CN103946240A - 对人ox40具有特异性的抗体分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对人OX40的抗原决定簇具有特异性的抗体分子、这些抗体分子的治疗用途以及用于产生所述抗体分子的方法。

Description

对人OX40具有特异性的抗体分子
本发明涉及对OX40的抗原决定簇具有特异性的抗体分子和包括其的组合物。本发明还涉及这些抗体分子、组合物的治疗用途以及制造所述抗体分子的方法。
OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35或TXGP1L)是TNF受体超家族的一名成员，该超家族包括4-1BB、CD27、CD30以及CD40。OX40的胞外配体结合域由3个完全的半胱氨酸富集域(CRD)和第四个C端不完全CRD组成(博德默(Bodmer)等人，2002，《生物化学科学趋势》(Trends BiochemSci),27,19-26)。
OX40的配体为OX40L并且3个拷贝的OX40结合于三聚体配体以形成OX40-OX40L复合体(孔庞(Compaan)和希莫威茨(Hymowitz)，2006，《结构》(Structure)，14,1321-1330)。OX40是膜结合受体；然而也已检测到可溶的同种型(泰勒(Taylor)和施瓦兹(Schwarz)，2001，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)，255,67-72)。可溶形式的功能意义目前未知。OX40并不表达于静息T细胞上，但与T细胞受体(TCR)连接后瞬时表达于活化T细胞上。OX40的配体OX40L是TNF家族的一名成员并且表达于活化的抗原呈递细胞(APC)，包括B细胞、巨噬细胞、内皮细胞以及树突状细胞(DC)上。
OX40是主要的共刺激受体，其中CD28与OX40的依序衔接为最佳的T细胞增殖和存活所必需。OX40在活化T细胞上的连接导致增强的细胞因子产生以及CD4+和CD8+T细胞两者的增殖(格拉马利亚(Gramaglia)等人，2000，《免疫学杂志》(J.Immunol)，165,3043-3050，邦萨尔-帕卡拉(Bansal-Pakala)等人，2004，《免疫学杂志》，172,4821-425)并且可以有利于正在进行的Th1和Th2应答两者(格拉马利亚等人，1998，《免疫学杂志》，161,6510-6517，阿里斯蒂德斯(Arestides)等人，2002，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)32,2874-2880)。OX40共刺激使T细胞的存活延长到超过免疫应答的初始效应期并且通过抑制效应T细胞的死亡而增加记忆T细胞的数目。
当免疫激活过度或不受控制时，可能发生病理性过敏、哮喘、炎症、自体免疫以及其他相关疾病。由于OX40对增强免疫应答有作用，故它可以加重自体免疫和炎性疾病。
OX40/OX40L相互作用在疾病模型中的作用已在OX40基因敲除小鼠中被证实。在实验性过敏性脑脊髓炎(EAE；一种多发性硬化的模型)中，在OX40基因敲除小鼠中注意到CNS内较不严重的疾病临床体征和减少的炎性浸润(卡尔博尼(Carboni)等人，2003，《神经免疫学杂志》(J.Neuroimmunology)，145,1-11)。同时用卵白蛋白初免并且激发的OX40基因敲除小鼠表现出肺部炎症的减少(嗜酸粒细胞增多方面减少80％-90％)、粘液产生减少以及明显减弱的气道高反应性(金贝尔(Jember)等人)，2001，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.),193,387-392)。鼠OX40配体的单克隆抗体已在以下中显示出有益作用：类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎模型(吉冈(Yoshioka)等人，2000，《欧洲免疫学杂志》，30,2815-2823)、EAE(野原(Nohara)等人，2001，《免疫学杂志》，166,2108-2115)、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(帕卡拉等人，2004，《欧洲免疫学杂志》，34,3039-3046)、T细胞重建小鼠的结肠炎(马尔姆斯特伦(Malmstrom)等人，2001，《免疫学杂志》，166,6972-6981，户冢(Totsuka)等人，2003，《美国生理学杂志-胃肠与肝脏生理学》(Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.)，284,G595-G603)以及肺部炎症的模型(萨拉克-阿尔达卡尼(Salek-Ardakani)等人，2003，《实验医学杂志》，198,315-324，星野(Hoshino)等人，2003，《欧洲免疫学杂志》，33,861-869)。人OX40L的抗体已在恒河猴肺部炎症的模型中描述并且导致过敏原激发后的细支气管灌洗液中IL-5、IL-13以及效应记忆T细胞的水平减少(赛沙赛耶(Seshasayee)等人，2007，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest),117,3868-3878)。
已在数种自体免疫和炎性疾病中注意到OX40表达的增加。这包括从类风湿性关节炎患者的滑液分离的T细胞上OX40表达的增加(布鲁尼奥尼D(Brugnoni D)等人，1998，《风湿病学杂志》(Br.J.Rheum.)，37,584-585；吉冈等人，2000，《欧洲免疫学杂志》，30,2815-2823；贾科梅利R(GiacomelliR)等人，2001，《临床与实验风湿病学》(Clin.Exp.Rheumatol.)，19,317-320)。类似地，在患有溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者的胃肠组织中(索萨(Souza)等人，1999，《消化道》(Gut)，45,856-863；施图贝尔(Stuber)等人，2000，《欧洲临床研究杂志》(Eur.J.Clin.Invest.)，30,594-599)和患有多发性硬化的患者的活动病灶(卡尔博尼等人，2003，《神经免疫学杂志》，145,1-11)中已注意到OX40表达的增加。人气道平滑肌(ASM)上也可以检测到OX40L并且哮喘患者ASM细胞显示出比健康供体对OX40L连接更强的炎性应答，指示哮喘中OX40/OX40L通路的作用(伯吉斯(Burgess)等人，2004，《过敏和临床免疫杂志》(J.Allergy Clin Immunol.)，113,683-689；伯吉斯等人，2005，《过敏和临床免疫杂志》，115,302-308)。还已报导从系统性红斑狼疮(SLE)患者的外周血液分离的CD4+T细胞表达的OX40水平升高，这种升高与疾病活动度相关(帕琴(Patschan)等人，2006，《临床与实验免疫学》(Clin.Exp.Immunol.)，145,235-242)。
鉴于OX40在过敏、哮喘以及与自体免疫和炎症相关的疾病中的作用，一种治疗这些疾病的方法是通过使用抗OX40L抗体或拮抗性抗OX40抗体阻断OX40-OX40L信号传导。
抗OX40L抗体已被描述于参见例如WO2006/029879。已描述许多激动性抗OX40抗体，但非常少拮抗性抗OX40抗体是已知的。兔多克隆抗小鼠OX40抗体由施图贝尔等人，1996，《实验医学杂志》，183,979-989制造，该抗体阻断了OX40与OX40L之间的相互作用。结合人OX40的小鼠单克隆抗体131和315由伊穆拉(Imura)等人，1996，《实验医学杂志》，2185-2195产生。
完整的人拮抗性抗体已被描述于WO2007/062245，这些抗体的最高亲和力对细胞表面表达的OX40(活化T细胞)具有11nM的亲和力。
人源化的拮抗性抗体已被描述于WO2008/106116并且对OX40具有最佳亲和力的抗体具有0.94nM的亲和力。
已描述了其他抗OX40抗体，包括鼠L106(美国专利号6,277,962)和鼠ACT35，可商购自电子生物科学公司(eBioscience)。
我们先前已在国际专利申请号WO2010/096418中描述了高亲和力拮抗性抗OX40抗体。
我们先前也已在国际专利申请号WO2010/035012中描述了一种新颖的多特异性抗体融合分子(下文称作Fab-dsFv且在此示出于图1中)。同一申请提供了可以用于延长该分子半衰期的有用的抗白蛋白结合可变区。
在本发明中，这些白蛋白结合可变区已经改进并且以Fab-dsFv形式与WO2010/096418中描述的抗OX40抗体组合。本发明的新的双特异性分子在与先前描述于WO2010/096418中的Fab'-PEG分子相比时在许多在此描述的体外和体内分析中具有改进的功效。因此，本发明提供了一种结合人OX40和人血清白蛋白两者的双特异性抗体融合蛋白，它适用于治疗或防治由OX40介导或与OX40水平提高相关的病理性病症。
附图简述
图1示出了本发明的一种双特异性抗体融合体(Fab-dsFv形式)。
图2-8示出了与根据本披露的一种抗体有关的某些氨基酸或DNA序列。
图9a示出了AlexaFluor488标记的A26Fab-dsFv与活化的人CD4+OX40+T细胞的结合。
图9b示出了在5％HSA存在下在活化的人CD4+、OX40+T细胞上的A26Fab'、A26Fab-Fv以及A26Fab'-PEG的结合。
图10a示出了A26Fab-dsFv对来自暴露于屋尘螨过敏性提取物的PBMC的细胞因子产生的作用。
图10b示出了A26Fab-dsFv在Hu-NSG小鼠模型中抑制CD4+和CD8+T细胞增殖的能力。
图11a示出了A26Fab-dsFv对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制。
图11b示出了A26Fab'、A26Fab-dsFv、A26Fab'-PEG以及两种对照对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制。
图12a示出了A26Fab-Fv抑制人混合淋巴细胞反应(MLR)。
图12b示出了A26Fab-Fv在人MLR的过程中抑制IFN-γ产生。
图13示出了在使用屋尘螨过敏原提取物进行二级抗原再刺激之后A26Fab-Fv减小活化的(CD25+)CD4+T细胞的百分比。
图14示出了在细胞转移之前投与的Fab-Fv和Fab-PEG在Hu-NSG模型中剂量依赖性地抑制CD4+和CD8+T细胞增殖。
人源化CA044_00026抗OX40抗体在此称为A26。
本发明的抗体融合分子(在此称为Fab-dsFv)在图1中示出。在本发明中，Fab部分(包括第一重链和轻链可变区和恒定域)结合人OX40，并且dsFv部分(包括第二重链和轻链可变区，由二硫键连接)结合人血清白蛋白。具体来说，Fab部分包括来源于拮抗性抗OX40抗体的CDR，并且Fv部分包括人源化抗白蛋白抗体的重链和轻链可变区，并且这些白蛋白结合可变区是由二硫键连接的。
因此，本发明提供了一种结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，包括：
重链，该重链从N端依序包括第一重链可变域(VH1)、CH1域以及第二重链可变域(VH2)，
轻链，该轻链从N端依序包括第一轻链可变域(VL1)、CL域以及第二轻链可变域(VL2)，
其中所述重链和所述轻链被对齐，使得VH1和VL1形成一个第一抗原结合位点并且VH2和VL2形成一个第二抗原结合位点，
其中由该第一抗原结合位点结合的抗原是人OX40，并且由该第二抗原结合位点结合的抗原是人血清白蛋白，具体来说
其中该重链的第一可变域(VH1)包括针对CDR-H1在SEQ ID NO:1中给出的序列、针对CDR-H2在SEQ ID NO:2中给出的序列以及针对CDR-H3在SEQ ID NO:3中给出的序列，并且该轻链的第一可变域(VL1)包括针对CDR-L1在SEQ ID NO:4中给出的序列、针对CDR-L2在SEQ ID NO:5中给出的序列以及针对CDR-L3在SEQ ID NO:6中给出的序列，
其中该第二重链可变域(VH2)具有在SEQ ID NO:11中给出的序列，并且该第二轻链可变域(VL2)具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，并且
该第二重链可变域(VH2)和该第二轻链可变域(VL2)是由二硫键连接的。
抗体可变域中的残基常规地根据由卡巴特(Kabat)等人设计的系统编号。这一系统阐述于卡巴特等人，1987，《免疫感兴趣的蛋白序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，美国卫生和公共服务部(US Department ofHealth and Human Services)，NIH，美国(此后“卡巴特等人(见上文)”)中。除非另外指明时，否则将这一编号系统用于本说明书。
卡巴特Kabat残基命名并不总是直接与氨基酸残基的线性编号对应。无论是框架还是互补决定区(CDR)，实际的线性氨基酸序列可能比严格的Kabat编号包含更少或另外的氨基酸，对应于缩短或插入基本可变域结构的结构组分。对于给定的抗体，残基的正确卡巴特编号可以通过比对抗体序列与“标准”卡巴特编号序列的同源性残基来确定。
重链可变域的CDR根据卡巴特编号系统位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)以及残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(乔西亚C.(Chothia,C.)和莱斯克A.M.(Lesk,A.M.)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.),196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的环从残基26延伸到残基32。因此除非另外指明，否则如在此采用的‘CDR-H1’是打算指残基26到35，如利用卡巴特编号系统和乔西亚的拓扑环定义的组合所述。
