具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下对本发明做进一步描述:在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中,术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。本发明中所述的氨基酸的位置根据abysis在线工具比对得到(http://www.bioinf.org.uk/ abysis/index.html),并不代表氨基酸的序列中的实际排位。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括,特别地,重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
在本发明中,术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分,所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如,OX40)的能力,与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下,抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如,scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在本发明中,术语“载体”指的是,可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说,载体包括:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。
在本发明中,术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞,包括如下许多细胞类型,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
在本发明中,“特异性结合”指的是,指两分子间的非随机结合反应,如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处,结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中,一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原,其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon),其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
实施例1:重组人OX40的表达和相关EGFP细胞制备
S1.1、根据蛋白数据库Uniprot上人OX40的氨基酸序列(P43489),得到人OX40胞外结构域的氨基酸序列(hOX40)(即P43489中第1位残基至216位残基);
S1.2、根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857),得到人IgG1-Fc(hFc)的结构域氨基酸序列(即P01857中第104位残基至330位残基);
S1.3、根据蛋白数据库Uniprot上小鼠免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01868),得到小鼠IgG1-Fc(muFc)的结构域氨基酸序列(即P01868中第98位残基至324位残基);
S1.4、通过人工合成的方式得到步骤S1.1~S1.3中的DNA片段,合成好的基因序列分别经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen,V863-20)中,测序验证构建质粒的准确性,获得重组质粒DNA即:pcDNA4-hOX40-hFc、pcDNA4-hOX40-muFc;
S1.5、根据蛋白数据库Uniprot上信息得到增强型绿色荧光蛋白EGFP氨基酸序列(C5MKY7)、人OX40的氨基酸序列(P43489)、鼠OX40的氨基酸序列(P47741)、人CD137的氨基酸序列(Q07011)、人CD27氨基酸序列(P26842);
S1.6、通过人工合成的方式得到步骤S1.5中的DNA片段,合成好的基因序列分别经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen,V863-20)中,测序验证构建质粒的准确性,获得重组质粒DNA即:pcDNA4-hOX40-EGFP、pcDNA4-hCD137-EGFP、pcDNA4-mOX40-EGFP和pcDNA4-hCD27-EGFP。
S1.7、将步骤S1.6中的EGFP重组质粒转染到HEK293(ATCC,CRL-1573TM)细胞中,转染48h后通过荧光激活信号分选(FACS)确认hOX40、hCD137、mOX40、hCD27的表达。
S1.8、将pcDNA4-hOX40-Fc、pcDNA4-hOX40-muFc瞬时转染至HEK293细胞用于蛋白生产。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液,将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中,放置在37℃,10%CO2,90rpm中培养;培养5~6天后,收集瞬时表达培养上清液,通过ProteinA亲和层析法,初步纯化得到hOX40-Fc、hOX40-muFc蛋白样品,用于以下各实施例。得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测,可以清晰的看到目的条带。
实施例2:从酵母展示文库中筛选anti-hOX40抗体,克隆表达和鉴定
2.1方法
采用酵母展示技术筛选针对人OX40的全人抗体。通过克隆来自150个健康人的PBMC的IgM和IgG cDNA中的VH和VL基因到特定载体,构建scFV酵母展示文库(VH和VL中间的连接序列是GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:1)连接肽),库容为5×108。将10倍库容的酵母库复苏,诱导酵母表面表达抗体,用100nM生物素化的hOX40抗原利用磁珠分选的方式富集二次,然后用生物素化的hOX40做流式分选再富集两次。得到的酵母涂板,挑取单克隆。单克隆酵母经扩增和诱导表达后用anti-myc抗体和生物素化的hOX40或对照抗原hCD137染色分析,抗原阳性/对照酵母阴性的酵母为阳性酵母。
将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序,PCR引物为:sequence-F:CGTAGAATCGAGACCGAGGAGA(SEQ ID NO:2);sequence-R:CTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC(SEQ IDNO:3);测序的引物为sequence-R。得到测序结果后用BioEdit软件对序列进行比对分析。
将上述得到的单链抗体scFv基因及前述的人IgG1-Fc基因融合后经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA中,按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在HEK293细胞中瞬时表达,并通过protein A柱纯化。
取hOX40-EGFP细胞,重悬于0.5%PBS-BSA Buffer中,加入上述纯化后2μg的anti-hOX40scFv抗体,同时设置相关对照,阴性对照为2μg的hIgG1蛋白。二抗为eBioscience的anti-hIg-PE。染色完毕后流式细胞仪进行检测。以此方法鉴定能结合细胞表面hOX40抗原的抗体。
经过筛选和鉴定后得到3株特性较好的抗体分别是O3scFv、O19scFv、O21scFv。如图1所示,3株抗hOX40的抗体均能够与细胞表面hOX40相结合,而阴性对照不能够与细胞表面hOX40相结合。上述抗体重链和轻链可变区之间含有连接肽序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:1)。
2.2序列
2.2.1 O3 scFv重链可变区氨基酸序列:
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCGFNGEYFTDYFWTWVRQPPGEALEWLALIYWDDDERYSPSLKNRLIITKDISKNQVVLTMTHMEPADTGTYYCARWGGSLMNAFDVWGPGTMVTVSS(SEQ ID NO:4)
