CN104080809A - 抗cd134(ox40)抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合人CD134的抗体。本发明的抗人CD134抗体特异性结合人CD134的胞外结构域，包括人CD134上的非OX40配体(OX40L)结合结构域，所述人CD134在例如激活的人常规效应CD4和/或CD8T淋巴细胞(Teff)上及在激活的人抑制调节CD4T淋巴细胞(Treg)上表达。本发明的抗人CD134抗体可用于癌症治疗(例如赋予Teff抗癌效应功能和/或抑制Treg抑制功能)。

Description

抗CD134(OX40)抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体，这类抗体的应用，特别涉及结合CD134的抗体，其用于治疗癌症。
发明背景
增强抗肿瘤T细胞功能代表治疗癌症的独特途径。有大量证据表明肿瘤细胞通过诱导主要由调节T淋巴细胞(Treg；Quezda et al.Immunol Rev2011；241:104-118)介导的主动免疫耐受而“逃避”免疫系统。因此，效应(即肿瘤细胞的直接或间接根除)T淋巴细胞(Teff)与耐受原性(tolerogenic)(即抑制Teff效应功能及存活)Treg之间的平衡对于有效抗肿瘤免疫治疗似乎至关重要。换句话说，有效抗肿瘤免疫应答可以通过增强肿瘤特异性Teff的效应功能和/或通过减弱肿瘤特异性Treg的抑制功能而获得。CD134(OX40)受体已被证明是介导这些应答的一种关键受体(Sugamura,K,Ishii,N,Weinberg,A.Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatorymolecule OX40.Nature Rev Imm2004；4:420-431)。
CD134(也称为OX40,TNFRSF4和ACT35)是肿瘤坏死因子受体超家族成员。这种CD134表面共刺激受体在激活的T淋巴细胞上表达，并且在其存活及功能中起重要作用。表达CD134的T淋巴细胞已被证实存在于各种人恶性肿瘤及癌症患者引流淋巴结中(Ramstad et al.Am J Surg2000；179:400-406；Vetto et al.Am J Surg1997；174:258-265)。
在携带肿瘤的小鼠中，小鼠CD134受体的体内连接(通过可溶性小鼠OX40配体(OX40L)-免疫球蛋白融合蛋白或小鼠OX40L模拟物，如抗小鼠CD134特异性抗体)增强抗肿瘤免疫，导致各种小鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型例如淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌和神经胶质瘤中的无肿瘤存活(Sugamura et al.Nature Rev Imm2004；4:420-431)。
有人建议通过使用OX40R结合剂结合OX40R而增强哺乳动物对抗原的免疫应答(WO99/42585；Weinberg,2000)。尽管该文献概括提及OX40结合剂，但是重点是使用OX40L或其部分；抗OX40抗体作为OX40L的等同物而公开。事实上，当Weinberg小组将该研究用于非人灵长类动物的研究时，他们再次有意选择了结合OX40L结合位点并大体模拟OX40L的抗体。
Al-Shamkhani et al.(Eur J Chem1996；26:1695-1699)使用了称为OX86的抗OX40抗体，其不阻断OX40L结合，以探索OX40在激活的小鼠T细胞上的差异表达；Hirschhorn-Cymerman et al.(J Exp Med2009；206:1103-1116)在小鼠模型中使用了OX86和环磷酰胺作为潜在化学免疫治疗。但是OX86预期不结合人OX40，当选择在人中有效的抗体时，人们根据Weinberg的研究会选择结合在OX40L结合位点的抗体。
在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，人CD134受体的体内连接(通过抗人CD134特异性抗体，其与人CD134上的OX40L结合结构域相互作用；US2009/0214560A1)增强抗肿瘤免疫，其导致各种人恶性肿瘤细胞系例如淋巴瘤、前列腺癌、结肠癌及乳腺癌的肿瘤生长抑制。
在人类中，人CD134连接介导的抗肿瘤免疫应答的精确机制尚未证实，但是据认为是经过CD134跨膜信号传导途径介导的，该途径受与OX40L的相互作用刺激。这种相互作用由三聚体OX40L与CD134的结合而介导。在目前抗癌治疗中，推荐使用三聚化OX40配体作为比抗OX40抗体更有效的药物(Morris et al.Mol Immunol2007；44:3112-3121)。
发明概述
现在申请人令人惊奇地发现，为了诱导T细胞介导的抗肿瘤活性，使用结合人CD134的分离的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(CD134)受体与OX40配体(OX40L)的结合，产生增强的免疫应答，其特征在于增强T效应细胞的免疫刺激/效应功能和/或使这些细胞增殖和/或下调T调节细胞的免疫抑制功能。
本发明因此提供了结合人CD134的分离的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合。
此类结合分子包括合适的抗CD134抗体、抗CD134抗体的抗原结合片段及抗CD134抗体的衍生物。在一些实施方案中，结合分子以1x10-7M或更小的Kd结合人CD134。结合分子对于T效应细胞上的人CD134具有激动剂活性和/或对于T调节细胞上的人CD134具有拮抗剂活性。在一些进一步实施方案中，结合分子是以100nM或更小、优选小于50nM、更优选小于20nM的Kd特异性结合人CD134的人单克隆抗体。
本发明还提供了组合物，其包含一或多种结合分子和药学可接受载体。在一些实施方案中，结合分子是人单克隆抗CD134抗体或其抗原结合片段。组合物可以进一步包含另外的药剂，如免疫治疗剂、化疗剂和激素治疗剂。
本发明进一步提供了使用所述结合分子的诊断和治疗方法。在一些实施方案中，提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的本文公开的结合分子或者包含结合分子的组合物。在一些其它实施方案中，本文提供了在哺乳动物中增强免疫应答的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的结合分子或者包含结合分子的组合物。在特定实施方案中，所述方法中使用的结合分子是人单克隆抗CD134抗体或者其抗原结合片段，其结合人CD134，其中所述抗体不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
本发明进一步提供了编码结合分子的氨基酸序列的核酸分子，包含此类核酸的载体，包含所述载体的宿主细胞及制备所述结合分子的方法。
本文还提供了其它方面，其从包括权利要求书在内的全部公开内容中显而易见。
附图说明
本发明参照附图进行描述：
图1：暴露于PHA-M对于人T淋巴细胞的表面人CD134表达的时程及剂量效应。
图2：静息(resting)及PHA-M激活的人CD4T淋巴细胞上的人CD134表达。
图3：小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35、克隆12H3及克隆20E5在PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的结合特征。
图4：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3及克隆20E5在PHA-M刺激的表达人CD134的CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞上的结合。
图5：未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5与PE缀合的商品化的小鼠抗CD134抗体克隆ACT35或克隆L106对PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的交叉竞争。
图6：在PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5与人OX40L的同时结合。
图7：暴露于抗人CD3/抗人CD28克隆刺激珠对于人效应T淋巴细胞(Teff)及调节T淋巴细胞(Treg)的表面人CD134表达的时程效应。
图8：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5或者暴露于人OX40L对于PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的剂量效应。
图9：组合小鼠抗人CD134抗体克隆12H3与人OX40L或者组合小鼠抗人CD134抗体克隆20E5与人OX40L对PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的作用。
图10：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5或者暴露于人OX40L对于抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激的表达人CD134的人效应T淋巴细胞的增殖的作用。
图11：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5或者暴露于人OX40L对于抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激的表达人CD134的人调节T淋巴细胞的增殖的作用。
图12：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3对于人OX40L介导的抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激的表达人CD134的人效应(A)和调节(B)T淋巴细胞的增殖的作用。
图13：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5或者暴露于人OX40L对于表达人CD134的人调节T淋巴细胞介导的表达人CD134的人效应T淋巴细胞增殖的抑制的作用。
图14：嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在(无和有IL-2)CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞上的结合。
图15：嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或人OX40L对于PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的作用。
图16：暴露于嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于人OX40L对于PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖的剂量效应。
图17：组合嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5与人OX40L对于PHA-M刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的作用。
图18：嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者人OX40L对于(无和有IL-2)CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖的作用。
图19：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5与非还原及还原的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的结合。(A)非还原(a，b)及还原(c，d)检测条件。(B)用考马斯亮蓝染色的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白(rhuCD134)在非还原(a,b)及还原(c,d)条件下的电泳迁移模式。(C)暴露于小鼠IgG1κ同种型对照抗体(mIgG1)或者暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5(分别为m12H3和m20E5)的非还原(a,b)及还原的(c,d)重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的Western印迹。
图20：在全长人CD134(称为“CRD1”)和各种截短的人CD134形式(称为“CRD2”、“CRD3”、“CRD4”和“截短的(tc)CRD4”)中富含半胱氨酸结构域(CRD)的示意图。
图21：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5在用全长人CD134构建体(称为“CRD1”)或者用各种截短的人CD134构建体(称为“CRD2”、“CRD3”、“CRD4”和“截短的(tc)CRD4”)瞬时转染的239-F细胞系上的结合。
图22：嵌合人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134抗体克隆12H3和20E5在用全长人CD134构建体(称为“CRD1”)或者用各种截短的人CD134构建体(称为“CRD2”、“CRD3”、“CRD4”和“截短的(tc)CRD4”)瞬时转染的239-F细胞系上的结合。
图23：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3(A)和嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3(B)与人CD134衍生肽的结合，所述肽相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(根据Latza et al.Eur JImmunol1994；24:677-683的定义)。
发明描述
T细胞激活不仅由通过T细胞受体的抗原刺激介导，而且也由通过共刺激分子的共刺激信号介导。在一些共刺激分子中，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员OX40(CD134)在效应和记忆T细胞的存活和稳态中起关键作用。根据对OX40共刺激的传统理解，当激活的T细胞结合专门的抗原呈递细胞(APC)时，OX40和OX40配体(OX40L)之间发生相互作用。T细胞功能包括细胞因子产生、扩增和存活继而由OX40共刺激信号增强。在T细胞-树突状细胞(DC)相互作用期间，即抗原识别后2-3天，OX40与OX40L之间发生相互作用。表达OX40的T细胞也可以与DC之外的表达OX40L的细胞相互作用，并且从该细胞接收OX40信号，其可提供关键信号，用于产生记忆T细胞、增强Th2应答及延长炎症反应。因此，OX40与OX40L之间的最佳相互作用可以通过两步形成：在激活的CD4T细胞上表达的OX40L与在其它应答(responder)CD4T细胞上表达的OX40相互作用，导致记忆CD4T细胞的最佳产生(Soroosh et al.,2006)，或者在CD4+辅佐细胞(accessory cell)上表达的OX40L可以通过与Th2细胞上的OX40的相互作用而促进Th2细胞存活(Kim et al.2003)。另外，B细胞上OX40L表达是体内Th2发育所需的，但是不是Th1发育所需的(Linton et al.2003)，表达OX40L的肥大细胞通过T细胞上的OX40与肥大细胞上的OX40L之间的相互作用直接增强效应T细胞功能(Kashiwakura et al.J Immunol2004；173:5247-5257；Nakae et al.J Immunol2006；176:2238-2248)。另外，因为内皮细胞也表达OX40L(Imura et al.1996)，所以与内皮细胞结合的OX40可能参与血管炎症。对于应答T细胞和T调节细胞而言过量的OX40信号，抑制Treg介导的免疫抑制。传递进入应答T细胞的OX40信号使得它们对Treg介导的抑制有抗性。另一方面，传递进入Treg细胞的OX40信号直接抑制Treg抑制性功能，尽管对于OX40信号是否可以控制Treg细胞中的Foxp3表达水平存有争议。另外，有意的OX40刺激抑制iTreg细胞(可诱导的Treg细胞)的TFG-β依赖性分化。所述抑制可以部分由效应细胞因子介导，所述效应细胞因子例如由用OX40刺激的效应T细胞产生的IL4和IFN-γ。重要的是，阻断OX40L显著促进iTreg分化并且诱导移植物耐受，其可能由Treg细胞介导。因此，OX40是用于控制T细胞介导的自身免疫的可能分子靶标。另外，最近研究报道了由肥大细胞表达的OX40L与由Treg细胞表达的OX40之间的相互作用可以互相抑制肥大细胞功能及Treg细胞抑制功能(Gri et al.2008；Piconese et al.2009)。
小鼠是免疫学家的实验工具选择，对它们的免疫应答的研究已经提供了对人类免疫系统工作的极大认知。小鼠和人类系统的大体结构看起来非常类似；但是，也存在显著差异。例如，在小鼠中，CD134在激活的Teff上表达，而Treg组成型表达CD134(Piconese et al.J Exp Med2008；205:825-839)。在人类中，CD134在Teff和Treg上均有表达，但是仅在激活时表达(参见以下例如实施例2(g)，“在用抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激后在人效应及调节T淋巴细胞上的CD134表达”)。另外，小鼠Treg诱导小鼠Teff的凋亡以实现抑制(Pandiyan et al.Nat Immunol2007；8:1353；Scheffold et al.Nat Immunol2007；8:1285-1287)，而人Treg不通过诱导人Teff的凋亡以实现抑制(Vercoulen et al.Plos ONE2009；4:e7183)。总而言之，这些数据表明CD134在人与小鼠免疫系统之间在Treg抑制功能中的不同作用。
术语“结合分子”包括(1)抗体，(2)抗体的抗原结合片段，及(3)抗体衍生物，各自如本文定义。术语“结合CD134”是指如本文定义的结合分子在如BIAcore测定或者通过Octet(表面等离子体共振)的体外测定中结合CD134受体。结合分子优选具有的结合亲和性(Kd)为1x10-6M或更小，更优选小于50x10-7M，还更优选小于1x10-7M。
术语“分离的抗体”或者“分离的结合分子”是指这样的抗体或者结合分子：(1)不与在其自然状态与其共存的自然结合的成分结合；(2)不含有来自同一物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或者(4)自然界中不存在。分离的抗体的例子包括用CD134亲和纯化的抗CD134抗体，通过杂交瘤或者其它细胞系体外产生的抗CD134抗体，及衍生自转基因动物的人抗CD134抗体。
术语“激动剂”是指本文定义的结合分子，其在结合CD134时，(1)刺激或激活CD134，(2)增强、促进、诱导、增加或者延长CD134的活性、存在或功能，或者(3)增强、促进、增加或者诱导CD134的表达。术语“拮抗剂”是指本文定义的结合分子，其在结合CD134时，(1)抑制(inhibits orsuppresses)CD134，(2)抑制CD134的活性、存在或功能，或者(3)抑制CD134的表达。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，通常由2对相同多肽链组成，每对具有一个“重”(H)链和一个“轻”(L)链。人轻链分为kappa(κ)和lambda(λ)，重链分为mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并且分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链由重链可变区(本文简写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。IgD、IgG和IgA的重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成，IgM和IgE的重链恒定区由4个结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成。每个轻链由轻链可变区(本文简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)。VH和VL区可以进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的称为构架区(FR)的区域。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。每个重链/轻链对(VH和VL)的可变区分别形成抗体结合位点。每个区域或结构域的氨基酸分布符合KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))的定义或者符合Chothia et al.Conformationsof immunoglobulin hypervariable regions(Nature1989；342(6252):877-83)的定义。术语“抗体”包括抗体多聚体形式的抗体，如单体抗体的二聚体、三聚体或更高级别多聚体。其还包括与非抗体部分连接或附着的抗体。另外，术语“抗体”不受产生抗体的任何特定方法限制。例如，其包括单克隆抗体、重组抗体和多克隆抗体。
