达的不同细胞标记物的应答的策略，通过使用自体或异体癌细胞作为疫苗接种的方法，无论它们是否带有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。GM-CSF在抗原呈递方面引起强烈应答，与上述策略一起使用时有显著效果。
化疗剂、放射疗法、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT疗法或激素治疗剂优选为化学治疗剂、放射疗法、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT疗法或用于所讨论癌症的激素治疗剂，即化学疗法、放射疗法、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT疗法或激素治疗剂，已被证明对所讨论的癌症有效。选择已表明对所讨论对上述癌症有效的合适的化疗剂、放射疗法、免疫治疗剂、抗肿瘤疫苗、溶瘤病毒、ACT治疗或激素治疗剂，完全在熟练技术人员的能力范围内。
考虑到OX40的免疫应答增强活性，OX40激动剂分子有望用于治疗传染病。因此，在另一个优选的实施方案中，本文所述的特异性结合成员可用于治疗传染病，例如急性或持续性传染病的方法。
不希望受到理论的束缚，本发明的特异性结合成员被认为可能通过通过诱导先天免疫细胞(如嗜中性粒细胞和单核细胞)的快速浸润和活化而增强针对由病原体引起的急性传染病的免疫应答，从而有助于清除引起急性传染病的病原体。因此，在另一个实施方案中，本文所述的特异性结合成员可用于治疗急性感染性疾病，例如急性细菌性疾病的方法。在优选的实施方式中，急性感染性疾病是由革兰氏阳性细菌如李斯特菌(Listeria)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属的细菌感染引起的急性细菌性疾病。
感染性疾病通常可通过免疫系统清除，但某些感染会持续很长时间，例如数月或数年，并且无法通过免疫系统有效抵抗。这种感染也称为持续性或慢性感染。
优选地，本文所述的特异性结合成员用于治疗持续性传染病，例如持续性病毒、细菌、真菌或寄生虫感染，优选持续性病毒或细菌感染。
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的特异性结合成员治疗的持续性病毒感染是以下人的持续性感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒。
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的特异性结合成员治疗的持续性细菌感染是以下的持续性感染：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒杆菌(Salmonella typhi)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、苍白螺旋体(Treponema pallidum)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的特异性结合成员治疗的持续性真菌感染是以下的持续性感染：念珠菌(例如白色念珠菌(Candida albicans))、隐球菌(例如格特隐球菌(Cryptococcus gattii)或新型细球菌(Cryptococcus neoformans))、篮状菌属(青霉菌)(如马尔尼菲蓝状菌(Talaromyces marneffe)、小孢子菌(如奥氏小孢子菌(Microsporum audouinii)),或断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)。
在一个优选的实施方案中，使用本文所述的特异性结合成员治疗的持续性寄生虫感染是以下的持续性感染：疟原虫，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，或利什曼原虫，例如利什曼原虫(Leishmania donovani)。
在持续感染性疾病的治疗中，治疗可以包括消除感染、降低个体的致病负荷，防止感染的复发。例如，治疗可包括预防、改善、延迟、减轻或阻止持续感染的一种或多种病症和/或症状。或者，治疗可包括预防传染病。
在治疗传染性疾病的背景下，本文所述的特异性结合成员可以与用于治疗传染性疾病的另一种治疗剂(例如已证明是合适的治疗剂或预期适合于治疗所讨论的传染病)联合施予个体。例如，可以将特异性结合成员与免疫治疗剂联合施予个体。与本文所述的抗体分子联合施用的免疫治疗剂可以是治疗性抗体分子。例如，治疗性抗体分子可以结合先天免疫系统的受体。治疗性抗体分子可以结合的先天免疫系统的受体的实例包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9、RIG-I样受体(例如RIG-I和MDA-5)和STING。
当特异性结合成员用于预防传染病时，可以将特异性结合成员与用于所述病原体的疫苗联合施用。不希望受到理论的束缚，本文所述的特异性结合成员被认为可以在疫苗接种中充当佐剂。特别地，特异性结合成员与疫苗联合施予个体被认为比单独施予疫苗引发更大的针对病原体的免疫应答。
鉴于包括以下实验示例的本公开，本发明的其他方面和实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。
本说明书中提及的所有文件均通过引用整体并入本文。
在本文中使用的“和/或”应被视为两个指定的特征或部件中的每个具有或不具有另一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就如同它们在本文中分别列出一样。
除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施例。
除非上下文另外指出，否则本发明的其他方面和实施方式提供了用术语“包含”替换为术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上述方面和实施方式。
现在将通过示例的方式并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方式。
实施例
实施例1-抗原选择和表征
用于选择对人和小鼠OX40特异的Fcab以及用于测试所选Fcab与食蟹食蟹猴OX40的交叉反应性的OX40抗原可如下所述自制或从商业来源获得。
1.1自制的抗原
自制重组的、可溶的、二聚体的OX40抗原以及表达OX40的细胞系。
1.1.1重组、可溶性人、食蟹猴和小鼠OX40抗原的制备
为了制备重组的可溶性二聚体OX40抗原，将OX40的胞外域与小鼠Fc融合，从而改善了抗原的溶解性和稳定性。具体而言，使用EcoRI-HF和BgIII限制性内切酶将相关OX40(人、食蟹猴或小鼠)的胞外域克隆到pFUSE-mIgG2aFc2载体(Invivogen货号pfuse-mg2afc2)中，以产生C端具有小鼠IgG2a Fc结构域的抗原。然后，通过在HEK293-6E细胞(加拿大国家研究委员会)中瞬时表达产生重组OX40抗原，并使用mAb选择SuRe蛋白A柱(通用医疗公司，11003494)纯化，然后通过体积排阻色谱法(SEC)纯化以确保产生的抗原是单一物种，不包含聚集体。
为了制备重组OX40抗原的生物素化形式，按照制造商的实验方法，使用EZ-LinkTMSulfo-NHS-SS-生物素试剂盒(赛默飞世尔科技，货号21331)对抗原进行生物素化。生物素化的OX40抗原用于以下所述的选择实验，但不用于结合亲和力测量。按照制造商的说明，使用PD10脱盐柱(通用医疗公司，17-0851-01)，然后使用Amicon 30k旋转柱(密理博公司，UFC903024)分两步进行生物素化OX40抗原的纯化。通过SE-HPLC分析表征重组抗原的生物物理特性，以确保不存在聚集体，并通过PAGE来验证分子的大小。通过PAGE确定的大小表明可溶性抗原是二聚体，因为它们的估计分子量是预测单体分子量的两倍。还通过凝胶移位分析法分析了重组抗原，其显示生物素化的程度在90％以上。通过ELISA和表面等离子体共振(SPR)确认生物素化的重组人(hOX40-mFc)、小鼠(mOX40-mFc)和食蟹猴(cOX40-mFc)OX40抗原可以被OX40特异性抗体(针对人和食蟹猴OX40的抗体11D4[欧洲专利2242771]；针对食蟹猴OX40的多克隆羊抗人OX40抗体[安迪生物货号AF3388]；针对人类OX40的抗体ACT35[百乐进公司货号35002]和针对小鼠OX40的抗体OX86[百乐进公司货号119408])结合。这些抗原在下面的表2中列出。
1.1.2制备表达人、食蟹猴和小鼠OX40的细胞系
使用SpeI-HF和NotI-HF限制酶将人、食蟹猴和小鼠OX40(序列见表1)克隆到载体pLVX-EF1a-IRES-puro(Clontech，货号631253)上。然后将载体转化到Lenti-X 293T细胞系(Clontech，货号632180)中，和Lenti-X HTX包装混合物(Clontech货号631249)一起生成慢病毒。然后将慢病毒转导DO11.10细胞(国家犹太健康局)。通过将细胞与5μg/ml嘌呤霉素(生命技术公司货号A11113803)孵育约2周,选择过表达OX40的细胞，然后通过连续稀释克隆细胞系。使用荧光标记的OX40特异性抗体(OX86；ACT35；和多克隆绵羊抗人OX40，如实施例1.1.1和表2中所述)，通过流式细胞术测试OX40在细胞系中的表达。选择表达人(DO11.10-hOX40)、小鼠(DO11.10-mOX40)或食蟹猴(DO11.10-cOX40)OX40的细胞系中，其中所有细胞的荧光值均比非转导细胞在流式细胞术分析高至少10倍。这些细胞系在下面的表2中列出。
表1：OX40序列
Figure BDA0002974976140000471
Figure BDA0002974976140000481
1.2市售的OX40抗原
测试了几种市售的OX40抗原。
重组的带His标签的人OX40胞外结构域获自Sino生物公司(货号10481-H08H-50)。然而，对该抗原的SE-HPLC分析表明，少于50％的抗原是单体的非聚集形式。因此，该抗原未用于后续分析中。
重组人OX40/人Fc(hOX40-hFc)和重组小鼠OX40/人Fc(mOX40-hFc)的C端包含人IgG1 Fc结构域，可从安迪生物获得(hOX40-hFc：货号3388-OX-050；mOX40-hFc：货号1256-OX-050)并在内部进行生物素化处理。这些可溶性抗原的生物物理特性通过SE-HPLC分析来表征，以确保不存在聚集体，并通过PAGE来验证分子的大小。通过PAGE确定的大小表明可溶性抗原是二聚体，因为它们的估计分子量是预测单体抗原分子量的两倍。还通过凝胶移位分析法分析了可溶性抗原，其显示生物素化的程度在90％以上。ELISA和SPR用于确认生物素化的重组人(hOX40-hFc)和小鼠(mOX40-hFc)OX40抗原可以被OX40特异性抗体(11D4；ACT35；和OX86)结合，如实施例1.1.1和下面的表2中所述。
表2：OX40抗原
Figure BDA0002974976140000482
实施例2–抗人OX40 Fcab的选择和表征
2.1初始选择抗人OX40抗体
为了从初始噬菌体文库中选择特异于人OX40的Fcab，将重组生物素化的可溶性二聚体人OX40(hOX40-mFc；参见表2)和细胞表达的人OX40(DO11.10-hOX40)用作抗原。在某些选择实验方案中，除重组生物素化的可溶性二聚人OX40外，还使用表达人OX40的细胞来确保所选择的Fcab能够以其天然构象结合到OX40上，并在细胞表面上结合。
六个初始的噬菌体库，显示CH3域(IMGT编号为1.4-130)，包括CH3域中的部分随机AB环(根据IMGT编号方案为残基14至18)和EF环(根据IMGT编号方案为残基92至101)。六个文库之一还包含在CH3域的EF环中101位置插入两个或四个氨基酸(由两个或四个NNK密码子编码)的克隆(根据IMGT编号方案，插入的残基编号为101.1至101.4)。
使用重组生物素化的可溶性二聚体人OX40(hOX40-mFc；参见表2)对所有六个文库进行三轮选择。具体而言，文库进行三轮分析，使用(在第1轮及第3轮中)在经链霉亲和素(赛默飞世尔科技，11206D)包被或(在第2轮)在经中性亲和素(赛默飞世尔科技，14203和A2666)包被的免疫磁珠中捕获hOX40-mFc。
在第一轮选择中，还使用hOX40-mFc对所有六个文库进行了进一步的选择运动，随后是细胞表达的人OX40(在另外两轮选择中为DO11.10-hOX40；参见表2)。
使用DO11.10-hOX40抗原表达细胞对两个文库进行三轮选择。
通过ELISA筛选从六个文库进行第三轮选择后鉴定了与人OX40结合的2133个克隆。这导致鉴定了32种独特的阳性结合物，在HEK Expi293细胞(Fcab克隆到pTT5载体[加拿大国家研究委员会]，通过ExpiFectamine 293转染试剂盒[生命技术公司，A14524]转染入Expi293F细胞[生命技术公司，A14527])中，其被亚克隆并表达为可溶性Fcab(由截短的铰链组成[SEQ ID NO：171]，CH2和CH3结构域)。
测试了32种独特的Fcab与细胞表达的人OX40(DO11.10-hOX40)结合的能力。筛选的32个Fcab中有15个显示细胞与DO11.10-hOX40结合，相互作用的EC50范围为0.1到62nM。在人NF-κB报道基因分析中测试了显示出与DO11.10-hOX40结合的15个Fcab(在以下实施例4.4中描述)。在人NF-κB报告基因分析中，与抗人Fc抗体交联时，15个Fcab中有6个显示出活性增加。所述三种Fcab，FS20-11、FS20-22和FS20-31在此测定中显示出最高的活性水平，并且当Fcab与抗人CH2 mAb交联时其活性增加(克隆MK1A6(Jefferis等，1985年和Jefferis等，1992年)，自制)，选中这三种Fcab进行亲和力成熟。
2.2抗人OX40抗体的亲和力成熟
基于实施例2.1中选择的三个Fcab(FS20-11，FS20-22和FS20-31)，通过使用ELLA生物技术的随机引物进行氨基酸等摩尔分布(不包括半胱氨酸)，将AB环中的5个残基(残基14至18)或CH3域的CD环中的5个残基(45.1至77残基)随机化，或通过随机化CH3域EF环的部分(对于FS20-22和FS20-31，92至94和97至101残基，以及对于FS20-11，97至100和101.1至101.4残基[参见上述实施例2.1])，构建了九个噬菌体展示的亲和力成熟文库(每个Fcab三个)(所有残基均根据IMGT编号方案编号)。还尝试了第四个Fcab克隆FS20-10的亲和力成熟，但与其他三个Fcab谱系相比，其子代的结合特性和功能活性较差，因此没有进一步的进行该谱系。
使用(在第1和第3轮)经链霉亲和素包被(赛默飞世尔科技，11206D)和(在第2轮)中性亲和素包被的(赛默飞世尔科技，14203和A2666)免疫磁珠上交替捕获的重组人生物素化的hOX40-mFc，对亲和力成熟文库进行三轮选择。使用从50nM(第1轮)至10nM(第2轮)至1nM(第3轮)(对于FS20-11和FS20-22谱系)，或从100nM(第1轮)至50nM(第2轮)至10nM或1nM(第3轮)(对于FS20-31谱系)的降低的抗原浓度，以鉴定高亲和力结合剂。对于第三轮输出中的两个输出，即来自AB环中具有随机化残基14至18位的FS20-11文库以及在CD环中具有随机化残基45.1至77位的FS20-22文库的输出，使用1nM浓度的相同抗原和链霉亲和素包被的免疫磁珠进行第四轮选择。如上文实施例2.1中所述，通过ELISA筛选来自第三轮和第四轮选择的输出的1410个Fcab与人OX40的结合，并鉴定204种独特的阳性结合物，亚克隆并以可溶性Fcab的形式在HEK Expi293细胞中表达。
在不存在和存在抗CH2交联的情况下，使用抗人CH2 mAb克隆MK1A6(参见实施例2.1)，使用Biacore 3000(通用医疗公司)测量了与hOX40-mFc结合时可溶性Fcab的解离率。针对与细胞表达的人OX40的结合以及在人T细胞活化测定中的活性(参见下面的实施例5.1)，与相关的亲本Fcab相比，进一步筛选了具有相对更高的解离率的Fcab。所有的Fcab结合细胞表达的人OX40。选择在人T细胞活化测定中具有最高活性的来自FS20-11谱系的20Fcab、来自FS20-22谱系的10Fcab和来自FS20-31谱系的18Fcab，以用于如下文所述的环改组(shuffling)。
对于FS20-11谱系，产生两个环改组库，一个通过将10个EF环和WT CD环对9个AB环改组产生，而另一个用亲和力成熟的CD环对AB和EF环进行改组产生。对于FS20-22谱系，通过改组三个CD环，六个EF环以及亲本AB环或亲和力成熟的AB环，产生了两个环改组库。对于FS20-31谱系，产生了一个环改组库，其中包含四个AB环、七个CD环和七个EF环。
如上文实施例2.1中所述，改组的序列以可溶性Fcab的形式在HEK Expi293细胞中表达，对结合生物素化的hOX40-mFc抗原，在Octet QKe系统(PallFortéBio)上使用Dip andReadTM链霉亲和素生物传感器(PallFortéBio，18-5050)进行筛选。对与结合至hOX40-mFc时相比亲本Fcab，解离率提高的Fcab进行测序，获得来自FS20-11谱系的66个独特的Fcab序列、来自FS20-22谱系的35个独特的Fcab序列以及来自FS20-31谱系的62个独特的Fcab序列。对于hOX40-mFc抗原的结合，在存在和不存在CH2交联的情况下，使用抗人CH2 mAb克隆MK1A6使用Biacore 3000仪器(通用医疗)对鉴定出的独特Fcab进行测试。
对于FS20-11谱系，选择与hOX40-mFc结合最强的18个Fcab(通过在固定浓度下在Biacore仪器上给出最高响应来确定)，以如下所述的模拟(4420LALA)mAb2形式表达并进一步表征。对于FS20-22谱系，选择18个Fcab以模拟(4420LALA)mAb2形式表达，并基于以下进一步表征：当结合至hOX40-mFc时在CH2交联的情况下的最慢解离速率，当结合至hOX40-mFc时非交联和CH2交联的解离速率之间的解离速率最大差值以及与如上hOX40-mFc的结合强度。对于FS20-31谱系，选择在CH2交联的情况下在结合至hOX40-mFc时具有最慢解离速率的9个Fcab，以及在无CH2交联的情况下在结合至hOX40-mFc时具有最慢解离速率的9个Fcab，以用于模拟(4420LALA)mAb2形式表达并进一步表征。由于这九种Fcab的组中共有数个Fcab，因此从FS20-31谱系选择在不存在CH2交联的情况下在结合至hOX40-mFc时展现缓慢解离速率的其他Fcab，以使用于模拟mAb2形式的表达和进一步表征的来自该谱系的Fcab的总数目为18。使用来自T细胞活化测定的数据，鉴定出来自FS20-22谱系的另外6个Fcab和来自FS20-31谱系的8个Fcab，它们在该测定中展示出高活性，因此以模拟(4420LALA)mAb2的形式表达并进一步的表征。
实施例3-抗小鼠OX40 Fcab的选择和表征
3.1抗小鼠OX40 Fcab的初始选择
通过一个初始酵母文库进行筛选，所述文库展示了人IgG1 CH1至CH3结构域，其中包含CH3域中的AB环(根据IMGT编号方案为残基11-18)和EF环(根据IMGT编号方案为残基92-101)中的随机化，并在AB环的第16和17位残基(根据IMGT编号方案)之间随机插入5个残基。酵母与融合至人IgG Fc结构域(mOX40-hFc；表2)的生物素化重组鼠OX40孵育，并使用抗生蛋白链菌素包被的珠粒通过MACS分选。随后在存在五倍过量摩尔浓度的hFc的情况下，使用递减浓度的生物素化的mOX40-hFc进行三轮FACS筛选。使用链霉亲和素-铝藻蓝蛋白(APC)(BD生物科学，349024)或抗生物素-APC(美天旎公司，130-090-856)对细胞染色，并使用FACSAria(BD生物科学)细胞分选仪进行分选。如先前在实施例2.1中所述，根据抗原结合筛选来自富集群体的182个个体Fcab，并将两种独特的阳性结合物亚克隆并以可溶性Fcab形式表达。针对于mOX40-hFc的结合，通过ELISA表征Fcab，且在小鼠NF-κB报告实验1(参见以下实施例4.5)中针对活性表征Fcab。在NF-κB报告实验中，只有一个Fcab、FS20m-232具有活性，并显示与表达小鼠OX40的细胞结合，因此筛选该Fcab用于亲和力成熟。
3.2mOX40 Fcab的亲和力成熟
通过随机化FS20m-232Fcab的AB环中的七个残基(根据IMGT编号方案，残基15–16.5)(库1)、CD环中的六个残基(根据IMGT编号方案，残基45.1-78)(库2)或EF环中五个残基(根据IMGT编号方案的残基92-94和97-98)(库3)，使用ELLA生物技术的随机引物，使用除半胱氨酸外的等摩尔分布的氨基酸，构建了三个噬菌体展示亲和力成熟文库。
