KR20140097329A - 인간 ox40에 대해 특이성을 나타내는 항체 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 OX40의 항원 결정기에 대해 특이성을 나타내는 항체 분자, 이러한 항체 분자의 치료적 이용 및 상기 항체 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

인간 OX40에 대해 특이성을 나타내는 항체 분자{ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR HUMAN OX40}
본 발명은 OX40의 항원 결정기에 대해 특이성을 나타내는 항체 분자 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 분자, 조성물의 치료적 용도 및 상기 항체 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
OX40(CD134, TNFRSF4, ACT35 또는 TXGP1L이라고도 알려져 있음)은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원으로, TNF 수용체 슈퍼패밀리는 4-1BB, CD27, CD30 및 CD40을 포함한다. OX40의 세포 외 리간드 결합 도메인은 3개의 완전한 시스테인이 풍부한 도메인(cysteine-rich domain, CRD)과 부분적인 제4의 C 말단 CRD로 이루어져 있다(Bodmer et al., 2002, Trends Biochem Sci, 27, 19-26).
OX40의 리간드는 OX40L로, 3카피의 OX40이 3량체의 리간드와 결합하여, OX40-OX40L 복합체를 형성한다(Compaan and Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1321-1330).
OX40은 막 결합 수용체이다. 그러나, 가용성 이소형도 검출된 바 있다(Taylor and Schwarz, 2001, J.Immunol. Methods, 255, 67-72). 가용성 형태의 기능적인 중요성은 현재 알려지지 않았다. OX40은 휴지 T 세포에서는 발현되지 않지만, T 세포 수용체(TCR)가 연결된 후 활성화된 T 세포에서 일시적으로 발현된다. OX40의 리간드 OX40L은 TNF 패밀리의 구성원으로, B 세포, 대식세포, 내피세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하는 활성화된 항원 제시 세포(APC)에서 발현된다.
OX40은 주요한 상호 자극적인 수용체로, CD28과 OX40의 순차적인 맞물림이 최적의 T 세포 증식과 생존에 필요하다. 활성화된 T 세포에서의 OX40의 연결은 사이토카인 생산 및 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 증식 증대로 이어지며(Gramaglia et al., 2000, J. Immunol, 165, 3043-3050, Bansal-Pakala et al., 2004, J.Immunol, 172, 4821-425), 계속 진행 중인 Th1 및 Th2 반응의 원인이 될 수 있다(Gramaglia et al., 1998, J. Immuno., 161, 6510-6517, Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880). OX40 상호 자극은 면역 반응 초기의 효과기 단계를 넘어 T 세포의 생존을 연장시키고, 효과기 T 세포 사망의 억제를 통해 기억 T 세포의 수를 증가시킨다.
면역 활성화가 과도하거나 조절되지 않을 때, 병적인 알레르기, 천식, 염증, 자가 면역 및 기타 관련된 질병이 발생할 수 있다. OX40은 면역 반응을 증진시키는 작용을 하므로, 자가 면역 및 염증성 질병을 악화시킬 수 있다.
질병 모델에서 OX40/OX40L 상호 작용의 역할은 OX40 녹아웃 마우스에서 증명된 바 있다. 실험적인 알레르기성 뇌척수염(EAE)에서, 다발성 경화증, 덜 심각한 임상적인 질병의 징후 및 CNS 내의 감소된 염증성 침윤에 관한 모델이 OX40 녹아웃 마우스에서 주목을 끌었다(Carboni et al., 2003, J.Neuroimmunology, 145, 1-11). 난알부민으로 초회 감작시키고 시험 감염시킨 OX40 녹아웃 마우스는 폐 염증 감소(호산구 증가증의 80~90% 감소), 점액 생산량 감소 및 기도 과반응의 유의미한 약화를 나타낸다(Jember et al., 2001, J. Exp.Med., 193, 387-392). 쥐의 OX40 리간드에 대한 단일 클론 항체는 류마티스 관절염의 콜라겐 유도 관절염 모델(Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823), EAE(Nohara et al., 2001, J. Immunol., 166, 2108-2115), 비 비만형 당뇨(NOD) 마우스(Pakala et al., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3039-3046), T 세포 회복 마우스의 대장염(Malmstrom et al., 2001, J. Immunol., 166, 6972-6981, Totsuka et al., 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284, G595-G603) 및 폐 염증 모델(Salek-Ardakani et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 315-324, Hoshino et al., 2003, Eur.J.Immunol, 33, 861-869)에서 유익한 효과를 나타냈다. 인간 OX40L에 대한 항체는 붉은털 원숭이의 폐 염증 모델에서 프로파일링 되었으며, 알레르기원의 시험 접종 후에 세기관지 세정액에서 IL-5, IL-13 및 효과기 기억 T 세포 수준이 감소되었다(Seshasayee et al., 2007, J. Clin.Invest, 117, 3868-3878).
OX40 발현의 증가는 몇몇 자가 면역 및 염증성 질환에서 주목된 바 있다. 이는 류마티스 관절염 환자의 윤활액에서 분리된 T 세포에서의 OX40 발현의 증가를 포함한다(Brugnoni D et al., 1998, Br.J. Rheum., 37, 584-585; Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823; Giacomelli R et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol., 19, 317-320). 마찬가지로, OX40 발현의 증가는 궤양성 대장염 및 크론병 환자의 위장 조직에서(Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863; Stuber et al., 2000, Eur.J.Clin.Invest., 30, 594-599), 그리고 다발성 경화증 환자의 활성 병소에서(Carboni et al., 2003, J.Neuroimmunology, 145, 1-11) 발견되었다. 또한, OX40L은 인간 기도 평활근(ASM)에서 검출될 수 있고, 천식 환자의 ASM 세포는 건강한 도너보다 OX40L 연결에 더 큰 염증성 반응을 나타내어, 천식에서 OX40/OX40L 경로의 역할을 보여주었다(Burgess et al., 2004, J. Allergy Clin Immunol., 113, 683-689; Burgess et al., 2005, J. Allergy Clin Immunol., 115, 302-308). 또한, 전신성 홍반성 루프스(SLE) 환자의 말초 혈액으로부터 분리된 CD4+ T 세포는 질병 활성도와 관련이 있는 OX40 수준의 상승을 나타낸다고 보고된 바 있다(Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242).
알레르기, 천식, 그리고 자가 면역 및 염증과 관련된 질병에서의 OX40의 역할을 고려할 때, 이러한 질병에서 치료를 위한 한 가지 접근법은 항-OX40L 항체 또는 길항성의 항-OX40 항체를 이용하여 OX40-OX40L 신호 전달을 차단하는 것이다.
항-OX40L 항체는 기술된 바 있다. 예를 들어, WO2006/029879 참조.
많은 효능적 항-OX40 항체들이 기술된 바 있지만, 길항적인 항-OX40 항체들은 거의 알려져 있지 않다. Stuber 등(1996, J.Exp.Med, 183, 979-989)에 의해 토끼 다클론성 항-마우스 OX40 항체가 생산되었는데, 이것은 OX40과 OX40L 사이의 상호 작용을 차단한다. 인간 OX40과 결합하는 마우스 단일 클론 항체 131과 315는 Imura 등(1996, J.Exp.Med, 2185-2195)에 의해 생성된 바 있다.
완전히 인간적인 길항적인 항체는 WO2007/062245에 기술된 바 있으며, 이들 항체의 최고 친화도는 세포 표면 발현된 OX40(활성화된 T 세포)에 대해 11nM의 친화도였다.
인간화된 길항적인 항체는 WO2008/106116에 기술된 바 있으며, OX40에 대해 최고의 친화도를 나타내는 항체는 0.94nM의 친화도를 나타냈다.
기타 쥐의 L106(US 특허 번호 6,277,962) 및 eBioscience로부터 상업적으로 구입할 수 있는 쥐의 ACT35를 포함하는 항-OX40 항체들이 기술된 바 있다.
본 발명자들은 이전에 국제 특허 출원 번호 WO2010/096418에서 높은 친화도의 길항적인 항-OX40 항체들을 기술한 바 있다.
또한, 본 발명자들은 이하에서 Fab-dsFv로 지칭되며, 본원의 도 1에 도시한, 신규한 다중 특이적인 항체 융합 분자를 국제 특허 출원 번호 WO2010/035012에 기술하였다. 동일한 출원은 분자의 반감기를 연장하는 데 이용할 수 있는 유용한 항-알부민 결합 가변 부위를 제공한다.
본 발명에서는, 이러한 알부민 결합 가변 부위가 개선되어, WO2010/096418에 기술된 항-OX40 항체와 Fab-dsFv 포맷으로 결합되었다. 본 발명의 새로운 이중 특이적인 분자는 이전에 WO2010/096418에 기술한 Fab' -PEG 분자와 비교할 때 본원에 기술된 다수의 시험관 내 및 생체 내 분석법에서 향상된 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민 모두에 결합하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질을 제공하며, 이는 OX40에 의해 매개되거나, 높은 수준의 OX40과 관련이 있는 병리학적 이상의 치료 또는 예방에 이용하기에 적합하다.
도 1은 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합(Fab-dsFv 포맷)을 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 8은 본 개시 내용에 따른 항체와 관련된 특정 아미노산 또는 DNA 서열을 나타낸 것이다.
도 9a는 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 알렉사플루오르 488이 표지된 A26 Fab-dsFv의 결합을 나타낸 것이다.
도 9b는 활성화된 인간 CD4+, OX40+ T 세포에서 5% HSA의 존재 하에 A26 Fab', A26 Fab-Fv 및 A26 Fab' -PEG의 결합을 나타낸 것이다.
도 10a는 유럽 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 알레르기 추출물에 노출된 PBMC로부터 사이토카인 생산에 미치는 A26 Fab-dsFv의 영향을 나타낸 것이다.
도 10b는 Hu-NSG 마우스 모델에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제하는 A26 Fab-dsFv의 능력을 나타낸 것이다.
도 11a는 A26 Fab-dsFv에 의한 OX40L의 인간 활성화 CD4+ OX40+ T 세포에 대한 결합 억제를 나타낸 것이다.
도 11b는 A26 Fab', A26 Fab-dsFv, A26 Fab' -PEG 및 두 대조군에 의한, OX40L의 인간 활성화 CD4+ OX40+ T 세포에 대한 결합 억제를 나타낸 것이다.
도 12a는 A26 Fab-Fv가 인간 혼합 림프구 반응(MLR)을 억제함을 나타낸 것이다.
도 12b는 A26 Fab-Fv가 인간 MLR 중에 IFN-감마 생산을 억제함을 나타낸 것이다.
도 13은 A26 Fab-Fv가 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물을 이용한 2차 항원 재자극 후에 활성화된 (CD25+) CD4+ T 세포의 백분율을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 14는 Hu-NSG 모델에서 세포 전달 이전에 투여된 Fab-Fv 및 Fab-PEG가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 용량 의존적으로 억제함을 나타낸 것이다.
인간화 CA044_00026 항-OX40 항체는 본원에서 A26이라 한다.
본원에서 Fab-dsFv로 지칭되는, 본 발명의 항체 융합 분자는 도 1에 도시하였다. 본 발명에서, (제1 중쇄 및 경쇄 가변 부위 및 불변 도메인을 포함하는) Fab 부분은 인간 OX40과 결합하고, (이황화 결합으로 연결된 제2 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하는) dsFv 부분은 인간 혈청 알부민과 결합한다. 특히, Fab 부분은 길항적인 항-OX40 항체로부터 유래된 CDR을 포함하고, Fv 부분은 인간화 항-알부민 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 포함하고, 이러한 알부민 결합 가변 부위는 이황화 결합에 의해 연결된다.
따라서, 본 발명은 N 말단으로부터 차례대로 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
N 말단으로부터 차례대로 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질로서,
이때, 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 자리를 형성하고, VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 자리를 형성하도록 정렬되고,
제1 항원 결합 자리에 의해 결합된 항원은 인간 OX40이고, 제2 항원 결합 자리에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이고, 특히
중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)은 CDR-H1에 대해 SEQ ID NO:1로 주어진 서열, CDR-H2에 대해 SEQ ID NO:2로 주어진 서열 및 CDR-H3에 대해 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열을 포함하고, 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)은 CDR-L1에 대해 SEQ ID NO:4로 주어진 서열, CDR-L2에 대해 SEQ ID NO:5로 주어진 서열 및 CDR-L3에 대해 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열을 포함하며,
제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 SEQ ID NO:11로 주어진 서열을 나타내고, 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 SEQ ID NO:12로 주어진 서열을 나타내고,
제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합으로 연결되는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질을 제공한다.
항체 가변 도메인의 잔기는 카밧(Kabat) 등이 창안한 체계에 따라 통상적으로 번호를 붙였다. 이러한 체계는 Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (이하 "Kabat 등(위 참조)")에 기재되어 있다. 본 명세서에는 달리 명시되지 않는 한 이러한 순번 체계가 사용된다.
카밧의 잔기 명명은 아미노산 잔기의 선형적인 번호화와 항상 직접적으로 대응되지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은, 구조적인 구성요소, 기본적인 가변 도메인 구조의 프레임워크이든지 상보성 결정 부위(CDR)이든지 간에, 이것의 단축, 또는 이것으로의 삽입에 대응하는 엄격한 카밧 번호화에서보다는 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카밧 번호화는 주어진 항체에 대해, "표준적인" 카밧 번호화 서열이 있는 항체 서열에 있어서 상동하는 잔기들의 정렬에 의해 확인할 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호화 체계에 따르면 잔기 31~35번(CDR-H1), 잔기 50~65번(CDR-H2) 및 잔기 95~102번(CDR-H3)에 위치해 있다. 그러나, 초티아(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))를 따르면, CDR-H1에 상응하는 루프는 잔기 26번부터 잔기 32번까지 포함한다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 'CDR-H1'은 카밧 번호화 체계와 초티아의 위상적 루프 정의를 조합하여 기술하는 잔기 26번 내지 35번을 의미하고자 한 것이다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호화 체계에 따르면 잔기 24~34번(CDR-L1), 잔기 50~56번(CDR-L2) 및 잔기 89~97번(CDR-L3)에 위치해 있다.
본 발명의 이중 특이적인 융합 단백질은 이전에 WO2010/096418에 기술된 항-OX 40 길항적 항체의 Fab 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 '길항적인'은 예를 들어, OX40의 OX40 리간드에의 결합을 차단하거나 상당히 감소시켜, OX40의 활성화를 억제함으로써, OX40의 생물학적 신호 전달 활성을 억제 및/또는 중화시킬 수 있는 항체 융합 단백질을 말한다.