术语“抗体衍生物”或者抗体的“衍生物”是指能与抗体所结合的相同抗原(即人CD134)结合，并且包含与另外的分子实体连接的抗体的氨基酸序列的分子。抗体衍生物中含有的抗体的氨基酸序列可以是全长抗体，或者可以是全长抗体的任何部分。另外的分子实体的实例包括化学基团、肽、蛋白质(如酶、抗体)、氨基酸和化合物。另外的分子实体可以用作检测剂、标记、治疗剂或药剂。抗体的氨基酸序列可以通过非共价结合、化学偶联、基因融合或其它方式附着于或连接于所述另外的实体。术语“抗体衍生物”还包括嵌合抗体、人源化抗体和通过CD134抗体氨基酸序列的修饰，如保守氨基酸取代、插入和添加衍生的分子。
术语抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的一或多个部分，其保留与抗体所结合的相同抗原(即人CD134)结合的能力。术语“抗原结合片段”还包括抗体的一部分，其为更大分子的一部分，所述更大分子由抗体部分与一或多个另外的分子实体非共价或共价结合而形成。另外的分子实体的例子包括氨基酸、肽或蛋白质，如链霉抗生物素核心区域，其可以用于制备四聚体scFv分子(Kipriyanov et al.Hum Antibodies Hybridomas1995；6(3):93-101)。
术语“嵌合抗体”是指包含衍生自两种或更多种不同抗体的氨基酸序列的抗体。所述两种或更多种不同抗体可以来自相同物种，或者来自两种或更多种不同物种。
术语“表位”是指能特异性结合抗体或者T细胞受体或者以另外方式与分子相互作用的抗原部分。“表位”在本领域中也称为“抗原决定簇”。表位通常由分子如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的化学活性表面集合组成。表位可以是“线性的”或“非线性的/构象的”。一旦确定希望的表位(例如通过表位定位确定)，可以产生针对该表位的抗体。抗体的产生和表征也可以提供有关希望的表位的信息。根据该信息，继而可以例如通过进行交叉竞争研究筛选结合相同表位的抗体，以发现互相竞争结合的抗体，即竞争结合抗原的抗体。
术语“宿主细胞”是指其中引入表达载体的细胞。该术语不仅包括特定受试细胞，还包括这种细胞的后代。因为在连续世代中由于环境影响或突变可能发生一些修饰，所以这些后代可能与亲代细胞不相同，但是仍包括在术语“宿主细胞”范围内。
术语“人抗体”是指仅由人免疫球蛋白序列的氨基酸序列组成的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或者在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则人抗体可以含有小鼠碳水化合物链。人抗体可以以本领域已知的各种方法制备。
术语“人源化抗体”是指嵌合抗体，其含有衍生自人抗体序列的氨基酸残基。人源化抗体可以含有一些或全部来自非人动物抗体的CDR，而抗体的构架区和恒定区含有衍生自人抗体序列的氨基酸残基。
术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何动物种。哺乳动物的例子包括：人；实验动物如大鼠、小鼠、猿猴和豚鼠；家畜如兔、牛、绵羊、山羊、猫、狗、马和猪等。
术语“分离的核酸”是指基因组、cDNA或合成来源的核酸分子或者其组合，其与核酸天然来源中存在的其它核酸分子分离。优选地，“分离的”核酸不含位于该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中感兴趣核酸的5’和3’端的序列。
术语“解离速率(off-rate)或"Kd"是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，用于描述配体(如抗体)和蛋白质(如CD134)之间的结合亲和性。平衡解离常数越小，配体结合得越紧密，或者配体和蛋白质之间的亲和性越高。Kd可以通过表面等离子体共振测量，例如使用BIACORE1或者Octet系统。术语“抗CD134抗体”是指本文定义的能结合人CD134的抗体。
术语“OX40受体”和“CD134受体”在本申请中可互换使用，包括人CD134及其变体、同种型和物种同源物。因此，本文公开的人结合分子在一些情况中也可以结合来自非人物种的CD134。在另外情况中，结合分子可以完全特异性针对人CD134并且可不展示物种或其它类型交叉反应性。特别地，它们不结合小鼠或大鼠CD134。
术语“特异性结合人CD134”是指结合分子结合人CD134的Kd优选比其结合例如人CD40的Kd高10倍、50倍或最优选高100倍，如使用本文描述的或者本领域技术人员已知的测定(例如BIAcore测定)所确定。作为选择，特定物质特异性结合OX40受体的确定可以容易地通过使用或调整常规程序而进行。一种合适的体外测定利用Western印迹程序(在许多标准教材中描述，包括"Antibodies,A Laboratory Manual"by Harlow and Lane)。为确定给定OX40受体结合物质特异性结合人OX40蛋白质，从不表达OX40抗原的哺乳动物细胞，如非淋巴细胞(例如COS细胞或CHO细胞)提取总细胞蛋白质，用编码OX40的核酸分子转化。作为阴性对照，也从相应的未转化细胞提取总细胞蛋白质。这些蛋白质制备物继而在非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(PAGE)。之后，蛋白质经Western印迹转移到膜(例如硝基纤维素)上，将待测物质与膜温育。洗涤膜以除去非特异性结合的物质后，用缀合于检测剂如碱性磷酸酶的抗测试物质的抗体检测结合的物质的存在，应用底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑导致由免疫固定的碱性磷酸酶产生致密蓝色化合物。通过这个技术，特异性结合人OX40的物质将显示结合OX40转化细胞的提取物中的人OX40条带(其分子质量决定了其将位于凝胶上的给定位置)，而在非转化细胞的提取物中观测到极少结合或无结合。该物质与其它蛋白质可发生非特异性结合并且可以在Western印迹上检测到较弱信号。通过Western印迹上获得的弱信号，相比于从特异性物质/人OX40蛋白质结合产生的强主要信号，本领域技术人员能够意识到这个结合的非特异性性质。理想地，OX40受体结合物质不结合从非转化细胞提取的蛋白质。除了使用提取蛋白质的结合测定之外，推定的OX40受体结合物质可以通过如下测试以证实它们在体内基本上仅结合OX40受体的能力，将该结合物质与荧光标记(如FITC)缀合，通过流式细胞术(FACS)分析其与抗原激活的CD4+T细胞和未激活的T细胞群的结合。基本上仅结合OX40受体的物质仅使激活的CD4+T细胞染色。
术语“载体”是指能将另一个核酸分子转运入宿主细胞的核酸分子。载体的例子包括质粒、病毒载体、粘粒或噬菌体载体，及裸露DNA或RNA表达载体。一些载体能在它们被导入的宿主细胞中自主复制。一些载体导入宿主细胞时，可以整合进宿主细胞基因组，由此与宿主基因组一起复制。某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达，因此可以被称为“表达载体”。
如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写遵循习惯用法。
本发明提供了结合人CD134的分离的结合分子，包括抗CD134抗体、抗CD134抗体的抗原结合片段及抗CD134抗体的衍生物。所述结合分子特征在于至少一种下述功能性质：(a)以1x10-6M或更小的Kd结合人CD134；(b)不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)；(c)对T效应细胞上的人CD134具有激动剂活性和/或对T调节细胞上的人CD134具有拮抗剂活性；(d)在高至500nM的浓度下不结合CD40受体；(e)在高至500nM的浓度下不结合CD137受体；(f)在高至500nM的浓度下不结合CD271受体；(g)能增强分离的人T细胞的IL-2产生；(h)能增强免疫应答；(i)能抑制肿瘤细胞生长；及(j)具有对癌症的治疗作用。在一些实施方案中，结合分子以1x10-7M或更小，或者1x10-8M或更小，或者5x1x10-9M或更小的Kd结合人CD134。
本发明的抗体及其它结合分子可以通过常规技术制备，然后经筛选以鉴别和获得不阻止OX40L结合CD134的结合分子。例如，可以选择即使在CD134已暴露于饱和浓度的OX40L时仍结合CD134的结合分子。
在本发明一个实施方案中，提供了结合人CD134的人抗体。在一些实施方案中，所述人抗体是单克隆抗体，其以100nM或更小，优选10nM或更小的Kd特异性结合人CD134，和/或对T效应细胞上的人CD134具有激动剂活性和/或对T调节细胞上的人CD134具有拮抗剂活性。这类人抗体的一个例子是人单克隆抗体克隆12H3。抗体克隆12H3的完整重链可变区的氨基酸序列及重链可变区(VH)的3个CDR的氨基酸序列分别示于SEQID NO:12和14-16。抗体克隆12H3的完整轻链可变区的氨基酸序列及轻链可变区(VL)的3个CDR的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:13和17-19。另一个公开的示例性抗体是人单克隆抗体克隆20E5。抗体克隆20E5的完整重链可变区的氨基酸序列及重链可变区(VH)的3个CDR的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:4和6-8。抗体克隆20E5的完整轻链可变区的氨基酸序列及轻链可变区(VL)的3个CDR的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:5和9-11。
本发明的抗体可以包含一或多个这些CDR，或者每个CDR具有1、2或3个氨基酸取代的一或多个这些CDR。取代优选是“保守”取代。提供功能类似的氨基酸的保守取代是本领域熟知的，例如在WO2010/019702的表1中描述，其通过引用并入本文。
鉴于克隆12H3和克隆20E5结合人CD134，其各自的VH和VL序列可以与其它抗CD134抗体“混合和匹配”以产生另外的抗体。这种“混合和匹配的”抗体与人CD134的结合可以用本领域已知的结合测定、包括实施例所述的测定进行检测。在一种情况中，当VH和VL区混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列用结构相似的VH序列置换。相似地，在另一种情况中，来自特定VH/VL配对的VL序列用结构相似的VL序列置换。
含有仅一个或两个CDR区(在一些情况中，甚至仅单个CDR或其部分，特别是CDR3)的分子能够保留该CDR所来源的抗体的抗原结合活性。参见例如，Laune et al.JBC1997；272:30937-44；Monnet et al.JBC1999；274:3789-96；Qiu et al.Nature Biotechnology2007；25:921-9；Ladner et al.Nature Biotechnology2007；25:875-7；Heap et al.J Gen Virol2005；86:1791-1800；Nicaise et al.Protein Science2004；13:1882-91；Vaughan andSollazzo Combinatorial Chemistry&High Throughput Screening2001；4:417-430；Quiocho Nature1993；362:293-4；Pessi et al.Nature1993；362:367-9；Bianchi et al.J Mol Biol1994；236:649-59；及Gao et al.J Biol Chem1994；269:32389-93。
因此，本发明的一个实施方案是分离的抗人CD134抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明进一步实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR1；和/或(b)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的重链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链CDR3。
在本发明进一步实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；和/或(b)包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3。
因此，本发明的一个实施方案是分离的抗人CD134抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明进一步实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1；和/或(b)包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的重链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR3。
在本发明进一步实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；和/或(b)包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；和/或包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3。
鉴于克隆12H3和克隆20E5结合人CD134，并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区域提供，VH CDR1、CDR2和CDR3序列及VLCDR1、CDR2和CDR3序列可以被“混合和匹配”以产生另外的抗CD134抗体。例如，来自不同抗CD134抗体的CDR可以混合和匹配，尽管每个抗体通常将含有VH CDR1、CDR2和CDR3及VL CDR1、CDR2和CDR3。这种“混合和匹配”的抗体与CD134的结合可以用上述及实施例中所述的结合测定(如ELISA，Biacore分析)测试。在一种情况中，当VH CDR序列被混合和匹配时，来自一特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构相似的CDR序列置换。类似地，当VL CDR序列被混合和匹配时，来自一特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构相似的CDR序列置换。对本领域技术人员将很显然的是，可以用来自本文公开的CDR序列的结构相似的序列置换一或多个VH和/或VL CDR区域序列而产生新型VH和VL序列。
抗CD134抗体的类别(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)及亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)可以通过任何合适方法如ELISA或Western印迹及其它技术确定。或者，所述类别及亚类可以通过对抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的全部或部分进行测序，将它们的氨基酸序列与各种类别及亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，确定抗体的类别及亚类。抗CD134抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，抗CD134抗体可以是IgG，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。因此，本发明的另一方面提供了将抗CD134抗体的类别或亚类转化为另一类别或亚类的方法。
本发明的实施方案的结合分子包括单克隆抗体、其片段、肽和其它化学实体。单克隆抗体可以通过传统方法免疫哺乳动物、随后分离产生感兴趣单克隆抗体的B浆细胞及与骨髓瘤细胞融合而制备。
在各种实施方案中，结合部分可以是抗体模拟物(例如基于非抗体骨架)、RNA适体、小分子或CovX-body，而非实际抗体。
应理解可以使用抗体模拟物(例如具有高度稳定性但是仍允许在一定位置引入变异的非抗体骨架结构)产生分子文库，从中可以衍生结合部分。生物化学领域技术人员熟悉许多这类分子。这类分子可以在本发明物质中用作结合部分。
典型的抗体模拟物在Skerra et al.(2007,Curr.Opin.Biotech.,18:295-304)中讨论，并且包括：affibodies(也称作Trinectins；Nygren,2008,FEBS J,275,2668-2676)；CTLDs(也称作Tetranectins；Innovations Pharmac.Technol.(2006),27-30)；adnectins(也称作monobodies；Meth.Mol.Biol.,352(2007),95-109)；anticalins(Drug Discovery Today(2005),10,23-33)；DARPins(ankyrins；Nat.Biotechnol.(2004),22,575-582)；avimers(Nat.Biotechnol.(2005),23,1556-1561)；microbodies(FEBS J,(2007),274,86-95)；肽适体(Expert.Opin.Biol.Ther.(2005),5,783-797)；Kunitz domains(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318,803-809)；affilins(Trends.Biotechnol.(2005),23,514-522)。
因此，优选的是抗体模拟物选自包含或由下述物质组成的组：affibodies、tetranectins(CTLDs)、adnectins(monobodies)、anticalins、DARPins(ankyrins)、avimers、iMabs、microbodies、肽适体、Kunitz结构域、适体及affilins。
“小分子”是指900道尔顿或更小的低分子量有机化合物。尽管大的生物聚合物如核酸、蛋白质和多糖(如淀粉或纤维素)不包括在“小分子”中，但是它们的组成单体(分别为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、氨基酸和单糖)及寡聚物(即短的聚合物如二核苷酸、肽如抗氧化谷胱甘肽和二糖如蔗糖)包括在内。小分子的产生如Mayes&Whitcombe,2005,Adv.Drug Deliv.Rev.57:1742-78及Root-Bernstein&Dillon,2008,Curr.Pharm.Des.14:55-62所述。
CovX-Bodies是通过将药效团经接头共价连接于特殊设计的抗体的结合位点而产生，其有效地重新编程抗体(Tryder et al.,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.,17:501-6)。结果是形成新一类化学实体，其中每个成分造就了完整的CovX-Body的希望特性——具体而言，该实体具有肽的生物学作用及抗体的延长的半衰期。
人抗体可以用若干不同方法制备，包括使用人免疫球蛋白表达文库(Stratagene Corp.,La Jolla,California；Cambridge Antibody Technology Ltd.,London,England)产生人抗体片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或(Fab')2)，及使用这些片段通过使用类似于产生嵌合抗体的技术，融合合适部分而构建完整人抗体。人抗体也可以在具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠中产生。这种小鼠可得自例如Abgenix,Inc.,Fremont,California,和Medarex,Inc.,Annandale,New Jersey。除了连接重链和轻链Fv区域形成单链肽以外，也可以用相似手段构建和表达Fab(M.J.Evans et al.J Immunol Meth1995；184:123-138)。
DelmmunizedTM抗体是其中已消除潜在的免疫原性T细胞表位的抗体，如国际专利申请PCT/GB98/01473所述。因此，当它们在体内应用时，在人类中的免疫原性预期将消除或实质降低。本发明的基于免疫球蛋白的结合分子可以通过这种方法消除它们的免疫原性T细胞表位(如果存在)。