使用重组生物素化的mOX40-mFc可选地捕获链霉亲和素包被的(赛默飞世尔科技，11205D)和中性亲和素包被的(赛默飞世尔科技，14203和A2666)免疫磁珠，在亲和力成熟文库上进行了三轮筛选。使用自50nM(第1轮)至10nM(第2轮)，至1nM(第3轮)降低的抗原浓度以鉴定高亲和力结合剂。通过噬菌体ELISA筛选与mOX40-mFc结合的来自第三轮筛选的1655个个体噬菌体，并且如实施例2.1中所述，鉴定了98种独特的阳性结合物，亚克隆并在HEKExpi293细胞中表达的可溶性Fcab。针对细胞结合及小鼠NF-κB报告基因测定2(详见下文实施例4.6)中的活性，进一步筛选Fcab。选择最活跃的Fcab用于环改组。
产生了一个环改组的文库，该库含有27个CD环(自亲和力成熟鉴定出所有26个独特序列和WT序列)，其用37个EF环(在噬菌体ELISA中具有与小鼠OX40的最佳结合的序列及WT序列)改组，其中所有改组克隆包含FS20m-232Fcab的AB环。如上所述，将750个改组序列以可溶性Fcabs(包含截短的铰链)形式在HEK Expi293细胞中表达。通过在Octet QKe系统(PallFortéBio)上使用Dip和Read链霉亲和素生物传感器(PallFortéBio，18-5050)测量Fcab与生物素化的mOX40-mFc(表2)的结合以提高脱附率，筛选出含有Fcab的HEK上清液。如上所述，将11个独特的AB环随机化的Fcab和60个独特的EF环随机化的Fcab亚克隆，在HEKExpi293细胞中以可溶性Fcab形式表达。将这些Fcab与具有最慢解离速率的43个改组的Fcab一起针对细胞结合及在小鼠T细胞活化试验(参见下文实施例5.2)中的活性进一步筛选。，当与抗人CH2 mAb克隆MK1A6交联时，FS20m-232-91Fcab在结合至生物素化的mOX40-mFc时具有最慢解离速率，且在小鼠T细胞活化测定中具有最高活性，因此被选作小鼠(替代)Fcab，用于后续实验。
实施例4–模拟mAb2的构建、表达和表征
4.1模拟mAb2的构建和表达
制备包含上面鉴定的抗人OX40和抗小鼠OX40 Fcab的“模拟”mAb2，以便以mAb2形式对这些Fcab进行表征。这些模式mAb2由抗OX40 Fcab和抗FITC抗体4420的可变区(Bedzyk等，1989；Bedzyk等，1990)在人IgG1骨架(详见SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、以及SEQ IDNO：156)，或人IgG1骨架中抗鸡卵蛋白溶菌酶(HEL)抗体D1.3(Braden等，1996)(细节参见SEQ ID NO：169和157)，通过在于人IgG1的未修饰的CH3结构域的序列中的XhoI和BamHI位点内，将抗OX40 Fcab的CH3结构域代替抗FITC和抗HEL抗体的CH3结构域来制备。模拟的mAb2分别包含抗FITC mAb 4420的轻链(SEQ ID NO：156)或抗-HEL mAb D1.3(SEQ ID NO：157)，并且在重链的CH2域中还包含LALA突变(Hezareh等，2001和Bruhns等，2009)，以减少Fc-γ受体相互作用和潜在的Fc-γ受体诱导的交联。这些示例中提到的模式mAb2和mAb2中存在LALA突变，在其克隆名称的Fcab部分的末尾用后缀“AA”表示。
通过在HEK293-6E细胞中瞬时表达产生模拟的mAb2，并使用mAb Select SuRe蛋白A柱进行纯化。
4.2模拟mAb2形式的抗人OX40 Fcab与细胞表达的人和食蟹猴OX40的结合亲和力
模拟(4420LALA)mAb2形式的抗人OX40 Fcab与细胞表达的人或食蟹猴OX40(表达人[DO11.10-hOX40]或食蟹猴OX40[DO11.10-cOX40]的DO11.10细胞；参见表2)使用流式细胞仪测量。还通过流式细胞术通过测试与不表达OX40的HEK细胞的结合来评估非特异性结合。
在1xDPBS(Gibco，14190-094)中一式三份地制备模拟(4420LALA)mAb2和对照mAb稀释液(2x最终浓度)。在PBS+2％BSA(西格马，A7906)中制备DO11.10-hOX40或DO11.10-cOX40或HEK细胞悬液，并在V型底96孔板中(Costar，3897)，以50升/孔接种4x106细胞/ml。将50μl模拟(4420LALA)mAb2或对照mAb(抗人OX40 mAb，11D4)稀释液添加到含有细胞的孔中(最终体积为100μl)，并在4℃下孵育1小时。洗涤板，然后在PBS+2％BSA中以1：1000稀释100μl/孔的二抗(抗人Fc-488抗体，杰克逊免疫研究，109-546-098)，然后在黑暗中，4℃孵育30分钟。洗涤板，并以1μg/ml浓度在100μl的含有DAPI(Biotium，货号40043)的PBS中重悬。使用Canto II流式细胞仪(BD生物科学)读取板。排除死细胞，并测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。在GraphPad Prism软件中使用log(激动剂)比响应拟合数据。
Fcab(均以模拟[4420LALA]mAb2形式测试)和阳性对照抗人OX40 mAb、11D4，位于人IgG1骨架中，并在重链CH2域中包含LALA突变，以一定亲和力与人OX40结合。在实施例2.2中描述的以模拟mAb2形式进一步表征所选择的克隆中，相比其他Fcab，14个Fcab(来自FS20-11谱系的三个，来自FS20-22谱系的五个和来自FS20-31谱系的六个)，与其他Fcab相比，针对人OX40展示出显著更高的亲和力。表3列出了这14个Fcab克隆对细胞表达的人和食蟹猴OX40的结合亲和力。
来自FS20-22和FS20-31谱系的Fcab以与人OX40相当的亲和力结合猕猴OX40。这可能是有利的，因为在体外显示出食蟹猴OX40的适当活化后，这些Fcabs可以用于食蟹猴中的毒理学研究，其结果可以预测人类中的毒理学效应。来自FS20-11谱系的Fcab也能结合至食蟹猴OX40，但亲和力较低，使其不适合在食蟹猴中测试。测试的Fcab和阳性对照mAb没有显示与HEK细胞的任何非特异性结合。
表3：模拟(4420LALA)mAb2形式的抗OX40 Fcab与细胞表达的人或食蟹猴OX40的结合亲和力
Figure BDA0002974976140000531
Figure BDA0002974976140000541
4.3模拟mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab与细胞表达的小鼠OX40的结合亲和力
使用流式细胞术测量模拟mAb2形式(4420LALA)的抗小鼠OX40 Fcab对细胞表达的小鼠OX40(DO11.10-mOX40；参见表2)的亲和力。还通过流式细胞术通过测试与不表达OX40的HEK细胞的结合来评估非特异性结合。
在1xDPBS(Gibco，14190-094)中制备模拟(4420LALA)mAb2和对照mAb稀释液(2x最终浓度)。在PBS+2％BSA(西格马，A7906)中制备DO11.10 mOX40或HEK细胞悬液，并在V型底96孔板中(Costar，3897)，以50升/孔接种4x106细胞/ml。将50μl模拟(4420LALA)mAb2或对照mAb(抗小鼠OX40 mAb，OX86稀释液添加到含有细胞的孔中(最终体积为100μl)，并在4℃下孵育1小时。洗涤板，然后在PBS+2％BSA中以1：1000稀释100μl/孔的二抗(抗人Fc-488抗体，杰克逊免疫研究，109-546-098)，然后在黑暗中，4℃孵育30分钟。洗涤板，并以1μg/ml浓度在100μl的含有DAPI(Biotium，40043)的PBS中重悬。使用Canto II流式细胞仪(BD生物科学)读取板。排除死细胞，并测量FITC通道(488nm/530/30)中的荧光。利用GraphPad Prism软件中的log(激动剂)比响应来拟合数据。
以模拟(4420LALA)mAb2形式测试的Fcab，和阳性对照，在人IgG1主链中，具有LALA突变的抗小鼠OX40 mAb、OX86(SEQ ID NO:175和176)，以表4中所列的亲和力特异性结合至小鼠OX40。抗小鼠OX40 Fcab对细胞表达的小鼠OX40的亲和力与抗小鼠OX40阳性对照mAb的亲和力相当。所测试的Fcab和阳性对照mAb对HEK细胞没有展示任何非特异性结合。
表4：模拟(4420LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab与细胞表达的小鼠OX40的结合亲和力
模拟(4420LALA)mAb<sup>2</sup>/mAb 结合至DO11.10-mOX40 EC<sub>50</sub>(nM)
mFS20-232-91AA/4420 1.006
G1AA/OX86 3.099
4.4人NF-κB报告实验
需要一种测定方法，以简单、快速地从初始的选择过程中分离出Fcab的OX40激动剂活性，以便可以快速决定继续选择哪种Fcab。如下所述，这种测定的发展在技术上具有挑战性。
OX40与其配体的结合导致OX40簇聚并激活NF-κB信号通路(Arch和Thompson，1998)。具有激动剂活性的抗OX40 Fcab通过诱导OX40簇聚和发出信号来模拟OX40配体。因此，设计了一种可以检测OX40聚簇后NF-κB信号通路激活的检测方法，以测试抗OX40 Fcab的活性。
Flp-In T-REx 293HEK细胞系(生命技术，R780-07)用Qiagen Cignal Lenti NFkBReporter(luc)(Qiagen目录号336851)慢病毒转导，该慢病毒包含控制萤光素酶表达的NF-κB敏感启动子。随后通过将细胞在5μg/ml嘌呤霉素(生命技术目录号A11113803)存在下培养约2周来选择这些细胞，然后通过连续稀释法克隆细胞系。根据制造商的说明，通过将细胞与10ng/ml TNFa(安迪生物目录号210-TA-005)孵育24小时，并在用普洛麦格Bio-Glo荧光素酶测定法系统(普洛麦格目录号G7941)处理15分钟后测量发光，来测试荧光素酶报告基因构建体的存在。使用Gen5软件，BioTek在酶标仪中测量发光(积分时间为0.5秒)。
使用EcoRI-HF和NotI-HF限制酶将人OX40亚克隆到载体pcDNA5FRT(生命技术目录号V6010-20)中。然后使用脂质体(Lipofectamine)2000(生命技术，11668-019)将载体转化到Flp-In T-REx 293HEK细胞系(生命技术，R780-07)中。转化的Flp-In T-REx 293细胞(称为HEK.FRT.luc细胞系)在含有10％FBS(生命技术，10270-1-6)、100μg/ml潮霉素B(美尔福实验室有限公司，Z2475)、15μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin),(美尔福实验室有限公司，B1105)的DMEM(生命技术，61965-026)中生长，持续3-4周，直到出现稳定转化的细胞集落为止。这些菌落在存在1μg/ml脱氧土霉素(西格玛，D9891)的情况下进行扩增，并使用抗OX40mAb ACT35(赛默飞世尔科技，目录号17-1347-42)通过流式细胞仪检测人OX40的表达。
在新构建的HEK.FRT.luc细胞系中人OX40的表达出乎意料地导致了NF-κB信号传导途径的组成性活化和荧光素酶的高水平表达。因此，不可能通过OX40激动剂抗体检测到该信号通路的差异活化。为了减少NF-κB信号传导途径的组成型活化，尝试通过用其他启动子(来自Invivogen PromTest质粒)替代高表达的CMV启动子来降低OX40的表达水平。然而，与预期相反，该策略并未改变OX40的表达水平，并且NF-κB信号传导途径仍然具有组成性活性。
通过将人OX40细胞外结构域与其他TNFR家族成员之一(CD40、GITR、TNFRII、CD27、CD30、CD137和HVEM)(Song等人，2014)的胞内结构域融合来进行另一种减少NF-κB信号传导途径组成性活性的尝试，并如上所述，在HEK.FRT.luc细胞系中表达所得的嵌合蛋白。使用OX40特异性抗体通过流式细胞术确定OX40表面表达。令人惊讶的是，表达hEK40-hCD137嵌合体的HEK.FRT.luc细胞显示出降低的NF-κB信号通路背景活化和对OX40激动剂抗体的浓度依赖性反应。测试的其他嵌合受体均未导致NF-κB信号传导途径的组成性活化降低。只有表达hOX40-hCD137嵌合体的细胞系(HEK.FRT.luc.hOX40hCD137)可因此用于在就抗人OX40Fcab的激动活性而言初始选择之后鉴别的抗人OX40 Fcab进行测试和分级，且用于这种作用。
如实施例2.1中所述，将抗OX40 Fcab以可溶性蛋白形式表达，并如下测试OX40激动剂活性。在37℃，5％CO2下，将HEK.FRT.luc.hOX40hCD137细胞以1x105细胞/孔的浓度接种于96孔白色透明平底平板中过夜。第二天，在DPBS(Gibco)中制备每种待检测的Fcab或对照mAb(人IgG1形式的11D4)的2μM稀释液，并进一步1:10稀释于报告细胞培养基(DMEM(Gibco目录号61965-026)中)；10％FCS(Gibco目录号10270-106)；1x青霉素链霉素(Gibco目录号15140-122)；潮霉素B100μg/ml(美尔福实验室有限公司.Z2475)；杀稻瘟菌素15μg/ml(美尔福实验室有限公司.B1105)；嘌呤霉素5μg/ml(生命技术目录号A11113803)和多喜霉素1μg/ml(西格玛目录号D9891))(30μl+270μl)，获得200nM稀释液。在需要时，将交联剂(抗人CH2mAb克隆MK1A6)与测试Fcab或对照mAb以1：1摩尔比添加到孔中。在96孔板中，在存在或不存在交联剂的情况下，制备Fcab或对照mAb的系列稀释液，并将100μl稀释液添加到培养板上的细胞中。
将细胞在37℃，5％CO2中孵育24小时，并根据制造商的说明，用普洛麦格Bio-Glo荧光素酶测定系统(普洛麦格目录号G7941)处理15分钟后测量发光。在酶标仪中使用Gen5软件，BioTek测量荧光(积分时间为0.5秒)，作为响应经由交联激动性Fcab或阳性对照单抗与OX40的结合诱导人OX40的簇聚的NF-κB信号通路活化，产生的荧光素酶的量度。相对于Fcab/mAb的对数浓度，绘制荧光值，并使用GraphPad Prism中的对数(激动剂)对响应方程拟合所得曲线。
4.5小鼠NF-κB报告实验1
为使分离出的抗小鼠OX40 Fcab快速、简单地测试OX40激动剂的活性，开发了一种小鼠NF-κB报告实验法。
最初遵循如实施例4.4中所述的产生人NF-κB报道基因测定类似方法，使用小鼠OX40序列进行。但是，遇到了类似的问题，导致NF-κB信号通路的组成性活化。
为了减少NF-κB信号传导途径的组成性活化，将小鼠OX40细胞外域与人CD40受体的细胞内域融合(Song等，2014)，且在如上所述的HEK.FRT.luc细胞系中表达。使用OX40特异性抗体通过流式细胞术确定OX40表面表达，以测试嵌合受体的存在。与表达全长小鼠OX40的细胞相比，嵌合的表达mOX40-hCD40受体的HEK.FRT.luc细胞(HEK.FRT.luc.mOX40hCD40细胞)显示出降低的NF-κB信号通路背景活化，且展示对OX40激动抗体的浓度依赖性反应。因此，选择该细胞系来测试初始选择后所鉴定出的抗小鼠OX40Fcab的OX40激动剂活性。该测定方案基本上如实施例4.4中所述，但是使用这些HEK.FRT.luc.mOX40hCD40细胞测试小鼠OX40结合Fcab，并使用以人IgG1形式的OX86作为阳性对照。
4.6小鼠NF-κB报告实验2
为了开发改良的小鼠OX40 NF-κB报告实验，采用用于人OX40 NF-κB报告实验的策略。如实施例4.4中所述，小鼠OX40细胞外结构域与人CD137受体的细胞内结构域融合，并在HEK.FRT.luc细胞系中表达。使用OX40特异性抗体通过流式细胞术确定OX40表面表达，以检测嵌合受体的存在。与在小鼠NF-κB报告实验法1中观察到的背景活化相比，表达嵌合mOX40-hCD137受体的HEK.FRT.luc细胞(HEK.FRT.luc.mOX40hCD137细胞)显示出降低的NF-κB信号通路背景活化，且展示对抗小鼠OX40激动剂抗体的浓度依赖性反应。因此，该细胞系可允许对抗小鼠OX40 Fcab进行改良的测试和分级，且用于对小鼠OX40激动剂活性进行亲和力成熟后所鉴定的抗小鼠OX40 Fcab进行测试和分级。使用这些细胞的测定方案基本上如实施例4.5中所述。
4.7抗人OX40 Fcab对人和食蟹猴OX40的结合亲和力
通过SPR测量抗人OX40 Fcabs(以OX40/EGFR mAb2形式)对人和食蟹猴OX40的亲和力。由于在抗原通过流通池上方时，mAb或mAb2分子的取向会影响结合动力学，因此试图通过在测量Fcab亲和力时，将mAb2的Fcab部分在远离Biacore芯片的结合表面定位，并在测量Fab的亲和力时，将mAb2的Fab部分远离Biacore芯片的结合表面定位。为实现此目的，使用了一种目标捕获方法以将mAb2分子根据需要进行定向。EGFR被用作捕获OX40/EGFR mAb2的抗原(参见表5)，该结构是使用抗人OX40 Fcabs和抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)(美国专利号6217866；用表5中的“Cx”指示)的可变区，与实施例4.1中描述的模拟mAb2相同方式构建。为了将抗OX40 Fcab的亲和力与抗OX40 mAb的亲和力进行比较，将结合EGFR的Fcab(专利公开号WO 2018/015448 A1)与抗OX40 mAb 11D4(EP2242771 B1)的Fab配对，且将EGFR用作捕获所得EGFR/OX40 mAb2的抗原。这使得Fcab和阳性对照mAb二者远离Biacore芯片表面，而朝向在Biacore芯片上方流动的OX40抗原定向。
按照BIAcore T200仪器的制造商说明，通过胺偶联(通用医疗，BR-1000-50)至5000RU的表面密度，将EGFR(安迪生物目录号344-ER)固定在S CM5系列芯片(通用医疗，BR-1005-30)上。通过以10μl/min的速度注入稀释于HBS-EP+缓冲液(GE目录号BR100669)中的mAb2的1μg/ml溶液持续40秒，将mAb2样品捕获至约150RU。然后将HBS-EP+缓冲液(GE目录号BR100669)中不同浓度的OX40抗原(自制未生物素标记的hOX40-mFc或未生物素标记的cOX40-mFc；见表2)以70μl/min在芯片上方流动3分钟，且随后使其解离6分钟。在各抗原浓度之后，通过以30μl/min的流速注入30mM氢氧化钠(NaOH)持续10秒，再生芯片。出于参考扣除目的，在最高浓度的抗原之前和最低浓度的抗原之后注入缓冲液HBS-EP+。
用1：1Langmuir模型拟合结合动力学，以生成每个样品的平衡结合常数(KD)。使用BiaEvaluation软件3.2版进行数据分析。结果显示在表5中。
表5：通过SPR测定对人和食蟹猴OX40的结合亲和力
Figure BDA0002974976140000571
Figure BDA0002974976140000581
观察到OX40 Fcab对人OX40具有一定的亲和力(见表5)。来自FS20-11谱系的Fcab与食蟹猴OX40的结合低于检测阈值，表明这些Fcab对食蟹猴OX40具有低亲和力，亦如在上文实施例4.2中所述的细胞结合实验中所观察到的。来自FS20-22和FS20-31谱系的抗人OX40 Fcab结合食蟹猴OX40的亲和力与结合人OX40的相当。
4.8抗小鼠OX40 Fcab对小鼠OX40的结合亲和力
使用与实施例4.7中所述相同的靶标捕获和EGFR固定化方法，但差别在通过以10μl/min的速度注入稀释于HBS-EP+缓冲液(GE目录号BR100669)中mAb2的5nM溶液持续1分钟，将mAb2样品捕获至约200RU，通过SPR测量FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab对小鼠OX40的亲和力。使用FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab(具有LALA突变)和抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)(专利US 6,217,866B1；由表6中的Cx指示)的可变区构建OX40/EGFR mAb2。随后使于HBS-EP+缓冲液(GE目录号BR100669)中不同浓度的OX40抗原(自制mOX40-mFc；详见表2)以70μl/min在芯片上方流动5分钟，随后使其解离10分钟。在各种抗原浓度之后，通过以30μl/min的流速注入30mM氢氧化钠(NaOH)持续10秒，再生芯片。出于参考扣除目的，在最高浓度的抗原之前和最低浓度的抗原之后注入缓冲液HBS-EP+。