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:5-7;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:8-11;
其对应的DNA序列为:
CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGGTTTCAATGGAGAATACTTCACTGATTACTTCTGGACCTGGGTCCGGCAGCCCCCCGGAGAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACTCATTTATTGGGATGATGATGAGCGCTACAGCCCATCTCTGAAGAACAGACTCATCATCACCAAGGACATTTCCAAAAACCAGGTGGTCCTTACAATGACCCACATGGAGCCTGCGGACACAGGCACCTATTACTGTGCGAGATGGGGTGGTTCTTTAATGAACGCTTTTGATGTCTGGGGCCCAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO:12)
其轻链可变区氨基酸序列:
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQRHPGKAPRLMIYDVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSIAVFGGGTQLTVL(SEQ ID NO:13)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:14-16;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:17-20;
其对应的DNA序列为:
CAGTCTGCCCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGTAGTGACGTTGGTGGTTATAATTATGTCTCCTGGTACCAACGACACCCAGGCAAAGCCCCCAGACTCATGATTTATGATGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCATTGCTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC(SEQ ID NO:21)
2.2.2 O19 scFv重链可变区氨基酸序列:
QVQLVESEGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYMDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNTLRAEDTAMYYCTRVSFGVPTYDDFWRSYATPAWYFDFWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:22)
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:23-25;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:26-29;
其对应的DNA序列为:
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGAGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTAGATTCACGTTTAGTAACTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGGTGGCCAATATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATATTATATGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAGATGAACACCCTAAGAGCCGAGGACACGGCTATGTATTACTGTACGAGGGTTAGTTTCGGAGTGCCGACGTATGACGATTTTTGGAGGAGTTACGCGACGCCCGCTTGGTACTTCGATTTTTGGGGCCGTGGTACCCTGGTCACTGTCTCCTCA(SEQ ID NO:30)
其轻链可变区氨基酸序列:
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGISSDDGYYKYVSWYQQYPGKAPKLMIYDVSKRPSGISFRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSNMTPYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:31)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:32-34;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:35-38;
其对应的DNA序列为:
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAATTAGTAGTGACGATGGTTATTATAAGTATGTCTCCTGGTACCAACAATATCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTTTTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGTAACATGACCCCCTATGTCTTCGGCACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA(SEQ ID NO:39)
2.2.3 O21scFv重链可变区氨基酸序列:
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVSWDWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNEYAVSVE SRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAIYFCVRNNYFFDLWGRGTLVTVSS(SEQ ID NO:40)
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:41-43;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:44-47;
其对应的DNA序列为:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGTCTCTTGGGACTGGATCAGGCAGTCCCCCTCGAGGGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTATAGGTCCAAGTGGTATAATGAGTATGCAGTATCTGTGGAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAACTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTTCTGTGTAAGAAATAACTACTTCTTCGATCTCTGGGGCCGTGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:48)
其轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRSNWPPGYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:50-52;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCGACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCTGCGTAGCAACTGGCCTCCGGGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO:57)
实施例3:3株抗体的scFv型抗体格式化为IgG型抗体
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma4(IgG4)的恒定区氨基酸序列(P01861),得到人IgG4恒定区氨基酸序列。将筛选得到的O3、O19、O21的重链可变区VH序列与人IgG4恒定区基因序列拼接在一起,将拼接好的基因合成,经Fermentas公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pcDNA4/myc-HisA中得到pcDNA4-O21HC、pcDNA4-O3HC、pcDNA4-O19HC。