上述完全或部分人类抗体比完全小鼠抗体或非人衍生的抗体的免疫原性低，片段和单链抗体也是如此。所有这些分子(或其衍生物)因而不太可能引起免疫或变应性应答。因此，它们比完全非人抗体更适合在人体内施用，特别是当需要重复或长期施用时。
双特异性抗体可以用作相同人靶细胞的人CD134，或者两个不同人靶细胞上的人CD134之间的交联剂。这种双特异性抗体具有一种针对人CD134上两个不同表位的每一个的特异性。这些抗体及其制备方法在美国专利5,534,254(Creative Biomolecules,Inc.)中描述。该专利中描述的双特异性抗体的不同实施方案包括用肽偶联物(包括Ser-Cys、(Gly)4-Cys、(His)6-(Gly)4-Cys)、螯合剂和化学或二硫键偶联(包括双马来酰亚氨基己烷和双马来酰亚氨基己酰)连接单链Fv。
非抗体分子可以通过常规手段从化合物文库分离或筛选。用于产生和筛选化合物文库的自动化系统在美国专利5,901,069和5,463,564中描述。更显著的方法涉及结合位点的三维建模，然后制备适合该模型的分子家族。这些分子家族继而被筛选以获得具有最佳结合特征的那些分子。
另一个方法是产生重组肽文库，然后筛选结合感兴趣的人CD134的表位的那些肽。参见例如美国专利5,723,322。这个表位与下述实施例中所述的单克隆抗体所结合的表位相同。事实上，一旦已知表位，根据本领域熟知技术可以相对容易地产生或分离分子。
进一步的实施方案提供了上述任一抗CD134抗体的衍生物。在一个特定方面，抗体衍生物衍生自克隆12H3和/或克隆20E5的氨基酸序列的修饰。抗体链的任何区域的氨基酸序列均可以被修饰，如构架区、CDR区或恒定区。修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然及非天然氨基酸。修饰类型包括插入、缺失、取代抗CD134抗体的一或多个氨基酸或其组合。在一些实施方案中，抗体衍生物包含重链CDR的1、2、3或4个氨基酸的取代和/或轻链CDR的1个氨基酸的取代。在一些实施方案中，抗CD134抗体的衍生物包含相对于人基因的种系氨基酸序列的一或多个氨基酸取代。在特定的实施方案中，来自种系的一或多个此类取代位于重链的CDR2区。在另一个特定实施方案中，相对于种系的氨基酸取代是在抗体克隆12H3和克隆20E5中相对于种系的取代的一或多个相同位置。在另一个实施方案中，氨基酸取代是将抗体中的一或多个半胱氨酸变为另一个残基，例如但不限于丙氨酸或丝氨酸。半胱氨酸可以是规范的或非规范的半胱氨酸。取代可以在可变结构域的CDR或构架区中或者在抗体的恒定结构域中进行。另一类型的氨基酸取代是通过改变一或全部两个残基而消除天冬酰胺-甘氨酸对，其形成潜在的脱酰胺化位点。在其它实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体衍生物在相对于克隆12H3和/或克隆20E5的氨基酸序列的重链CDR区中具有1、2、3或4个保守氨基酸取代。抗CD134抗体的另一类型修饰是改变抗体的原始糖基化模式。术语“改变”是指缺失一或多个在抗体中的碳水化合物部分，和/或加入一或多个在抗体中不存在的糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。其它修饰的例子包括酰基化、酰胺化、乙酰化、交联、环化、甲酰化、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、氧化、磷酸化、异戊二烯化、PEG化、蛋白水解加工及硫酸化。
进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其包含与一另外的分子实体连接的如本文所述的抗CD134抗体或其抗原结合片段。另外的分子实体的例子包括药剂、肽或蛋白质及检测剂或标记。可以连接于抗CD134抗体的药剂的具体例子包括细胞毒性剂或其它癌症治疗剂，及放射性同位素。可以连接于抗CD134抗体的肽或蛋白质的具体例子包括抗体，其可以是相同的抗CD134抗体或者不同抗体。可以连接于抗CD134抗体的检测剂或标记的具体例子包括(1)荧光化合物，如荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、罗丹明、5-二甲基胺-l-萘磺酰氯及镧系元素磷光体；(2)酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和葡萄糖氧化酶；(3)生物素；(4)由第二报告分子识别的预先确定的多肽表位，如亮氨酸拉链对序列、金属结合结构域、表位标记和第二抗体的结合位点。进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其是抗CD134抗体的多聚体形式，如抗体二聚体、三聚体或者单体抗体的更高级别多聚体。抗体多聚体内的个体单体可以是相同或不同的，即它们可以是异聚或同聚抗体多聚体。抗体的多聚化可以通过天然聚集完成。例如，一定百分比的纯化抗体制备物(例如纯化的IgG1分子)自发形成含有抗体同二聚体和其它更高级别抗体多聚体的蛋白质聚集物。或者，抗体同二聚体可以通过本领域已知的化学连接技术形成。合适的交联剂包括异双官能交联剂，如间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯和琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯或者同双功能交联剂(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)。这种交联剂商业可得。抗体也可以通过本领域已知的重组DNA技术多聚化制得。
进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其是嵌合抗体，包含本文上述的抗人CD134抗体的氨基酸序列。在另一个例子中，嵌合抗体的全部CDR均衍生自抗人CD134抗体。在另一个例子中，来自一个以上抗人CD134抗体的CDR组合在嵌合抗体中。进一步，嵌合抗体可以包含衍生自一个抗人CD134抗体的构架区及来自一或多个不同人抗体的一或多个CDR。嵌合抗体可以用本领域已知的常规方法产生。在一些特定实施方案中，嵌合抗体包含来自选自抗体克隆12H3和/或克隆20E5的抗体的重链可变区的或者来自轻链可变区的1、2或3个CDR。
本发明提供的其它抗体衍生物的例子包括单链抗体、二价抗体、结构域抗体、纳米抗体和unibody。在优选实施方案中，单克隆抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、DelmmunizedTM抗体、单链抗体、片段，其包括Fab、F(ab')2、Fv或其它保留亲代抗体的抗原结合功能的片段。单链抗体(“ScFv”)及它们的构建方法在美国专利4,946,778中描述。
“单链抗体”(scFv)由单个多肽链组成，其包含连接于VH结构域的VL结构域，其中VL结构域和VH结构域配对形成单价分子。单链抗体可以根据本领域已知方法制备(参见例如Bird et al.,(1988)Science242:423-426和Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)、“二价抗体”由两条链组成，每条链包含在同一多肽链上的由短肽接头连接的重链可变区和轻链可变区，其中同一链上的两个区域互相不配对，而是与另一条链上的互补结构域配对形成双特异性分子。制备二价抗体的方法是本领域已知的(参见例如，Holliger P.et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448和Poljak R.J.et al.,(1994)Structure2:1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的小功能性结合单位，相应于抗体的重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体及其生产方法的进一步细节是本领域已知的(参见例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；WO04/003019和WO03/002609)。纳米抗体衍生自抗体的重链。纳米抗体通常包含单个可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)，并且保留原始抗体的抗原结合能力。纳米抗体可以用本领域已知的方法制备(参见例如，美国专利6,765,087，美国专利6,838,254，WO06/079372)。Unibody由IgG4抗体的一个轻链和一个重链组成。Unibody可以通过除去IgG4抗体的铰链区而制备。Unibody及其制备方法的进一步细节可见于WO2007/059782。
除了结合部分之外，本发明的分子可以另外包含用于增加分子的体内半衰期的部分，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。这种另外的部分可以用本领域熟知方法与结合部分缀合或其它方式组合。
本发明的另一方面提供了编码本发明第一方面的CD134结合分子的氨基酸序列的核酸分子。由所述核酸分子编码的氨基酸序列可以是完整抗体的任何部分，如CDR、包含1、2或3个CDR的序列或重链或轻链的可变区，或者可以是全长重链或轻链。在一些实施方案中，所述核酸分子编码这样的氨基酸序列，其包含(1)抗体克隆12H3和/或20E5的CDR3区域，特别是重链CDR3区域；(2)抗体克隆12H3和/或20E5的重链可变区或轻链可变区；或者(3)抗体克隆12H3和/或20E5的重链或轻链。在其它实施方案中，核酸分子编码多肽，所述多肽包含选自SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17、18或19或者选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列。
本文提供的核酸分子可以得自产生本发明的CD134抗体的任何来源。来自产生抗CD134抗体的细胞的mRNA可以通过标准技术分离，用PCR及文库构建技术克隆和/或扩增，并用标准方案筛选以获得编码抗CD134抗体的氨基酸序列的核酸分子。mRNA可以用于产生cDNA，用于抗体基因的聚合酶链反应(PCR)或者cDNA克隆。在一个实施方案中，核酸分子得自如上所述表达抗CD134抗体的杂交瘤，优选具有表达人免疫球蛋白基因的非人转基因动物细胞作为其融合配偶体之一的杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤衍生自非人、非转基因动物。
编码抗CD134抗体的重链的核酸分子可以通过将编码重链可变区的核酸分子与编码重链恒定区的核酸分子融合而构建。类似地，编码抗CD134抗体的轻链的核酸分子可以通过将编码轻链可变区的核酸分子与编码轻链恒定区的核酸分子融合而构建。编码VH和VL链的核酸分子可以通过分别插入到已经编码重链和轻链恒定区的表达载体中，以使VH区段与载体内的重链恒定区(CH)区段有效连接，VL区段与载体内的轻链恒定区(CL)区段有效连接，而转化为全长抗体基因。或者，通过连接，例如使用标准分子生物学技术将编码VH链的核酸分子与编码CH链的核酸分子连接，将编码VH或VL链的核酸分子转化为全长抗体基因。使用编码VL和CL链的核酸分子能同样实现。编码全长重链和/或轻链的核酸分子继而可以从它们所导入的细胞中表达，并且分离抗CD134抗体。
核酸分子可以用于重组表达大量抗CD134抗体，如下所述。核酸分子也可以用于产生本文所提供的其它结合分子，如嵌合抗体、单链抗体、免疫粘附素、二价抗体、突变的抗体及抗体衍生物，如本文它处所述。在一个实施方案中，核酸分子用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可以用于诊断方法中，或者核酸分子PCR引物可以用于扩增DNA区域，该DNA区域可以特别用于分离用于产生抗CD134抗体的可变区的核酸序列。
一旦获得编码抗CD134抗体的VH和VL节段的DNA分子，这些DNA分子可以通过重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或者scFv基因。
本发明的另一方面提供了载体，其包含本文上述的核酸分子。核酸分子可以编码轻链或重链的部分(如CDR或可变区)、全长轻链或重链、包含重链或轻链的部分或全长的多肽，或者抗体衍生物或抗原结合片段的氨基酸序列。
合适的表达载体的例子是编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的表达载体，其具有工程化的合适的限制性位点，从而可以插入和表达任何VH或VL序列。表达载体也可以编码促进抗体链的氨基酸序列从宿主细胞分泌的信号肽。可将编码抗体链的氨基酸序列的DNA克隆进载体，以使信号肽符合读框地连接至抗体链氨基酸序列的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。除了编码抗CD134抗体的氨基酸序列的核酸序列(抗体链基因)以外，表达载体携带调控序列，控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可以依赖于这样的因素，如待转化宿主细胞的选择、希望的蛋白质表达水平等等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，如启动子和/或增强子，其衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒及强哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。
宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物、细菌或酵母细胞。适合作为宿主细胞的哺乳动物细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、PER-C6细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞瘤细胞(例如HepG2)、人肺细胞、A549细胞及许多其它细胞系。昆虫细胞系的例子包括Sf9或Sf21细胞。植物宿主细胞的例子包括烟草(Nicotiana)、拟南芥(Arabidopsis)、浮萍(duckweed)、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌(Streptomyces)种。酵母宿主细胞的例子包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
由不同细胞系或在转基因动物中表达的结合分子的氨基酸序列可以具有不同糖基化。但是，由本文提供的核酸分子编码的或者包含本文提供的氨基酸序列的所有结合分子是本发明的一部分，无论结合分子的糖基化如何。
本发明的另一方面提供了用噬菌体展示产生上述定义的CD134结合分子的方法。所述方法包括(a)在噬菌体上合成人抗体文库，(b)用CD134或其部分筛选文库，(c)分离结合CD134或其部分的噬菌体，和(d)从噬菌体获得抗体。用于制备抗体文库的一个示例性方法包括步骤：(a)用CD134或其抗原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答；(b)从免疫动物中提取产生抗体的细胞；(c)从提取的细胞中分离编码抗CD134抗体的重链和轻链的RNA；(d)逆转录RNA产生cDNA；(e)扩增所述cDNA；及(f)将所述cDNA插入噬菌体展示载体，从而在噬菌体上表达抗体。通过筛选重组组合抗体文库可以分离重组抗人CD134抗体或其抗原结合片段。所述文库可以是scFv噬菌体展示文库，其用分离自B细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNA而产生。制备和筛选这种文库的方法是本领域已知的。产生噬菌体展示文库的试剂盒商业可得。
在本发明一个优选实施方案中，提供了组合物，例如药物组合物，其含有本文描述的结合分子的一种或其组合，及任选地药物学可接受的载体。组合物可以通过本领域已知的常规方法制备。在一些实施方案中，组合物包含抗CD134抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，组合物包含抗体克隆12H3和/或克隆20E5，或者任一抗体的抗原结合片段。在其它实施方案中，组合物包含抗体克隆12H3和/或克隆20E5的衍生物。术语“药物学可接受的载体”是指任何适用于在制剂中递送结合分子的无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、填充剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗细菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。
本发明的非肽分子可以口服施用，包括经悬液、片剂等施用。液体制剂可以通过吸入冻干或气溶胶微囊而施用。也可以使用栓剂。可以使用另外的药物学运载体以控制本发明分子的作用时间。选择的制剂的剂量和时序安排可以通过本领域熟知的标准程序确定。这种程序涉及从动物模型外推估计的剂量方案，然后在人类临床剂量范围研究中确定最佳剂量。
组合物可以是任何合适形式，如液体、半固体和固体剂型。组合物的各种剂型可以用本领域已知的常规技术制备。
组合物中所包括的结合分子的相对量根据许多因素变化，如希望的释放及药动学特征、使用的特定结合分子和载体及剂型。在单个剂型中结合分子的量通常是产生治疗效果的量，但是也可以更少量。通常，这个量范围是相对于剂型总重量的大约0.001％至大约99％、大约0.1％至大约70％或者大约1％至大约30％。
除了结合分子之外，一或多种另外的治疗剂可以包括在组合物中，或者单独作为同一治疗方案的一部分。所述另外的治疗剂的例子在以下描述。组合物中所包括的另外的治疗剂的合适量可以由本领域技术人员容易地选择，并且根据一些因素变化，如使用的特定试剂和载体、剂型以及希望的释放和药动学特征。单剂型中所包括的另外的治疗剂的量通常是产生治疗效果的药剂量，但也可以是更少量。
本文提供的结合分子和包含结合分子的药物组合物用于治疗、诊断或其它目的，如增强免疫应答、治疗癌症、增强其它癌症治疗的功效或者增强疫苗功效，并且具有许多用途，如用作药物或诊断剂。因此，在本发明的优选方面，提供了使用结合分子或药物组合物的方法。
本发明进一步方面提供了调节人CD134介导的抗肿瘤免疫应答的方法，包括用结合人CD134的结合分子增强表达人CD134的人Teff效应功能和/或减弱表达人CD134的人Treg抑制功能，所述结合分子包括抗人CD134抗体，其(1)防止天然存在的人OX40L与人CD134受体的相互作用和/或(2)在人CD134被天然存在的人OX40L占据后，不阻断人CD134介导的细胞信号传导。
本发明另一方面提供了调节人CD134介导的抗肿瘤免疫应答的方法，其中所述方法不包括结合人CD134的结合分子，所述结合分子包括抗人CD134抗体，如人OX40L模拟物，其与人CD134受体上的OX40L结合结构域相互作用和/或阻断人OX40L-人CD134细胞信号传导。
本发明公开了用于抗肿瘤治疗目的的结合人CD134的结合分子，包括抗人CD134抗体。所述抗人CD134抗体结合人CD134的胞外结构域。更具体地，所述抗人CD134抗体结合激活的人Teff和人Treg上的人CD134的胞外结构域上的非OX40L结合区域(即所述抗人CD134抗体不完全阻断人OX40L与人CD134的结合)。
在一个特定方面，提供了增强哺乳动物免疫应答的方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的本文描述的结合分子。在一些实施方案中，结合分子是抗CD134抗体或其抗原结合片段，并且哺乳动物是人。在另外的实施方案中，结合分子是抗体克隆12H3和/或克隆20E5，或任一抗体的抗原结合片段。术语“增强免疫应答”是指刺激、激起、增加、改善或增强哺乳动物免疫系统的任何应答。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或者体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是初次或再次免疫应答。增强免疫应答的例子包括增加的CD4+辅助T细胞活性及产生细胞毒性T细胞。免疫应答的增强可以用本领域技术人员已知的一些体外或体内测量进行评估，包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定，细胞因子释放(例如IL-2的产生)，肿瘤消退，携带肿瘤动物的存活，抗体产生，免疫细胞增殖，细胞表面标记表达及细胞毒性。在一个实施方案中，所述方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。
本发明的一个方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在所述结合分子的饱和浓度或在其饱和浓度以上，如实施例2(f)所述，通过基于荧光的流式细胞术测定，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用降低不超过70％。更优选地，对OX40L与CD134的结合作用降低不超过大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，或者优选完全不降低结合。