用1：1Langmuir模型拟合结合动力学，以生成样品的平衡结合常数(KD)。使用BiaEvaluation软件3.2版进行数据分析。表6显示，抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91的亲和力约为0.7nM。
表6：通过SPR测定mAb2对小鼠OX40的结合亲和力
mAb<sup>2</sup> KD(nM)
FS20m-232-91AA/Cx 0.681
4.9抗人OX40抗体的特异性
以模拟mAb2形式测试抗人OX40 Fcab针对人OX40的特异性，测试Fcab对其他人类TNFR家族受体(CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR和CD137)的结合，在Biacore T200中通过SPR进行测试。使用胺偶联(胺偶联试剂盒，通用医疗，BR-1000-50)将人CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR、CD137受体(均获自安迪生物)在Biacore CM5芯片(通用医疗，目录号29149603)中，包被至大约1000RU。在HBS-EP+缓冲液(BR100669)中制备以1μM开始的模拟mAb2形式的抗人OX40Fcab(参见表7)的稀释液，且以30μl/min的速度注入，持续3分钟，且随后在缓冲液中解离4分钟。通过以30μl/min的速度注入pH 2.5的10mM甘氨酸，持续12s，再生芯片。将针对不同TNFR家族成员有特异性的抗体用作阳性对照，以验证Biacore芯片涂层。将数据进行二重参考减除且使用BIAevaluation 3.2软件分析。表7中列出的Fcab不结合至所测试的TNFR家族受体中的任一种，表明其对人OX40的特异性。
表7：通过SPR测试模拟mAb2形式的抗人OX40抗体的特异性。
测试的模拟mAb<sup>2</sup>
FS20-11-127AA/4420
FS20-11-131AA/4420
FS20-11-134AA/4420
FS20-22-38AA/4420
FS20-22-41AA/4420
FS20-22-47AA/4420
FS20-22-49AA/4420
FS20-22-85AA/4420
FS20-31-58AA/4420
FS20-31-66AA/4420
FS20-31-94AA/4420
FS20-31-102AA/4420
FS20-31-108AA/4420
FS20-31-115AA/4420
4.10抗小鼠OX40 Fcab的特异性
通过测试与其他小鼠TNFR家族受体(小鼠CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR和CD137受体)的结合，在Biacore T200仪器中通过SPR测量模拟(HEL D1.3 LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40Fcab(FS20m-232-91)的特异性。使用胺偶联(胺偶联试剂盒，通用医疗，BR-1000-50)以将小鼠CD40、TNFRI、TNFRII、NGFR、CD137受体(全部从安迪生物获得)在Biacore CM5芯片(通用医疗，货号29149603)上包被至大约1000RU。在HBS-EP+缓冲液(BR100669)中制备从1μM开始的模拟mAb2(FS20m-232-91AA/HEL D1.3)稀释液，并以30μl/min的速度注入，持续3分钟，且随后在缓冲液中解离6分钟。通过以30μl/min的速度注入pH 2.5的10mM甘氨酸，持续20s来再生芯片。将针对不同TNFR家族成员有特异性的抗体用作阳性对照，以验证Biacore芯片涂层。
将数据进行二重参考减除且使用BIAevaluation 3.2软件进行分析。模拟(HELD1.3 LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91不结合所测试的相关TNFR家族成员的任一种，证明了该Fcab对小鼠OX40的特异性。
实施例5至8–Fcab在体外和体内通过不同的交联方式诱导OX40活性的功能活性
在先前的实施例中，鉴定了可与人OX40或小鼠OX40结合的Fcab。随后在NF-κB检测中测试了这些模拟(4420LALA)mAb2形式的Fcab活化OX40簇聚和信号传导的能力。下列实施例显示了在通过其Fc区或通过Fab结合至另一个靶标进行交联时，模拟mAb2和mAb2形式的Fcab在体外和体内激活OX40的能力。由于Fcab能够导致包含多种Fab的mAb2形式的OX40簇聚和活化，因此它们有望用于治疗多种不同的疾病。
实施例5–模拟mAb2形式的抗OX40 Fcab在体外和体内活化OX40
活化的T细胞在其细胞表面表达OX40。三聚体OX40配体与OX40的结合导致受体的三聚。由于OX40配体在抗原呈递细胞的细胞表面上以簇的形式表达，因此OX40配体与OX40之间的相互作用导致OX40的簇化，这对于OX40信号转导和进一步的T细胞活化至关重要。活化OX40的抗体必须模拟OX40配体的簇聚活性。对于单特异性抗OX40抗体，Fcγ受体与抗体的Fc结构域结合并使其交联，从而导致OX40簇聚。
在交联剂存在下，在T细胞活化测定中测试了实施例4中述及的模拟(4420)LALA形式的抗人OX40和抗小鼠OX40 Fcab交联Fcab时活化在T细胞上表达的OX40的能力。还以模拟(HEL D1.3)mAb2形式(参见实施例4.1)测试了FS20m-232-91抗小鼠OX40Fcab抑制体内肿瘤生长的能力，通过在CT26同系小鼠肿瘤生长模型中活化表达OX40的肿瘤浸润淋巴细胞。
5.1使用模拟mAb2形式的抗人OX40 Fcab进行人T细胞活化测定
活化的人T细胞在其细胞表面表达人OX40。已知OX40的簇聚对于诱导受体信号传导和进一步的T细胞活化至关重要。在模拟(4420LALA)mAb2和mAb分子的存在下，使用T细胞活化试验评估OX40的簇聚和信号传导，详见下表8。通过测量IL-2的释放来检测T细胞活化。
5.1.1分离和激活人T细胞
为了分离T细胞，从白细胞耗竭锥(NHS血液和移植服务)中分离了外周血单核细胞(PBMC)，后者是血小板捐赠的副产品。简而言之，用PBS冲洗白细胞锥细胞(leucocytecone)内容物，并通过Ficoll梯度(GE生命科学目录号17144002)密度离心。通过离心和回收未穿过Ficoll梯度的细胞来分离PBMC。用PBS进一步洗涤PBMC，并根据制造商的说明通过添加10ml红细胞裂解缓冲液(e生物科学)裂解剩余的红细胞。根据制造商的说明，使用pan T细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术公司)从存在于洗脱液中的PBMC中分离T细胞。
通过涡旋重悬人T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠(生命技术11452D)。使用T细胞培养基(含有10％FBS(生命技术公司)、1x青霉素链霉素(生命技术公司)、丙酮酸钠(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco)的RPMI培养基(生命技术公司))，将磁珠清洗两次。
在T-25烧瓶(西格玛)中，所需数量的T细胞以1.0x 106细胞/ml的浓度在T细胞培养基中，以细胞对磁珠2：1的比例用洗脱过的人T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠刺激T细胞，并在37℃，5％CO2中孵育过夜以活化T细胞。从免疫磁珠洗脱活化的T细胞，并以2.0×106细胞/ml的浓度重悬于T细胞培养基中。将96孔平板底包被在PBS中稀释的2.5μg/ml抗人CD3抗体(安迪生物克隆UHCT1)，在37℃，5％CO2下孵育2h，然后用PBS洗涤两次。将活化的T细胞以2x105细胞/孔的浓度添加到平板中。2μM的模拟(4420LALA)mAb2分子，阳性对照11D4 mAb(在人IgG1骨架中并包含LALA突变)和阴性对照4420mAb(在人IgG1骨架中并包含LALA突变)的稀释液，在DPBS(Gibco)中制备，随后在T细胞培养基(30μl+270μl)中按1:10稀释，得到200nM稀释液。抗人CH2 mAb克隆MK1A6，通过Fc或FITC-葡聚糖(西格玛)交联阳性对照mAb，通过Fab结合以模拟(4420LALA)mAb2形式交联Fcab(参见表8)，与模拟mAb2或阳性对照mAb以1：1的摩尔比加入孔中。在96孔板中，制备与相关交联剂的(1)阳性对照或模拟mAb2或(2)阳性对照或模拟mAb2的系列稀释液。将100μl稀释的模拟mAb2/阳性对照mAb或稀释的模拟mAb2或阳性对照mAb和交联剂加入平板上活化的T细胞中。
在37℃，5％CO2下，将T细胞孵育72小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用人的IL-2ELISA试剂盒(e生物科学或安迪生物)分析。使用装有Gen5软件，BioTek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(Gen5软件，BioTek)。将人IL-2(hIL-2)的浓度与模拟mAb2阳性对照mAb的对数浓度作图，并使用对数(激动剂)对响应方程在GraphPad Prism中拟合所得曲线。表8显示了在存在或不存在模拟mAb2和测试的阳性对照mAb的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。图2显示了来自每个谱系(谱系FS20-11、FS20-22和FS20-31)的代表性克隆的T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。
表8：使用模拟(4420LALA)mAb2形式的抗人OX40 Fcab活化T细胞
Figure BDA0002974976140000611
Figure BDA0002974976140000621
*在未交联的情况下，这些模拟mAb2/对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
如表8所示，模拟(4420LALA)mAb2形式的抗人OX40 Fcab与Fab靶标(FITC-葡聚糖)交联时，显示出一系列活性。在抗CD3抗体存在的情况下，所有Fcab均具有共刺激T细胞并诱导人IL2产生的能力。
FS20-11谱系Fcab只能在交联时共同刺激T细胞，在没有交联的情况下没有活性。仅当交联时才具有这种活性，这意味着当施用于患者时，预期这些Fcab仅在Fab靶标或其他交联方式存在时才活化T细胞。与该谱系中的其他克隆相比，FS20-11-131具有较低的EC50。但是，由于FS20-11谱系的克隆与食蟹猴OX40的交叉反应性较低，因此在该物种的毒理学研究中，需要进一步提高对食蟹猴OX40的亲和力。
来自FS20-22和FS20-31谱系的Fcab在交联和不交联时均表现出活性。具体而言，来自这些谱系的Fcabs在不存在交联剂的情况下具有活性，该交联剂在交联时增加。由于这些Fcab与食蟹猴OX40(与结合人OX40相比)具有很高的交叉反应性，因此有可能在该物种中进行毒理学研究。在FS20-22谱系的克隆中，克隆FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-49和FS20-22-85交联时激动剂活性的EC50值最低，因此首选从该谱系中克隆。其中，克隆FS20-22-49在交联时的激动剂活性有最大的增加，并且在交联存在时的激动剂活性具有最低的EC50，因此是优选的克隆。在FS20-31谱系的克隆中，克隆FS20-31-108、FS20-31-108和FS20-31-115显示出最高的最大响应，同时还显示出低EC50值，因此具有良好的效力。
在没有交联的情况下，FS20-22和FS20-31谱系中的克隆显示出有限的T细胞活化这一事实预计不会带来安全风险，因为靶向OX40的分子在临床上未显示不利影响。相反，据认为在没有交联的情况下，这些克隆的有限的T细胞活化活性可能是有益的，因为这些克隆在没有交联的情况下，可能活化表达OX40的记忆T细胞，从而诱导它们增殖，并因此产生更大的T细胞群体，随后可以通过结合交联的抗OX40 Fcab驱动的OX40簇聚进一步活化。
5.2使用模拟mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab进行的小鼠T细胞活化测定
为了评估结合小鼠OX40的Fcab的活性，在以下表9中详述的模拟(4420LALA)mAb2和mAb分子存在下，使用T细胞活化测定法评估小鼠OX40的簇聚和信号传导。如在人类测定中一样，通过测量IL-2的释放来检测T细胞活化。
5.2.1分离和活化小鼠T细胞
为了分离T细胞，从4-8周龄的雌性Balb/C小鼠(Charles River)收集脾脏。对小鼠进行人道安乐死并通过解剖分离脾脏。通过将脾脏推入5ml塑料注射器内部，通过70μm细胞过滤器(Corning)，分离脾细胞。用1ml Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)(Gibco)将细胞过滤器洗涤10次，并将洗脱液收集在50ml试管中。根据制造商的说明，通过添加10ml红细胞裂解缓冲液(e生物科学)来裂解洗脱液中存在的红细胞。根据制造商的说明，使用pan T细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术公司)从存在于洗脱液中的脾细胞中分离T细胞。
通过涡旋重悬小鼠T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠(生命技术，11452D)。使用T细胞培养基(含有10％FBS(生命技术公司)、1x青霉素链霉素(生命技术公司)、丙酮酸钠(Gibco)、10mM Hepes(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco)的RPMI培养基(生命技术公司))，将磁珠清洗两次。
T细胞培养基中所需数量的T细胞的浓度为1.0x 106细胞/ml，以细胞对磁珠2：1的比例用洗脱过的小鼠T-活化剂CD3/CD28免疫磁珠在T-25烧瓶(西格玛)中刺激T细胞，并在37℃，5％CO2中孵育过夜以活化T细胞。
过夜孵育后，从免疫磁珠洗脱活化的T细胞，并以2.0x 106细胞/ml的浓度重新在T细胞培养基中悬浮。在37℃，5％CO2中，通过与在PBS中稀释的2.5μg/ml抗小鼠CD3抗体(Biolegend克隆145-2C11)孵育2小时，将96孔平底平板包被抗小鼠CD3抗体，随后用PBS洗脱两次。将活化的T细胞以2x 105细胞/孔的浓度添加到平板中。在DPBS(Gibco)中制备2μM的模拟物(4420LALA)mAb2和阳性对照抗小鼠OX40 OX86 mAb稀释液(在具有LALA突变的人IgG1主链中；SEQ ID NO:175和176)(详细信息参见表9)，然后在T细胞培养基(30μl+270μl)中进一步按1:10稀释以获得200nM稀释液。抗人CH2 mAb克隆MK1A6，用于通过OX86阳性对照mAb的Fc进行交联，以及FITC-葡聚糖(西格玛)，用于通过模拟(4420LALA)mAb2形式中的Fcab的Fab结合进行交联，将模拟mAb2或阳性对照mAb以1：1的摩尔比加入孔中。在96孔板中，制备与相关交联剂的(1)阳性对照或模拟mAb2或(2)阳性对照或模拟mAb2的系列稀释液。将100μl的稀释模拟物(4420LALA)mAb2/对照mAb或模拟物(4420LALA)mAb2或阳性对照mAb与交联抗体的混合物添加到平板上的活化T细胞中。
在37℃，5％CO2下，将T细胞孵育72小时。收集上清液，并按照制造商的说明使用小鼠IL-2ELISA试剂盒(e生物科学或安迪生物)分析。使用装有Gen5软件，BioTek的酶标仪在450nm下读板。从450nm的吸光度值中减去630nm的吸光度值(校正)。基于四参数对数曲线拟合，计算细胞因子浓度的标准曲线(Gen5软件，BioTek)。将小鼠IL-2(mIL-2)的浓度与模拟mAb2阳性对照mAb的对数浓度作图，并使用对数(激动剂)对响应方程在GraphPad Prism中拟合所得曲线。表9显示了在存在或不存在测试的模拟mAb2和阳性对照mAb的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。
表9：使用模拟(4420LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab活化T细胞
Figure BDA0002974976140000641
*在未交联的情况下，这些模拟mAb2/对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
如表9所示，在T细胞活化测定中，当通过与Fab靶标(FITC-葡聚糖)交联时，模拟(4420LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab的活性与在人IgG1骨架中，并通过抗人CH2 mAb克隆MK1A6交联的阳性对照抗小鼠OX40 mAb OX86活性相当。对于模拟(4420LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab或抗小鼠OX40 mAb阳性对照抗体，在没有交联的情况下未观察到T细胞活化这些结果表明，抗小鼠OX40 Fcab具有与阳性对照抗小鼠OX40 mAb相似的激动活性，并且表明Fcab形式在交联时可以介导OX40的簇聚和激活。抗小鼠OX40 Fcab的活性类似于抗人OX40 Fcab的FS20-11谱系的活性，也观察到只有交联时才具有活性。Fcab的FS20-22和FS20-31谱系显示，在不存在交联的情况下具有激动剂活性，在存在交联的情况下活性进一步增强。如上所述，在没有交联的情况下，这些Fcab的背景激动剂活性有望使这些Fcab在临床上比没有这种背景激动剂活性的Fcabs更强效。因此，来自FS20-22和FS20-31谱系的抗人OX40 Fcab的临床活性可能大于使用抗小鼠OX40 Fcab时观察到的体内活性。
5.3模拟mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab的体内抗肿瘤功效
使用CT26同系肿瘤模型检测模拟mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91在体内的抗肿瘤活性。先前已证明CT26同系肿瘤模型对OX40激动剂抗体敏感(Sadun等人，2008)，从CT26肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)有望表达OX40。
如使用T细胞活化测定法所示，抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91和抗人OX40 Fcab是T细胞活化的有效激动剂。对于模拟(4420LALA)mAb2形式的抗小鼠OX40 Fcab，未交联时未观察到T细胞活化(请参见实施例5.2)。由于FS20-11谱系仅在交联时具有T细胞活性，类似FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab，因此使用FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab进行的体内研究结果有望达到该FS20-11谱系的抗人OX40 Fcab在人类患者中的预期临床疗效(参见实施例5.1)。来自FS20-22和FS20-31谱系的抗人OX40 Fcab在没有交联的情况下显示了OX40激动剂活性(参见实施例5.1)。如实施例5.2.1中所解释的，预期来自FS20-22和FS20-31谱系的Fcab将比在没有交联的情况下的不具有OX40激动剂活性的Fcab显示出更高的临床功效。因此，来自FS20-22和FS20-31谱系的抗人OX40 Fcab的临床疗效可能大于使用FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab观察到的体内结果。