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白Kappa的恒定区氨基酸序列(P01834),得到人Kappa轻链恒定区氨基酸序列。将筛选得到的O21的轻链可变区VL序列与人Kappa轻链恒定区基因序列拼接在一起;根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白lambda的恒定区氨基酸序列(A0M8Q6),得到人lambda轻链恒定区氨基酸序列,将筛选得到的O3、O19的轻链可变区VL序列与人lambda轻链恒定区基因序列拼接在一起,将拼接好的基因合成,经Fermentas公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pcDNA4/myc-HisA中得到pcDNA4-O21LC;pcDNA4-O3LC;pcDNA4-O19LC。
利用AidLab公司提供的质粒大提试剂盒(PL14)对上述得到的重链和轻链质粒进行质粒大提。将重组构建的轻链和重链质粒共转染HEK293细胞进行抗体表达。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液,将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中,放置在37℃,10%CO2,120rpm中培养,培养5~6天后,收集瞬时表达培养上清液,通过ProteinA亲和层析法,纯化得到anti-hOX40抗体:O3mAb、O19mAb和O21mAb。
实施例4:anti-hOX40Abs特性鉴定
抗体是否特异性识别hOX40的鉴定:
纯化的anti-hOX40抗体与hOX40、hCD137和hCD27蛋白的结合
取实施例1构建的表达hOX40-EGFP、hCD137-EGFP和hCD27-EGFP的HEK293细胞,重悬于0.5%PBS-BSA Buffer中,加入anti-hOX40 mAb蛋白,冰上孵育20min。洗涤后加入eBioscience二抗anti-hIg-PE,冰上20min。洗涤后将细胞重悬于500μl0.5%PBS-BSABuffer中,流式细胞仪进行检测。结果如图2所示,三株抗体(O3mAb、O19mAb和O21mAb)均能与hOX40-EGFP细胞结合,而不能与其他几种EGFP细胞(hCD137-RGFP-293F、hCD27-RGFP-293F)结合,展示出很好的特异性。
实施例5:anti-OX40抗体的体外亲和力提高
由于三株抗体(O3mAb、O19mAb和O21mAb)均能特异性与hOX40-EGFP细胞结合,且试验发现O21 scFv与hOX40有更高的亲和力,同时瞬时转染有稳定的较高表达量,因而选择O21 scFv抗体做进一步的体外亲和力提高试验;然而应当说明的是,体外亲和力提高试验的目的在于研究突变率对于抗体亲和力的影响,试验结果应当不局限于O21 scFv的判定,而应理解为包括O3scFv、O19 scFv和O21 scFv在内的抗体,其突变率对于抗体亲和力的影响。
5.1 anti-OX4021#ScFv亲和力改善的酵母文库构建
以实施例1构建的pcDNA4-OX40-21-Fc质粒为模板,pcDNA4-F:TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC(SEQ ID NO:58)和cMyc-BBXhoI:GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG(SEQ ID NO:59)为引物进行标准PCR反应。得到的PCR产物经Fermentas公司的NheI和BglII酶切后构建重组质粒。接下来参考文献Ginger等(2006)NatProtoc1(2):755-68的方法,利用error prone PCR的方法获得scFv随机突变的PCR产物。所用的引物为ep-F:TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO:60)和ep-R:GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT(SEQ ID NO:61)。得到的PCR产物经Fermentas公司GeneJETDNA purification Kit纯化后再乙醇沉淀浓缩至浓度大于1μg/μl。剩下的操作方法参考文献Ginger等(2006)Nat Protoc 1(2):755-68的方法,利用酵母电转化和体内重组的方法获得亲和力成熟的酵母库。
5.2产生亲和力改善的酵母anti-OX40 21#scFv筛选
将上述得到的亲和力成熟后的酵母库用10nM和1nM的hOX40-Fc蛋白经过两轮流式分选,分选得到的酵母产物涂板,挑取单克隆鉴定。利用低浓度抗原染色的方法,以之前得到的野生型酵母作为对照,流式染色确定亲和力提高的酵母单克隆,将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序,方法同上。将测序得到的序列利用BioEdit软件进行突变位点的分析。
整理对抗体亲和力没有影响甚至是提高亲和力的O21 scFv突变位点,结果如表1所示,该表结果应当理解为,O21 scFv上发生如表中所示的其中之一个或多个突变,对于亲和力没有影响甚至会有所提高;与之相对应的筛选出的酵母单克隆序列分析结果,如表2所示,该表应当理解为,表1中列出的突变位点,当具有如表2所示的几种突变组合时,可以提高抗体的亲和力;表2中所示的酵母染色结果如图3所示,可见与O21 scFv相比,抗体的亲和力均得到不同程度的提高。
表1对抗体亲和力没有影响的O21 scFv突变位点
重链 |
轻链 |
H7位:S突变成L |
L30位:S突变成G |
H13位:K突变成M |
L90位:L突变成Q |
H28位:S突变成N |
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H33位:S突变成G |
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H43位:R突变成G |
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H65位:S突变成N |
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H67位:I突变成M |
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H96位:N突变成D |
|
表2亲和力提高的酵母单克隆序列分析结果
由表2可知,对于O21 scFv重链CDR区和轻链CDR区而言,已有实验指出可分别突变3个和2个氨基酸(实施例6中的anti-OX40 21#H96-L80 mAb,其轻链突变可至3个氨基酸),仍可以维持甚至提高抗体的亲和力,而现在已知O21 scFv重链可变区和轻链可变区分别包括119个氨基酸(其中CDR区32个氨基酸,FR区87个氨基酸)和109个氨基酸(其中CDR区29个氨基酸,FR区80个氨基酸),那么可以认为与重链CDR区或轻链CDR区的同源性在90%以上的,仍具有维持甚至提高抗体亲和力的能力。实际情况下,抗体的亲和力与序列同源性的百分比例之间并没有决定性的联系,而是更多地受到可决定抗体表位(或称抗原决定部位)的关键氨基酸残基的影响,在这些关键氨基酸残基未发生突变或突变不具决定性改变作用的前提下,序列同源性可低至70%。
实施例6:scFv型抗体格式化为IgG型抗体
按照实施例3中的方法对亲和力成熟后的scFv型抗体格式化为IgG型抗体型抗体,得到一系列的anti-OX40 21#mAb的变体,具体序列信息如下:
6.1 anti-OX40 21#H28H33 mAb
其重链可变区氨基酸序列:
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQID NO:63、42和43;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:64、45、46和47;
其对应的DNA序列为:
其轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRSNWPPGYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:50-52;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCGACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCTGCGTAGCAACTGGCCTCCGGGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO:57)