OX40과 결합하는 것들을 식별하기 위한 항체 스크리닝은 인간 OX40에 대한 결합을 측정하는 분석법 및/또는 OX40과 그것의 리간드 OX40L의 결합을 차단하는 능력을 측정하는 분석법을 이용하여 이루어질 수 있다. 결합 분석법의 한 예는 ELISA로, 특히, 플레이트 위에 고정되는 인간 OX40과 인간 Fc의 융합 단백질을 이용하며, 융합 단백질에 결합된 항-OX40 항체를 검출하고자 콘쥬게이트된 2차 항체를 이용하는 ELISA이다. 차단 분석법의 한 예는 인간 CD4 세포 위에서 OX40에 대한 OX40 리간드 융합 단백질 결합의 차단을 측정하는 유동 세포 계수법을 기초로 한 분석법이다. 형광으로 표지된 2차 항체가 세포에 대한 OX40 리간드 융합 단백질 결합의 양을 검출하는 데 이용된다. 이러한 분석법은 상층액의 항체가 리간드 융합 단백질의 OX40에 대한 결합을 차단할 때 신호의 감소를 찾는 것이다. 차단 분석법의 추가적인 예는 삼중 수소 티미딘 도입량을 측정하여, 플레이트에 코팅된 OX40 리간드 융합 단백질에 의해 매개된 미분화 인간 T 세포의 상호 자극 차단을 측정하는 분석법이다.
본 발명에서, 가변 부위는 인간화된다. (CDR이 이식된 항체를 포함하는) 인간화 항체는 비 인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR)와 인간 면역 글로불린 분자로부터의 프레임워크 부위를 가지고 있는 항체 분자이다(예컨대, US 5,585,089; WO91/09967 참조). 전체 CDR보다는 CDR의 특이성 결정 잔기들만을 전달하는 것이 필수적일 수 있음은 이해할 것이다(예를 들어, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34 참조). 인간화 항체는 CDR이 유래되었던 비 인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기들을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, VH1과 VL1의 CDR은 WO2010/096418에 기술된, A26으로 알려져 있는 항체로부터 유래된다. 따라서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질에서, 중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)은 CDR-H1에 대해 SEQ ID NO:1로 주어진 서열, CDR-H2에 대해 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:23으로 주어진 서열 및 CDR-H3에 대해 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열을 포함하고, 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)은 CDR-L1에 대해 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:24로 주어진 서열, CDR-L2에 대해 SEQ ID NO:5로 주어진 서열 및 CDR-L3에 대해 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열을 포함한다.
OX40에 결합하여 OX40 활성을 중화시키는 항체의 능력을 상당히 바꾸지 않고도 본 발명에 의해 제공된 CDR에 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. OX40 결합 및 OX40/OX40L 상호 작용의 억제를 밝히기 위하여, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 예를 들어, WO2010/096418에 기술된 방법을 이용하여 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과를 용이하게 시험할 수 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 아미노산이, 예를 들어 1개 또는 2개의 아미노산이, 본원에서 아래에 정의된 비슷한 아미노산과 같은 또 다른 아미노산으로 치환된, 도 2c에 나타낸 CDRH-1(SEQ ID NO:1), CDRH-2(SEQ ID NO:2), CDRH-3(SEQ ID NO:3), CDRL-1(SEQ ID NO:4), CDRL-2(SEQ ID NO:5) 및 CDRL-3(SEQ ID NO:6)을 포함하는, 인간 OX40에 대해 특이성을 나타내는 이중 특이적인 항체를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 중쇄를 포함하는데, 이때, 중쇄의 제1 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함하고, 이때, CDRH-1의 서열은 SEQ ID NO:1로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타내고, CDRH-2는 SEQ ID NO:2로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타내고/나타내거나 CDRH-3는 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 융합 단백질은 중쇄를 포함하는데, 이때, 중쇄의 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함하고, 이때, CDRH-1의 서열은 SEQ ID NO:1로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내고, CDRH-2는 SEQ ID NO:2로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내고/나타내거나 CDRH-3는 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타낸다.
본원에 사용된 ?오究?은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 간에 동일함을 나타낸다. 본원에 사용된 ??煐?은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 간에 비슷한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린을 대신하여 치환될 수 있다. 서로를 대신해 흔히 치환될 수 있는 기타 아미노산으로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 곁사슬이 있는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티틴(염기성 곁사슬이 있는 아미노산);
- 아스파르트산 및 글루탐산(산성 곁사슬이 있는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 곁사슬이 있는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황을 함유하는 곁사슬이 있는 아미노산). 동일성 및 유사성 정도는 용이하게 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).
또 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 제1 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함하고, 이때, CDRL-1의 서열은 SEQ ID NO:4로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타내고, CDRL-2는 SEQ ID NO:5로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타내고/나타내거나 CDRL-3는 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열에 대해 적어도 90% 동일성 또는 유사성을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 제1 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함하고, 이때, CDRL-1의 서열은 SEQ ID NO:4로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내고, CDRL-2는 SEQ ID NO:5로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내고/나타내거나 CDRL-3는 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열에 대해 적어도 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 이중 특이적인 항체 융합 단백질의 Fab 부분은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6(도 2c)에 제공된 하나 이상의 CDR 또는 이의 변이체를 포함하는, 인간화 항체 분자 또는 CDR이 이식된 항체 분자이다. 본원에 사용된 용어 'CDR이 이식된 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 억셉터(acceptor) 항체(예컨대, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 부위 프레임워크 내로 이식된 도너(donor) 항체(예컨대, 쥐의 단일 클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원한다면, 하나 이상의 수정된 CDR을 포함)을 함유하는 항체 분자를 의미한다. 자세한 내용은 Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998을 참조. 일 구현예에서, 전체 CDR이 전달되기보다는, 본원에서 위에 기술된 CDR 중 임의의 하나로부터 하나 이상의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다(예를 들어, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34 참조). 일 구현예에서, 본원에서 위에 기술된 하나 이상의 CDR로부터 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다. 또 다른 구현예에서, 본원에서 위에 기술된 각각의 CDR로부터 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 전달된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 부위를 포함하는, CDR이 유래되는 도너 항체의 부류/유형을 고려하는, 임의의 적절한 억셉터 가변 부위 프레임워크 서열이 이용될 수 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 CDR이 이식된 항체는 위에 기술된 하나 이상의 CDR 또는 특이성 결정 잔기뿐만 아니라, 인간 억셉터 프레임워크 부위를 포함하는 가변 도메인을 가지고 있다. 따라서, 가변 도메인이 인간 억셉터 프레임워크 부위 및 비 인간 도너 CDR을 포함하는, 중화하는 CDR이 이식된 항체가 일 구현예에서 제공된다.
본 발명에 이용될 수 있는 인간 프레임워크의 예로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 위 참조). 예를 들어, KOL과 NEWM은 중쇄에 이용될 수 있고, REI는 경쇄에 이용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄에 이용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식 계열 서열이 이용될 수 있다. 이것들은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용할 수 있다.
본 발명의 CDR이 이식된 항체에서, 억셉터의 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요가 없으며, 원한다면, 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 부위를 가지고 있는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 중쇄 가변 도메인(VH1)에 적합한 프레임워크 부위는 JH4와 함께 인간 하위 집단 VH3 서열 1-3 3-07로부터 유래된다. 제1 경쇄 가변 도메인(VL1)을 위한 경쇄에 적합한 프레임워크 부위는 JK4와 함께 인간 생식 계열 하위 집단 VK1 서열 2-1 1-02로부터 유래된다.
또한, 본 발명의 CDR이 이식된 항체 가변 부위에서, 프레임워크 부위는 억셉터 항체의 그것들과 정확히 동일한 서열을 가지고 있을 필요가 없다. 예를 들어, 특이한 잔기는 그러한 억셉터 사슬 부류 또는 유형 대신 더욱 자주 발생하는 잔기로 바뀔 수 있다. 대안적으로, 억셉터 프레임워크 부위에서 선택된 잔기는 그것들이 도너 항체의 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 대응하도록 바뀔 수 있다(Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324 참조). 그러한 변화는 도너 항체의 친화도를 회복하는데 필요한 최소한도로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는, 억셉터 프레임워크 부위의 잔기를 선택하는 프로토콜은 WO 91/09967에 기재되어 있다.
적절하게는, 본 발명의 제1 중쇄 가변 부위(VH1)에서, 억셉터 중쇄가 JH4와 함께 인간 VH3 서열 1-3 3-07을 가지고 있으면, 중쇄의 억셉터 프레임워크 부위는 하나 이상의 도너 CDR 이외에 (Kabat et al., (위 참조)에 따른) 37번, 73번, 78번 또는 94번 위치 중 적어도 하나에 도너 잔기를 포함한다. 따라서, 중쇄의 제1 가변 도메인의 적어도 37번, 73번, 78번 및 94번 위치의 잔기는 도너 잔기인 이중 특이적인 항체 융합 단백질이 제공된다.
적절하게는, 본 발명의 제1 경쇄 가변 부위(VL1)에서, 억셉터 경쇄가 JK4와 함께 인간 하위 집단 VK1 서열 2-1 1-02를 가지고 있으면, 경쇄의 억셉터 프레임워크 부위는 하나 이상의 도너 CDR 이외에, 64번 또는 71번 위치 중 적어도 하나에 도너 잔기를 포함한다. 따라서, 경쇄의 제1 가변 도메인의 적어도 64번 및 71번 위치의 잔기는 도너 잔기인 이중 특이적인 항체 융합 단백질이 제공된다.
도너 잔기는 도너 항체, 즉, CDR이 본래 유래되었던 항체로부터의 잔기이다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 중쇄를 포함하며, 이때, 중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)은 도 2b SEQ ID NO:8로 주어진 서열을 포함한다.
OX40에 결합하여 OX40 활성을 중화시키는 항체 융합 단백질의 능력을 상당히 바꾸지 않고도, 본 발명에 의해 제공된 제1 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1개 또는 2개의 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. OX40 결합 및 리간드 차단을 밝히기 위하여, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 예를 들어, WO2010/096418에 기술된 방법을 이용하여 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과를 용이하게 시험할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 중쇄를 포함하며, 이때, 중쇄의 제1 가변 도메인은 도 2b SEQ ID NO:8로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 융합 단백질은 중쇄(VH1)를 포함하며, 이때, 중쇄의 제1 가변 도메인은 SEQ ID NO:8로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)은 도 2a SEQ ID NO:7로 주어진 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 제1 가변 도메인은 SEQ ID NO:7로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 제1 가변 도메인은 SEQ ID NO: 7로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
일 구현예에서 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)이 SEQ ID NO:8로 주어진 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)이 SEQ ID NO:7로 주어진 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 항체 융합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 이때, 중쇄의 제1 가변 도메인은 SEQ ID NO:8로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하고, 경쇄의 제1 가변 도메인은 SEQ ID NO:7로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 적절하게는, 항체 융합 단백질은, 중쇄의 제1 가변 도메인이 SEQ ID NO:8로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 제1 가변 도메인이 SEQ ID NO:7로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질에서, 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 경쇄는 카파 또는 람다의 CL 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 SEQ ID NO:10으로 주어진 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:9로 주어진 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
OX40에 결합하여 OX40 활성을 중화시키는 항체의 능력을 상당히 바꾸지 않고도, 본 발명에 의해 제공된 항체 가변 및/또는 불변 도메인에 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 1개 또는 2개의 아미노산의 치환, 첨가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. OX40 결합 및 OX40/OX40L 상호 작용의 차단을 밝히기 위하여, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 예를 들어, WO2010096418에 기술된 방법을 이용하여 임의의 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실의 효과를 용이하게 시험할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체 융합 단백질은 중쇄를 포함하며, 이때, 중쇄의 VH1 및 CH1 도메인은 SEQ ID NO:10으로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 적절하게는, 항체 융합은 중쇄를 포함하며, 이때, 중쇄의 VH1 및 CH1 도메인은 SEQ ID NO:10으로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 이중 특이적인 항체 융합 분자는 도 2d SEQ ID NO:9로 주어진 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 VL1 및 CH1 도메인은 SEQ ID NO:9로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체 융합 단백질은 경쇄를 포함하며, 이때, 경쇄의 VL1 및 CL 도메인은 SEQ ID NO:9로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다.
본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질에 의해 결합된 제2 항원은 인간 혈청 알부민이다. 이것은 제2 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 VH2와 VL2로 이루어지는 Fab-dsFv의 Fv 부분에 의해 결합된다. 본 발명에서, VH2와 VL2는 WO2010/035012에 기술된 항체들 중 하나로부터 유래되며, 그러한 항체의 향상된, 더욱 인간적인 이식편이다.
일 구현예에서 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 도 3a SEQ ID NO:11로 주어진 서열을 가지고 있다.
일 구현예에서 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 도 3b SEQ ID NO:12로 주어진 서열을 가지고 있다.
따라서, 본 발명은
N 말단으로부터 차례대로, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
N 말단으로부터 차례대로, 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄,
를 포함하는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는, 이중 특이적인 항체 융합 단백질을 제공하며,
이때, 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1과 VL1이 제1 항원 결합 자리를 형성하고, VH2와 VL2가 제2 항원 결합 자리를 형성하도록 정렬되고,
이때, 제1 항원 결합 자리에 의해 결합되는 항원은 인간 OX40이고, 제2 항원 결합 자리에 의해 결합되는 항원은 인간 혈청 알부민이고,
중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)은 CDR-H1에 대해 SEQ ID NO:1로 주어진 서열, CDR-H2에 대해 SEQ ID NO:2로 주어진 서열 및 CDR-H3에 대해 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열을 포함하고, 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)은 CDR-L1에 대해 SEQ ID NO:4로 주어진 서열, CDR-L2에 대해 SEQ ID NO:5로 주어진 서열 및 CDR-L3에 대해 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열을 포함하고,
제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 SEQ ID NO:11로 주어진 서열을 가지고 있고, 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 SEQ ID NO: 12로 주어진 서열을 가지고 있으며,
제2 중쇄 가변 도메인(VH2)과 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합에 의해 연결된다.