轻链可变域的CDR根据卡巴特编号系统位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)以及残基89-97(CDR-L3)。
本发明的双特异性融合蛋白包括先前描述于WO2010/096418中的抗OX40拮抗性抗体的Fab片段。如在此所使用，术语‘拮抗性’描述了一种抗体融合蛋白，它能够抑制和/或中和OX40的生物信号传导活性，例如通过阻断或实质上减少OX40与OX40配体的结合，并且由此抑制OX40的活化。
对抗体进行筛选以鉴别结合OX40的抗体可以使用测量对人OX40的结合的分析和/或测量阻断OX40与其配体OX40L的结合的能力的分析执行。结合分析的一个实例是ELISA，具体来说，它使用被固定在板上的人OX40和人Fc的融合蛋白，并且采用一种结合的二级抗体以检测结合于融合蛋白的抗OX40抗体。阻断分析的一个实例是一种基于流式细胞术的分析，它测量OX40配体融合蛋白结合于人CD4细胞上的OX40的阻断。一种荧光标记的二级抗体被用于检测结合于细胞的OX40配体融合蛋白的量。这一分析是寻找由于上清液中的抗体阻断了配体融合蛋白与OX40的结合而减小的信号。阻断分析的另一个实例是以下分析：其中通过测量氚化胸苷掺入，来测量对由涂布到板上的OX40配体融合蛋白所介导的天然人T细胞共刺激的阻断。
在本发明中，可变区是人源化的。人源化抗体(它们包括CDR移植抗体)是具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子(参见例如US5,585,089；WO91/09967)。应了解，唯一可能必需的是转移这些CDR的特异性决定残基而非整个CDR(参见例如克什米尔(Kashmiri)等人，2005，《方法》(Methods)，36,25-34)。人源化抗体可以任选地进一步包括一个或多个来源于CDR所来源的非人物种的框架残基。
在本发明中，VH1和VL1的CDR是来源于WO2010/096418中所述的称为A26的抗体。因此，在本发明的双特异性抗体融合蛋白中，重链的第一可变域(VH1)包括针对CDR-H1在SEQ ID NO:1中给出的序列、针对CDR-H2在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:23中给出的序列以及针对CDR-H3在SEQ IDNO:3中给出的序列，并且轻链的第一可变域(VL1)包括针对CDR-L1在SEQID NO:4或SEQ ID NO:24中给出的序列、针对CDR-L2在SEQ ID NO:5中给出的序列以及针对CDR-L3在SEQ ID NO:6中给出的序列。
应了解，可以对由本发明提供的CDR作出一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合到OX40以及中和OX40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以轻易地由本领域普通技术人员测试，例如通过使用WO2010/096418中所述的方法进行，从而测定OX40结合和对OX40/OX40L相互作用的抑制。因此，本发明提供了一种对人OX40具有特异性的双特异性抗体，它包括CDRH-1(SEQ ID NO:1)、CDRH-2(SEQ ID NO:2)、CDRH-3(SEQ ID NO:3)、CDRL-1(SEQ ID NO:4)、CDRL-2(SEQ ID NO:5)以及CDRL-3(SEQ ID NO:6)，如图2(c)中所示，例如在该双特异性抗体中，这些CDR中的一者或多者中的一个或多个氨基酸(例如1或2个氨基酸)已被另一个氨基酸(如在此下文所定义的一个类似氨基酸)取代。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链，其中该重链的第一可变域包括三个CDR，其中CDRH-1的序列与在SEQ ID NO:1中给出的序列具有至少90％一致性或相似性，CDRH-2与在SEQ ID NO:2中给出的序列具有至少90％一致性或相似性和/或CDRH-3与在SEQ ID NO:3中给出的序列具有至少90％一致性或相似性。在另一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链，其中该重链的可变域包括三个CDR，其中CDRH-1的序列与在SEQ ID NO:1中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性，CDRH-2与在SEQ ID NO:2中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性和/或CDRH-3与在SEQ ID NO:3中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性。
如在此所使用的“一致性”指示在所比对序列中的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基是相同的。如在此所使用的“相似性”指示在所比对序列中的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基具有相似的类型。举例来说，亮氨酸可以被异亮氨酸或缬氨酸取代。其他可以经常彼此取代的氨基酸包括(但不限于)：
-苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸以及组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及
-半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。可以容易地计算出一致性和相似性的程度(《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology)，莱斯克A.M.编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(Biocomputing.Informatics and Genome Projects)，史密斯D.W.(Smith,D.W.)编，学术出版社(Academic Press)，纽约，1993；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1部分，格里芬A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬H.G.(Griffin,H.G.)编，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西，1994；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in MolecularBiology)，冯海因耶G.(von Heinje,G.)，学术出版社，1987，《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer)，格里布斯科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编,M斯多克顿出版社(M Stockton Press)，纽约，1991，可获得自NCBI的BLASTTM软件(阿特休尔S.F.(Altschul,S.F.)等人，1990，《分子生物学杂志》215:403-410；吉什W.(Gish,W.)和斯特丝D.J.(States,D.J.)1993，《自然-遗传学》(Nature Genet.)3:266-272。麦顿T.L.(Madden,T.L.)等人，1996，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)266:131-141；阿特休尔S.F.等人，1997，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402；张J.(Zhang,J.)和麦顿T.L.1997，《基因组研究》(Genome Res.)7:649-656)。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的第一可变域包括三个CDR，其中CDRL-1的序列与在SEQ ID NO:4中给出的序列具有至少90％一致性或相似性，CDRH-2与在SEQ ID NO:5中给出的序列具有至少90％一致性或相似性和/或CDRH-3与在SEQ ID NO:6中给出的序列具有至少90％一致性或相似性。在另一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的第一可变域包括三个CDR，其中CDRL-1的序列与在SEQ ID NO:4中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性，CDRL-2与在SEQ ID NO:5中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性和/或CDRL-3与在SEQ ID NO:6中给出的序列具有至少95％或98％一致性或相似性。
在一个实施例中，由本发明提供的双特异性抗体融合蛋白的Fab部分是人源化或CDR移植抗体分子，其包括SEQ ID NO:1、2、3、4、5和/或6(图2(c))中提供的CDR中的一者或多者或其变体。如在此所使用，术语‘CDR移植抗体分子’是指以下抗体分子，其中重链和/或轻链包含一个或多个来自供体抗体(例如鼠单克隆抗体)的CDR(如果希望的话，包括一个或多个修饰的CDR)，这一个或多个CDR被移植到接受体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区框架。关于综述，参见沃恩(Vaughan)等人，《自然-生物技术》(NatureBiotechnology)，16,535-539,1998。在一个实施例中，并非转移整个CDR，而是仅将来自上文在此所述的任何一个CDR的一个或多个特异性决定残基转移到人抗体框架(参见例如克什米尔等人，2005，《方法》，36,25-34)。在一个实施例中，仅将来自上文在此所述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移到人抗体框架。在另一个实施例中，仅将来自上文在此所述的每个CDR的特异性决定残基转移到人抗体框架。
当CDR或特异性决定残基被移植时，可以顾及这些CDR所来源的供体抗体的种类/类型使用任何适当接受体可变区框架序列，包括小鼠、灵长类动物以及人框架区。适当地，根据本发明的CDR移植抗体具有包括人接受体框架区以及上述一个或多个CDR或特异性决定残基的可变域。因此，在一个实施例中提供了其中可变域包括人接受体框架区和非人供体CDR的中和性CDR移植抗体。
可以用于本发明的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY以及POM(卡巴特等人，见上文)。举例来说，KOL和NEWM可以用于重链，REI可以用于轻链，并且EU、LAY以及POM可以用于重链和轻链两者。可替代地，可以使用人种系序列；这些可获自：http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/。
在本发明的CDR移植抗体中，接受体重链和轻链并不一定需要来源于同一抗体并且如果希望的话，可以包括具有来源于不同链的框架区的复合链。
本发明的第一重链可变域(VH1)的适合的框架区来源于人亚群VH3序列1-33-07以及JH4。第一轻链可变域(VL1)的轻链的适合的框架区来源于人种系亚群VK1序列2-11-02以及JK4。
此外，在本发明的CDR移植抗体可变区中，框架区不需要与接受体抗体的那些具有完全相同的序列。举例来说，罕见残基可以变成对该接受体链类别或类型更频繁存在的残基。可替代地，接受体框架区中所选的残基可以被改变以使它们对应于供体抗体的相同位置处发现的残基(参见赖克曼(Reichmann)等人，1998，《自然》，332,323-324)。这样的改变应保持最小必要性以恢复供体抗体的亲和力。一种选择接受体框架区中可能需要被改变的残基的方案阐述于WO91/09967中。
适当地，在本发明的第一重链可变区(VH1)中，如果接受体重链具有人VH3序列1-33-07以及JH4，那么该重链的接受体框架区除包括一个或多个供体CDR外，还在位置37、73、78或94(根据卡巴特等人(见上文))中的至少一者处包括供体残基。因此，提供了一种双特异性抗体融合蛋白，其中至少在重链的第一可变域的位置37、73、78以及94处的残基是供体残基。
适当地，在本发明的第一轻链可变区(VL1)中，如果接受体轻链具有人亚群VK1序列2-11-02以及JK4，那么该轻链的接受体框架区除包括一个或多个供体CDR外，还在位置64或71中的至少一者处包括供体残基。因此，提供了一种双特异性抗体融合蛋白，其中至少在轻链的第一可变域的位置64和71处的残基是供体残基。
供体残基为来自供体抗体(即CDR最初来源的抗体)的残基。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链，其中该重链的第一可变域(VH1)包括在图2(b)SEQ ID NO:8中给出的序列。
