EA035112B1 - Биспецифическое антитело, которое связывается с ох40 человека и сывороточным альбумином человека, его получение и применение - Google Patents

Биспецифическое антитело, которое связывается с ох40 человека и сывороточным альбумином человека, его получение и применение Download PDF

Info

Publication number
EA035112B1
EA035112B1 EA201400565A EA201400565A EA035112B1 EA 035112 B1 EA035112 B1 EA 035112B1 EA 201400565 A EA201400565 A EA 201400565A EA 201400565 A EA201400565 A EA 201400565A EA 035112 B1 EA035112 B1 EA 035112B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
disease
pathological disorder
seq
fab
bispecific antibody
Prior art date
Application number
EA201400565A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201400565A1 (ru
Inventor
Ралф Адамс
Паллави Бхатта
Сэм Филип Хейвуд
Дейвид Пол Хамфриз
Original Assignee
Юсб Байофарма Спрл
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47388492&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA035112(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Юсб Байофарма Спрл filed Critical Юсб Байофарма Спрл
Publication of EA201400565A1 publication Critical patent/EA201400565A1/ru
Publication of EA035112B1 publication Critical patent/EA035112B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биспецифическому антителу, которое связывается с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека, содержащему тяжелую цепь, содержащую в последовательности от N-конца первый вариабельный домен тяжелой цепи (V1), C1-домен и второй вариабельный домен тяжелой цепи (V2), и легкую цепь, содержащую в последовательности от N-конца первый вариабельный домен легкой цепи (V1), C-домен, и второй вариабельный домен легкой цепи (V2), где V1 и V1 образуют первый антигенсвязывающий центр, который связывает ОХ40, a V2 и V2 образуют второй антигенсвязывающий центр, который связывает сывороточный альбумин, а также к способу лечения или профилактики с помощью этого антитела, его применению, а также получению при использовании предложенных ДНК, векторов и клеток-хозяев.

Description

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфичному в отношении антигенных детерминант ОХ40, и к композициям, содержащим такое антитело. Оно также относится к терапевтическому применению этого антитела, композициям и способам его получения.
ОХ40 (также известный как CD134, TNFRSF4, АСТ35 или TXGP1L) является членом суперсемейства рецепторов TNF, которое включает 4-1ВВ, CD27, CD30 и CD40. Внеклеточный лигандсвязывающий домен ОХ40 состоит из трех полных богатых цистеином доменов (CRD) и неполного четвертого С-концевого CRD (Bodmer et al., 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 19-26).
Лигандом для ОХ40 является OX40L, и три копии ОХ40 связываются с трехмерным лигандом с образованием комплекса OX40-OX40L (Compaan and Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1321-1330).
ОХ40 является мембраносвязанным рецептором, однако его растворимая изоформа также была обнаружена (Taylor and Schwarz, 2001, J. Immunol. Methods, 255, 67-72). Функциональное значение растворимой формы в настоящее время неизвестно. ОХ40 не экспрессируется на неактивных Т-клетках, но временно экспрессируется на активированных Т-клетках после связывания Т-клеточного рецептора (TCR). Лиганд для ОХ40, OX40L, является членом семейства TNF и экспрессируется на активированных антигенпрезентирующих клетках (АРС), в том числе на В-клетках, макрофагах, эндотелиальных клетках и дендритных клетках (DC).
ОХ40 является одним из основных костимулирующих рецепторов с последующим участием CD28 и ОХ40, необходимым для оптимальной пролиферации и выживания Т-клеток. Связывание ОХ40 на активированных Т-клетках приводит к повышенному производству цитокинов и пролиферации как CD4+, так и CD8+ Т-клеток (Gramaglia et al., 2000, J. Immunol., 165, 3043-3050, Bansal-Pakala et al., 2004, J. Immunol., 172, 4821-425) и может вносить вклад в оба Th1 и Th2 ответа (Gramaglia et al., 1998, J. Immunol., 161, 6510-6517, Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880). Костимуляция ОХ40 увеличивает выживаемость Т-клеток на начальной эффекторной фазе иммунного ответа и увеличивает количество Т-клеток памяти посредством ингибирования гибели эффекторных Т-клеток.
Когда иммунная активация является чрезмерной или неконтролируемой, может возникнуть патологическая аллергия, астма, воспаление, аутоиммунные и другие родственные заболевания. Поскольку ОХ40 повышает иммунный ответ, это может усугубить аутоиммунные и воспалительные заболевания.
Роль взаимодействий OX40/OX40L на моделях заболевания была продемонстрирована на ОХ40нокаутных мышах. При экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЕАЕ), модели рассеянного склероза, были отмечены менее тяжелые клинические признаки заболевания и уменьшение воспалительного инфильтрата в ЦНС у ОХ40-нокаутных мышей (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). Также ОХ40-нокаутные мыши, примированные и иммунизированные овальбумином, демонстрируют уменьшенное легочное воспаление (80-90% снижение эозинофилии), сниженную выработку слизи и значительное уменьшение гиперреактивности дыхательных путей (Jember и соавт., 2001, J. Exp. Med., 193, 387-392). Моноклональные антитела к мышиному лиганду ОХ40 показали положительные результаты при коллаген-индуцированном артрите на модели ревматоидного артрита (Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823), EAE (Nohara et al., 2001, J. Immunol., 166, 2108-2115), у не страдающих ожирением диабетических (NOD) мышей (Pakala et al., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3039-3046), при колите у мышей с восстановленными Т-клетками (Malmstrom et al., 2001, J. Immunol., 166, 6972-6981, Totsuka et al., 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284, G595-G603) и на моделях легочного воспаления (Salek-Ardakani et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 315-324, Hoshino et al., 2003, Eur. J. Immunol., 33, 861-869). Антитело к OX40L человека было изучено на модели легочного воспаления у макак-резусов и приводило к снижению уровней IL-5, IL-13 и эффекторных Т-клеток памяти в жидкости бронхоальвеолярного лаважа после иммунизации аллергеном (Seshasayee et al., 2007, J. Clin. Invest, 117, 3868-3878).
Повышение экспрессии ОХ40 было отмечено при некоторых аутоиммунных и воспалительных заболеваниях. Сюда входит увеличение экспрессии ОХ40 на Т-клетках, выделенных из синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (Brugnoni D. et al., 1998, Br. J. Rheum., 37, 584-585; Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823; Giacomelli R. et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320). Аналогично, увеличение экспрессии ОХ40 было отмечено в желудочно-кишечной ткани у пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона (Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863; Stuber et al., 2000, Eur. J. Clin. Invest., 30, 594-599) и в местах активного поражения у пациентов с рассеянным склерозом (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). OX40L также обнаружены на гладких мышцах дыхательных путей человека (ASM), причем клетки больных астмой проявляют более сильную воспалительную реакцию на связывание OX40L, чем таковые у здоровых доноров, что указывает на роль пути OX40/OX40L при астме (Burgess et al., 2004, J. Allergy Clin. Immunol., 113, 683-689; Burgess et al., 2005, J. Allergy Clin. Immunol., 115, 302-308). Кроме того, было сообщено, что CD4+ Т-клетки, выделенные из периферической крови пациентов с системной красной волчанкой (SLE), экспрессируют повышенные уровни ОХ40, которые связаны с активностью заболевания (Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242).
Учитывая роль ОХ40 в аллергии, астме и заболеваниях, связанных с аутоиммунитетом и воспалением, один из подходов к терапии при этих заболеваниях состоит в блокировании OX40-OX40L сигнала с применением антител к OX40L или антагонистических антител к ОХ40.
Антитела к OX40L были описаны, см., например, WO 2006/029879.
- 1 035112
Были описаны многочисленные агонистические антитела к ОХ40, но известны лишь немногие антагонистические антитела к ОХ40. Было получено поликлональное антитело кролика к ОХ40 мыши (см.
Stuber et al., 1996, J. Exp. Med, 183, 979-989), оно блокирует взаимодействие между ОХ40 и OX40L. Были созданы моноклональные антитела 131 и 315 мыши, которые связывают ОХ40 человека (см. Imura et al.,
1996, J. Exp. Med, 2185-2195).
Полноразмерные антагонистические антитела человека были описаны в WO 2007/062245, самой высокой аффинностью этих антител была аффинность в отношении экспрессированного на клеточной поверхности ОХ40 (активированные Т-клетки), которая составляла 11 нМ.
Гуманизированные антагонистические антитела были описаны в WO 2008/106116, и антитело с лучшей аффинностью в отношении ОХ40 имело аффинность, равную 0,94 нМ.
Были описаны другие антитела к ОХ40, в том числе L106 мыши (патент США № 6277962) и АСТ35 мыши, коммерчески доступное от eBioscience.
Ранее были описаны высокоаффинные антагонистические антитела к ОХ40 (см. международную заявку на патент с номером WO 2010/096418).
Также ранее в международной заявке на патент с номером WO 2010/035012 была описана новая молекула мультиспецифического антитела, упоминаемая в дальнейшем как Fab-dsFv и проиллюстрированная в данном документе на фиг. 1. Эта же заявка содержит сведения о полезных вариабельных областях, связывающих альбумин, которые могут быть использованы для продления периода полураспада молекулы.
В настоящем изобретении эти альбумин-связывающие вариабельные области были усовершенствованы и объединены в формате Fab-dsFv с антителами к ОХ40, описанными в WO 2010/096418. Новое биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению имеет улучшенную эффективность в ряде анализов in vitro и in vivo, описанных в данном документе, по сравнению с молекулой Fab'-PEG, ранее описанной в WO 2010/096418. Соответственно, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое связывает одновременно ОХ40 человека и сывороточный альбумин человека, и которое пригодно для лечения или профилактики патологических нарушений, опосредованных ОХ40 или связанных с повышенным уровнем ОХ40.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению (формат Fab-dsFv).
На фиг. 2-8 показаны определенные последовательности аминокислот или ДНК, относящиеся к антителу согласно настоящему раскрытию.
На фиг. 9a показано связывание А26 Fab-dsFv, меченного AlexaFluor 488, с активированными ОП4+ОХ40+ Т-клетками человека.
На фиг. 9b показано связывание A26Fab', Fab-Fv A26 и А26 Fab'-PEG в присутствии 5% бычьего сывороточного альбумина (HSA) на активированных CD4+, OX40+ Т-клетках человека.
На фиг. 10a показан эффект А26 Fab-dsFv на выработку цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС), подвергнутыми действию аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus.
На фиг. 10b показана способность А26 Fab-dsFv ингибировать пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток на модели мышей Hu-NSG.
На фиг. 11a показано ингибирование связывания OX40L с активированными CD4+ OX40+ Т-клетками человека с помощью А26 Fab-dsFv.
На фиг. 11b показано ингибирование связывания OX40L с активированными CD4+ ОХ40+ Т-клетками человека с помощью A26Fab', A26 Fab-dsFv, A26 Fab'-PEG и двух контролей.
На фиг. 12a показано, что А26 Fab-Fv ингибирует смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) человека.
На фиг. 12b показано, что А26 Fab-Fv ингибирует выработку IFN-гамма во время MLR человека.
На фиг. 13 показано, что А26 Fab-Fv снижает процент активированных (CD25+) CD4+ Т-клеток после вторичной рестимуляции антигеном с помощью аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus.
На фиг. 14 показано, что Fab-Fv и Fab-PEG, введенные до переноса клеток, дозозависимым образом ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток в модели Hu-NSG.
Гуманизированное антитело к ОХ40 СА044_00026 упоминается в данном документе как А26.
Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению упомянуто в данном документе как Fab-dsFv, проиллюстрировано на фиг. 1. В настоящем изобретении Fab-фрагмент (содержащий первые вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константные домены) связывается с ОХ40 человека, а dsFv-фрагмент (содержащий вторые вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соединенные дисульфидной связью) связывается с сывороточным альбумином человека. В частности, Fab-фрагмент содержит CDR, полученные из антагонистического антитела к ОХ40, а Fv-фрагмент содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела к альбумину, и эти альбуминсвязывающие вариабельные области соединены дисульфидной связью.