将具有或不具有LALA突变的模拟(HEL D1.3)mAb2形式的FS20m-232-91抗小鼠OX40 Fcab的抑制肿瘤生长的能力与阳性对照抗小鼠OX40 mAb(在人IgG1骨架的OX86)和阴性对照抗FITC抗体(在人IgG1骨架中的4420)相比较。
在研究开始之前，让8-10周龄的BALB/c雌性小鼠(Charles River)(每只重约20g)适应1周。将所有动物插入微芯片，并赋予唯一的标识。每个组有12只小鼠。CT26结肠癌细胞系(ATCC，CRL-2638)首先扩增、储备，然后使用IMPACT I方案通过IDEXX生物研究对病原体进行预筛选，结果表明不含病原体。将CT26细胞(约3-5x106)从-150℃解冻，并添加到含10％FCS(Gibco，10270-106)的20ml DMEM(Gibco，61965-026)的T175组织培养瓶中。使用异氟烷(Abbott Laboratories)将小鼠麻醉，在每只动物的左侧胁腹皮下注射1x 106细胞，。接种肿瘤细胞后第10天，监测小鼠的健康和肿瘤生长状况，将其分类并随机分为研究组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
模拟(HEL D1.3)mAb2分子和对照mAb通过SEC-HPLC进行分析，并在注射前24小时内检查杂质。制备在PBS中的终浓度为0.1mg/ml的模拟(HEL D1.3)mAb2和mAb，并在肿瘤接种后的第10、12和14天，以200μl/小鼠的体积通过腹膜内(IP)注射给药，对于20g小鼠的终剂量为1mg/ml。每周在麻醉下以盲选法对动物进行3次健康检查，在此期间对肿瘤进行精确测量。通过卡尺进行肿瘤体积测量，以确定肿瘤的最长轴和最短轴。以下公式用于计算肿瘤体积：
Lx(S2)/2
(其中L＝最长轴；S＝最短轴)
当认为肿瘤负荷接近极限时，试验在第22天停止，并且所有小鼠被人道处死。结果如图3所示。使用GraphPad Prism软件包中的双尾学生t检验对最终肿瘤体积进行统计学分析。
在抑制肿瘤生长方面，阳性对照抗小鼠OX40 mAb(G1/OX86)和阴性对照抗FITC对照抗体(正常生长)之间存在统计学上的显著差异。模拟(HEL D1.3)mAb2与具有LALA突变的模拟(HEL D1.3)mAb2在抑制肿瘤生长方面也有统计学上的显著差异。
CT26肿瘤模型是一种侵略性、快速生长的肿瘤模型，小鼠固有地易于发生肠道转移，因此治疗窗口非常有限。在此肿瘤模型中肿瘤浸润T细胞上表达的OX40的簇聚和激活，通过FcγR介导的模拟mAb2形式的FS20m-232-91Fcab和G1/OX86阳性对照(两者均不包含LALA突变)的交联驱动，从而抑制了肿瘤的生长。然而，如模拟mAb2形式的含LALA突变的FS20m-232-91AA Fcab所见，当很少或没有FcγR介导的Fcab交联，因此没有OX40簇聚和活化时，未观察到肿瘤生长的抑制。因此可以由此得出结论，抗小鼠OX40 Fcab仅在交联时才具有导致肿瘤生长减少的活性。
基于这些结果，预期抗人OX40 Fcab在交联时将类似地能够抑制人患者中包含表达OX40的肿瘤浸润T细胞的肿瘤生长。
实施例6-通过细胞表面受体结合的mAb2交联
活化的T细胞在其细胞表面表达OX40。三聚体OX40配体与OX40的结合导致受体的三聚。由于OX40配体在抗原呈递细胞的细胞表面上以簇的形式表达，因此OX40配体与OX40之间的相互作用导致OX40的簇化，这对于OX40信号转导和进一步的T细胞活化至关重要。活化OX40的抗体必须模拟OX40配体的簇聚活性。对于单特异性抗OX40抗体，Fcγ受体与抗体的Fc结构域结合并使其交联，从而导致OX40簇聚。双特异性抗体可以通过其第二抗原结合位点与第二细胞表面表达的受体结合，从而导致抗体交联和OX40簇聚。由双特异性抗体结合的第二细胞表面表达的受体可以是肿瘤相关抗原(TAA)。双特异性抗体在肿瘤部位交联具有优势，导致OX40簇聚和肿瘤部位的T细胞活化。因此，双特异性抗体的使用有可能导致免疫系统在肿瘤局部的活化，从而消除或控制肿瘤。
因此，如下所述，将在其表面表达TAA的肿瘤细胞用于T细胞活化分析中，以评估包含本发明抗OX40 Fcab和在可变区中的TAA抗原结合位点的mAb2结合TAA是否会导致mAb2交联，因此诱导OX40的簇聚和信号传导。
6.1使用包含抗人OX40 Fcab以及抗EGFR、抗EphA2、抗CEACAM5或抗EpCAM Fab的mAb2进行的人T细胞活化测定
如实施例4.1中所述，制备具有LALA突变的下表10和11中列出的抗体分子，用于在T细胞活化测定中进行测试。使用抗FITC抗体4420(SEQ ID NO:167、168和156)、抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab)(美国专利号6217866；以‘Cx’表示)、EphA2抗体E2A(WO 2004/014292 A2)、EpCAM抗体MOC31(美国专利号8637017)、OX40抗体11D4(EP 2 242 771 B1)或抗CEACAM5抗体CEA(US 8,771,690 B2，克隆hMN15)构建抗体分子，与实施例4.1中所述的构建模拟mAb2的方法相同。在这些测定中，肿瘤细胞充当了mAb2的交联剂，该抗体包含抗人OX40 Fcab和对TAA(EGFR、EphA2、CEACAM5或EpCAM在表10中的抗人OX40 Fcab FS20-22-49AA的情况下，以及EphA2或CEACAM5在表11中的抗人OX40 Fcab FS20-11-131AA的情况下)特异的可变区，通过可变区结合位点结合TAA。通过IL-2的释放来确定T细胞的活化。
表10.已检测的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC n/a hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/11D4 OX40 n/a hIgG1 无 抗hCH2
FS20-22-49AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-22-49AA/Cx EGFR OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
FS20-22-49AA/E2A EphA2 OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
FS20-22-49AA/CEA CEACAM5 OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
FS20-22-49AA/MOC31 EpCAM OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
表11.已检测的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1AA/4420 FITC n/a hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/11D4 OX40 n/a hIgG1 无 抗hCH2
FS20-11-131AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 无
FS20-11-131AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-11-131AA/E2A EphA2 OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
FS20-11-131AA/CEA CEACAM5 OX40 hIgG1 有 HPAC细胞
如上文实施例5.1.1中所述分离并活化T细胞。
将在其细胞表面表达EGFR、EpCAM、EphrinA2和CEACAM5的HPAC细胞(ATCC，CRL-2119)，维持在含10％FBS(生命技术)的DMEM培养基(生命技术)中。将HPAC细胞在T细胞培养基中洗涤一次，并在需要时以2.5x 104细胞/孔的浓度添加到平板中。
在DPBS(Gibco)中制备2μM各种测试mAb/mAb2的稀释液(有关详细信息，请参见表10和表11)，然后在T细胞培养基(30μl+270μl)中按1:10的比例稀释以获得200nM的稀释液。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6或FITC-葡聚糖(西格玛)；参见表10和11)以1：1的摩尔比与mAb/mAb2加入到需要测试的孔中。在96孔板中，制备测试mAb/mAb2的系列稀释液，并将100μl稀释的mAb/mAb2混合物添加至板上的活化T细胞和HPAC细胞中。
如实施例5.1.1所述孵育T细胞并收集上清液。读取板，绘制人IL-2(hIL-2)的浓度对测试mAb/mAb2的对数浓度作图，并使用对数(激动剂)对响应方程式拟合得到的曲线，如实施例5.1.1中所述。
表12显示了在存在或不存在通过交联剂或HPAC细胞交联的情况下，表10中列出的mAbs/mAb2对T细胞的活化作用(EC50值和最大IL-2释放)。图4显示用于T细胞活化测定的IL-2释放图。
表12：HPAC肿瘤细胞存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000671
*在没有交联的情况下，该对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
图4显示，当OX40与交联的抗OX40 mAb/mAb2结合时，T细胞活化增加。如所预期的，交联的抗FITC抗体G1AA/4420未观察到T细胞活化，其用作阴性对照。当抗人CH2抗体交联时，靶向OX40的mAb G1/11D4在HPAC细胞存在下诱导T细胞活化。如前所见，模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在没有交联的情况下具有激动活性，并且在交联剂FITC-葡聚糖存在下，其结合至模拟mAb2的Fab臂时，该激动活性得到增强。当将靶向OX40的Fcab与抗TAA Fab(EGFR为西妥昔单抗，EphrinA2为E2A，EpCAM为MOC31和CEACAM5为CEA)配对时，与模拟mAb2形式的Fcab相比，所得mAb2的激动活性增加了，表明TAA Fab与HPAC细胞上细胞表面表达的TAA的结合导致mAb2交联，因此导致OX40簇聚和激活。
表13显示了在存在或不存在通过交联剂或HPAC细胞交联的情况下，使用表11中列出的mAbs/mAb2进行的T细胞活化(EC50值和最大IL-2释放)。图5显示用于T细胞活化测定的IL-2释放图。
表13：HPAC肿瘤细胞存在下的T细胞活化测定
Figure BDA0002974976140000681
*在没有交联的情况下，该对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
图5中绘制的数据显示，当OX40被交联的抗OX40 mAb/mAb2结合时，T细胞活化增加。如所预期的，用交联的抗FITC抗体G1/4420未观察到T细胞活化，其用作阴性对照。当抗人CH2抗体交联时，靶向OX40的mAb抗体G1/11D4在HPAC细胞存在下诱导T细胞活化。如前所见，模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab FS20-11-131AA/4420不具有激动活性，并且仅在存在交联剂FITC-葡聚糖的情况下表现出激动活性，其与模拟mAb2的Fab臂结合。当将靶向OX40的Fcab与抗TAA Fab配对(EphrinA2为E2A或CEACAM5为CEA)时，与模拟mAb2形式的Fcab在存在表达TAA的HPAC细胞的情况下相比，所得mAb2的激动活性增加，表明TAA Fab与HPAC细胞的细胞表面表达的TAA结合导致mAb2交联，从而导致OX40簇聚和激活。
用抗OX40/抗EGFR、抗OX40/抗CEACAM5、抗OX40/抗EphA2或抗OX40/抗EpCAM mAb2抗体观察到的T细胞活化表明，超过一种以上类型的细胞表面受体可以与抗OX40抗体配对。
6.2使用包含抗小鼠OX40 Fcab和抗EphA2 Fab的mAb2进行的小鼠T细胞活化测定
在存在下表14中列出的测试mAb/mAb2的情况下，该T细胞活化测定法用于评估OX40的簇聚和信号传导。如实施例4.1中所述，制备具有LALA突变的mAb2。分析中使用的肿瘤细胞通过Fab与EphA2的结合，充当靶向TAA EphA2的阳性对照mAb和mAb2的交联剂。
表14：已测试的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> 分子类型 Fab靶标 Fab克隆 Fcab靶标
G1/4420 单抗 FITC 4420 n/a
FS20m-232-91AA/4420 mAb<sup>2</sup> FITC 4420 mOX40
G1/E2A 单抗 EphA2 E2A n/a
FS20m-232-91AA/E2A mAb<sup>2</sup> EphA2 E2A mOX40
G1/OX86 单抗 mOX40 OX86 n/a
如实施例5.2.1中所述分离并活化小鼠T细胞，并以与实施例6.1中所述的人T细胞活化测定基本相同的方案使用HPAC细胞，但通过如上所述和以下所述的不同交联剂和对照抗体，并评估IL-2的产生。
将交联剂(抗人Fc(a-hFc)，杰克逊免疫研究；或FITC-葡聚糖，西格玛)以1：1摩尔比添加到孔中，并在必要时使用测试mAb/mAb2。在96孔板中，制备了mAb/mAb2或mAb/mAb2和交联抗体混合物的六份五倍系列稀释液(60μl+240μlT细胞培养基)。将100μl稀释的mAb/mAb2或mAb/mAb2和交联抗体混合物添加到板上的活化T细胞中。
表15显示了在存在或没有交联剂或HPAC细胞发生交联的情况下，表14中列出的mAb/mAb2对T细胞的活化作用(EC50值和最大IL-2释放)。图6显示了用于T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。
表15：HPAC肿瘤细胞存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000691
Figure BDA0002974976140000701
*这些mAb/mAb2在T细胞活化试验中未显示任何活性。
图6显示了在各种mAbs/mAb2存在下，含有表达EphA2的HPAC细胞的T细胞活化测定的IL-2释放的代表性图。在此测定法中，以递增浓度测试了六种不同的mAb/mAb2或其组合，并根据其人IgG同种型/Fab克隆或合适的Fcab/Fab克隆名称(G1/4420、G1/E2A、G1/OX86、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420+G1/E2A和FS20m-232-91AA/E2A)进行标记。图6A中显示的结果表明，在存在表达EphA2的HPAC细胞的情况下，FS20m-232-91AA/E2AmAb2抗体可增强T细胞的活化。这表明靶向OX40的抗体需要交联来增加T细胞活化，并且FS20m-232-91AA/E2A mAb2抗体是唯一可以通过存在HPAC(EphA2+)细胞而交联的分子，并且不需要任何其他非生理交联剂。图6B显示，当靶向OX40且抗OX40 mAbs/mAb2交联时，T细胞的活化增加。这些结果表明，靶向OX40的mAb/mAb2需要交联以增加T细胞活化。
在表达EphA2的HPAC细胞存在下，用抗小鼠OX40/抗EphA2 mAb2(FS20m-232-91AA/E2A)观察到T细胞活化表明，该受体被具有EphA2和OX40的结合位点的mAb2靶向时，也可以介导OX40的交联。
6.3抗mOX40/抗EphA2 mAb2抑制体内肿瘤生长
CT26同系肿瘤模型用于本实验，因为CT26细胞表达EphA2，而从CT26肿瘤中分离的TIL包括表达OX40的T细胞。测试了实施例6.2中描述的抗mOX40/抗EphA2mAb2抗体(FS20m-232-91AA/E2A)在CT26同基因小鼠肿瘤生长模型中的体内活性。
将抗mOX40/抗EphA2 mAb2抑制肿瘤生长的能力与模拟mAb2形式(FS20m-232-91AA/4420)中的抗OX40 Fcab的能力进行了比较，模拟mAb2形式(FS20m-232-91AA/4420)的抗OX40 Fcab和抗EphA2 mAb(G1/E2A)和抗FITC mAb(G1/4420)的组合为对照。
向BALB/c雌性小鼠注射CT26细胞，监测其健康状况和肿瘤生长，按照实施例5所述将其分类并随机分为实验组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
对mAb2/mAb进行分析，检查杂质，制备，并如实施例5所述施用于小鼠。如实施例5中所述，对动物进行健康检查，进行肿瘤测量并计算肿瘤体积。
当认为肿瘤负荷接近极限时，试验在第20天停止，并且所有小鼠被人道处死。结果如图7所示。使用GraphPad Prism软件包中的双尾学生t检验对最终肿瘤体积进行统计学分析。
在抑制肿瘤生长方面，抗OX40/抗EphA2 mAb2(FS20m-232-91AA/E2A)和抗FITCmAb(G1/4420)对照(正常生长)之间存在统计上的显著差异。FS20m-232-91AA/4420和G1/E2A或FS20m-232-91AA/4420和G1/4420对照组的组合均未观察到这种统计学上的显著差异。
出乎意料的是，与IgG1对照(G1/4420)组相比，靶向OX40和EphA2的抗体组合并未显著抑制肿瘤生长。但是，与IgG1对照相比，用抗mOX40/抗EphA2 mAb2(FS20m-232-91AA/E2A)治疗的组确实显示出显著的生长抑制。该试验表明，与观察到的体外结果类似，靶向肿瘤细胞上表达的EphA2的mAb2和表达OX40的肿瘤浸润性T细胞上的OX40交联导致T细胞活化和在对照上观察到随后肿瘤生长对照。
图7显示了通过G1/4420、FS20m-232-91AA/4420、FS20m-232-91AA/4420+G1/E2A和FS20m-232-91AA/E2A治疗下Balb/c小鼠分组中CT26同系模型的肿瘤生长曲线。将平均肿瘤体积加上或减去标准误差平均值作图，并使用两尾t检验比较不同组的最后一天的肿瘤体积。与用对照抗体(G1/4420)治疗的组相比，用抗mOX40/抗EphA2 mAb2抗体(FS20m-232-91AA/E2A)治疗的组显示出统计学上显著的肿瘤体积减小。该结果表明，与FS20m-232-91AA/4420和G1/E2A抗体的组合相比，抗mOX40/抗EphA2 mAb2抗体在体内对表达EphA2的肿瘤具有更好的抗肿瘤功效，表明通过抗mOX40/抗EphA2 mAb2介导的OX40和EphA2的双特异性结合，OX40的体内交联可有效控制肿瘤的生长。
实施例7-mAb2通过与可溶性因子结合而交联
血管内皮生长因子(VEGF)是一种可溶性同二聚体分子，在响应缺氧时表达，并与内皮细胞上的受体结合，导致新血管的形成，这一过程称为血管生成。肿瘤微环境(TME)缺氧且VEGF水平升高，从而为肿瘤细胞提供了足够的营养以使其生长。使用靶向VEGF的单克隆抗体是抗肿瘤治疗的既定形式。由于细胞表面表达的TAA能够介导OX40靶向mAb2的交联，因此还测试了OX40和使用可溶性VEGF的VEGF靶向mAb2的交联。
7.1使用包含抗人OX40 Fcab和抗VEGF Fab的mAb2进行人T细胞活化测定
在存在或不存在另外的VEGF的情况下，T细胞活化测定被用于评估在下表16中列出的抗体的存在下OX40的簇聚和信号传导。如实施例4.1中所述制备具有LALA突变的OX40/VEGF mAb2和OX40/FITC模拟mAb2。在此测定中，VEGF充当OX40/VEGF mAb2的交联剂，它是使用OX40靶向Fcab FS20-22-49AA和抗VEGF抗体贝伐单抗(EP1325932B9克隆A4.6.1；表16和表17中的“Bev”表示)的可变区构建的。
表16.已测试的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC 无 hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/11D4 OX40 无 hIgG1 无 抗hCH2
FS20-22-49AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-22-49AA/Bev VEGF OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-49AA/Bev VEGF OX40 hIgG1 有 VEGF