应了解，可以对由本发明提供的第一重链和轻链可变域作出一个或多个氨基酸(例如1或2个氨基酸)取代、添加和/或缺失而不显著改变抗体融合蛋白结合到OX40以及中和OX40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以容易地由本领域普通技术人员测试，例如通过使用WO2010/096418中所述的方法进行，从而测定OX40结合和配体阻断。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链，其中该重链的第一可变域包括与在图2(b)SEQ ID NO:8中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。在一个实施例中，本发明的抗体融合蛋白包括重链(VH1)，其中该重链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:8中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的第一可变域(VL1)包括在图2(a)SEQ ID NO:7中给出的序列。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:7中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。在一个实施例中，本发明的抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:7中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链和轻链，其中该重链的第一可变域(VH1)包括在SEQ ID NO:8中给出的序列，其中该轻链的第一可变域(VL1)包括在SEQ ID NO:7中给出的序列。
在本发明的另一个实施例中，抗体融合蛋白包括重链和轻链，其中该重链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:8中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列，并且该轻链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:7中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。适当地，抗体融合蛋白包括重链和轻链，其中该重链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:8中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列，其中该轻链的第一可变域包括与在SEQ ID NO:7中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
在本发明的双特异性抗体融合蛋白中，重链包括CH1域，并且轻链包括CL域，或者κ或者λ。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合蛋白包括重链和轻链，其中该重链包括在SEQ ID NO:10中给出的序列，其中该轻链包括在SEQ ID NO:9中给出的序列。
应了解，可以对由本发明提供的抗体可变域和/或恒定域作出一个或多个氨基酸(例如1或2个氨基酸)取代、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合到OX40以及中和OX40活性的能力。任何氨基酸取代、添加和/或缺失的作用可以容易地由本领域普通技术人员测试，例如通过使用WO2010096418中所述的方法进行，从而测定OX40结合和OX40/OX40L相互作用的阻断。
在本发明的一个实施例中，抗体融合蛋白包括重链，其中重链的VH1和CH1域包括与在SEQ ID NO:10中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。适当地，抗体融合蛋白包括重链，其中重链的VH1和CH1域包括与在SEQ ID NO:10中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
在一个实施例中，根据本发明的双特异性抗体融合分子包括轻链，该轻链包括在图2(d)SEQ ID NO:9中给出的序列。
在本发明的一个实施例中，抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的VL1和CH1域包括与在SEQ ID NO:9中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。举例来说，抗体融合蛋白包括轻链，其中该轻链的VL1和CL域包括与在SEQ ID NO:9中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
由本发明的双特异性抗体融合蛋白结合的第二抗原是人血清白蛋白。这是由Fab-dsFv的Fv部分结合的，该Fv部分是由第二重链和轻链可变域VH2和VL2组成。在本发明中，VH2和VL2是来源于WO2010/035012中所述的抗体中的一者，并且代表该抗体的一种改进的更人化的移植物。
在一个实施例中，第二重链可变域(VH2)具有在图3(a)SEQ ID NO:11中给出的序列。
在一个实施例中，第二轻链可变域(VL2)具有在图3(b)SEQ ID NO:12中给出的序列。
因此，本发明提供了一种结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，包括：
重链，从N端依序包括第一重链可变域(VH1)、CH1域以及第二重链可变域(VH2)，
轻链，从N端依序包括第一轻链可变域(VL1)、CL域以及第二轻链可变域(VL2)，
其中所述重链和所述轻链被对齐，使得VH1和VL1形成一个第一抗原结合位点并且VH2和VL2形成一个第二抗原结合位点，
其中由该第一抗原结合位点结合的抗原是人OX40，并且由该第二抗原结合位点结合的抗原是人血清白蛋白，
其中该重链的第一可变域(VH1)包括针对CDR-H1在SEQ ID NO:1中给出的序列、针对CDR-H2在SEQ ID NO:2中给出的序列以及针对CDR-H3在SEQ ID NO:3中给出的序列，并且该轻链的第一可变域(VL1)包括针对CDR-L1在SEQ ID NO:4中给出的序列、针对CDR-L2在SEQ ID NO:5中给出的序列以及针对CDR-L3在SEQ ID NO:6中给出的序列，
其中该第二重链可变域(VH2)具有在SEQ ID NO:11中给出的序列，并且该第二轻链可变域(VL2)具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，并且
该第二重链可变域(VH2)和该第二轻链可变域(VL2)是由二硫键连接的。
优选地，CH1域和第二重链可变域(VH2)经由连接子连接，并且CL域和第二轻链可变域(VL2)经由连接子连接。任何适合的肽连接子序列都可以被使用，并且这些肽连接子序列在每条链中可以是相同的或不同的。适合的连接子先前已描述于WO2010/035012中并且通过引用结合在此。适合的连接子的实例在图3(c)和(d)中示出。在一个实施例中，CH1域与第二重链可变域(VH2)之间的连接子包括在图3(c)SEQ ID NO:13中给出的序列或者由其组成。在一个实施例中，CH1域与第二重链可变域(VH2)之间的连接子包括在图3(c)SEQ ID NO:14中给出的序列或者由其组成。在一个实施例中，CL域与第二轻链可变域(VL2)之间的连接子包括在图3(d)SEQ ID NO:14中给出的序列或者由其组成。
在一个实施例中，轻链中的连接子是15个氨基酸序列，具体来说GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)。
在一个实施例中，重链中的连接子是16个氨基酸序列，具体来说SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO:30)。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗体融合蛋白，其中该重链包括在图3(e)(SEQ ID NO:15)中给出的序列或者由其组成，并且轻链包括在图3(f)(SEQ ID NO:16)中给出的序列或者由其组成。
在本发明的一个实施例中，双特异性抗体融合蛋白包括重链和轻链，其中该重链包括与在SEQ ID NO:15中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列，并且该轻链包括与在SEQ ID NO:16中给出的序列具有至少60％一致性或相似性的序列。总体而言，抗体融合体包括重链和轻链，其中该重链包括与在SEQ ID NO:15中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列，其中该轻链包括与在SEQ ID NO:16中给出的序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％一致性或相似性的序列。
本发明的抗体融合分子适当地具有高结合亲和力，具体来说对于人OX40的皮摩尔亲和力和对于人血清白蛋白的纳摩尔亲和力。亲和力可以使用本领域已知的任何适合方法，包括表面等离子共振，例如BIAcoreTM，如针对WO2010096418中OX40和WO2010/035012中血清白蛋白所述，使用分离的天然或重组OX40或血清白蛋白或适合的融合蛋白/多肽来测量。
在一个实例中，亲和力使用如WO2010/096418中所述的重组人OX40胞外域来测量。在一个实例中，所用的重组人OX40胞外域是二聚体，例如Fc融合二聚体。适当地，本发明的抗体融合分子对分离的人OX40具有约200pM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体分子具有约100pM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体分子具有约50pM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体融合分子具有约40pM或更小的结合亲和力。
本发明的抗体融合分子适当地对在活化T细胞的表面上表达的人OX40具有高结合亲和力，例如纳摩尔或皮摩尔亲和力。亲和力可以使用本领域已知的任何适合方法(包括WO2010096418中所述的方法)使用活化的CD4+OX40+人T细胞来测量。具体来说，本发明的抗体融合分子对细胞表面表达的人OX40具有约2nM或更好的结合亲和力。在一个实例中，本发明的抗体分子对细胞表面表达的人OX40具有约1nM或更好的结合亲和力。在另一个实例中，本发明的抗体分子对细胞表面表达的人OX40具有约0.5nM或更好的结合亲和力。在另一个实例中，本发明的抗体分子对细胞表面表达的人OX40具有约0.2nM或更好的结合亲和力。
适当地，本发明的抗体融合分子对分离的人血清白蛋白具有约50nM或更小的结合亲和力。适当地，本发明的抗体融合分子对分离的人血清白蛋白具有约20nM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体分子具有约10nM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体分子具有约5nM或更小的结合亲和力。在一个实施例中，本发明的抗体融合分子具有约2nM或更小的结合亲和力。
本发明的抗体融合分子可以结合人血清白蛋白和食蟹猕猴、小鼠以及大鼠血清白蛋白。在一个实施例中，本发明的抗体融合蛋白以5nM或更小的亲和力结合食蟹猕猴血清白蛋白。在一个实施例中，本发明的抗体融合蛋白以5nM或更小的亲和力结合小鼠血清白蛋白。
本发明的抗体融合分子能够同时结合人OX40和人血清白蛋白。
有利地，本发明的融合分子对OX40具有高亲和力并且还具有治疗有用的适当体内半衰期，例如半衰期在5-15天范围内，如7-11天。
应了解，由本发明提供的抗体融合蛋白对人OX40和/或人血清白蛋白的亲和力可以使用本领域已知的任何适合方法改变。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，这些变体对OX40或人血清白蛋白具有提高的亲和力。这些变体可以通过许多亲和力成熟方案获得，包括使CDR突变(杨(Yang)等人，《分子生物学杂志》，254,392-403,1995)、链改组(马克斯(Marks)等人，《生物技术》(Bio/Technology)，10,779-783,1992)、大肠杆菌增变菌株的使用(楼(Low)等人，《分子生物学杂志》，250,359-368,1996)、DNA改组(帕特恩(Patten)等人，《生物技术新见》(Curr.Opin.Biotechnol.)，8,724-733,1997)、噬菌体展示(汤普森(Thompson)等人，《分子生物学杂志》，256,77-88,1996)以及有性PCR(克拉默瑞(Crameri)等人，《自然》，391,288-291,1998)。沃恩等人(见上文)讨论了亲和力成熟的这些方法。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体融合分子阻断OX40与OX40L之间的相互作用。适用于确定抗体阻断这一相互作用的能力的许多分析描述于WO2010/096418中。在一个实施例中，本发明提供了一种对人OX40具有特异性的抗体融合蛋白，它能够在低于0.5nM的浓度下抑制人OX40L(在2μg/ml的最终浓度下测试)与活化的人CD4+OX40+T细胞结合达50％。在一个实施例中，用于该分析的人OX40L是天然人OX40。在一个实施例中，用于该分析的人OX40是重组人OX40。
如果希望的话，用于本发明的抗体可以结合于一个或多个效应分子。应了解，该效应分子可以包括单个效应分子或者两个或更多个如此连接的这类分子以形成可以连接于本发明的抗体的单个部分。当所希望的是获得与效应分子连接的抗体片段时，这可以通过标准化学或重组DNA程序制备，在这些程序中该抗体片段或者直接或者经由偶联剂与效应分子连接。用于将这类效应分子结合到抗体的技术为本领域所熟知(参见海尔斯特伦(Hellstrom)等人，《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)，第2版，鲁宾逊(Robinson)等人编，1987，第623-53页；索普(Thorpe)等人，1982，《免疫学综述》(Immunol.Rev.)，62:119-58以及杜博维奇克(Dubowchik)等人，1999，《药理学与治疗学》(Pharmacology and Therapeutics)，83,67-123)。具体的化学程序包括例如描述于WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476以及WO03/031581中的那些。可替代地，当效应分子为蛋白或多肽时，连接可以使用重组DNA程序实现，例如WO86/01533和EP0392745中所述。