바람직하게는, CH1 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 링커에 의해 연결되고, CL 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 링커에 의해 연결된다. 임의의 적절한 펩티드 링커 서열이 이용될 수 있으며, 이것들은 각 사슬에서 동일하거나 상이할 수 있다. 적절한 링커는 이전에 WO2010/035012에 기술된 바 있으며, 본원에서 참조로 통합된다. 적절한 링커의 예를 도 3c 및 도 3d에 나타냈다. 일 구현예에서, CH1 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 사이의 링커는 도 3c SEQ ID NO:13으로 주어진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진다. 일 구현예에서, CH1 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 사이의 링커는 도 3c SEQ ID NO:14로 주어진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진다. 일 구현예에서 CL 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인(VL2) 사이의 링커는 도 3d SEQ ID NO:14로 주어진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진다.
일 구현예에서, 경쇄의 링커는 15개 아미노산 서열로, 특히, GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 29)이다.
일 구현예에서, 중쇄의 링커는 16개 아미노산 서열로, 특히 SGGGGSGGGGTGGGGS(SEQ ID NO: 30)이다.
일 구현예에서, 본 발명은 중쇄가 도 3e(SEQ ID NO:15)에 주어진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지고, 경쇄가 도 3f(SEQ ID NO:16)에 주어진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 이중 특이적인 항체 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 이중 특이적인 항체 융합 단백질은 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 이때, 중쇄는 SEQ ID NO:15로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO:16으로 주어진 서열에 대해 적어도 60% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함한다. 일반적으로, 항체 융합은 SEQ ID NO:15로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:16으로 주어진 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 동일성 또는 유사성을 나타내는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 항체 융합 분자는 적절하게는 높은 결합 친화도, 특히 인간 OX40에 대해 피코몰의 친화도와 인간 혈청 알부민에 대해 나노몰의 친화도를 나타낸다. 친화도는 분리된 천연 또는 재조합 OX40 또는 혈청 알부민 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 이용하여, WO2010096418에서 OX40에 대해 기술한 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 예컨대, 비아코어(BIAcore™)를 포함하는, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
일 예에서, 친화도는 WO2010/096418에 기술된 바와 같이 재조합 인간 OX40 세포 외 도메인을 이용하여 측정된다. 일 예에서, 사용된 재조합 인간 OX40 세포 외 도메인은 이량체, 예를 들어, Fc 융합 이량체이다. 적절하게는 본 발명의 항체 융합 분자는 분리된 인간 OX40에 대해 약 200pM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서 본 발명의 항체 분자는 약 100pM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서 본 발명의 항체 분자는 약 50pM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서 본 발명의 항체 융합 분자는 약 40pM 이하의 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명의 항체 융합 분자는 적절하게는 활성화된 T 세포의 표면 위에 발현된 인간 OX40에 대해 높은 결합 친화도, 예를 들어, 나노몰 또는 피코몰의 친화도를 나타낸다. 친화도는 활성화된 CD4+ OX40+ 인간 T 세포를 이용하여, WO2010096418에 기술된 바와 같은 방법을 포함하는, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 융합 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대해 약 2nM 또는 더 나은 결합 친화도를 나타낸다. 일 예에서, 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대해 약 1nM 또는 더 나은 결합 친화도를 나타낸다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대해 약 0.5nM 또는 더 나은 결합 친화도를 나타낸다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체 분자는 세포 표면 발현된 인간 OX40에 대해 약 0.2nM 또는 더 나은 결합 친화도를 나타낸다.
적절하게는 본 발명의 항체 융합 분자는 분리된 인간 혈청 알부민에 대해 약 50nM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 적절하게는 본 발명의 항체 융합 분자는 분리된 인간 혈청 알부민에 대해 약 20nM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 10nM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 5nM 이하의 결합 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 융합 분자는 약 2nM 이하의 결합 친화도를 나타낸다.
본 발명의 항체 융합 분자는 인간 혈청 알부민 및 사이노몰구스, 마우스 및 랫트 혈청 알부민과 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 융합 단백질은 5nM 이하의 친화도로 사이노몰구스 혈청 알부민과 결합한다. 일 구현예에서 본 발명의 항체 융합 단백질은 5nM 이하의 친화도로 마우스 혈청 알부민과 결합한다.
본 발명의 항체 융합 분자는 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 동시에 결합할 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 융합 분자는 OX40에 대해 높은 친화도를 나타내고, 또한 치료적으로 유용하도록 생체 내에서 적당한 반감기를 나타낸다. 예를 들어, 반감기는 7~11일과 같은, 5~15일의 범위 내이다.
본 발명에 의해 제공된 항체 융합 단백질의 인간 OX40 및/또는 인간 혈청 알부민에 대한 친화도는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 바뀔 수 있음은 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자의 변이형에 관한 것이며, 이것들은 OX40 또는 인간 혈청 알부민에 대해 향상된 친화도를 나타낸다. 그러한 변이형은 CDR 돌연변이화(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 대장균의 돌연변이 유발 유전자 계통 이용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 유성(sexual) PCR(Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 얻을 수 있다. Vaughan 등(위 참조)은 이러한 친화도 성숙 방법을 논의하였다.
일 구현예에서 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 분자는 OX40과 OX40L 사이의 상호 작용을 차단한다. 항체의 이러한 상호 작용을 차단하는 능력을 확인하기에 적합한 여러 가지 분석법은 WO2010/096418에 기술되어 있다. 일 구현예에서 본 발명은 0.5nM 미만의 농도에서 50%까지 (2㎍/ml의 최종 농도에서 시험한) 인간 OX40L의 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 결합을 억제할 수 있는, 인간 OX40에 대해 특이성을 나타내는 항체 융합 단백질을 제공한다. 일 구현예에서 분석에 사용된 인간 OX40L은 자연 발생적인 인간 OX40이다. 일 구현예에서 분석에 사용된 인간 OX40은 재조합 인간 OX40이다.
원한다면, 본 발명에 이용하기 위한 항체는 하나 이상의 효과기 분자(들)에 콘쥬게이트될 수 있다. 효과기 분자는 단일 효과기 분자 또는, 연결되어 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 둘 이상의 그러한 분자들을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 효과기 분자에 연결된 항체 단편을 획득하는 것이 바람직한 경우, 이것은 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 효과기 분자에 연결되는 표준 화학 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 그러한 효과기 분자를 항체에 콘쥬게이트하는 기법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123 참조). 특정 화학적 절차로는 예를 들어, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기술된 것들을 포함한다. 대안적으로는, 효과기 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 연결은 예를 들어, WO 86/01533 및 EP0392745에 기술된 바와 같이, 재조합 DNA 절차를 이용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 효과기 분자는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적으로 활성이 있는 단백질, 예를 들어, 효소, 기타 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 자연 발생적인 고분자, 핵산 및 이의 단편, 예컨대, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오드, 방사성 동위원소, 킬레이트 금속, 나노입자 및 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물과 같은 리포터 집단을 포함한다.
효과기 분자의 예로는 세포 독소 또는 세포에 치명적인(예컨대, 세포를 죽이는) 임의의 작용제를 포함하는 세포 독성 작용제를 포함할 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스털린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에머틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 마이토잔트론, 미스라마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 그리고 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
효과기 분자는 또한 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(이전의 다우노루비신) 및 독소루비신), 항생물질(예컨대, 닥티노마이신(이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리키마이신 또는 듀오카마이신) 및 항유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
기타 효과기 분자는 111In과 90Y, Lu177, 비스무트213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188과 같은 킬레이트 방사성 핵종; 또는 알킬포스포콜린, 토포이성질화효소 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 약물을 포함할 수 있다.
기타 효과기 분자로는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 있는 효소들로는 단백질 분해효소, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소, 전달효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 관심 있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 인슐린, 종양 괴사 인자, a-인터페론, b-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성인자와 같은 단백질, 혈전제 또는 항혈관형성제, 예컨대, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 기타 성장 인자 및 면역글로불린과 같은 생물학적 반응 조절자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
기타 효과기 분자로는 예를 들어, 진단에 유용한 검출할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 검출할 수 있는 물질의 예로는 다양한 효소, 보결분자단, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성 핵종, (양전자 방사 단층 촬영에 사용하기 위한) 양전자 방사 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단술로 이용하기 위한 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허번호 4,741,900호 참조. 적합한 효소로는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스터라아제를 포함한다. 적합한 보결분자단으로는 스트렙타아비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함한다. 적합한 형광물질로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 염화물 및 피코에리트린을 포함한다. 적합한 발광물질로는 루미놀을 포함한다. 적합한 생물발광물질로는 루시페라아제, 루시페린 및 에쿼린을 포함한다. 그리고, 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
효과기 분자가 고분자인 경우, 그것은 일반적으로는 합성 또는 자연 발생적인 고분자, 예를 들어, 선택적으로 치환된 곧은 사슬 또는 가지형 사슬 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 고분자 또는 가지형 또는 비가지형 다당류, 예컨대, 호모 또는 헤테로 다당류일 수 있다.
위에 언급된 합성 고분자 위에 존재할 수 있는, 구체적인 선택적 치환기로는 하나 이상의 하이드록시, 메틸, 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 고분자의 구체적인 예로는 선택적으로 치환된 곧은 사슬 또는 가지형 사슬 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이의 유도체, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체와 같은 선택적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜)을 포함한다.
구체적인 천연 발생적인 고분자로는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이의 유도체를 포함한다.
본원에 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어, 말레이미드 등과 같은 티올-선택적 반응성이 있는 기를 포함하고자 한 것이다. 반응성이 있는 기는 직접적으로 또는 링커 부분을 통해 고분자에 연결될 수 있다. 그러한 기의 잔기는 일부 사례에서 항체 단편과 고분자 사이의 연결하는 기로서 산출물의 일부분을 형성할 것임을 이해할 것이다.
고분자의 규모는 원하는 대로 달라질 수 있지만, 일반적으로는 500Da 내지 50000Da 범위, 예를 들어, 20000 내지 40000Da과 같이, 5000 내지 40000Da의 평균 분자량일 것이다.
일 예에서, 적합한 효과기 분자는 항체 융합 단백질에 위치한 임의의 이용 가능한 아미노산 곁사슬 또는 말단 아미노산 기능기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카르복실 기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 아미노산은 항체 단편에 자연적으로 발생할 수 있거나, 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 내로 유전자 조작될 수 있다(예를 들어, US 5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971 참조).
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 암호화하는 분리된 DNA 서열을 제공한다. 적절하게는, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 암호화한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들어, 화학적 프로세싱에 의해 생성된, 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA 서열은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 암호화하는 DNA 서열은 결정된 DNA 서열로부터 원하는 대로, 또는 상응하는 아미노산 서열을 기초로 하여 합성할 수 있다.
억셉터 프레임워크 서열을 암호화하는 DNA는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 널리 이용할 수 있으며, 그것들의 알려진 아미노산 서열을 기초로 하여 용이하게 합성될 수 있다.
분자 생물학의 표준 기법은 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA 서열을 제조하는 데 이용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유도 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법이 적절히 이용될 수 있다.
적합한 서열의 예를 도 5a SEQ ID NO:21, 도 5b SEQ ID NO:22, 도 6a SEQ ID NO:23, 도 6b SEQ ID NO:24에 제공하였다. SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 1~63과 SEQ ID NO:23의 뉴클레오티드 1~63은 절단되어 본 발명의 길항적인 항체 융합 분자를 제공하는 신호 펩티드 서열 OmpA를 암호화한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:21 또는 SEQ ID NO:22를 포함하는 본 발명의 항체 융합 단백질의 중쇄를 암호화하는 분리된 DNA 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:24를 포함하는 본 발명의 항체 융합 단백질의 경쇄를 암호화하는 분리된 DNA 서열을 제공한다.
적합한 서열의 기타 예를 도 7a SEQ ID NO:25, 도 7b SEQ ID NO:26, 도 8a SEQ ID NO:27, 도 6b SEQ ID NO:28에 제공하였다. SEQ ID NO:25의 뉴클레오티드 1~57과 SEQ ID NO:27의 1~60은 절단되어 본 발명의 길항적인 항체 융합 분자를 제공하는 마우스 항체 B72.3(Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505.)의 신호 펩티드 서열을 암호화한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:25 또는 SEQ ID NO:26을 포함하는 본 발명의 항체 융합 단백질의 중쇄를 암호화하는 분리된 DNA 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28을 포함하는 본 발명의 항체 융합 분자의 경쇄를 암호화하는 분리된 DNA 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터가 제공된다. 적절하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 두 개의 DNA 서열을 포함한다. 적절하게는, 본 발명에 따른 벡터는 SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:23으로 주어진 서열들을 포함한다. SEQ ID NO:21의 뉴클레오티드 1~63과 SEQ ID NO:23의 1~63은 OmpA의 신호 펩티드 서열을 암호화한다.
벡터가 구축될 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이 점에서, "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York과 Cold Spring Harbor Publishing에 의해 제작된 Maniatis Manual을 참조한다.
또한, 본 발명의 항체 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 이용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어, 대장균, 및 기타 미생물 시스템이 이용될 수 있거나, 진핵생물, 예를 들어, 포유류의 숙주 세포 발현 시스템도 이용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포로는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA로부터 단백질 발현을 유도하기에 적합한 조건 하에서, 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 분자를 분리하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 항체 융합 분자의 생산 방법을 제공한다.
중쇄 및 경쇄를 포함하는 산출물의 생산을 위해, 세포주는 두 개의 벡터, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터와 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로는, 단일 벡터가 이용될 수 있는데, 이러한 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 서열들을 포함한다.
본 발명의 항체 융합 단백질이 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하므로, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합된, 본 발명의 항체 분자를 포함하는 약학적 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 융합 단백질의 이용이 제공된다. 조성물은 대개 보통 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 멸균된 약학적 조성물의 일부분으로 제공될 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께, 본 발명의 항체 융합 분자를 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는 약학적 또는 진단 조성물의 제조방법을 제공한다.
항체 융합 분자는 약학적 또는 진단 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나, 기타 항체 성분, 예를 들어, 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNУ또는 항-LPS 항체, 또는 크산틴과 같은 비 항체 성분을 포함하는 기타 활성 성분들을 수반할 수 있다. 기타 적합한 활성 성분으로는 내성을 유도할 수 있는 항체, 예를 들어, 항-CD3 또는 항-CD4 항체를 포함한다.
추가적인 구현예에서, 본 개시 내용에 따른 항체 융합 단백질 또는 조성물은 추가적인 약학적으로 활성이 있는 작용제, 예를 들어, (프로피온산 플루티카손과 같은) 코르티코스테로이드 및/또는 (살부타몰, 살메테롤 또는 포르모테롤과 같은) 베타-2-작용제 또는 (라파마이신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트와 같은) 세포 성장 및 증식 억제제 또는 대체적인 CD28 및/또는 CD40 억제제와 조합하여 이용된다. 일 구현예에서 억제제는 소분자이다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 표적에 특이적인 항체이다.