- 2 035112
Соответственно, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое связывается с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека, содержащему тяжелую цепь, содержащую в последовательности от N-конца первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH1), СД-домен, и второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH2), легкую цепь, содержащую в последовательности от N-конца первый вариабельный домен легкой цепи (VL1), C)-домен, и второй вариабельный домен легкой цепи (Vl2), где VH1 и VL1 образуют первый антигенсвязывающий центр, который связывает ОХ40, a VH2 и VL2 образуют второй антигенсвязывающий центр, который связывает сывороточный альбумин человека. Причем первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH1) этого антитела содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 для CDR-H1, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 для CDR-H2, и последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3 для CDR-H3, и первый вариабельный домен легкой цепи (VL1) содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4 для CDR-L1, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5 для CDR-L2, и последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 6 для CDR-L3, а его второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH2) имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, и второй вариабельный домен легкой цепи (VL2) имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12, при этом второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH2) и второй вариабельный домен легкой цепи (VL2) соединены дисульфидной связью.
Это антитело препятствует связыванию ОХ40 с OX40L.
В предпочтительном варианте предложенное биспецифическое антитело имеет пептидный линкер между СД-доменом и вторым вариабельным доменом тяжелой цепи (VH2) или имеет пептидный линкер между G-доменом и вторым вариабельным доменом легкой цепи (VL2).
Первый вариабельный домен тяжелой цепи этого биспецифического антитела (VH1) может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, или его первый вариабельный домен легкой цепи (VL1) может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7.
Предпочтительно тяжелая цепь указанного антитела может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, или состоять из таковой, а его легкая цепь может содержать последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16, или состоять из таковой.
Вторым вариантом данного изобретения является биспецифическое антитело, которое связывается с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека, и имеет тяжелую цепь, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15, а также легкую цепь, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16.
Еще объектами данного изобретения являются выделенная ДНК, кодирующая вышеуказанные биспецифические антитела и вектор клонирования или экспрессии, содержащий кодирующую их ДНК.
Причем предпочтительно этот вектор может содержать последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24.
Другим объектом предложенного изобретения служит клетка-хозяин, предназначенная для получения заявленных антител, содержащая указанный вектор клонирования или экспрессии.
Изобретение также относится к способу получения биспецифических антител, включающему культивирование указанной клетки-хозяина и выделение биспецифического антитела.
В нем описана фармацевтическая композиция для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40, содержащая вышеописанные биспецифические антитела и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Наконец, еще одним объектом предложенного изобретения является способ лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40, у нуждающегося в этом пациента, при этом способ включает введение пациенту описанных биспецифических антител.
Кроме того, изобретение касается применения этих антител для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40, а также для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое связано с повышенным уровнем ОХ40.
В предпочтительных вариантах патологическое расстройство выбирается из группы, состоящей из аллергии, хронической обструктивной болезни легких, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, астмы, реакции трансплантат против хозяина, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, сахарного диабета 1 типа, рассеянного склероза, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, тяжелой миастении, болезни Грейвса, отторжения трансплантата, гранулематоза Вегенера, пурпуры Шенлейна-Геноха, системной склеродермии, вирусного воспаления легких, воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Пейрони, заболевания брюшной полости, перитонита, псориаза, васкулита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, панкреатита и периодонтита. В других более предпочтительных вариантах это расстройство вы- 3 035112 бреется из группы, состоящей из ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, заболевания брюшной полости, псориаза, сахарного диабета 1 типа, системной красной волчанки, синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, болезни Грейвса и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
Остатки в вариабельных доменах данного антитела условно пронумерованы согласно системе, разработанной Kabat et al. Эта система изложена в Kabat et al., 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далее Kabat et al. (выше)). Эта система нумерации используется в настоящем описании, если не указано иное.
Обозначения остатков по Kabat не всегда непосредственно соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, чем в строгой нумерации Kabat, соответствующие укорачиванию или вставке в структурный компонент, будь то каркасный или гипервариабельный участок (CDR) основной структуры вариабельного домена. Правильная нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания остатков по гомологии в последовательности антитела со стандартной последовательностью, пронумерованной по Kabat.
CDR вариабельного домена тяжелой цепи расположены в положении остатков 31-35 (CDR-H1), остатков 50-65 (CDR-H2) и остатков 95-102 (CDR-H3) согласно системе нумерации Kabat. Тем не менее, согласно Chothia (Chothia С. and Lesk A. M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)) петля, эквивалентная CDR-H1, простирается от остатка 26 до остатка 32. Таким образом, если не указано иное, CDR-H1, использованное в данном документе, предназначено для обозначения остатков с 26 по 35, как описано при сочетании системы нумерации Kabat и топологического определения петли по Chothia.
CDR вариабельного домена легкой цепи расположены в положении остатков 24-34 (CDR-L1), остатков 50-56 (CDR-L2) и остатков 89-97 (CDR-L3) согласно системе нумерации Kabat.
Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению содержит Fab-фрагмент антагонистического антитела к ОХ40, ранее описанного в WO 2010/096418. Использованный в данном документе термин антагонистический описывает антитело, которое способно ингибировать и/или нейтрализовать биологическую сигнальную активность ОХ40, например блокируя связывание или существенно уменьшая связывание ОХ40 с лигандом ОХ40 и, таким образом, ингибируя активацию ОХ40.
Скрининг антител для выявления тех, которые связываются с ОХ40, можно выполнить с использованием анализов для измерения связывания с ОХ40 человека и/или анализов для измерения способности блокировать связывание ОХ40 с его лигандом, OX40L. Примером анализа на основе связывания является ELISA, в частности, с использованием белка ОХ40 человека, слитого с Fc человека, который иммобилизуют на планшетах, и с использованием конъюгированного вторичного антитела для обнаружения антитела к ОХ40, связанного со слитым белком. Примером анализа на основе блокирования является анализ на основе проточной цитометрии с измерением блокирования связывания слитого белка ОХ40-лиганда с ОХ40 на CD4 клетках человека. Флуоресцентно меченое вторичное антитело используют для обнаружения количества связывания слитого белка ОХ40-лиганда с клеткой. Этот анализ выявляет снижение сигнала, поскольку антитело в супернатанте блокирует связывание слитого белка лиганда с ОХ40. Еще одним примером блокирующего анализа является анализ, где блокирование костимуляции наивных Т-клеток человека, опосредованное слитым белком ОХ40-лиганда, нанесенного на планшет, измеряют путем измерения включения меченого тритием тимидина.
В настоящем изобретении вариабельные области являются гуманизированными. Гуманизированные антитела (которые включают CDR-привитые антитела) являются молекулами антител, имеющими один или несколько гипервариабельных участков (CDR), не принадлежащих человеку, и каркасную область из молекулы иммуноглобулина человека (см., например, патент США № 5585089; WO 91/09967). Следует иметь в виду, что иногда необходимо перенести только определяющие специфичность остатки CDR, а не весь CDR (см., например, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Гуманизированные антитела могут дополнительно содержать один или несколько каркасных остатков, не принадлежащих человеку, а соответствующих виду, от которого были получены CDR.
В настоящем изобретении CDR из VH1 и VL1 получены из антитела, известного как А26, описанного в WO 2010/096418. Следует иметь в виду, что в CDR согласно изобретению могут быть осуществлены заменой одной или нескольких аминокислот, инсерции и/или делеции, без значительного изменения способности антитела к связыванию с ОХ40 и нейтрализации активности ОХ40. Эффект любых аминокислотных замен, инсерций и/или делеций может быть легко проверен специалистом в данной области техники, например, с использованием способов, описанных в WO 2010/096418, для определения связывания ОХ40 и ингибирования взаимодействия OX40/OX40L.
Идентичность, использованная в данном документе, означает, что в любом конкретном положении аминокислотные остатки в выравниваемых последовательностях совпадают. Сходство, использованное в данном документе, означает, что в любом конкретном положении в выравниваемых последовательностях аминокислотные остатки являются остатками аналогичного типа. Например, лейцин может быть заменен на изолейцин или валин. Другие аминокислоты, которые часто могут быть заменены друг на друга, включают, но без ограничения:
- 4 035112 фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи);
лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи);
аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислотные боковые цепи);
аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи);
цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи).
Степени идентичности и сходства могут быть легко рассчитаны (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991, программное обеспечение BLAST™, доступное от NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
Используемый в данном документе термин молекула CDR-привитого антитела относится к молекуле антитела, в которой тяжелая и/или легкая цепь содержит один или несколько CDR (в том числе, если необходимо, один или несколько модифицированных CDR) из донорного антитела (например, моноклонального антитела мыши), привитых на каркас вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи акцепторного антитела (например, антитела человека) (см. обзор см. Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). Вместо переноса полного CDR возможен перенос на каркас антитела человека только одного или нескольких определяющих специфичность остатков из любых из CDR, описанных в данном документе выше (см., например, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Если CDR или определяющие специфичность остатки привиты, может быть использована любая приемлемая акцепторная последовательность каркаса вариабельной области с учетом класса/типа донорного антитела, из которого получены CDR, в том числе каркасные области мыши, примата и человека. Соответственно, CDR-привитое антитело имеет вариабельный домен, содержащий акцепторные каркасные области человека, а также один или несколько CDR или определяющих специфичность остатков, описанных выше. Примерами каркасов человека, которые могут быть использованы, являются KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (Kabat et al., выше). Например, KOL и NEWM могут быть использованы для тяжелой цепи, REI может быть использован для легкой цепи и EU, LAY и РОМ могут быть использованы как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи. Альтернативно, могут быть использованы последовательности зародышевого типа человека; они доступны по адресу: http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/.
В CDR-привитом антителе акцепторные тяжелые и легкие цепи необязательно должны быть получены из того же антитела и могут, если необходимо, содержать составные цепи, имеющие каркасные области, полученные из разных цепей.
Подходящую каркасную область для первого вариабельного домена тяжелой цепи (VH1) можно получить из последовательности 1-3 3-07 подгруппы VH3 человека вместе с JH4. Подходящую каркасную область легкой цепи для первого вариабельного домена легкой цепи (VL1) можно получить из последовательности 2-1 1-02 подгруппы VK1 зародышевого типа человека вместе с JK4.
Кроме того, в вариабельной области CDR-привитого антитела каркасные области не должны иметь точно ту же последовательность, что и у акцепторного антитела. Например, редкие остатки могут быть изменены на более часто встречающиеся остатки для этого класса или типа цепи акцептора. Альтернативно, выбранные остатки в акцепторных каркасных областях могут быть изменены таким образом, чтобы они соответствовали остатку, обнаруженному в том же положении в донорном антителе (см. Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Такие изменения должны быть сведены к минимуму, необходимому для восстановления аффинности донорного антитела. Протокол для выбора остатков в акцепторных каркасных областях, которые могут нуждаться в замене, изложен в WO 91/09967.
Соответственно, в первой вариабельной области тяжелой цепи (VH1), если акцепторная тяжелая цепь имеет последовательность 1-3 3-07 VH3 человека вместе с JH4, акцепторные каркасные области тяжелой цепи содержат в дополнение к одному или нескольким донорским CDR донорский остаток по меньшей мере в одном из положений 37, 73, 78 или 94 (в соответствии с Kabat et al., (выше)). Соответственно, получается биспецифическое антитело, в котором, по меньшей мере, остатки в положениях 37, 73, 78 и 94 первого вариабельного домена тяжелой цепи являются донорскими остатками.
Соответственно, в первой вариабельной области легкой цепи (VL1), если акцепторная легкая цепь имеет последовательность 2-1 1-02 подгруппы VK1 человека вместе с JK4, акцепторные каркасные области легкой цепи содержат в дополнение к одному или нескольким донорским CDR донорский остаток по меньшей мере в одном из положений 64 или 71. Соответственно, получается биспецифическое антитело, в котором, по меньшей мере, остатки в положениях 64 и 71 первого вариабельного домена легкой цепи являются донорскими остатками.
Донорские остатки являются остатками из донорного антитела, т.е. антитела, из которого были первоначально получены CDR.
- 5 035112
Следует понимать, что замены, инсерции и/или делеции могут быть осуществлены в первых вариабельных доменах тяжелой и легкой цепей, без значительного изменения способности слитого белка антитела к связыванию с ОХ40 и нейтрализации активности ОХ40. Эффект любых аминокислотных замен, инсерций и/или делеций может быть легко проверен специалистом в данной области техники, например, с применением способов, описанных в WO 2010/096418, для определения связывания с ОХ40 и блокирования лиганда.
В биспецифическом антителе тяжелая цепь содержит C^-домен и легкая цепь содержит Оь-домен, каппа или лямбда.
Следует понимать, что замены, инсерции и/или делеции могут быть также осуществлены в вариабельных и/или константных доменах антитела без значительного изменения способности антитела к связыванию с ОХ40 и нейтрализации активности ОХ40. Эффект любых аминокислотных замен, инсерций и/или делеций может быть легко проверен специалистом в данной области техники, например, с применением способов, описанных в WO 2010/096418, для определения связывания с ОХ40 и блокирования взаимодействия OX40/OX40L.