如在此所使用的术语效应分子包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白例如酶、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段例如DNA、RNA和其片段、放射性核素、特别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子以及报导基团如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱检测的化合物。
效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒素剂，包括对细胞有害的(例如杀死细胞)的任何药剂。实例包括考布他汀、海兔毒素、埃博霉素、星形孢菌素、美登木素生物碱、海绵抑制素、根瘤菌素、软海绵素、杆孢菌素、哈米特林(hemiasterlin)、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔以及嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。
效应分子还包括(但不限于)抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-疏基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C以及顺二氯二氨合铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(原先的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(原先的放线菌素)、博莱霉素、光神霉素、安曲霉素(AMC)、刺孢霉素或倍癌霉素)以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
其他效应分子可以包括螯合的放射性核素，如111In和90Y、Lu177、铋213、锎252、铱192以及钨188/铼188；或药物如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷以及苏拉明。其他效应分子包括蛋白、肽以及酶。感兴趣的相关酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的相关蛋白、多肽以及肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织纤溶酶原激活物、血栓生成剂或抗血管生成剂，例如血管抑制素或内皮抑制素，或者，生物应答调节剂如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应分子可以包括适用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括不同酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描)以及非放射性顺磁金属离子。总体上参见美国专利号4,741,900关于可以结合于抗体用作诊断剂的金属离子。适合的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基包括链霉亲和素、抗生物素蛋白以及生物素；适合的荧光物质包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯以及藻红蛋白；适合的发光物质包括鲁米诺；适合的生物发光物质包括萤光素酶、萤光素以及水母素；并且适合的放射性核素包括125I、131I、111In以及99Tc。
当效应分子为聚合物时，它可以总体上为合成或天然存在的聚合物，例如任选被取代的直链或分支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或者分支链或非分支链多糖，例如同多糖或杂多糖。
可以可能存在于上述合成聚合物上的特定任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的特定实例包括任选被取代的直链或分支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选被取代的聚(乙二醇)如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如在此所使用的“衍生物”打算包括反应衍生物，例如硫醇选择性反应基团，如马来酰亚胺等。该反应基团可以直接与聚合物连接或通过连接子区段与聚合物连接。应了解，这类基团的残基在一些情况下将作为抗体片段与聚合物之间的连接基团形成产物的一部分。
聚合物的大小可以如所希望的变化，但总体上平均分子量范围将为从500Da到50000Da，例如从5000到40000Da，如从20000到40000Da。
在一个实例中，适合的效应分子可以通过位于抗体融合蛋白中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基)连接。这类氨基酸可以天然存在于抗体片段中或者可以使用重组DNA方法工程化到片段中(参见例如US5,219,996；US5,667,425；WO98/25971)。
本发明还提供了一种分离的DNA序列，它编码本发明的抗体分子的一条或多条重链和/或轻链。适当地，该DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可以包括例如通过化学加工而制造的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。编码本发明的抗体分子的DNA序列可以通过本领域普通技术人员熟知的方法获得。举例来说，编码一部分或完全的抗体重链和轻链的DNA序列可以如所希望的从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成。
编码接受体框架序列的DNA对于本领域普通技术人员来说为广泛可获得的并且可以容易地基于其已知的氨基酸序列合成。
分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。所希望的DNA序列可以完全或部分使用寡核苷酸合成技术合成。适当时可以使用定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术。
适合的序列的实例提供于：图5(a)SEQ ID NO:21；图5(b)SEQ ID NO:22；图6(a)SEQ ID NO:23；图6(b)SEQ ID NO:24。SEQ ID NO21中的核苷酸1-63和SEQ ID NO:23中的核苷酸1-63编码信号肽序列OmpA，将该信号肽序列裂解以得到本发明的拮抗性抗体融合分子。本发明还提供了一种分离的DNA序列，它编码包括SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的本发明的抗体融合蛋白的重链。本发明还提供了一种分离的DNA序列，它编码包括SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的本发明的抗体融合分子的轻链。
适合的序列的其他实例提供于：图7(a)SEQ ID NO:25；图7(b)SEQ IDNO:26；图8(a)SEQ ID NO:27；图6(b)SEQ ID NO:28。SEQ ID NO25中的核苷酸1-57和SEQ ID NO27中的核苷酸1-60编码来自小鼠抗体B72.3的信号肽序列(维妥(Whittle)等人，1987，《蛋白质工程》(Protein Eng.)1(6)499-505)，将该信号肽序列裂解以得到本发明的拮抗性抗体融合分子。本发明还提供了一种分离的DNA序列，它编码包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的本发明的抗体融合蛋白的重链。本发明还提供了一种分离的DNA序列，它编码包括SEQID NO:27或SEQ ID NO:28的本发明的抗体融合分子的轻链。
本发明还涉及一种克隆或表达载体，它包括本发明的一个或多个DNA序列。因此，提供了一种克隆或表达载体，它包括编码本发明的抗体融合蛋白的一个或多个DNA序列。适当地，该克隆或表达载体包括两个DNA序列，分别编码本发明的抗体分子的轻链和重链。适当地，根据本发明的载体包括在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23中给出的序列。SEQ ID NO21中的核苷酸1-63和SEQ ID NO23中的核苷酸1-63编码来自OmpA的信号肽序列。
可以构建载体的一般方法、转染方法以及培养方法为本领域普通技术人员熟知。在这一方面，参考“《现代分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecular Biology)”，1999，F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)(编)，威利跨学科(Wiley Interscience)，纽约和由冷泉港(Cold Spring Harbor)出版的《马尼亚蒂手册》(Maniatis Manual)。
还提供了一种宿主细胞，包括一个或多个克隆或表达载体，该一个或多个克隆或表达载体包括一个或多个编码本发明的抗体融合蛋白的DNA序列。任何适合的宿主细胞/载体系统都可以用于表达编码本发明的抗体分子的DNA序列。可以使用细菌例如大肠杆菌和其他微生物系统，或者还可以使用真核例如哺乳动物宿主细胞表达系统。适合的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。
本发明还提供了一种用于产生根据本发明的抗体融合分子的方法，包括将包含本发明的载体的宿主细胞在适于引起从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养，以及分离该抗体分子。
对于产生包括重链和轻链两者的产物，细胞株可以用两种载体转染，即编码轻链多肽的一个第一载体和编码重链多肽的一个第二载体。可替代地，可以使用单一载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。
由于本发明的抗体融合蛋白有用于治疗和/或防治病理性病况，所以本发明还提供了一种医药或诊断组合物，它包括本发明的抗体分子以及医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一者或多者。因此，提供了本发明的抗体融合蛋白的用途，用于制造药物。该组合物通常将作为通常将作为包括医药学上可接受的载剂的无菌医药组合物的一部分提供。本发明的医药组合物可以另外地包括医药学上可接受的佐剂。
本发明还提供了一种用于制备医药或诊断组合物的方法，包括添加并且混合本发明的抗体融合分子以及医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一者或多者。
该抗体融合分子可以是医药或诊断组合物中唯一的活性成分或者可以伴随其他活性成分，包括其他抗体成分例如抗TNF、抗IL-1β、抗T细胞、抗IFNγ或抗LPS抗体，或非抗体成分如黄嘌呤。其他适合的活性成分包括能够诱导耐受性的抗体，例如抗CD3或抗CD4抗体。
在另一个实施例中，根据本披露的抗体融合蛋白或组合物与另外的医药活性剂组合使用，该医药活性剂为例如皮质类固醇(如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激动剂(如沙丁胺醇、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(如雷帕霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤)或替代的CD28和/或CD40抑制剂。在一个实施例中，该抑制剂是小分子。在另一个实施例中，该抑制剂是对标靶具有特异性的抗体。
医药组合物适当地包括治疗有效量的本发明的抗体融合蛋白。如在此所使用的术语“治疗有效量”是指对治疗、改善或预防目标疾病或病况所需的治疗剂的量或对表现出可检测的治疗或预防作用所需的治疗剂的量。对于任何抗体，治疗有效量可以最初或者在细胞培养分析中或者在动物模型中，通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估算。动物模型还可以用于确定投药的适当浓度范围和途径。这类信息可以接着用于确定对于在人中投药的适用剂量和途径。
人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状况的严重性、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重以及性别、饮食、投药时间和频率、一种或多种药物组合、反应灵敏度以及对疗法的耐受/应答。这个量可以通过常规实验测定并且在临床医生的判断范围内。总体而言，治疗有效量将为从0.01mg/kg到50mg/kg，例如0.1mg/kg到20mg/kg。医药组合物可以便利地以每剂包含预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式呈现。
组合物可以单独地投与患者或者可以与其他药剂、药物或激素组合(例如同时、依序或分别地)投与。
本发明的抗体融合分子投与的剂量取决于待治疗病况的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是否被防治性地使用或用于治疗已存在的病况。