本发明的另一方面提供了结合分子，其中在70nM结合分子浓度，如实施例2(f)所述，通过基于荧光的流式细胞术测定，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用降低不超过70％。更优选地，对OX40L与CD134的结合作用降低不超过大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，或者优选完全不降低结合。
本发明另一方面提供了结合分子，其与如下抗体竞争结合人CD134，所述抗体包含(1)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变区和(2)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区，如通过流式细胞术测量的在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的所述结合分子与荧光标记的所述抗体之间的交叉竞争所示(在实施例2(e)中进一步描述)。优选地，当通过针对所述结合分子的交叉竞争测定时，在其饱和浓度或饱和浓度以上，所述抗体的结合被降低至少大约50％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％或更多，优选被废止。
本发明另一方面提供了结合分子，其与如下抗体竞争结合人CD134，所述抗体包含(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链可变区和(2)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区，如通过流式细胞术测量的在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的所述结合分子与荧光标记的所述抗体之间的交叉竞争所示(在实施例2(e)中进一步描述)。优选地，当通过针对所述结合分子的交叉竞争测定时，在其饱和浓度或饱和浓度以上，所述抗体的结合被降低至少大约50％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％或更多，优选被废止。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子增强人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子增强人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步增强人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子增强人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不抑制或防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子进一步不阻止人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子抑制人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不抑制或防止人CD134(OX40)受体与OX40配体(OX40L)的结合，并且其中所述结合分子抑制人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
测量OX40L与抗CD134抗体的同时结合的合适方法描述如下。在不存在抗人CD134抗体的情况下，在PHA刺激的表达人CD134的PBMC上结合的人OX40L的FITC荧光信号(几何平均或平均荧光密度(MFI))设为100％。在不存在人OX40L的情况下，在PHA刺激的表达人CD134的PBMC上结合的抗人CD134抗体的PE荧光信号(MFI)设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到PHA刺激的表达人CD134的PBMC时，该FITC荧光信号及PE荧光信号的降低优选不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低。
测量对OX40L介导的Teff的增殖性应答的阻碍的丧失的合适方法如下。在人OX40L处理后，在表达人CD134的Teff中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的变化(即消耗或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更小。
测量对OX40L介导的Teff的增殖性应答的增强的合适方法如下。在人OX40L处理后，在表达人CD134的Teff中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的增强优选大于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％或更大。
测量对OX40L介导的Treg的抑制功能的阻碍的丧失的合适方法如下。在人OX40L处理后，在与表达人CD134的Teff共培养的表达人CD134的Teff(例如Teff/Treg比率＝1:1)中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到与表达人CD134的Teff共培养的激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff(例如Teff/Treg比率＝1:1)时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的变化(即消耗或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更小。
测量对OX40L介导的Treg的抑制功能的增强的合适方法如下。在人OX40L处理后，在与表达人CD134的Teff共培养的表达人CD134的Teff(例如Teff/Treg比率＝1:1)中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到与表达人CD134的Teff共培养的激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff(例如Teff/Treg比率＝1:1)时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的增强优选大于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％或更大。
测量对OX40L介导的Treg的增殖性应答的阻碍的丧失的合适方法如下。在人OX40L处理后，在表达人CD134的Treg中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Treg时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的变化(即消耗或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更小。
测量对OX40L介导的Treg的增殖性应答的抑制的合适方法如下。在人OX40L处理后，在表达人CD134的Treg中的氚代胸苷或BrdU掺入设为100％。当人OX40L和抗人CD134抗体被同时加入到激活的(例如PHA刺激的或者抗CD3/抗CD28珠刺激的)表达人CD134的Treg时，这种氚代胸苷或BrdU掺入的降低优选大于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％或更大。
本发明另一方面提供了在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的结合分子。
在本发明进一步优选实施方案中，所述结合分子是抗体克隆12H3和/或克隆20E5，或者任一抗体的抗原结合片段。在进一步实施方案中，哺乳动物是人。
在本发明另一个优选实施方案中，提供了在哺乳动物中预防癌症的方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的本文所述的结合分子。
术语“预防癌症”是指在哺乳动物中延迟、抑制或防止癌症发作，所述哺乳动物中癌发生或肿瘤发生的起始尚未得到证实，但是通过例如遗传筛查或其它方法确定，已鉴定了癌症易感性。该术语还包括治疗具有癌变前病症的哺乳动物以终止所述癌变前病症向恶性肿瘤的进展或导致其消退。癌变前病症的例子包括增生、发育异常和化生。在一些实施方案中，结合分子是本文所述抗CD134抗体或其片段。在本发明进一步实施方案中，提供了选自抗体克隆12H3和/或克隆20E5或任一抗体的抗原结合片段的结合分子。在进一步实施方案中，哺乳动物是人。
各种癌症，包括恶性或良性的和/或原发或继发的，均可以用本发明的方法治疗或预防。此类癌症的例子是本领域技术人员已知的并且记载在标准教科书如Merck Manual of Diagnosis and Therapy(由Merck出版)中。
在本发明另一个实施方案中，结合分子可以作为单一治疗(monotherapy)单独施用，或者与一或多种另外的治疗剂或治疗联合施用。因此，本发明的另一个实施方案中提供了经联合治疗以治疗或预防癌症的方法，所述方法包括与一或多种另外的治疗或治疗剂联合施用本文公开的结合分子。术语“另外的治疗”是指不采用本文提供的结合分子作为治疗剂的治疗。术语“另外的治疗剂”是指非本文提供的结合分子的任何治疗剂。在一些实施方案中，结合分子是抗人CD134抗体克隆12H3和/或克隆20E5或任一抗体的抗原结合片段。在一个特定方面中，本发明提供了在哺乳动物中治疗癌症的联合治疗，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的与一或多种另外的治疗剂联合的本文提供的结合分子。在进一步实施方案中，哺乳动物是人。
许多种癌症治疗剂可以与结合分子联合使用。本领域技术人员了解可以与本文的方法和结合分子联合使用的其它癌症治疗的存在和发展，并且不会限于本文所述的治疗形式。可以用于癌症联合治疗中的另外的治疗剂的类别的例子包括(1)化疗剂，(2)免疫治疗剂，及(3)激素治疗剂。
术语“化疗剂”是指可以导致癌细胞死亡或者干扰癌细胞的分裂、修复、生长和/或功能的化学或生物学物质。化疗剂的例子包括WO2006/088639、WO2006/129163和US20060153808中公开的那些，其公开通过引用并入本文。
术语“免疫治疗剂”是指能增强哺乳动物免疫应答的化学或生物学物质。免疫治疗剂的例子包括：卡介苗(BCG)；细胞因子如干扰素；疫苗如MyVax个体化免疫治疗，Onyvax-P,Oncophage，GRNVACl，Favld，Provenge，GVAX，Lovaxin C，BiovaxID，GMXX和NeuVax；以及抗体如阿仑珠单抗(CAMPATH)，贝伐珠单抗(AVASTIN)，西妥普单抗(ERBITUX)，吉妥珠单抗奥佐米星(MYLOTARG)，替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN)，帕尼单抗(VECTIBIX)，利妥普单抗(RITUXAN,MABTHERA)，曲妥珠单抗(HERCEPTIN)，托西莫单抗(BEXXAR)，tremelimumab，CAT-3888，及在WO2003/040170中所公开的针对CD40受体的激动剂抗体。
术语“激素治疗剂”是指抑制或消除激素产生，或者抑制或抵消激素对癌细胞生长和/或存活的作用的化学或生物学物质。适合本文方法的此类治疗剂的例子包括在US20070117809中公开的那些。特定的激素治疗剂的例子包括他莫昔芬(NOLVADEX)，托瑞米芬(Fareston)，氟维司群(FASLODEX)，阿那曲唑(ARIMIDEX)，依西美坦(AROMASIN)，来曲唑(FEMARA)，醋酸甲地孕酮(MEGACE)，戈舍瑞林(ZOLADEX)和利普安(LUPRON)。本文的结合分子也可以与非药物激素治疗联合使用，如(1)除去全部或部分参与激素产生的器官或腺体如卵巢、睾丸、肾上腺和垂体的手术方法，及(2)放射治疗，其中患者器官或腺体接受足以抑制或消除靶激素产生的量的辐射。
本发明另一个实施方案中提供了通过联合治疗而治疗或预防癌症的方法，所述方法包括施用本文公开的结合分子及手术除去肿瘤。可以在所述手术之前、期间或之后对哺乳动物施用所述结合分子。
治疗癌症的联合治疗也包括本文提供的结合分子和放射治疗的联合，放射治疗如电离(电磁)放射治疗(例如X-射线或γ射线)及粒子束放射治疗(例如高线能量辐射)。辐射源可以在哺乳动物外部或内部。可以在放射治疗之前、期间或之后对哺乳动物施用所述结合分子。
可以经任何合适的肠内途径或肠胃外途径施用本文提供的结合分子和组合物。术语“肠内途径”施用是指经胃肠道的任何部分施用。肠内途径的例子包括口服、粘膜、含服(buccal)和直肠途径，或者胃内途径。“肠胃外途径”施用是指非肠内途径的施用途径。合适的施用途径和方法可以根据各种因素变化，如使用的具体抗体、希望的吸收速率、使用的具体制剂或剂型、被治疗的疾病的类型或严重性、具体作用位点及患者的状况，可以由本领域技术人员容易选择。
术语结合分子的“治疗有效量”是指有效用于预期治疗目的的量。例如，在增强免疫应答的背景中，“治疗有效量”是有效刺激、激起、增加、改善或增强哺乳动物免疫系统的任何应答的任何量。在治疗癌症的背景中，“治疗有效量”是足以在被治疗哺乳动物中产生任何希望的或有益的效果的任何量，如抑制癌细胞的进一步生长或扩散、癌细胞死亡、抑制癌症复发、降低与癌症相关疼痛或者改善哺乳动物的存活。在预防癌症方法中，“治疗有效量”是有效延迟、抑制或防止被施用结合分子的哺乳动物中的癌症的发作的任何量。
结合分子的治疗有效量通常范围在大约0.001至大约500mg/kg、更通常大约0.05至大约100mg/kg哺乳动物体重。例如，所述量可以是大约0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg或100mg/kg哺乳动物体重。在一些实施方案中，抗人CD134抗体的治疗有效量在大约0.1-30mg/kg哺乳动物体重的范围内。待施用的精确剂量水平可以由本领域技术人员容易确定，并且依赖于多种因素，如被治疗疾病的类型和严重性、采用的特定结合分子、施用途径、施用时间、治疗持续时间、采用的特定另外治疗、被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前医疗历史及本领域熟知的类似因素。
通常在多个情况下施用结合分子或组合物。单个剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每3个月或每年。示例性的治疗方案为每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或者每3-6个月施用一次。抗人CD134抗体的典型给药方案包括经静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用如下给药方案之一：(i)每4周一次，进行6个剂量，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，随后每3周一次1mg/kg体重。
本发明通过下述实施例进一步例证，它们不是以任何方式限制本发明范围。相反，应明了在阅读本发明描述之后可以提示本领域技术人员在不偏离本发明精神和/或所附权利要求书范围内可以采取各种其它实施方案、修饰及其等价物。
实施例
实施例1：小鼠抗人CD134(＝OX40)单克隆抗体的产生
(a).表达表面CD134的Sf9昆虫细胞的产生
编码人CD134蛋白的cDNA(GenBank ref CAB96543.1；参见SEQ IDNO.1)针对Sf9昆虫细胞(Spodotera frugiperda)表达而优化，并由GENEART,Regensburg,Germany合成(参见SEQ ID NO.2)。将该cDNA亚克隆进杆状病毒转移质粒pVL1393(BD transfection kit cat no.560129；BD Biosciences)中。随后用含有编码人CD134的cDNA的转移质粒pVL1393和BaculoGold杆状病毒DNA(BD transfection kit)一起共转染Sf9细胞(ATCC)，然后在27℃温育4-5天。在这个共转染步骤后，收集上清并储存在4℃，并用于感染更多Sf9昆虫细胞进行病毒扩增。为此目的，用扩增的重组杆状病毒转染Sf9昆虫细胞，然后在27℃温育3-5天。收获这些Sf9昆虫细胞，用无菌PBS洗涤，并在PBS中以5x106细胞/250μl等分，储存在-80℃以获得细胞裂解物。在储存之前，用1:10藻红蛋白(PE)缀合的小鼠抗人CD134(cloneACT35；BD Biosciences)和流式细胞术证实转染的Sf9昆虫细胞上的人CD134表面表达。
(b).免疫和小鼠抗人CD134单克隆抗体的产生
在第0天用约400μL人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物(250μL细胞裂解物等份+250μL完全弗氏佐剂；Sigma)对BALB/c小鼠(雌性，6周龄；Charles River Laboratories)进行皮下注射。在第21天和第42天用人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物和不完全弗氏佐剂(Sigma)进行类似的皮下注射。在第61天和第62天用不加佐剂的人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物(250μL/小鼠)进行腹腔内加强注射。在第65天，使用最初由and Milstein(Nature1975；256:p495-497)描述的标准杂交瘤技术，将来自免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)融合。杂交瘤被扩增、冷冻保存及经有限稀释而克隆，所述杂交瘤产生抗人CD134的抗体(小鼠IgG类别)(分别使用重组人CD134:人Fcγ融合蛋白(R&D Systems)和表达人CD134的PHA(Roche)刺激的CD4T细胞母细胞(见下述实施例2)作为靶标，用常规ELISA和流式细胞术技术筛选)。用蛋白G柱(GE Healthcare)纯化抗人CD134特异性单克隆抗体，产生小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3(小鼠IgG1κ同种型；用来自Roche的IsoStripTM Mouse Monoclonal antibodyIsotype Kit确定)和克隆20E5(小鼠IgG1κ同种型；同上)。
实施例2：流式细胞术表征小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5
(a).PHA刺激的人T淋巴细胞上的CD134表达
来自健康供体(知情同意)的人外周血单个核细胞(PBMC)在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上经密度离心分离。随后，在1-2x106PBMC/mL RPMI-1640培养基(Gibco)(含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco))中补加0、0.1、1.0或10.0μg/mL植物凝集素-M(PHA-M；Roche)，于37℃，5％CO2下培育1-3天。培养后，收获PBMC并且以1-2x106细胞/mL置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS/BSA/NaN3)(含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma)/0.05％NaN3，补加10％人集合血清(HPS；阻断Fcγ受体；BioWhittaker))的中。细胞用10μg/mL商业可得小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(小鼠IgG1同种型；BD Biosciences,Alphen aan de Rijn,TheNetherlands)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:20稀释的检测T淋巴细胞的荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的小鼠抗人CD3抗体(BDBiosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图1所示(来自每个供体的n＝1)，外周血衍生的未刺激的/静息的人T淋巴细胞不表达任何CD134，但是，PHA剂量依赖性刺激人CD3+T淋巴细胞表达表面CD134。当暴露于10μg/mL PHA时，激活的人CD3+T淋巴细胞上的CD134表达水平似乎在“第1天”和“第2天”之间达到稳定，但是，在实验期间人CD134+/CD3+T淋巴细胞百分比时间依赖性增加。
(b).PHA刺激的人CD4T淋巴细胞亚群上的CD134表达