6.2、anti-OX40 21#H65 mAb
其重链可变区氨基酸序列:
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQID NO:41、67和43;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:44-47;
其对应的DNA序列为:
其轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRSNWPPGYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:50-52;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCGACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCTGCGTAGCAACTGGCCTCCGGGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO:57)
6.3、anti-OX40 21#H96mAb
其重链可变区氨基酸序列:
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQID NO:41、42和70;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:44-47;
其对应的DNA序列为:
其轻链可变区氨基酸序列:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASDRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQLRSNWPPGYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:49)
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,其序列编号分别为SEQ ID NO:50-52;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCGACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCTGCGTAGCAACTGGCCTCCGGGGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO:57)
6.4、anti-OX40 21#VHnew-L80
其重链可变区氨基酸序列:
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQID NO:63、67和70;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:44-47;
其对应的DNA序列为:
其轻链可变区氨基酸序列:
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQ ID NO:75-77;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
6.5、anti-OX40 21#H96-L80 mAb
其重链可变区氨基酸序列:
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQID NO:41、42和70;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:44-47;
其对应的DNA序列为:
其轻链可变区氨基酸序列:
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分,其序列编号分别为SEQ ID NO:75-77;未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4,其序列编号分别为SEQ ID NO:53-56;
其对应的DNA序列为:
实施例7:anti-hOX40 Abs特性鉴定
7.1纯化的anti-hOX40抗体与hOX40结合能力检测(ELISA法)
以包被缓冲液(50mM Na2CO3,NaHCO3pH9.6)稀释hOX40-muFc至2μg/ml,100μL/well,4℃过夜。洗板后,3%BSA-PBS37℃封闭1h。将anti-hOX40抗体分别从2000ng/ml开始,进行2倍梯度稀释,共11个浓度,稀释液(1%BSA-PBS)作对照,37℃孵育2h。加入羊抗人IgG-HRP(Goat anti-human IgG-HRP conjugated),37℃孵育1h。加可溶性单组分TMB底物显色液,室温避光显色5-10min。2N H2SO4 50μL/well,终止显色反应。置MD SpectraMax Plus384酶标仪上读OD 450nm-650nm值,应用软件SoftMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析,结果如图4-6所示。由图4可知,由ScFv转变为IgG型抗体后,O19 mAb亲和力依然比较低;O21mAb亲和力变化不大,亲和力比较好;O3 mAb亲和力显著提高。由图5和图6可知,上述的anti-OX40 21#mAb的变体均能和OX40结合,且经过体外亲和力成熟后的anti-OX40 21#VHnew-L80mAb,anti-OX40 21#H96-L80 mAb与anti-OX40 21#mAb相比,亲和力大约提高两倍。
7.2通过表面等离子共振(SPR)分析a-hOX40 mAbs与hOX40的动力学亲和力常数
anti-hOX40抗体针对重组的人OX40的结合动力学通过表面等离振子共振(surface plasmon resonance,SRP)方法,使用BIAcore X100仪器测量。CM5芯片偶联anti-humanFc抗体(不交叉识别mouse Fc),将待测抗体用running buffer稀释至5nM并被芯片上抗体捕获作为配体。OX40-muFc用running buffer稀释至1000-1.37nM二倍稀释。进样时间为180S,解离时间为1800s,再生时间为60S。running buffer为HBS-EP+,再生buffer为10mMglycine-HCl(pH2.0)。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcoreEvaluation Software version3.2))计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(kD)以比率koff/kon计算。由表3可知,亲和力成熟后的anti-OX40 21#H96-L80mAb的亲和力约提高两倍。
表3 anti-hOX40抗体与hOX40结合动力学检测
名称 |
Kon(1/Ms) |
Koff(1/s) |
KD(M) |
O3 mAb |
2.84E+05 |
3.91E-04 |
1.378E-09 |
O21 mAb |
4.181E+4 |
6.077E-04 |
1.454E-08 |
VHnew-L80 |
3.329E+04 |
3.415E-04 |
1.026E-08 |
H96-L80 |
2.999E+04 |
2.368E-04 |
7.898E-09 |
7.3 NF-κb系统检测anti-hOX40抗体体外agonist活性
构建OX40-CD40质粒:根据蛋白数据库Uniprot上人OX40的氨基酸序列(P43489),得到人OX40胞外结构域的和跨膜区氨基酸序列(即P43489中第1位残基至235位残基);根据蛋白数据库Uniprot上人CD40氨基酸序列(P25942),得到人CD40的胞内段氨基酸序列(即P25942中第216位残基至277位残基);通过基因合成的方法将两者拼接到一起,再经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen,V863-20)中,测序验证构建质粒的准确性,获得重组质粒DNA即:pcDNA4-OX40-CD40(即下文中提到的OX40-CD40)。
293T-NF-κB稳定细胞系:293T细胞接种24孔板,1x105/well,每孔200μlDMEM完全培养基,同时加入20μlNF-κB-luciferase-lentivirus(Qiagen,cat:CLS-013L),MOI=2。感染24h之后,弃去上清,加入1ml DMEM完全培养基继续培养,24h后,换用含0.3μg/mlpromycin的DMEM完全培养基继续培养,培养扩大细胞并冻存。用promycin筛选的293T-NF-κB细胞接种24孔板,1x105/well,10ng/ml TNF-α刺激6h后,裂解细胞检测luciferase,结果显示,TNF-α刺激过的细胞luciferase值明显高于未刺激的细胞,证明NF-κB-luciferase已经稳转进293T细胞。