剂量的频率将取决于抗体融合分子的半衰期和它作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2到10小时)，那么它可以有必要每天给予一个或多个剂量。可替代地，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2到15天)，那么它可以仅需每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次给予一个剂量。
医药学上可接受的载剂本身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且不应有毒。适合的载剂可以为大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及失活的病毒粒子。
可以使用医药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐以及硫酸盐，或者有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐以及苯甲酸盐。
治疗组合物中的医药学上可接受的载剂可以另外地包含液体，如水、盐水、甘油以及乙醇。另外，辅助物质如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于这类组合物中。这些载剂使医药组合物能够配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液以及悬浮液，用于被患者摄取。
用于投药的适合形式包括适于胃肠外投药的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或持续输注。当产品用于注射或输注时，它可以采取在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且它可以包含配制剂，如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，该抗体分子可以呈干燥的形式，用于使用前用适当无菌液体复原。
一旦配制，本发明的组合物即可以直接投与受试者。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施例中，组合物适合投与人受试者。
适当地，在根据本披露的配制品中，最终配制品的pH值不类似于抗体或片段的等电点的值，举例来说，如果配制品的pH值是7，那么pI值为从8-9或更高可以为适当的。尽管不希望受理论所约束，但据认为这可能最终提供具有改进的稳定性的最终配制品，例如抗体或片段保持在溶液中。
在一个方面中，有利地，本披露的融合分子不具有对应于整个中性分子的pI值。这使分子变得更不易于聚集。
本发明的医药组合物可以通过许多途径投与，包括(但不限于)口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。皮下注射器也可以用于投与本发明的医药组合物。典型地，这些治疗组合物可以制备为可注射剂，即或者作为液体溶液或者悬浮液。也可以制备在注射前适于溶于或悬浮于液体媒剂中的固体形式。
组合物的直接递送总体上将通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射或者递送到组织的间质间隙来实现。组合物还可以投与到病灶内。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
应了解，组合物中的活性成分将是抗体分子。因此，它将易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物待通过使用胃肠道的途径投与，那么组合物将需要包含以下药剂，它们保护抗体免受降解，但一旦它们从胃肠道吸收就释放抗体。
医药学上可接受的载剂的全面论述在《雷明登氏制药科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)(马克出版公司(Mack Publishing Company)，新泽西州(N.J.)1991)中是可获得的。
在一个实施例中，配制品作为用于包括吸入在内的局部投药的配制品提供。
适合的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含推进剂气体的计量气雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液。包含活性物质的根据本披露的可吸入粉剂可以仅由上述活性物质或上述活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。
这些可吸入粉剂可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡聚糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些彼此的混合物。适合使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，尤其但非独占地以其水合物的形式。
用于肺中沉积的粒子要求粒度小于10微米，如1-9微米，例如从0.1到5μm，特别地从1到5μm。活性成分(如抗体或片段)的粒度是首要重要的。
可以用于制备可吸入气雾剂的推进剂气体为本领域中已知。适合的推进剂气体是选自以下各项中：烃，如正丙烷、正丁烷或异丁烷，和卤代烃，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可以单独使用或以其混合物使用。
具体来说，适合的推进剂气体为选自以下各项中的卤代烷烃衍生物：TG11、TG12、TG134a以及TG227。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物是特别适合的。
包含推进剂气体的可吸入气雾剂还可以包含其他成分，如共溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活性物质)、抗氧化剂、润滑剂以及用于调节pH值的工具。所有这些成分均为本领域已知。
根据本发明的包含推进剂气体的可吸入气雾剂可以包含最多5重量％的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如0.002重量％到5重量％、0.01重量％到3重量％、0.015重量％到2重量％、0.1重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％或0.5重量％到1重量％的活性成分。
可替代地，对肺的局部投药还可以通过液体溶液或悬浮液配制品投与，例如采用如喷雾器例如连接到压缩器的喷雾器(例如连接到弗吉尼亚州里奇蒙的帕里呼吸设备公司(Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.)生产的PariMaster(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)的装置。
本发明的抗体融合蛋白可以分散于溶剂中例如以溶液或悬浮液的形式递送。它可以悬浮于适当生理溶液例如盐水或其他药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液。本领域中已知的缓冲溶液每1mL水可以包含0.05mg到0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg到9.0mg NaCl、0.15mg到0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg到0.30mg无水柠檬酸以及0.45mg到0.55mg柠檬酸钠，以便实现约4.0到5.0的pH值。悬浮液可以采用例如冻干抗体。
治疗性悬浮液或溶液配制品还可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂为本领域熟知，并且包括缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液以及碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇以及甘油。溶液或悬浮液可以囊封在脂质体或生物可降解微球体内。配制品总体上将采用无菌生产工艺以实质上无菌的形式提供。
这可以包括通过以下方式产生和灭菌：利用本领域的普通技术人员熟悉的方法，过滤用于配制品(无菌缓冲溶剂溶液中抗体的无菌悬浮液)的缓冲溶剂/溶液，并且将该配制品分配到无菌容器中。
可以提供根据本披露的可雾化配制品，例如作为包装于箔包封中的单一剂量单位(例如密封的塑料容器或小瓶)。每个小瓶在例如2mL溶剂/溶液缓冲液的体积中包含单位剂量。
在此披露的抗体融合蛋白可以适用于经由雾化递送。
还考虑的是，本发明的抗体可以通过使用基因疗法投与。为了实现此目的，将在适当DNA组分的控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者中，使得抗体链从DNA序列中表达出来并在原位装配。
本发明还提供了一种用于控制炎性疾病(例如急性或慢性炎性疾病)的抗体融合分子(或包括它的组合物)。适当地，抗体分子(或包括其的组合物)可以用于减少炎症过程或预防炎症过程。在一个实施例中，提供了活化T细胞的体内减少、特别是涉及不当炎症免疫应答的那些，例如募集到这类应答的附近/部位。
如在此所用的活化T细胞的减少可以为与治疗前或未治疗相比减少10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多百分比。有利地，用根据本发明的抗体、片段或组合物治疗可以允许活化T细胞的水平的降低，而不降低患者T细胞的一般水平(未活化T细胞)。这可以引起更少的副作用，并且可能预防患者的T细胞耗竭。
本发明还提供了本发明的抗体融合分子用于治疗或防治由OX40介导或与OX40水平提高相关的病理性病症。该病理性病况可以例如选自下组，该组由以下各项组成：感染(病毒性、细菌性、真菌性以及寄生虫性)、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、盆腔炎症性疾病、阿尔茨海默氏病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼病、腹部疾病、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癣、血管炎、外科粘连、中风、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自体免疫葡萄膜炎、免疫介导的中枢和外周神经系统的炎性病症如多发性硬化、狼疮(如系统性红斑狼疮和狼疮肾炎)和格-巴综合征、特应性皮炎、自体免疫肝炎、纤维化肺泡炎、格雷氏病、IgA肾病变、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、类肉瘤病、硬皮症、韦格纳氏肉芽肿病、其他自体免疫病症、胰脏炎、外伤(手术)、移植物抗宿主疾病、移植排斥、心脏病包括缺血性疾病如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎以及胃酸过少。
在一个实施例中，根据本发明的抗体融合蛋白用于治疗过敏、COPD、自体免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、重症肌无力、格雷氏病、移植排斥、韦格纳氏肉芽肿病、亨-舍二氏紫癜、系统性硬化或病毒诱发的肺部炎症。
在一个实施例中，根据本发明的抗体融合蛋白用于治疗一种选自下组的疾病，该组由以下各项组成：过敏、COPD、自体免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、重症肌无力、格雷氏病、移植排斥、韦格纳氏肉芽肿病、亨-舍二氏紫癜、系统性硬化以及病毒诱发的肺部炎症。
本发明还提供了根据本发明的抗体融合分子用于治疗或防治疼痛，特别是与炎症相关的疼痛。
在一个实施例中，本披露的融合分子起作用所通过的机制包括以下各项中的一者或多者：T细胞增殖或存活的抑制、TReg产生的增强、减少的B细胞的分化和/或减少的细胞因子产生。
本发明进一步提供了根据本发明的抗体融合分子或组合物在制造用于治疗或防治由OX40介导或与OX40水平提高相关的病理性病症的药物中的用途，具体来说该病理性病症为类风湿性关节炎、哮喘或COPD。
本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子、片段或组合物在制造用于治疗或防治一种或多种在此所述的医学适应症的药物中的用途。
本发明的抗体融合分子或组合物可以用于任何其中所希望的是减少OX40在人或动物身体中的作用的疗法中。OX40可以在身体中循环或者可以按不希望的高水平集中位于身体的特定部位例如炎症部位。
在一个实施例中，将本发明的抗体融合分子或包括其的组合物用于控制炎性疾病，例如在此所述的。
本发明还提供了一种治疗罹患由OX40介导的病症或处于由OX40介导的病症的风险的人或动物受试者的方法，该方法包括投与该受试者有效量的本发明的抗体融合分子或包括其的组合物。
在一个实施例中，提供了一种结合人OX40和人血清白蛋白的纯化的双特异性抗体融合蛋白，以实质上纯化的形式，特别是不含或实质上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白或DNA。
如上文所用的纯化的形式打算指至少90％的纯度，如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更纯。
实质上不含内毒素总体上打算指每mg抗体产物的内毒素含量为1EU或更少，如每mg产物0.5或0.1EU。
实质上不含宿主细胞蛋白或DNA总体上打算指每mg抗体产物的宿主细胞蛋白和/或DNA含量为400μg或更少，如100μg/mg或更少，特别是适当时20μg/mg。
本发明的抗体融合分子还可以用于诊断，例如涉及OX40的疾病状态的体内诊断和成像。