Вторым антигеном, с которым связывается биспецифическое антитело, является сывороточный альбумин человека. С ним связывается Fv-фрагмент из Fab-dsFv, который составлен из вторых вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, VH2 и VL2. В настоящем изобретении VH2 и VL2 получены из одного из антител, описанных в WO 2010/035012, и представляют собой улучшенный, более гуманизированный трансплантат этого антитела.
Антитела согласно настоящему изобретению соответственно имеют высокую аффинность связывания, в частности пикомолярную аффинность в отношении ОХ40 человека и наномолярную аффинность в отношении сывороточного альбумина человека. Аффинность может быть измерена с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники, включая поверхностный плазмонный резонанс, например BIAcore™, как описано для ОХ40 в WO 2010/096418 и сывороточного альбумина в WO 2010/035012, с применением выделенного природного или рекомбинантного ОХ40, или сывороточного альбумина, или подходящего слитого белка/полипептида.
Аффинность измеряют с использованием внеклеточного домена рекомбинантного ОХ40 человека, как описано в WO 2010/096418. Причем используемый внеклеточный домен рекомбинантного ОХ40 человека представляет собой димер, например слитый димер Fc. Соответственно, антитела по настоящему изобретению имеют аффинность связывания выделенного ОХ40 человека около 200 пМ или менее, предпочтительно 100 пМ или менее, наиболее предпочтительно около 50 пМ или менее и, наконец, около 40 пМ или менее.
Антитела согласно настоящему изобретению соответственно имеют высокую аффинность связывания в отношении ОХ40 человека, экспрессированного на поверхности активированных Т-клеток, например наномолярную или пикомолярную аффинность. Аффинность может быть измерена с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники, в том числе способом, описанным в WO 2010/096418, с применением активированных CD4+ ОХ40+ Т-клеток человека. В частности, антитела по настоящему изобретению имеют аффинность связывания в отношении экспрессированного на клеточной поверхности ОХ40 человека около 2 нМ или более предпочтительно около 1 нМ или более, наиболее предпочтительно около 0,5 нМ или более и, наконец, около 0,2 нМ или более.
Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению имеют аффинность связывания в отношении выделенного сывороточного альбумина человека около 50 нМ или менее, предпочтительно около 20 нМ или менее, наиболее предпочтительно 10 нМ или менее, и, наконец, 5 нМ или менее или около 2 нМ или менее.
Антитела по настоящему изобретению могут связываться с сывороточным альбумином человека и сывороточным альбумином яванского макака, мыши и крысы. Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с сывороточным альбумином яванского макака с аффинностью 5 нМ или менее и с сывороточным альбумином мыши с аффинностью 5 нМ или менее.
Антитела по настоящему изобретению способны связываться с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека одновременно.
Преимущественно антитела по настоящему изобретению имеют высокую аффинность в отношении ОХ40 и также имеют достаточный период полураспада in vivo для того, чтобы быть терапевтически пригодным, например период полураспада варьирует в диапазоне 5-15 дней, например 7-11 дней.
Следует иметь в виду, что аффинность слитого белка антитела к ОХ40 человека и/или сывороточному альбумину человека может быть изменена с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники. Такие варианты могут быть получены с помощью ряда протоколов созревания аффинности, включая мутирование CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), перетасовку цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), применение штаммов-мутаторов E.coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), ДНК-перетасовку (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) и половую ПЦР (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). В Vaughan et al. (выше) рассматриваются эти способы созревания аффинности.
- 6 035112
Биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению блокирует взаимодействие между ОХ40 и OX40L. Многочисленные анализы, подходящие для определения способности антитела блокировать это взаимодействие, описаны в WO 2010/096418. Антитело может иметь специфичность в отношении ОХ40 человека, который способен на 50% ингибировать связывание OX40L человека (исследуют при конечной концентрации 2 мкг/мл) с активированными CD4+ ОХ40+ Т-клетками человека при концентрации менее 0,5 нМ. OX40L человека, использованный в анализе, может быть природным ОХ40 человека. ОХ40 человека, использованный в анализе, также может быть рекомбинантным ОХ40 человека.
При необходимости, антитело может быть конъюгировано с одной или несколькими эффекторными молекулами. Следует иметь в виду, что эффекторная молекула может включать одну эффекторную молекулу либо две или более таких молекул, связанных так, чтобы образовать единый фрагмент, который может быть присоединен к антителам. Если необходимо получить фрагмент антитела, связанный с эффекторной молекулой, это может быть получено с помощью стандартных химических процедур или процедур рекомбинантной ДНК, в которых фрагмент антитела соединяют непосредственно или с помощью связующего агента с эффекторной молекулой. Методы конъюгирования таких эффекторных молекул с антителами хорошо известны в данной области техники (см., Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, p. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Конкретные химические процедуры включают, например, те, которые описаны в WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03/031581. Альтернативно, если эффекторная молекула представляет собой белок или полипептид, соединение может быть достигнуто с применением процедур рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и ЕР 0392745.
Термин эффекторная молекула, использованный в данном документе, включает, например, противоопухолевые средства, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например, ферменты, другие антитела или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например, ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, в частности радиоактивный йод, радиоизотопы, хелатные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые могут быть обнаружены с помощью ЯМР или ESRспектроскопии.
Примеры эффекторных молекул могут включать цитотоксины или цитотоксические средства, в том числе любое средство, которое наносит ущерб клеткам (например, убивает). Примеры включают комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин, майтанзиноиды, спонгистатины, ризоксин, галихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.
Эффекторные молекулы также включают, но без ограничения, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин, тиоэпахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромоманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлородиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), калихеамицины или дуокармицины) и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин).
Другие эффекторные молекулы могут включать хелатные радионуклиды, такие как 'In и 90Y, 177Lu, висмут-213, калифорний-252, иридий-192 и вольфрам-188/рений-188; или лекарственные средства, такие как, но без ограничения, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин.
Другие эффекторные молекулы включают белки, пептиды и ферменты. Представляющие интерес ферменты включают, но без ограничения, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Представляющие интерес белки, полипептиды и пептиды включают, но без ограничения, иммуноглобулины, токсины, такие как абрин, рицин А, экзотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин, белок, такой как инсулин, фактор некроза опухоли, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или тканевой активатор плазминогена, тромботическое средство или анти-ангиогенное средство, например, ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, такой как лимфокин, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста нервов (NGF) или другой фактор роста и иммуноглобулины.
Другие эффекторные молекулы могут включать детектируемые вещества, полезные, например, в диагностике. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радионуклиды, позитронно-активные металлы (для применения в позитронно-эмиссионной томографии) и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. В патенте США № 4741900 описаны ионы металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для применения в качестве диагностических. Пригодные фер
- 7 035112 менты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; пригодные простетические группы включают стрептавидин, авидин и биотин; пригодные флуоресцентные материалы включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлоротриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид и фикоэритрин; пригодные люминесцентные материалы включают люминол; пригодные биолюминесцентные материалы включают люциферазу, люциферин и экворин; и подходящие радионуклиды включают 125I, 131I, 111In и 99Tc.
Если эффекторная молекула является полимером, она, как правило, может быть синтетическим или природным полимером, например факультативно замещенным полиалкиленом с прямой или разветвленной цепью, полиалкенильным или полиоксиалкиленовым полимером или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например гомо- или гетерополисахаридом.
Конкретные факультативные заместители, которые могут быть представлены на указанных выше синтетических полимерах, включают одну или несколько гидрокси-, метиловых или метоксигрупп.
Конкретные примеры синтетических полимеров включают факультативно замещенный с прямой или разветвленной цепью поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) или их производные, особенно факультативно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или их производные.
Конкретные природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные.
Термин производные, использованный в данном документе, предназначен для включения реакционноспособных производных, например тиол-селективных реакционноспособных групп, таких как малеимиды и т.п. Реакционноспособная группа может быть соединена непосредственно или посредством линкерного сегмента с полимером. Следует иметь в виду, что остаток такой группы будет в некоторых случаях образовывать часть продукта в виде связующей группы между фрагментом антитела и полимером.
Размер полимера можно варьировать по желанию, но обычно он находится в диапазоне среднего молекулярного веса от 500 а до 50000 Да, например от 5000 до 40000 Да, такой как от 20000 до 40000 Да.
Пригодные эффекторные молекулы могут быть присоединены через любую доступную аминокислотную боковую цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, расположенную в антителе, например любую свободную амино-, имино-, тиоловую, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут быть природного происхождения во фрагменте антитела или могут быть встроены во фрагмент с применением способов рекомбинантной ДНК (см., например, патенты США № 5219996; 5667425, WO 98/25971).
Последовательности ДНК, которые кодируют антитело, могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Например, последовательности ДНК, кодирующие часть или все тяжелую и легкую цепи антитела, могут быть синтезированы в соответствии с пожеланиями из определенных последовательностей ДНК или на основе соответствующих аминокислотных последовательностей.
ДНК, кодирующая акцепторные каркасные последовательности, широко доступна специалистам в данной области техники и может быть легко синтезирована на основе известных аминокислотных последовательностей.
Целевые последовательности ДНК могут быть синтезированы полностью или частично с использованием методов синтеза олигонуклеотидов. Сайт-направленный мутагенез и методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут быть использованы при необходимости.
Примеры подходящих последовательностей приведены в SEQ ID NO: 21 фиг. 5(a); SEQ ID NO: 22 фиг. 5(b); SEQ ID NO: 23 фиг. 6(a); SEQ ID NO: 24 фиг. 6(b). Нуклеотиды 1-63 в SEQ ID NO: 21 и 1-63 в SEQ ID NO: 23 кодируют последовательность сигнального пептида OmpA, который расщепляется с получением антагонистического антитела. Другие примеры подходящих последовательностей приведены в SEQ ID NO: 25 фиг. 7(a); SEQ ID NO: 26 фиг. 7(b); SEQ ID NO: 27 фиг. 8(a); SEQ ID NO: 28 фиг. 6(b). Нуклеотиды 1-57 в SEQ ID NO: 25 и 1-60 в SEQ ID NO: 27 кодируют последовательность сигнального пептида мышиного антитела В72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1 (6) 499-505.), который расщепляется с получением антагонистического антитела. Соответственно, вектор клонирования или экспрессии может содержать две последовательности ДНК, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепи молекулы антитела. Таким образом, вектор может содержать последовательности, представленные в SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 23. Нуклеотиды 1-63 в SEQ ID NO: 21 и 1-63 в SEQ ID NO: 23 кодируют последовательность сигнального пептида из OmpA.
Общие способы, с помощью которых могут быть сконструированы векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в данной области техники. В этом отношении делается ссылка на Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York и Maniatis Manual, produced by Cold Spring Harbor Publishing.
Любая подходящая клетка-хозяин и векторная система могут быть использованы для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих молекулу антитела. Могут быть использованы бактериальные, например E.coli, и другие микробные системы или эукариотические, например системы млекопитающих,
- 8 035112 а также системы экспрессии клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают
СНО, клетки миеломы или гибридомы.
Для получения продуктов, содержащих одновременно тяжелые и легкие цепи, клеточная линия может быть трансфицирована двумя векторами, первым вектором, кодирующим полипептид легкой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, при этом вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.
Поскольку антитела пригодны для лечения и/или профилактики патологического состояния, то они могут быть включены в фармацевтическую или диагностическую композицию с одним или более фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый адъювант.
Антитело может быть единственным активным ингредиентом в фармацевтической или диагностической композиции или может сопровождаться другими активными ингредиентами, в том числе другими антителами, например антителом к TNF, антителом к IL-13, антителом к Т-клеткам, антителом к IFNy или антителом к LPS, или ингредиентами, не являющимися антителами, такими как ксантины. Другие подходящие активные ингредиенты включают в себя антитела, способные индуцировать толерантность, например антитела к CD3 или антитела к CD4.