用不含双抗的培养基重悬5x105 293T-NF-κB细胞,接种于6孔板中。24h后,弃上清,并用PBS清洗一遍,加入1.8ml的无双抗无血清的培养液。以质粒:脂质体=1:3的比例,转染0.2μg OX40-CD40质粒。转染4h后,弃上清,换成新鲜完全培养液,继续培养。转染次日,将细胞以5x104/孔的密度接种于96孔板,加入一系列浓度梯度的抗体(初浓度10μg/ml,10倍稀释7个梯度),同时加入同浓度的cross-link(Jackson ImmunoResearchLaboratories:109-006-008)继续培养6h,裂解细胞检测luciferase。如图7所示,图中A、C、E、G分别代表O3 mAb、O21 mAb、anti-OX40 21#VHnew-L80 mAb和anti-OX40 21#H96-L80mAb在不同浓度下,体外激动剂活性检测结果,图中B、D、F、H分别为取log之后的体外激动剂活性检测结果图,结果显示O3 mAb和O21 mAb在体外均有较好的agonist活性,并且呈现较好的剂量依赖性。亲和力提高后的anti-OX40 21#VHnew-L80 mAb,anti-OX40 21#H96-L80mAb在Agonist活性上大约提高两倍。
实施例8不同亚型对抗体agonist活性的影响
由于anti-OX40 21#mAb的各种变体,均对hOX40具有特异的高亲和力,与hOX40结合动力学结果均较好,而其中之一的anti-OX40 21#H96-L80 mAb在Agonist活性上大约提高两倍,因此本申请以anti-OX40 21#H96-L80 mAb(以下简称H96-L80)为例做进一步的说明,其余各变体不再赘述。然而应当说明的是,后续各实施例中虽然仅对H96-L80做出说明,但不应当理解为anti-OX40 21#mAb的各种变体不具有相应的特性,或是其它两种抗体(O3mAb、O19mAb)不具有相应的特性。后续各实施例中对于H96-L80的进一步实验数据,仅用于证明根据本发明方法获得的各种anti-OX40抗体,具有较高的活性、亲和力、功能性或稳定性。
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)和人免疫球蛋白gamma2(IgG2)的恒定区氨基酸序列(分别是P01857和P01859),得到人IgG1和IgG2恒定区氨基酸序列。剩余按照上述的方法操作,得到anti-OX40 21#H96-L80 IgG1 mAb和anti-OX40 21#H96-L80 IgG2 mAb。按照实施例7的方法进行实验,结果如图8所示,其中图8A和图8B分别为IgG1和IgG4两种亚型,在不同浓度下,体外激动剂活性检测结果,图8C为IgG1和IgG4两种亚型取log之后的对比结果图,图8D为0.1ug/ml浓度下,可见H96-L80的三种亚型的抗体agonist活性相当。
实施例9:纯化的H96-L80抗体与人和恒河猴活化后CD4+T和CD8+T细胞结合能力检测
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC,接种到RPMI完全培养基中。用终浓度为5ug/ml的PHA活化PBMC 48小时。将细胞重悬于0.5%PBS-BSA Buffer中,加入H96-L80蛋白,冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG(Cat#409310)或Biolegend抗体PE anti-hOX40(Cat#350003),以及biolegend抗体APC anti-human CD4(Cat#317416),冰上孵育20min。洗涤后将细胞重悬于500μl 0.5%PBS-BSA Buffer中,流式细胞仪进行检测。结果如图9A所示,H96-L80可以很好的结合活化的CD4+T细胞。
为检测H96-L80与CD4+细胞中Treg与Teff的结合能力,用上述活化后的人PBMC染色。将细胞重悬于0.5%PBS-BSA Buffer中,加入H96-L80蛋白,冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG,以及biolegend抗体APC anti-human CD4,冰上孵育20min,洗涤后穿膜固定液(BD,51-2090KZ)作用1h,穿膜液(eBioscience,00-8333-56)洗涤后再用穿膜液从悬,加入PE anti-human Foxp3(Cat#320208),4℃染色过夜,洗涤后将细胞重悬于500μl 0.5%PBS-BSA Buffer中,流式细胞仪进行检测。结果如图9B所示,H96-L80可以很好的结合活化的CD4+Foxp3+Treg和CD4+Foxp3-Teff细胞。
为检测H96-L80与恒河猴OX40的结合能力,利用上述步骤获得活化的恒河猴外周血单核细胞PBMC。将细胞重悬于0.5%PBS-BSA Buffer中,加入H96-L80蛋白,冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG,以及biolegend抗体APC anti-humanCD4和PE anti-human CD8a(Cat#301008),冰上孵育20min。洗涤后将细胞重悬于500μl0.5%PBS-BSA Buffer中,流式细胞仪进行检测。结果如图9C所示,H96-L80可以很好的结合活化的恒河猴CD4+T和CD8+T细胞,提示H96-L80可以结合恒河猴OX40。
实施例10:anti-OX40抗体促进T细胞的活化和增殖
10.1用T细胞活化和增殖来研究anti-OX40scFv抗体的体外活性和评价其激动剂(agonist)功能。
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC,接种到RPMI完全培养基中。预先用50μl 1μg/ml的anti-CD3包被96孔板,4℃过夜。实验组用50μl 2μg/ml的O21 scFv,37℃包被2h,和同时加上soluble形式终浓度2μg/ml O21 scFv+终浓度4μg/ml cross-link(JacksonImmunoResearch Laboratories:109-006-008),阴性对照为RPMI完全培养基。PBMC量为2×105/孔,培养五天后取上清。如图10所示,利用IFN-γELISA检测试剂盒(ebioscience)检测上清中IFN-γ的水平(图10A),以及用BrdU染色试剂盒(罗氏:11647229001)检测T细胞增殖(图10B),可见O21 scFv在coating和cross-link两种用药方式下均有较好的活化PBMC和促进T细胞增殖的活性。
10.2用体外PBMC和CD4+T细胞活化评价O21 scFv和IgG两种形式的agonist活性
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC,接种到RPMI完全培养基中。用CD4+T细胞分离试剂盒(美天旎,cat#no.130-096-533)从PBMC中分离CD4+T细胞。预先用50μl 1μg/ml的anti-CD3包被96孔板,4℃过夜。实验组用50μl2μg/ml的O21 scFv或O21 mA
b,37℃包被2h,阴性对照为同等剂量的hIgG-Fc。PBMC和CD4+T细胞量为2×105/孔,培养五天后取上清,利用IFN-γELISA检测试剂盒(ebioscience)检测上清中IFN-γ的水平。
如图11所示,对于PBMC(图11A)和CD4+T细胞(图11B),可以看出在体外O21抗体的全抗体mab型比scFv型有更好的agonist活性。
实施例11:IgG1和IgG4亚型的anti-OX40抗体H96-L80对T细胞亚群的影响
按照实施例10操作,获得人外周血单核细胞(PBMC),将PBMC用溶解的抗CD28(0.5μg/ml)和结合板的抗CD3(3μg/ml)和抗人OX40mAb H96-L80 IgG1或IgG4(10μg/ml)刺激。48小时后,收获细胞。用biolegend抗体APC anti-human CD4和PE anti-human CD8a(Cat#301008)染色,或用biolegend抗体APC anti-human CD4和PE anti-human Foxp3(Cat#320208)染色,流式细胞仪进行检测。结果如下图所示,O21 mAb H96-L80 IgG1和IgG4两种亚型可以降低CD4+Foxp3+Treg在CD4+ T细胞中的比例(图12A),但对CD4+T与CD8+T细胞的比例没有影响(图12B)。
实施例12:anti-OX40抗体在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用
12.1使用植入肿瘤细胞PC-3和人PBMC的NOD-SCID小鼠肿瘤肿瘤模型,来评价anti-OX40抗体在体内的药效