有利的是，本发明融合分子被认为对于按适当治疗剂量投与人来说是安全的，具体来说因为它们并不是超激动剂并且不太可能引起细胞因子风暴。
如在此所用的超激动剂是指在不存在TCR衔接下扩增T细胞的抗体。
在一个实施例中，A26Fab-Fv减小分裂指数指示了群体中更少的细胞致力于分裂；这一作用推测由表达OX40的NK细胞所介导。分裂指数代表了原始群体中的细胞已经历的细胞分裂的平均数并且包括未分裂的细胞。
增殖指数反映了仅应答群体的增殖，并且在一个实施例中使用这一量度的A26Fab-Fv的抑制作用相对地降低。
在本说明书的内容中包含打算意指包括。
当技术上适当时，本发明的实施例可以组合。
实施例在此描述为包括某些特征/要素。本披露还延伸到分开由所述特征/要素组成或基本由所述特征/要素组成的实施例。
本发明在以下实例中通过仅阐述的方式进一步描述，这些实例是指附图，在这些附图中：
实例
图式详解：
图1：一种本发明的双特异性抗体融合蛋白，称为Fab-dsFv。
图2：
a)抗体A26的轻链V区(SEQ ID NO:7)
b)抗体A26的重链V区(SEQ ID NO:8)
c)抗体A26的CDRH1(SEQ ID NO:1)、CDRH2(SEQ ID NO:2)、CDRH3(SEQ ID NO:3)、CDRL1(SEQ ID NO:4)、CDRL2(SEQ ID NO:5)以及CDRL3(SEQ ID NO:6)。
d)抗体A26Fab组分的轻链(SEQ ID NO:9)
e)抗体A26Fab组分的重链(SEQ ID NO:10)
图3
a)抗白蛋白Fv组分645gH5的重链(SEQ ID NO:11)
b)抗白蛋白Fv组分645gL4的轻链(SEQ ID NO:12)
c)连接子1(SEQ ID NO:13)
d)连接子2(SEQ ID NO:14)
e)Fab-dsFv重链(SEQ ID NO:15)
f)Fab-dsFv轻链(SEQ ID NO:16)
图4
a)645g1重链可变域(SEQ ID NO:17)
b)645g1轻链可变域(SEQ ID NO:18)
c)A26Fab-dsFv645gH1(SEQ ID NO:19)
d)A26Fab-dsFv645gL1(SEQ ID NO:20)
图5
a)编码包括OmpA前导子的Fab-dsFv的重链的DNA(SEQ ID NO:21)
b)编码不具有OmpA前导子的Fab-dsFv的重链的DNA(SEQ ID NO:22)
图6
a)编码包括OmpA前导子的Fab-dsFv的轻链的DNA(SEQ ID NO:23)
b)编码不具有OmpA前导子的Fab-dsFv的轻链的DNA(SEQ ID NO:24)
图7
a)编码包括B72.3前导子的Fab-dsFv的重链的DNA(SEQ ID NO:25)
b)编码不具有B72.3前导子的Fab-dsFv的重链的DNA(SEQ ID NO:26)
图8
a)编码包括B72.3前导子的Fab-dsFv的轻链的DNA(SEQ ID NO:27)
b)编码不具有B72.3前导子的Fab-dsFv的轻链的DNA(SEQ ID NO:28)
图9a示出了AlexaFluor488标记的A26Fab-dsFv与活化的人CD4+OX40+T细胞的结合。
图9b示出了在5％HSA存在下在活化的人CD4+、OX40+T细胞上的A26Fab'、A26Fab-Fv以及A26Fab'-PEG的结合。
图10a示出了A26Fab-dsFv对来自暴露于屋尘螨过敏性提取物的PBMC的细胞因子产生的作用。
图10b示出了A26Fab-dsFv在Hu-NSG小鼠模型中抑制CD4+和CD8+T细胞增殖的能力。
图11a示出了A26Fab-dsFv对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制。
图11b示出了A26Fab'、A26Fab-dsFv、A26Fab'-PEG以及两种对照对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制。
图12a示出了A26Fab-Fv抑制人混合淋巴细胞反应(MLR)。
图12b示出了A26Fab-Fv在人MLR的过程中抑制IFN-γ产生。
图13示出了在使用屋尘螨过敏原提取物进行二级抗原再刺激之后A26Fab-Fv减小活化的(CD25+)CD4+T细胞的百分比。
图14示出了在细胞转移之前投与的Fab-Fv和Fab-PEG在Hu-NSG模型中剂量依赖性地抑制CD4+和CD8+T细胞增殖。
DNA操作和一般方法
将感受态大肠杆菌菌株用于转化和常规培养生长。DNA限制和修饰酶是获自罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics Ltd.)和新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)。质粒制备使用Maxi Plasmid纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN)，目录号12165)进行。DNA测序反应使用ABI Prism Big Dye终止子测序试剂盒(目录号4304149)进行并且在ABI3100自动测序仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))上运行。数据使用程序Sequencher(基因密码公司(Genecodes))分析。寡核苷酸是获自西玛公司(Simga)或英杰公司(Invitrogen)。编码初始V区序列的基因由DNA2.0公司(DNA2.0)通过自动合成方法构建，并且通过寡核苷酸定向诱变修饰以产生移植的版本。Fab-Fv的浓度利用基于蛋白质G的HPLC方法测定。
实例1
A26Fab-645dsFv中645的不同人源化移植物的产生和分析
我们先前已在WO2010/035012中描述了Fab-dsFv抗体形式(图1)(在此有时简称为Fab-Fv)和称为‘645gH1gL1’的人源化抗白蛋白抗体。我们先前还已在WO2010/096418中描述了称为‘A26’的人源化拮抗性抗OX40抗体和其聚乙二醇化Fab'片段的产生。此处，我们描述了一种称为645dsgH5gL4的抗体‘645’的新的改进的人源化移植物的产生以及在Fv组分中并入该移植物并且在Fab组分中并入‘A26’可变区的Fab-dsFv抗体分子的产生。A26的可变区在图2a和b(SEQ ID NO7和8)中给出。
所组合的A26的可变区和恒定区序列在图2d和e(SEQ ID NO9和10)中给出。
645gH1和gL1的序列在图4(a)和(b)(SEQ ID NO17和18)中给出。
其中使用了术语Fab'-PEG或A26Fab'-PEG，这是指在WO2010/096418中描述的A26Fab-40K PEG'。
1.1.A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)G4S连接子质粒的构建
将A26Fab-645dsFv(gL1)轻链(SEQ ID NO:20)的全部编码区克隆到在HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列控制下的UCB哺乳动物表达载体中。645dsFv(gL1)的轻链可变区(SEQ ID NO:18)利用重叠PCR方法突变成645dsFv(gL4)(SEQ ID NO:12)。将A26Fab-645dsFv(gH1)重链(SEQ ID NO:19的全部编码区克隆到在HCMV-MIE启动子和SV40E polyA序列控制下的UCB哺乳动物表达载体中。645dsFv(gH1)的重链可变区(SEQ ID NO:17)利用重叠PCR方法突变成645dsFv(gH5)(SEQ ID NO:11)。这些构建体通过测序进行验证。两种构建体包含在SEQ ID NO:14(图3(d))中给出的3xG4S连接子。
1.2A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)的哺乳动物表达
HEK293细胞使用英杰公司的293fectin转染试剂根据制造商的说明书用重链和轻链质粒转染。简言之，将25μg重链质粒和25μg轻链质粒与100μl293fectin和1700μl Optipro培养基一起在室温下孵育20分钟。该混合物接着被添加到处于50ml悬浮液中的50×106个HEK293细胞中并且在37℃下在振荡下孵育6天。6天后，上清液通过在1500×g下离心10分钟来收集，从而移除细胞并且接着进行0.22μm无菌过滤。
1.3A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)的蛋白质G纯化
约50ml的0.22μm过滤的上清液利用具有10kDa分子量截断膜的AmiconUltra-15浓缩器和在4000×g下在甩开转子中的离心而浓缩成约2ml。将1.8ml浓缩的上清液以1ml/min施加到在20mM磷酸盐、40mM NaCl pH7.4中平衡的1ml Gammabind Plus Sepharose(通用电气医疗集团(GE Healthcare))柱上。该柱用20mM磷酸盐、40mM NaCl pH7.4洗涤，并且结合的物质用0.1M甘氨酸/HCl pH2.7洗脱。收集洗脱峰，并且用2M Tris/HCl pH8.5将pH值调整到约pH7。利用具有10kDa分子量截断膜的Amicon Ultra-15浓缩器和在4000×g下在甩开转子中的离心，将经pH值调整的洗脱物浓缩并且透滤到20mM磷酸盐、150mM NaCl pH7.4中，达到约0.3ml的最终体积。
1.4尺寸排阻分析A26Fab-645dsFv(gH1gL1)和A26Fab-645dsFv(gH5gL4)
蛋白质G纯化的样品通过尺寸排阻HPLC分析。这些样品在用等度梯度的PBS pH7.4以1ml/min冲洗的Superdex20010/300GL Tricorn柱(通用电气医疗集团)上分离。峰检测是在280nm下，并且表观分子量通过与已知分子量蛋白质对洗脱体积的标准曲线比较来计算。645dsFv的人源化移植物从gH1gL1改变成gH5gL4引起表达的A26Fab-645dsFv的单体百分比从59％增加到71％(增加12％)，并且在dsfv的热稳定性(数据未示出)方面或在dsFv对HSA的结合亲和力(数据未示出)方面无任何变化。
实例2
2.1A26Fab-dsFv(645gH5gL4)结合OX40的BIAcore动力学
在这个和所有后续实例中，A26Fab-dsFv645gH5gL4具有在SEQ ID NO:15(图3(e))中给出的重链序列和在SEQ ID NO:16(图3(f))中给出的轻链序列，即重链包含在SEQ ID NO:13(图3(c))中给出的G4S、G4T、G4S连接子。
BIA(生物分子相互作用分析)使用BIAcore T200(通用电气医疗集团)进行。将亲和纯(Affinipure)F(ab')2片段山羊抗人IgG(F(ab')2片段特异性的；杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))经由胺偶联化学固定于CM5传感器芯片上达到5000个反应单位(RU)的捕获水平。HBS-EP缓冲液(10mMHEPES pH7.4、0.15M NaCl，3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，通用电气医疗集团)被用作流速为10μL/min的运行缓冲液。注射10μL的0.5μg/mL的A26Fab'或1μg/mL的A26Fab-dsFv用于通过固定的抗人IgG-F(ab')2的捕获。人OX40以不同浓度(25nM到1.5625nM)以30μL/min的流速用捕获的A26进行滴定。通过以10μL/min的流速注射2×10μL的50mM HCl、接着注射5μL的5mM NaOH来再生表面。本底扣除的结合曲线按照标准程序使用T200evaluation软件(1.0版本)分析。动力学参数由拟合算法测定。
4次测定的平均值
表1
2.2.A26Fab-dsFv(645gH5gL4)结合白蛋白的BIAcore动力学
BIA(生物分子相互作用分析)使用BIAcore T200(通用电气医疗集团)进行。将亲和纯(Affinipure)F(ab')2片段山羊抗人IgG(F(ab')2片段特异性的；杰克逊免疫研究公司)经由胺偶联化学固定于CM5传感器芯片上达到5000个反应单位(RU)的捕获水平。HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、0.15MNaCl，3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20，通用电气医疗集团)被用作流速为10μL/min的运行缓冲液。注射10μL的0.75μg/mL的Fab-Fv用于通过固定的抗人IgG-F(ab')2的捕获。人血清白蛋白(HSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)以及食蟹猕猴血清白蛋白(CSA)以不同浓度(50nM到6.25nM)以30μL/min的流速用捕获的Fab-Fv进行滴定。通过以10μL/min的流速注射2×10μL的50mM HCl、接着注射5μL的5mM NaOH来再生表面。本底扣除的结合曲线按照标准程序使用T200evaluation软件(1.0版本)分析。动力学参数由拟合算法测定。
表2
3次测定的平均值
2.3A26Fab-dsFv(645gH5gL4)同时结合OX40和白蛋白的证实
对人OX40和人血清白蛋白对A26Fab-dsFv的同时结合进行评估。A26Fab-dsFv构建体被捕获于如在用于针对结合A26Fab-dsFv白蛋白的BIAcore动力学的方法中所述的传感器芯片表面。50nM HAS、25nM OX40或最终浓度为50nM HSA和25nM OX40的混合溶液分别地用捕获的A26Fab-dsFv进行滴定。组合的HSA/OX40溶液的结合反应相当于独立注射的反应的总和。这证实了Fab-dsFv能够同时结合人OX40和HSA两者。
表3
2.4A26Fab-dsFv(645gH5gL4)的基于细胞的亲和力
方法：
A26Fab-Fv与人活化的CD4+OX40+T细胞的结合.