如上文实施例5.1.1中所述分离并活化T细胞，并使用上述阳性对照抗体和mAb2和交联剂(例如可溶性VEGF而不是HPAC细胞)，按照与实施例6.1中所述的人T细胞活化测定基本相同的方案进行操作。如前所述确定hIL-2的产生。将交联剂(抗人CH2mAb克隆MK1A6，FITCdex(西格玛)或VEGF(Peprotech，目录号100-20)；参见表16)与测试mAb/mAb2以1：1摩尔比加入有需要的孔中。
表17显示在存在或不存在与交联剂交联的情况下，由表16中列出的mAb/mAb2的T细胞活化(EC50值和最大IL-2释放)。图8显示了用于T细胞活化测定的IL-2释放图。
表17：VEGF存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000721
*在没有交联的情况下，该对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
图8显示，当靶向OX40且抗OX40 mAb/mAb2交联时，T细胞的活化增加。如所预期的，用交联的抗FITC抗体G1/4420未观察到T细胞活化。当与抗人CH2抗体交联时，靶向OX40的mAb G1/11D4诱导T细胞活化。模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab，FS20-22-49AA/4420，在与模拟mAb2的Fab臂结合的交联剂FITC-葡聚糖的存在下具有激动活性。当将靶向OX40的Fcab与抗VEGF Fab贝伐单抗配对时，mAb2抗体在不存在交联的情况下具有一定的激动活性，这很可能是在没有抗OX40 Fcab FS20-22-49观察到的交联情况下的激动剂活性的产物。当将VEGF添加到OX40/贝伐单抗mAb2抗体中时，激动剂活性增加，如EC50降低约100倍所表明的那样，表明抗VEGF Fab在VEGF存在下能够交联mAb2。
用抗hOX40/抗VEGF mAb2观察到的T细胞活化证明可溶因子可用作交联剂。
7.2使用包含抗小鼠OX40 Fcab和抗VEGF Fab的mAb2进行小鼠T细胞活化测定
在下表18中列出的mAb/mAb2存在下，使用T细胞活化测定法评估OX40的簇聚和信号传导。将抗小鼠OX40 Fcab FS20m-232-91与抗VEGF mAb R84的Fab区配对(专利公开号US2009/0175791A1)，并且如实施例4.1中所述制备所有具有LALA突变的mAb2。在该测定中，VEGF充当了与小鼠OX40和VEGF结合的mAb2的交联剂。
表18：已测试的mAb和mAb2
Figure BDA0002974976140000722
Figure BDA0002974976140000731
如实施例5.2.1所述分离并活化小鼠T细胞，并以与实施例7.1基本相同的方案但使用上述的阳性对照抗体和mAb2以及如下所述的交联剂。如前所述确定mIL-2的产生。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6，FITCdex，(西格玛)或VEGF(Peprotech，目录号100-20)；见表18)与受试抗体以1：1摩尔比添加至孔中有需要的地方。
表19显示了在存在测试的mAb2和mAb的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。图9显示了用于T细胞活化测定的IL2释放的代表性图。
表19：VEGF存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000732
*在没有交联的情况下，该对照mAb在T细胞活化测定中未显示任何活性。
图9显示，在存在VEGF的情况下，当mAb2靶向OX40以及VEGF可溶性因子存在时，T细胞活化增加，然而当其他靶向OX40的mAb2存在但未交联时，T细胞活化不增加。这表明mAb2通过与OX40和VEGF结合而交联。图9显示，在非生理交联剂(抗Fc抗体或FITC-葡聚糖)存在下，靶向OX40的mAb/mAb2活化T细胞。如预期的那样，抗VEGF和抗FITC对照抗体在交联剂存在下不诱导T细胞活化。当与抗Fc抗体(G1/OX86交联剂)交联时，抗小鼠OX40抗体诱导了一些T细胞活化(请参阅表19)。当通过FITC-葡聚糖(FS20m-232-91AA/4420Xlink)交联时，抗OX40Fcab与mAb2活化的T细胞中的抗FITC Fab配对时，具有比OX40抗体G1/OX86更低的EC50和更高的最大响应。相同的抗OX40 Fcab在mAb2(FS20m-232-91AA/R84)中与抗VEGF Fab配对时，在没有其他交联剂的情况下活化T细胞，这可能是由于活化的T细胞产生了VEGF。额外的VEGF通过抗OX40/抗VEGF mAb2(FS20m-232-91AA/R84)增加了T细胞活化，与抗OX40/抗VEGFmAb2抗体在没有额外的VEGF相比，观测到较低水平的EC50和相当的最大响应。
在VEGF存在下，用抗mOX40/抗VEGF mAb2观察到的T细胞活化表明，可溶性因子也可以介导OX40的交联，例如当被结合VEGF和OX40的mAb2靶向时。
7.3抗mOX40/抗VEGF mAb2抑制体内肿瘤生长
测试了实施例7.2中描述的抗mOX40/抗VEGF mAb2抗体(FS20m-232-91AA/R84)在CT26同系小鼠肿瘤生长模型中的体内活性。
该实验使用了CT26同系肿瘤模型，因为CT26肿瘤已被描述具有升高的VEGF浓度(Voron等人，2015)，并且从CT26肿瘤分离的TIL包括表达OX40的T细胞。
将抗mOX40/抗VEGF mAb2抑制肿瘤生长的能力与mAb G1/4420，FS20m-232-91AA/4420和mAb G1/R84的组合以及以作为对照的mAb G1/R84进行了比较。
向BALB/c雌性小鼠注射CT26细胞，监测其健康状况和肿瘤生长，按照实施例5所述将其分类并随机分为实验组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
对mAb2/mAb进行分析，检查杂质，制备，并如实施例5所述施用于小鼠。如实施例5中所述，对动物进行健康检查，进行肿瘤测量并计算肿瘤体积。当认为肿瘤负荷接近极限时，试验在第24天停止，并且所有小鼠被人道处死。结果如图10所示。使用GraphPad Prism软件包中的双尾学生t检验对最终肿瘤体积进行统计学分析。
在抑制肿瘤生长方面，抗mOX40/抗VEGF mAb2(FS20m-232-91AA/R84)和抗FITCmAb G1/4420对照(正常生长)之间有统计上的显著差异。FS20m-232-91AA/4420和无FS20m-232-91AA/R84对照或抗VEGF mAb G1/R84对照与G1/4420对照的组合均未观察到这样的统计学显著差异。
CT26肿瘤模型是一种侵略性，快速生长的肿瘤模型。出乎意料的是，与IgG1对照(G1/4420)组相比，靶向OX40和VEGF的抗体组合并未显著抑制肿瘤生长。但是，与IgG1对照相比，用抗mOX40/VEGF mAb2(FS20m-232-91AA/R84)处理的分组确实显示出显著的生长抑制。该试验表明，与观察到的体外结果相似，OX40的交联通过mAb2靶向VEGF，其由肿瘤细胞或肿瘤微环境中或在肿瘤微环境过表达，并且在肿瘤浸润性T细胞中表达的OX40导致T细胞活化和随后的肿瘤生长控制高于对照所观察到的。
实施例8-mAb2通过与共表达的受体结合而交联
OX40在肿瘤浸润性T细胞上的表达可能伴随着其他受体的表达，这些受体是共刺激受体和免疫检查点受体。在含有mAb2的OX40-Fcab中，将这些共表达的受体用作Fab靶标，也可以使mAb2交联，从而导致OX40和Fab靶标聚簇，从而激活两个受体。为了测试该概念，进行了以下T细胞活化测定。
8.1使用包含与抗ICOS、抗CD27或抗GITR Fabs配对的抗人OX40 Fcab的mAb2进行人T细胞激活测定
在该测定中，利用人OX40和共刺激分子ICOS、CD27和GITR的共表达来确定下表20中列出的mAb/mAb2的交联。使用抗FITC抗体4420(SEQ ID NO:167、168和156)、抗OX40抗体11D4(EP 2242771 B1)、抗ICOS抗体ICOSj(美国2016/0304610 A1)、抗CD27抗体695(US2013/0243795 A1)或抗GITR抗体6C8(US 7,812,135 B2)的可变区制备具有LALA突变的mAb2，方法与实施例4.1中所述相同。
表20.已检测的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC 无 hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/11D4 OX40 无 hIgG1 有 抗hCH2
G1AA/ICOSj ICOS 无 hIgG1 无 抗hCH2
G1AA/695 CD27 无 hIgG1 有 抗hCH2
G1AA/6C8 GITR 无 hIgG1 有 抗hCH2
FS20-22-49AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-49AA/4420交联剂 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-22-49AA/ICOSj ICOS OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-49AA/695 CD27 OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-49AA/6C8 GITR OX40 hIgG1 有 无
如上文实施例5.1.1中所述分离并活化T细胞，并使用上文所述的阳性对照抗体和mAb2以及下文中的交联剂以与实施例6.1中所述的人T细胞活化测定基本相同的方案进行实验。如前所述确定人IL-2的产生。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6或FITC-葡聚糖(西格玛)；请参见表20)与测试mAb/mAb2以1：1摩尔比加入有需要的孔中。
表21显示了在存在或不存在与交联剂交联的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。图11显示用于T细胞活化测定的IL-2释放图。
表21：共表达受体存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000751
*在没有交联的情况下，这些对照mAb在T细胞活化试验中未显示任何活性
图11显示，当OX40被靶向并且抗OX40抗体被交联时，T细胞的活化增加。如预期的那样，交联的抗FITC抗体G1/4420或交联的抗ICOS、抗CD27或抗GITR抗体(分别为G1AA/ICOSj、G1AA/695或G1AA/6C8)未观察到T细胞活化。如前所述，靶向OX40的mAb G1/11D4与抗人CH2抗体交联时可诱导T细胞活化。如前所见，模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在没有交联的情况下具有激动活性，并且通过添加结合Fab臂的交联剂FITC-葡聚糖增强了该活性。当将靶向OX40的Fcab与抗ICOS、抗CD27或抗GITR Fab(分别为ICOSj，695或6C8)配对时，Fcab的激动活性增加，表明mAb2通过结合T细胞表面上的共表达受体被交联。
用抗OX40/抗ICOS、抗OX40/抗CD27和抗OX40/抗GITR mAb2抗体观察到的T细胞活化证明可以使用与人OX40共表达的受体在T细胞表面作为交联剂。
8.2使用包含抗人OX40 Fcab和抗PD1 Fab的mAb2进行人T细胞活化测定
在该测定中，利用人OX40和PD1的共表达来确定下表22中列出的mAb/mAb2的交联。使用抗FITC抗体4420(SEQ ID NO:167和156)、抗PD1抗体5C4(US 8,008,449B2)或抗OX40抗体11D4(EP 2242771B1)的可变区制备具有LALA突变的mAb2，以与实施例4.1中所述相同的方式。
表22：已测试的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC 无 hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1AA/5C4 PD1 无 hIgG1 有 抗hCH2
G1/11D4 OX40 无 hIgG1 无 抗hCH2
FS20-22-49AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-49AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-22-49AA/5C4 PD1 OX40 hIgG1 有 无
如上文实施例5.1.1中所述分离和活化T细胞，并以与实施例8.1中基本相同的方案使用T细胞，但是使用上述阳性对照抗体和mAb2以及如下所述的交联剂。如前所述确定hIL-2的产生。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6或FITCdex(西格玛)；请参见表22)与测试mAb/mAb2以1：1摩尔比加入有需要的孔中。
表23显示了在存在或不存在与交联剂交联的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。图12显示用于T细胞活化测定的IL-2释放图。
表23：靶向共表达受体的mAb2的T细胞活化测定
Figure BDA0002974976140000761
Figure BDA0002974976140000771
*在没有交联的情况下，这些对照mAb在T细胞活化试验中未显示任何活性
图12显示，当OX40被靶向并且抗OX40抗体被交联时，T细胞的活化增加。如所预期的，用交联的抗FITC抗体G1/4420或交联的抗PD1抗体G1AA/5C4未观察到T细胞活化。如前所述，靶向OX40的mAb G1/11D4与抗人CH2抗体交联时可诱导T细胞活化。如前所见，模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab FS20-22-49AA/4420在没有交联的情况下具有激动活性，并且通过添加结合mAb2的Fab臂的交联剂FITC-葡聚糖增强了该活性。当将靶向OX40的Fcab与抗PD1 Fab(5C4)配对时，Fcab的激动活性增加，表明mAb2通过结合T细胞表面共表达的受体PD1而发生交联。
用抗OX40/抗PD1 mAb2抗体观察到的T细胞活化表明，对受体特异的Fab结合位点可以用作交联剂，该受体与T细胞表面的人OX40共表达。
8.3使用包含抗人OX40 Fcab和抗LAG3 Fab的mAb2进行人T细胞活化测定
在该测定中，利用人OX40和LAG-3的共表达来确定下表24中列出的mAb/mAb2的交联。如实施例4.1中所述，制备具有LALA突变的mAb2。
表24.已检测的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC 无 hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/25F7 LAG3 无 hIgG1 有 抗hCH2
G1/11D4 OX40 无 hIgG1 无 抗hCH2
FS20-22-41AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 无
FS20-22-41AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20-22-41AA/25F7 LAG3 OX40 hIgG1 有 无
如上文实施例5.1.1中所述分离和活化T细胞，并以与实施例8.1中基本相同的方案使用T细胞，但是使用上述阳性对照抗体和mAb2以及如下所述的交联剂。如前所述确定hIL-2的产生。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6或FITC-葡聚糖(西格玛)；请参见表24)与测试mAb/mAb2以1：1摩尔比加入有需要的孔中。
表25：共表达受体LAG3存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000772
Figure BDA0002974976140000781
*在没有交联的情况下，这些对照mAb在T细胞活化试验中未显示任何活性
图13显示，当OX40被靶向并且抗OX40抗体被交联时，T细胞的活化增加。如所预期的，用交联的抗FITC抗体G1/4420或交联的抗LAG3抗体G1/25F7未观察到T细胞活化。如前所述，靶向OX40的mAb G1/11D4被抗人CH2抗体交联时诱导T细胞活化。如前所见，模拟mAb2(4420LALA)形式的靶向OX40的Fcab FS20-22-41AA/4420在没有交联的情况下具有激动活性，并且通过添加结合mAb2的Fab臂的交联剂FITC-葡聚糖增强了该活性。当将靶向OX40的Fcab与抗LAG3 Fab(25F7)配对时，Fcab的激动活性增加，表明mAb2通过与T细胞表面上共表达的受体结合而发生交联。
用抗OX40/抗LAG3 mAb2抗体观察到的T细胞活化表明，在T细胞表面与人OX40共表达的受体特异性Fab结合位点可以用作交联剂。
8.4使用包含抗小鼠OX40 Fcab和抗LAG3 Fab的mAb2进行小鼠T细胞激活测定
在该测定中，利用小鼠OX40和LAG-3受体的共表达来确定下表26中列出的双特异性抗体的交联。如实施例4.1中所述，制备具有LALA突变的mAb2。
表26.已测试的mAb和mAb2
mAb/mAb<sup>2</sup> Fab结合至 Fcab结合至 同型 LALA突变 交联剂
G1/4420 FITC 无 hIgG1 无 FITC-葡聚糖
G1/C9B7W LAG3 无 hIgG1 无 抗hCH2
G1/OX86 OX40 无 hIgG1 无 抗hCH2
FS20m-232-91AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 无
FS20m-232-91AA/4420 FITC OX40 hIgG1 有 FITC-葡聚糖
FS20m-232-91AA/C9B7W LAG3 OX40 hIgG1 有 无
如实施例5.2.1所述分离并活化小鼠T细胞，并以与实施例8.3基本相同的方案但使用上述的阳性对照抗体和mAb2以及如下所述的交联剂。如前所述确定mIL-2的产生。
将交联剂(抗人CH2 mAb克隆MK1A6或FITC-葡聚糖(西格玛)；请参见表26)与测试mAb/mAb2以1：1摩尔比加入有需要的孔中。
表27显示了在存在测试的mAb2和mAb的情况下，在T细胞活化测定中观察到的EC50值和IL-2释放的最大响应。图14显示了用于T细胞活化测定的IL2释放的代表性图。
表27：LAG3存在下的T细胞活化
Figure BDA0002974976140000782
Figure BDA0002974976140000791
*在没有交联的情况下，此对照单抗在T细胞活化试验中未显示任何活性
图14显示，当OX40被靶向并且抗OX40抗体被交联时，T细胞的活化增加。如所预期的，用交联的抗FITC抗体G1/4420或交联的抗LAG3抗体G1/C9B7W未观察到T细胞活化。如前所述，靶向OX40的mAb G1/OX86与抗人CH2抗体交联时可诱导T细胞活化。模拟mAb2(4420LALA)形式的OX40靶向Fcab，FS20m-232-91AA/4420，在没有交联的情况下没有激动作用，并且在添加结合Fab臂的交联剂FITC-葡聚糖交联时，其显示出强效的T细胞活化。当将靶向OX40的Fcab与抗LAG3 Fab(C9B7W)配对时，得到的mAb2在没有任何其他交联剂的情况下显示出T细胞活性。这表明mAb2通过与LAG3结合而被交联。
用抗OX40/抗LAG3 mAb2抗体观察到的T细胞活化表明，在T细胞表面与小鼠OX40共表达的受体可用作交联剂。
8.5能够在体外产生OX40激动作用的抗mOX40/抗LAG3 mAb2抑制体内肿瘤生长
由于从CT26肿瘤中分离的TIL包含表达OX40和LAG3受体的T细胞，因此本实验使用了CT26同系肿瘤模型。
测试了实施例8.4的抗mOX40/抗LAG3mAb2抗体(FS20m-232-91AA/C9B7W)在CT26同系小鼠肿瘤生长模型中的体内活性。将抗mOX40/抗LAG3 mAb2抑制肿瘤生长的能力与PBS对照进行了比较。
向BALB/c雌性小鼠注射CT26细胞，监测其健康状况和肿瘤生长，按照实施例5所述将其分类并随机分为实验组。此时将没有肿瘤的小鼠从研究中移除。