在第0天用PC-3(ATCC CRL-1435TM)和人的外周血单个核细胞(PBMC)一起进行皮下(SC)注射小鼠,并在第0、7天用10mg/kg的O21mAb或PBS腹腔注射给药,PBS作为阴性对照,每组5只小鼠。每周两次观察肿瘤的形成,并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线图,结果如图13所示,可以看出抗体O21 mAb可以显著抑制肿瘤生长。
12.2使用植入肿瘤细胞A375和人PBMC的NOD-SCID小鼠肿瘤肿瘤模型,来评价anti-OX40抗体在体内的药效
在第0天用7×106的A375(ATCC CRL-1619TM)和1×106人的外周血单个核细胞(PBMC)一起进行皮下(SC)注射小鼠,并在第0、7天用1mg/kg的O21 mAb或PBS腹腔注射给药,PBS作为阴性对照,每组5只小鼠。每周两次观察肿瘤的形成,并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线图,如图14所示,可以看出抗体O21 mAb可以显著抑制肿瘤生长。
实施例13:anti-OX40 Abs稳定性检测
对anti-hOX40抗体O21 mAb的稳定性用45℃加速稳定性实验进行检测。具体实验方法为:将抗O21 mAb抗体浓缩至约10mg/ml,置于45℃水浴,在第0天、第10天、第20天、第30天收样进行浓度、SEC-HPLC、NF-κb分析实验。SEC-HPLC采用岛津LC20AT HPLC液相色谱仪进行分析实验,将样品浓缩至1mg/ml,流速为0.5ml/min上样,总上样量为50ug,上样后进行等度洗脱30min;NF-κb按实施例7进行操作,结果如图15所示,可以看到anti-hOX40抗体O21mAb在体外有较好的稳定性。
实施例14 anti-hOX40抗体O21 mAb的药物代谢动力学评价
用10mg/kg和1mg/kg的剂量来评价H96-L80 IgG1抗体的药物代谢动力学。使用Balb/C、雌性、8周龄小鼠,取16只小鼠,每个剂量分为A/B两组,每组四只。向所有的小鼠静脉注射H96-L80 IgG1抗体200μg(10mg/kg)或20ug(1mg/kg),给药后分14个时间点分别取血100μl,每个时间点取一组小鼠,两组轮换。分离血清。用ELISA方法检测血清中受试蛋白的浓度:hOX40-muFc包板,加入适当稀释度的血清样品,然后加入Goat anti-Human IgG HRP(Sigma CatNO:A0170),用TMB显色。使用H96-L80 IgG1抗体作为标准蛋白做标准曲线。利用WinNolin软件计算药代动力学参数。平均C-T曲线如图16所示,经检测,本发明的H96-L80IgG1抗体比较稳定,1mg/kg的剂量其体内半衰期平均为205小时;10mg/kg的剂量其体内半衰期平均为371小时。经检测,没有anti-H96-L80的抗抗体产生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州丁孚靶点生物技术有限公司
<120> 抗OX40抗体及其应用
<130> 0027-PA-012
<160> 80
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 2
cgtagaatcg agaccgagga ga 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 3
ctggtggtgg tggttctgct agc 23
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Phe Asn Gly Glu Tyr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Phe Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Asn Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp Ile Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr His Met Glu Pro Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Gly Ser Leu Met Asn Ala Phe Asp Val Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 5
Asp Tyr Phe Trp Thr
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 6
Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gly Ser Leu Met Asn Ala Phe Asp Val
1 5 10
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Gly Phe Asn Gly Glu Tyr Phe Thr
20 25 30
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 9
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 10
Arg Leu Ile Ile Thr Lys Asp Ile Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr His Met Glu Pro Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 11
Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcggtt tcaatggaga atacttcact gattacttct ggacctgggt ccggcagccc 120
cccggagagg ccctggagtg gcttgcactc atttattggg atgatgatga gcgctacagc 180
ccatctctga agaacagact catcatcacc aaggacattt ccaaaaacca ggtggtcctt 240
acaatgaccc acatggagcc tgcggacaca ggcacctatt actgtgcgag atggggtggt 300
tctttaatga acgcttttga tgtctggggc ccagggacaa tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 13
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 13
Gln Ser Ala Leu Ile Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Arg His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Ile Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 14
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 15
Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 16
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Ile Ala Val
1 5 10
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 17
Gln Ser Ala Leu Ile Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 18
Trp Tyr Gln Arg His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Met Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 19
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 20
Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 21
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 21
cagtctgccc tgattcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagtag tgacgttggt ggttataatt atgtctcctg gtaccaacga 120