PBMC通过在Ficoll梯度上的分离而分离并且用4μg/mL PHA-L在37℃、5％CO2、100％湿度下活化3天。CD4+T细胞通过使用磁性珠粒(人的CD4+T细胞分离试剂盒II；美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec))的阴性选择来分离。将约1×105个细胞在抗体存在下在或者Facs缓冲液(PBS/0.2％BSA/0.09％NaN3)或者补充有5％HSA的Facs缓冲液中在4℃下孵育。抗体的最终浓度在48nM-0.0005nM范围内))。将细胞在PBS中洗涤，随后使用FACScalibur(碧迪公司(Becton Dickinson))通过流式细胞术分析。两个滴定数据组在两种缓冲条件中产生，一种用A26Fab-dsFv而第二种用不相关对照Fab-Fv以测定非特异性结合。结合的抗体的摩尔数通过使用来自通过使用包括不同但已知量的荧光染料的珠粒而产生的标准曲线的内插值来计算。几何平均荧光值在细胞和珠粒的流式细胞分析中测定。将非特异性结合从A26Fab-dsFv值中减去，并且由此得到的特异性结合曲线通过非线性回归使用单位点结合方程式分析以测定KD。
为了测定A26Fab-dsFv对细胞表面表达的抗原的亲和力，使用活化的CD4+OX40+T细胞和Alexa Fluor488标记的A26Fab-dsFv进行饱和结合实验。将在一定抗体浓度范围内平衡时抗体与受体的特异性结合用于测定KD，假定在结合曲线的任何点上仅非常小部分的抗体与受体结合。
平衡结合使用以下方程式描述：
抗体与受体的结合速率＝kon×[受体游离]×[抗体游离]
受体-抗体复合体的解离速率＝koff×[受体-抗体]
平衡时，结合和解离速率相等并且方程式可以被导出，它描述了结合等温线；在半对数图上结合是S形的。KD由koff/kon定义并且可以由结合曲线计算为出现半数最大结合时的浓度。
AlexaFluor488标记的A26Fab-Fv与活化的人CD4+OX40+T细胞的结合通过流式细胞术跨越5-log浓度范围来测量。
A26Fab-Fv的代表性结合曲线在图9A中示出。
在来自5个不同的供体的活化的细胞上得到的平均KD值为145pM。
A26Fab、A26Fab-Fv以及A26Fab-PEG的比较结合曲线在图9B中示出。
这些图代表了4或5次实验的平均值，其中在每个实验中使用不同的供体。
PBMC通过在Ficoll梯度上的分离而分离并且用4μg/mL PHA-L在37℃、5％CO2、100％湿度下活化3天。在这之后，CD4+T细胞通过使用磁性珠粒(人的CD4+T细胞分离试剂盒II；美天旎生物科技公司)的阴性选择来分离。将约1×105个细胞在抗体存在下在或者Facs缓冲液(PBS/0.2％BSA/0.09％NaN3)或者补充有5％HSA的Facs缓冲液中在4℃下孵育。抗体的最终浓度在48nM-0.0005nM范围内。将细胞在PBS中洗涤，随后使用FACScalibur(碧迪公司)通过流式细胞术分析。滴定数据组也针对每种A26形式对同种型对照抗体产生，从而测定非特异性结合。结合的抗体的摩尔数通过使用来自由包括不同但已知量的荧光染料的珠粒产生的标准曲线的内插值来计算。几何平均荧光值在细胞和珠粒的流式细胞分析中测定。将非特异性结合从A26Fab-Fv值中减去，并且由此得到的特异性结合曲线通过非线性回归使用单位点结合方程式分析以测定KD。
表4：人细胞亲和力分析中A26抗体的平均KD值
实例3：A26Fab-Fv调节暴露于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)过敏原提取物的PBMC的细胞因子的产生
PBMC从过敏性志愿者中通过在Ficoll梯度上的分离而分离。将纯化的PBMC在测试抗体(浓度范围在50μg/mL到0.0005μg/mL)存在下在96孔圆底板中以200μL/孔的最终体积暴露于25μg/mL屋尘螨过敏原提取物。在37℃、5％CO2、100％湿度下孵育6天后，收集上清液并且通过MSD分析IL-13含量。图10(a)中的图示出了4个中的1个代表性供体的代表性数据，其中抑制IL-13产生的平均EC50是0.87nM(在0.6nM到1.07nM范围内)。
表5：人HDM体外分析中A26抗体的平均EC50值
EC50值使用Graphpad软件利用非线性回归从单独的供体抑制曲线计算
在使用屋尘螨过敏原提取物进行二级抗原再刺激之后A26Fab-Fv减小活化的(CD25+)CD4+T细胞的百分比
将来自过敏性供体的CD4+T细胞用25μg/ml屋尘螨过敏原提取物(格里尔公司(Greer))和自体性APC在无抗体或10μg/ml A26Fab'PEG、A26Fab-Fv或对照Fab'(A33Fab')存在下体外刺激7天。将细胞洗涤并且静息3天，并且接着用如先前的屋尘螨提取物再刺激(图13)。3天后，将细胞洗涤并且针对表面CD3、CD4以及CD25进行荧光染色。细胞接着在FACS Canto流式细胞仪(碧迪公司(BD))上通过流式细胞术分析。对活淋巴细胞和CD3+CD4+表达对细胞进行设门，随后分析。数据代表了n＝3个供体，包括平均n.s，A26Fab-Fv与对照Fab'相比(显著性使用配对2尾T检验测量)。
实例4：A26Fab-Fv在Hu-NSG小鼠模型中抑制CD4+和CD8+T细胞增殖.