如实施例5中所述对mAb2/mAb进行分析，检查杂质，制备并施用于小鼠。如实施例5中所述，对动物进行健康检查，进行肿瘤测量并计算肿瘤体积。
当认为肿瘤负荷接近极限时，试验在第24天停止，并且所有小鼠被人道处死。结果如图15所示。使用GraphPad Prism软件包中的双尾学生t检验对最终肿瘤体积进行统计学分析。
在抑制肿瘤生长方面，抗mOX40/抗LAG3 mAb2与PBS对照(正常生长)之间存在统计学上的显著差异。
出人意料的是，与PBS对照相比，用抗mOX40/抗LAG3 mAb2处理的分组显示出显著的生长抑制。该试验表明，与观察到的体外结果相似，通过靶向与肿瘤浸润性T细胞中表达的OX40共表达的LAG3的mAb2，OX40交联导致T细胞活化和随后的肿瘤生长控制。
序列表
WT Fcab CH3结构域结构环的氨基酸序列
WT Fcab AB环–RDELTKNQ(SEQ ID NO:1)
WT Fcab CD环–SNGQPENNY(SEQ ID NO:2)
WT Fcab EF环–DKSRWQQGNV(SEQ ID NO:3)
WT Fcab CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
AB,CD和EF环处下划线
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
有LALA突变的Fcab CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
LALA突变处下划线
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
有LALA-PA突变的Fcab CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
LALA-PA突变处下划线
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK
有LALA突变的WT Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000801
无LALA突变WT Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000802
有LALA突变的Fcab FS20-11的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000803
的氨基酸序列Fcab FS20-11无LALA突变(SEQ ID NO:11)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000804
Fcab FS20-11-127 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-11-127第一序列–DDND(SEQ ID NO:12)
FS20-11-127第二序列–IPIGP(SEQ ID NO:13)
FS20-11-127第三序列–WRHYVEEHP(SEQ ID NO:14)
Fcab FS20-11-127 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWRHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-11-127 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAGGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
的氨基酸序列Fcab FS20-11-127有LALA突变的(SEQ ID NO:17)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000811
有LALA突变的Fcab FS20-11-127的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAGGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-11-127的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000812
无LALA突变的Fcab FS20-11-127的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAGGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-11-127/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWRHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-11-127/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWRHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-11-131 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-11-131第一序列–DDND(SEQ ID NO:12)
FS20-11-131第二序列–IPIGP(SEQ ID NO:13)
FS20-11-131第三序列–WKHYVDEHP(SEQ ID NO:23)
Fcab FS20-11-131 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKNRWWKHYVDEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-11-131 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAACAGATGGTGGAAGCATTATGTTGATGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-11-131的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000821
有LALA突变的Fcab FS20-11-131的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAACAGATGGTGGAAGCATTATGTTGATGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-11-131的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000822
无LALA突变的Fcab FS20-11-131的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAACAGATGGTGGAAGCATTATGTTGATGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-11-131/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKNRWWKHYVDEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-11-131/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKNRWWKHYVDEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-11-134 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-11-134第一序列–DDND(SEQ ID NO:12)
FS20-11-134第二序列–IPIGP(SEQ ID NO:13)
FS20-11-134第三序列–WKHYVEEHP(SEQ ID NO:32)
Fcab FS20-11-134 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWKHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-11-134 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:34)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAAGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-11-134的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000831
有LALA突变的Fcab FS20-11-134的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAAGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-11-134的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000832
无LALA突变的Fcab FS20-11-134的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAAGATGATAACGATGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAATCGGTCCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGATGGTGGAAGCATTATGTTGAGGAGCATCCGTTCTTGTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-11-134/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWKHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-11-134/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEDDNDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPIGPYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWWKHYVEEHPFLCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
有LALA突变的Fcab FS20-22的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000841
无LALA突变的Fcab FS20-22的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000842
Fcab FS20-22-38 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-22-38第一序列–YWDQE(SEQ ID NO:43)
FS20-22-38第二序列–AEKYQ(SEQ ID NO:44)
FS20-22-38第三序列–QYRWNPGDY(SEQ ID NO:45)
Fcab FS20-22-38 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGAEKYQYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-38 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:47)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGCAGAAAAATACCAGTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的Fcab FS20-22-38的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体)和LALA突变(加粗和斜体)
Figure BDA0002974976140000843
有LALA突变的Fcab FS20-22-38的核苷酸序列(SEQ ID NO:49)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGCAGAAAAATACCAGTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
无LALA突变的Fcab FS20-22-38的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000844
Figure BDA0002974976140000851
无LALA突变的Fcab FS20-22-38的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGCAGAAAAATACCAGTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的FS20-22-38/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGAEKYQYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-22-38/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGAEKYQYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-41 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-22-41第一序列–YWDQE(SEQ ID NO:43)
FS20-22-41第二序列–DEQFA(SEQ ID NO:54)
FS20-22-41第三序列–QYRWNPGDY(SEQ ID NO:45)
Fcab FS20-22-41 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-41 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:56)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGA
有LALA突变的Fcab FS20-22-41的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000852
有LALA突变的Fcab FS20-22-41的核苷酸序列(SEQ ID NO:58)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGA
无LALA突变的Fcab FS20-22-41的氨基酸序列(SEQ ID NO:59)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000861
无LALA突变的Fcab FS20-22-41的核苷酸序列(SEQ ID NO:60)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCCAGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGA
有LALA突变的FS20-22-41/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-22-41/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-47 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-22-47第一序列–YWDQE(SEQ ID NO:43)
FS20-22-47第二序列–DEQFA(SEQ ID NO:54)
FS20-22-47第三序列–QYRWSPGDY(SEQ ID NO:62)
Fcab FS20-22-47 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:63)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWSPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-47 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:64)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAGTCCGGGTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-22-47的氨基酸序列(SEQ ID NO:65)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000862
Figure BDA0002974976140000871
有LALA突变的Fcab FS20-22-47的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAGTCCGGGTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-22-47的氨基酸序列(SEQ ID NO:67)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000872
无LALA突变的Fcab FS20-22-47的核苷酸序列(SEQ ID NO:68)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAGTCCGGGTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-22-47/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:69)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWSPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-22-47/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:70)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWSPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-49 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-22-49第一序列–YWDQE(SEQ ID NO:43)
FS20-22-49第二序列–DEQFA(SEQ ID NO:54)
FS20-22-49第三序列–QYRWNPADY(SEQ ID NO:71)
Fcab FS20-22-49 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:72)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-49 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:73)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-22-49的氨基酸序列(SEQ ID NO:74)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000881