PHA刺激(以0和10μg/mL刺激1天，见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)的PBS/BSA/NaN3。细胞与1:10稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)，或1:10稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)与1:10稀释的商业可得的PE缀合的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(BD Biosciences)的组合在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图2所示，在PHA刺激的人CD4+T淋巴细胞上观测到CD134表达，但是在静息的人CD4+T淋巴细胞上未观测到。在PHA激活的人CD8+T淋巴细胞上发现CD134低表达，但是在静息的人CD8+T淋巴细胞上未发现(数据未示出)。
(c).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的结合
PHA刺激(以10μg/mL刺激2天，见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)的PBS/BSA/NaN3中。细胞在4℃与0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg/mL商业可得的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(小鼠IgG1同种型；BD Biosciences)，及自制的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:20稀释的检测T淋巴细胞的FITC缀合的小鼠抗人CD3抗体(BDBiosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图3所示(平均值±SD；结果在两个供体中观测)，小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35、克隆12H3及克隆20H5在大约5.0-10.0μg/mL使PHA刺激的CD3+T淋巴细胞上的人CD134表面分子饱和。使用这两个供体，在约0.5μg/mL观测到小鼠抗人CD134抗体克隆12H3的半数最大结合，在约2.5μg/mL观测到小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35及克隆20E5的半数最大结合。
(d).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上的结合
PHA刺激(以20μg/mL刺激1天，见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)的PBS/BSA/NaN3中。细胞在4℃与20.0μg/mL小鼠IgG1κ同种型对照(BD Biosciences)，或者与20.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或克隆20E5温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:100稀释的PE缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:20稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)，或者与1:20稀释的检测T淋巴细胞亚群的FITC缀合的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图4所示，证实小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3及克隆20E5在激活的人CD4+T淋巴细胞亚群上阳性染色，在激活的人CD8+T淋巴细胞亚群上低阳性染色。
(e).在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5与PE缀合的商品化的小鼠抗人CD134抗体的交叉竞争
PHA(以10μg/mL或20μg/mL分别刺激4天或1天，见上述)刺激产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)的PBS/BSA/NaN3中。细胞与20μg/mL未标记的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或与10μg/mL未标记的克隆20E5在4℃温育30分钟。细胞随后与1:20稀释的PE缀合的商业可得的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(BD Biosciences)或克隆L106(BD Biosciences；也参见Godfrey专利)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。PE缀合的商业可得抗CD134抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图5所示，与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3的预温育部分阻断了商业化的PE缀合的小鼠抗人CD134抗体克隆L106对PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134的结合。与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的预温育轻微阻断了商业化的PE缀合的小鼠抗人CD134抗体克隆L106对PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134的结合。与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5的预温育显示对商业化的PE缀合的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35与PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134的结合无作用。
这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3特异性识别PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134(部分阻断克隆L106结合)，以及结合(ii)人CD134上的与由商业化的小鼠抗人CD134抗体克隆L106所识别的表位不同的表位。这些结果还证实小鼠抗人CD134抗体克隆20E5(i)特异性识别PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134(轻微阻断L106结合)，以及(ii)结合与由商品化的小鼠抗人CD134抗体克隆L106所识别的表位不同的表位。另外，这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5看起来识别PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134表位，这些表位与由商业化的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35识别的表位不同。另外，这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5看起来识别PHA刺激的T淋巴细胞上的不相似的人CD134表位(分别由部分阻断vs轻微阻断L106结合所证实)。
(f).PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上重组人OX40配体与小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5的同时结合
PHA刺激(以10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)的PBS/BSA/NaN3中。细胞与10.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40配体(OX40L；R&D Systems)和50.0μg/mL抗聚组氨酸抗体(小鼠IgG1,clone AD1.1.10；R&D Systems)的组合在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:100稀释的FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与10.0μg/mL生物素化(使用来自Pierce的N-羟基琥珀酰亚胺基生物素)小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或克隆20E5在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:100稀释的PE缀合的链霉抗生物素蛋白(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。人OX40L及抗人CD134抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图6所示，在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5均与人OX40L同时结合。这表明小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3及克隆20E5不与人CD134受体上的OX40L结合区域内的表位相互作用。这个发现与商业可得的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆L106(StanfordUniversity/Godfrey patent EP0 726 952B1)相反，克隆L106识别人CD134受体的人OX40L结合区域内的表位(Taylor and Schwarz.J Immunol Methods2001；255:67-72；Kirin&La Jolla Institute/Croft patent WO2007/062235A2)。
(g).在用抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激后在人效应和调节T淋巴细胞上的CD134表达
人CD4T淋巴细胞通过使用微珠缀合的小鼠抗人CD4抗体(MiltenyiBiotec)和VarioMACSTM Magnet/LS柱(Miltenyi Biotec)经阳性选择而从PBMC中纯化。随后，这些CD4T淋巴细胞用FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(Dako)和PE缀合的小鼠抗人CD25抗体(BD Biosciences)染色。CD4+/CD25-常规效应T淋巴细胞(Teff)和CD4+/CD25high调节T淋巴细胞(Treg)用Altra流式细胞术细胞分选仪分选(Beckman-Coulter)。这导致大于95％Teff和大于95％Treg的富集。将Teff和Treg以2.5x105细胞/mL置于补加0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％热失活HPS(HPSi；来自LMI)的RPMI-1640/glutamax培养基(Gibco)中。然后，细胞以2.5x104细胞/200μL/孔接种于96孔圆底平板(Greiner)中，并且在25U/mL重组人白介素-2(来自Novartis PharmaceuticalsUK Ltd)存在下用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)以1个珠/2个细胞在37℃，5％CO2下刺激2-8天。培养后，收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/0.2％BSA中，并且同时用1:50稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(Dako)、1:10稀释的PE缀合的小鼠抗人CD25抗体(BD Biosciences)、1:50稀释的ECDTM缀合的小鼠抗人CD3抗体(Beckman-Coulter)、1:10稀释的PE-CyTM5缀合的小鼠抗人CD134抗体(克隆ATC35；BD Biosciences)和1:10稀释的PE-CyTM7缀合的小鼠抗人CD127抗体(eBiosciences)染色。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图7所示(来自每个供体的n＝1)，外周血纯化的未刺激的/静息的(第0天)人Teff和人Treg不表达任何CD134，但是，CD3/CD28珠刺激的人Teff和人Treg表达表面CD134。在激活的人Teff和人Treg上的CD134表达在培养2天后达到峰值，在培养5和8天后减弱。
实施例3：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的生物学表征
(a).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
PHA刺激(以0和10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2x106细胞/mL悬浮于含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中。细胞以0.1x106细胞/100μL/孔(即1x106细胞/mL)接种于96孔圆底平板(Corning)中，并在37℃，5％CO2下暴露于0、0.025、0.25、2.5或25.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5，和/或与0、0.01、0.1或者1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&D Systems)的组合6天。6天后，用比色(BrdU掺入)Cell Proliferation ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量细胞增殖。
如图8所示(平均值±SD，n＝4使用1个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5剂量依赖性诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在0.25、2.5和25μg/mL诱导增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在2.5和25μg/mL诱导增殖。另外，人OX40L也剂量依赖性诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖。人OX40L在0.1和1.0μg/mL诱导增殖。静息的(无PHA刺激)人CD134-T淋巴细胞在用小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3、小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5或人OX40L处理后不显示任何增殖性应答(数据未示出)。
如图9所示(平均值±SD，n＝2使用1个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3(在2.5和25μg/mL)、小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5(2.5和25μg/mL)及人OX40L(1.0μg/mL)诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖。未处理的(仅培养基)或者用小鼠IgG1κ同种型对照(2.5和25μg/mL；BD Biosciences)处理未显示对PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何作用。2.5和25μg/mL(或者更低浓度；数据未示出)的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或者2.5和25μg/mL(或者更低浓度；数据未示出)的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5与1.0μg/mL(或者更低浓度；数据未示出)的人OX40L的组合未显示对PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何交互(reciprocal)(即协同或加和或者甚至抑制性)作用。
(b).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后抗人CD3/抗-CD28珠刺激的表达人CD134的T效应淋巴细胞和T调节淋巴细胞的增殖
用针对人CD8(克隆RPA-T8)、CD14(克隆M5E2)、CD16(克隆3G8)、CD19(克隆4G7),CD33(克隆P67.6)、CD56(克隆B159)和CD235a(HIR2)的小鼠抗体混合物(BD BioSciences)，经阴性选择从PBMC中纯化人CD4T淋巴细胞。在与缀合的绵羊抗小鼠IgG(Invitrogen)温育后，从Dynal Magnetic Particle Concentrator,MPCTM-6(Invitrogen)中收集未结合的CD4T淋巴细胞。从这些富集的CD4T淋巴细胞中，用10μL微珠缀合的小鼠抗人CD25抗体(Miltenyi Biotec)/107细胞和MiniMACSTM Magnet/MS柱(Miltenyi Biotec VarioMACSTM Magnet/LS柱(Miltenyi Biotec)经MACS分选分离CD25high Treg和CD25-Teff。这导致大于90％Teff和大于90％Treg的富集。将Teff和Treg以0.25x106细胞/mL置于补加0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％HPSi的RPMI-1640/glutamax培养基(Gibco)中。然后，Teff和Treg以2.5x104细胞/200μL/孔(即0.125x106细胞/mL)接种于96孔圆底平板(Greiner)中，并且用CD3/CD28珠(Invitrogen)以1个珠/5个细胞在37℃，5％CO2下刺激4或5天，进行所述刺激时存在或不存在5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3、5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5、1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比的小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&D Systems)、5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比的小鼠抗聚组氨酸抗体存在下)的组合，或者5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5与1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比的小鼠抗聚组氨酸抗体存在下)的组合。在4或5天后，细胞增殖用0.5μCi氚代胸苷(Perkin&Elmer)掺入和β-计数器(Canberra-Packard)测量。
如图10所示(平均值±SD)，尽管CD3/CD28刺激珠在表达人CD134的Teff中单独诱导可观的增殖(即培养基)，但是小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中诱导额外的增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中不诱导额外的增殖。
如图11所示(平均值±SEM，来自5个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中不诱导增殖或诱导低增殖，而人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中诱导非常强的增殖。
如图12A所示(平均值±SD)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与人OX40L的组合未显示在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中的任何交互(即抑制、协同或加和)作用。另外，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5与人OX40L的组合未显示在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中的任何交互(即抑制、协同或加和)作用(数据未示出)。