약학적 조성물은 적절하게는 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 항체 융합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료적으로 유효한 양"은 표적으로 한 질병 또는 병태를 치료, 개선 또는 예방하거나, 검출할 수 있는 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 의미한다. 임의의 항체의 경우, 치료적으로 유효한 양은 초기에는 세포 배양 분석법 또는 동물 모델에서, 대개는 설치류, 토끼, 개, 돼지, 또는 영장류에서 추정할 수 있다. 또한, 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다. 그러면 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는 데 이용될 수 있다.
인간 대상자를 위한 정확한 치료적으로 유효한 양은 질병 상태의 심각도, 대상자의 일반 건강, 대상자의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 투여 빈도, 약물 병용, 반응 민감도 및 치료에 대한 내성/반응에 달려있을 것이다. 이러한 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 범위 내이다. 일반적으로, 치료적으로 유효한 양은 0.01mg/kg 내지 50mg/kg, 예를 들어 0.1mg/kg 내지 20mg/kg일 것이다. 약학적 조성물은 용량당 본 발명의 활성이 있는 작용제의 소정의 양을 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있다.
조성물은 개별적으로 환자에 투여될 수 있거나, 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 병용하여(예컨대, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 융합 분자가 투여되는 용량은 치료되는 병태의 속성, 존재하는 염증의 정도에 따라, 그리고 항체 분자가 예방적으로 이용되는지 또는 기존의 상태를 치료하기 위하여 이용되는지에 의해 결정된다.
용량의 빈도는 항체 융합 분자의 반감기와 그것의 효과의 지속기간에 의해 결정될 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기(예컨대, 2 내지 10시간)를 나타낼 경우, 하루당 1회 이상의 용량을 제공하는 것이 필수적일 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기(예컨대, 2 내지 15일)를 나타낼 경우, 1일당 1회, 1주당 1회, 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회 투여량을 제공하는 것이 필수적일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 그 자체가 조성물을 투여 받는 개인에 유해한 항체의 생산을 유도해서는 안 되며, 독성이 있어서는 안 된다. 적합한 담체는 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 다량체 아미노산, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자와 같은 크고, 서서히 대사되는 거대분자일 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 무기산염, 또는 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염과 같은 유기산의 염이 이용될 수 있다.
치료적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가적으로 함유할 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질이 그러한 조성물에 존재할 수 있다. 그러한 담체는 약학적 조성물이 환자가 섭취하기 위한 정제, 환제, 드라제, 캡슐제, 액제, 젤, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.
투여를 위해 적합한 형태로는 예컨대, 주사 또는 주입에 의해, 예를 들어, 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의해, 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 산출물이 주사 또는 주입을 위한 것인 경우, 그것은 유성 또는 수성 용제 내의 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용하기 전에 적당한 멸균 액체로 재구성하기 위한, 건조 형태일 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상자에 직접적으로 투여될 수 있다. 치료 대상자는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 인간 대상자에 투여하도록 이루어진 것이다.
적절하게는 본 개시 내용에 따른 제형에서, 최종 제형의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 비슷하지 않다. 예를 들어, 제형의 pH가 7이라면, 8~9 이상의 pI가 적합할 수 있다. 이론에 얽매이기를 바라지 않지만, 이로써 궁극적으로는 예를 들어, 항체 또는 단편이 용액으로 남아있는, 안정성이 향상된 최종 제형을 제공할 수 있다고 여겨진다.
일 양태에서 유리하게도 본 개시 내용의 융합 분자는 전반적으로 중성 분자에 해당하는 pI를 나타내지 않는다. 이로써, 분자는 응집에 덜 민감하게 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 뇌실 내, 경피 흡수(transdermal), 피부 통과(transcutaneous, 예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강 내, 비강 내, 장 내, 국소적, 설하, 질 내, 또는 직장 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 수의 경로로 투여될 수 있다. 또한, 하이포스프레이가 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 데 이용될 수 있다. 전형적으로, 치료적 조성물은 주사 가능 물질로 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 용제 내의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사에 의해, 피하적으로, 복강 내로, 정맥 내로 또는 근육 내로 이루어지거나, 조직의 간질 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 도한 병소로 투여될 수 있다. 투여량 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다용량 스케줄일 수 있다.
조성물의 활성 성분이 항체 분자일 것임은 이해할 것이다. 따라서, 그것은 위장관에서 분해되기 쉬울 것이다. 따라서, 조성물인 위장관을 이용하는 경로로 투여된다면, 조성물은 항체를 분해로부터 보호하지만, 일단 위장관으로부터 흡수되면, 항체를 방출하는 작용제를 함유해야 할 것이다.
약학적으로 허용 가능한 담체에 대한 면밀한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)에서 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소적 투여를 위한 제형으로 제공된다.
적절한 흡입 제제로는 흡입 가능한 분말, 추진제 기체를 함유하는 조절식 에어로졸 또는 추진체 기체가 없는 흡입 가능한 용액을 포함한다. 활성 성분을 함유하는 본 개시 내용에 따른 흡입 가능한 분말은 위에 언급된 활성 물질 단독으로 또는 생리적으로 허용 가능한 부형제와 위에 언급된 활성 물질의 혼합물로 이루어질 수 있다.
이러한 흡입 가능한 분말로는 단당류(예컨대, 글루코오스 또는 아라비노오스), 이당류(예컨대, 락토오스, 사카로오스, 말토오스), 올리고당 및 다당류(예컨대, 덱스트란), 폴리알코올(예컨대, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예컨대, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들을 서로 혼합한 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 다당류가 적절히 이용되는데, 락토오스 또는 글루코오스는 특히, 그것들의 수화물의 형태로 이용되나, 전적으로 그렇지는 않다.
폐 침착을 위한 입자는 1~9마이크론, 예를 들어, 0.1 내지 5μm, 특히 1 내지 5μm와 같이, 10마이크론 미만의 입자 크기를 필요로 한다. (항체 또는 단편과 같은) 활성 성분의 입자 크기는 가장 중요하다.
흡입 가능한 에어로졸을 제조하는 데 이용될 수 있는 추진체 기체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 적합한 추진체 기체는 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄과 같은 탄화수소 및 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염소화 및/또는 불소화 유도체와 같은 할로겐 탄화수소로부터 선택된다. 위에 언급된 추진체 기체는 독자적으로 또는 이의 혼합물로 이용될 수 있다.
특별히 적합한 추진체 기체는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 가운데 선택된 할로겐화 알칸 유도체이다. 위에 언급된 할로겐화 탄화수소 가운데, TG134a (1,1,1,2-테트라플루오로에탄)과 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 그의 혼합물이 특히 적합하다.
추진체 기체를 함유하는 흡입 가능한 에어로졸은 또한 공용매, 안정제, 표면활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH 조절 수단과 같은 다른 성분들을 함유할 수 있다. 이러한 성분들 전부는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진체 기체를 함유하는 흡입 가능한 에어로졸은 활성 성분을 5중량%까지 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어, 0.002 내지 5중량%, 0.01% 내지 3 중량 %, 0.015 내지 2 중량 %, 0.1 내지 2 중량 %, 0.5 내지 2 중량 % 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로 폐로의 국소 투여는 또한 액체 용액 또는 현탁액 제형을 투여하여, 예를 들어, 분무기(nebulizer), 예를 들어, 압축기에 연결된 분무기(예컨대, 미국 버지니아 주 리치몬드의 Pari Respiratory Equipment, Inc.가 제조한 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기)와 같은 장치를 이용하여, 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 융합 단백질은 용매에, 예컨대, 용액 또는 현탁액의 형태로 분산되어 전달될 수 있다. 본 발명의 항체 융합 단백질은 적절한 생리적 용액, 예컨대, 염수 또는 기타 약학적으로 허용 가능한 용매 또는 완충 용액에 현탁시킬 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 완충 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하기 위하여 물 1ml당 0.05mg 내지 0.15mg 에테트산 디소듐염, 8.0mg 내지 9.0mg NaCl, 0.15mg 내지 0.25mg 폴리소르베이트, 0.25mg 내지 0.30mg 무수 시트르산 및 0.45mg 내지 0.55mg 시트르산 소듐염을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 감압 동결 건조된 항체를 이용할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 완충액(예컨대, 시트르산염 완충액, 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 중탄산염 완충액), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예컨대, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 마이크로스피어에 캡슐화될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 멸균 제조 공정을 이용하는 실질적으로 멸균된 형태로 제공될 것이다.
이는 제형에 이용되는 완충 용매/용액의 여과에 의한 생산 및 멸균, 멸균 완충 용매 용액 내 항체의 무균 현탁 및 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익숙한 방법에 의해 멸균 용기로의 제형의 조제를 포함할 수 있다.
본 개시 내용에 따른 분무 가능한 제형은 예를 들어, 포일 봉투에 포장된 단일 용량 단위(예컨대, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 용매/용액 완충액의 부피, 예컨대, 2mL에 단위 용량을 함유한다.
본원에 개시된 항체 융합 단백질은 분무화를 통해 전달하기에 적합할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 유전자 요법을 이용하여 투여될 수 있음이 예상된다. 이를 달성하기 위하여, 항체 사슬이 DNA 서열로부터 발현되어 그 자리에서 조합되도록, 적절한 DNA 구성요소의 제어 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열이 환자에 도입된다.
또한, 본 발명은 염증성 질병, 예를 들어, 급성 또는 만성 염증성 질병 제어에 이용하기 위한 항체 융합 분자(또는 이를 포함하는 조성물)를 제공한다. 적절하게는, 항체 분자(또는 이를 포함하는 조성물)는 염증 과정을 감소시키거나 염증 과정을 방지하는 데 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 활성화 T 세포, 특히, 부적절한 염증성 면역 반응에 수반된 활성화 T 세포, 예를 들어, 그러한 반응의 인근/위치에 모집된 활성화 T 세포의 생체 내 감소가 제공된다.
본원에 사용된 활성화 T 세포의 감소는 치료 전 또는 치료를 하지 않았을 때와 비교하여, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 이상의 퍼센트의 감소일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물을 이용한 치료는 환자의 일반적인 T 세포(활성화되지 않은 T 세포)의 수준을 감소시키지 않고, 활성화 T 세포의 수준을 감소시킬 수 있다. 이는 더 적은 부작용을 초래할 수 있으며, 아마도 환자의 T 세포 고갈을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명은 OX40에 의해 매개되거나, OX40의 증가된 수준과 관련이 있는 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본 발명의 항체 융합 분자를 제공한다. 병리학적 상태는, 예를 들어, 감염(바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 기생충), 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 골반 염증성 질병, 알츠하이머병, 염증성 장 질병, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병, 복강 질병, 담낭 질병, 모소 질병, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 1형 당뇨병, 라임병, 관절염, 수막뇌염, 자가 면역 포도막염, 다발성 경화증, (전신성 홍반성 루푸스 및 홍반성 신장염과 같은) 루푸스 및 기엥 바레 증후군과 같은 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 아토피성 피부염, 자가 면역 간염, 섬유화 폐포염, 그레이브병, IgA 신병증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 사르코이드증, 경피증, 베게너 육아종증, 기타 자가 면역 장애, 췌장염, 외상(수술), 이식편 대 숙주 질병, 이식 거부 반응, 심근 경색뿐만 아니라 죽상 동맥 경화증과 같은 허혈성 질병을 포함하는 심장 질병, 혈관내 응고, 뼈 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염 및 위산 감소증으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 항체 융합 단백질은 알레르기, 만성 폐쇄성 폐질환, 자가 면역 질병, 류마티스 관절염, 천식, 이식편 대 숙주 질병, 크론병, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 신장염, 중증 근무력증, 그레이브병, 이식 거부 반응, 베게너 육아종증, 헤노흐 쇤라인 자반병, 전신성 경화증 또는 바이러스에 의한 폐 염증의 치료에 이용된다.
일 구현예에서 본 발명에 따른 항체 융합 단백질은 알레르기, 만성 폐쇄성 폐질환, 자가 면역 질병, 류마티스 관절염, 천식, 이식편 대 숙주 질병, 크론병, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 신장염, 중증 근무력증, 그레이브병, 이식 거부 반응, 베게너 육아종증, 헤노흐 쇤라인 자반병, 전신성 경화증 또는 바이러스에 의한 폐 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료에 이용된다.
또한, 본 발명은 통증, 특히, 염증과 관련된 통증의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 본 발명에 따른 항체 융합 분자를 제공한다.
일 구현예에서 본 개시 내용의 융합 분자가 작동하는 메커니즘으로는 T 세포 증식 또는 생존의 억제, TReg 세대의 증대, B 세포의 분화 감소 및/또는 사이토카인 생산의 감소 중 하나 이상을 포함한다.
또한, 본 발명은 OX40에 의해 매개되거나, OX40의 증가된 수준과 관련이 있는 병리학적 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 항체 융합 분자 또는 조성물의 용도를 제공하며, 특히, 병리학적 장애는 류마티스 관절염, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 의학적 조짐 중 하나 이상의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명에 따른 항체 분자, 단편 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 항체 융합 분자 또는 조성물은 인간 또는 동물 신체에서 OX40의 효과를 감소시키는 것이 바람직한 경우의 임의의 치료법에 이용될 수 있다. OX40은 신체 내에서 순환할 수 있거나, 신체의 특정 부위, 예를 들어, 염증 부위에 바람직하지 않게 높은 수준으로 존재할 수 있다.
일 구현예에서 본 발명의 항체 융합 분자 또는 이를 포함하는 조성물은 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 염증성 질병의 제어를 위해 이용된다.
또한, 본 발명은 OX40에 의해 매개되는 장애를 앓거나, 이러한 장애의 위험이 있는 인간 또는 동물 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 대상에 유효한 양의 본 발명의 항체 융합 분자 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 실질적으로 정제된 형태의, 특히, 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA가 없거나 실질적으로 없는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 정제된 이중 특이적인 항체 융합 단백질이 제공된다.
위에서 이용된 바와 같은 정제된 형태는 적어도 90% 순도, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 이상 순수한 것을 의미하고자 한 것이다.
내독소가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 항체 산출물 mg당 0.5 또는 0.1EU와 같이, 항체 산출물 mg당 1EU 이하의 내독소 함유량을 의미하고자 한 것이다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없다는 것은 일반적으로 적절히, 항체 산출물 mg당 100? 이하, 특히, mg당 20?과 같이, 항체 산출물 mg당 400? 이하의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함유량을 의미하고자 한 것이다.