Антитела или композицию можно использовать в комбинации с дополнительным фармацевтически активным средством, например кортикостероидом (таким как флутиказона пропионат) и/или бета-2агонистом (таким как сальбутамол, сальметерол или формотерол), или ингибиторами роста и пролиферации клеток (такими как рапамицин, циклофосфамид, метотрексат), или альтернативным ингибитором CD28 и/или CD40. Фармацевтические композиции соответственно содержат терапевтически эффективное количество антитела. Термин терапевтически эффективное количество, использованный в данном документе, относится к количеству терапевтического средства, необходимому для лечения, облегчения или профилактики заболевания или состояния или для достижения обнаруживаемого терапевтического или профилактического эффекта. Для любого антитела терапевтически эффективное количество может быть оценено первоначально в анализах на клеточных культурах или на животных моделях, как правило, на грызунах, кроликах, собаках, свиньях или приматах. Модель на животных может быть также использована для определения соответствующего диапазона концентраций и пути введения. Такая информация затем может быть использована для определения подходящих доз и путей введения человеку.
Точное терапевтически эффективное количество для субъекта-человека будет зависеть от тяжести болезненного состояния, общего состояния здоровья субъекта, возраста, веса и пола субъекта, от диеты, времени и частоты введения, комбинации (комбинаций) лекарственного средства, чувствительности реакции и толерантности/ответа на терапию. Это количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и находится в компетенции врача-клинициста. Как правило, терапевтически эффективное количество будет составлять от 0,01 до 50 мг/кг, например от 0,1 до 20 мг/кг. Фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в форме стандартных доз, содержащих заранее определенное количество активного средства на дозу.
Композиции можно вводить пациенту отдельно или можно вводить в комбинации (например, одновременно, последовательно или раздельно) с другими средствами, лекарственными средствами или гормонами.
Доза, в которой вводят антитело, зависит от природы состояния, подлежащего лечению, от имеющейся степени воспаления и от того, используется ли молекула антитела профилактически, или для лечения существующего состояния.
Частота дозирования будет зависеть от периода полураспада антитела и продолжительности ее эффекта. Если молекула антитела имеет короткий период полураспада (например, от 2 до 10 ч), необходимо вводить одну или несколько доз в день. Альтернативно, если молекула антитела имеет длительный период полураспада (например, от 2 до 15 дней), необходимо вводить дозу только раз в день, раз в неделю или даже раз в 1 или 2 месяца.
Фармацевтически приемлемый носитель не должен сам по себе вызывать выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию, и не должен быть токсичным. Подходящие носители могут быть большими, медленно метаболизируемыми макромолекулами, такими как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимеры молочной кислоты, полимеры гликолевой кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как воду, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие средства, или рН-буферные вещества могут присутствовать в таких композициях. Такие носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей и суспензий для
- 9 035112 приема внутрь пациентом.
Подходящие формы для введения включают формы, пригодные для парентерального введения, например путем инъекции или инфузии, например путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Там, где продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может иметь форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе и может содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, консервирующие стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, антитело может быть в сухом виде и разбавляется перед применением соответствующей стерильной жидкостью.
После составления композиции можно вводить непосредственно субъекту. Субъектами, подлежащими лечению, могут быть животные.
Соответственно, в составах рН конечного состава не аналогичен значению изоэлектрической точки антитела или фрагмента, например, если рН состава 7, тогда может быть целесообразным pI от 8-9 или выше. Не желая быть связанными теорией, считается, что в конечном итоге это может обеспечить конечный состав с улучшенной стабильностью, например, антитело или фрагмент остается в растворе.
Предпочтительно, чтобы антитело не имела pI, которая соответствует общей нейтральной молекуле. Это делает молекулу менее чувствительной к агрегации.
Фармацевтические композиции можно вводить любым путем, включая, но без ограничения, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, интрамедуллярный, интратекальный, интравентрикулярный, трансдермальный, чрескожный (см., например, WO 98/20734), подкожный, внутрибрюшинный, интраназальный, энтеральный, местный, сублингвальный, вагинальный или ректальный пути. Безыгольный инжектор также может быть использован для введения фармацевтических композиций. Как правило, терапевтические композиции могут быть подготовлены для инъекции в виде либо жидких растворов, либо суспензий. Но и твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией, также могут быть получены.
Непосредственная доставка композиций обычно выполняется путем инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или она может быть доставлена в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут также быть введены в место поражения. Дозирование лечения может представлять собой схему с однократным введением дозы или с многократным введением дозы.
Следует иметь в виду, что активным ингредиентом в композиции будет молекула антитела. Как таковая, она будет подвержена разрушению в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если композиция предназначена для введения посредством желудочно-кишечного тракта, она должна будет содержать средства, которые защищают антитело от разрушения, но высвобождают его после всасывания из желудочно-кишечного тракта.
Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, New Jersey, 1991).
Состав может представлять собой состав для местного введения, включая ингаляцию.
Подходящие ингаляционные препараты включают ингаляционные порошки, дозирующие аэрозоли, содержащие газы-пропелленты, или ингаляционные растворы, свободные от газов-пропеллентов. Ингаляционные порошки, содержащие активное вещество, могут состоять только из указанных выше активных веществ или из смеси указанных выше активных веществ с физиологически приемлемым наполнителем.
Эти ингаляционные порошки могут содержать моносахариды (например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбитол, маннитол, ксилитол), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) или их смеси друг с другом. Моно- или дисахариды являются удобными в применении, особенно при применении лактозы или глюкозы, в частности, но не исключительно, в форме их гидратов.
Частицы для осаждения в легких требуют размер частиц менее 10 мкм, например 1-9 мкм, например от 0,1 до 5 мкм, в частности от 1 до 5 мкм.
Размер частиц активного ингредиента (такого как антитело или его фрагмент) имеет первостепенное значение.
Газы-пропелленты, которые могут быть использованы для подготовки ингаляционных аэрозолей, известны в данной области техники. Подходящие газы-пропелленты выбирают из углеводородов, таких как н-пропан, н-бутан или изобутан, и галогенированных углеводородов, таких как хлорированные и/или фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циклобутана. Указанные выше газы-пропелленты могут быть использованы сами по себе или в их смеси.
Особенно подходящими газами-пропеллентами являются галогенированные производные алканов, выбранные из TG 11, TG 12, TG 134а и TG227. Из указанных выше галогенированных углеводородов TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан), а также их смеси являются особенно подходящими.
Содержащие газ-пропеллент ингаляционные аэрозоли могут также содержать другие ингредиенты, такие как сорастворители, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества (суфрактанты), антиоксиданты, смазочные материалы и средства для регулирования рН. Все эти ингредиенты известны в данной
- 10 035112 области техники.
Содержащие газ-пропеллент ингаляционные аэрозоли могут содержать до 5 вес.% активного вещества. Аэрозоли содержат, например, от 0,002 до 5 вес.%, от 0,01 до 3 вес.%, от 0,015 до 2 вес.%, от 0,1 до вес.%, от 0,5 до 2 вес.% или от 0,5 до 1 вес.% активного ингредиента.
Альтернативно местному введению в легкие может также быть введение жидкого раствора или суспензионного состава, например, с использованием устройства, такого как небулайзер, например небулайзер, соединенный с компрессором (например, небулайзер Pari LC-Jet Plus (R), соединенный с компрессором производства Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
Антитела могут быть доставлены диспергированными в растворителе, например, в виде раствора или суспензии. Они могут быть суспендированы в подходящем физиологическом растворе, например солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом растворителе или буферном растворе. Буферные растворы, известные в данной области техники, могут содержать 0,05-0,15 мг динатрий эдетата, 8,0-9,0 мг NaCl, 0,15-0,25 мг полисорбата, 0,25-0,30 мг безводной лимонной кислоты и 0,45-0,55 мг цитрата натрия на 1 мл воды так, чтобы достичь рН от около 4,0 до 5,0. В суспензии можно использовать, например, лиофилизированное антитело.
Терапевтические составы в виде суспензий или раствора могут также содержать один или несколько наполнителей. Наполнители хорошо известны в данной области техники и включают буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), ЭДТА, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть инкапсулированы в липосомы или биоразлагаемые микросферы. Состав может быть получен с использованием процессов, которые включают производство и стерилизацию фильтрованием буферного растворителя/раствора, используемого для состава, асептическое суспендирование антитела в стерильном буферном растворителе/растворе и распределение состава в стерильные сосуды с помощью методов, известных специалистам в данной области техники.
Распыляемый состав может быть получен в виде комплектов с разовой дозой (например, запечатанных пластиковых контейнеров или флаконов), упакованных в конверты из фольги. Каждый флакон содержит стандартную дозу в объеме, например, 2 мл буферного растворителя/раствора.
Антитела могут быть доставлены путем распыления.
Предполагается также, что антитела можно вводить с применением генной терапии. Для того чтобы достичь этого, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи молекулы антитела под контролем соответствующих компонентов ДНК, вводят пациенту таким образом, что цепи антитела экспрессируются из последовательностей ДНК и собираются in situ.
Антитела (или композиции, содержащие его, могут применяться для контроля воспалительных заболеваний, например, острого или хронического воспалительного заболевания. Соответственно, антитела (или композиции, содержащие его) могут быть использованы для уменьшения воспалительного процесса или для предотвращения воспалительного процесса. Они обеспечивают снижение in vivo активированных Т-клеток, в частности тех, которые участвуют в воспалительных иммунных ответах, например, привлеченных в район/местоположение такого ответа.
Снижение количества активированных Т-клеток может быть снижением на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более по сравнению с их количеством до лечения или без лечения.
Предпочтительно лечение с использованием антитела, фрагмента или композиции может обеспечить снижение уровня активированных Т-клеток без снижения общего уровня Т-клеток (неактивированных Т-клеток) пациента. Это может привести к уменьшению побочных эффектов и, возможно, предотвращению истощения Т-клеток у пациента.
Патологическое состояние, которое опосредовано ОХ40 или связано с повышенным уровнем ОХ40, может, например, быть выбрано из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, связанного с инфекцией, артрита, ревматоидного артрита, астмы, COPD, воспаления органов таза, болезни Альцгеймера, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта, сахарного диабета I типа, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, таких как рассеянный склероз, волчанки (например, системной красной волчанки и волчаночного нефрита) и синдрома ГийенаБарре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, болезни Грейвса, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, гранулематоза Вегенера, других аутоиммунных заболеваний, панкреатита, травмы (хирургической операции), реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, болезни сердца, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистого свертывания, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, пародонтита и гипохлоргидрии.
- 11 035112
Механизм, посредством которого работают антитела, включает ингибирование пролиферации или выживания Т-клеток, и/или повышение выработки Treg, и/или снижение дифференцировки В-клеток, и/или снижение производства цитокинов.
Антитело, его фрагмент или композиция могут применяться для изготовления лекарственного препарата для лечения или профилактики одного или нескольких медицинских показаний, описанных в данном документе.
Антитело или композиция могут быть использованы в любой терапии, когда желательно уменьшить эффекты ОХ40 в организме человека или животного. ОХ40 может циркулировать в организме или может быть представлен на нежелательно высоком уровне локализованным в определенном месте в организме, например в месте воспаления.
Антитело или содержащую его композицию можно использовать для контроля воспалительного заболевания, например, описанного в данном документе.
Способ лечения человека или животных субъектов, страдающих от или подверженных риску нарушения, опосредованного ОХ40, включает введение субъекту эффективного количества антитела или композиции, содержащей его.
Биспецифическое антитело, которое связывается с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека, по существу, является очищенным от, в частности, не содержит или по существу не содержит эндотоксина и/или белка или ДНК клетки-хозяина.
Термин очищенная форма, как использовано выше, предназначен для обозначения по меньшей мере 90% чистоты, например 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% вес./вес. или большей чистоты.
Термин по существу не содержащий эндотоксина предназначен для обозначения содержания эндотоксина 1 EU на 1 мг продукта антитела или менее, например 0,5 или 0,1 EU на 1 мг продукта.
Термин по существу не содержащий белка или ДНК клетки-хозяина предназначен для обозначения содержания белка и/или ДНК клетки-хозяина 400 мкг на 1 мг продукта антитела или менее, например 100 мкг на 1 мг или менее, в частности 20 мкг на 1 мг, в случае необходимости.
Антитело также может быть использовано в диагностике, например в диагностике in vivo и в визуализации болезненных состояний с участием ОХ40.
Преимущественно антитела считаются безопасными для введения людям в надлежащей терапевтической дозе, в частности, потому что они не являются суперагонистами и вряд ли могут вызвать цитокиновый шторм.
Термин суперагонист, использованный в данном документе, относится к антителу, которое приводит к размножению Т-клеток без участия TCR.