如图12B所示(平均值±SD)，与在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中观测到的对人OX40L介导的增殖性应答(缺少任何)的作用相比，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中强烈抑制人OX40L介导的增殖性应答。.
(c).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后抗人CD3/抗CD28珠刺激的表达人CD134的T调节淋巴细胞的抑制功能
如上述实施例3(b)所述从PBMC中纯化人CD4T淋巴细胞，并富集Teff和Treg。将Teff和Treg以0.25x106细胞/mL置于补加0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％HPSi的RPMI-1640/glutamax培养基(Gibco)中。然后Teff以2.5x104细胞/200μL/孔(即,0.125x106Teff/mL)接种于96孔圆底平板(Greiner)中并与2.5x104抑制性Treg/200μL/孔(即，0.125x106Treg/mL；Teff/Treg比率＝1:1)共培养。这些Teff/Treg共培养物用CD3/CD28珠(Invitrogen)以1个珠/10个细胞在37℃，5％CO2下刺激5天，进行所述刺激时存在或不存在5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3、5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比的小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&D Systems)。5天后，细胞增殖用0.5μCi氚代胸苷(Perkin&Elmer)掺入和β-计数器(Canberra-Packard)测量。
如图13所示(平均值±SD)，人Treg抑制CD3/CD28珠诱导的人Teff增殖性应答(即培养基)。人Treg的这种抑制功能在小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3存在下或者在人OX40L存在下被减弱(dampened)。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5显示对人Treg抑制功能无作用。
实施例4：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的分子遗传学表征
(a).同种型分型(Isotyping)及Edman降解
使用IsoStripTM Mouse Monoclonal Antibody Isotype Kit(Roche)，确定蛋白G纯化的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的免疫球蛋白类别、同种型及轻链类型，结果显示小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3均是具有κ轻链的小鼠IgG1。
在使用预成型凝胶系统(Invitrogen)在还原(DTT及70℃加热)条件下进行标准LDS-PAGE电泳后，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5电印迹到聚偏二氟乙烯(PDVF/Immobilon-P)转移膜(Millipore)上，并且用考马斯亮蓝(BioRad)染色。然后，从PVDF膜上切下轻链及重链条带(分别为50kDa和25kDa)，用于Edman降解分析(由EuroSequence,Groningen,The Netherlands进行)以确定N-末端氨基酸序列。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结果示于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.61。确定了来自重链的N-末端的11个氨基酸及来自轻链的N-末端的11个氨基酸。
(b).RT PCR
从细胞培养物收获克隆20E5和12H3的杂交瘤细胞。细胞用PBS洗涤，等分到各含有5x106个细胞的小瓶中，并以沉淀储存在-80℃。使用RNeasy Mini Isolation Kit(QIAGEN)分离细胞沉淀的RNA。确定RNA浓度(A260nm)并将RNA储存在-80℃。分离的RNA的总收率：克隆20E5为27.3μg，克隆12H3为58.4μg(两者A260/A280比率均为1.9)。通过逆转录酶，使用RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)从1μg RNA合成cDNA，并储存在-20℃。
基于小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的同种型(小鼠κ/IgG1)和Edman降解分析，设计了下述引物以扩增小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的V区：
*编号根据Bioceros内部编码系统；
**简并引物:N＝A,C,G或T,Y＝C或T,R＝A或G,W＝A或T,S＝G或C。
基于小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的同种型(小鼠κ/IgG1)及与编码小鼠信号肽的cDNA互补结合的有义引物(部分基于AntibodyEngineering Volume1Kontermann,Roland E.；Dübel,Stefan(Eds.),SpringerLab Manuals,2nd ed.,2010)，设计了下述引物以扩增小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的V区：
*编号根据Bioceros内部编码系统；
**简并引物:N＝A,C,G或T,Y＝C或T,R＝A或G,W＝A或T,S＝G或C，M＝C或A，K＝G或T。
引物201和266是反义引物，设计分别与小鼠κ基因的恒定区内位置214-232及236-255(基于登录号V00807[版本V00807.1])互补结合。
引物203和204是反义引物，设计分别与小鼠IgG1的恒定区内位置115-134及221-240(基于登录号J00453[版本J00453.1])互补结合。
引物259和260是有义简并引物(简并性分别为512和256)，与基于Edman降解的小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的重链的N-末端(分别为氨基酸1-8和2-9)互补结合。
引物265是有义简并引物(简并性为16)，与基于Edman降解的小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的轻链的N-末端(氨基酸1-7)互补结合。
引物416是反义的，设计与小鼠IgG1恒定区位置111-131(基于登录号J00453[版本J00453.1])互补结合。
引物394是反义的，设计与小鼠κ基因的恒定区位置235-254(基于登录号V00807[版本V00807.1])互补结合。
引物389、405和410是简并引物(简并性分别为2、8和8)，与小鼠抗体的信号肽序列互补结合。引物389设计针对轻链，引物405和410针对重链。
引物201、266、203、204、259、260和265以各种组合应用以扩增小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的可变区，引物416、394、405、410和389以各种组合应用以扩增小鼠抗人CD134抗体克隆12H3的可变区。使用产生的两个克隆的cDNA作为模板进行各种不同PCR。
使用AccuprimeTM Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)扩增小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和克隆12H3的重链和轻链的可变区。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析。PCR反应产物经凝胶纯化并且克隆进pCR-Blunt II-载体用于序列分析。从含有PCR插入序列的质粒中，使用T7经DNA测序分析了克隆的插入序列(由ServicXS B.V.,Leiden,The Netherlands or Macrogen,Amsterdam,The Netherlands进行)，以获得小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和12H3的V区的共有序列。对于小鼠抗CD134抗体克隆20E5获得了11个信息序列重链反应和3个信息轻链序列反应。对于小鼠抗CD134抗体克隆12H3获得了5个信息序列重链反应和3个信息轻链序列反应。基于这个信息，确定了两个抗体的V区的共有序列(见SEQ ID NO.4、5、12和13)。
本说明书中列出或论述了明显在先公开的文献，这不应必须被视为承认所述文献为该领域现状的一部分或为公知常识。
实施例5：嵌合人IgG4/κ和/或人IgG1/κ(即小鼠恒定结构域换成人IgG/κ恒定结构域)抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的产生
基于确定的小鼠抗CD134抗体克隆20E5和12H3的小鼠V区(见上述实施例4(b))，设计产生了嵌合人抗体版本。为此，从GENEART(Regensburg,Germany)购买了CHO细胞优化的cDNA序列(参见SEQ ID NO.20(编码嵌合人IgG4重链克隆20E5)，SEQ ID NO.21(编码嵌合人κ轻链克隆20E5)，SEQ ID NO.22(编码嵌合人IgG1重链克隆20E5)，SEQ ID NO.23(编码嵌合人IgG4重链克隆12H3)，和SEQ ID NO.24(编码嵌合人κ轻链克隆12H3))，其编码小鼠信号肽，其后为与人κ恒定区连接的可变轻链，或者与人IgG恒定区连接的可变重链。这个设计针对两个抗体进行，对于克隆20E5，可变重链与人IgG4或者与人IgG1恒定区连接；对于克隆12H3，可变重链与人IgG4恒定区连接。使用合适的限制酶，将产生的cDNA亚克隆进pcDNA3.1衍生的表达质粒中。嵌合抗体用FreeStyleTM MAX CHO(CHO-S细胞)Expression System(Invitrogen)表达。表达的抗体用亲和层析蛋白A柱(GE Healthcare)纯化。嵌合氨基酸序列参见SEQ ID NO.25，26，27，28和29。
实施例6：嵌合人IgG4/κ和/或IgG1/κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结合表征
(a).人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性T淋巴细胞上的结合表征
PHA刺激(以10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。细胞与0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:50稀释的FITC缀合的小鼠抗人IgG4抗体(Sigma)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:10稀释的PE缀合的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在大约5.0-10.0μg/mL使PHA刺激的CD4+T淋巴细胞上的人CD134表面分子饱和(数据未示出)。在约1.0μg/mL观测到嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5的半数最大结合(数据未示出)。
(b).嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上的结合
PHA刺激(以10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。细胞在4℃温育30分钟，有或无20.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性的)抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:10稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)或与1:10稀释的检测T淋巴细胞亚群的FITC缀合的小鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5证实在PHA激活的人CD4+T淋巴细胞亚群上的阳性染色，以及在PHA激活的人CD8+T淋巴细胞亚群上的低阳性染色(数据未示出)。
(c).嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上的结合
来自健康供体(知情同意)的人外周血单个核细胞(PBMC)在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上经密度离心分离。随后，在1x106PBMC/mL RPMI-1640培养基(Gibco)(含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco))中，用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)以1个珠/4个细胞，在25U/mL重组人白介素-2(PeproTech)不存在或存在下于37℃，5％CO2刺激1天。培养后，收获PBMC并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。细胞在4℃温育30分钟，有或无20.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性的)抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞与1:10稀释的FITC缀合的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)或与1:10稀释的检测T淋巴细胞亚群的FITC缀合的小鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BD Biosciences)。
如图14所示，嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5证实在CD3/CD28珠激活的人CD4+T淋巴细胞亚群上的阳性染色，及在CD3/CD28珠激活的人CD8+T淋巴细胞亚群上的低阳性染色。用重组人IL-2补剂未观测到明显作用。
实施例7：嵌合人IgG4/κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的生物学表征
(a).在用嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5处理后PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
PHA刺激(以10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2x106细胞/mL悬浮于含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中。细胞以0.1x106细胞/100μL/孔(即1x106细胞/mL)接种于96孔平底平板(Corning)中，并且在37℃，5％CO2暴露于25.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于25.0μg/mL对照人IgG4κ抗人CD40抗体(PG102；Pangenetics)，或者暴露于1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&D Systems)6天。6天后，用比色(BrdU掺入)Cell Proliferation ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量细胞增殖。
如图15所示(平均值±SD)，嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L诱导了PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖。未处理的(仅培养基)或者用对照人IgG4κ抗人CD40抗体(huIgG4)处理未显示对PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何作用。
(b).在用嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5与重组人OX40L的组合处理后PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
PHA刺激(以10μg/mL刺激1天；见上述)产生了表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2x106细胞/mL悬浮于含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中。细胞以0.1x106细胞/100μL/孔(即1x106细胞/mL)接种于96孔平底平板(Corning)中，并且在37℃，5％CO2下暴露于0、0.025、0.25、2.5或25.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或/和与0、0.01、0.1或1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&DSystems)的组合6天。6天后，用比色(BrdU掺入)Cell Proliferation ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量细胞增殖。
如图16所示(平均值±SD)，嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L剂量依赖性诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖。嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在2.5和25μg/mL(供体1)或者在0.25、2.5和25μg/mL(供体2)供体依赖性地诱导增殖。另外人OX40L在0.1和1.0μg/mL(供体1)或者在0.01、0.1和1.0μg/mL(供体2)供体依赖性地诱导增殖。
如图17所示(平均值±SD)，2.5和25μg/mL(或更低浓度；数据未示出)的嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)与0.1和1.0μg/mL(或更低浓度；数据未示出)的人OX40L的组合未显示对于PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖的任何交互(即协同或加和或者甚至抑制性)作用。
(c).在用嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5处理后抗人CD3/抗人CD28抗体刺激珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
来自健康供体(知情同意)的人外周血单个核细胞(PBMC)在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上经密度离心分离。随后，PBMC以0.1x106细胞/100μL/孔(即1x106细胞/mL)接种在96孔平底平板(Corning)中的RPMI-1640培养基(Gibco)(含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco))中，并用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)以1个珠/2个细胞在25U/mL重组人白介素-2(PeproTech)不存在或存在下于37℃，5％CO2进行刺激。1天或2天后，这些(无或有白介素-2)CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞在37℃，5％CO2下分别暴露于25.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于1.0μg/mL聚组氨酸标记的重组人OX40L(在1:5摩尔比的小鼠抗聚组氨酸抗体存在下；R&D Systems)6天或5天。在细胞增殖测量之前，最初用CD3/CD28珠加重组人白介素-2组合刺激的细胞用25U/mL重组人白介素-2再刺激1天。在暴露于嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或暴露于人OX40L6天或5天之后，用比色(BrdU掺入)Cell Proliferation ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量细胞增殖。