또한, 본 발명의 항체 융합 분자는 OX40이 관련된 질병 상태의 진단, 예를 들어, 생체 내 진단, 및 영상화에 이용될 수 있다.
유리하게도, 본 융합 분자는 특히, 본 융합 분자가 과 작동제가 아니고, 사이토카인 발작을 유발할 가능성이 낮으므로, 적절한 치료적 용량으로 인간에 투여하기에 안전하다고 간주된다.
본원에 사용된 과 작동제는 TCR 관여 부재 시에 T 세포를 확장시키는 항체를 의미한다.
일 구현예에서 A26 Fab-Fv는 집단 내의 더 적은 수의 세포가 분열에 집중하고 있음을 나타내는 분열 지수를 감소시킨다. 이러한 효과는 아마도 OX40을 발현시키는 NK 세포에 의해 매개된다. 분열 지수는 본래 집단 내의 세포가 겪었던 세포 분열의 평균 수를 나타내며, 분열되지 않은 세포들을 포함한다.
증식 지수는 상응하는 집단만의 증식을 반영하며, 일 구현예에서, 이러한 방식를 이용하는 A26 Fab-Fv의 억제 효과는 상대적으로 감소된다.
본 명세서의 맥락에서 "포함하는(comprising)"은 "including"을 의미하고자 한 것이다.
본 발명의 기술적으로 적절한 구현예가 조합될 수 있다.
특정 특징/요소들을 포함하는 구현예가 본원에 기술된다. 또한, 본 개시 내용은 상기 특징/요소들로 이루어지거나, 상기 특징/요소들로 필수적으로 이루어지는 별도의 구현예까지 미친다.
본 발명은 추가적으로 첨부된 도면을 참조로 하는 하기의 실시예에서 단지 예시로써 기술된다.
실시예
도면 설명
도 1: Fab-dsFv로 지칭된 본 발명의 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
도 2:
a) 항체 A26의 경쇄 V 부위(SEQ ID NO:7)
b) 항체 A26의 중쇄 V 부위(SEQ ID NO:8)
c) 항체 A26의 CDRH1(SEQ ID NO:1), CDRH2(SEQ ID NO:2), CDRH3(SEQ ID NO:3), CDRL1(SEQ ID NO:4), CDRL2(SEQ ID NO:5) 및 CDRL3(SEQ ID NO:6).
d) 항체 A26 Fab 구성요소의 경쇄(SEQ ID NO:9)
e) 항체 A26 Fab 구성요소의 중쇄(SEQ ID NO:10)
도 3
a) 항-알부민 Fv 구성요소 645gH5의 중쇄(SEQ ID NO:11)
b) 항-알부민 Fv 구성요소 645gL4의 경쇄(SEQ ID NO:12)
c) 링커 1(SEQ ID NO:13)
d) 링커 2(SEQ ID NO:14)
e) Fab-dsFv 중쇄(SEQ ID NO:15)
f) Fab-dsFv 경쇄(SEQ ID NO:16)
도 4
a) 645g1 중쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:17)
b) 645g1 경쇄 가변 도메인 (SEQ ID NO:18)
c) A26 Fab-dsFv 645gH1 (SEQ ID NO:19)
d) A26 Fab-dsFv 645gL1 (SEQ ID NO:20)
도 5
a) OmpA 리더를 포함하는 Fab-dsFv의 중쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:21)
b) OmpA 리더가 없는 Fab-dsFv의 중쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:22)
도 6
a) OmpA 리더를 포함하는 Fab-dsFv의 경쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:23)
b) OmpA 리더가 없는 Fab-dsFv의 경쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:24)
도 7
a) B72.3 리더를 포함하는 Fab-dsFv의 중쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:25)
b) B72.3 리더가 없는 Fab-dsFv의 중쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:26)
도 8
a) B72.3 리더를 포함하는 Fab-dsFv의 경쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:27)
b) B72.3 리더가 없는 Fab-dsFv의 경쇄를 암호화하는 DNA(SEQ ID NO:28)
도 9a는 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 알렉사플루오르 488이 표지된 A26 Fab-dsFv의 결합을 나타낸 것이다.
도 9b는 활성화된 인간 CD4+, OX40+ T 세포 상의 5% HSA의 존재 하에 A26 Fab', A26 Fab-Fv 및 A26 Fab' -PEG의 결합을 나타낸 것이다.
도 10a는 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물에 노출된 PBMC로부터 사이토카인 생산에 미치는 A26 Fab-dsFv의 영향을 나타낸 것이다.
도 10b는 Hu-NSG 마우스 모델에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제하는 A26 Fab-dsFv의 능력을 나타낸 것이다.
도 11a는 A26 Fab-dsFv에 의한 OX40L의 인간 활성화 CD4+ OX40+ T 세포에 대한 결합 억제를 나타낸 것이다.
도 11b는 A26 Fab' ,A26 Fab-dsFv, A26 Fab' -PEG 및 두 대조군에 의한, OX40L의 인간 활성화 CD4+ OX40+ T 세포에 대한 결합 억제를 나타낸 것이다.
도 12a는 A26 Fab-Fv가 인간 혼합 림프구 반응(MLR)을 억제함을 나타낸 것이다.
도 12b는 인간 MLR 중에 A26 Fab-Fv가 IFN-감마 생산을 억제함을 나타낸 것이다.
도 13은 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물을 이용한 2차 항원 재자극 후에 A26 Fab-Fv가 활성화 (CD25+) CD4+ T 세포의 백분율을 감소시킴을 나타낸 것이다.
도 14는 세포 전달 이전에 투여된 Fab-Fv 및 Fab-PEG가 Hu-NSG 모델에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 용량 의존적으로 억제함을 나타낸 것이다.
DNA 조작 및 일반적인 방법
수용성 대장균 균주를 형질전환 및 통상적인 배양 성장에 이용하였다. DNA 제한 및 수정 효소는 Roche Diagnostics Ltd.와 New England Biolabs로부터 얻었다. 플라스미드 제조는 Maxi 플라스미드 정제 키트(QIAGEN, 카탈로그 번호 12165)를 이용하여 수행하였다. DNA 시퀀싱 반응은 ABI Prism Big Dye 터미네이터 시퀀싱 키트(카탈로그 번호 4304149)를 이용하여 수행하고, ABI 3100 자동 시퀀서(Applied Biosystems)로 실행하였다. 데이터는 Sequencher(Genecodes) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 올리고뉴클레오티드는 Simga 또는 Invitrogen으로부터 얻었다. 초기 V 부위 서열을 암호화하는 유전자는 DNA2.0에 의한 자동 합성 접근법으로 구축하였고, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이화에 의해 이식된 버전을 생성하고자 수정하였다. Fab-Fv의 농도는 단백질-G를 기초로 한 HPLC법에 의해 확인하였다.
실시예 1
A26Fab-645 dsFv 에서 645의 상이한 인간화 이식편의 생성 및 분석
본 발명자들은 이전에 WO2010/035012에서 Fab-dsFv 항체 포맷(도 1)(가끔 본원에서 단순히 Fab-Fv라고 지칭함)과 '645gH1gL1'라고 알려져 있는 인간화 항-알부민 항체를 기술하였다. 또한, 본 발명자들은 이전에 WO2010/096418에서 'A26'으로알려져 있는 인간화된 길항적인 항-OX40 항체와 이의 페길화 Fab' 단편의 생성을 기술하였다. 본원에서 본 발명자들은 645dsgH5gL4라고 알려진 항체 '645'의 새로운 향상된 인간화된 이식편의 생성과 그러한 이식편을 Fv 구성요소에 그리고 'A25' 가변 부위를 Fab 구성요소에 도입하는 Fab-dsFv 항체 분자의 생성을 기술한다. A26의 가변 부위는 도 2a와 도 2b에 제시하였다(SEQ ID NO:7 및 8).
조합된 A26의 가변 부위와 불변 부위 서열은 도 2d와 도 2e에 제시하였다(SEQ ID NO:9 및 10).
645gH1과 gL1의 서열은 도 4a와 도 4b, SEQ ID NO:17 및 18로 제시하였다.
용어 Fab' -PEG 또는 A26 Fab' -PEG가 사용되는 경우, 이는 WO2010/096418에 기술된 A26 Fab-40K PEG' 를 의미한다.
1.1 A26Fab-645 dsFv ( gH1gL1 ) 및 A26Fab-645 dsFv ( gH5gL4 )G4S 링커 플라스미드의 구축
A26Fab-645dsFv(gL1) 경쇄의 전체 암호화 부위(SEQ ID NO:20)를 HCMV-MIE 프로모터와 SV40E polyA 서열의 제어 하에 UCB 포유류 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 645dsFv(gL1)의 경쇄 가변 부위(SEQ ID NO:18)를 중첩 PCR 방법에 의해 645dsFv(gL4)(SEQ ID NO:12)로 돌연변이시켰다. A26Fab-645dsFv(gH1) 중쇄의 전체 암호화 부위(SEQ ID NO:19)를 HCMV-MIE 프로모터와 SV40E polyA 서열의 제어 하에 UCB 포유류 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 645dsFv(gH1)의 중쇄 가변 부위(SEQ ID NO:17)를 중첩 PCR 방법에 의해 645dsFv(gH5)(SEQ ID NO:11)로 돌연변이시켰다. 구성체를 시퀀싱으로 확인하였다. 두 구성체는 도 3d SEQ ID NO:14로 주어진 3xG4S 링커를 함유하였다.
1.2 A26Fab-645 dsFv ( gH1gL1 )와 A26Fab-645 dsFv ( gH5gL4 )의 포유류 발현
HEK293 세포를 제조업체의 설명서에 따라 Invitrogen의 293펙틴(fectin) 형질감염 시약을 이용하여 중쇄 및 경쇄 플라스미드로 형질감염시켰다. 간단히 설명하자면, 25? 중쇄 플라스미드와 25? 경쇄 플라스미드를 100? 293펙틴 및 1700? Optipro 배지와 함께 실온에서 20분 동안 항온배양하였다. 그런 다음, 혼합물을 50ml 현탁액 내의 50x106개 HEK293 세포에 첨가하고, 37℃에서 진탕하면서 6일 동안 항온배양하였다. 6일 후, 세포를 제거하기 위하여 상층액을 1500xg에서 10분 동안 원심분리에 의해 수집한 다음, 0.22? 멸균 필터로 여과하였다.
1.3 A26Fab-645 dsFv ( gH1gL1 ) 및 A26Fab-645 dsFv ( gH5gL4 )의 단백질-G 정제
0.22㎛로 여과시킨 상층액 약 50ml을 10kDa 분자량의 차단막이 있는 Amicon Ultra-15 농축기를 이용하여 약 2ml로 농축시키고, 스윙 아웃 회전자에서 4000xg로 원심분리하였다. 농축된 상층액 1.8ml을 20mM 인산염, 40mM NaCl pH7.4에서 평형화한 1ml Gammabind Plus Sepharose(GE Healthcare) 컬럼에 1ml/분으로 가하였다. 컬럼을 20mM 인산염, 40mM NaCl pH7.4로 세척하고, 결합된 물질을 0.1M 글리신/HCl pH2.7로 용리시켰다. 용리 피크를 수집하여, pH를 2M Tris/Hcl pH8.5로 약 pH7로 조정하였다. pH 조정된 용리액을 농축시키고, 10kDa 분자량의 차단막이 있는 Amicon Ultra-15 농축기를 이용하여 20mM 인산염, 150mM NaCl pH7.4로 다이어필터(diafilter)시키고, 스윙 아웃 회전자에서 4000xg로 원심분리하여 약 0.3ml의 최종 부피를 얻었다.
1.4 A26Fab-645 dsFv ( gH1gL1 ) 및 A26Fab-645 dsFv ( gH5gL4 )의 크기 배제 분석
단백질-G로 정제한 시료를 크기 배제 HPLC에 의해 분석하였다. 시료를 1ml/분으로 PBS pH7.4의 등용매 기울기로 전개시킨 Superdex 200 10/300 GL Tricorn 컬럼(GE Healthcare)으로 분리하였다. 피크 검출을 280nm에서 하였고, 겉보기 분자량을 공지된 분자량의 단백질 대 용리 부피의 표준 곡선과 비교하여 계산하였다. 645dsFv의 인간화 이식편을 gH1gL1로부터 gH5gL4로 바꾼 결과, dsFv의 열 안정성(데이터 미도시) 또는 dsFv의 HSA에 대한 결합 친화도(데이터 미도시)의 임의의 변화 없이, 발현된 A26Fab-645dsFv의 단량체 백분율이 59%에서 71%로 12% 증가하였다.
실시예 2
2.1 OX40 과 결합하는 A26 Fab - dsFv (645 gH5gL4 )의 비아코어 ( BIAcore ) 동역학
본 실시예 및 이후의 모든 실시예에서, A26 Fab-dsFv 645gH5gL4는 SEQ ID NO:15(도 3e)로 주어진 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:16(도 3f)으로 주어진 경쇄 서열을 가지고 있었다. 즉, 중쇄는 SEQ ID NO:13(도 3c)으로 주어진 G4S, G4T, G4S 링커를 함유하였다.
BIA(바이오분자 상호 작용 분석)을 BIAcore T200(GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다. F(ab')2 단편 특이적인 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 약 5000 반응 단위(RU)의 포획 수준까지 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 러닝 완충액으로 HBS-EP 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, GE Healthcare)을 10mL/분의 유동 속도로 이용하였다. 고정화된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포획을 위해 0.5mg/mL의 A26 Fab' 또는 1mg/mL A26Fab-dsFv의 10mL 주입을 이용하였다. 30mL/분의 유동 속도로, 다양한 농도(25nM 내지 1.5625nM)에서, 포획된 A26에 대해 인간 OX40을 적정하였다. 10mL/분의 유동 속도로 50mM HCl을 2 x 10mL 주입한 후, 5mM NaOH를 5mL 주입하여, 표면을 재생시켰다. 표준 절차에 따라 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)를 이용하여, 배경 제거 결합 곡선을 분석하였다. 동력학적 매개변수를 적합 알고리즘으로부터 결정하였다.