cacccaggca aagcccccag actcatgatt tatgatgtca ctaagcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cattgctgtg 300
ttcggaggag gcacccagct gaccgtcctc 330
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Met Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Ser Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asp Asp Phe Trp Arg Ser
100 105 110
Tyr Ala Thr Pro Ala Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 23
Asn Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 24
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Met Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 25
Val Ser Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asp Asp Phe Trp Arg Ser Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Pro Ala Trp Tyr Phe Asp Phe
20
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> P39
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 27
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 28
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 29
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 30
caggtgcagc tggtggagtc tgagggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgcgcag cctctagatt cacgtttagt aactattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaat ataaagcaag atggaagtga gaaatattat 180
atggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240
ctgcagatga acaccctaag agccgaggac acggctatgt attactgtac gagggttagt 300
ttcggagtgc cgacgtatga cgatttttgg aggagttacg cgacgcccgc ttggtacttc 360
gatttttggg gccgtggtac cctggtcact gtctcctca 399
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 31
Gln Ser Ala Leu Ile Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ile Ser Ser Asp Asp Gly Tyr Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Phe Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Asn
85 90 95
Met Thr Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> P44
<400> 32
Thr Gly Ile Ser Ser Asp Asp Gly Tyr Tyr Lys Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 33
Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 34
Ser Ser Tyr Thr Ser Asn Met Thr Pro Tyr Val
1 5 10
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 35
Gln Ser Ala Leu Ile Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys
20
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 36
Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 37
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 37
Gly Ile Ser Phe Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 38
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
1 5 10
<210> 39
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 39
cagtctgctc tgattcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaattagtag tgacgatggt tattataagt atgtctcctg gtaccaacaa 120
tatccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca gtaagcggcc ctcagggatt 180
tcttttcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagtaacat gaccccctat 300
gtcttcggca ctgggaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 40
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asn Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 41
Ser Asn Ser Val Ser Trp Asp
1 5
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 42
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 43
Asn Asn Tyr Phe Phe Asp Leu
1 5
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser
20 25 30
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 45
Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 46
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Val Arg
20 25 30
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 47
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 48
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaataact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 49
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asp Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 50
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 51