有LALA突变的Fcab FS20-22-49的核苷酸序列(SEQ ID NO:75)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-22-49的氨基酸序列(SEQ ID NO:76)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000882
无LALA突变的Fcab FS20-22-49的核苷酸序列(SEQ ID NO:77)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-22-49/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:78)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-22-49/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:79)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-85 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-22-85第一序列–YWDQE(SEQ ID NO:43)
FS20-22-85第二序列–DEQFA(SEQ ID NO:54)FS20-22-85第三序列–QYRWNPFDD(SEQ ID NO:80)
Fcab FS20-22-85 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:81)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTLDQYRWNPFDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-22-85 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:82)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCTTGGATCAGTATAGGTGGAATCCGTTTGATGATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-22-85的氨基酸序列(SEQ ID NO:83)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000891
有LALA突变的Fcab FS20-22-85的核苷酸序列(SEQ ID NO:84)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCTTGGATCAGTATAGGTGGAATCCGTTTGATGATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-22-85的氨基酸序列(SEQ ID NO:85)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000892
无LALA突变的Fcab FS20-22-85的核苷酸序列(SEQ ID NO:86)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCTTGGATCAGTATAGGTGGAATCCGTTTGATGATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-22-85/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:87)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTLDQYRWNPFDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-22-85/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTLDQYRWNPFDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
有LALA突变的Fcab FS20-31的氨基酸序列(SEQ ID NO:89)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000901
无LALA突变的Fcab FS20-31的氨基酸序列(SEQ ID NO:90)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000902
Fcab FS20-31-58 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-58第一序列–YYSGE(SEQ ID NO:91)
FS20-31-58第二序列–QPEND(SEQ ID NO:92)
FS20-31-58第三序列–PYWRWGSPRT(SEQ ID NO:93)
Fcab FS20-31-58 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:94)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGSPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-58 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:95)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATTGGAGGTGGGGTAGTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的Fcab FS20-31-58的氨基酸序列(SEQ ID NO:96)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000903
有LALA突变的Fcab FS20-31-58的核苷酸序列(SEQ ID NO:97)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATTGGAGGTGGGGTAGTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
无LALA突变的Fcab FS20-31-58的氨基酸序列(SEQ ID NO:98)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000904
无LALA突变的Fcab FS20-31-58的核苷酸序列(SEQ ID NO:99)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATTGGAGGTGGGGTAGTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的FS20-31-58/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:100)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGSPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-58/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:101)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGSPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-66 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-66第一序列–YYSGE(SEQ ID NO:91)
FS20-31-66第二序列–QPEND(SEQ ID NO:92)
FS20-31-66第三序列–PYWRWGVPRT(SEQ ID NO:102)
Fcab FS20-31-66 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:103)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-66 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:104)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的Fcab FS20-31-66的氨基酸序列(SEQ ID NO:105)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000911
有LALA突变的Fcab FS20-31-66的核苷酸序列(SEQ ID NO:106)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
无LALA突变的Fcab FS20-31-66的氨基酸序列(SEQ ID NO:107)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000912
Figure BDA0002974976140000921
无LALA突变的Fcab FS20-31-66的核苷酸序列(SEQ ID NO:108)ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的FS20-31-66/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:109)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-66/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:110)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-94 Fcab CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-94第一序列–WEHGE(SEQ ID NO:111)
FS20-31-94第二序列–IREHD(SEQ ID NO:112)
FS20-31-94第三序列–PYWRWGGPGT(SEQ ID NO:113)
Fcab FS20-31-94 Fcab CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:114)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEWEHGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIREHDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGGPGTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-94 Fcab CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:115)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGAACATGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCAGAGAACATGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCATATTGGAGGTGGGGCGGCCCAGGCACCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-31-94 Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO:116)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000922
有LALA突变的Fcab FS20-31-94 Fcab的核苷酸序列(SEQ ID NO:117)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGAACATGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCAGAGAACATGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCATATTGGAGGTGGGGCGGCCCAGGCACCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-31-94 Fcab的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000931
无LALA突变的Fcab FS20-31-94 Fcab的核苷酸序列(SEQ ID NO:119)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGAACATGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCAGAGAACATGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCATATTGGAGGTGGGGCGGCCCAGGCACCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-31-94/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:120)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWEHGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIREHDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGGPGTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-94/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:121)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWEHGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIREHDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGGPGTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-102 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-102第一序列–WASGE(SEQ ID NO:122)
FS20-31-102第二序列–QPEVD(SEQ ID NO:123)
FS20-31-102第三序列–PYWRWGVPRT(SEQ ID NO:102)
Fcab FS20-31-102 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:124)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEVDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-102 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:125)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCAGAAGTTGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的Fcab FS20-31-102的氨基酸序列(SEQ ID NO:126)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000932
Figure BDA0002974976140000942
有LALA突变的Fcab FS20-31-102的核苷酸序列(SEQ ID NO:127)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCAGAAGTTGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
无LALA突变的Fcab FS20-31-102的氨基酸序列(SEQ ID NO:128)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000941
无LALA突变的Fcab FS20-31-102的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCAGAAGTTGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGTTCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的FS20-31-102/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:130)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEVDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-102/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:131)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEVDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-108 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-108第一序列–WASGE(SEQ ID NO:122)
FS20-31-108第二序列–EKEID(SEQ ID NO:132)
FS20-31-108第三序列–PYWRWGAKRT(SEQ ID NO:133)
Fcab FS20-31-108 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:134)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEKEIDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-108 CH3结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:135)
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAAAAAGAAATCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的Fcab FS20-31-108的氨基酸序列(SEQ ID NO:136)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000951
有LALA突变的Fcab FS20-31-108的核苷酸序列(SEQ ID NO:137)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAAAAAGAAATCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