А26 Fab-Fv снижает индекс деления. Этот эффект предположительно опосредован NK-клетками, которые экспрессируют ОХ40. Индекс деления представляет собой среднее количество клеточных делений, которое претерпела клетка в исходной популяции, и включает не разделившиеся клетки.
Индекс пролиферации отражает только пролиферацию отвечающей популяции, причем ингибиторный эффект А26 Fab-Fv при использовании этого измерения может быть относительно снижен.
Термин содержащий в контексте настоящего описания предполагает значение включающий.
Настоящее изобретение дополнительно описано в следующих примерах.
Примеры
Подробное описание фигур.
Фиг. 1: биспецифическое антитело, названное Fab-dsFv.
Фиг. 2:
a) V-область легкой цепи антитела А26 (SEQ ID NO: 7),
b) V-область тяжелой цепи антитела А26 (SEQ ID NO: 8),
c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5) и CDRL3 (SEQ ID NO: 6) антитела A26,
d) легкая цепь Fab-компонента антитела А26 (SEQ ID NO: 9),
e) тяжелая цепь Fab-компонента антитела A26(SEQ ID NO: 10).
Фиг. 3:
a) тяжелая цепь Fv-компонента 645gH5 к альбумину (SEQ ID NO: 11),
b) легкая цепь Fv-компонента 645gL4 к альбумину (SEQ ID NO: 12),
c) линкер 1 (SEQ ID NO: 13),
d) линкер 2 (SEQ ID NO: 14),
e) тяжелая цепь Fab-dsFv (SEQ ID NO: 15),
f) легкая цепь Fab-dsFv (SEQ ID NO: 16).
Фиг. 4:
вариабельный домен тяжелой цепи 645g1 (SEQ ID NO: 17), вариабельный домен легкой цепи 645g1 (SEQ ID NO: 18),
645gH1 A26 Fab-dsFv (SEQ ID NO: 19),
645gL1 A26 Fab-dsFv (SEQ ID NO: 20).
- 12 035112
Фиг. 5:
a) ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab-dsFv, включая лидерную последовательность OmpA (SEQ ID NO: 21),
b) ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab-dsFv без лидерной последовательности OmpA (SEQ ID NO: 22).
Фиг. 6:
a) ДНК, кодирующая легкую цепь Fab-dsFv, включая лидерную последовательность OmpA (SEQ ID NO: 23),
b) ДНК, кодирующая легкую цепь Fab-dsFv без лидерной последовательности OmpA (SEQ ID NO: 24).
Фиг. 7:
a) ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab-dsFv, включая лидерную последовательность В72.3 (SEQ ID NO: 25),
b) ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab-dsFv без лидерной последовательности В72.3 (SEQ ID NO: 26).
Фиг. 8:
a) ДНК, кодирующая легкую цепь Fab-dsFv, включая лидерную последовательность В72.3 (SEQ ID NO: 27),
b) ДНК, кодирующая легкую цепь Fab-dsFv без лидерной последовательности В72.3 (SEQ ID NO: 28).
На фиг. 9a показано связывание А26 Fab-dsFv, меченного AlexaFluor 488, с активированными CD4+ OX40+ Т-клетками человека.
На фиг. 9b показано связывание A26Fab', A26 Fab-Fv и А26 Fab'-PEG в присутствии 5% HSA на активированных CD4+, ОХ40+ Т-клетках человека.
На фиг. 10а показан эффект А26 Fab-dsFv на производство цитокинов в РВМС, подвергнутых действию аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus.
На фиг. 10b показана способность А26 Fab-dsFv ингибировать пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток в модели мышей Hu-NSG.
На фиг. 11а показано ингибирование связывания OX40L с активированными CD4+ ОХ40+ Т-клетками человека с помощью А26 Fab-dsFv.
На фиг. 11b показано ингибирование связывания OX40L с активированными CD4+ ОХ40+ Т-клетками человека с помощью A26Fab', A26 Fab-dsFv, A26 Fab'-PEG и двух контролей.
На фиг. 12a показано, что А26 Fab-Fv ингибирует реакцию смешанных лимфоцитов (MLR) человека.
На фиг. 12b показано, что А26 Fab-Fv ингибирует производство IFN-гамма в ходе MLR человека.
На фиг. 13 показано, что А26 Fab-Fv снижает процент активированных (CD25+) CD4+ Т-клеток после вторичной рестимуляции антигеном с помощью аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus.
На фиг. 14 показано, что Fab-Fv и Fab-PEG, введенные до клеточного переноса, дозозависимым образом ингибируют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток в модели Hu-NSG.
Обработка ДНК и общие способы.
Компетентные штаммы B.coli использовали для трансформаций и рутинного культивирования. Ферменты для рестрикции и модификации ДНК получили от Roche Diagnostics Ltd. and New England Biolabs. Плазмидные препараты получили с использованием наборов Maxi Plasmid purification (QIAGEN, номер по каталогу 12165). Реакции секвенирования ДНК выполнили с использованием набора ABI Prism Big Dye terminator sequencing (номер по каталогу 4304149) и провели на автоматическом секвенаторе ABI 3100 (Applied Biosystems). Данные проанализировали с помощью программы Sequencher (Genecodes). Олигонуклеотиды получили от Simga или Invitrogen. Гены, кодирующие начальные последовательности V-области, сконструировали методом автоматизированного синтеза с помощью DNA2.0 и модифицировали для создания привитых версий путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Концентрацию Fab-Fv определили методом ВЭЖХ на основе белка G.
Пример 1. Создание и анализ различных гуманизированных трансплантатов 645 в A26Fab-645dsFv.
Ранее авторами изобретения описан формат антитела Fab-dsFv (фиг. 1) (иногда называемый в данном документе просто как Fab-Fv) и гуманизированное антитело к альбумину, известное как 645gH1gL1, в WO 2010/035012. Также ранее описано создание гуманизированного антагонистического антитела к ОХ40, известного как 'А26', и его пэгилированного Fab'-фрагмента в /096418. Здесь мы описываем создание нового улучшенного гуманизированного трансплантата антитела '645', известного как 645dsgH5gL4, и создание молекулы антитела Fab-dsFv, включающей этот трансплантат в Fv-компоненте и вариабельные области А26 в Fab-компоненте. Вариабельные области А26 приведены на фиг. 2а и 2b (SEQ ID NO: 7 и 8).
- 13 035112
Последовательности вариабельной и константной области А26 совместно приведены на фиг. 2d и 2е (SEQ ID NO: 9 и 10).
Последовательности 645gH1 и gL1 приведены на фиг. 4(а) и (b), SEQ ID NO 17 и 18. Если использован термин Fab'-PEG или А26 Fab'-PEG, то это относится к А26 Fab-40R PEG', описанному в
WO 2010/096418.
1.1. Конструирование линкерных плазмид A26Fab-645dsFv(gH1gL1) и A26Fab645dsFv(gH5gL4)G4S.
Общую кодирующую область легкой цепи A26Fab-645dsFv(gL1) (SEQ ID NO: 20) клонировали в вектор экспрессии млекопитающих UCB под контролем промотора HCMV-MIE и последовательности полиаденилирования SV40E. Вариабельную область легкой цепи из 645dsFv (gL1) (SEQ ID NO: 18) мутировали в 645dsFv (gL4) (SEQ ID NO: 12) способом перекрывающейся ПЦР. Всю область кодирования тяжелой цепи A26Fab-645dsFv(gH1) (SEQ ID NO: 19) клонировали в вектор экспрессии млекопитающих UCB под контролем промотора HCMV-MIE и последовательности полиаденилирования SV40E. Вариабельную область тяжелой цепи 645dsFv(gH1) (SEQ ID NO: 17) мутировали в 645dsFv(gH5) (SEQ ID NO: 11) способом перекрывающейся ПЦР. Конструкции подтвердили секвенированием. Обе конструкции содержали линкер 3xG4S, приведенный в SEQ ID NO: 14, фиг. 3(d).
1.2. Экспрессия A26Fab-645dsFv(gH1gL1) и A26Fab-645dsFv(gH5gL4) у млекопитающих.
Клетки HEK293 трансфицировали плазмидами с тяжелой и легкой цепями с использованием реагента для трансфекции 293fectin от Invitrogen в соответствии с инструкциями изготовителя. Коротко, 25 мкг плазмиды с тяжелой цепью и 25 мкг плазмиды с легкой цепью инкубировали с 100 мкл 293fectin и 1700 мкл среды Optipro в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем смесь добавили к 50x106 клеток HEK293 в 50 мл суспензии и инкубировали в течение 6 дней со встряхиванием при 37°C. Через 6 дней супернатант собрали центрифугированием при 1500xg в течение 10 мин для удаления клеток и затем фильтровали через сито размером 0,22 мкм.
1.3. Очистка A26Fab-645dsFv(gH1gL1) и A26Fab-645dsFv(gH5gL4) белком G.
Примерно 50 мл отфильтрованных через 0,22 мкм супернатантов сконцентрировали до ~2 мл с помощью концентраторов Amicon Ultra-15 с низкопроточной мембраной для молекулярного веса 10 кДа и центрифугированием при 4000xg в поворотном роторе. 1,8 мл концентрированного супернатанта поместили в колонку 1 мл Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare) со скоростью потока 1 мл/мин, уравновешенной 20 мМ фосфата, 40 мМ NaCl, pH 7,4. Колонку промыли с 20 мМ фосфата, 40 мМ NaCl, pH 7,4 и связанный материал элюировали 0,1 М глицин/HCl рН 2,7. Пик элюирования собрали и рН довели примерно до 7 с помощью 2 М Tris/HCl pH 8,5. Элюат с доведенным рН сконцентрировали и подвергли диафильтрации в 20 мМ фосфата, 150 мМ NaCl, pH 7,4 с помощью концентраторов Amicon Ultra-15 с низкопроточной мембраной для молекулярного веса 10 кДа и центрифугированием при 4000xg в колебательном роторе до конечного объема ~0,3 мл.
1.4. Анализ A26Fab-645dsFv(gH1gL1) и A26Fab-645dsFv(gH5gL4) с помощью эксклюзионной хроматографии.
Очищенные белком G образцы проанализировали с помощью эксклюзионной HPLC. Образцы разделили на колонке 10/300 GL Tricorn Superdex 200 Superdex 200 10/300 GL Tricorn column (GE Healthcare), спроектированной с изократическим градиентом PBS pH 7,4, при скорости 1 мл/мин. Обнаружение пиков провели при 280 нм и кажущийся молекулярный вес рассчитали путем сравнения со стандартной кривой белков с известным молекулярным весом. Изменение гуманизированного трансплантата 645dsFv с gH1gL1 на gH5gL4 привело к увеличению процентного содержания мономера экспрессированного A26Fab-645dsFv с 59 до 71% на 12% без каких-либо изменений в термической стабильности dsFv (данные не показаны) или аффинности связывания dsFv с HSA (данные не показаны).
Пример 2.
2.1. Кинетика связывания А26 Fab-dsFv (645gH5gL4) с ОХ40 по BIAcore.
В этом и всех последующих примерах А26 Fab-dsFv 645gH5gL4 имело последовательность тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 15 (фиг. 3(е)), и последовательность легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO: 16 (фиг. 3(f)), т.е. тяжелая цепь содержала линкер G4S, G4T, G4S, приведенный в SEQ ID NO: 13, фиг. 3(с).
BIA (анализ биомолекулярного взаимодействия) выполнили с использованием BIAcore T200 (GE Healthcare). F(ab')2-фрагмент аффинного антитела козы к IgG человека, специфичного в отношении F(ab')2-фрагмента (Jackson ImmunoResearch), иммобилизовали на сенсорный чип СМ5 с помощью химии связывания аминов до уровня захвата »5000 единиц ответа (RU). Буфер HBS-EP (10 мМ HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% суфрактант Р20, GE Healthcare) использовали в качестве рабочего буфера со скоростью потока 10 мкл/мин. Введение 10 мкл А26 Fab' при 0,5 мкг/мл или A26Fab-dsFv при 1 мкг/мл использовали для захвата иммобилизованным F(ab')2 к IgG человека. ОХ40 человека титровали к захваченному А26 в различных концентрациях (от 25 до 1,5625 нМ) при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхность регенерировали посредством введения 2x10 мкл 50 мМ HCl с последующим введением 5 мкл 5 мМ NaOH при скорости потока 10 мкл/мин. Кривые связывания с вычитанием фона проанализи- 14 035112 ровали с помощью программного обеспечения Т200 evaluation (версия 1.0), следуя стандартным процедурам. Кинетические параметры определили исходя из алгоритма подбора.