시료 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) KD(pM)
　 　 　 　 　
Fab 2.18 + 0.38 E+05 1.00 E-05 4.68E-11 46.8
Fab-Fv 2.55 + 0.35 E+05 1.04 E-05 4.12E-11 41.2
Fab' PEG 2.33 + 0.46 E+05 1.12 E-05 4.84E-11 48.4
4개 측정치의 평균
2.2 알부민과 결합하는 A26 Fab - dsFv (645 gH5gL4 )의 비아코어 동역학
BIA(바이오분자 상호 작용 분석)을 BIAcore T200(GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다. F(ab')2 단편 특이적인 Affinipure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch)를 약 5000 반응 단위(RU)의 포획 수준까지 아민 커플링 화학을 통해 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 러닝 완충액으로 HBS-EP 완충액(10mM HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, GE Healthcare)을 10mL/분의 유동 속도로 이용하였다. 고정화된 항-인간 IgG-F(ab')2에 의한 포획을 위해 0.75mg/mL의 Fab-Fv의 10mL 주입을 이용하였다. 30mL/분의 유동 속도로, 다양한 농도(50nM 내지 6.25nM)에서, 포획된 Fab-Fv에 대해, 인간 혈청 알부민(HSA), 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 사이노몰구스 혈청 알부민(CSA)를 적정하였다. 10mL/분의 유동 속도로, 50mM HCl을 2 x 10mL 주입한 후, 5mM NaOH를 5mL 주입하여, 표면을 재생시켰다. 표준 절차에 따라 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)를 이용하여, 배경 제거 결합 곡선을 분석하였다. 동력학적 매개변수를 적합 알고리즘으로부터 결정하였다.
시료 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) KD(nM)
HSA 5.84 E+04 1.63 E-04 2.93E-09 2.93
MSA 8.86 E+04 3.68 E-04 4.16E-09 4.16
CSA 7.1 E+04 1.89 E-04 2.66E-09 2.66
3개 측정치의 평균
2.3 A26 Fab - dsFv (645 gH5gL4 )의 OX40 및 알부민과의 동시 결합 입증
인간 OX40과 인간 혈청 알부민의 A26 Fab-dsFv에 대한 동시적인 결합을 평가하였다. A26 Fab-dsFv 알부민 결합에 대한 비아코어 동력학 방법에서 언급한 바와 같이, A26 Fab-dsFv 구성체를 센서 칩 표면에 포획하였다. 50nM HAS, 25nM OX40 또는 50nM HSA과 25nM OX40의 최종 농도의 혼합 용액을 포획된 A26 Fab-dsFv에 개별적으로 적정하였다. 조합한 HSA/OX40 용액에 대한 결합 반응은 독립적인 주입의 반응의 합과 동일하였다. 이로써 Fab-dsFv가 인간 OX40과 HSA에 동시에 결합할 수 있음을 확인할 수 있다.
시료 분석물질 결합( RU )
A26 Fab-Fv hOX40 25
HSA 9
hOX40 + HSA 35 (34)
2.4 A26 Fab - dsFv (645 gH5gL4 )의 세포 기반 친화도
방법:
인간 활성화 CD4 + OX40 + T 세포에 대한 A26 Fab - Fv 결합
PBMC를 피콜 구배 분리법에 의해 분리하고, 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 3일 동안 4?/mL PHA-L로 활성화시켰다. CD4+ T 세포는 자성 비즈를 이용하는 음성 선택법에 의해 분리하였다(인간용 CD4+ T 세포 분리 키트 II; Miltenyi Biotec). 대략 1 x 105개의 세포를 Facs 완충액(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3) 또는 5% HSA가 보충된 Facs 완충액 내의 항체 존재 하에 4℃에서 항온배양하였다. 항체의 최종 농도는 48nM~0.0005nM 범위였다. 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 유동 세포 계수법으로 분석하기 전에 PBS로 세척하였다. 두 가지 완충액 조건, A26 Fab-dsFv를 이용한 조건과 비 특이적인 결합을 확인하기 위한, 무관한 대조군 Fab-Fv를 이용한 두 번째 조건에서 두 가지 적정 데이터 세트를 산출하였다. 상이하지만, 공지된 양의 형광 염료로 이루어진 비즈를 이용하여 생성한 표준 곡선으로부터 내삽한 값을 이용하여 결합된 항체의 몰 수를 계산하였다. 기하학적 평균 형광 값을 세포와 비즈의 유동 세포 계수 분석법으로 측정하였다. KD를 측정하기 위하여, A26 Fab-dsFv 값으로부터 비 특이적인 결합을 제하고, 그렇게 하여 생성된 특이적 결합 곡선을 1자리 결합 방정식(Graphpad Prism®)을 이용하여 비선형 회귀로 분석하였다.
항원을 발현시킨 세포 표면에 대한 A26 Fab-dsFv의 친화도를 확인하기 위하여, 활성화 CD4+OX40+ T 세포 및 알렉사플루오르 488이 표지된 A26 Fab-dsFv를 이용하여 포화 결합 실험을 수행하였다. KD를 측정하기 위하여 항체 농도 범위에 걸쳐 평형 상태에서의 수용체에 대한 항체의 특이적인 결합을 이용하여, 항체의 매우 적은 부분만이 결합 곡선의 임의의 점에서 수용체에 결합됨을 추정하였다.
평형 결합은 다음의 식을 이용하여 설명된다:
kon
수용체유리 + 항체유리
Figure pct00001
수용체-항체
koff
항체와 수용체의 결합 속도 = kon x [수용체유리] x [항체유리]
수용체-항체 복합체의 해리 속도 = koff x [수용체-항체]
평형에서, 결합 및 해리 속도는 동일하고, 결합 등온선을 기술하는 식을 유도할 수 있다. 반로그 도표에서 결합은 S자형이다. KD는 koff / kon으로 정의되고, 반 최대 결합이 발생하는 농도로 결합 곡선으로부터 계산할 수 있다.
활성화 인간 CD4+OX40+ T 세포에 대한 알렉사플루오르 488이 표지된 A26 Fab-Fv의 결합을 5-로그 농도 범위에 걸쳐 유동 세포 계수법으로 측정하였다.
A26 Fab-Fv에 대한 대표적인 결합 곡선을 도 9a에 나타내었다.
상이한 네(4) 도너로부터의 활성화된 세포에서 얻어진 평균 KD 값은 145pM이다.
A26 Fab, A26 Fab-Fv 및 A26 Fab-PEG에 대한 비교 결합 곡선을 도 9b에 나타내었다.
그래프는 상이한 도너를 각 실험에 이용한 4개 또는 5개 실험의 평균을 나타낸다.
PBMC를 피콜 구배 분리법에 의해 분리하고, 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 3일 동안 4?/mL PHA-L로 활성화시켰다. 이에 이어, CD4+ T 세포는 자성 비즈를 이용하는 음성 선택법에 의해 분리하였다(인간용 CD4+ T 세포 분리 키트 II; Miltenyi Biotec). 대략 1 x 105개의 세포를 Facs 완충액(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3) 또는 5% HSA가 보충된 Facs 완충액 내의 항체 존재 하에 4℃에서 항온배양하였다. 항체의 최종 농도는 48nM~0.0005nM 범위였다. 세포를 FACScalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 유동 세포 계수법으로 분석하기 전에 PBS로 세척하였다. 또한, 비 특이적인 결합을 확인하기 위하여, 각각의 A26 포맷에 대한 이소형 대조군 항체에 대하여 적정 데이터 세트를 산출하였다. 상이하지만, 공지된 양의 형광 염료로 이루어진 비즈를 이용하여 생성한 표준 곡선으로부터 내삽한 값을 이용하여 결합된 항체의 몰 수를 계산하였다. 기하학적 평균 형광 값을 세포와 비즈의 유동 세포 계수 분석법으로 측정하였다. KD를 측정하기 위하여, A26 Fab-dsFv 값으로부터 비 특이적인 결합을 제하고, 그렇게 하여 생성된 특이적 결합 곡선을 1자리 결합 방정식(Graphpad Prism®)을 이용하여 비선형 회귀로 분석하였다.
인간 세포 친화도 분석에서의 A26 항체에 대한 평균 K D 값
항체 포맷 세포 친화도
HSA
KD(nM) ± S.E.M		 세포 친화도
무 HSA
KD (nM) ±S.E.M
A26 Fab - Fv ( n=5 ) 0.145 ±0.019 0.096 ± 0.017
A26 Fab' PEG (n=4) 0.230 ± 0.057 0.322 ± 0.089
A26 Fab' (n=4) 0.068 ± 0.011 0.085 ± 0.031
실시예 3: A26 Fab - Fv 는 유럽 집먼지진드기 알레르기 추출물에 노출된 PBMC 로부터의 사이토카인 생성을 조절한다
알레르기 지원자로부터 PBMC를 피콜 구배 분리법에 의해 분리하였다. 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 최종 부피 200μＬ의 시험 항체(농도 범위 50μg/mL 내지 0.0005μg/mL)의 존재 하에 정제된 PBMC를 25μg/mL 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물에 노출시켰다. 37℃C, 5% CO2, 100% 습도에서의 6일 항온배양 후, 상층액을 수확하여, MSD로 IL-13 함량을 분석하였다. 도 10a의 그래프는 네 도너로부터 하나의 대표적인 도너의 대표적인 데이터를 나타내며, IL-13 생성 억제에 대한 평균 EC50은 0.87nM이었다(0.6nM 내지 1.07nM 범위),
Figure pct00002
A26 Fab - Fv 는 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물을 이용한 2차 항원 재자극 후, 활성화된 ( CD25 + ) CD4 + T 세포의 백분율을 감소시킨다
무 항체 또는 10μg/ml의 A26 Fab' PEG, A26 Fab-Fv 또는 대조군 Fab' (A33 Fab')의 존재 하에 알레르기 도너의 CD4+ T 세포를 25?/ml 유럽 집먼지 진드기 알레르기 추출물(Greer)과 자가 APC와 함께 7일 동안 시험관 내에서 자극시켰다. 세포를 세척하고 3일 동안 휴지시킨 다음, 이전과 같이 유럽 집먼지 진드기 추출물로 재자극시켰다(도 13). 3일 후, 세포를 세척하고 표면 CD3, CD4 및 CD25에 대해 형광으로 염색시켰다. 그런 다음, 세포를 FACS Canto 유동 세포 계수기(BD)로 유동 세포 계수법에 의해 분석하였다. 분석하기 전에 세포를 살아있는 림프구와 CD3+CD4+ 발현 시 게이팅하였다. 데이터는 평균을 포함하는 n = 3의 도너를 나타낸다. n.s, 대조군 Fab'와 비교할 때의 A26 Fab-Fv(대응표본, 양측 T 검정을 이용하여 측정한 유의성).
실시예 4: A26 Fab - Fv 는 Hu - NSG 마우스 모델에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 증식을 억제한다
복강 내로 1 x 107개 인간 PBMC를 전달하기 하루 전에 마우스를 0.03, 0.3, 3 또는 30mg/kg의 A26 Fab-Fv를 피하로 투여하였다. 14일 후, 마우스를 말단 미학(terminal aesthetic) 하에 심장 천자로 채혈한 다음, 경추 탈구로 희생시켰다. 그런 다음, 혈액 내의 인간 CD4+ 및 CD8+ 세포의 수를 FACS 분석법으로 확인하였다(도 10b). 데이터(n=10)는 평균 ± SEM으로 나타내었고, 통계적 분석은 본페로니 사후 검정과 함께 일원분산분석으로 하였다. 값은 % 억제 + SEM를 나타낸다.
결과를 도 14에 나타내었다.
Hu-NSG 모델은 A26 Fab-Fv가 생체 내에서 인간 T 세포 증식을 완전히 억제하고, T 세포가 매개하는 병리학의 억제에 대한 실현 가능한 치료 후보로 A26 Fab-Fv을 지지함을 증명하였다. 또한, Fab-Fv 포맷은 Fab' PEG 포맷보다 더 낮은 용량에서 더 큰 효능을 부여하였다. 도너 T 세포의 이러한 이종 증식성 반응의 감소는 A26 Fab-Fv가 이식편 대 숙주 질병에 대한 실현 가능한 치료제가 될 수 있다는 뒷받침 증거를 제공할 수 있다.
실시예 5: 리간드 차단 능력
유동 세포 계수법을 기초로 한 리간드 차단 분석법을 이용하여 세포 표면 발현된 OX40과 재조합 OX40L 사이의 상호 작용을 차단하는 A26 Fab-dsFv의 능력을 측정하였다. 간단히 말하자면, 활성화된 인간 CD4+OX40+ T 세포를 A26 Fab-Fv의 적정과 함께 사전 배양하였다. 재조합 OX40L을 이후에 세포에 첨가하고, A26 Fab-dsFv의 존재 하에 결합하도록 하였다. 그런 다음, 결합된 OX40L의 비율을 표지된 2차 시약을 이용하여 유동 세포 계수법으로 검출하였다. 도 11은 3개의 개별적인 도너로부터의 조합된 데이터를 나타내는 억제 곡선을 보여주며, A26 Fab-dsFv가 OX40L 결합을 완전히 차단할 수 있음을 증명한다. 재조합 OX40L 결합 억제에 대한 평균 IC50은 0.44nM이었다(n = 3의 도너).
방법: 인간 활성화 CD4 + OX40 + T 세포에 대한 OX40L 결합의 A26 Fab - Fv 에 의한 억제
PBMC를 피콜 구배 분리법에 의해 분리하고, 37℃, 5% CO2, 100% 습도에서 3일 동안 4?/mL PHA-L(Sigma)로 활성화시켰다. 그런 다음, CD4+ T 세포는 MACS 컬럼을 이용하는 음성 선택법에 의해 배양물로부터 정제하였다(Miltenyi Biotech, CD4+ T 세포 분리 키트 II). 2 x 105개의 CD4+ T 세포를 A26 Fab-dsFv(최종 농도 범위 10?/mL ~ 0.000056?/mL(136.6nM ~ 0.000765nM)) 존재 하에 4℃에서 30분 동안 항온배양하였다. OX40L(비오틴이 부착된 CD252 muCD8, Ancell)을 2?/mL의 최종 농도로 첨가하고, 추가적으로 30분 동안 4℃에서 항온배양하였다. 세포를 세척하고, FACS Canto(Becton Dickinson)를 이용하는 유동 세포 계수법에 의한 분석 전에 PE가 표지된 스트렙타아비딘(Jackson Immunoresearch)과 함께 배양하여 OX40L 결합을 검출하였다. 대응되는 비-OX40과 결합하는 Fab-dsFv를 대조군으로 이용하였다. IC50을 결정하고자 비 선형 회귀(Graphpad Prism®에 의해 억제 곡선을 분석하였다. 개별적인 세 도너로부터 조합한 데이터를 나타내는 억제 곡선을 도 11에 나타내었으며, 이때, 데이터의 점들은 평균을 나타내고, 오차 바는 SEM을 나타낸다.