Asp Ala Ser Asp Arg Ala Thr
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 52
Gln Leu Arg Ser Asn Trp Pro Pro Gly Tyr Thr
1 5 10
<210> 53
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 54
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 55
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 55
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 56
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 57
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccgaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag ccttgagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagctg cgtagcaact ggcctccggg gtacactttt 300
ggccagggga ccaaggtgga gatcaaa 327
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 58
tctggtggtg gtggttctgc tagc 24
<210> 59
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 59
gccagatctc gagctattac aagtcttctt cagaaataag cttttgttct agaattccg 59
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 60
taatacgact cactataggg 20
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 61
ggcagcccca taaacacaca gtat 24
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Asn Val Ser Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asn Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 63
Ser Asn Gly Val Ser Trp Asp
1 5
<210> 64
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 64
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Asn Val Ser
20 25 30
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 65
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga caatgtctct agcaacggtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaataact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Asn Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asn Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 67
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Glu Asn
<210> 68
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 68
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaaatcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaataact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asp Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 70
Asn Asp Tyr Phe Phe Asp Leu
1 5
<210> 71
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 71
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaatgact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Gly Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Asn Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asp Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 73
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacggtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaaatcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaatgact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 74
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Gly Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 75
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 76
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 77
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Gly Tyr Thr
1 5 10
<210> 78
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 78
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag ccttgagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctccggg gtacactttt 300
ggccagggga ccaaggtgga gatcaaa 327
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Asp Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Phe Cys Val Arg Asn Asp Tyr Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificical Sequence)
<400> 80
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg tctcttggga ctggatcagg 120
cagtccccct cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actataggtc caagtggtat 180
aatgagtatg cagtatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcaactgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctatata tttctgtgta 300
agaaatgact acttcttcga tctctggggc cgtggtaccc tggtcaccgt ctcctca 357