小鼠在1×107个人PBMC转移到腹膜腔内的前一天用0.03、0.3、3或30mg/kg A26Fab-Fv皮下给药。14天后，小鼠在末端麻醉下通过心脏穿刺取血并且接着通过颈脱位法处死。血液中人CD4+和CD8+细胞的数目接着通过FACS分析测定(图10(b))。数据(n＝10)表示为平均值±SEM，并且统计分析是使用邦费罗尼事后检验(Bonferroni post test)通过单因素ANOVA进行的。值代表了抑制％±SEM。
结果在图14中示出。
Hu-NSG模型已证实了A26Fab-Fv在体内深度抑制人T细胞增殖并且支持A26Fab-Fv作为用于抑制T细胞介导的病理学的可行的治疗候选物。另外，Fab-Fv形式与Fab'PEG形式相比在更低剂量下赋予更大功效。供体T细胞的这一异种增殖反应的减少可以提供A26Fab-Fv可以是针对GVHD的可行治疗剂的支持证据。
实例5：配体阻断能力
A26Fab-dsFv阻断细胞表面表达的OX40与重组OX40L之间相互作用的能力使用基于流式细胞术的配体阻断分析来测量。简言之，活化的人CD4+OX40+T细胞用A26Fab-Fv的滴定预孵育。随后将重组OX40L加入细胞并且使其在A26Fab-dsFv存在下结合。结合的OX40L的比例接着通过流式细胞术使用标记的第二试剂检测。图11示出了代表来自3个独立供体的合并的数据的抑制曲线并且证实了A26Fab-dsFv能够完全阻断OX40L结合。抑制重组OX40L结合的平均IC50为0.44nM(n＝3个供体)。
方法：A26Fab-Fv对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制
PBMC通过在Ficoll梯度上的分离而分离并且用4μg/mL PHA-L(西格玛公司(Sigma))在37℃、5％CO2、100％湿度下活化3天。CD4+T细胞接着通过使用MACS柱(美天旎生物科技公司，CD4+T细胞分离试剂盒II)的阴性选择而从培养物纯化。将2×105个CD4+T细胞在A26Fab-dsFv(最终浓度范围为10μg/mL-0.000056μg/mL(136.6nM-0.000765nM))存在下在4℃下孵育30分钟。加入最终浓度为2μg/mL的OX40L(生物素化的CD252muCD8，安赛尔公司(Ancell))并且在4℃下再孵育30分钟。洗涤细胞，并且通过与PE标记的链霉亲和素(杰克逊免疫研究公司)孵育，随后使用FACS Canto(碧迪公司)通过流式细胞术分析来检测OX40L结合。将匹配的非OX40结合Fab-dsFv用作对照。抑制曲线通过非线性回归(Graphpad分析以测定IC50。代表来自3个独立供体的合并的数据的抑制曲线在图11中示出，其中数据点代表了平均值并且误差线代表了SEM。
A26Fab-Fv对重组OX40L结合于OX40的抑制的平均EC50是0.445nM。比较起来，A26Fab'PEG在配体阻断上略微更不有效(EC50＝0.739nM)，而A26Fab'与Fab-Fv相比稍微具有更大效力(EC50＝0.242nM)，如以下所示。
表6：A26抗体对OX40L结合于人活化的CD4+OX40+T细胞的抑制的EC50值
EC50值使用Graphpad软件利用非线性回归从单独的供体抑制曲线计算。
实例6A26Fab-Fv在功能性人体外分析中的作用
A26Fab-Fv对OX40-OX40L依赖性细胞相互作用的作用在一定范围的抗原驱动的人淋巴细胞分析中评估。这些分析在5％人血清存在下进行以确保Fv区的白蛋白结合位点的饱和，如将被预测为在体内发生般。
A26Fab-Fv抑制混合淋巴细胞反应
单向同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)是一种同种异体反应性T细胞活化和增殖的体外模型(巴赫(Bach)等人，1964，欧弗莱厄蒂(O'Flaherty)等人，2000)。供体T细胞通过识别不相关供体刺激者PBMC上的同种异体MHC抗原而活化，引起细胞增殖和细胞因子产生(卢卡奇(Lukacs)等人，1993)。T淋巴细胞同种异体反应已显示通过同种异体MHC抗原和结合的肽两者驱动(谢尔曼(Sherman)等人，1993)。MLR反应的强度与应答者-刺激者对之间的MHC错配的程度相关(福里斯特(Forrester)等人，2004)。MLR反应引起来自反应供体的细胞增殖以及TH1(IL-2、IFN-γ以及TNF-α)和TH2(IL-4、IL-5、IL-10以及IL-13)T细胞衍生细胞因子的产生。MLR中精确的细胞因子谱被认为对应答者-刺激者配对是特异性的(乔丹(Jordan)等人，2002)。MLR分析已广泛用于研究中，以研究T细胞活化通路、筛选免疫抑制药物以及预测移植接受者可能的供体器官排斥(布罗米洛(Bromelow)等人，2001)。
A26Fab-Fv对体外人同种异体反应性T细胞活化和增殖的作用使用基本上如由欧弗莱厄蒂等人，2000所述的MLR分析进行研究。来自两个不相关供体的PBMC在A26Fab-Fv、A26Fab'或A26Fab'PEG存在或不存在下共培养，并且通过3H-胸苷掺入测量细胞增殖。如图12中所示，A26Fab-Fv以浓度依赖性方式抑制细胞增殖，其中EC50值为0.56nM(40.9ng/mL)并且最大抑制为55％(n＝3个供体配对)。A26Fab-Fv与A26Fab'PEG(它的EC50值为0.88nM)相比稍微更有效，而A26Fab'的EC50值为0.25nM，如表7中所示。
将来自两个不相关供体的人PBMC从全血中分离。将来自一个供体的细胞通过γ-辐射灭活以得到刺激者群体。来自余下供体的细胞形成应答者群体。刺激者和应答者群体以1:1比例(1×105个细胞/供体)混合并且在A26Fab'、A26Fab-Fv或A26Fab'PEG(0.4ng-25μg/mL)存在下培养6天。将内部试剂CA162-01297.1Fab-Fv作为同种型匹配对照使用。细胞增殖在第6天通过3H-胸苷掺入(0.5μCi/孔)测量。数据被表示为相对于在不存在生物试剂下应答者加刺激者反应的抑制百分比，并且为来自三个供体配对的合并的数据。EC50值使用Graphpad软件计算。
表7A26抗体对人MLR增殖反应的抑制的EC50值
来自人MLR的上清液也被分析以研究A26Fab-Fv对细胞因子产生的作用。如图5.4中所示，A26Fab-Fv在MLR中显著抑制IFN-γ的产生平均达81％(n＝3个供体配对)。
将来自两个不相关供体的人PBMC从全血中分离。将来自一个供体的细胞通过γ-辐射灭活以得到刺激者群体。来自余下供体的细胞形成应答者群体。刺激者和应答者群体以1:1比例(1×105个细胞/供体)混合并且在25μg/mlA26Fab'、A26Fab-Fv或A26Fab'PEG或对照(A33Fab'或CA162.01297.1)存在下培养6天。收集上清液，并且使用MSD分析针对IFN-γ含量进行分析。抑制百分比相对于在无抗体下培养的细胞计算。这些图代表了来自三个供体的汇集的数据(平均值±S.E.M)。**＝p<0.01；A26Fab-Fv与对照Fab-Fv相比(显著性使用配对2尾T检验测量)。
实例7A26Fab-Fv在人MLR中结合于NK细胞
研究A26Fab-Fv在MLR内对NK细胞分裂的作用。T淋巴细胞同种异体反应驱动混合淋巴细胞反应，并且A26Fab-Fv在这一系统中深度抑制T细胞分裂和IFNγ产生。NK细胞分裂的抑制还可以有助于减少的IFNγ产生。使用CFSE标记的应答者细胞，NK细胞分裂的抑制通过分裂群体的FACS分析证实(图5.6)。示出了细胞分裂的两个不同量度。分裂指数代表了原始群体中的细胞已经历的细胞分裂的平均数并且包括未分裂的细胞；A26Fab-Fv减小分裂指数，指示了群体中更少的细胞致力于分裂；这一作用大概由表达OX40的NK细胞所介导。增殖指数反映了仅应答群体的增殖，并且使用这一量度的A26Fab-Fv的抑制作用相对地降低。
实例8人体外分析中A26Fab-Fv的平均KD/EC50值
显然应了解的是，本发明已通过仅仅实例的方式描述，并不以任何方式意指限制，并且细节的修改可以在随附权利要求范围内作出。本发明的每个实施例的优选特征是如针对每个其他实施例细节上作必要的修正。本说明书中引用的所有的出版物(包括(但不限于)专利和专利申请)通过引用结合在此，如同各单独的出版物具体并单独地指出通过在此如同充分陈述地引用结合。

Claims (20)

1.一种结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，包括：
重链，从N端依序包括第一重链可变域(VH1)、CH1域以及第二重链可变域(VH2)，
轻链，从N端依序包括第一轻链可变域(VL1)、CL域以及第二轻链可变域(VL2)，
其中所述重链和轻链被对齐，使得VH1和VL1形成一个第一抗原结合位点并且VH2和VL2形成一个第二抗原结合位点，
其中由该第一抗原结合位点结合的抗原是人OX40，并且由该第二抗原结合位点结合的抗原是人血清白蛋白，
其中该重链的第一可变域(VH1)包括针对CDR-H1在SEQ ID NO:1中给出的序列、针对CDR-H2在SEQ ID NO:2中给出的序列以及针对CDR-H3在SEQ ID NO:3中给出的序列，并且该轻链的第一可变域(VL1)包括针对CDR-L1在SEQ ID NO:4中给出的序列、针对CDR-L2在SEQ ID NO:5中给出的序列以及针对CDR-L3在SEQ ID NO:6中给出的序列，
其中该第二重链可变域(VH2)具有在SEQ ID NO:11中给出的序列，并且该第二轻链可变域(VL2)具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，并且
该第二重链可变域(VH2)和该第二轻链可变域(VL2)是由二硫键连接的。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体融合蛋白，它拮抗OX40与OX40L的结合。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体融合蛋白，其中该CH1域与该第二重链可变域(VH2)之间存在肽连接子。
4.根据权利要求1到3中任何一项所述的双特异性抗体融合蛋白，其中该CL域与该第二轻链可变域(VL1)之间存在肽连接子。
5.根据权利要求1到4中任何一项所述的抗体融合蛋白，其中该第一重链可变域(VH1)包括在SEQ ID NO:8中给出的序列。
6.根据权利要求1到5中任何一项所述的抗体融合蛋白，其中该第一轻链可变域(VL1)包括在SEQ ID NO:7中给出的序列。
7.根据权利要求1到6中任何一项所述的抗体融合蛋白，其中该重链包括在SEQ ID NO:15中给出的序列或由其组成。
8.根据权利要求1到7中任何一项所述的抗体融合蛋白，其中该轻链包括在SEQ ID NO:16中给出的序列或由其组成。
9.一种结合人OX40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，具有重链和轻链，该重链包括在SEQ ID NO:15中给出的序列，该轻链包括在SEQ ID NO:16中给出的序列。
10.一种分离的DNA序列，编码根据权利要求1到9中任何一项所述的抗体融合蛋白的一条或多条重链和/或轻链。
11.一种克隆或表达载体，包括一个或多个根据权利要求10所述的DNA序列。
12.根据权利要求11所述的载体，其中该载体包括在SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:24中给出的序列。
13.一种宿主细胞，包括一个或多个根据权利要求11或12所述的克隆或表达载体。
14.一种用于产生如权利要求1到9中任何一项所述的抗体融合蛋白的方法，包括培养如权利要求13所述的宿主细胞以及分离该抗体融合蛋白。
15.一种医药组合物，包括根据权利要求1到9中任何一项所述的双特异性抗体融合蛋白，连同医药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一者或多者。
16.根据权利要求15所述的医药组合物，另外地包括其他活性成分。
17.根据权利要求1到9中任何一项所述的双特异性抗体融合蛋白或根据权利要求15或权利要求16所述的医药组合物，用于在疗法中使用。
18.根据权利要求1到9中任何一项所述的双特异性抗体融合蛋白或根据权利要求15或权利要求16所述的医药组合物，用于在治疗或防治由OX40介导或与OX40水平提高相关的病理性病症中使用。
19.一种根据权利要求1到9中任何一项所述的双特异性抗体融合蛋白在制造用于治疗或防治由OX40介导或与OX40水平提高相关的病理性病症的药物中的用途。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中该病理性病症是一种选自下组的疾病，该组由以下各项组成：过敏、COPD、自体免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、移植物抗宿主疾病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、重症肌无力、格雷氏病、移植排斥、韦格纳氏肉芽肿病、亨-舍二氏紫癜、系统性硬化以及病毒诱发的肺部炎症。
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