Таблица 1
Образец ka(l/Mc) kd(l/c) KD(M) KD(nM)
Fab’ 2,18 ±0,38 E+05 1,00 E-05 4,68E-11 46,8
Fab-Fv 2,55 ±0,35 E+05 1,04 E-05 4Д2Е-11 41,2
Fab’ PEG 2,33 ±0,46 E+05 1,12 E-05 4,84E-11 48,4
Среднее по 4 определениям.
2.2. Кинетика связывания А26 Fab-dsFv (645gH5gL4) с альбумином по BIAcore.
BIA (анализ биомолекулярного взаимодействия) выполнили с использованием BIAcore T200 (GE Healthcare). Аффинный F(ab')2-фрагмент антитела козы к IgG человека, специфичного в отношении F(ab')2-фрагмента (Jackson ImmunoResearch), иммобилизовали на сенсорный чип СМ5 с помощью химии связывания аминов до уровня захвата «5000 единиц ответа (RU). Буфер HBS-EP (10 мМ HEPES рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% суфрактант Р20, GE Healthcare) использовали в качестве рабочего буфера со скоростью потока 10 мкл/мин. Введение 10 мкл Fab-Fv при 0,75 мкг/мл использовали для захвата иммобилизованным F(ab')2 к IgG человека. Сывороточный альбумин человека (HSA), сывороточный альбумин мыши (MSA) и сывороточный альбумин яванского макака (CSA) титровали к захваченному FabFv при различных концентрациях (от 50 до 6,25 нМ) при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхность реге нерировали введением 2x10 мкл 50 мМ HCl с последующим введением 5 мкл 5 мМ NaOH при скорости потока 10 мкл/мин. Кривые связывания с вычитанием фона проанализировали с помощью программного обеспечения Т200 evaluation (версия 1.0), следуя стандартным процедурам. Кинетические параметры определили исходя из алгоритма подбора.
Таблица 2
Образец ka(l/Mc) kd(l/c) KD(M) KD(hM)
HSA 5,84 E+04 1,63 E-04 2,93E-09 2,93
MSA 8,86 E+04 3,68 E-04 4Д6Е-09 4,16
CSA 7,1 E+04 1,89 E-04 2,66E-09 2,66
Среднее по 3 определениям.
2.3. Демонстрация одновременного связывания А26 Fab-dsFv (645gH5gL4) с ОХ40 и альбумином.
Оценили одновременное связывание ОХ40 человека и сывороточного альбумина человека с А26 Fab-dsFv. Конструкция А26 Fab-dsFv была помещена на поверхности сенсорного чипа, как указано в способе для кинетики связывания А26 Fab-dsFv с альбумином по BIAcore. 50 нМ HAS, 25 нМ ОХ40 или смешанный раствор с конечной концентрацией 50 нМ HSA и 25 нМ ОХ40 отдельно титровали к захваченному А26 Fab-dsFv. Ответ связывания для комбинированного раствора HSA/OX40 был эквивалентен сумме ответов независимых инъекций. Это подтверждает, что Fab-dsFv способен к одновременному связыванию как с ОХ40 человека, так и с HSA.
Образец
А26 Fab-Fv
Аналит_____ hOX40
HSA hOX40 + HSA
Таблица 3
Связывание(ЯЦ) 25 9 35 (34)
2.4. Анализ аффинности А26 Fab-dsFv (645gH5gL4) с помощью клеток.
Способы.
Связывание А26 Fab-Fv с активированными CD4 ОХ40 Т-клетками человека.
РВМС выделяли путем разделения в градиенте Ficoll и активировали с помощью 4 мкг/мл PHA-L в течение 3 дней при 37°C, 5% CO2, 100% влажности. CD4 Т-клетки выделяли путем негативной селекции с помощью магнитных гранул (CD4+ T cell Isolation Kit II for Human; Miltenyi Biotec). Приблизительно 1 x105 клеток инкубировали в присутствии антитела либо в буфере Facs (PBS/0,2 % BSA/0,09 % NaN3), либо в буфере Facs с добавлением 5% HSA при 4°C. Конечная концентрация антитела колебалась в пределах от 48 до 0,0005 нМ. Клетки промыли в PBS перед анализом методом проточной цитометрии с использованием FACScalibur (Becton Dickinson). Два набора данных титрования получили в обоих буферных условиях, один с А26 Fab-dsFv и второй с нерелевантным контрольным Fab-Fv, чтобы определить неспецифическое связывание. Число молей связанного антитела рассчитали с использованием интерполированных значений из стандартной кривой, созданной с использованием гранул, состоящих из различных, но известных количеств флуоресцентного красителя. Геометрические средние значения флуоресценции определили в анализе проточной цитометрии клеток и гранул. Неспецифическое связывание вычли из значений для А26 Fab-dsFv и созданные таким образом кривые специфического связывания проанализировали с помощью нелинейной регрессии, используя уравнение связывания с одним сайтом (GraphPad Prism®) для определения KD.
- 15 035112
Для определения аффинности Fab-A26 dsFv к антигену, экспрессированному на клеточной поверхности, провели эксперименты по насыщению связывания с использованием активированных CD4+ ОХ40+
Т-клеток и А26 Fab-dsFv, меченого AlexaFluor488. Специфическое связывание антитела с рецептором при равновесии в диапазоне концентраций антитела использовали для определения KD при условии, что только очень небольшая фракция антитела связана с рецептором в любой точке на кривой связывания.
Равновесное связывание описывается с помощью следующего уравнения:
коп
Рецептор свободный+Антитело свиное * Рецептор-Антитело
IkOff
Скорость ассоциации антитела с рецептором = konx [Рецептор свободный] х [АнТИТеЛО свободное]
Скорость диссоциации комплекса рецептор-антитело = kOffX [РецепторАнтитело]
При равновесии скорости ассоциации и диссоциации равны, и можно получить уравнение, которое описывает изотерму связывания; на полулогарифмическом участке связывание является сигмоидальным. KD определяется как koff/kon и может быть рассчитана из кривой связывания как концентрация, при которой происходит половина от максимального связывания.
Связывание А26 Fab-Fv, меченого AlexaFluor488, с активированными CD4+ ОХ40+ Т-клетками человека измерили с помощью проточной цитометрии в 5-log диапазоне концентраций.
Репрезентативная кривая связывания для А26 Fab-Fv показана на фиг. 9А.
Среднее значение KD, полученное на активированных клетках от 5 различных доноров, составляет 145 пМ.
Компаратор кривой связывания для А26 Fab, A26 Fab-Fv и А26 Fab-PEG показан на фиг. 9В.
Графики представляют собой среднее из 4 или 5 экспериментов, где другой донор использован в каждом эксперименте.
РВМС выделили путем разделения в градиенте Ficoll и активировали с помощью 4 мкг/мл PHA-L в течение 3 дней при 37°C, 5% CO2, 100% влажности.
Затем эти CD4+ Т-клетки выделили путем негативной селекции с помощью магнитных гранул (CD4+ T cell Isolation Kit II for Human; Miltenyi Biotec). Приблизительно 1x105 клеток инкубировали в присутствии антитела либо в буфере Facs (PBS/0,2 % BSA/0,09 % NaN3), либо в буфере Facs с добавлением 5% HSA при 4°C. Конечная концентрация антитела колебалась в пределах от 48 до 0,0005 нМ. Клетки промыли в PBS перед анализом проточной цитометрии с использованием FACScalibur (Becton Dickinson). Наборы данных титрования также были получены для изотипических контрольных антител к каждому формату А26, чтобы определить неспецифическое связывание. Число молей связанного антитела рассчитали с использованием интерполированных значений из стандартной кривой, созданной с использованием гранул, состоящих из различных, но известных количеств флуоресцентного красителя. Геометрические средние значения флуоресценции определили в анализе проточной цитометрии клеток и гранул. Неспецифическое связывание вычли из значений для А26 Fab-dsFv, и созданные таким образом кривые специфического связывания проанализировали с помощью нелинейной регрессии, используя уравнение связывания с одним сайтом (GraphPad Prism®) для определения KD.
Таблица 4
Средние значения KD для антител А26 в анализах аффинности на клетках человека
Формат антитела Клеточная аффинность HSA KD (hM) ± S.E.M Клеточная аффинность NO HSA KD (hM) ± S.E.M
А26 Fab-Fv (и =5) 0,145 ± 0,019 0,096 ± 0,017
А26 Fab’PEG (n=4) 0,230 ± 0,057 0,322 ± 0,089
A26 Fab’ (n=4) 0,068 ± 0,011 0,085 ± 0,031
Пример 3. А26 Fab-Fv модулирует производство цитокинов в РВМС, подвергнутых воздействию аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus.
РВМС выделили у добровольцев с аллергией разделением в градиенте Ficoll. Очищенные РВМС подвергли воздействию 25 мкг/мл аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus в присутствии испытываемого антитела (диапазон концентраций от 50 до 0,0005 мкг/мл) в конечном объеме 200 мкл/лунку в 96-луночном круглодонном планшете. Через 6 дней инкубации при 37°C, 5% CO2, 100% влажности супернатанты собрали и проанализировали на содержание IL-13 с помощью MSD. График на фиг. 10(а) показывает репрезентативные данные 1-го репрезентативного донора из 4, где средняя ЕС50 ингибирования производства IL-13 составила 0,87 нМ (диапазон от 0,6 до 1,07 нМ).
- 16 035112
Значения ЕС50 (табл. 5) рассчитали из кривых ингибирования у отдельных доноров с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism®.
Таблица 5
Средние значения EC50 для антител А26 в анализах in vitro на HDM человека
Формат антитела Ингибирование производстваIL-13 ЕС50 (нМ)± S.E.M Ингибирование производства IL-5 ЕС50 (нМ) ± S.E.M
А26 Fab-Fv (и=4) 0,865 ± 0,112 0,785 ± 0,216
А26 Fab’PEG (и=4) 0,928 ± 0,282 1,310 ± 0,425
А26 Fab’ (и=4) 0,335 ± 0,040 0,680 ± 0,223
А26 Fab-Fv снижает процент активированных (CD25+) CD4+ Т-клеток после вторичной антигенной рестимуляции аллергенным экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus.
CD4+ Т-клетки от доноров с аллергией простимулировали in vitro в течение 7 дней 25 мкг/мл аллергенного экстракта Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) и аутологичными АРС без антитела или в присутствии 10 мкг/мл А26 Fab'PEG, А26 Fab-Fv или контрольного Fab'(A33 Fab'). Клетки промыли и оставили на 3 суток, а затем рестимулировали экстрактом Dermatophagoides pteronyssinus, как ранее (фиг. 13). Через 3 дня клетки промыли и флуоресцентно окрасили на поверхностные CD3, CD4 и CD25. Затем клетки проанализировали проточной цитометрией на проточном цитометре FACS Canto (BD). Клетки отделили от живых лимфоцитов и пред анализом от экспрессрующих CD3 CD4 . Данные представляют n=3 донора, включая среднее значение, А26 Fab-Fv по сравнению с контрольным Fab' (значимость измерена с использованием парного двустороннего Т-критерия).
Пример 4. А26 Fab-Fv ингибирует пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток на модели мышей HuNSG.
Мышам вводили подкожно 0,03, 0,3, 3 или 30 мг/кг А26 Fab-Fv за один день до переноса 1х107 РВМС человека в брюшную полость. Через 14 дней у мышей брали кровь путем сердечной пункции под местной анестезией, а затем умертвили смещением шейных позвонков. Затем определили число CD4 и CD8 клеток человека в крови посредством анализа FACS (фиг. 10(b)). Данные (n=10) выражены как среднее ± SEM и статистический анализ выполнен односторонним ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Значения представляют % ингибирования ± SEM. Результаты показаны на фиг. 14.
Модель Hu-NSG демонстрирует, что А26 Fab-Fv полностью ингибирует пролиферацию Т-клеток человека in vivo и подтверждает А26 Fab-Fv в качестве терапевтического кандидата на ингибирование опосредованных Т-клетками патологий. Кроме того, формат Fab-Fv обладает большей эффективностью при более низких дозах, чем формат Fab'-PEG. Уменьшение данного ксено-пролиферативного ответа донорских Т-клеток доказывает, что А26 Fab-Fv может быть пригодным для применения терапевтическим средством при GVHD.
Пример 5. Лиганд-блокирующая способность.