如图18所示(平均值±SD,n＝3，使用1个供体)，尽管CD3/CD28刺激珠单独诱导了可观的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖(即培养基)，嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中诱导了额外的增殖。加入白介素-2看起来仅增加CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中的基础(即培养基)增殖。
(d).在用人(嵌合)抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后恒河猴(rhesus macaque monkeys)中的免疫刺激应答
非人灵长类恒河猴可以用猿猴免疫缺陷病毒蛋白gp130免疫，如Weinberg et al.(J Immunother2006；29:575-585)所述。
与对照免疫接种的猴相比，来自用人(例如嵌合或人源化或去免疫化的(deimmunized)；例如亚类人IgG1或IgG4)的抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理的免疫接种猴的引流淋巴结预期显示肿大淋巴结。与对照相比，人(例如嵌合或人源化或去免疫化的)的抗人CD134抗体克隆12H3处理的及20E5处理的猴预期显示增加的gp130特异性抗体效价，及增加的长时间T细胞应答。在(例如嵌合或人源化或去免疫化的)抗人CD134抗体克隆12H3处理的或克隆20E5处理的猴中应该没有明显的毒性迹象。
实施例8：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的人CD134结构域和表位的表征
(a).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与非还原的和还原的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的结合(western印迹)
在各种非还原和还原条件下(见图19-A)，在预成型LDS-PAGE变性电泳系统中，使用4-12％Tris-Bis凝胶和MOPS电泳缓冲液(Invitrogen)对1300或650ng/泳道(用于考马斯亮蓝染色)或者250ng/泳道(用于western印迹)重组人CD134:人Fcγ(IgG1)融合蛋白(R&D Systems)进行电泳。然后，重组人CD134:人Fcγ融合蛋白用考马斯亮蓝(BioRad)染色或者电印迹到聚偏二氟乙烯(PDVF)转移膜(Millipore)上。在用PBS/0.05％Tween20/1％BSA级分V(Roche)在室温封闭20分钟后，将PDVF膜与100ng/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或20E5在室温温育1小时。平行地，将100ng/mL小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BD Biosciences)用作阴性对照。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或20E5的结合用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温测定1小时，之后用TMB底物的即用溶液(Sigma)进行比色检测。
如图19-B所示，重组人CD134:人Fcγ融合蛋白在非还原(及不进行和进行热变性的LDS变性，分别为条件a和b)条件下证实分子质量为约130-140kDa。不加热的非还原(条件a)显示紧密相邻的2条带，提示重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的级分不完全变性/展开。加热的非还原(条件b)显示1条带，提示重组人CD134:人Fcγ融合蛋白完全变性/展开。重组人CD134:人Fcγ融合蛋白在还原(及不进行和进行热变性的LDS变性，分别为条件c和d)条件下产生约110kDa条带(条件c)和约60-65kDa条带(条件d)。前一观测提示重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的不完全还原，后一观测提示每个重组人CD134:人Fcγ融合蛋白分子内的连接2个人IgG1衍生的Fcγ片段的二硫键的完全还原/断裂。
如图19-C所示，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5在非还原(及不进行和进行热变性的LDS变性，分别为条件a和b)条件下均识别重组人CD134:人Fcγ融合蛋白，主要在约130kDa。相比之下，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3显示在还原(及不进行和进行热变性的LDS变性，分别为条件c和d)条件下与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白仅轻微结合，而小鼠抗人CD134抗体克隆20E5显示在还原(及不进行和进行热变性的LDS变性，分别为条件c和d)条件下与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白强结合。
这些结果证实小鼠抗人CD134克隆12H3和克隆20E5特异性识别人CD134。另外，这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5看起来识别不同的人CD134表位，这由在还原(及不进行和进行热变性的LDS变性)条件下与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的轻微结合(克隆12H3)vs强结合(克隆20E5)所证实。这些结果提示小鼠抗人CD134抗体克隆12H3识别人CD134上的对变性(LDS和热处理)不敏感及对还原(即DTT对二硫键的断裂，很可能是富半胱氨酸结构域(CRD)相关的)敏感的表位。这些结果提示小鼠抗人CD134抗体克隆20E5识别人CD134上的对变性(LDS和热处理)不敏感及对还原(即DTT对二硫键的断裂，很可能是富半胱氨酸结构域(CRD)相关的)不敏感的表位。
(b).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与293-F细胞系上全长人CD134构建体和各种截短的人CD134构建体的结合(结构域定位)
为了分析小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的精细特异性，通过结构域定位确定由小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的表位的位置。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5结合(HEK衍生的)297-F细胞表面上表达的截短的人CD134构建体的能力经FACS分析确定。
基于文献(Swiss-Prot:P43489.1；Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683；Bodmer et al.Trends Biochem Sci2002；27:19-26；Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330；US专利2011/0028688A1)，鉴定了人CD134胞外区中的富含半胱氨酸结构域(CRD)和铰链样结构。CRD被编号为CRD1、CRD2、(截短的)CRD3、(截短的)CRD4(见图20)。CRD含有拓扑学独立的模块类型，称为A模块和B模块(也见图20)。A模块是C形结构，B模块是S形结构。典型的CRD通常由A1-B2模块或A2-B1模块(或者较不常见的不同的模块对，如A1-B1)组成，具有6个保守半胱氨酸残基，其中数字代表每个模块中的二硫键数目(也见图20)。如图20所示，制备和表达5个不同的人CD134构建体：(1)全长人CD134构建体，其起自N-末端CRD1(即CRD1A1-B2模块覆盖氨基酸29-65)，因此称为“CRD1”，并且包含氨基酸1-277(见SEQ ID NO.1),(2)“CRD2”构建体，其起自N-末端CRD2(即CRD2A1-B2模块覆盖氨基酸66-107)并且包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸66-277(见SEQ ID NO.30)，(3)“CRD3”构建体，其起自N-末端CRD3(即CRD3A1-B1模块覆盖氨基酸108-146(根据Compaan etal.Structure2006；14:1321-1330)或者截短的CRD3A1模块覆盖氨基酸108-126(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683))，并且包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸108-277(见SEQ ID NO.31)，(4)“CRD4”构建体，其由N-末端CRD4或CRD3亚结构域B1模块/截短的CRD4A1模块组成(即CRD4A1-B1-模块覆盖氨基酸127-167(Latza et al.Eur JImmunol1994；24:677-683)或者CRD3亚结构域B1模块与截短的CRD4A1模块的组合(图20未示出)分别覆盖氨基酸127-146和氨基酸147-167(Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330))，并且包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸127-277(见SEQ ID NO.32)，(5)“截短的(tc)CRD4”构建体，其由N-末端截短的CRD4或CRD4亚结构域B1模块组成(即截短的CRD4A1模块覆盖氨基酸147-167(Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330)或者CRD4亚结构域B1模块(图20未示出；Latza et al.Eur JImmunol1994；24:677-683)覆盖氨基酸147-167)，并且包含与信号肽1-28连接的氨基酸147-277(见SEQ ID NO.33)。通过使用AccuprimeTM Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)的组装PCR，这5个人CD134构建体使用下表中的引物产生：
*根据Bioceros内部编码系统的引物编号
简而言之，编码信号肽氨基酸1-28的cDNA和编码人CD134的氨基酸66-277的cDNA在用全长人CD134作为模板的PCR反应中分别用引物对362/365和364/363进行扩增。随后，在使用引物对362/363的组装PCR中使用这两个PCR产物产生“CRD2”构建体。编码“CRD2”构建体的cDNA使用合适的限制位点亚克隆进pcDNA3.1衍生的表达质粒中。类似地，用上表中所示相应引物产生了“CRD3”构建体(信号肽氨基酸1-28连接于人CD134的氨基酸108-277)、“CRD4”构建体(信号肽氨基酸1-28连接于氨基酸127-277)及“截短的CRD4”构建体(信号肽氨基酸1-28连接于氨基酸147-277)，并且亚克隆进pcDNA3.1衍生的表达质粒中。另外，全长人CD134(SEQ ID NO.1)也重新克隆进pcDNA3.1衍生的表达质粒中。
使用FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen)，用5个产生的人CD134变体瞬时转染FreeStyleTM293-细胞(Invitrogen)。在48-72小时后，用FACS分析转染细胞上的表面人CD134的表达。为此，收获转染细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。细胞与20.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在4℃温育30分钟。平行地，20.0μg/mL小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BD Biosciences)用作阴性对照。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗小鼠IgG(Fcγ特异性的)抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图21所示，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5均识别转染293-F细胞上的全长(称为“CRD1”构建体)人CD134，而小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5均显示在转染试剂对照转染的293-F细胞上无结合。另外，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5识别转染的293-F细胞上的截短的人CD134变体，所述变体缺少CRD1和CRD1-CRD2(分别称为“CRD2”构建体和“CRD3”构建体)。相比之下，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3对缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1模块的截短的人CD134变体(称为“CRD4”构建体)的结合非常弱，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3对缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaet al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330的定义；称为“tcCRD4”构建体)的截短的人CD134变体的结合完全丧失，而小鼠抗人CD134抗体克隆20E5对缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(称为“CRD4”构建体)及对缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330的定义；称为“tcCRD4”构建体)的截短的人CD134变体显示强结合。
这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5特异性识别人CD134(比较全长人CD134转染vs转染试剂对照转染)。另外，这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5看起来识别不同的人CD134表位，证据是各自缺乏结合(使用克隆12H3)vs与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(称为‘CRD4’构建体)的强结合及与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330的定义；称为“tcCRD4”构建体)的截短的人CD134变体的强结合(使用克隆20E5)。这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3看起来不识别CRD1和CRD2中的人CD134表位，小鼠抗人CD134抗体克隆20E5看起来不识别CRD1、CRD2及截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330的定义)中的人CD134表位。这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3看起来识别在胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-126(即19-聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQ ID NO.34)的截短的CRD3A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)中的线性或非线性/构象表位，或者氨基酸序列108-126(即19-聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQ ID NO.34)形成关键部分，以结合胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-214(见SEQ ID NO.35)的截短的CRD3A1-模块/CRD4A1-B1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)及可能的铰链样结构中的非线性/构象表位。这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆20E5看起来识别胞外人CD134上的具有氨基酸序列147-214(见SEQ ID NO.36)的截短的CRD4A1-模块(根据Compaanet al.Structure2006；14:1321-1330的定义)及可能的铰链样结构中的线性或非线性/构象表位。
使用晶体照相术，Compaan et al.(Structure2006；14:1321-1330)最近发现CD134上的CRD1、CRD2(特别是A1环及紧接其后的残基)和CRD3(主要是A1环)在OX40配体(CD252)/CD134(＝OX40)相互作用中至关重要。这个发现与我们的发现刚好符合，即(1，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆20E5看起来不识别胞外人CD134上的CRD1、CRD2和截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaan et al.Structure2006；14:1321-1330的定义)中的人CD134表位，以及(2，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆20E5同时与PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的人OX40L结合。这提示小鼠抗人CD134抗体克隆20E5识别人CD134上的一个表位，所述表位对人CD134与人OX40L的相互作用并不重要。另外，我们的发现，即(1，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆12H3看起来识别胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-126(即19聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQ ID NO.34)的截短的CRD3A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)中的线性或非线性/构象表位，或者氨基酸序列108-126(即19聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQ ID NO.34)形成关键部分，用以结合胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-214(见SEQ ID NO.35)的截短的CRD3A1-模块/CRD4A1-B1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)及可能的铰链样结构中的非线性/构象表位，以及(2，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆12H3同时结合PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的人OX40L，支持了这样的观点，即由小鼠抗人CD134抗体克隆12H3识别的人CD134上的表位(如上所述)人CD134与人OX40L的相互作用并不重要。
(c).使用人CD134衍生肽ELISA的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的表位定位(1)
为了进一步分析小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的精细特异性，通过表位定位确定由小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3识别的表位的位置。通过ELISA确定小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur JImmunol1994；24:677-683的定义)的氨基酸序列的人CD134衍生的肽结合的能力。