无LALA突变的Fcab FS20-31-108的氨基酸序列(SEQ ID NO:138)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000952
无LALA突变的Fcab FS20-31-108的核苷酸序列(SEQ ID NO:139)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAAAAAGAAATCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
有LALA突变的FS20-31-108/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:140)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEKEIDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-108/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:141)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEKEIDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20-31-115 CH3结构域结构环序列的氨基酸序列
FS20-31-115第一序列–WASGE(SEQ ID NO:122)
FS20-31-115第二序列–EQEFD(SEQ ID NO:142)
FS20-31-115第三序列–PYWRWGAKRT(SEQ ID NO:133)
Fcab FS20-31-115 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:143)
第一、第二和第三序列下划线
GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEQEFDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGFcab FS20-31-115 CH3结构域的核苷酸序列 (SEQ ID NO:144)
GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAACAGGAATTCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的Fcab FS20-31-115的氨基酸序列(SEQ ID NO:145)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗),CH3结构域(斜体),LALA突变(加粗和下划线)
Figure BDA0002974976140000961
有LALA突变的Fcab FS20-31-115的核苷酸序列(SEQ ID NO:146)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAACAGGAATTCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
无LALA突变的Fcab FS20-31-115的氨基酸序列(SEQ ID NO:147)
铰链区(下划线),CH2结构域(加粗)和CH3结构域(斜体)
Figure BDA0002974976140000962
无LALA突变的Fcab FS20-31-115的核苷酸序列(SEQ ID NO:148)
ACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATCTGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGAACAGGAATTCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGCTAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA
有LALA突变的FS20-31-115/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:149)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEQEFDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20-31-115/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:150)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEQEFDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fcab FS20m-232-91 CH3结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:151)
AB,CD和EF环 下划线
GQPREPQVYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
有LALA突变的FS20m-232-91/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 152)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20m-232-91/4420模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 153)
VH结构域(下划线)
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGR FTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
有LALA突变的FS20m-232-91/HelD1.3模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 154)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
无LALA突变的FS20m-232-91/HelD1.3模拟mAb2的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 155)
VH结构域(下划线)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTM LVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4420 mAb的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:156)
VL结构域(下划线)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HelD1.3模拟mAb2的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:157)
VL结构域(下划线)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGT QYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人OX40-mFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:158)
IL-2引导序列(下划线),OX40细胞外结构域(斜体),小鼠IgG2a Fc结构域(加粗)
Figure BDA0002974976140000971
Figure BDA0002974976140000981
小鼠OX40-mFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:159)
IL-2引导序列(下划线),OX40细胞外结构域(斜体),小鼠IgG2a Fc结构域(加粗)
Figure BDA0002974976140000982
食蟹猴OX40-mFc的氨基酸序列(SEQ ID NO:160)
IL-2引导序列(下划线),OX40细胞外结构域(斜体),小鼠IgG2a Fc结构域(加粗)
Figure BDA0002974976140000983
人OX40细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:161)
LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRA
食蟹猴OX40细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:162)
LHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPA
小鼠OX40细胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:163)
VTARRLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWETQRPTFRPTTVQSTTVWPRTSELPSPPTLVTPEGP
DO11.10-hOX40和人OX40受体的氨基酸序列(SEQ ID NO:164)
LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
DO11.10-mOX40 and小鼠OX40受体的氨基酸序列(SEQ ID NO:165)
VTARRLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWETQRPTFRPTTVQSTTVWPRTSELPSPPTLVTPEGPAFAVLLGLGLGLLAPLTVLLALYLLRKAWRLPNTPKPCWGNSFRTPIQEEHTDAHFTLAKI
DO11.10-cOX40和食蟹猴OX40受体的氨基酸序列(SEQ ID NO:166)
KLHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPAVAAILGLGLALGLLGPLAMLLALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPIQEEQADAHSALAKI
包含LALA突变的抗-FITC mAb G1AA/4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:167)
CDR的位置处下划线.LALA突变的位置处加粗.
Figure BDA0002974976140000984
无LALA突变的抗-FITC mAb G1/4420的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:168)
CDR的位置处下划线.
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
有LALA突变的G1/HelD1.3抗体的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:169)
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
全长IgG1铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO:170)
EPKSCDKTHTCPPCP
截短Fcab铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)
TCPPCP
FS20-22-49-AA/FS30-10-16的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
FS20-22-49-AA/FS30-10-16的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
包含LALA突变的G1/OX86 mAb(G1AA/OX86)的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTGYNLHWVRQPPGKGLEWMGRMRYDGDTYYNSVLKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTAIYYCTRDGRGDSFDYWGQGVMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
G1AA/OX86 mAb的轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:176)
DIVMTQGALPNPVPSGESASITCRSSQSLVYKDGQTYLNWFLQRPGQSPQLLTYWMSTRASGVSDRFSGSGSGTYFTLKISRVRAEDAGVYYCQQVREYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
参考文献
本说明书中提到的所有文件均通过引用整体并入本文。
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Claims (19)

1.结合OX40的特异性结合成员，其包含位于该特异性结合成员的CH3结构域中的OX40抗原结合位点，其中该OX40抗原结合位点包括以下特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-22-49，分别在SEQ ID NO:43、54和71中列出；
(ii)FS20-22-41，分别在SEQ ID NO:43、54和45中列出；
(iii)FS20-22-47，分别在SEQ ID NO:43、54和62中列出；
(iv)FS20-22-85，分别在SEQ ID NO:43、54和80中列出；或
(v)FS20-22-38，分别在SEQ ID NO:43、44和45中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
2.根据权利要求1所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包含分别在SEQID NO：72、55、63、81和46中列出的特异性结合成员FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38的CH3结构域序列。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:74、57、65、83和48中列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38；或
(ii)分别在SEQ ID NO:76、59、67、85和50中列出的FS20-22-49、FS20-22-41、FS20-22-47、FS20-22-85或FS20-22-38。
4.一种结合OX40的特异性结合成员，其包含位于所述特异性结合成员的CH3结构域中的OX40抗原结合位点，其中所述OX40抗原结合位点包括下述特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-31-115，分别在SEQ ID NO:122、142和133中列出；
(ii)FS20-31-108，分别在SEQ ID NO:122、132和133中列出；
(iii)FS20-31-58，分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出；
(iv)FS20-31-94，分别在SEQ ID NO:111、112和113中列出；
(v)FS20-31-102，分别在SEQ ID NO:122、123和102中列出；或
(vi)FS20-31-66，分别在SEQ ID NO：91、92和102中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
5.根据权利要求2或4所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括如下所述的特异性结合成员FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66的CH3结构域序列，分别在SEQ ID NO:143、134、94、114、124和103中列出。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:145、136、96、116、126和105中列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66；或
(ii)分别在SEQ ID NO:147、138、98、118、128和107中列出的FS20-31-115、FS20-31-108、FS20-31-58、FS20-31-94、FS20-31-102或FS20-31-66。
7.一种结合OX40的特异性结合成员，其包含位于该特异性结合成员的CH3结构域中的OX40抗原结合位点，其中该OX40抗原结合位点包括下述特异性结合成员的第一、第二和第三序列：
(i)FS20-11-131，分别在SEQ ID NO:12、13和23中列出；
(ii)FS20-11-127，分别在SEQ ID NO:12、13和14中列出；或
(iii)FS20-11-134，分别在SEQ ID NO:12、13和32中列出；和
其中第一、第二和第三序列分别位于特异性结合成员的CH3结构域的AB、CD和EF结构环中。
8.根据权利要求7所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括SEQ ID NO：24、15和33中列出的特异性结合成员FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134的CH3结构域序列。
9.根据权利要求7或8所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员包括下述特异性结合成员的序列：
(i)分别在SEQ ID NO:26、17和35中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134；或
(ii)分别在SEQ ID NO:28、19和37中列出的FS20-11-131、FS20-11-127或FS20-11-134。
10.根据前述权利要求中任一项所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员还包含基于CDR的抗原结合位点。
11.根据权利要求10所述的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体分子。
12.根据权利要求10或11所述的抗体分子，其中所述基于CDR的抗原结合位点结合选自下组的第二抗原：免疫细胞抗原、肿瘤抗原和病原体抗原。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的特异性结合成员或抗体分子，其中所述特异性结合成员或抗体分子不结合Fcγ受体。
14.一种核酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的特异性结合成员或抗体分子。
15.一种重组宿主细胞，其包含权利要求14所述的核酸。
16.一种产生根据权利要求1至13中任一项的特异性结合成员或抗体分子的方法，包括在产生该特异性结合成员或抗体分子的条件下培养权利要求15的重组宿主细胞。
17.根据权利要求1-13中任一项的特异性结合成员或抗体分子，其用于通过疗法治疗人或动物体的方法中。
18.一种治疗患者的疾病或病症的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的特异性结合成员或抗体分子。
19.根据权利要求17所述应用的特异性结合成员或抗体分子，或根据权利要求18所述的方法，其中所述治疗是个体癌症或传染病的治疗。
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