OX40에 대한 재조합 OX40L 결합의 A26 Fab-Fv에 의한 억제에 대한 평균 EC50은 0.445nM이었다. 대조적으로, A26 Fab' PEG은 리간드 차단에서 약간 덜 강력하였지만(EC50 = 0.739 nM), A26 Fab'은 아래에 나타난 바와 같이 Fab-Fv보다 미미하게 더 큰 효능을 나타냈다(EC50 = 0.242 nM).
인간 활성화 CD4 + OX40 + T 세포에 대한 OX40L 결합의 A26 항체에 의한 억제에 대한 EC 50 값
항체 포맷 EC 50 리간드 차단(nM)
평균 ±S.E.M.
A26 Fab - Fv (n = 3) 0.445 ±0.110
A26 Fab' PEG ( n = 3) 0.739 ±0.166
A26 Fab' ( n = 3) 0.242 ±0.069
Graphpad Prism® 소프트웨어를 이용한 비 선형 회귀에 의해 개별적인 도너의 억제 곡선으로부터 EC 50 값을 계산하였다
실시예 6: 시험관 내 분석법에서 기능적인 인간에서의 A26 Fab - Fv 의 효과
OX40-OX40L에 의존적인 세포 상호 작용에 미치는 A26 Fab-Fv의 영향을 항원 추진 인간 림프구 분석의 범위에서 평가하였다. 생체 내에서 발생할 것으로 예상되는 Fv 부위의 알부민 결합 자리의 포화를 확실히 하고자, 5% 인간 혈청의 존재 하에 이러한 분석을 수행하였다.
A26 Fab - Fv 는 혼합 림프구 반응을 억제한다
일방적인 동종 이계의 혼합 림프구 반응(MLR)은 동종 반응성 T 세포 활성화 및 증식의 시험관 내 모델이다(Bach et al., 1964, O?laherty et al., 2000). 관련되지 않은 도너 자극자 PBMC 상의 동종 이계 MHC 항원 인식을 통해 도너 T 세포를 활성화시키고, 그 결과, 세포 증식 및 사이토카인 생산을 가져온다(Lukacs et al., 1993). T 림프구 동종 반응은 동종 이계 MHC 항원 및 결합된 펩티드에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다(Sherman et al., 1993). MLR 반응의 규모는 반응자-자극자 쌍 사이의 오대응의 정도와 관련이 있다(Forrester et al., 2004). MLR 반응은 반응하는 도너의 세포 증식 및 Th1(IL-2, IFN-γ 및 TNF-α)과 Th2(IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13) T 세포 유래 사이토카인의 생산을 가져온다. MLR의 정확한 사이토카인 프로파일은 반응자-자극자 짝지음에 대해 특이적이라고 여겨진다(Jordan et al., 2002). MLR 분석법은 T 세포 활성화 경로 연구, 면역 억제제 스크리닝 및 이식 받은 자에서 가능한 도너 장기 거부 예측을 위한 연구에 널리 이용되고 있다(Bromelow et al., 2001).
시험관 내 인간 동종 반응성 T 세포 활성화 및 증식에 미치는 A26 Fab-Fv의 영향은 O' Flaherty et al., 2000에 의해 기술된 바와 같이 기본적으로 MLR 분석법을 이용하여 조사하였다. A26 Fab-Fv, A26 Fab' 또는 A26 Fab' PEG의 존재 또는 부재 하에서 두 명의 관련 없는 도너로부터의 PBMC를 공동 배양하고, 세포 증식을 3H-티미딘 도입에 의해 측정하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, A26 Fab-Fv는 0.56nM(40.9ng/mL)의 EC50 값과 55%의 최대 억제(n = 3의 도너 짝지음)로 농도 의존적인 방식으로 세포 증식을 억제하였다. 표 7에서 보는 바와 같이, A26 Fab-Fv는 0.88nM의 EC50 값을 나타냈던 A26 Fab?EG보다 약간 더 강력했으며, A26 Fab' 는 0.25nM의 EC50 값을 나타냈다.
두 명의 관련 없는 도너로부터의 인간 PMBC를 전혈로부터 분리하였다. 자극자 집단을 발생시키기 위하여 한 도너로부터의 세포를 γ-조사에 의해 불활성화시켰다. 나머지 도너로부터의 세포는 반응자 집단을 형성하였다. 자극자와 반응자 집단을 1:1 비율(1x105개 세포/도너)로 혼합하고, A26 Fab', A26 Fab-Fv 또는 A26 Fab' PEG(0.4ng~25μg/mL)의 존재 하에 6일 동안 배양하였다. 내부 시약인 CA162-01297.1 Fab-Fv를 이소형 대응 대조군으로 이용하였다. 3H-티미딘 도입(0.5μCi/웰)에 의해 6일째에 세포 증식을 측정하였다. 데이터를 생물학적 작용제 부재 하의 반응자 더하기 자극자 반응에 대한 억제 백분율로 표시하였으며, 세 도너 짝지음으로부터 조합한 데이터이다. EC50 값은 Graphpad Prism® 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
인간 MLR 증식 반응의 A26 항체에 의한 억제에 대한 EC50 값
항체 포맷 EC 50 (nM)
평균 ± S.E.M.
A26 Fab - Fv (n = 3) 0.56 ±0.12
A26 Fab' PEG ( n = 3) 0.88 ± 0.44
A26 Fab' ( n = 3) 0.25 ±0.06
또한, 사이토카인 생산에 미치는 A26 Fab-Fv의 영향을 조사하기 위하여 인간 MLR으로부터의 상층액을 분석하였다. 도 5.4에 나타난 바와 같이, A26 Fab-Fv는 MLR에서 IFN-γ의 생산을 평균 81%로 상당히 억제하였다(n = 3의 도너 짝지음).
두 명의 관련 없는 도너로부터의 인간 PMBC를 전혈로부터 분리하였다. 자극자 집단을 발생시키기 위하여 한 도너로부터의 세포를 γ-조사에 의해 불활성화시켰다. 나머지 도너로부터의 세포는 반응자 집단을 형성하였다. 자극자와 반응자 집단을 1:1 비율(1x105개 세포/도너)로 혼합하고, 25μg/ml의 A26 Fab', A26 Fab-Fv 또는 A26 Fab-Fv 또는 대조군(A33 Fab' 또는 CA162.01297.1)의 존재 하에 6일 동안 배양하였다. 상층액을 수확하고, MSD 분석법을 이용하여 IFN-γ 함량을 분석하였다. 무 항체와 함께 배양한 세포와 비교하여 억제 퍼센트를 계산하였다. 그래프는 세 명의 도너로부터 수집된 데이터를 나타낸다(평균 ± S.E.M). ** = p<0.01; 대조군 Fab-Fv와 비교한 A26 Fab-Fv(대응표본, 양측 T 검정을 이용하여 측정한 유의성).
실시예 7: 인간 MLR 에서 NK 세포에 대한 A26 Fab - Fv 결합
MLR에서 NK 세포 분열에 미치는 A26 Fab-Fv의 영향을 조사하였다. T 림프구 동종 반응성은 혼합 림프구 반응을 추진하며, A26 Fab-Fv는 이러한 시스템에서 T 세포 분열과 IFNγ 생산을 극심하게 억제한다. 또한, NK 세포 분열의 억제는 IFN 생산 감소의 원인이 될 수 있다. CFSE로 표지된 반응자 세포를 이용하여, 분열하는 집단의 FACS 분석에 의하여 NK 세포 분열의 억제를 증명하였다(도 5.6). 세포 분열의 두 가지 상이한 척도가 나타났다. 분열 지수는 본래 집단의 세포가 겪었던 평균 세포 분열의 수를 나타내며, 분열되지 않은 세포들을 포함한다. A26 Fab-Fv는 분열 지수를 감소시켜, 집단에서 더 적은 수의 세포들이 분열에 집중하고 있음을 나타냈다. 이러한 효과는 아마도 OX40을 발현시키는 NK 세포에 의해 매개된다. 증식 지수는 반응하는 집단만의 증식을 반영하며, 이러한 척도를 이용한 A26 Fab-Fv의 억제 효과는 상대적으로 감소되었다.
실시예 8: 인간 시험관 내 분석법에서 A26 Fab - Fv 에 대한 평균 K D / EC 50 값
결합 / 기능적 분석 평균 K D / EC 50 (nM)
± S.E.M. 		평균 K D / EC 50 (μg/mL)
친화도 (n = 5) 0.145 ±0.019 0.011
OX40L 차단 (n = 3) 0.445 ±0.110 0.033
혼합 림프구 반응 -
증식 억제 (n = 3)		 0.558 ±0.121 0.041
집먼지 진드기 -
IL-13 생산의 억제 (n = 4)		 0.865 ±0.112 0.063
물론, 본 발명은 예시로서만 기술되었으며, 어떠한 방식으로든 제한하고자 한 것이 아니며, 이하의 특허청구범위의 범위 내에서 세부 사항의 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 각 구현예의 바람직한 특징들은 기타 구현예 각각에 대해 필요한 부분만 약간 수정된 것이다. 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나, 이에 한정되지 않는 모든 출판물은 각각의 개별적인 출판물이 전체가 기재된 것처럼 참조로서 통합되도록, 구체적으로 그리고 개별적으로 명시된 것처럼 본원에 참조로 통합된다.
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230 235 240 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 245 250 255 Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn Trp 260 265 270 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile Trp 275 280 285 Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr 290 295 300 Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 305 310 315 320 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr 325 330 335 Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 340 345 350 Val Ser Ser 355 <210> 20 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A26 Fab Light-(3xG4S)-645dsFv(gL1) <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Ser Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ser Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 225 230 235 240 Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser 245 250 255 Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 260 265 270 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly 275 280 285 Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 290 295 300 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly 305 310 315 320 Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys 325 330 335 Val Glu Ile Lys 340 <210> 21 <211> 1137 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) including E.coli OmpA leader <400> 21 atgaagaaga ctgctatagc gatcgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60 gctgaagttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt 120 ctctcttgtg cagcaagcgg tttcacgttc accaactacg gtatccactg gattcgtcag 180 gcaccaggta aaggtctgga atgggtagcc tctatctctc cgtctggtgg tctgacgtac 240 taccgtgact ctgtcaaagg tcgtttcacc atctctcgtg atgacgcgaa aaactctccg 300 tacctgcaaa tgaactctct gcgtgcagaa gataccgcag tgtactactg cgctactggt 360 ggtgaaggta tcttcgacta ctggggtcag ggtaccctgg taactgtctc gagcgcttct 420 acaaagggcc caagcgtttt cccactggct ccgtcctcta aatccacctc tggtggtacg 480 gctgcactgg gttgcctggt gaaagactac ttcccagaac cagttaccgt gtcttggaac 540 tctggtgcac tgacctctgg tgttcacacc tttccagcag ttctccagtc ttctggtctg 600 tactccctgt ctagcgtggt taccgttccg tcttcttctc tgggtactca gacctacatc 660 tgcaacgtca accacaaacc gtccaacacc aaggtcgaca aaaaagtcga gccgaaatcc 720 tgtagtggag gtgggggctc aggtggaggc gggaccggtg gaggtggcag cgaggttcaa 780 ctgcttgagt ctggaggagg cctagtccag cctggaggga gcctgcgtct ctcttgtgca 840 gtaagcggca tcgacctgag caattacgcc atcaactggg tgagacaagc tccggggaag 900 tgtttagaat ggatcggtat aatatgggcc agtgggacga ccttttatgc tacatgggcg 960 aaaggaaggt ttacaattag ccgggacaat agcaaaaaca ccgtgtatct ccaaatgaac 1020 tccttgcgag cagaggacac ggcggtgtac tattgtgctc gcactgtccc aggttatagc 1080 actgcaccct acttcgatct gtggggacaa gggaccctgg tgactgtttc aagttaa 1137 <210> 22 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) <400> 22 gaagttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120 ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcaaatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcgag cgcttctaca 360 aagggcccaa gcgttttccc actggctccg tcctctaaat ccacctctgg tggtacggct 420 gcactgggtt gcctggtgaa agactacttc ccagaaccag ttaccgtgtc ttggaactct 480 ggtgcactga cctctggtgt tcacaccttt ccagcagttc tccagtcttc tggtctgtac 540 tccctgtcta gcgtggttac cgttccgtct tcttctctgg gtactcagac ctacatctgc 600 aacgtcaacc acaaaccgtc caacaccaag gtcgacaaaa aagtcgagcc gaaatcctgt 660 agtggaggtg ggggctcagg tggaggcggg accggtggag gtggcagcga ggttcaactg 720 cttgagtctg gaggaggcct agtccagcct ggagggagcc tgcgtctctc ttgtgcagta 780 agcggcatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaagctcc ggggaagtgt 840 ttagaatgga tcggtataat atgggccagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaaa 900 ggaaggttta caattagccg ggacaatagc aaaaacaccg tgtatctcca aatgaactcc 960 ttgcgagcag aggacacggc ggtgtactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020 gcaccctact tcgatctgtg gggacaaggg accctggtga ctgtttcaag ttaa 1074 <210> 23 <211> 1089 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain A26-645(gL4) including E.coli OmpA leader <400> 23 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gcgttggctg gtttcgcgac cgttgcgcaa 60 gctgatatcc agatgaccca gagcccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg 120 actattacct gtcgtgcaac ccagagcatc tacaacgctc tggcttggta tcagcagaaa 180 ccgggtaaag cgccaaaact cctgatctac aacgcgaaca ctctgcatac tggtgttccg 240 tctcgtttct ctgcgtctgg ttctggtacg gactctactc tgaccatctc ctctctccag 300 ccggaagatt tcgcgaccta ctactgccag cagtactacg attacccact gacgtttggt 360 ggtggtacca aagttgagat caaacgtacg gttgcagctc catccgtctt catctttcca 420 ccgtctgacg aacagctcaa atctggtact gcttctgtcg tttgcctcct gaacaacttc 480 tatccgcgtg aagcgaaagt ccagtggaaa gtcgacaacg cactccagtc tggtaactct 540 caggaatctg tgaccgaaca ggactccaaa gactccacct actctctgtc tagcaccctg 600 actctgtcca aagcagacta cgagaaacac aaagtgtacg cttgcgaagt tacccatcag 660 ggtctgagct ctccggttac caaatccttt aatagagggg agtgtggtgg cggtggcagt 720 ggtggtggag gttccggagg tggcggttca gacatacaaa tgacccagag tccttcatcg 780 gtatccgcgt ccgttggcga tagggtgact attacatgtc aaagctctcc tagcgtctgg 840 agcaattttc tatcctggta tcaacagaaa ccggggaagg ctccaaaact tctgatttat 900 gaagcctcga aactcaccag tggagttccg tcaagattca gtggctctgg atcagggaca 960 gacttcacgt tgacaatcag ttcgctgcaa ccagaggact ttgcgaccta ctattgtggt 1020 ggaggttaca gtagcataag tgatacgaca tttgggtgcg gtactaaggt ggaaatcaaa 1080 cgtacctaa 1089 <210> 24 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain A26-645(gL4) <400> 24 gatatccaga tgacccagag cccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcatactgg tgttccgtct 180 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctccagccg 240 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtt gcagctccat ccgtcttcat ctttccaccg 360 tctgacgaac agctcaaatc tggtactgct tctgtcgttt gcctcctgaa caacttctat 420 ccgcgtgaag cgaaagtcca gtggaaagtc gacaacgcac tccagtctgg taactctcag 480 gaatctgtga ccgaacagga ctccaaagac tccacctact ctctgtctag caccctgact 540 ctgtccaaag cagactacga gaaacacaaa gtgtacgctt gcgaagttac ccatcagggt 600 ctgagctctc cggttaccaa atcctttaat agaggggagt gtggtggcgg tggcagtggt 660 ggtggaggtt ccggaggtgg cggttcagac atacaaatga cccagagtcc ttcatcggta 720 tccgcgtccg ttggcgatag ggtgactatt acatgtcaaa gctctcctag cgtctggagc 780 aattttctat cctggtatca acagaaaccg gggaaggctc caaaacttct gatttatgaa 840 gcctcgaaac tcaccagtgg agttccgtca agattcagtg gctctggatc agggacagac 900 ttcacgttga caatcagttc gctgcaacca gaggactttg cgacctacta ttgtggtgga 960 ggttacagta gcataagtga tacgacattt gggtgcggta ctaaggtgga aatcaaacgt 1020 acctaa 1026 <210> 25 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) including B72.3 leader sequence <400> 25 atggaatggt cctgggtctt cctgtttttc ctttctgtca caaccggggt gcacagcgag 60 gtgcagctcg tcgagtctgg aggcgggctt gtccagcctg gagggagcct gcgtctctct 120 tgtgcagcaa gcggtttcac gttcaccaac tacggtatcc actggattcg tcaggcacca 180 ggtaaaggtc tggaatgggt agcctctatc tctccgtctg gtggtctgac gtactaccgt 240 gactctgtca aaggtcgttt caccatctct cgtgatgacg cgaaaaactc tccgtacctg 300 cagatgaact ctctgcgtgc agaagatacc gcagtgtact actgcgctac tggtggtgaa 360 ggtatcttcg actactgggg tcagggtacc ctggtaactg tctcaagcgc ttctacaaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctctgg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgttcc 720 ggaggtggcg gttccggagg tggcggtacc ggtggcggtg gatccgaagt ccagctgctt 780 gaatccggag gcggactcgt gcagcccgga ggcagtcttc gcttgtcctg cgctgtatct 840 ggaatcgacc tgagcaatta cgccatcaac tgggtgagac aggcacctgg gaaatgcctc 900 gaatggatcg gcattatatg ggctagtggg acgacctttt atgctacatg ggcgaagggt 960 