Способность А26 Fab-dsFv к блокированию взаимодействия между экспрессированным на клеточной поверхности ОХ40 и рекомбинантным OX40L измерили с использованием анализа блокирования лиганда, основанного на проточной цитометрии. Коротко, активированные CD4 ОХ40 Т-клетки человека предварительно проинкубировали с титрованием А26 Fab-Fv. Затем рекомбинантный OX40L добавили к клеткам и оставили для связывания в присутствии А26 Fab-dsFv. Определили долю связанного OX40L с помощью проточной цитометрии с использованием меченого вторичного реагента. На фиг. 11 показана кривая ингибирования, представляющая объединенные данные от 3 независимых доноров, и продемонстрировано, что А26 Fab-dsFv способно полностью блокировать связывание OX40L. Средняя IC50 ингибирования связывания рекомбинантного OX40L составила 0,44 нМ (n=3 донора).
Способы. Ингибирование связывания OX40L с активированными CD4 OX40 Т-клетками человека с помощью А26 Fab-Fv.
РВМС выделили путем разделения в градиенте Ficoll и активировали с 4 мкг/мл PHA-L (Sigma) в течение 3 дней при 37°C, 5% CO2, 100% влажности. Затем CD4+ Т-клетки очистили от культуры путем негативной селекции с использованием колонки MACS (Miltenyi Biotech, CD4+ T cell isolation kit II). 2х105 CD4+ T- клеток инкубировали в присутствии А26 Fab-dsFv (диапазон конечной концентрации 10-0,000056 мкг/мл (136,6-0,000765 нМ)) в течение 30 мин при 4°C. OX40L (биотинилированный CD252-muCD8, Ancell) добавили в конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубировали еще в течение 30 мин при 4°C. Клетки промыли и связывание OX40L обнаружили с помощью инкубации с РЕ-меченым стрептавидином (Jackson ImmunoResearch) до анализа путем проточной цитометрии с использованием FACS Canto (Becton Dickinson). Соответствующее Fab-dsFv, не связывающее ОХ40, использовали в качестве контроля. Кривую ингибирования проанализировали с помощью нелинейной регрессии (GraphPad Prism®), чтобы определить IC50. Кривая ингибирования, представляющая объединенные данные от трех независимых доноров, показана на фиг. 11, где точки данных представляют среднее, а планки погрешностей представляют SEM.
- 17 035112
Средняя EC50 ингибирования связывания рекомбинантного OX40L с ОХ40 с помощью А26 Fab-Fv составила 0,445 нМ. Для сравнения, А26 Fab'PEG было немного менее активным при блокировании лиганда (EC50=0,739 нМ), тогда как А26 Fab' было незначительно более активным (EC50=0,242 нМ), чем
Fab-Fv, как показано ниже.
Таблица 6
Значения EC50 ингибирования связывания OX40L с активированными CD4+OX40+ Т-клетками человека с помощью антител А26
Формат антитела EC50 блокирования лиганда (нМ) среднее ± S.E.M.
А26 Fab-Fv (η = 3) 0,445 ± 0,110
А26 Fab’PEG (и = 3) 0,739 ± 0,166
А26 Fab’ (и = 3) 0,242 ± 0,069
Значения EC50 были рассчитаны из кривых ингибирования отдельных доноров с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения GraphPad Prism®.
Пример 6. Эффект А26 Fab-Fv в функциональных анализах in vitro на клетках человека.
Эффект А26 Fab-Fv на зависимые от OX40-OX40L клеточные взаимодействия оценили в целом ряде анализов на стимулированных антигеном лимфоцитах человека. Эти анализы выполнили в присутствии 5% сыворотки человека, чтобы обеспечить насыщение альбумин-связывающего сайта Fv-области, которое, как можно было бы предсказать, происходит in vivo.
А26 Fab-Fv ингибирует реакцию смешанных лимфоцитов.
Однонаправленная реакция аллогенных смешанных лимфоцитов (MLR) является моделью in vitro активации и пролиферации аллореактивных Т-клеток (Bach et al., 1964, O'Flaherty et al., 2000). Донорские Т-клетки активируют посредством распознавания аллогенных антигенов МНС на неродственных донорских стимулирующих РВМС, приводя к клеточной пролиферации и производству цитокинов (Lukacs et al., 1993). Аллореакция Т-лимфоцитов, как было показано, вызвана одновременно аллогенным антигеном МНС и связанным пептидом (Sherman et al., 1993). Величина ответа MLR коррелирует со степенью неправильного подбора МНС между парой респондер-стимулятор (Forrester et al., 2004). Ответ MLR приводит к пролиферации клеток донора и производству как Th1 (IL-2, IFN-γ и TNF-α), так и Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13) Т-клеточных цитокинов. Точный цитокиновый профиль в MLR считают специфичным при образовании пары респондер-стимулятор (Jordan et al., 2002). Анализы MLR широко используют в исследованиях по изучению путей активации Т-клеток, в скрининге иммунодепрессантных лекарственных средств и для прогноза возможного отторжения донорского органа у реципиентов с трансплантацией (Bromelow et al., 2001).
Эффект А26 Fab-Fv на активацию и пролиферацию аллореактивных Т-клеток человека in vitro исследовали с использованием анализа MLR, по существу, как описано O'Flaherty et al., 2000. РВМС от двух неродственных доноров совместно культивировали в присутствии или в отсутствие А26 Fab-Fv, А26 Fab' или А26 Fab'PEG и измерили клеточную пролиферацию по включению 3Н-тимидина. Как показано на фиг. 12, А26 Fab-Fv ингибировало клеточную пролиферацию зависимым от концентрации образом со значением EC50 0,56 нМ (40,9 нг/мл) и максимальным ингибированием на 55% (n=3 донорских пар). А26 Fab-Fv было немного более активным, чем А26 Fab'PEG, которое имело значение ЕС50 0,88 нМ, в то время как А26 Fab' имело значение ЕС50 0,25 нМ, как показано в табл. 7.
РВМС человека от двух неродственных доноров выделили из цельной крови. Клетки от одного донора инактивировали γ-облучением для создания популяции-стимулятора. Клетки от оставшегося донора образовали популяцию-респондер. Популяции стимулятора и респондера смешали в соотношении 1:1 (1 х105 клеток/донор) и культивировали в присутствии А26 Fab', A26 Fab-Fv или А26 Fab'PEG (0,4 нг-25 мкг/мл) в течение 6 дней. Реагент собственного производства СА162-01297.1 Fab-Fv использовали в качестве подобранного по изотипу контроля. Клеточную пролиферацию измерили на шестой день по включению 3Н-тимидина (0,5 мкКи/лунку). Данные показаны как процент ингибирования по отношению к ответу респондер плюс стимулятор в отсутствии биологического реагента, и являются объединенными данными из трех донорских пар. Значения ЕС50 рассчитали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism®.
Таблица 7
Значения ЕС50 ингибирования пролиферативного ответа
MLR человека с помощью антител А26
Формат антитела EC5q (нМ) среднее ± S.E.M.
А26 Fab-Fv (η = 3) 0,56 ± 0,12
А26 Fab’PEG (η = 3) 0,88 ± 0,44
Α26 Fab’ (η = 3) 0,25 ± 0,06
Супернатанты от MLR человека также проанализировали для исследования эффекта А26 Fab-Fv на производство цитокинов. Как показано на фиг. 5.4, А26 Fab-Fv значительно ингибировало выработку IFN-γ при MLR в среднем на 81% (n=3 донорских пар).
- 18 035112
РВМС человека от двух неродственных доноров выделили из цельной крови. Клетки от одного донора инактивировали γ-облучением для создания популяции-стимулятора. Клетки от оставшегося донора образовали популяцию-респондер. Популяции стимулятора и респондера смешали в соотношении 1:1 (1x105 клеток/донор) и культивировали в присутствии 25 мкг/мл А26 Fab', A26 Fab-Fv, A26 Fab'PEG или контроля (A33 Fab' или СА162.01297.1) в течение 6 дней. Супернатанты собрали и проанализировали на содержание IFN-γ с использованием анализа MSD. Процент ингибирования рассчитали по отношению к клеткам, культивированным без каких-либо антител. Графики представляют объединенные данные от трех доноров (среднее ± SEM). ** Р<0,01; А26 Fab-Fv по сравнению с контрольным Fab-Fv (значимость измерена с помощью парного двустороннего Т-критерия).
Пример 7. Связывание А26 Fab-Fv с NK-клетками в MLR человека.
Исследовали эффект А26 Fab-Fv на деление NK-клеток в MLR. Аллореакция Т-лимфоцитов стимулирует ответ смешанных лимфоцитов и А26.
Fab-Fv полностью ингибирует деление Т-клеток и производство IFNy в этой системе. Ингибирование деления NK-клеток также может способствовать снижению производства IFNy. С использованием клеток-респондеров, меченных CFSE, продемонстрировано ингибирование деления NK-клеток с помощью анализа FACS в делящейся популяции (данные не показаны). Показаны два различных измерения деления клеток. Индекс деления представляет собой среднее количество клеточных делений, которое претерпела клетка в исходной популяции, и включает не разделившиеся клетки; А26 Fab-Fv снижает индекс деления, указывая, что меньшее количество клеток в популяции подвержено делению; этот эффект предположительно опосредован NK-клетками, которые экспрессируют OX4. Индекс пролиферации отражает только пролиферацию популяции, и ингибиторный эффект А26 Fab-Fv при использовании этого измерения относительно снижен.
Пример 8. Средние значения K/EQ0 для А26 Fab-Fv в анализах in vitro на клетках человека.
Связывание/Функциональный анализ Среднее KD / ЕС50 (нМ) ± S.E.M. Среднее KD / ЕС50 (мкг/мл)
Аффинность (и = 5) 0,145 ± 0,019 0,011
Блокирование OX40L (и = 3) 0,445 ± 0,110 0,033
Реакция смешанных лимфоцитов Ингибирование пролиферации (и = 3) 0,558 ± 0,121 0,041
Клещ домашней пыли - Ингибирование продукции IL-13 (и = 4) 0,865 ± 0,112 0,063
- 19 035112
Перечень последовательностей <110> ЮСБ Фарма С.А.
<120> Молекулы антител, имеющие специфичность в отношении 0X40 человека <130> G0160 W001 <150> US 61/558,545 <151> 2011-11-11 <160>28 <170> Patentin версия 3.5 <210>1 <211>5 <212> Белок <213> Искусственный <220>
<223> CDRH1 <400>1
Asn Туг Gly lie His <210>2 <211>17 <212> Белок <213> Искусственный <220>
<223> CDRH2 <400>2
Ser lie Ser Pro Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 15 1015
Gly <210>3 <211>8 <212> Белок <213> Искусственный <220>
<223> CDRH3 <400>3
Gly Gly Glu Gly Ile Phe Asp Tyr <210>4 <211>11 <212> Белок <213> Искусственный <220>
<223> CDRL1 <400>4
Arg Ala Thr Gin Ser lie Tyr Asn Ala Leu Ala
1510 <210>5 <211>7

Claims (41)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Биспецифическое антитело, которое связывается с ОХ40 человека и сывороточным альбумином человека, содержащее:
    тяжелую цепь, содержащую от N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (Vh1), Он1-домен и второй вариабельный домен тяжелой цепи (Vh2);
    легкую цепь, содержащую от N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (Vl1), CL-домен и второй вариабельный домен легкой цепи (Vl2), где Vh1 и Vl1 образуют первый антигенсвязывающий центр, который связывает ОХ40, a Vh2 и Vl2 образуют второй антигенсвязывающий центр, который связывает сывороточный альбумин человека, причем Vh1 содержит CDR-H1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, CDR-H2 - с последовательностью SEQ ID NO: 2 и CDR-H3 - с последовательностью SEQ ID NO: 3, и Vl1 содержит CDR-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDR-L2 - с последовательностью SEQ ID NO: 5, и CDR-L3 - с последовательностью SEQ ID NO: 6;
    Vh2 имеет последовательность SEQ ID NO: 11, a Vl2 имеет последовательность SEQ ID NO: 12;
    Vh2 и Vl2 соединены дисульфидной связью.
  2. 2. Биспецифическое антитело по п.1, которое препятствует связыванию ОХ40 с OX40L.
  3. 3. Биспецифическое антитело по п.1 или 2, содержащее пептидный линкер между C^-доменом и Vh2.
    4. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-3, содержащее пептидный линкер между CL-доменом и Vl2. 5. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-4, где Vh1 содержит последовательность SEQ ID NO: 8. 6. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-5, где Vl1 содержит последовательность
    SEQ ID NO: 7.