96孔平底ELISA平板(Corning)用10ng/孔人CD134衍生的肽(由Pepscan Presto,Lelystad,The Netherlands合成)，其相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(见SEQ ID NO.38)，或者用10ng/孔人纤连蛋白衍生的对照肽(由Pepscan Presto,Lelystad,TheNetherlands合成)，其相应于外III型结构结构域的氨基酸序列(见SEQ IDNO.37)，在PBS o/n中于4℃包被过夜。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSA级分V(Roche)中室温封闭1小时。随后平板与0，0.00005-50.0(在封闭缓冲液中10倍梯度稀释)μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或者小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BD Biosciences)室温温育1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，抗体的结合用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG Fcγ-特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温1小时确定，随后通过TMB底物的即用溶液(Invitrogen)进行比色检测。加入1M H2SO4后，用微板分析仪(BioRad)在波长450nm测量光密度(参考波长655nm)
如图23-A(n＝1)所示，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3剂量依赖性及特异性结合人CD134衍生的肽，而小鼠IgG1κ同种型对照抗体证实与人CD134衍生的肽无结合。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和IgG1κ同种型对照抗体均证实与人纤连蛋白衍生的对照肽无结合。
这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3特异性识别人CD134上的表位(对比人CD134衍生的肽vs人纤连蛋白衍生的对照肽)。另外，这些结果证实小鼠抗人CD134抗体克隆12H3看起来识别在胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-146(即39-聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN；见SEQ IDNO.38)的截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)中的线性或非线性/构象表位。
(d)使用Pepscan的CLIPS表位定位技术对小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的表位定位(2)
可以使用Pepscan的CLIPS表位定位技术(Lelystad,The Netherlands)确定由小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5识别的表位。CLIPS技术能确定涉及二聚或多聚蛋白质复合物的线性、构象、不连续及复杂表位。为此，人CD134＝OX40的线性氨基酸序列(SEQ ID NO.1)用作靶蛋白。
实施例9：由嵌合人IgG4/κ和/或IgG1/κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的人CD134结构域和表位的表征
(a).嵌合人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与293-F细胞系上表达的全长人CD134构建体和各种截短的人CD134构建体的结合(结构域定位)
为了分析嵌合人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的精细特异性，通过结构域定位确定由嵌合人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的表位的位置。通过FACS分析确定嵌合人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与(HEK衍生的)297-F细胞表面上表达的截短的人CD134构建体(见上述实施例8(b))结合的能力。
使用FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen)，用5个产生的人CD134变体(见上述)瞬时转染FreeStyleTM293-细胞(Invitrogen)。在48-72小时后，用FACS分析转染细胞上的表面人CD134的表达。为此，收获转染细胞并以1-2x106细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。细胞在4℃温育30分钟，有或无20.0μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞随后与1:200稀释的PE缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性的)抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃温育30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，细胞在2％甲醛于PBS/BSA/NaN3中4℃固定30分钟。抗体的结合用流式细胞术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图22所示，嵌合人IgG4κ和IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3及嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5均证实对转染细胞上的各种截短的人CD134构建体的结合特征，这与它们相应的亲本小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5对应物的结合特征相同(见实施例8(b)；对比见图22vs图21)。
(b).使用人CD134衍生肽ELISA的嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的表位定位
为了进一步分析嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的精细特异性，通过表位定位确定由嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3识别的表位的位置。通过ELISA确定嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3结合人CD134衍生的肽的能力，其相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)的氨基酸序列。
96孔平底ELISA平板(Corning)用10ng/孔人CD134衍生的肽(由Pepscan Presto,Lelystad,The Netherlands合成)，其相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(见SEQ ID NO.38)，或者用10ng/孔人纤连蛋白衍生的对照肽(由Pepscan Presto,Lelystad,TheNetherlands合成)，其相应于外III型结构结构域的氨基酸序列(见SEQ IDNO.37)，在PBS o/n中于4℃包被过夜。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSA级分V(Roche)中室温封闭1小时。随后平板与0，0.00005-50.0(在封闭缓冲液中10倍梯度步骤)μg/mL嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或者对照人IgG4κ抗人CD40抗体(Biocult)在室温温育1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，抗体的结合用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG Fcγ-特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温1小时确定，随后通过TMB底物的即用溶液(Invitrogen)进行比色检测。加入1M H2SO4后，用微板分析仪(BioRad)在波长450nm测量光密度(参考波长655nm)。
如图23-B(n＝1)所示，嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3剂量依赖性及特异性结合人CD134衍生的肽，而对照人IgG4κ抗人CD40抗体证实与人CD134衍生的肽无结合。嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和对照人IgG4κ抗人CD40抗体均证实与人纤连蛋白衍生的对照肽无结合。
这些结果证实嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3特异性识别人CD134上的表位(对比人CD134衍生的肽vs人纤连蛋白衍生的对照肽)。另外，这些结果证实嵌合人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3看起来识别在胞外人CD134上的具有氨基酸序列108-146(即39-聚体肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN；见SEQ IDNO.38)的截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latza et al.Eur J Immunol1994；24:677-683的定义)中的线性或非线性/构象表位。
所附序列表构成说明书一部分。
在SEQ ID NO:1中，其是人CD134的氨基酸序列(GenBank refCAB96543.1；aa1-277)，信号肽在氨基酸(aa)1-28，跨膜区在aa215-235。
SEQ ID NO:61，其形成SEQ ID NO:5的11个N-末端氨基酸，也是感兴趣的。其是SEQ ID NO:3的20E5轻链等价物，其是20E5重链的11个N-末端氨基酸。
SEQ ID NO.37(TYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGGC)，来自人纤连蛋白衍生的肽的氨基酸序列，相应于外III型(extra type III)结构域的氨基酸序列(ED1；Peters et al.Am Rev Resp Dis1988；138:167-71)。
序列表
 

Claims (48)

1.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
2.权利要求1的结合分子，其中在所述分子的饱和浓度或饱和浓度以上，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过50％。
3.权利要求1或2的结合分子，其中在所述结合分子的浓度为70nM时，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过70％。
4.结合分子，包含
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
5.权利要求1、2或4的结合分子，包含
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
6.权利要求1、2或4的结合分子，包含
(a)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
(b)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(c)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
7.与抗体竞争结合人CD134的结合分子，所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
8.结合分子，包含
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
9.权利要求1、2或8的结合分子，包含：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
10.权利要求1、2或8的结合分子，包含：
(a)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；
(b)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体；和/或
(c)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或者所述序列的具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
11.与抗体竞争结合人CD134的结合分子，所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
12.结合分子，其特异性结合人CD134的胞外结构域的氨基酸序列中的表位，所述表位是权利要求7或11中定义的抗体结合的表位。
13.权利要求12的结合分子，其中所述结合分子结合人CD134的胞外结构域的一个表位，所述表位包含氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:34；
(b)SEQ ID NO:35；
(c)SEQ ID NO:36；和/或
(d)SEQ ID NO:38。
14.权利要求12或13的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134受体与参与抑制人肿瘤细胞生长的表达人CD134的人免疫活性细胞(例如激活的Teff和/或激活的Treg)上的OX40配体(OX40L)的结合。
15.权利要求12或13的结合分子，其中所述结合分子增强人OX40配体(OX40L)在参与抑制人肿瘤细胞生长的表达人CD134的人免疫活性细胞(例如激活的Teff和/或激活的Treg)上的结合和/或免疫刺激应答。
16.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合并且不阻碍人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
17.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合并且增强人OX40L在表达人CD134的T效应细胞上的免疫刺激和/或增殖性应答。
18.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合并且不阻碍人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
19.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合并且增强人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的抑制功能应答。
20.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合但是不阻碍人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
21.结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134与OX40配体(OX40L)的结合但是抑制人OX40L在表达人CD134的T调节细胞上的增殖性应答。
22.前述任一项权利要求的结合分子，其中在所述分子的饱和浓度或饱和浓度以上，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过50％。
23.权利要求22的结合分子，其中在所述结合分子的浓度为70nM时，在表达人CD134的T细胞上，OX40L与CD134的结合作用被降低不超过70％。
24.前述任一项权利要求的结合分子，其是人抗体。
25.前述任一项权利要求的结合分子，其是嵌合的、人源化或DeImmunizedTM抗体，或者其片段。
26.前述任一项权利要求的结合分子，其是抗体、抗体模拟物(例如，基于非抗体支架)、RNA适体、小分子或者CovX-body。
27.前述任一项权利要求的结合分子，其是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
28.前述任一项权利要求的结合分子，其中所述抗体是抗体的抗原结合片段，例如选自：Fv片段(例如单链Fv及二硫键键合的Fv)；Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段及F(ab’)2片段)；和结构域抗体。
29.权利要求28的结合部分，其中所述抗原结合片段是scFv。
30.前述任一项权利要求的结合部分，其中所述结合部分是重组抗体。
31.前述任一项权利要求的结合部分，其中所述结合部分是单克隆抗体。
32.编码前述任一项权利要求的结合分子的核酸分子，条件是所述结合部分是多肽。
33.包含至少一种权利要求32的核酸分子的载体。
34.包含权利要求33的载体的宿主细胞。
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞来源于哺乳动物或昆虫。
36.制备权利要求1-31任一项的结合分子的方法，包括步骤：(i)制备结合CD134的分子及(ii)筛选所述分子以鉴定及获得不阻止OX40L与CD134的结合的结合分子。
37.权利要求36的方法，其中步骤包括鉴定在CD134暴露于饱和浓度的OX40L之后结合CD134的结合分子。
38.权利要求36或37的方法，其中所述结合分子是单克隆抗体，并且包括用人CD134免疫动物，制备分泌抗CD134抗体的杂交瘤，及筛选产生抗CD134抗体的杂交瘤。
39.权利要求1-31任一项的结合分子或者根据权利要求36-38任一项产生的结合分子，用于在有需要的对象中预防或治疗癌症。
40.根据权利要求39的结合分子的用途，其中所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、血液系统癌症或者任何特征在于不受控细胞生长的其它疾病或病症。
41.增强人类对象中的免疫应答的方法，包括对人类对象施用治疗有效量的权利要求1-31任一项的结合分子或者根据权利要求36-38任一项产生的结合分子，及任选地药学可接受的载体。
42.权利要求41的方法，其中所述增强的免疫应答包括T效应细胞的免疫刺激/效应功能的增加，任选地是这些细胞增殖的结果，和/或T调节细胞的免疫抑制功能的下调，任选地这些细胞数量不扩增。
43.治疗有需要的人类对象中的癌症的方法，包括对人类对象施用治疗有效量的权利要求1-31任一项的结合分子或者根据权利要求36-38任一项产生的结合分子。
44.权利要求43的方法，其中癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、血液系统癌症或者任何特征在于不受控细胞生长的其它疾病或病症。
45.降低对象中肿瘤大小或抑制癌细胞生长或者降低或抑制患癌对象中转移癌的发展的方法，包括对人类对象施用权利要求1-31任一项的结合分子或者根据权利要求36-38任一项产生的结合分子。
46.权利要求1-31任一项的结合分子或者根据权利要求36-38任一项产生的结合分子在制备用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
47.药物组合物，其包含权利要求1-31任一项的结合部分或者根据权利要求36-38任一项产生的结合部分及一或多种药学可接受的稀释剂或赋形剂。
48.权利要求47的组合物，其中所述组合物适合肠胃外施用于人体，例如通过静脉内、肌内、皮内、腹腔内、肿瘤内、膀胱内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、经气管、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内或皮下施用。
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