agattcacaa tctcacggga taatagtaag aacacagtgt acctgcagat gaactccctg 1020 cgagcagagg ataccgccgt ttactattgt gctcgcactg tcccaggtta tagcactgca 1080 ccctactttg atctgtgggg gcagggcact ctggtcaccg tctcgagttg a 1131 <210> 26 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Heavy chain A26-645(gH5) <400> 26 gaggtgcagc tcgtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag caagcggttt cacgttcacc aactacggta tccactggat tcgtcaggca 120 ccaggtaaag gtctggaatg ggtagcctct atctctccgt ctggtggtct gacgtactac 180 cgtgactctg tcaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgatg acgcgaaaaa ctctccgtac 240 ctgcagatga actctctgcg tgcagaagat accgcagtgt actactgcgc tactggtggt 300 gaaggtatct tcgactactg gggtcagggt accctggtaa ctgtctcaag cgcttctaca 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc tggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 tccggaggtg gcggttccgg aggtggcggt accggtggcg gtggatccga agtccagctg 720 cttgaatccg gaggcggact cgtgcagccc ggaggcagtc ttcgcttgtc ctgcgctgta 780 tctggaatcg acctgagcaa ttacgccatc aactgggtga gacaggcacc tgggaaatgc 840 ctcgaatgga tcggcattat atgggctagt gggacgacct tttatgctac atgggcgaag 900 ggtagattca caatctcacg ggataatagt aagaacacag tgtacctgca gatgaactcc 960 ctgcgagcag aggataccgc cgtttactat tgtgctcgca ctgtcccagg ttatagcact 1020 gcaccctact ttgatctgtg ggggcagggc actctggtca ccgtctcgag ttga 1074 <210> 27 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain A26-645(gL4) including B72.3 leader sequence <400> 27 atgtcagttc ccacacaggt gctgggcctg cttctgttgt ggctcaccga tgctaggtgt 60 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 120 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 180 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 240 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 300 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 360 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 420 tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 540 gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 600 ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 660 ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 720 ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 780 agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 840 aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 900 gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 960 tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 1020 ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1080 acctga 1086 <210> 28 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Light chain A26-645(gL4) <400> 28 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gtgcaaccca gagcatctac aacgctctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtaaagcgc caaaactcct gatctacaac gcgaacactc tgcataccgg tgttccgtct 180 cgtttctctg cgtctggttc tggtacggac tctactctga ccatctcctc tctgcagccg 240 gaagatttcg cgacctacta ctgccagcag tactacgatt acccactgac gtttggtggt 300 ggtaccaaag ttgagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccccca 360 tctgatgagc agttgaagtc tggcactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctac 420 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc ttcaatccgg aaactcccag 480 gagagtgtca ctgagcagga ctcaaaggac tccacctata gccttagcag cacactgaca 540 ctgagcaagg ctgactacga gaaacacaag gtctacgcct gcgaagtgac acatcaaggc 600 ctgagctcac ccgtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc 660 ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta 720 agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc 780 aattttctat cctggtacca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa 840 gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac 900 tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga 960 ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt 1020 acctga 1026

Claims (20)

  1. N 말단으로부터 차례대로 제1 중쇄 가변 도메인(VH1), CH1 도메인 및 제2 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 중쇄,
    N 말단으로부터 차례대로 제1 경쇄 가변 도메인(VL1), CL 도메인 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 경쇄를 포함하는,
    인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질로서,
    이때, 상기 중쇄 및 경쇄는 VH1 및 VL1이 제1 항원 결합 자리를 형성하고, VH2 및 VL2가 제2 항원 결합 자리를 형성하도록 정렬되고,
    제1 항원 결합 자리에 의해 결합된 항원은 인간 OX40이고, 제2 항원 결합 자리에 의해 결합된 항원은 인간 혈청 알부민이고,
    중쇄의 제1 가변 도메인(VH1)은 CDR-H1에 대해 SEQ ID NO:1로 주어진 서열, CDR-H2에 대해 SEQ ID NO:2로 주어진 서열 및 CDR-H3에 대해 SEQ ID NO:3으로 주어진 서열을 포함하고, 경쇄의 제1 가변 도메인(VL1)은 CDR-L1에 대해 SEQ ID NO:4로 주어진 서열, CDR-L2에 대해 SEQ ID NO:5로 주어진 서열 및 CDR-L3에 대해 SEQ ID NO:6으로 주어진 서열을 포함하며,
    제2 중쇄 가변 도메인(VH2)은 SEQ ID NO:11로 주어진 서열을 나타내고, 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 SEQ ID NO:12로 주어진 서열을 나타내고,
    제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 경쇄 가변 도메인(VL2)은 이황화 결합으로 연결되는 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, OX40의 OX40L에 대한 결합에 반대로 작용하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CH1 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인(VH2) 사이에 펩티드 링커가 있는 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CL 도메인과 제2 경쇄 가변 도메인(VL1) 사이에 펩티드 링커가 있는 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄 가변 도메인(VH1)은 SEQ ID NO:8로 주어진 서열을 포함하는 항체 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 경쇄 가변 도메인 (VL1)은 SEQ ID NO:7로 주어진 서열을 포함하는 항체 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄는 SEQ ID NO:15로 주어진 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 이루어지는 항체 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄는 SEQ ID NO:16으로 주어진 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 이루어지는 항체 융합 단백질.
  9. SEQ ID NO:15로 주어진 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:16으로 주어진 서열을 포함하는 경쇄를 가지고 있는, 인간 OX40 및 인간 혈청 알부민과 결합하는 이중 특이적인 항체 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 융합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 암호화하는 분리된 DNA 서열.
  11. 제10항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:24로 주어진 서열들을 포함하는 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 융합 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 융합 단백질의 생산방법.
  15. 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합하여, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적인 항체 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 기타 활성 성분을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
  17. 치료용의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적인 항체 융합 단백질 또는 제15항 또는 제16항에 따른 약학적 조성물.
  18. OX40에 의해 매개되거나 OX40의 증가된 수준과 관련이 있는 병리학적 장애의 치료 또는 예방에 이용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적인 항체 융합 단백질 또는 제15항 또는 제16항에 따른 약학적 조성물.
  19. OX40에 의해 매개되거나 OX40의 증가된 수준과 관련이 있는 병리학적 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이적인 항체 융합 단백질의 용도.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 병리학적 장애는 알레르기, 만성 폐쇄성 폐질환, 자가 면역 질병, 류마티스 관절염, 천식, 이식편 대 숙주 질병, 크론병, 궤양성 대장염, 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 신장염, 중증 근무력증, 그레이브병, 이식 거부 반응, 베게너 육아종증, 헤노흐 쇤라인 자반병, 전신성 경화증 및 바이러스에 의한 폐 염증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질병인 용도.
KR1020147015520A 2011-11-11 2012-11-09 인간 ox40에 대해 특이성을 나타내는 항체 분자 KR102071054B1 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170139131A (ko) * 2015-04-22 2017-12-18 유씨비 바이오파마 에스피알엘 단백질 정제 방법

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5782385B2 (ja) * 2009-02-17 2015-09-24 ユーシービー ファーマ ソシエテ アノニム ヒトｏｘ４０に対する特異性を有する抗体分子
EP2475682B1 (en) * 2009-09-10 2018-01-31 UCB Biopharma SPRL Multivalent antibodies
PT2609118T (pt) 2010-08-23 2017-03-22 Univ Texas Anticorpos anti-ox40 e métodos de utilização dos mesmos
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
EP2758432B1 (en) * 2011-09-16 2019-03-06 UCB Biopharma SPRL Neutralising antibodies to the major exotoxins tcda and tcdb of clostridium difficile
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
BR112015023862A2 (pt) 2013-03-18 2017-10-24 Biocerox Prod Bv anticorpo isolado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, célula hospedeira, método de realçar uma resposta imune, método de tratar câncer, composição farmacêutica, e, anticorpo agonístico isolado
WO2015041515A1 (en) 2013-09-19 2015-03-26 N.V. Nutricia Improved process for the humanization of animal skim milk
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
DE112016001013T5 (de) 2015-03-03 2017-12-21 Kymab Limited Antikörper, verwendungen und verfahren
WO2016145085A2 (en) 2015-03-09 2016-09-15 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506869D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
MA42043A (fr) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc Anticorps anti-ox40 et procédés d'utilisation de ceux-ci
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EP3356403A2 (en) * 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
CN114380908B (zh) * 2015-10-15 2023-03-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
CN116063542A (zh) 2015-12-02 2023-05-05 阿吉纳斯公司 抗体和其使用方法
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
CA3006963A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
EP3471754A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CA3041340A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
US20210251994A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
EP4007771A1 (en) 2019-08-02 2022-06-08 UCB Biopharma SRL Methods for purifying antibodies
PE20221506A1 (es) 2019-12-17 2022-10-04 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
WO2010096418A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Ucb Pharma S.A. Antibody molecules having specificity for human ox40

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
GB0124317D0 (en) 2001-10-10 2001-11-28 Celltech R&D Ltd Biological products
US20040146948A1 (en) 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
GB0303337D0 (en) 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
TWI461436B (zh) 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
JP2009518320A (ja) 2005-12-05 2009-05-07 シュムフォウエン アクティーゼルスカブ 抗オルトポックスウイルス組換えポリクローナル抗体
US20070224627A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Lawrence Horowitz Facilitation of translocation of molecules through the gastrointestinal tract
RU2009135824A (ru) 2007-02-27 2011-04-10 Дженентек, Инк. (Us) Антитела-антагонисты против ох40 и их применение в лечении воспалительных и аутоиммунных заболеваний
EP2535349A1 (en) 2007-09-26 2012-12-19 UCB Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
EP2475682B1 (en) 2009-09-10 2018-01-31 UCB Biopharma SPRL Multivalent antibodies
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
JP5522668B2 (ja) 2010-02-03 2014-06-18 株式会社ブリヂストン タイヤ構成部材の切断装置及び製造方法
SG11201401649VA (en) * 2011-11-11 2014-07-30 Ucb Pharma Sa Albumin binding antibodies and binding fragments thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
WO2010096418A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Ucb Pharma S.A. Antibody molecules having specificity for human ox40

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170139131A (ko) * 2015-04-22 2017-12-18 유씨비 바이오파마 에스피알엘 단백질 정제 방법

Also Published As

Publication number Publication date
LT2776469T (lt) 2019-08-12
AU2012333997A1 (en) 2014-05-29
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IL232420B (en) 2019-02-28
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CY1122073T1 (el) 2020-11-25
BR112014011404A2 (pt) 2017-05-30
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IL232420A0 (en) 2014-06-30
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US20130243772A1 (en) 2013-09-19
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US9040048B2 (en) 2015-05-26
JP2015506910A (ja) 2015-03-05
HRP20191219T1 (hr) 2019-10-04
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WO2013068563A3 (en) 2013-06-27
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MA35724B1 (fr) 2014-12-01
DK2776469T3 (da) 2019-07-29

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