  4. 7. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-6, где тяжелая цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 15 или имеет SEQ ID NO: 15.
  5. 8. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-7, где легкая цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 16 или имеет SEQ ID NO: 16.
  6. 9. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-8, имеющее тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16.
  7. 10. Выделенная ДНК, кодирующая биспецифическое антитело по любому из пп.1-9.
  8. 11. Вектор клонирования или экспрессии, содержащий ДНК по п. 10.
  9. 12. Вектор клонирования или экспрессии по п.11, где указанная ДНК содержит последовательности SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24.
  10. 13. Клетка-хозяин для получения биспецифического антитела по любому из пп.1-9, содержащая вектор клонирования или экспрессии по п.11 или 12.
  11. 14. Способ получения биспецифического антитела по любому из пп.1-9, включающий культивирование клетки-хозяина по п.13 и выделение биспецифического антитела.
  12. 15. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп.1-9 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
  13. 16. Способ лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40, включающий введение пациенту биспецифического антитела по любому из пп.1-9.
  14. 17. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-9 для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое ассоциировано с повышенным уровнем ОХ40.
  15. 18. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-9 для получения лекарственного препарата для лечения или профилактики патологического расстройства, которое опосредовано ОХ40 или которое связано с повышенным уровнем ОХ40.
  16. 19. Способ по п.16, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из аллергии, хронической обструктивной болезни легких, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, астмы, реакции трансплантат против хозяина, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, сахарного диабета 1 типа, рассеянного склероза, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, тяжелой миастении, болезни Грейвса, отторжения трансплантата, гранулематоза Вегенера, пурпуры Шенлейна-Геноха, системной склеродермии, вирусного воспаления легких, воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Пейрони, заболевания брюшной полости, перитонита, псориаза, васкулита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, синдрома Гийена-Барре, атопического
    - 21 035112 дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, панкреатита и периодонтита.
  17. 20. Способ по п.19, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, заболевания брюшной полости, псориаза, сахарного диабета 1 типа, системной красной волчанки, синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, болезни Грейвса и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
  18. 21. Применение по п.17 или 18, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из аллергии, хронической обструктивной болезни легких, аутоиммунного заболевания, ревматоидного артрита, астмы, реакции трансплантат против хозяина, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, сахарного диабета 1 типа, рассеянного склероза, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, тяжелой миастении, болезни Грейвса, отторжения трансплантата, гранулематоза Вегенера, пурпуры Шенлейна-Геноха, системной склеродермии, вирусного воспаления легких, воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Пейрони, заболевания брюшной полости, перитонита, псориаза, васкулита, менингоэнцефалита, аутоиммунного увеита, иммуно-опосредованных воспалительных нарушений центральной и периферической нервной системы, синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, панкреатита и периодонтита.
  19. 22. Применение по п.21, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, хронической обструктивной болезни легких, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, заболевания брюшной полости, псориаза, сахарного диабета 1 типа, системной красной волчанки, синдрома Гийена-Барре, атопического дерматита, болезни Грейвса и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
  20. 23. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой ревматоидный артрит.
  21. 24. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой воспалительное заболевание кишечника.
  22. 25. Способ по п.19, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, язвенного колита и заболевания брюшной полости.
  23. 26. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой атопический дерматит.
  24. 27. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой псориаз.
  25. 28. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой системную красную волчанку.
  26. 29. Способ по п.19, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из сахарного диабета 1 типа, синдрома Гийена-Барре, болезни Грейвса и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
  27. 30. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой аллергию.
  28. 31. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой астму.
  29. 32. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой реакцию трансплантат против хозяина.
  30. 33. Способ по п.19, где патологическое расстройство представляет собой отторжение трансплантата.
  31. 34. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой ревматоидный артрит.
  32. 35. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой воспалительное заболевание кишечника.
  33. 36. Применение по п.21, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, язвенного колита и заболевания брюшной полости.
  34. 37. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой атопический дерматит.
  35. 38. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой псориаз.
  36. 39. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой системную красную волчанку.
  37. 40. Применение по п.21, где патологическое расстройство выбрано из группы, состоящей из сахарного диабета 1 типа, синдрома Гийена-Барре, болезни Грейвса и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
  38. 41. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой аллергию.
  39. 42. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой астму.
  40. 43. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой реакцию трансплантат против хозяина.
  41. 44. Применение по п.21, где патологическое расстройство представляет собой отторжение трансплантата.
EA201400565A 2011-11-11 2012-11-09 Биспецифическое антитело, которое связывается с ох40 человека и сывороточным альбумином человека, его получение и применение EA035112B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161558545P 2011-11-11 2011-11-11
PCT/EP2012/072325 WO2013068563A2 (en) 2011-11-11 2012-11-09 Antibody molecules having specificity for human ox40

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201400565A1 EA201400565A1 (ru) 2014-12-30
EA035112B1 true EA035112B1 (ru) 2020-04-28

Family

ID=47388492

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201400565A EA035112B1 (ru) 2011-11-11 2012-11-09 Биспецифическое антитело, которое связывается с ох40 человека и сывороточным альбумином человека, его получение и применение

Country Status (34)

Country Link
US (2) US9040048B2 (ru)
EP (1) EP2776469B1 (ru)
JP (1) JP6367714B2 (ru)
KR (1) KR102071054B1 (ru)
CN (1) CN103946240B (ru)
AP (1) AP2014007668A0 (ru)
AR (1) AR088820A1 (ru)
AU (1) AU2012333997B2 (ru)
BR (1) BR112014011404A2 (ru)
CA (1) CA2855174C (ru)
CL (1) CL2014001193A1 (ru)
CO (1) CO7010784A2 (ru)
CY (1) CY1122073T1 (ru)
DK (1) DK2776469T3 (ru)
EA (1) EA035112B1 (ru)
EC (1) ECSP14000329A (ru)
ES (1) ES2737998T3 (ru)
HR (1) HRP20191219T1 (ru)
HU (1) HUE044333T2 (ru)
IL (1) IL232420B (ru)
LT (1) LT2776469T (ru)
MA (1) MA35724B1 (ru)
MX (1) MX358391B (ru)
MY (1) MY183795A (ru)
PE (1) PE20141995A1 (ru)
PL (1) PL2776469T3 (ru)
PT (1) PT2776469T (ru)
SG (1) SG11201402093RA (ru)
SI (1) SI2776469T1 (ru)
TN (1) TN2014000206A1 (ru)
TR (1) TR201910721T4 (ru)
TW (1) TWI588155B (ru)
UA (1) UA112203C2 (ru)
WO (1) WO2013068563A2 (ru)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY157473A (en) * 2009-02-17 2016-06-15 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecules having specificity for human ox40
US20120283415A1 (en) * 2009-09-10 2012-11-08 Ucb Pharma S.A. Multivalent Antibodies
MX339964B (es) 2010-08-23 2016-06-17 Board Of Regents The Univ Of Texas System * Anticuerpos anti-ox40 y metodos para usarlos.
EP3617227A3 (en) * 2011-09-16 2020-06-03 UCB Biopharma SRL Neutralising antibodies to the major exotoxin tcda of clostridium difficile
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
BR112015023862A2 (pt) 2013-03-18 2017-10-24 Biocerox Prod Bv anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, célula hospedeira, método de realçar uma resposta imune, método de tratar câncer, composição farmacêutica, e, anticorpo agonístico isolado
WO2015041515A1 (en) 2013-09-19 2015-03-26 N.V. Nutricia Improved process for the humanization of animal skim milk
JP6588461B2 (ja) 2014-03-31 2019-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗血管新生剤及びｏｘ４０結合アゴニストを含む併用療法
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
CN114504651A (zh) 2015-03-03 2022-05-17 科马布有限公司 抗体、用途和方法
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506869D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506868D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method for protein purification
US10259882B2 (en) 2015-05-07 2019-04-16 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601073D0 (en) * 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
KR20180053674A (ko) * 2015-10-02 2018-05-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 공자극 tnf 수용체에 특이적인 이중특이성 항체
CN114380908B (zh) * 2015-10-15 2023-03-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
TW202134282A (zh) 2015-12-02 2021-09-16 美商艾吉納斯公司 抗體和使用彼之方法
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CA3006963A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
BR112018076260A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a hpd-l1, anticorpo biespecífico ou proteína de fusão, uso de um anticorpo ou fragmento, método, composição farmacêutica, método de modulação, método de inibição, método de tratamento, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e imunocitocina
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
AU2017359467A1 (en) * 2016-11-09 2019-05-02 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies, anti-GITR antibodies, and methods of use thereof
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
WO2020227159A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity
MX2022001349A (es) 2019-08-02 2022-03-25 UCB Biopharma SRL Metodos para purificar anticuerpos.
WO2021127217A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
AU2020407208A1 (en) 2019-12-17 2022-06-02 Amgen Inc. Dual interleukin-2 /tnf receptor agonist for use in therapy
CA3184366A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Darby Rye Schmidt Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
WO2010096418A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Ucb Pharma S.A. Antibody molecules having specificity for human ox40
WO2011030107A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
WO2011086091A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
GB0124317D0 (en) 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20040146948A1 (en) 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
GB0303337D0 (en) 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
TWI461436B (zh) 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
AU2006322445B2 (en) 2005-12-05 2011-05-12 Symphogen A/S Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody
WO2007112054A2 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Sea Lane Biotechnologies, Llc Facilitation of translocation of molecules through the gastrointestinal tract
AU2008219666A1 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Genentech, Inc. Antagonist OX40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
JP5522668B2 (ja) 2010-02-03 2014-06-18 株式会社ブリヂストン タイヤ構成部材の切断装置及び製造方法
US9803004B2 (en) * 2011-11-11 2017-10-31 Ucb Biopharma Sprl Albumin binding antibodies and binding fragments thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
WO2010096418A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Ucb Pharma S.A. Antibody molecules having specificity for human ox40
WO2011030107A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
WO2011086091A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013068563A2 (en) 2013-05-16
TW201326205A (zh) 2013-07-01
AU2012333997B2 (en) 2017-08-31
WO2013068563A9 (en) 2014-06-19
AU2012333997A1 (en) 2014-05-29
KR20140097329A (ko) 2014-08-06
UA112203C2 (uk) 2016-08-10
CA2855174C (en) 2021-11-02
SI2776469T1 (sl) 2019-09-30
PE20141995A1 (es) 2014-12-06
CO7010784A2 (es) 2014-07-31
CY1122073T1 (el) 2020-11-25
JP6367714B2 (ja) 2018-08-01
MY183795A (en) 2021-03-16
US20160031974A1 (en) 2016-02-04
EP2776469B1 (en) 2019-04-24
IL232420B (en) 2019-02-28
US9873735B2 (en) 2018-01-23
KR102071054B1 (ko) 2020-01-29
HRP20191219T1 (hr) 2019-10-04
WO2013068563A3 (en) 2013-06-27
PL2776469T3 (pl) 2019-10-31
IL232420A0 (en) 2014-06-30
MA35724B1 (fr) 2014-12-01
TR201910721T4 (tr) 2019-08-21
PT2776469T (pt) 2019-07-25
JP2015506910A (ja) 2015-03-05
CN103946240B (zh) 2018-02-23
CL2014001193A1 (es) 2014-12-26
CA2855174A1 (en) 2013-05-16
MX2014005564A (es) 2014-11-10
HUE044333T2 (hu) 2019-10-28
NZ624583A (en) 2015-05-29
ES2737998T3 (es) 2020-01-17
AR088820A1 (es) 2014-07-10
EA201400565A1 (ru) 2014-12-30
TN2014000206A1 (en) 2015-09-30
US20130243772A1 (en) 2013-09-19
EP2776469A2 (en) 2014-09-17
US9040048B2 (en) 2015-05-26
SG11201402093RA (en) 2014-06-27
AP2014007668A0 (en) 2014-05-31
ECSP14000329A (es) 2016-01-29
BR112014011404A2 (pt) 2017-05-30
MX358391B (es) 2018-08-17
LT2776469T (lt) 2019-08-12
CN103946240A (zh) 2014-07-23
DK2776469T3 (da) 2019-07-29
TWI588155B (zh) 2017-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9873735B2 (en) Method of treatment with antibodies having specificity for human OX40
US10017575B2 (en) Antibody molecules having specificity for human OX40
KR20180089521A (ko) Tnf 알파에 결합하는 항체 분자
NZ624583B2 (en) Antibody molecules having specificity for human ox40

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM